JPH0661455B2 - 多糖誘導体によって安定化された脂肪乳剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、医用、食用、その他工業用エマルジョンに関
し、更に詳細には多量に脂溶性物質の包埋ができる多糖
誘導体によって安定化された脂肪乳剤に関する。

（従来の技術） 薬物の運搬体として、アルブミン、フィブリノーゲン、
明血球ゴースト、ゼラチン、デンプン、ポリラクチド、
ポリグリコリド、デキストラン、ポリエチルカーボネー
ト、リボソーム、エマルジョン等、種々のものが考案さ
れているが、その中ではリポソームと0/W エマルジョン
が有望とされている。

リボソームの表面を多糖誘導体で非共有結合性相互作用
により被覆した時、リポソームの構造安定性の得られる
ことが公知となっている（特開昭58−49311、特開昭61
−69801）。

（発明が解決しようとする課題） 近年、薬物の運搬体としてリポソーム、0/W エマルジョ
ンが有望とされているが、そのうち、リポソームは化学
的機械的安定性が悪く長期保存し難いことが欠点であ
る。既に本発明者らが発明したごとくリポソームの外表
面を多糖で被覆することにより、かなりその構造安定性
を向上させることができるが、まだ充分とは言えない。
一方、レシチン、油、水からなる0/W エマルジョンは脂
溶性薬物の運搬体として内包可能な量が多く優れてい
る。しかし、従来開発されてきた脂肪乳剤（リピッドマ
イクロスフェアー）は、コロイド安定性を得るために負
荷荷を帯びたリン脂質を用いて油を乳化させたものであ
り、カルシウムイオン等の存在、脂溶性薬物の内包、系
のpH変化等によって粒子の表面電荷が中和された時、会
融合しやすく、コロイド安定性の点で未だ問題がある。

そこで、本発明者らは、従来の脂肪乳剤の安定性を向上
させるために、リン脂質以外の乳化剤で油を安定に乳化
させることを発案、鋭意研究した結果、リポソームの構
造安定性の向上に効果の認められた多糖誘導体が油も安
定に乳化できることを見出し、多糖誘導体によって安定
化された脂肪乳剤の発明に至った。

本発明の目的は脂溶性物質を多量に内包でき且つ保持で
きるコロイド化学的かつ生化学的に安定な脂肪乳剤を提
供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、糖単位100 個当たり0.5 〜５個の割合でコレ
ステロールで置換された多糖誘導体のみによって乳化安
定化された脂肪乳剤である。

本発明に使用する多糖誘導体は天然または合成由来の多
糖の誘導体を用いることができ、多糖誘導体を構成する
多糖類としては、例えばプルラン、アミロペクチン、ア
ミロース、デキストリン、シクロデキストリン、デキス
トラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン等が
ある。

多糖誘導体は、上記多糖類の水酸基が、糖単位100 個当
たり0.5 〜５個の割合でコレステロールで置換されたも
のであり、この置換度が0.5 未満のものでは安定な脂肪
乳剤が得られず、また置換度が５を越えるものは合成が
困難である。

多糖誘導体として特に好ましいものに、糖骨格の６位ま
たは３位の炭素の１級水酸基が、-OCH₂CONHCH₂CH₂NHR
（式中ＲはＨまたはコレステリルオキシカルボニル基を
表す）で誘導され、かつ該式中Ｒがコレステリルオキシ
カルボニル基である場合に、糖単位100 個当たり0.5 〜
3.0 個置換された多糖誘導体である。

また、多糖類とステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチ
ン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とのエステルである多糖誘
導体も本発明に用いる多糖誘導体として好ましく利用す
ることができる。

さらに、コレステロールを多糖類に直接結合させるに
は、一例を挙げると、コレステロールと多糖類との立体
障害を考慮して、スペーサーとしてエチレンジアミンを
用いる。まず、多糖類の反応性の高い一級水酸基（６
位）をアルカリ条件下、カルボキシメチル化し、更に縮
合剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プ
ロピルカルボジイミド（以下ＥＤＣという）塩酸塩を用
いエチレンジアミンをアミド結合で付加する。最後に無
水系においてコレステリルクロロホルメイトと反応させ
ることによりコレステロール基を導入する。

本発明の脂肪乳剤は前記多糖誘導体の他に、水、油等を
含むことができるが、使用する油としては魚油および大
豆油、ゴマ油、ナタネ油、やし油および綿実油等の植物
油、さらには脂肪酸、脂肪酸エステル、中鎖脂肪酸トリ
グリセライドエステル、およびこれらの混合物が挙げら
れる。

本発明の多糖誘導体と油との比率は、安定なエマルジョ
ンを形成できる比率であれば問題とならないが多糖誘導
体／油＝0.1 〜1.0(wt/wt)が適している。また、水とし
ては、注射用蒸留水、滅菌水などの純水の他、ブドウ糖
液または生理食塩水を使用してもよい。

本発明の乳剤の濃度は高濃度の方が好ましいが、高濃度
になると比重および粘度が高くなり過ぎることから、実
用的には、油／水比で0.01〜0.5(wt/wt)が適している。

本発明の乳剤は、その油相に脂溶性抗癌剤、抗生物質、
ステロイドホルモン、プロスタグランジン等の脂溶性化
合物を多量に溶かすことができ、それらの脂溶性物質の
可溶化剤として利用できる。それ故、本発明の乳剤を薬
物運搬体として用いるときには、静脈注射、動脈注射、
リンパ管内注射、および疾患部位への直接投与が可能で
ある。

即ち、本発明における多糖誘導体は油滴のコロイド化学
的構造安定性の向上とターゲッティング療法に必要な細
胞特異性の発現とに同時に寄与し、薬物運搬体としての
理想的な性質を示す。

生体内において糖鎖は情報伝達メカニズムに関わってお
り本発明に使用する多糖誘導体を構成する多糖の種類を
変えることにより、例えばシアル酸残基の導入、アミノ
糖鎖の導入、糖鎖のリン酸化等によって、これら多糖で
被覆した油滴そのものの細胞認識性を人工的に変えるこ
とが可能になる。更に多糖誘導体に抗体を結合すること
により、抗原−抗体反応によるターゲッティング可能な
乳液を作製することも可能となる 本発明の乳剤の調製には、マントン・ゴーリー型ホモジ
ナイザー等の各種のホモジナイザー機または高出力超音
波発振機の利用が挙げられる。また、乳化後の油滴の粒
径の調整には、ゲル濾過または超遠心分離法等が挙げら
れる。

本発明の乳剤は基本的には多糖誘導体の他に油および水
からなるが、それ以外にグリセリン等の等張剤、および
油に対する抗酸化剤等を添加することも可能である。

（発明の効果） 本発明によれば、脂溶性物質の水への乳化あるいは均一
分散の可溶化が容易になり、特に脂溶化薬物については
多量に可溶化でき、更にターゲット療法が可能となり、
脂溶性薬物に対する理想的な医用リピッドマイクロスフ
ェアーを提供することができる。さらに、乳化安定性の
優れた脂肪乳剤を１工程の乳化で簡便に提供することが
できると共に、この脂肪乳剤はリン脂質や他の乳化剤等
余分の成分を含まないので安全性が高く生体適合性も優
れている。このものは単に脂用性薬物のための運搬体と
してだけにとどまらず、広く食品化学および他の工業に
も応用可能である。

（実施例） 以下、合成例および実施例に基づき本発明を具体的に説
明する。

合成例１ カルボキシメチル化プルランの合成 プルラン（平均分子量50,000）3.0g（1.9×10^-2モル単
糖単位）を200 mlナス型フラスコに入れ、1.35Ｍ−モノ
クロロ酢酸ナトリウム水溶液74mlを加え、プルラン完全
に溶解した。そしてマグネチックスターラー上で撹拌し
つつ、10Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液10mlを加え、さら
に蒸留水16mlを加えた。このとき反応溶液は１Ｍ−モノ
クロロ酢酸ナトリウム、１Ｎ−水酸化ナトリウムとなっ
ている。そのまま、25℃において７時間撹拌反応させ
た。(100単糖単位当たり約10個のカルボキシメチル基が
導入された)。

その後、１Ｍ−リン酸二水素ナトリウム水溶液20ml(1.0
×10^-2モル)を加え、６Ｎ−塩酸水溶液、１Ｎ−塩酸水
溶液を用い、pH７として反応を停止させた。反応溶液を
透析チューブに移し、蒸留水に対し透析を行った。蒸留
水の交換は、１×15回行った。遊離のモノクロロ酢酸
が残っていないことを、透析外液を約100 倍に濃縮し、
ＵＶ測定することにより確認した。収量2.96ｇ(1.8×10
^-2モル単糖単位)。

Ｎ−（２−アミノエチル）カルバモイルメチル化プルラ
ンの合成 前記のようにして得られたカルボキシメチル化プルラン
2.9g(1.8×10^-2モル単糖単位)を200mlナス型フラスコに
入れ、蒸留水40mlを加え、カルボキシメチル化プルラン
を完全に溶解した。そしてマグネチックスターラー上で
撹拌しつつ、 0.1Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液、0.1 −
塩酸水溶液を用い、溶液をpH4.7 に調整した。次にエチ
レンジアミン二塩酸塩 1.6ｇ(1.2×10^-2モル)を加え、
更にＥＤＣ塩酸塩 2.3ｇ(1.2×10^-2モル)を10分間隔で
３回に分けて加え、その都度pHを 4.7に保った。このと
き、反応系における溶質のモル比は、カルボキシメチル
化プルラン：エチレンジアミン：ＥＤＣ＝３：２：２と
なっている。

そのまま25℃、pH4.7 に保ちつつ７時間撹拌反応させ
た。(100単糖単位あたり約３個のＮ−(2−アミノエチ
ル)カルバモイルメチル基が導入されている)。その後、
反応溶液を透析チューブに移し、蒸留水に対し透析を行
った。蒸留水の交換は１×15回行った。遊離のエチレ
ンジアミンが残っていないことを、透析外液を約100 倍
に濃縮し、そのニンヒドリン発色が検出されないことに
より確認した。収量2.81ｇ(1.7×10^-2モル単糖単位)。
Ｎ−〔２−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）エ
チル〕カルバモイルメチル化プルランの合成 Ｎ−(2−アミノエチル)カルバモイルメチル化プルラン
2.7ｇ(1.7×10^-2モル単糖単位)を塩化カルシウム管でシ
ールした還流冷却管を備えた 100mlナス型フラスコに入
れ、無水ジメチルスルホキシド30mlを加え、マグネチッ
クスターラー上で撹拌しつつＮ−(2−アミノエチル）カ
ルバモイルメチル化プルランを完全に溶解した。次に無
水ピリジン２mlを加え、油浴を用いて60〜70℃に加熱し
た。

一方、コレステリルクロロホルメイト0.77ｇ(1.7×10^-3
モル)をサンプル瓶に入れ、無水ジメチルホルムアミド
５mlを加え加熱して、コレステリルクロロホルメイトを
完全に溶解した。そのままコレステリルクロロホルメイ
ト溶液をＮ−(2−アミノエチル)カルバモイルメチル化
プルラン溶液に加えた。このとき、反応系における溶質
のモル比は、Ｎ−(2−アミノエチル)カルバモイルメチ
ル化プルラン：コレステリルクロロホルメイト＝10：１
となっている。

そのまま、60〜70℃に保ちつつ、７時間撹拌反応させ
た。その後、反応溶液は熱いまま、エタノール200 ml中
に滴下し多糖を沈澱させた。多糖を濾取し、蒸留水100
mlに溶解させ蒸留水に対して透析を行った。蒸留水の交
換は１×10回行った。その後、濾過により不純物（濾
紙の繊維など）を除き凍結乾燥した。収量2.03ｇ(1.3×
10^-2モル単糖単位)。単糖単位100個当たりのコレステロ
ールの導入量は^１Ｈ−ＮＭＲ測定による多糖とコレステ
ロールのプロトン積分比から算出した。

このようにして、最終生成物CHP-50-1.9が合成できた。

(CHP：コレステロール修飾プルラン、50：平均分子量
（▲▼＝50,000)、1.9：単糖単位100 個当たりのコ
レステロール置換数をそれぞれ意味する）。

実施例１ 多糖誘導体(CHP-50-1.9)と油（中鎖脂肪酸トリグリセリ
ド：パナセート800 日本油脂(株)製）との比率を変え、
試料１、２、３の乳剤を作製した。乳化の方法はプロー
ブ型ソニケーター(200W，Model UR-200P，トミー製)を
用い、Ｎ_２気流下、70℃で15分間、超音波処理し作製し
た。

実験に用いた多糖誘導体(CHP-50-1.9)は、製造例で得ら
れたプルランのコレステロール誘導体で、プルランの分
子量が５万、100 単糖当たりのコレステロール誘導体の
置換度が1.9である。

また比較のために、未処理のプルランについて同様に乳
剤を作製し、試料４とした。

作製後の乳化の状態を先ず肉眼で評価した。結果を第１
表に示す。試料１、２および３で乳化の状態が良好であ
った。

ＥＳＲ法による乳化液の安定性の評価 第１表中の試料３の１mlの乳化液にＥＳＲプローブであ
る12−ドキシルステアリン酸メチル（以下12−ＮＳとい
う）4.3μｇをプローブ型ソニケーター(200W、Model UR
-200P，、トミー製)を用い、Ｎ_２気流下、70℃で２分間
超音波処理しプローブを可溶化した。

乳化液が不安定な時、油滴が凝集または融合し、しばし
ば水と油とが相分離する。12−NSは油相のみに溶けるの
で、乳化液が安定なとき、12−NSは乳化液中に均一分散
し、ＥＳＲのシグナル強度は常に一定である。しかし、
相分離時、比重の小さい油がＥＳＲ測定管上に浮上し、
ＥＳＲのシグナル強度が低下する。この減少を利用して
12−NSのＥＳＲシグナル強度を経時的に測定することに
より、乳化液のコロイド安定性を評価した。

ＥＳＲ法を用い、第１表記載の試料１、２、３、４の安
定性を比較した。結果を第１図に示す。第１図より、多
糖誘導体／油(wt/wt) 比が0.1 以上では安定な乳剤が得
られることがわかった。

電子顕微鏡による観察 第１表記載の試料３について、透過型電子顕微鏡(JEM-1
00SX，JEOL，25,000倍)にて観察した。試料は酢酸ウラ
ニルで染色後、コロジオン−カーボン膜をコーティング
した銅メッシュ上に固定し観察した。

第２図に、透過型電子顕微鏡写真を示す。粒径0.5 μｍ
以下の油滴が観察できた。更に走査型電子顕微鏡(JSM-T
100，JEOL，7500倍)にて観察した。試料は濾紙（ワット
マンNO.2）に吸着後、グルタルアルデヒド／マラカイト
グリーン液で着色、オスミュウムテトラオキシサイトで
固定し、金蒸着し観察した。粒径0.5 μｍ以下の油滴が
観察できた。

粒度分布の測定 第１表記載の試料３について粒度分布測定装置(NICOMP
370 HPL，Pacific Science社)を用い粒度分布を測定し
た。第３図に結果を示す。本実験下では平均粒径0.3 μ
ｍで粒子サイズの正規分布した乳剤が作製されることが
わかった。

実施例２ 種々の多糖誘導体を用い、実施例１の試料３の組成で乳
剤を作製し、その安定性を肉眼で評価した。

乳化方法は、実施例１と同じである。

用いた多糖誘導体はCHAp-112-2.0（分子量11万２千のア
ミロペクチン、100 単糖当たりのコレステロール置換度
が2.0）、CHD-176-1.7（分子量17万６千のデキストラ
ン、100 単糖当たりのコレステロール置換度が1.7）、C
HP-50-1.9（分子量５万のプルラン、100 単糖当たりの
コレステロール置換が1.9）の３種類である。

結果を第２表に示す。多糖の種類によらず安定な乳剤が
得られた。

実施例３ 種々の油を用い、実施例１の試料３に相当する組成と条
件で剤を作製し、その安定性を肉眼で評価した。

乳化方法は実施例１と同じである。結果を第３表に示
す。用いた油の種類によらず安定な乳剤を作ることが可
能であった。

実施例４ 12−NSをプローブとして内包し、本発明の乳剤と、市販
されているリピッドマイクロスフェアー（イントラリピ
ッド）との安定性をＥＳＲ法により比較した。

本発明の乳剤（３種類）は実施例２の方法で作製した。
結果を第４図に示す。他の市販リピッドマイクロスフェ
アーはプローブとしての12−NSの添加時に不安定とな
り、直ちに相分離するが、本発明による乳剤は３種類と
もすべて安定であった。

実施例５ 本発明による乳剤が血流中へ注射されたとき生理条件下
でのＣａ（II）イオンに対する安定性を考慮し、CaCl₂
が存在する時の本発明の乳剤と市販されているリピッド
マイクロスフェアーとの安定性を実施例４と同様にＥＳ
Ｒ法で比較した。

実験に用いた乳剤（３種類）は実施例２の方法で作製し
た。CaCl₂(5mM)が共存した時の結果を第５図に示す。市
販リピッドマイクロスフェアーはCaCl₂(5mM)の存在によ
り不安定となり、容易に相分離したが本発明の乳液は３
種類とも、CaCl₂存在下でも全て極めて安定であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得た乳剤の安定性を示すＥＳＲシグ
ナル強度図である。 第２図は図面に代わる写真で、実施例１の試料３の乳剤
の粒子構造を示す透過電子顕微鏡写真である。 第３図は実施例１の試料３の粒度分布図である。 第４図は実施例２で得たものと市販品の安定性を比較し
たＥＳＲ図である。 第５図は実施例２で得たものと市販品の安定性をCaCl₂
共存下で比較したＥＳＲ図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖単位100個当たり0.5〜５個の割合でコレ
   ステロールで置換された多糖誘導体のみによって乳化安
   定化された脂肪乳剤。