JPH0671424B2

JPH0671424B2 - リグニン分解酵素およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0671424B2
Application number: JP6027886A
Authority: JP
Inventors: 一雄小出; 純杉浦; 和也辻岡; 徹成高橋
Original assignee: 新王子製紙株式会社
Priority date: 1986-03-18
Filing date: 1986-03-18
Publication date: 1994-09-14
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: JPS62220190A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規なリグニン分解酵素およびその製造方法に
関するものである。本発明の酵素はリグニンに作用し
て、これを低分子化または分解する性質を有するため、
木材等のリグノセルロース材料を原料とする紙パルプ製
造工程における種々の工程で利用することができる。た
とえば、パルプ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工程
等におけるリグニンの低分子化または分解を行わせるこ
とに利用できる。又、木材の糖化において、糖化の前段
の処理としてリグニンを分解することによって、セルラ
ーゼ作用を高めるといういわゆるセルロース系バイオマ
ス利用の分野にも適用できる。

［従来の技術］木材等のリグノセルロース物質に白色腐朽菌を接種、培
養することによってリグニンを分解し、セルロースパル
プを製造する提案がなされている（特開昭50−46903号
公報参照）。しかし、この方法の白色腐朽菌は共存する
炭水化物をも分解してしまい、またセルラーゼ欠損変異
株を用いた場合には、本来のリグニン分解力が弱まって
しまうことなどの問題点があり、実用化されるに至って
いない。

一方、このような問題点を解決するため、白色腐朽菌の
リグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作用させ、
リグニンのみを選択的に分解させようとすることも提案
されている（サイエンス第221巻、第661〜第662頁、198
3年12月）。この酵素はファネロケーテ・クリソスポリ
ウム（Phanerochaete chrysosporium）が生産する菌体
外酵素であり、主な特徴は鉄含有酵素であること、分子
量が42,000であること、酵素作用に過酸化水素が必要で
あること、リグニンモデル化合物の４位のフェノール性
水酸基がメトキシル基になった化合物に対して作用する
ことが確認されていること等である。

さらに、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phaneroc
haete chrysosporium）が生産する菌体外酵素として、
２つの酵素が報告されている（フェデレーション・オブ
・ヨーロピアンバイオケミカルソサイエテーズレ
ターズ第169巻、第２号第247〜第250頁、1984年）。
これらの酵素の１つは分子量が41,000以下である。他方
の酵素は分子量が46,000以下である。そして両酵素とも
鉄含有酵素であると推定されていること、酵素作用に過
酸化水素が必要であること、リグニンモデル化合物の４
位のフェノール性水酸基がエトキシル基になった化合物
に対して作用することが確認されていること等の性質を
有することが報告されている。

［発明が解決しようとする問題点］本発明は、白色腐朽菌をリグノセルロース物質に作用さ
せるときに生ずるリグニンの分解の他に共存する炭水化
物の分解を起こすという問題点を解決することを意図す
るものであり、又、従来公知のリグニン分解酵素の酵素
作用には過酸化水素が必要であり、工業的適用において
はコスト高となる問題点があったのを解決しようとする
ものである。

従って、本発明の目的は新規なリグニン分解酵素および
その製造方法を提供することにあり、他の目的は主とし
てリグノセルロース物質中のリグニンを低分子化または
分解する新規酵素およびその製造方法を提供することに
ある。また他の目的は過酸化水素依存性のない新規酵素
およびその製造方法を提案することにある。

［問題点を解決するための手段Ｉ］本発明は新規なリグニン分解酵素およびその製造方法に
関するものである。

リグニンは木材腐朽菌と呼ばれる担子菌によって良く分
解されることが知られている。しかしながら、高分子化
合物であるリグニンの化学構造は複雑であり、現在でも
その化学構造が決定されていないため、リグニン分解酵
素に関する知見は非常に少ないのが実情である。

本発明者らは木材腐朽菌として知られている菌の中か
ら、クラフトパルプ晒廃液およびリグニンの主要骨格構
造の代表的なモデル化合物シリンギルグリセロール‐β
‐シリルギルエーテルを分解する酵素活性を指標とし
て、酵素の探索を行なった結果、カワラタケ属の菌の培
養物中から得られた菌体外酵素を高度に精製して標品を
得た。

リグニン分解酵素生産菌としてはカワラタケ属に属する
アラゲカラワタケすなわちコリオラスヒルスタス（Cori
olus hirsutus）IFO4917,C.ヒルスタスIFO4920,C.ヒル
スタスIFO7038,などが使用できる。

本発明のリグニン分解酵素の主な特徴は銅含有酵素であ
ること、等電点が3.5付近であること、酵素作用に酵素
が必要であること、分子量が約63,000±5,000〔SDS電気
泳動法による〕であること、リグニンモデル化合物の４
位のフェノール性水酸基がメトキシル基になった化合物
に対して作用しないこと等であり、前記のファネロケー
テ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporiu
m）の生産する菌体外酵素とは全く性質が異なる酵素で
ある。

本発明のリグニン分解酵素は、下記の性質を有する。

（１）作用（ｉ）シリンギルグリセロール‐β‐シリンギルエー
テルに作用して、2,6-ジメトキシフエノールを生成す
る。

（ii）化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液中に
含まれるリグニンを低分子化する。

（２）基質特異性シリンギルグリセロール‐β‐シリンギルエーテルに対
して作用するが、シリンギルグリセロール‐β‐シリン
ギルエーテルの４位のフエノール性水酸基がメトキシル
基になった化合物に対しては作用しない。

（３）至適pHおよびpH安定性 pH4.5〜5.0付近が至適であり、安定pHは6.0〜9.0であ
る。

（４）至適温度および熱安定性 60℃付近が至適温度であり、50℃までの熱に安定であ
る。

（５）等電点は3.5付近である。

（６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を
呈する。

（７）本酵素の作用には酵素を必要とする。

次に本酵素の作用機序を確認するために、リグニンモデ
ル化合物としてシリンギルグリセロール‐β‐シリンギ
ルエーテル（以下SOSと称する）を用いて試験を行なっ
た。

少量のジオキサンに溶解した0.4MSOSを含有する200mM酢
酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）4ml中に実施例１で得た本
発明の酵素溶液0.4mlを含む反応液を25℃で30秒間及び
８時間反応させた。

得られた酵素反応液をTLC、ガスクロマトグラフィー、
マススペクトルグラフィーで分析した。

TLC分析酵素添加後30秒でSOSのスポットが消滅しておりSOSは速
やかに分解される。

ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルグラ
フィー分析 SOSと本発明酵素を８時間反応させた酵素反応液をガス
クロマトグラフィーで分析したところ第１図に示すよう
なピークが認められ、マススペクトルよりピークＩは2,
6-ジメトキシフェノールであることが判明した（第２
図）。

以上の結果により、本発明の酵素によってシリンギルグ
リセロール‐β‐シリンギルエーテルのβ‐アリルエー
テル結合が切断されることが確認された。

なおSOSのフェノール性水酸基をメトキシル基に変えた
基質に対しては本発明の酵素は全く作用を示さない。こ
のことから本発明の酵素はフェノール性水酸基を有する
基質に対して特異的に作用するものと考えられる。

［作用］本発明酵素が天然リグニンに作用する機構は次のように
考えられる。

リグニンのフェノール性水酸基を有する骨格に対して本
発明酵素が特異的に作用しβ‐アリルエーテル結合を切
断する。その結果2,6-ジメトキシフェノールに相当する
構造を有しその４位に更にリグニン基本骨格が結合した
フェノール性水酸基を有する化合物が生成する。このよ
うにβ‐アリルエーテル結合の切断により新たにフェノ
ール性水酸基が生成するためリグニンは本発明酵素によ
り引き続き分解を受け反応が進行する。

［問題点を解決するための手段II］なお、天然リグニン中ではβ‐アリルエーテル結合が約
50％存在することから、本発明の酵素がβ‐アリルエー
テル結合を切断することは天然リグニンの分解において
極めて意義がある。

本発明酵素を主要成分とする実施例１（後出）で得た精
製酵素液をブナ摩砕木粉に35℃で３日間反応させたとこ
ろ、リグニン中の遊離フェノール単位の約65％が分離し
ており、全芳香核の約15％が芳香性を失なうような変化
（分解）を受け、アルキルエ−アリルエーテル結合も10
％程度開裂していた。

本発明の酵素は反応に際し、酵素を必要とするが、反応
は大気中より純酵素雰囲気中の方が望ましく振とう、撹
拌することなどにより酵素反応速度を更に高めることが
できる。

また本発明はカワラタケ属に属するアラゲカワラタケか
ら成るリグニン分解酵素オキシダーゼ生産菌を培地に培
養し、培養物から前記性質（１）〜（７）を有するリグ
ニン分解酵素を採取することを特徴とするリグニン分解
酵素の製造方法に存する。

上記菌体の培養形態は、液体培養、固体培養のいずれで
あっても良い。培地の栄養源としては、微生物の培養に
通常用いられているものが広く使用することができる。
炭素源としては同化可能な炭素源であれば良く、例えば
木粉、グルコース、シュークロス、ラクトース、糖蜜な
どが使用される。特にリグノセルロース成分からなる木
粉培地で培養すると本発明のリグニン分解酵素を純度高
く生産することができるため有利である。窒素源として
は利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプト
ン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などが用い
られる。その他、リン酸塩、硫酸、塩、マグネシウム、
カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、マンガン、亜
鉛などの塩類が必要に応じて使用される、特に本酵素は
銅含有酵素であり、銅塩の添加は有効である。

培養温度は菌が発育し、該リグニン分解酵素を生産する
範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは23〜27℃程度が
良い。培養時間は条件によって異なるが、液体培養では
５〜10日間、固体培養は１〜３ヶ月程度である。

次いで、このようにして得られた培養物からリグニン分
解酵素を採取するのであるが、本酵素は主として菌体外
に分泌されるので、本酵素を採取するには、液体培養に
おいては菌体を遠心分離等で除去した培養液、また固
体培養においては培養物から抽出した抽出液を用いて、
酵素含有溶液を濃縮するか、または濃縮することなく可
溶性塩類、例えば硫安などを用いて塩析せしめるか、親
水性溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン、
イソプロパノールなどの添加により本酵素を沈澱せしめ
れば良い。

次いで、この沈澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜
にて透析せしめて低分子量の不純物を除去することがで
きる。また吸着剤あるいはゲル過剤などによるクロマ
トグラフィーにより、リグニン分解酵素を精製する。さ
らにこれらの手段により得られた酵素溶液は減圧濃縮、
限外過膜濃縮、さらに凍結乾燥などの処理により精製
されリグニン分解酵素を得る。

［実施例］以下本発明を実施例によって説明する。

実施例１〔実験１〕グルコース３％、ペプトン１％、KH₂PO₄0.15％、MgSO₄
・7H₂O0.05％、塩酸チアミン0.0002％、CuSO₄・5H₂O0.0
016％を含有する培地（pH5.0）５を10容ジャーファ
ーメンターに入れ、120℃、20分間加熱殺菌した後、ア
ラゲカワラタケ｛コリオラス・ヒルスタス（Coriolus h
irsutus）IFO4917,（K.Aoshima;Ps-4a）｝を接種し28
℃、８日間、150rpm（撹拌速度）。５／分（通気量）
の条件下で培養を行なった。

培養終了後、布で過して除菌し粗酵素液を得た。

次にこの粗酵素液を10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.
0）で緩衝化したDEMEトヨパールカラム（20×5cm）に通
した。酵素は吸着されるので同じ緩衝液で吸着されない
不純蛋白を洗い流した後、30％硫安を含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）で溶出した。活性画分を集め、5
0％飽和硫酸アンモニウムで沈澱する不純蛋白を遠心分
離で除き、70％飽和硫酸アンモニウム沈澱する部分を遠
心分離で集めた。少量の水に溶解し、蒸留水２に対し
透析した。透析外液は１日に数回交換し、一晩透析した
後限外過（Amicon社、PM-10）で濃縮した。60mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.0）を加えて限外過する操作
を２回くり返した後、同じ緩衝液で平衡化したDEAEトヨ
パールカラム（1.5×20cm）にのせた。同じ緩衝液400ml
で洗滌した後、溶出は80mMの同緩衝液で行ない、5mlず
つ分画した。活性のある画分からそれぞれ一部をポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて均一性を検討し、電
気泳動の結果で均一な画分を集めた。この画分はさらに
SDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一性を
確めた。

次に本発明酵素の力価の測定法および性質などについて
述べる。

（１）力価の測定法少量のジオキサンに溶解した0.4mMSOSを含有する200mM
酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）溶液4ml中に本発明酵素
溶液0.4mlを含む反応液を30℃に保温し、290mmにおける
吸光度の増加を測定する。

酵素活性は１分間に0.01の吸光度増加を１単位とする。

（２）本酵素はシリンギルグリセロール‐β‐シリンギ
ルエーテルに作用して、2,6-ジメトキシフェノールを生成する。

（３）シリンガ酸に作用して、カルボキシル基の脱離反
応が起こり、2,6-ジメトキシ‐p-ベンゾキノン、並びに
シリンガ酸のフェノール性水酸基の脱水素反応に伴うラ
ジカルを生成し、引続きラジカル重合による6-メトキシ
‐4-（２′,6′‐ジメトキシ‐４′‐カルボキシフェノ
キシ）ベンゾキノン（1,2）を生成する。

（４）シリンギルグリセロール‐β‐シリンギルエーテ
ルに対して作用するが、シリンギルグリセロール‐β‐
シリンギルエーテルの４位のフェノール性水酸基がメト
キシル基になった化合物に対しては作用しない。

（５）至適pH 50mM酢酸緩衝液（pH3〜5.5）、50mMリン酸緩衝液（pH5
〜９）、50mM Tris-HNO₃緩衝液（pH8〜９）を用いて本
発明酵素に対する酵素活性を測定した結果第３図に示す
通りであってその至適pHは4.0〜5.0付近と認められる。

（６）pH安定性 50mM酢酸緩衝液（pH3〜5.5）、50mMリン酸緩衝液（pH5
〜９）、50mMTris-HNO₃緩衝液（pH8〜９）中に本発明酵
素を50℃で30分間放置し酵素活性を測定した。

その結果は第４図に示す通りであってそのpH安定性はpH
6〜９付近である。

（７）至適温度温度条件を変えて酵素反応を行ない本発明酵素の活性を
測定した結果、第５図に示す通りであってその至適温度
は60℃付近と認められる。

（８）熱安定性 50mMリン酸緩衝液（pH7.0）中、30〜70℃の各温度で本
発明酵素を10分間放置し酵素活性を測定した。

その結果は第６図に示す通りであってその熱安定性にお
いて本発明酵素は50℃まで安定である。

（９）種々の物質の影響種々の物質を添加して本発明酵素の酵素活性を測定した
結果は次の通りである。なお添加濃度は1mMである。

（10）分子量約63,000±5,000〔SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（分子量マーカー;LKB社製、分子量範囲12,300〜7
8,000）にて測定〕（11）等電点は3.5付近である（アンホラインを用い
る等電点電気泳動法により測定）（12）本酵素は銅含有窒素であり、水溶液は深青色を
呈する。

（13）本酵素の作用には酵素を必要とする。

実施例２〔実験２〕実験１のC.ヒルスタスIFO4917の代りにアラゲカワラタ
ケ｛C.ヒルスタスIFO4920｝を用いて、実験１と同じ条
件で酵素液を調製した。得られた酵素は実験１の場合と
同じ性質を示した。

ダグラスファーのチップを常法によりクラフト蒸解し、
蒸解度（カッパ価）30の未漂白パルプを得、該パルプを
多段漂白（CEHED）し、白色度81ポイントの漂白パルプ
を得た。塩素処理後の第一次アルカリ抽出液を5N硫酸で
pH5に調製し、この調製液10mlに実験２で得た酵素液1ml
を加えて37℃で５時間反応を行なった後、2mlをセファ
デックスG-50（径24×250mm）のカラムにのせ、蒸留水
で溶出した。コントロールとして酵素液の代わりに水を
加えたものを同様に行なうと、第７図に示す通り、酵素
処理により分子量約1,000〜5,000のリグニンが低分子化
している。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素反応液のガスクロマトグラム、第２図はピ
ークＩのマススペクトルであり、第３図は至適pH、第４
図はpH安定性、第５図は至適温度、第６図は熱安定性を
示すグラフである。第７図は本発明の酵素をパルプを漂
白廃水に適用した場合のゲル過曲線のグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カワラタケ属に属するアラゲカワラタケか
ら生産され、下記性質を有するリグニング分解酵素（１）作用（ｉ）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエー
テルに作用して、2,6−ジメトキシフエノールを生成す
る。（ii）化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液中に
含まれるリグニンを低分子化する。（２）基質特異性シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテルに対
して作用するが、シリンギルグリセロール−β−シリン
ギルエーテルの４位のフエノール性水酸基がメトキシル
基になった化合物に対しては作用しない。（３）至適pHおよびpH安定性 pH4.5〜5.0付近が至適であり、安定pHは6.0〜9.0であ
る。（４）至適温度および熱安定性 60℃付近が至適温度であり、50℃までの熱に安定であ
る。（５）等電点は3.5付近である。（６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を
呈する。（７）本酵素の作用には酵素を必要とする。
【請求項２】カワラタケ属に属するアラゲカワラタケか
ら成るリグニン分解酵素生産菌を培地に培養し、培養物
から下記性質すなわち（１）作用（ｉ）シリンギルグリセロール−β−シリンギルエー
テルに作用して、2,6−ジメトキシフエノールを生成す
る。（ii）化学パルプ製造の多段漂白工程からの排液中に
含まれるリグニンを低分子化する。（２）基質特異性シリンギルグリセロール−β−シリンギルエーテルに対
して作用するが、シリンギルグリセロール−β−シリン
ギルエーテルの４位のフエノール性水酸基がメトキシル
基になった化合物に対しては作用しない。（３）至適pHおよびpH安定性 pH4.5〜5.0付近が至適であり、安定pHは6.0〜9.0であ
る。（４）至適温度および熱安定性 60℃付近が至適温度であり、50℃までの熱に安定であ
る。（５）等電点は3.5付近である。（６）本酵素は銅含有酵素であり、水溶液は深青色を
呈する。（７）本酵素の作用には酵素を必要とする。を有するリグニン分解酵素を採取することを特徴とする
リグニン分解酵素の製造方法。