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JPH067191A - モノクローナル抗体、それを産生するハイブリド−マ、その対応抗原及びそれを用いた測定方法 - Google Patents

モノクローナル抗体、それを産生するハイブリド−マ、その対応抗原及びそれを用いた測定方法

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Publication number
JPH067191A
JPH067191A JP4078305A JP7830592A JPH067191A JP H067191 A JPH067191 A JP H067191A JP 4078305 A JP4078305 A JP 4078305A JP 7830592 A JP7830592 A JP 7830592A JP H067191 A JPH067191 A JP H067191A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
act
monoclonal antibody
antibody according
antichymotrypsin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP4078305A
Other languages
English (en)
Inventor
Masahiko Yamazaki
誠彦 山崎
Masayuki Numama
雅之 沼間
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP4078305A priority Critical patent/JPH067191A/ja
Priority to US08/170,673 priority patent/US5451664A/en
Publication of JPH067191A publication Critical patent/JPH067191A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトα１−アンチキモトリプシン物質群の特
定群を測定することにより、癌、アルツハイマー病の診
断を可能にする手段を提供すること。 【構成】 特定のヒトα１−アンチキモトリプシンを特
異的に認識するモノクローナル抗体、これに対応する抗
原、及びこの抗体を用いる特定のヒトα１−アンチキモ
トリプシンの測定方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌、炎症又はアルツハ
イマー病の診断に有用なモノクローナル抗体、それを産
生するハイブリドーマ、その対応抗原及びそれを用いた
特定のヒトα１−アンチキモトリプシンの測定方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトα1 −アンチキモトリプシン（以
下、ＡＣＴと略称することがある）は、キモトリプシン
のプロテアーゼ活性を阻害する糖タンパク質であり、血
液等の体液中に含まれている。ＡＣＴの意義は細菌等の
プロテアーゼ活性を阻害して生体を防御することにある
と考えられているが、炎症患者、肝癌等の癌患者、アル
ツハイマー病患者等の体液中でＡＣＴ濃度が健常人より
も高くなっていることが知られており、体液中のＡＣＴ
濃度を測定することにより、これらの疾病の診断を行な
う試みがなされている。
【０００３】従来より、ＡＣＴの測定は免疫学的測定法
のほかに、キモトリプシン活性の阻害の度合いに基づく
インヒビター活性測定により行なわれていた。しかしな
がら、このインヒビター活性測定法は方法の複雑さ、値
の不確定さ等の問題があった。また、従来の免疫学的測
定法は、ポリクローナル抗体を用いた方法、例えばＳＲ
ＩＤ法、サンドイッチ法等で行なわれてきた。しかしな
がらポリクローナル抗体はＡＣＴ物質群のうちの全ての
ＡＣＴ、すなわち特定化されないＡＣＴと反応すると考
えられることから、これらの方法においてはＡＣＴ物質
群をトータルで測定することとなり、従ってある程度の
臨床的有用性が示されてはいても、ＡＣＴの特定の部分
構造あるいはＡＣＴ物質群のうち特定のＡＣＴ群のみを
検出することによる臨床上のより以上の利点については
知られることはなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はＡＣＴ
の物質群のうちの特定の一部を特異的に検出することに
よって、より臨床意義の高い診断、特に癌又はアルツハ
イマー病の診断に有用なモノクローナル抗体、それを産
生するハイブリドーマ及びそれを用いた特定のヒトα１
−アンチキモトリプシンの測定方法を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、ＡＣＴ
測定の意義について鋭意検討を進める中で、従来ＡＣＴ
と考えられる物質が不均一性を示す群であることを見出
し、その群のうちの一部特有の構造を認識することがで
きるモノクローナル抗体を得ることに成功し、さらにそ
の特有の構造を有するＡＣＴの特異的検出が極めて臨床
上重要な意味を有することを見出し、本発明を完成する
に到った。
【０００６】すなわち、本発明は、ヒトα1 −アンチキ
モトリプシン物質群の特定の一部を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を提供する。また、本発明は、本発明
の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。さらに、
本発明は、本発明の抗体が認識する特定のヒトα１−ア
ンチキモトリプシンを提供する。さらに、本発明は、本
発明の抗体と試料中のヒトα１−アンチキモトリプシン
物質群との免疫学的特異結合反応を利用して試料中の特
定のヒトα１−アンチキモトリプシンを測定する方法を
提供する。
【０００７】以下に、本発明を詳細に説明する。
【０００８】従来の測定系ではＡＣＴ物質群全てを対象
に検出を行なっていたがため、ＡＣＴの一部構造のみを
特定化して検出することができず、その臨床的意義も見
出されていなかった。本発明のＡＣＴの一部構造に特異
的なモノクローナル抗体を用いた測定系においてＡＣＴ
物質群のうち特有な部位又は物質を検出することにより
その臨床上の意味付けが極めて明瞭になった。
【０００９】特に近年、アルツハイマー病の診断に血
清、髄液等体液中のＡＣＴの測定の有用性が報告されて
いる（Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、第２８巻、ｐｐ５６１−
５６７，１９９０年）。しかしながら、これらの報告は
ＡＣＴ全体を測定するがため、診断能としては不十分で
ある。本発明者は、本発明のモノクローナル抗体を用い
た測定系を開発し、ＡＣＴの一部構造を特異的に検出す
ることにより、診断能が劇的に向上することを見出し
た。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体は、実施例に
おいて詳述するように癌患者の腹水中に含まれるタンパ
ク質を免疫原として用いてハイブリドーマを作製するこ
とにより得られたものであるが、目的とするＡＣＴ物質
群を含む生体抽出物、そこから単離した精製物、その分
解物、合成された対応ポリペプチド、遺伝子工学的産生
物等を免疫原にして用い常法に従ってハイブリドーマを
作製、そこから常法により得ることもできる。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体の例としては
ＡＣ−００５、ＡＣ−００６、ＡＣ−０１３、ＡＣ−６
０６及びＡＣ−０６５を挙げることができる。これらの
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはいずれ
も工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、その受
託番号はそれぞれ微工研条寄第３４８２号、微工研菌寄
第１２３５３号、微工研菌寄第１２３５４号、微工研菌
寄第１２５９１号及び微工研菌寄第１２５９０号であ
る。
【００１２】ＡＣ−００６、ＡＣ−０１３、ＡＣ−６０
６及びＡＣ−０６５は常法（Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ，第２２５巻、ｐｐ３０６〜３１２、
１９８３年）により得られたＡＣＴと大きな反応性を有
し、これらそれぞれのモノクローナル抗体に対応する抗
原決定部位は、ＡＣＴの物質群の中のメジャーな部分を
占めると考えられる。また、これらのモノクローナル抗
体に対応する抗原決定部位を有するＡＣＴの測定値は、
従来のポリクローナル抗体により検出されるＡＣＴの測
定値と明らかな差異を示し、物質的な相違が示された。
すなわち、ポリクローナル抗体はＡＣＴ物質群のトータ
ルを検出することを考えると、本発明のモノクローナル
抗体に特異的に認識されるＡＣＴはポリクローナル抗体
で検出されるトータルのＡＣＴ物質群の一部であること
が示唆された。
【００１３】一方、ＡＣ−００５は常法にて得られた上
記ＡＣＴとの反応性は極めて乏しく、ＡＣ−００５の認
識する物質は一般的に知られていたＡＣＴと異なる物質
であると思われた。ＡＣ−００５が認識する物質とＡＣ
Ｔとの異同を検討したところ、後記実施例で詳述するよ
うに１）キモトリプシン阻害活性を有すること、２）Ｄ
ＮＡ結合能を示すこと、３）ＡＣ−００５のアフィニテ
ィーカラムで精製した物質を免疫原として作製したモノ
クローナル抗体（例えばＡＣ−６０６、ＡＣ−０６５）
がＡＣＴを強く認識すること等から、ＡＣ−００５の認
識する物質は大部分がＡＣＴと共通の構造を有する物
質、すなわち、ＡＣＴ物質群に属する物質であることが
明らかになった。ＡＣＴ物質群の中でＡＣ−００５に特
異的な抗原決定部位を有する、新たに見出されたこの物
質を以下Ａｃｔａと呼ぶ。ＡｃｔａはＡＣ−００５の抗
原決定部位を有するという特徴で他のＡＣＴ物質群と明
瞭に区別される。ＡｃｔａはＡＣＴ物質群の中で特に微
量成分であり、一般にＡＣＴ全体の１００分の１以下の
含有量である。
【００１４】本発明者らは、本発明のモノクローナル抗
体を用いることによりＡＣＴ物質群のうち特定のＡＣＴ
を検出する方法を可能とした。目的とするＡＣＴの検出
には、対応するモノクローナル抗体を用い免疫学的に測
定すればよい。使用できる免疫学的測定法は特に限定さ
れず、様々な公知の方法、例えば免疫染色法、免疫組織
化学法、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、凝集法、競合法、サ
ンドイッチ法等が適用可能である。好ましい例としては
サンドイッチ法が挙げられる。特に固定化抗体をモノク
ローナル抗体とし、標識抗体にポリクローナル抗体を用
いることによって感度、特異性の高い検出が可能であ
る。標識抗体としてモノクローナル抗体を用いてもよ
い。
【００１５】また、ＡＣＴ物質群はＤＮＡとの結合能を
有しているのでこの性質を利用して、例えばＤＮＡを固
相に固定化し本発明のモノクローナル抗体との間でサン
ドイッチ法により測定することも可能である。
【００１６】本発明の５種のモノクローナル抗体はお互
いに結合の阻害を示さず、抗原決定部位は異なってい
る。また、本発明のモノクローナル抗体を用いた体液中
のＡＣＴの測定の結果より、ＡＣ−００６とＡＣ−０１
３との相関が高く、実質的に同じ物質か又は極めて類似
の物質を認識することが明かにされた。また、ＡＣ−６
０６とＡＣ−０６５との間の相関も高く、同様なことが
言える。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体を用いた特定
のＡＣＴの測定は臨床診断に有用である。免疫組織化
学、体液診断共に適用可能であるが、体液診断への使用
が好ましく、血液（血清、血漿）や髄液を検体とした各
種炎症、癌、神経疾患等の診断への適用がより好まし
い。特に有用なのは癌、アルツハイマー病の診断への適
用である。
【００１８】上述のように、本発明はまた、上記本発明
のモノクローナル抗体が認識する特定のヒトα１−アン
チキモトリプシンを提供する。これは、本発明のモノク
ローナル抗体を常法により固定化したアフィニティカラ
ムを作製し、これに例えば癌患者腹水をアプライし、Ｐ
ＢＳで洗浄後、３Ｍ ＫＳＣＮ／ＰＢＳでアンチキモト
リプシンを溶離させることにより調製することができる
（実施例２参照）。このような特定のヒトα１−アンチ
キモトリプシンは、本発明のモノクローナル抗体を調製
するために用いられる抗原としての用途を有する。
【００１９】本発明のモノクローナル抗体は、免疫療
法、ミサイル療法等治療への応用も可能である。
【００２０】また、本発明のモノクローナル抗体の対応
抗原又は本発明のモノクローナル抗体に対する抗イデオ
タイプ抗体のワクチンとしての使用も可能である。
【００２１】体液診断の場合、本発明のモノクローナル
抗体を用い特定のＡＣＴを検出することにより、従来の
ＡＣＴ総量を検出する測定方法と比較して、臨床上の有
用性が示される。体液診断には従来公知の方法が使用可
能であるが、好ましい例としてはサンドイッチ法が挙げ
られる。特に固定化抗体をモノクローナル抗体とし標識
抗体にポリクローナル抗体を用いることによって感度、
特異性の高い検出が可能である。標識抗体としてモノク
ローナル抗体を用いてもよい。例えばＡＣＴ物質群のう
ち、１種のある特定の構造を有するＡＣＴ群を検出する
には固定化抗体にその構造を認識するモノクローナル抗
体、標識抗体にポリクローナル抗体を使用すればよく、
２種の特定構造を有するＡＣＴ群を検出するには、それ
ぞれに対応するモノクローナル抗体を固定化抗体、標識
抗体に使用すればよい。
【００２２】また、ＡＣＴ物質群はＤＮＡとの結合能を
有しているので、この性質を利用することもできる。例
えばＤＮＡを固相に固定化し、本発明のモノクローナル
抗体との間でサンドイッチ法により測定することも可能
である。
【００２３】本発明者はさらに検討を加え、複数の異な
った特定のＡＣＴ群の量比を測定することによって臨床
上の有用性を確認した。
【００２４】例えば、アルツハイマー病の患者体液中の
ＡＣＴ濃度が上昇することは既に知られていたが、この
従来のポリクローナル抗体を用いるトータルのＡＣＴを
検出する測定法と比較して、本発明のモノクローナル抗
体を用いた測定系によって、識別能が大きく向上するこ
とを確認した。すなわち、ＡＣ−００５に特異的に認識
されるＡｃｔａは髄液中で正常人と比較してアルツハイ
マー痴呆症患者で明らかな高値を示し明瞭に区別できた
が、さらに、Ａｃｔａと他の本発明のモノクローナル抗
体に認識される特定のＡＣＴとの量比をとることによっ
て識別能の向上を示した。特にＡｃｔａとＡＣ−０６５
又はＡＣ−６０６に認識されるＡＣＴとの量比をとるこ
とが、アルツハイマー型痴呆（ＡＤ）と能血管性痴呆
（ＭＩＤ）との識別の向上に極めて有効であった。ま
た、ポリクローナル抗体で検出される特定化されない全
てのＡＣＴとＡＣ−０６５又はＡＣ−６０６に認識され
るＡＣＴとの量比をとった場合、特定化されないＡＣＴ
のみの測定に比べ、識別能が向上することが確認され
た。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定さ
れるものではない。
【００２６】実施例１ モノクローナル抗体の作製 １）免疫原の調製 肝癌患者腹水３００ｍｌを凍結乾燥後、０．６Ｍ過塩素
酸２００ｍｌを加え、攪拌した。上清を純水に対して透
析した後、その不溶部を分離、乾燥して３７２ｍｇのサ
ンプルを得た。これを５ｍｌの６Ｍグアニジン塩素／Ｐ
ＢＳに溶解し、セファクリルＳ−２００ＨＲ（５cmｘ１
２０cm）（ファルマシア製）を用いてゲルろ過をおこな
った。（図１） 得られた２つの画分のうち、より高分
子の画分を８Ｍ尿素含有燐酸バッファー（ｐＨ８．５）
に対し透析し、ＭｏｎｏＱ（ファルマシア製）にて陰イ
オン交換カラムクロマトグラフィーを行った（図２）。
１００ｍＭＮａＣ１付近で溶出されるシャープなピーク
をＰＢＳに対し透析して、サンプル−Ａを調製し、これ
を免疫原としてもちいた。正常人血清３００ｍｌを用い
て、同様の操作を行い、サンプル−Ｂを調製した。
【００２７】２）免疫感作、細胞融合 １ｍｌのサンプル−Ａと等量のフロイントコンプリート
アジュバントと乳化混合し、この１００μｌをＢａｌｂ
／ｃマウス（８週齢、雌）の腹腔内に投与した。さらに
３週間おきに３回投与を行い、免疫した。最終投与の３
日後、マウスから脾臓を取り出し、単細胞に分離した
後、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した。一
方、対数増殖期にあるマウスミエローマＸ６３．６．
５．３を集め、ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した。脾
細胞２．５ｘ１０8 個とマウスミエローマ５ｘ１０7 個
を混合し、５０％ポリエチレングリコールを用いて３７
℃中、細胞融合をおこなった。遠心分離にて培地を除去
した後、細胞に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地７０ｍｌを加え、９６穴プレート７枚に
１穴当たり０．１ｍｌずつ分配した。翌日、ＨＡＴ培地
（アミノプテリン、チミジン、ヒポキサンデン含有）
０．１ｍｌを各穴に添加し、さらに、３日または４日ご
とにＨＡＴ培地を半量ずつ交換した。３週間後、ほとん
どの穴にハイブリドーマの生育がみられた。
【００２８】３）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマから産生される抗体はＥＬＩＳＡ法にて
検索した。サンプル−Ａまたはサンプル−Ｂを５μｇ／
ｍｌの濃度になる様にＰＢＳに希釈し、９６穴マイクロ
タイタープレートに５０μｌずつ添加し４℃にて一晩固
定した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングした後、
培養上清５０μｌを加え３７℃にて１時間反応させた。
ＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ杭マウスイムノグロブ
リン抗体（カッペル社）と反応させた。ＰＢＳで洗浄
後、色原体としてオルトフェニレンジアミンを用い、４
９２ｎｍの吸光度を測定した。サンプル−Ｂと比較して
サンプル−Ａに対し強い反応性を示したハイブリドーマ
クローンを選択した。得られたハイブリドーマはＨＡＴ
培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に移し、さら
に１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に移し培養し
た。このハイブリドーマをモノクローン化した。即ち、
９６穴プレートに１穴当たり０．８個の濃度に細胞を希
釈して４ｘ１０5 個のマウス胸腺細胞と共に培養し、２
週間後にＥＬＩＳＡ法にて抗体産生細胞を選択した。こ
のクローニング操作を繰り返し、安定なハイブリドーマ
を得た。最終的に３種のハイブリドーマ、ＡＣ−００
５、ＡＣ−００６、ＡＣ−０１３を得た。これらのハイ
ブリドーマは微工研に寄託され、各々微工研条寄第３４
８２号、微工研菌寄第１２３５３号、同第１２３５４号
の受託番号が与えられた。これらのハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体ＡＣ−００５、ＡＣ−００
６、ＡＣ−０１３のクラスはすべてＩｇＧ１であった。
【００２９】実施例２ モノクローナル抗体の作製−２ １）免疫原の調製 ＡＣ−００５アフィニティカラムに肝癌患者腹水５００
ｍｌをアプライし、ＰＢＳで充分洗浄後、３ＭのＫＳＣ
Ｎ／ＰＢＳにてＡＣ−００５に対応する抗原物質である
Ａｃｔａを溶出させた。次いで、これをＰＢＳに対して
透析後、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した。
【００３０】２）免疫原の調製 上記Ａｃｔａを等量のフロイントコンプリートアジュバ
ントと乳化混合し、この１００μｌをＢａｌｂ／ｃマウ
ス（８週令、雌）の腹腔内に投与した。次いで、２週間
おきに３回、上記Ａｃｔａ１００μｌを静脈注射により
投与した。
【００３１】最終投与の３日後、マウスから脾臓をとり
出し、単細胞に分離した後、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０
培地にて洗浄した。一方、対数増殖期にあるマウスミエ
ローマＸ６３．６．５．３を集め、ＲＰＭＩ１６４０培
地にて洗浄した。脾細胞２ｘ１０8 個とマウスミエロー
マ４ｘ１０7 個を混合し、５０％ポリエチレングリコー
ルを用いて３７℃中、細胞融合を行なった。遠心分離に
て細胞を除去後、細胞に１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６
４０培地６０ｍｌを加え、９６穴プレート６枚に１穴当
り０．１ｍｌずつ分配した。翌日、ＨＡＴ培地０．１ｍ
ｌを各穴に添加し、さらに３日又は４日ごとにＨＡＴ培
地を半量ずつ交換した。３週間後、ほとんどの穴にハイ
ブリドーマの生育が見られた。
【００３２】３）ハイブリドーマの選択 Ａｃｔａを１μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳにて
希釈し、これを固定化抗原として実施例１と同様にＥＬ
ＩＳＡ法にて検索し、ハイブリドーマを選択した。その
結果、２種のハイブリドーマ、ＡＣ−６０６、ＡＣ−０
６５が得られた。これらのハイブリドーマは微工研に寄
託され、それぞれ微工研菌寄第１２５９１号、第１２５
９０号の受託番号が与えられた。
【００３３】なお、これら２種のハイブリドーマの産生
するモノクローナル抗体のクラスはいずれもＩｇＧ2bで
あった。
【００３４】実施例３ モノクローナル抗体の特性化 １）抗原物質の解析 サンプル−Ａに対し電気泳動、免疫染色法を行い解析し
た。１２．５％のゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び、
等電点電気泳動を行い、その後、免疫染色法を行った。
すなわち、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティン
グし、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキング後、各抗体
を反応させ、さらに、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を反応させた。検出はコニカイムノステイ
ンキットＨＲＰ（コニカ社製）を用いた。その結果、各
抗体とも、分子量６０Ｋｄ乃至７０Ｋｄの分子量、ｐＩ
４．０乃至５．０を有する物質と反応した。この周辺の
分子量、ｐＩを有する種々の血清蛋白標品との反応性を
検討したところ、ＡＣ−００６およびＡＣ−０１３はＡ
ＣＴと反応することが明らかになった。
【００３５】２）抗体の特異性−１ サンプル−ＡおよびＡＣＴに対する各モノクローナル抗
体の反応性をサンドウィッチアッセイにて検討した。す
なわち、各モノクローナル抗体を５μｇ／ｍｌ・ＰＢＳ
の濃度で固定化した９６穴プレートをブロッキング後、
各サンプル（１μｇ／ｍｌ）を反応させ、さらにＨＲＰ
標識した各モノクローナル抗体を反応させ、その活性を
測定した。その結果を表１に示す。
【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 標識抗体 ＡＣ−００５ ＡＣ−００６ ＡＣ−０１３ 固定化抗体 ａ ｂ ａ ｂ ａ ｂ ＡＣ−００５ − − − ＋ − ＋ ＡＣ−００６ − ＋ − − ＋ ＋ ＡＣ−０１３ − ＋ ＋ ＋ − − ──────────────────────────────────── ａはＡＣＴ標品、ｂはサンプル−Ａを表す。 −は反応せず、＋は反応したことを表す。 この結果から、ＡＣ−００６とＡＣ−０１３はＡＣＴと
反応性を有すること、及び各モノクローナル抗体に対応
する抗原決定部位は物質上に１つだけ存在し、かつ該抗
原決定部位は異なることがわかる。
【００３６】３）抗体の特異性−２ 実施例２の１）にて精製したＡｃｔａとＡＣＴ標品に対
し実施例３の２）と同様にモノクローナル抗体ＡＣ−６
０６、ＡＣ−０６５の反応性を検討した。その結果を表
２に示す。
【表２】 表２ ──────────────────────────────────── 標識抗体 ＡＣ−００６ ＡＣ−０１３ ＡＣ−６０６ ＡＣ−０６５ 固定化抗体 ａ ｂ ａ ｂ ａ ｂ ａ ｂ ＡＣ−００５ − ＋ − ＋ − ＋ − ＋ ＡＣ−６０６ ＋ ＋ ＋ ＋ − − ＋ ＋ ＡＣ−０６５ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − − ──────────────────────────────────── ａはＡＣＴ標品、ｂはサンプル−Ａを表す。 −は反応せず、＋は反応したことを表す。 この結果より、本発明の５種のモノクローナル抗体はそ
の対応する抗原決定部位が互いに異なること、さらに、
Ａｃｔａに対して作製したモノクローナル抗体ＡＣ−６
０６とＡＣ−０６５がＡＣＴとの反応性を有することに
よりＡｃｔａはＡＣＴに関連した物質であることがわか
る。
【００３７】実施例４ ＡｃｔａとＡＣＴとの関連性の検討 １）ＤＮＡ結合性 ＡＣ−００５アフィニティカラムに肝癌患者腹水５００
ｍｌをアプライし、ＰＢＳで洗浄後、３ＭのＫＳＣＮ／
ＰＢＳにて溶出させＡｃｔａを単離した。これを１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５ 以下ＰＢと称す）に対し透
析し、Ａｂｄｕｌｌａｈらの方法（Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃｓ Ｖｏｌ．２２５ ｐｐ．３０６ ’８３）
に従って、ＤＮＡ−セルロースカラム（ファルマシア社
製）にアプライした。ＰＢにて洗浄後、塩化ナトリウム
を加えたＰＢにて溶出を行ったところ、２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌにてＡｃｔａが溶出された。なお反応性は、溶出
液をニトロセルロース膜に点着しＰＯＤ標識ＡＣ−００
５との反応性をみることにより検出した。以上より、Ａ
ｃｔａはＡＣＴと同じくＤＮＡ結合性を有していること
が明かになった。
【００３８】２）プロテアーゼインヒビター活性 プロテアーゼインヒビター活性はプロテアーゼとの複合
体の生成能により検出した。肝癌患者腹水５ｍｌと牛キ
モトリプシン（Worthington biochemical Corp. 社製）
１ｍｇのＰＢＳ溶液５ｍｌとを３７℃にて１時間反応さ
せた。この混液をＡＣ−００５アフィニティカラムにア
プライし、ＰＢＳにて充分洗浄した後、３ＭのＫＳＮＣ
／ＰＢＳにて溶出させた。溶出液をＰＢＳに対して透
析、濃縮し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した（図
３）。レーン１には牛キモトリプシン、レーン２には牛
キモトリプシンとＡＣＴとを反応させた混合物（複合体
の生成）、レーン３にはＡｃｔａ、レーン４には上記濃
縮物を泳動した。Ａは銀染色、Ｂはモノクローナル抗体
ＡＣ−００５による免疫染色により検出した。レーン４
には、レーン２にみられるＡＣＴとキモトリプシンの複
合体（ＭＷ９０ｋｄ）と同じ移動度にバンドがみられ、
さらにこのバンドはＡＣ−００５との反応性を有してい
ることが明かになった。以上の結果よりＡｃｔａがプロ
テアーゼインヒビター活性を有することが明かになっ
た。実施例３−３）及び実施例４の結果より、Ａｃｔａ
がＡＣＴ物質群に属することが明らかになった。
【００３９】実施例５ １０μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体ＡＣ−００
５のＰＢＳ溶液をＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに５０μ
ｌずつ分注し、４℃にて一晩固定化した。さらに、１％
ＢＳＡ／ＰＢＳにて４℃一晩処理することによりブロッ
キングを行った。ＰＢＳにて洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓにて５倍から段階希釈した検体（肝癌患者腹水）５０
μｌをプレートに加え、室温にて２時間反応させた。
０．０５％ＴＷ−２０／ＰＢＳにて洗浄後、ＰＯＤ標識
ヒツジ抗アンチキモトリプシン抗体（バインヂングサイ
ト社製、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０００倍希釈）５０
μｌを加え、室温にて１時間反応させた。０．０５％Ｔ
Ｗ−２０／ＰＢＳにて洗浄後、１ｍｇ／ｍｌの濃度のオ
ルトフェニレンジアミンを含むクエン酸緩衝液（０．０
２％過酸化水素含有、ｐＨ５．０）２００μｌを加え、
１０分間発色させた。５０μｌの９Ｎ硫酸を加え発色を
停止させ４９２ｎｍの吸光度を測定した。この肝癌患者
腹水中の量を２５０Ｕとして検量線を作成した（図
４）。ついで各検体（正常人血清３１例、癌患者血清１
６例）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０倍希釈したものに
ついて同様に測定を行い、検量線によりＵ値を求めた
（図５）。このＡＣ−００５を用いた測定系により癌の
検出が可能になることが明かである。
【００４０】実施例６ ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートＤＮＡ（ウシ胸腺由来、Wo
rthington Biochemical 社製）を１０μｇ／ｍｌの濃度
にＰＢＳで希釈し、４℃で一晩かけることにより固定化
した。さらに１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４℃、一晩ブロッキ
ングした。ＡＣＴ標品（アテンズリサーチ社製）を１％
ＢＳＡ／ＰＢで希釈し、ＡＣＴの濃度を１０、３．３、
１．１、０．４、０μｇ／ｍｌとした。それを室温１時
間でプレート内でＤＮＡと反応させた。未反応物を除く
ためＰＢで洗浄した。その後、ＰＯＤ標識したヒツジ抗
ＡＣＴ抗体（バインディングサイト社製）又はＰＯＤ標
識ＡＣ−０１３を１％ＢＳＡ／ＰＢで１μｇ／ｍｌに希
釈し、５０μｌを加え、室温で１時間インキュベートし
た。この後、プレートをＰＢで洗浄し、０．０２％Ｈ2
Ｏ2 及び１ｍｇ／ｍｌの濃度のｏ−フェニレンジアミン
を含むクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．２ｍｌ
を加え室温で１０分間かけ発色させ、その後９Ｎ硫酸５
０μｌを添加して発色反応を停止し、４９２ｎｍの吸光
度を測定した。ＡＣＴの濃度に対する検量線を得た（表
２）。
【００４１】次に正常人の血清を３例及び肝癌患者の血
清を３例用い、各々１００倍に希釈し、前記のＡＣＴ標
品に代えて、その他は同様な操作を行なった。得られた
吸光度から、先に得られた検量線よりＡＣＴ濃度を推定
した（表４）。
【表３】 ┘
【表４】
【００４２】以上のように、本測定系によりＡＣＴの定
量測定がより確実性が高く、かつ簡易に行なうことが可
能であると言える。
【００４３】実施例７ １０μｇ／ｍｌの濃度の各モノクローナル抗体のＰＢＳ
溶液をそれぞれＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに５０μｌ
ずつ分注し、４℃にて一晩固定化した。さらに１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）を加
え、３７℃にて１時間ブロッキングを行なった。０．０
５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳにて洗浄後、１％ＢＳＡ
／ＰＢＳにて希釈したＡＣＴ標品５０μｌをプレートに
加え、３７℃にて１時間半反応させた。０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０／ＰＢＳにて洗浄後、ＰＯＤ標識ヒツジ抗
ＡＣＴ抗体５０μｌを加え、２０℃にて１時間半反応さ
せた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳにて洗浄
後、実施例５と同様に発色反応を行ない、検量線を作製
した。次いで各検体（正常人血清３１例、婦人科系癌患
者血清２６例）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて希釈したもの
について同様に測定を行ない、検量線より用いたＡＣＴ
標品換算の値（相対値）を得た。また、比較例としてモ
ノクローナル抗体の代わりに抗ＡＣＴポリクローナル抗
体（バインディングサイト社製）を用い同様に行なっ
た。なお、血清の希釈倍率はＡＣ−００５が５０倍、Ａ
Ｃ−００６が１００倍とＡＣ−０１３が４００倍、ＡＣ
−６０６とＡＣ−０６５が２０００倍、ポリクローナル
抗体が５００００倍であった。
【００４４】正常人の平均値プラス２ＳＤをカットオフ
値とし、陽性率を算出した。結果を図６及び表５に示
す。なお、ＡＣ−００６とＡＣ−０１３はほとんど同じ
値を示し、また、ＡＣ−６０６とＡＣ−０６５もほとん
ど同じ値を示したため、ＡＣ−０１３とＡＣ−０６５の
結果のみを示す。図６においてカットオフ値は破線で示
した。
【表５】 表５ ──────────────────────────────────── 癌患者の陽性率 正常人の平均値 癌患者の平均値 Ｂ／Ａ 抗体 （％） Ａ（μg/ml） Ｂ（μg/ml） （％） ＡＣ−００５ ４２．３ ９６ １７５ １８２ ＡＣ−０１３ ３８．５ ３１ ８３ ２６８ ＡＣ−０６５ ５０．０ ７２ １９２ ２６７ ポリクローナル ３８．５ ９７ １３８ １４２ 抗体 ────────────────────────────────────
【００４５】特定のＡＣＴをモノクローナル抗体によっ
て検出する本発明の測定方法は、従来のポリクローナル
抗体を用いる方法に比べると、同等以上の陽性率を示
し、さらに、癌患者の平均値の正常人の平均値に対する
比が大きくなっており、明らかに癌の識別能の向上が確
認された。
【００４６】実施例８ 実施例７と同様の方法でアルツハイマー型痴呆症（以
下、ＡＤと略称することがある）１０例の血清測定を行
なった。結果を図７及び表６に示す。なお、ＡＣ−００
６とＡＣ−０１３はほとんど同じ値を示し、また、ＡＣ
−６０６とＡＣ−０６５もほとんど同じ値を示したた
め、ＡＣ−０１３とＡＣ−０６５についての結果のみを
示す。陽性率は実施例７の血清カットオフ値を用いて算
出した。
【表６】 表６ ──────────────────────────────────── AD患者の陽性率 正常人の平均値 AD患者の平均値 Ｂ／Ａ 抗体 （％） Ａ（μg/ml） Ｂ（μg/ml） （％） ＡＣ−００５ ６０．０ ９６ １７０ １７７ ＡＣ−０１３ ８０．０ ３１ ８９ ２８７ ＡＣ−０６５ ６０．０ ７２ １５０ ２０８ ポリクローナル ６０．０ ９７ １３７ １４１ 抗体 ────────────────────────────────────
【００４７】特定のＡＣＴをモノクローナル抗体によっ
て検出する本発明の測定方法は、従来のポリクローナル
抗体を用いる方法に比べると、同等以上の陽性率を示
し、さらに、ＡＤ患者の平均値の正常人の平均値に対す
る比が大きくなっており、明らかにＡＤの識別能の向上
が確認された。
【００４８】実施例９ 実施例７と同様の方法でアルツハイマー型痴呆症１０
例、脳血管性痴呆症（以下、ＭＩＤと略称することがあ
る）７例、正常人７例の髄液の測定を行なった。なお、
髄液の希釈倍率はＡＣ−００５が１．５倍、ＡＣ−００
６が３倍とＡＣ−０１３が９倍、ＡＣ−６０６とＡＣ−
０６５が５０倍、ポリクローナル抗体が５００倍で行な
った。
【００４９】結果を図８及び表７に示す。なお、ＡＣ−
００６とＡＣ−０１３はほとんど同じ値を示し、また、
ＡＣ−６０６とＡＣ−０６５もほとんど同じ値を示した
ため、ＡＣ−０１３とＡＣ−０６５の結果のみを示す。
なお、図８の「Ａ」はＡＤを、「Ｂ」はＭＩＤを、
「Ｃ」は正常人をそれぞれ表わす。
【表７】 表７ ──────────────────────────────────── 正常人の平均値 AD患者の平均値 MID 患者の平均値 Ｂ／Ａ 抗体 Ａ（μg/ml） Ｂ（μg/ml） （μｇ／ｍｌ） （％） ＡＣ−００５ １．３５ ２．５７ １．５１ １９１ ＡＣ−０１３ ０．６４ ０．４２ ０．５９ ６６ ＡＣ−０６５ ３．３６ ２．３０ ５．２０ ６８ ポリクローナル ０．８２ ０．９８ ０．８３ １２０ 抗体 ────────────────────────────────────
【００５０】髄液測定において、本発明のＡＣ−００５
を用いた測定系はポリクローナル抗体を用いた測定系に
比べ、正常人とＡＤとの大きな識別能を示し、明らかに
アルツハイマー病の診断における有用性が確認された。
一方、ＡＣ−００６、ＡＣ−０１３、ＡＣ−６０６、Ａ
Ｃ−０６５を用いた測定系では正常人に比べＡＤはやや
低値を示した。
【００５１】実施例１０ 実施例９の結果についてＡＣ−００５による測定値と他
の抗体による測定値の比を算出した結果を表８に示す。
ＡＣ−００５単独の結果と比べ、ＡＣ−０１３（ＡＣ−
００６）またはＡＣ−０６５（ＡＣ−６０６）との比を
とることにより痴呆症におけるＡＤとＭＩＤとの間の識
別能が向上した。特にＡＣ−００５とＡＣ−０１３（Ａ
Ｃ−００６）との比をとった場合が効果が顕著であっ
た。同様にポリクローナル抗体とＡＣ−０６５（又はＡ
Ｃ−６０６）の比をとった場合、ポリクローナル抗体単
独の場合よりＡＤとＭＩＤとの識別能が向上した。
【表８】 表８ ──────────────────────────────────── MID 患者の平均値 AD患者の平均値 Ｂ／Ａ 抗体の量比 Ａ（μg/ml） Ｂ（μg/ml） （％） ＡＣ−００５単独 １．５１ ２．５７ １７０ ＡＣ−００５／ＡＣ−０１３ ３．５８ ６．４２ １７９ ＡＣ−００５／ＡＣ−０６５ ０．２８ １．３４ ４７６ ポリクローナル抗体単独 ０．８３ ０．９８ １１８ ポリクローナル抗体／AC-013 ２．１５ ２．５２ １１７ ポリクローナル抗体／AC-065 ０．１７ ０．５３ ３１２ AC-005／ポリクローナル抗体 １．８０ ２．４３ １３５ ────────────────────────────────────
【００５２】
【発明の効果】本発明により、特定のＡＣＴを認識する
モノクローナル抗体及びそれを用いた特定のＡＣＴの測
定法が提供された。本発明の測定方法は、炎症、癌、ア
ルツハイマー病の診断に有用である。特に本発明のモノ
クローナル抗体を用いて得られた複数の測定値の量比を
とることにより、アルツハイマー病の診断に極めて有用
となる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のモノクローナル抗体の作製に用いら
れる免疫原の精製過程におけるゲルろ過クロマトグラフ
ィーの溶出曲線を示す図である。
【図２】 本発明のモノクローナル抗体の作製に用いら
れる免疫原の精製過程における陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーの溶出曲線を示す図である。
【図３】 Ａｃｔａのプロテアーゼインヒビター活性を
調べるために行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図で
ある。
【図４】 本発明のモノクローナル抗体ＡＣ−００５を
用いて作製した検量線を示す図である。
【図５】 正常人血清及び癌患者血清について免疫測定
を行い、図４の検量線に基づきＵ値を求めた結果を示す
図である。
【図６】 各種抗体を用いて正常人血清及び婦人科系癌
患者血清について免疫測定を行って得られたＡＣＴ標品
換算値（相対値）を示す図である。
【図７】 各種抗体を用いてアルツハイマー型痴呆症患
者血清について免疫測定を行って得られたＡＣＴ標品換
算値（相対値）を示す図である。
【図８】 各種抗体を用いてアルツハイマー型痴呆症患
者、脳血管性痴呆症及び正常人の髄液について免疫測定
を行って得られたＡＣＴ標品換算値（相対値）を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトα1 −アンチキモトリプシン物質群
    の特定の一部を特異的に認識するモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】 ＡＣ−００６である請求項１記載のモノ
    クローナル抗体。
  3. 【請求項３】 ＡＣ−０１３である請求項１記載のモノ
    クローナル抗体。
  4. 【請求項４】 ＡＣ−６０６である請求項１記載のモノ
    クローナル抗体。
  5. 【請求項５】 ＡＣ−０６５である請求項１記載のモノ
    クローナル抗体。
  6. 【請求項６】 ＡＣ−００５である請求項１記載のモノ
    クローナル抗体。
  7. 【請求項７】 請求項２記載の抗体を産生するハイブリ
    ドーマＡＣ−００６（微工研菌寄第１２３５３号）。
  8. 【請求項８】 請求項３記載の抗体を産生するハイブリ
    ドーマＡＣ−０１３（微工研菌寄第１２３５４号）。
  9. 【請求項９】 請求項４記載の抗体を産生するハイブリ
    ドーマＡＣ−６０６（微工研菌寄第１２５９１号）。
  10. 【請求項１０】 請求項５記載の抗体を産生するハイブ
    リドーマＡＣ−０６５（微工研菌寄第１２５９０号）。
  11. 【請求項１１】 請求項６記載の抗体を産生するハイブ
    リドーマＡＣ−００５（微工研条寄第３４８２号）。
  12. 【請求項１２】 請求項２記載の抗体が認識する特定の
    ヒトα１−アンチキモトリプシン。
  13. 【請求項１３】 請求項３記載の抗体が認識する特定の
    ヒトα１−アンチキモトリプシン。
  14. 【請求項１４】 請求項４記載の抗体が認識する特定の
    ヒトα１−アンチキモトリプシン。
  15. 【請求項１５】 請求項５記載の抗体が認識する特定の
    ヒトα１−アンチキモトリプシン。
  16. 【請求項１６】 請求項６記載の抗体が認識する特定の
    ヒトα１−アンチキモトリプシン。
  17. 【請求項１７】 請求項１ないし６のいずれか１項に記
    載の抗体と試料中のヒトα１−アンチキモトリプシン物
    質群との免疫学的特異結合反応を利用して試料中の特定
    のヒトα１−アンチキモトリプシンを測定する方法。
  18. 【請求項１８】 固定化された請求項１ないし６のいず
    れか１項に記載の抗体と標識化された抗ヒトα１−アン
    チキモトリプシンポリクローナル抗体とを用いたサンド
    イッチ法によって行なう請求項１７記載の方法。
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