JPH0659234B2

JPH0659234B2 - 強心配糖体の製造方法

Info

Publication number: JPH0659234B2
Application number: JP4158326A
Authority: JP
Inventors: 敬人行宗
Original assignee: 株式会社ピーシーシーテクノロジー
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 1994-08-10
Anticipated expiration: 2009-08-10
Also published as: JPH061798A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の組織培養により
ジギトキシン、ジゴキシン等の強心配糖体を製造する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ジギトキシン、ジゴキシン等の強心配糖
体は、心筋に対し著しい親和性をもち、その収縮力を強
め、同時に強力な利尿作用を現わすので、心筋興奮性強
心剤、特に欝血性心不全に対するきわめて強力な治療剤
である。これらの強心配糖体はゴマノハグサ科ジギタリ
ス属の２年生植物であるジギタリス（Digitalis purpu
rea）やケジギタリス（Digitalis lanata）の葉に含ま
れているステロイド配糖体であり、天然の又は栽培され
た植物中から抽出して製造されている。しかし天然物を
原料としているため、その生産は天候に左右されるこ
と、収穫時期が限定されていること等が問題となってい
る。そのため、これらの化合物を植物の組織培養によっ
て生産する研究が数多く行われている。R. M. Garve ら
の報告［Planta Med., 40, 92-103(1980)］やM. Hagimo
ri らの報告［Plant & Cell Physiol., 23, 1205-1211
(1982) ］によると、これらの化合物は、分化した茎葉
器官で生産されるが、未分化な培養細胞では、その生産
性が非常に低い。また、茎葉器官においても、天然の植
物葉に比べ非常に低いのが現状である。

【０００３】一方、強心配糖体の生合成に関する研究で
は、植物を用いたトレーサー実験により、メバロン酸由
来のコレステロール、プレグネノロン、プロゲステロ
ン、５β−プレグナン−３，２０−ジオン、５β−プレ
グナン−３β−オール−２０−オン、５β−プレグナン
−３β，１４β−ジオール−２０−オン等が生合成中間
体と考えられている。J.H.C.Lui ら［Phytochemistry,
18, 1913-1916(1979) ］は、培養した茎葉器官にプロゲ
ステロンを添加することにより、ジゴキシンの生産性が
顕著に増大することを見いだしている。しかし、中間体
であってもフィードバック阻害等により必ずしも強心配
糖体の生産性増大に効果があるかどうか不明であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物組織培
養により、強心配糖体を簡便に製造する方法を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、強心配糖体を産生する植物の茎葉器官培養株の
培地中に５β−プレグナン−３，２０−ジオン及び／又
は５β−プレグナン−３β−オール−２０−オンを添加
して組織培養を行うと、強心配糖体の生産性が増大する
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明の強心配糖体の製造方法は、
強心配糖体を産生する植物の茎葉器官培養株の組織培養
培地中に５β−プレグナン−３，２０−ジオン及び／又
は５β−プレグナン−３β−オール−２０−オンを添加
して組織培養を行い、培養物より強心配糖体を採取する
ことを特徴とするものである。本発明の製造方法の対象
となる強心配糖体としては、例えばジギトキシン、ジゴ
キシン、ラナトシドＡ，Ｂ，Ｃ、デスラノシド、ジギコ
リンが挙げられる。

【０００７】本発明の製造方法において組織培養に用い
られる強心配糖体を産生する植物としては、前記強心配
糖体を産生する植物であれば特に制限はなく、例えばジ
ギトキシン、ジゴキシン等の強心配糖体を産生するゴマ
ノハグサ科ジギタリス属のDigitalis purpurea, Digita
lis lanata, Digitalis lutea, Digitalis mertonesi
s, Digitalis ambigua等が挙げられる。

【０００８】前記植物の組織培養は、本発明により５β
−プレグナン−３，２０−ジオン及び／又は５β−プレ
グナン−３β−オール−２０−オンを添加する以外は、
普通の手段によって行うことができる。５β−プレグナ
ン−３，２０−ジオン及び５β−プレグナン−３β−オ
ール−２０−オンは、培地における濃度が0.01〜2mM、
好ましくは0.05〜0.5mM になる量で使用される。

【０００９】本発明で使用される培地は、前記５β−プ
レグナン−３，２０- ジオン及び／又は５β−プレグナ
ン−３β−オール−２０−オンの他に普通の培地成分を
含有する。このような成分として一般に炭素源及び無機
成分が用いられ、これに植物ホルモン類、ビタミン類を
添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加することが
できる。炭素源としては、シュクロース、マルトース、
ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガ
ラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の
２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。

【００１０】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。

【００１１】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA) 、ナフタレン酢酸(NAA)、ｐ−クロロフェノ
キシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-
D) 等のオーキシン類、ベンジルアミノプリン、カイネ
チン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン
類が用いられる。ビタミン類としては、例えばビオチ
ン、チアミン（ビタミンＢ₁）、ピリドキシン（ビタミ
ンＢ₆）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等
が用いられる。

【００１２】アミノ酸類としては、例えばグリシン、ア
ラニン、グルタミン、システイン等を添加できる。一般
に前記の各成分は、炭素源が約１〜約30g/l 、無機成分
が約0.1 μM 〜100mM 、植物ホルモン類が約0.01〜約10
μM 、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約0.1 〜約
100mg/l の濃度で用いられる。

【００１３】本発明の組織培養に用いられる培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962 年) 〔Murashig
e &Skoog 〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965
年) 〔Linsmaier Skoog 〕の培地、ホワイト(1954 年)
〔White 〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg 〕のＢ−５培
地、三井のＭ−９培地等に前記の植物ホルモンを添加
し、更に必要に応じて前記した炭素源、ビタミン類、ア
ミノ酸等を添加して調製される培地を例示できるが、こ
の中でも特にムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製さ
れる培地が好ましい。

【００１４】本発明には液体培地及び寒天やゲランガム
等を通常0.1 〜1 ％含有する固形培地のいずれも使用で
きるが、通常は液体培地が好ましい。本発明の組織培養
においては、前記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花
粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを前
記培地あるいは他の従来の培地によって組織培養して得
られる茎葉器官を使用することができる。茎葉器官を本
発明により５β−プレグナン−３，２０−ジオン及び／
又は５β−プレグナン−３β−オール−２０−オンを添
加した培地を用いて組織培養すると、強心配糖体含量の
増大した培養組織が得られる。この培養組織から、エタ
ノール等の有機溶媒による抽出によって強心配糖体を分
離することができる。

【００１５】本発明の組織培養の好ましい一例として
は、次の方法が挙げられる。先ず、ジギタリス属に属す
る植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子等か
ら採取される植物片を殺菌処理後、寒天で固めたムラシ
ゲ・スクーグの固体培地上に置床し、10〜35℃で７〜30
日程度経過させて組織片の一部より茎葉器官を分化させ
る。このようにして得られた茎葉器官を継代培養すると
生育速度が漸次高まり安定化した茎葉器官が得られる。
この茎葉器官を増殖に適した液体培地、例えばムラシゲ
・スクーグの液体培地に移して増殖させる。液体培地に
おいて更に生育速度が高められる。この安定化した茎葉
器官を、本発明により５β−プレグナン−３，２０−ジ
オン及び／又は５β−プレグナン−３β−オール−２０
−オンを含有する液体培地に添加して培養する。

【００１６】本発明の組織培養における５β−プレグナ
ン−３，２０−ジオン及び／又は５β−プレグナン−３
β−オール−２０−オンの添加時期としては、培養初期
〜１０日目が好適である。本発明の組織培養における培
養温度としては、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃
が好適である。約10℃未満では増殖速度が小さく、約35
℃より高くても同様に増殖速度が小さい。本発明の組織
培養を行うに当たっては、光が必要であり、光の照度は
１０００〜１００００ルクスが好適である。

【００１７】本発明の方法において液体培地を用いた場
合には、培養終了後に培養組織を濾過等の方法によって
培地から分離し、このものから目的とする強心配糖体を
有機溶媒による抽出等の方法によって分離することがで
きる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限
定されるものではない。実施例１インドール酢酸及びベンジルアミノプリンをそれぞれ1p
pmの濃度になるように添加した改変ムラシゲ・スクーグ
の寒天培地（寒天0.8 重量％）に、前もって2％アンチ
ホルミン溶液又は70％エタノール溶液等で滅菌処理した
ケジギタリス（Digitalis lanata）の葉片を置床し、25
℃で明所（１５００〜３０００ルクス）にて静置培養す
ると、カルスが生じた後、一部より茎葉器官が分化し
た。茎葉器官を切取り、３〜４週間毎に継代培養を繰り
返すことにより、安定な茎葉器官培養株を得た。

【００１９】このようにして得られた茎葉器官培養株0.
5g（新鮮重）を、インドール酢酸及びベンジルアミノプ
リンをそれぞれ1ppmの濃度になるように添加した改変ム
ラシゲ・スクーグの液体培地20ml入りの100 容三角フラ
スコに移し、25℃で明所（１５００〜３０００ルクス）
にて振盪培養し、培養２日目に５β−プレグナン−３，
２０−ジオンを0.3mM の濃度になるよう添加し、更に９
日間25℃で振盪培養した。

【００２０】培養終了後、ケジギタリス茎葉器官を濾過
により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定
し、液体培地１Ｌ当りの培養物の生育重量を求めた。得
られた乾燥培養物からエタノール等を用いて強心配糖体
を抽出し、ＥＬＩＳＡ法により強心配糖体含量を測定し
た。その結果を表１に示す。比較例１実施例１において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その
結果を表１に示す。比較例２実施例１において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりにプレグネノロン 0.3mMを２日目に添加した
以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示
す。比較例３実施例１において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりにプロゲステロン 0.3mMを２日目に添加した
以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示
す。比較例４実施例１において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりに５α−プレグナン−３，２０−ジオン 0.3
mMを２日目に添加した以外は該実施例と同様に操作し
た。その結果を表１に示す。実施例２実施例１において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの濃度を0.15mM、添加時期を１０日目に変更し、更に
１１日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表１に示す。実施例３実施例２において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりに５β−プレグナン−３β−オール−２０−
オン 0.15mM を１０日目に添加した以外は該実施例と同
様に操作した。その結果を表１に示す。比較例５実施例２において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その
結果を表１に示す。比較例６実施例２において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりにプロゲステロン 0.15mM を１０日目に添加
した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１
に示す。比較例７実施例２において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりに５α−プレグナン−３，２０−ジオン 0.1
5mM を１０日目に添加した以外は該実施例と同様に操作
した。その結果を表１に示す。比較例８実施例２において、５β−プレグナン−３，２０−ジオ
ンの代わりに５α−プレグナン- ３β- オール- ２０-
オン 0.15mM を１０日目に添加した以外は該実施例と同
様に操作した。その結果を表１に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【発明の効果】本発明の組織培養による強心配糖体の製
造方法を採用すれば、従来法に比べて強心配糖体を大量
に効率よく生産することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 33/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】強心配糖体を産生する植物の茎葉器官培
養株の組織培養培地中に５β−プレグナン−３，２０−
ジオン及び／又は５β−プレグナン−３β−オール−２
０−オンを添加して組織培養を行い、培養物より強心配
糖体を採取することを特徴とする強心配糖体の製造方
法。
【請求項２】強心配糖体を産生する植物がジギタリス
属植物であることを特徴とする請求項１記載の方法。