JPH06501614A

JPH06501614A - 組換えｐｃｒ法を用いるキメラ抗体の調製

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Publication number: JPH06501614A
Application number: JP3516456A
Authority: JP
Inventors: クロウ、ジェイムズ・スコット; ルウイス、アラン・ピーター
Original assignee: ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド
Priority date: 1990-10-10
Filing date: 1991-10-08
Publication date: 1994-02-24
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: DK0552266T3; WO1992007075A1; JP3516950B2; EP0552266B1; EP0552266A1; GB9022011D0; DE69131930D1; ES2143466T3; ATE188995T1; DE69131930T2; US5858725A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】この発明はキメラ抗体の調製に関する。この発明は、典型的には、ヒト化抗体（ｈｕｍａｏｉｓｅｄ　ａ＋ｕｉｂｏｄｉｅ＋）の産生に適用可能である。

抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって互いに連結する２つのＨ鎖および２つのＬ鎖を含む。各り鎖はジスルフィド結合によって各々のＨ鎖に連結している。各Ｈ鎖は、その一端に、可変部ドメイン、それに続く多数の定常部ドメインを有する。各り鎖は、その一端に可変部ドメイン、および他端に定常部ドメインを有してる。このＬ鎖可変部ドメインは、Ｈ鎖の定常部ドメインに並列している。Ｌ鎮定常部ドメインは、Ｈ鎖の第１定常部ドメインに並列している。Ｌ鎖およびＨ鎖の定常部ドメインは、抗体の抗原への結合には直接は影響しない。

Ｌ鎖およびＨ鎖の多対の可変部ドメインは、抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖およびＨ鎖のこれらドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が比較的保全され、３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）によって結合された、４つの領域からなるフレームワークを含む。４つのフレームワーク領域は主としてβ−シート構造をとり、ＣＤＲ５はこのβ−シート構造に結合し、時にはその一部を形成するループを形成する。ＣＤＲ５はフレームワーク領域により非常に接近して保持され、他方のドメインからのＣＤＲ５と一緒に、抗原結合部位の形成に寄与する。抗体のＣＤＲ５およびフレームワーク領域は、にａｂ［ら（“５ｅｑｕｓｏｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅｍｌ　１ｎｔｅｎｓｆ”　ＬＩＳ　Ｄｅｐ＋、ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ＨｕｍａｎＳｓｔｖ：ｃｔ＋、　υＳ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒ１ｎｆｉＢ　０ｆｌｉｃｓ、１９８７　）を参照することにより決定することができる。

ＣＤＲ５が可変部ドメインフレームワーク領域とは異なる種に由来する改変抗体（ｘｌｆｓ＋ｓｄ　ｕｆｉｂｏｄ７）の調製がＥＰ−Ａ−０２３９４００に開示されている。ＣＤＲ５はラットもしくはマウスのモノクローナル抗体であってもよい。改変抗体の可変部ドメイン、および定常部ドメイン、のフレームワークは、ヒト抗体由来であってもよい。そのようなヒト化抗体は、ヒトに投与された場合に、ラットもしくはマウス抗体に対するヒトの免疫応答と比較して、無視し得る免疫応答しか誘発しない。ヒト化ＣＡ　Ｍ　Ｐ　Ａ　Ｔ　Ｈ−１抗体がＥＰ− Ａ−０３２８４０４に開示されている。

「オーパーラ’７ブ伸長（ｏｖｅｒｌｉｐ　！ｘｔｅｎｓｉｏａ　）　Ｊの技法には、テンプレート・ヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドブライマーの使用および重複末端を有するＤＮＡ断片を生成するポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）が含まれる。これらの断片は、各鎖の３′重複を相補鎖の３′伸長のプライマーとして機能させることを可能にする重複のヌクレオチド変更の組み込みによるヌクレオチド配列への特定の改変の導入にこの技法を用いることを記述している。

部位指向（ｔｉｆｅ−ｄｉｕｃｔｅｄ　）変異生成であるこの技法を使用して、マウス主要組織適合遺伝子複合体クラス−！遺伝子のそれらの変異を生成させ、クローニングし、分析する。

Ｂｏｒｆｏｎら（Ｇｒｎｅ、　７７．６１−６８　（１９８９））は、重複伸張による遺伝子スプライシング（ＳＯＥ）の技法を記述している。この技法は、プライマーＡ、ＢＳＣおよびＤを用いるＰＣＲによって生成される２つのＤＮＡ片、ＡＢおよびＣＤ、を結合させることによる、ハイブリッド長さのＤＮＡ、ＡＤ、の生成を可能にする。プライマーＢおよびＣの少なくとも一部は、互いに相補的である。ＰＣＲによって生成した断片ＡＢおよびＣＤは、ポジ鎖（ｐｏｓｉ＋ｉｖｔ　５ｊｒｘｎｄ　）であるＡＢがネガ鎖（ｎＢａｌｉｖｅ　ｔｆｒａｎｄ　）であるＣＤのアニールを可能ならしめるよう混合される。ＢＣ間の重複は２本の鎖が互いの伸長を開始させることを可能にする。プライマーＡおよびＤは、伸長した鎖のＰＣＲ反応の開始に用いられる。

マウスＨ−２Ｋ　の一部（ＣＤ）の、Ｈ−２Ｌ’遺伝子の対応する上流および下流部分である上流および下流領域（それぞれＡＢおよびＥＦ）間への結合に、上記技法が用いられた。これら全ての断片、ＡＢ、、ＣＤおよびＥＦは、プライマーＡないしＦを用いるＰＣＨにより生成された。３種の断片は、最初に断片ＡＤ（すなわち、ＡＢ−ＣＤ）　、次いで生成物ＡＦ（すなわち、ＡＢ−ＣＤ−ＥＦ）を生成するＳＯＥを２回行なうことにより、結合させた。

この発明によると、第１抗体のＣＤＲが第２抗体のフレームワーク領域間に結合されるキメラ抗体の製造方法が創案されている。

一般に、この発明の技法は、２種のフレームワーク領域、ＡＢおよびＣＤ、およびそれらの間にドナーＣＤＲによって置き換えられるＣＤＲを含むテンプレートを用いて行なわれる。プライマーＡおよびＢはフレームワーク領域ＡＢの増幅に用いられ、プライマーＣおよびＤはフレームワーク領域ＣＤの増幅に用いられる。しかしながら、プライマーＢおよびＣもまたそれらの５′末端に、ドナーＣＤＲ配列の全てもしくは少なくとも一部に対応するさらなる配列を有している。プライマーＢおよびＣは、ポリメラーゼ・チェインφリアクション（ＰＣＲ）を実施し、それにより全てのドナーＣＤＲ配列を組み込むことを可能にする条件下において、互いにそれらの５′末端のアニーリングを可能にするに十分な長さて重複する。増幅された領域ＡＢおよびＣＤは、単一反応においてＳＯＥを行ない、キメラ生成物を生成させることもできる。

この発明の１つの面によると、抗体鎖もしくはそれらの断片をフードし、この抗体鎖の可変部領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも１つが第１の哺乳動物抗体に由来し、かつ可変領域のフレームワークが第２の異なる哺乳動物抗体に由来するものである、下記式で表わされる二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡの製造方法であって、５−Ｆｌ−Ｍ−Ｆ２　１’ ここで、Ｍは第２の抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡを含み、かつＦｌおよびＦ２はＭの側方に位置する配列をコードし、（１）　下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡテンプレートを調製し、５−ｆｌ−Ｈ−ｆｌ　３− ここで、ＨはＭとは異なる特異性のＣＤＲをコードするＤＮＡを含み、かっｆｌおよびｆｌは各々Ｆ１およびＦ２に実質的に相同であり、（ｉ　ｉ）　Ｄ　Ｎ　ＡオリゴヌクレオチドプライマーＡ％ＢＳＣおよびＤを得、ここで、Ａは、Ｆｌの５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配列Ｆｌの対応長さに等しい配列ａｌを含み、Ｈに向かって５′から３′の方向に指向し；Ｂは、配列ｂｌはＭの対応長さに相補的であり、かっＭの５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、ｂ２はＦｌにおける対応長さの配列に相補的であり、かつＦｌの３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｃは、配列５−ｃ’　−Ｃ２３− からなり、ここで、Ｃ１は、Ｍの対応長さに等しく、かつＭの３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、Ｃ２は、Ｆ２における対応長さの配列に等しく、かっＦ２の５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｄは、Ｆ２の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつＦ２の対応長さに相補的である配列ｄ１を含み、およびＨに向かって５′から３′の方向に指向し；並びに、ｂｌおよびｃｌは、ＰＣＲを実施可能な条件下において、それらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複しており、（１目）所望の順番で、プライマ一対Ａ、ＢおよびＣ，Ｄを用いて、上記（１）において調製されるテンプレートに対するＰＣＲ反応を行ない、および（１ｖ）　上記（目１）において得られる生成物を混合し、プライマーＡおよびＤを用いてＰＣＲ反応を行なう、ことを包含する方法が提供される。

オリゴヌクレオチドは都合のよい大きさであればよい。

好ましくは、ＦｌおよびＦ２は、各々少なくとも１種のヒト抗体フレームワーク領域をコードし、さらに、任意に、ＣＤＲ５をコードする。好ましくは、Ｈは前記第１抗体のＣＤＲをコードする。好ましくは、Ｍは、非非とＣＤＲ領域をコードし、最も好ましくは、ネズミ科動物もしくは鰯歯類動物ＣＤＲをコードする。

プライマーＡおよびＤは、通常少なくとも１２、例えば少なくとも１５ヌクレオチド、より一般的には２０ないし３０ヌクレオチドの長さである。所望であれば、プライマーＡおよびＤは、それらの５′末端ヌクレオチド内に少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができる。プライマーＢおよびＣは、通常少なくとも２０、例えば少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。より一般的には、これらのプライマーは４０をこえ、例えば４５ないし６０ヌクレオチドの長さである。

一般に、２００ヌクレオチド長さまでのオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。したがって、一般にプライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、各々１５ないし２００ヌクレオチド長さである。

■ ｂ　およびＣ１の間の重複の長さは、ＢおよびＣの全長並びに重複領域の特定の塩基組成を含む多数の因子に依存し得る。しかしながら、重複は通常少なくとも１２、例えば少なくとも１５ヌクレオチドである。実施！Ｂ様の１つによると、プライマーＢおよびＣ内の配列ｂ　およびｃｌは、同じ数のヌクレオチド長さである。この発明の好ましい態様によると、ｂ　およびｃｌは両者ともにＭの長さであり、そのため、重複ちまたこの長さである。

通常、プライマーＡの３′末端とＨの５′末端との距離は少なくともＩ５ヌクレオチドである。より一般的には、この距離は、ｆｌの長さからＡそれ自身の長さを減じたものである。同様に、Ｄの３′末端と領域Ｈとの距離も少なくとも１５ヌクレオチドであり、より一般的には、ｆｌの長さからＤそれ自身の長さを減じたものである。実施態様の１つによると、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤの各々の配列ａｌ、ｂ２、Ｃ２およびｄｌは、それぞれ１５ないし３０ヌクレオチドの長さである。

Ｍ、並びにＦｌおよびＦ２の５′および３′領域の全配列が、プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤの配列によって決定されることは認識されるであろう。

したがって、この状況において、これらのプライマーと配列Ｆｌ　、ＭまたはＦ２のどの一部とでもあっても、その間の「相同性」に言及することは適当ではないと考えられる。その代わり、ここで用いられるように、「対応長さくｃｏｒｒｅｓｐ。

ｎｄｉｎｇ　ｌｅｎｇｔｈ）　Ｊという用語が、ヌクレオチド数が等しく、かつ同一の（または相補的な）配列を有する配列を意味する。

上記（ｉ）に関して、配列ｆ１およびＲ２はＦｌおよびＦ２の各々に実質的に相同であり、ここでは、プライマーＡないしＤは、これらのプライマー配列の領域内でのｆｌおよびＲ２への小変更の導入に用いることができる。

領域ＦｌおよびＦ２は、ＣＤＲＭのいずれかの側方のフレームワーク領域の少なくとも一部をコードするＤＮＡを含む。ＦｌおよびＦ２はこれらの配列の側方に位置する領域、例えば、さらなるＣＤＲ５をコードするＤＮＡの内部もしくはそれをこえた領域をコードしてもよい。

他の面によると、この発明は、下記配列からなる、長さが３０ないし＋１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。

５−ｏｌ−Ｒ２３− （ここで、Ｏｌは非ヒト起源のＣＤＲ領域の少なくとも１５ヌクレオチドの配列を含み、かつ０２はヒト起源のフレームワーク領域の少なくとも１５ヌクレオチドを含む）このオリゴヌクレオチドは、上述の方法におけるプライマーとしての使用に適している。

さらなる面によると、この発明は、抗体鎖もしくはそれらの断片をコードし、この抗体鎖の可変部領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）が第１の哺乳動物抗体に由来し、かつ可変部ドメインの４つのフレームワーク領域が第２の異なる哺乳動物抗体に由来するものである、下記式で表わされる二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡの製造方法であって、５１１−Ｍｌ−Ｆ２−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ３−Ｒ４３−ここで、ＭＩ　ＳＲ２およびＲ３は第２の抗体のＣＤＲをコードす；５ＤＮＡを含み、かっＦｌ、Ｆ２、Ｒ３およびＲ４はｃＤＲｓ　Ｍｌ、Ｒ２およびＲ３の側方に位置するフレームワーク配列を含み、（１）　下記式で表わされる一本鎖もしくは二本ｇＤＮＡテンプレートを調製し、５−ｆｌ−Ｈｌ−Ｒ２−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ３−Ｒ４３−ここで、Ｈｌ　、Ｒ２およびＲ３はＭｌ　、Ｒ２およびＲ３とは異なる特異性のＣＤＲ５をコードするＤＮＡを含み、がっｆｌ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々Ｆｌ、Ｆ２、Ｒ３およびＲ４と実質的に相同であり、（ｉｉ）　ＤＮＡオリゴヌクレオチドブライ？−Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ。

Ｅ、ＦｌＧおよびＨを得、ここで、Ａは、Ｆｌの５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配列Ｆ１の対応長さに等しい配列ａ１を含み、ｆ（１に向かって５′から３′の方向に指向し；Ｂは、配列５−ｂ’−ｂｌ　３− からなり、ここで、ｂｌはＭｌの対応長さに相補的であり、かっＭｌの５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、ｂｌはＦｌにおける対応長さの配列に相補的であり、かつＦｌの３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｃは、配列ｃｌは、Ｍｌの対応長さに等しく、かつＭｌの３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、Ｃ−は、Ｆ２における対応長さの配列に等しく、かつＦ２の５ ′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を育し；Ｄは、配列５−ｄ’−ｄｌ　３− からなり、こ二で、ｄＩは、Ｒ２の対応長さに相補的であり、かつ〜１２の５′末端に相補的な３′ 末端を存する配列を含み、ｄｌは、Ｆ２における対応長さの配列に相補的であり、かつＦ２の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｅは、配列ｅｌは、Ｒ２の対応長さに等しく、かつＲ２の３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、Ｒ２は、Ｒ３における対応長さの配列に等しく、かっＲ３の５ ′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｆは、配列ｆｌは、Ｒ３の対応長さに相補的であり、かっＲ３の５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、Ｒ２は、Ｒ３における対応長さの配列に相補的であり、かつＲ３の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｇは、配列ｇｌは、Ｒ３の対応長さに等しく、かっＲ３の３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、ｇｌは、Ｒ４における対応長さの配列に等しく、かっＲ４の５ ′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｈは、Ｒ４の３′末端に相補的な５″末端を有し、かっＲ４の対応長さに相補的である配列ｈｌを含み、およびＲ３に向かって５′から３′の方向に指向し；並びに、対ｂ１およびｃｌ、ｄｌおよびｅｌ、およびｆｌおよびｇｌは、ＰＣＲを実施可能な条件下において、それらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複しており、（１目）所望の順番で、プライマー対Ａ％Ｂ、Ｃ％Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ、Ｈを用いて、上記（ｉ）において調製されるテンプレートに対するＰＣＲ反応を行ない、ＤＮＡ断片ＡＢ％ＣＤ。

ＥＦおよびＧＨを得、（１ｖ）　上記（ｉｉｉ）において得られる断片を結合させ、所望のＤＮＡを得る、ことを包含する方法が提供される。

実施態様の１つによると、Ｆ４はＣＤＲＭ３の側方に位置するフレームワーク配列および抗体鎖の定常部領域の全てもしくは一部をコードするＤＮＡを含む。

工程（１ｖ）は、（ｉｖａ）　断片ＡＢおよびＣＤをプライマーＡおよびＤと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＡＤを得；（ｉｖｂ）　上記工程（ｉｖａｌ　の前、その間またはそれに続いて、断片ＥＦおよびＧＨをプライマーＥおよびＨと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＥＨを得、並びに（ｉｖｃ）　断片ＡＤおよびＥＨをプライマーＡおよびＨと混合し、所望のＤＮＡを得る、ことにより行なうこともできる。

変わりに、工程（１ｖ）は、（ｉｖｘ）　断片ＣＤおよびＥＦをプライマー〇およびＦと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＣＦを得、並びに（ｉｖｌｒｌ）断片ＡＢおよびＣＦをプライマーＡおよびＦと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＡＦを得、かつ（ｉｖｃ −１１断片ＡＦおよびＧＨをプライマーＡおよびＨと混合し、所望のＤＮＡを得るか、あるいは（ｉｖｂ−２１断片ＣＦおよびＧＨをプライマー〇およびＨと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＣＨを得、かつ（ｉｖｃ−２）断片ＡＢおよびＣＨをプライマーＡおよびＨと混合し、所望のＤＮＡを得る、ことにより行なうこともできる。

図面の簡単な説明図１は、この発明による方法を説明する。黒塗りのボックスは、ＣＡＭＦＡＴＩ！抗体のフレームワーク領域の間に挿入され、本来のＣＤＲ（白抜きのボックス）に置き換わる、ネズミ科動物のＣＤＲ領域からのＤＮＡ配列を示す。Ａ、、Ｂ、ＣおよびＤは、用いられたＰＣＲプライマーを、それらの５′から３′への方向を示す半矢印（ｈｘｌｆ−ｕｒｏｖ）と共に示す。

図２は、図１に示される方法に関わるキー配列を詳細に示す。

図３は、この発明の方法が、抗体の３つのＣＤＲ領域の全ての置き換えにどのように用いられ得るのかを模式的に示す図。

図４は、二の発明に用いることができるプライマーの１つの取合わせをさらに詳細に説明する。

ＦｌおよびＦ２　ＤＮＡ領域における可能な変異は、図１および３に説明されるこの発明の態様を対比することにより明らかである。

図１において、車−のＣＤＲＤＮＡの置換を示すこの発の５′末端から始まり、 “Ｄ”の５′末端の補足物までである。

この領域は、全体で、３つのフレームワーク領域、２つのＣＤＲ５およびプライマーＤ内の停止コドンを組み込んでいる全Ｈ鎖定常部領域をコードする。対称的に、５′からＣＤＲまでが置換されたＦｌのＤＮＡは、単一のフレームワークを含み、ＣＤＲ５は有していない。

図３において、プライマー′Ｃ＃および“Ｄ”の間のＤＮＡは、単一のフレームワーク領域をコードする。これは、図示される方法が、抗体の可変部類域をコードするＤＮＡの３つのＣＤＲ５の全ての置換を示すためである。この取合わせに関して、プライマー゛Ｄ”はｄｌの配列だけではなく、第２のＣＤＲ領域の一部をコードするさらなる５′配列をも含むことに注意すべきである。

抗体鎖の３つのＣＤＲ５の全てをコードするＤＮＡが置換される場合には、図３の取合わせを用いることができる。

したがって、４種のプライマー“Ａ”、Ｂ″、“Ｃ″および“Ｄ”　（Ａ、Ｂ、、ＣおよびＤに対して上で定義した通り）からなる第１セツトが、全ての第１ＣＤＲ（ＣＤＲＩ　）および第２ＣＤＲ（ＣＤＲ２）の少な（とも一部の置き換えに用いられる。プライマー”Ｅ”、′Ｆ”、′Ｇ”およびＨ”（各々Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと同様の定義）からなる第２セツトが、第３ＣＤＲ（ＣＤＲ３）およびＣＤＲ２の少なくとも一部の置き換えに用いられる。ＣＤＲ２の置換を確実にするために、プライマー′Ｄ１および“Ｅ”はＰＣＨの実施を可能にする条件下においてそれらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複しなければならない。本質的に、ＣＤＲ２の置き換えは、各々ＡＳＢ、ＣおよびＤと同様に定義されている４種のプライマー″Ｃ”、“Ｄ”、“Ｅ”および“Ｆ’のセットにより達成される。

図３に図示されるこの発明の態様において、断片ＡＢおよびＣＤがアニールされて断片ＡＤが得られ、断片ＥＦおよびＧＨが結合して断片ＥＨが得られる。最後に、ＡＤがＥＨと結合して、３つのＣＤＲ５全てが置き換えられた可変部類域をコードする断片ＡＨが得られる。

それにより、可変部類域をコードするＤＮＡにおいて、図３に図示されるようなプライマー“Ａｏないし“Ｈ“を用いて、３つのＣＤＲＤＮＡの全てを置き換え得る他の取合わせには、図３（１）に示されるようにプライマー対“Ａ”十′Ｂ ”、“Ｃ”＋“Ｄｏ、“Ｅ”十゛Ｆ″および“Ｇ”＋“Ｈ”を用いて反応を行ない、断片ＣＤおよびＥＦを一緒に結合させて断片ＣＦを生成させ、およびこの断片を第１断片ＡＢ、次にＧＨ，またはその逆のいずれかで結合させることが含まれる。

その代わりに、３つのＣＤＲ５をコードするＤＮＡは連続的に置き換えることもできる。プライマー“Ａ”、“Ｂ”、“Ｃ”および“Ｈ”を用いる第１反応（図３に示す通りであり、プライマーＡないしＤと同様の定義）を、この発明に従ってＣＤＲＩの置き換えに用いることができる。プライマー“Ａ”、“Ｅ“、“Ｄ゛および′Ｈ”を用いる反応からなる第２セツト（図３に示す通りであり、プライマーＡないしＤと同様の定義）はＣＤＲ２を置き換える。プライマー“Ａ”、 “Ｆ”、“Ｇｏおよび“Ｈ”を用いる反応からなる最後のセットはＣＤＲ３を置き換える。

プライマーＡおよびＤは、それらの５′末端に、例えばｆｌまたはＦ２には表現されない制限エンドヌクレアーゼ認識配列を表わすさらなる配列を有していてもよい。

ＡおよびＤの配列、５′からａｌおよびｄｌは、ｆｌとＦｌおよびＦ２とＦ２との間の相同性の程度を考慮する場合、無視される。同様に、Ｆｌおよび／またはＦ２がそれぞれｆｌおよび／またはＦ２よりも短かければ、相同性の程度を測定する際に、Ｆｌ　／Ｆ２に対になる相手が存在しないｆｌ／ｆ２のさらなる配列も無視される。

全てのプライマーには、ｆｌ／ｆ２配列および対応する、もしくは相補的なプライマー配列との間に、２ないし５のヌクレオチド不適合のような数、例えばｌないしｌＯが含まれていてもよい。これらの不適合は、ｆｌおよびＦ２と比較したときに、ＦｌおよびＦ２の配列における所望のコーディング変更の設計に用いることかできる。

この発明の方法は、ＣＤＲ領域のいずれか１つが置き換えられているキメラ抗体またはそれらの断片の製造に用いることができる。また、これは、抗原結合領域のＣＤＲ領域のいずれか２つ、もしくは３つ全ての置き換えにも用いることもできる。

この発明の方法は、完全抗体りもしくはＨ鎖の１以上のＣＤＲ５をコードするＤＮＡの置き換えに用いることができる。

少なくとも１つのＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ断片を用いてもよい。例えば、ＬもしくはＨ鎖の一方もしくは両方をコードするＤＮＡがこの発明の方法により処理されている、ＦａｂＳＦ　（ａｂ）２またはＦｖ断片のような抗体断片を製造することが可能である。

抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ５をコードするＤＮＡはしばしばベクター、例えば発現ベクター内に存在する。

幾つかのケースでは、プライマーＡおよびＤ（または少なくともそれらの領域ａ　およびｄ、）の一方もしくは両方が、置き換えられているＣＤＨの側方に位置するフレームワーク領域の１つの配列よりも、むしろベクター配列に対応することが必要であるか、もしくは望ましい。

この発明によって製造されたＤＮＡは、適切な複製もしくは発現ベクターにクローンし、バクテリア、イースト、昆虫または哺乳動物細胞に導入してキメラ抗体を製造することができる。適切な発現系の例を以下に記載する。

抗体鎖は相補的抗体鎖と共に共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｓｄ）　シ得る。少なくとも、相補釣鐘の可変部領域および／または各定常部領域のフレームワークは、一般に、前記第２の種に由来するものである。Ｌ鎖およびＨ鎖は共発現し得る。いずれか、もしくは両方の鎖は、この発明の方法により調製されている。

好ましくは、両鏡のＣＤＲ５は選択された同一の抗体に由来する。両発現鎖を含む抗体を回収することができる。

抗体は、天然抗体またはそれらの断片の構造を有していることが好ましい。したがって、抗体には、完全抗体、（Ｆｉｂ’）　２断片、Ｆａｂ断片、Ｌ鎖二量体またはＨ鎖を含みｆ尋る。抗体は、Ｉ　ｇＧｌ　、Ｉ　ｇＧ２．１ｇＧ３もしくは１ｇＧ４のようなＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤてあってもよい。その代わりに、抗体は、ＷＯ３６１０１５３３に記載されている型のキメラ抗体であってもよい。

ＷＯ３６１０１５３３によるキメラ抗体には、抗原結合領域および非免疫グロブリン領域が含まれる。この抗原結合領域は、抗体り鎖可変部領域またはＨ鎖可変部領域である。典型的には、キメラ抗体は、ＬおよびＨ鎖可変部領域の両者を含む。

非免疫グロブリン領域は、そのＣ末端で抗原結合領域に融合している。非免疫グロブリン領域は、典型的には、非免疫グロブリンタンパク質であり、酵素領域、公知の結合特異性を有するタンパク質由来の領域、タンパク毒由来の領域、または実に遺伝子によって発現したいかなるタンパク質に由来する領域であってもよい。キメラ抗体の２つの領域は、切断可能なリンカ−配列によって接続されていてもよい。

この発明は、抗体、典型的にはモノクローナル抗体、例えばラットまたはマウス抗体のヒト化に好ましく用いられる。

したがって、得られた抗体のフレームワークおよび定常領域は、抗体のＬおよび／またはＨ鎖のＣＤＲ５がラットもしくはマウスＣＤＲ５であるにもかかわらず、ヒトフレームワークおよび定常領域である。好ましくは、全てのＣＤＲ５はラットまたはマウスＣＤＲ５である。この発明に従って製造される抗体は、ラットまたはマウスＣＤＲ５をのせたＩｇＧ１゜１ｇＧ２．１ｇＧ３．１ｇＧ４のようなヒトＩｇＧ、ＩｇＭ。

ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤであり得る。

この発明の方法は、得られるキメラ抗体が、ＣＤＲ領域（複数）の起源である非ヒト抗体の抗原結合能力を保持するような方法で行なわれる。

出発抗体は、典型的には、選択された特異性を有する抗体である。この特異性の保持を確実にするために、この抗体の可変部領域フレームワークは、最も近い他の種の抗体の可変部領域フレームワークであることが好ましい。「概ね最も近い」とは、アミノ酸配列に関して概ね最も相同性が高いことを意味する。２つの可変部領域の間で、少なくとも５０％の相同性があることが好ましい。

この発明による方法によってヒト化抗体を製造するための４つの一般的な工程がある。

（１）出発抗体りおよびＨ鎖可変部領域のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列の決定；（２）キメラ抗体の設計、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をこの方法で用いるかの決定；（３）オリゴヌクレオチドＡ、ＢＳＣおよびＤの同定、およびヒト化抗体をコードするＤＮＡを製造するための一連のＰＣＲ反応におけるこれらのプライマーの使用；並びに（４）このＤＮＡの適切な宿主細胞系への形質導入およびヒト化抗体の発現。

これら４つの工程を、抗体のヒト化に関連して以下に説明する。しかしながら、それらは、非ヒト種の抗体に改変する場合にも等しく良好に適用可能である。

１望１：抗体りおよびＨ鎖可変部領域のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列の決定キメラ抗体を作製するために、抗体のＨおよびＬ鎖可変部領域のアミノ酸配列のみを知る必要がある。定常部領域の配列は、これらがヒト化策に寄与しないので、無関係である。

抗体の可変部領域アミノ酸配列を決定する最も簡単な方法は、ＨおよびＬ鎖可変部領域をコードするクローン化ｃＤＮＡからのものである。

与えられた抗体のＨおよびＬ鎖可変部領域ｃＤＮＡをクローニングする２つの一般法：（１）通常のｅＤＮＡライブラリーから、または（２）ＰＣＲによる方法が存在する。これら両者の方法は広く知られている。ＣＤＮＡのヌクレオチド配列が与えられれば、この情報を抗体可変部領域の予想されるアミノ酸配列に翻訳することは簡単なことである。

工程２：キメラ抗体の設計ヒト化の工程でどのヒト抗体配列を用いるかを決定するにあたり、考慮すべき幾つかの因子がある。ＬおよびＨ鎖のヒト化は互いに独立に考慮されるが、その議論の道筋は基本的には互いに似ている。

この選択工程は、以下の根拠に基づいている：与えられた抗体の抗原特異性および親和性は、主として、可変部領域ＣＤＲ５のアミノ酸配列によって決定される。可変部領域フレームワーク残基はほとんど、もしくは直接は寄与しない。フレームワーク領域の主な機能は、ＣＤＲ５を、抗原を認工するための正しい空間方位に保持することである。このため、ヒト可変部領域フレームワークへの鰯歯類動物のＣＤＲ５の置換は、ヒト可変部領域がそれらの起源である鰯歯類動物の可変部領域と高い相同性を有している場合に、それらの正確な空間方位が最も保持される結果となるようである。したがって、好ましくは、ヒト可変部領域は奮歯類動物の可変領域（複数）と高い相同性を有するものが選ばれるべきである。

適切なヒト抗体可変領域配列は以下のようにして選択することができる：１、コンピュータ・プログラムを用い、全ての利用可能なタンパク質（およびＤＮＡ）データベースを、鰯歯類動物の抗体可変部領域と最も相同のヒト抗体可変領域配列について検索する。適切なプログラムの出力は、鰯歯類動物の抗体と最も相同な配列、各配列の相同性のパーセント、および鰯歯類動物の配列に対する各配列のアラインメントのリストである。これは、ＨおよびＬ鎖可変部領域の両方について独立に行なわれる。上記分析は、ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれている場合には、より簡単に遂行される。

２、ヒト抗体可変部領域配列を挙げ、相同性の比較を行なう。

最初に、非常に変わりやすいＨ鎖のＣＤＲ３を除いて、ＣＤＲ５の長さについて比較を行なう。ヒトＨ鎖並びににおよびλＬ鎖はサブグループに分けることができる：Ｈ鎖３サブグループ、に鎖４サブグループ、λ鎖すブグループ６サブグループ。各サブグループ内のＣＤＲの大きさは似ているか、サブグループ間で変化する。通常、相同性の第１の近似値として、諺歯類動物Ａｂ　ＣＤＲをヒト−サブグループと合わせることができる。その後、同じ長さのＣＤＲ５を有する抗体のアミノ酸配列相同性について、特にＣＤＲ５内、しかしそれだけではなく周囲のフレームワーク領域においても、比較を行なう。最も相同のＣＤＲ５を有するヒト可変部領域をヒト化のためのフレームワークとして選択する。

例えば、Ｒ，Ｘ、５ａｉｋｉ　（’Ｔｈｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｏｐｌｉｍｉｓａ＋ｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　ＰＣＲ″　ｉｎ　”ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇ７ ”　、　Ｅｄ　Ｈ，Ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ。

５ｌｏｃｋ＋ｏｎ　Ｐｒｅｓｌ、（１９８９）　）によって記載されているように、ＰＣＲ用のプライマーを設計する一般的な原理はよく知られている。加えて、各ＣＤＲ置換に対して、特別な要素を考慮することができる。必要または所望であるならば、Ａおよび／またはＤの５′末端は、第２および／または第３ＣＤＨの一部または全てをコードする。このプライマー、ＡおよびＤは、それらの５ ′末端に、制限酵素部位を含むこともできる。これらの部位は、最終ＰＣＲ反応からのヒト化抗体のクローニングに用いられるベクターに従って設計することができる。プライマーＢおよびＣは、ＰＣＲを実施可能にする条件下でそれらの５ ′末端を互いにアニールし得るに十分な長さで少なくとも重複することを満足させる長さでなければならない。これには、通常、少なくとも１２、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドの重複が必要とされる。４種のプライマーのうちの１種以上が、それらのテンプレート配列とヌクレオチド１個以上が異なっていてもよい。これらの相違は、抗体のフレームワーク領域への所望のコーディング変更の導入に利用することができる。

これらのプライマーは、その後、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを生成するために、適当なテンプレートを用いる一連のＰＣＲ反応に用いられる。ＰＣＲ反応は、５ｘｉｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｕ　、２３９．４８７−４９１　（１９８８）の記載の通りに行なうことができる。各段階で、ＰＣＲ反応の所望の生成物を、例えば選択濾過を用いて、必要に応じて精製することができ、必要であれば、生成物の同一性を、例えばゲル電気泳動により、確立することができる。

工程４：改変抗体の形質導入および発現キメラ抗体をコードするＤＮＡを製造する反応に続いて、このＤＮＡを、ＬまたはＨ鎖定常部領域をコードする適当なりＮＡに結合させ、発現ベクターにクローニングし、適当な宿主細胞系、好ましくは哺乳動物細胞系に形質導入する。これらの工程は、ルーチン方式で行なうことができる。したがって、キメラ抗体は、ａ）少なくともＩｇ　ＨまたはＬ鎖の可変部領域をコードするＤＮＡ配列に動作可能に結合する、適当なプロモータを含む第１の増殖可能な発現ベクターであって、前記可変部領域が第１の抗体からのフレームワーク領域および異なる特異性を有する第２の抗体からのＣＤＲ５を含むベクターを調製し、ｂ）必要であれば、少なくとも相補的１ｇ　ＬまたはＨ鎖各々の可変部領域をコードするＤＮＡ配列に動作可能に結合する、適当なプロモータを含む第２の複製可能な発現ベクターを調製し、Ｃ）前記第１ベクターまたは調製されたベクターの両方を用いて細胞系を形質転換し、ｄ）前記形質転換細胞系を培養して前記改変抗体を製造する、ことを包含する方法によって調製することができる。

好ましくは、工程ａ）におけるＤＮＡ配列は、抗体鎖の可変部領域および、または各定常部領域の両方をコードする。

抗体は回収し、精製することができる。改変抗体を製造するために形質転換された細胞系は、チャイニーズｌ＼ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系またはミエローマ、１１イブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマのような、有利にリンパ系起源の不死化哺乳動物細胞系であってもよい。この細胞系は、エプスタイン・バールウィルスのようなウィルスを用いた形質転換により不死化されている、Ｂ細胞のような正常９２７９球であってもよい。最も好ましくは、不死化細胞系はミエローマ細胞系またはそれらの誘導細胞系である。

キメラ抗体の製造に用いられる細胞系は好ましくは哺乳動物細胞系ではあるが、バクテリア細胞系またはイースト細胞系のような他の適当な細胞系を代わりに用いることができる。

ミエローマ細胞系のような不死化細胞系の幾つかが、それらの正常状態において、単離されたＩｇ　ＬまたはＨ鎖を分泌することが知られている。そのような細胞系が工程ａ）で調製されたベクターで形質転換された場合には、通常分泌される鎖が、工程ａ）において調製されるベクターによってコードされるＩｇ鎖の可変部領域に相補的である限りにおいて、方法の工程ｂ）を行なう必要はない。

しかしながら、不死化細胞系が分泌を行なわないか、もしくは相補釣鐘を分泌しない場合には、工程ｂ）を行なう必要がある。この工程は、工程ａ）において製造されたベクターを、キメラ抗体のＬまたはＨ鎖の可変部領域だけではなく、相補的な可変部領域をコードするようにさらに操作することにより行なうことができる。

代わりに、工程ｂ）は、不死化細胞系の形質転換に用いられる第２のベクターを調製することにより行なわれる。この代替法は調製品のより簡便な構築をもたらすが、抗体製造の効率に劣り、第１の代替法はど好ましいものではない。

不死化細胞系が相補的りまたはＨ鎖を分泌する場合には、例えば、適当なバクテリア細胞をベクターで形質転換し、次いでバクテリア細胞をスフ二ロプラスト融合により不死化細胞系と融合させることにより、形質転換細胞系を製造することができる。代わりに、エレクトロポレーシヨンもしくは他の適切な方法により、ＤＮＡを不死化細胞系内に直接導入することもできる。

その結果、抗体鎖の可変部領域のＣＤＲ５が第１の哺乳動物種の抗体の対応するＣＤＲ５と相同であり、かつ抗体の可変部領域のフレームワークおよび定常部領域が第２の異なる哺乳動物種の抗体の対応するフレームワークおよび定常部領域と相同である抗体か製造される。典型的には、ＬもしくはＨ鎖の可変部領域の３つのＣＤＲ５全てが第１の種に由来する。

抗体は、ＩｇＧ１．１ｇＧ２．１ｇＧ３もしくは１ｇＧ４のようなＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤであってもよい。代わりに、抗体はＷ　Ｏａ６１０１５３３に記載される型のキメラ抗体であってもよい。

この発明の組換えＰＣＲ技法は、３回のＰＣＲ反応を用いてわずか２日で完全にヒト化されたＭＡｂ　ＤＮＡ配列の生成を可能にする。従来、部位指向変異誘発（Ｊｏｏｅｉ　凶、合成（Ｑｕｅｔｎ　旦、匣１回具　Ａｃａｄ、　Ｓｔｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８６゛１００２９−１００３３　（１９８９）　）が抗体のヒト化に用いられている。

上記方法は、多数のヒトＩｇＧサブグループｍＨ鎖（Ｃｂａｒ７ら、Ｃｅ１ｌ、４４．９７−１０６　（１９８６）　）に存在する１９アミノ酸ＣＤＲＨ２のような大きなＣＤＲ５を移相するにも拘らず、手順の中でより少ないオリゴヌクレオチドしか必要としないという、これらの技法を凌駕する利点を有する。例えば、図４に示されるように、第１のＰＣＲ生成物がＣＤＲの中央部で１５ｂｐ重復するように設計されている場合には、ＦＲ標的配列に対応する１５ｂｐの相同性を推測すると、５７ｂｐのＣＤＲの適当なＦＲ上への移送には最大５１ｂｐのオリゴヌクレオチドが必要となる（Ｈｉｇｕｃｈｉ、　υｓｉｎｇ　ＰＣＲｔｏ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ＤＮＡ、ｉｎ″ＰＣＲＴ！ｃｈｎｏｌｏｇ７＠Ｅｄ、　１１．Ａ、　Ｅｒ１ｉｃｈ、　５ｔｏｃｋｆｏｎ　Ｐｒｅｓｓ（＋９８９）　）。

また、この発明の技法は、全ての操作を、ｄｓおよびｓｓベクター間のサブクローニングを必要とすることなくｄｓＤＮＡで行ない、その結果、ヒト化生成物の生成に要する時間および労力を減少させることができるという、部位指向変異誘発を凌駕する利点を有する。

以下の例によりこの発明を説明する。

例　１（ａ）ヒト・バックグランドへのＤＮＡ８　ＣＤＲＩＩＩの組換えＰＣＲグラフティングこの目的は、ラット抗ジゴキシンｍＡｂ　（ＤＮＡ８）からのＨ鎖ＣＤＲＩ　（ＣＤＲＨＩ　）をヒト１ｇ主鎖にグラフトすることであった。

組換えＰＣＨに使用されるテンプレートは、予めヒト化される（配列番号１）。

これは、ゲノムの形態からｃＤＮＡの形態に再操作（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｓｄ　）　Ｌ、続いて、Ｒ１３において、ＣＡＭＰＡＴトＩＢ　ＣＤＲ１１２オヨヒＣＤＲ１１３配列をＤＩ４８　ＣＤＲＢ２　オヨヒＣＤＲＢ３に置き換えてＨＵＩＪＤＸＣＢ、２３　ｕテンプレートを生成させるために、部位変異誘発を行なったものである。

ＰＣＲ反応（Ｓｉｉｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３９．４８７−４９１　（１９８８））は、Ｓｇｔｔｒｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ！ｃｕｌａｒ　ＣｌｏＩｌｉｎｇ　：　Ａ　Ｌｓｂｏｒａ＋ａｒＩＭａｎｕａｌ、　２ｎｄ　Ｅｄｎ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ「ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌｉｂｏｒａ＋ｏ＋７　（１９８９１の方法によって調製したｔｉ　ＨＵＭＤＸＣＢ、　２３テンプレートを用いて行なった。反応は、温度サイクル（９４℃！分間、５０℃２分間および７２℃３分間）２５回とそれに続＜７２℃での最後の１０分間の工程を用いて、プログラム可能な加熱ブロック（Ｈマｂｘｉｄ）内で行なった。製造者が推すように、各プライマー１８ｇ１テンプレート５０ｎｇおよびｎＬポリメラーゼ（１’ｅｒｋｉｎ　ＨａｂｅｒＣｅｔｕｓ　）　２．５ユニツトを反応緩衝液で最終容積１００ μｌとして用いた。合成オリゴヌクレオチドは、７５００ＤＮＡシンセサイザー（Ｍｉｌｌｉｇｕ）で作製した。

用いた方法を図１にまとめる。使用したプライマーは：Ａ：配列番号２Ｂ：配列番号３Ｃ：配列番号４Ｄ：配列番号５プライマー対ＡとＢ１およびＣとＤそれぞれを用いて２つのＰＣＲ反応を行なった。プライマーＡおよびＤは、ＨＩＩＭＤＸＣＩＩｌ、　２３インサー　ト（Ｄ　５’　オヨび３″末端１：Ｂｉｎｄ　Ｉ１１部位を取り込んだポジおよびネガ鎖オリゴヌクレオチドに対応する。

図２は、！ＩＩＩＭＤＸｃＨ，２３インサートの３つの領域のヌクレオチド配列を示し、このインサートは、ＣＡＭＰＡＴＩＩ−１！Ｉリーダー配列の開始コドンを含むインサートの５′末端の最初の４２ｂｐ　；ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩｌｌからのＦＲＢＩの３’　２７ｂｐ　、　ＣＤＲＩｌｌの全長およびＦｌｌｌＩ２の５’　２７ｂｌｌ　；およびＣＡＭＰＡＴＨ−１１１定常部領域（Ｃ８４＞末端の停止コドンを含むインサートの３′末端の最後の２７ｂｐを取り込んでいる。

これらの配列は、それぞれ１１７ｂＰおよび＋２０６ｂｐに分離している。プライマーＢは、ＤＮＡ８のＣＤＲＨＩ配列と共に、ＣＡＭＰＡＴＨ−１１１ＣりＲ１ｌ＋の代わりにＣＣＡＭＰＡＣＡＭＰＡＴＨｈｅ　２７およびＴｈｒ　３０をＮＥＷ　ＦＲＨＩに存在するＳｅｒ残基に変換し戻す点変異を有する’Ｉ　ＣＡＭＰＡＴＩＩ−１１ｔ　ＦＲ旧領領域３′末端からのネガ鎖配列を有している（図２）。プライマーＣは、プライマーＢのＣＤＲＩＩＩ領域に相補的であり、ＣＡＭＰＡＴＩＩ−ＩＨＦＲ１１２の５′末端に入り込むＤＮＡ８　ＣＤＲＩＩＩのポジ鎖配列から構成されている（図２）。第１回のＡＢおよびＣＤ　ＰＣＲ反応において、プライマーＢおよびＤそれぞれからＢＵＭＤＸＣＩｌ、　２３ネガ鎖が合成される（図１）。次のサイクルにおいて、断片ＡＢおよびＣＤ（各々配列番号６および７）が増幅される（図１および２）。このように、この２つの反応の生成物はＨＵＭＤＩＣＨ，２３インサートの全長を構成するが、これは上述の点変異およびＤＮＡ８のＣＤＲＩＩ１１配列で置換されたＣｏｏｐ［ｈ−１ｎ　ＣＤＲＨＩを有する。断片ＡＢおよびＣＤは両者とも、変性および再アニーリング（ｒｅｉｎｎ！ｘｌｉＢ　）の際に重複配列がアニールできるように、ＤＮＡ８　ＣＤＲ旧配列配列している。

過剰のプライマーは、Ｃ＜＋＋ｊ＋１ｃｏｎ　１００で選択濾過することによりＡＢおよびＣＤ　ＰＣＲ反応から除去した（Ｈｉｇｕｃｈｉ各反応液５０μｌをＴＥ　（１０ｍＭ）リス−ＨＣＮ％ｐＨ８，０、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ）２ｍｌに入れ、Ｃｅｎｊｒｉｃｏｎ　１００の上部貯蔵槽において混合した。製造者のプロトコルでは、続いて固定角ローター内における１００ＯＸＧでの２５分間の遠心が用いられ、ＰＣＲ生成物を４０μｌ濃縮物として回収した。

Ｃｓｎ１ｒｉｃｏｎ　１００濃縮物１０μｍに対し、上述の第１ＰＣＲ反応で行なった条件と同じ条件を用い、プライマーＡおよびＤ（図１）を用いる組換えＰＣＲ反応を行なった。断片ＡＢのポジ鎖およびＣＤのネガ鎖はそれらの３′末端に相補的ＤＸ４８ＣＤＲＨＩ配列を含んでおり、第１ＰＣＲサイクルにおいて、アニールし、互いのプライマーとして作用する。重複の伸長は、移植ＤＸ４８　ＣＤＲＢＩを含有する組換え生成物断片ＡＤを生成し、これはＰＣＨの次の回でプライマーＡおよびＤにより増幅される（図１および２）。断片ＡＢおよびＣＤの残りの鎖（それらの５″末端で相補的）は互いに開始させることはできないが、プライマーＡおよびＤのテンプレートの役割を果たすことができる。これらは、反応中にプライマーＢおよびＣが欠けているために指数的な様式で増殖することはないが、より多くの第１ＰＣＲ生成物を生成する。

ゲル精製ＰＣＲ生成物を、８９ｍＭ）リス−ホウ酸塩７２ｍ〜Ｉ　ＥＤＴＡ中の０．８％タイプ■：メデイウムＥＥＯアガロース（Ｓｉｇｍａ　）を含有し、エチジウムブロマイドで染色することにより可視化されたアガロースゲルで分析した。断片の予想されたサイズは以下の通りであった：ＡＢ、２０７ｂｐ：ＣＤ、　１２８５ｂｐ　；　ＡＤ、　＋４７１ｂｐ０反応ＡＤにおいて他の小さなバンドもみられたものの、各々の場合に観察された顕著なバンドは予想されたサイズであった。

（ｂ）組換えＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定断片ＡＤ（配列番号８）をゲル溶出させ、Ｈｉｎｄｌｎ　（ＢＲＬ）で消化してｐＵＣ−１８（ＢＲＬ）のＢｉｎｄＩ［Ｉ部位にクローニングした。組換え分子を含有するクローンのヌクレオチド配列を、５ｅｑｕｓｎａｓｓ　Ｋｉｔ　（Ｕ　Ｓ　Ｂ）のプロトコルに従って、プラスミド争ブライミング（ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｒｉｍｉｎｇ　）　、続くジデオキシ連鎖停止法（ｄｉｄｅｏｘ７　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎｚｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　：Ｓａａｇｔｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎｇ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、、７４．５４６３−５４６７　（１９７７）　）によって決定した。全１４６３　ｎ＋インサートは適正な配列であり、２組のＰＣＲ反応に起因する取り込みの誤りはないことが見出された。

例２この目的は、ＹＦＣ５１，１，１ラット抗ヒト−ＣＤ１８　ＨおよびＬ鎖のヒト化であった。両鏡の可変部領域のＤＮＡ配列が決定され、以下に示されている。

配列番号９および１０　−　Ｈ鎖、および配列番号１１および１２−　Ｌ組上述の工程（２）に記載される選択手順を用い、ＮＥＷＭ　Ｈ鎖およびＲＥＩ　Ｌ鎖のヒト可変部ドメインｅフレームワーク（Ｋａｂｉｊ　亘、’５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｊｏｌｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍ＋＊ｕｎｏｌｏｇｉｃｘｌｉｎｔｅｒｅｓｔ’　Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐｔ、ｏｆ　ｌ１ｅｘｌｊｈ　ｘｎｄ　ｌｌｕ＋ｕ＋＋　５ｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ、Ｓ。

Ｇｏｖｓｒｎｍｓｎ！　Ｐｒｉｌｉｎｇ　０１！ｉｅｓ　（１９８７）　）をヒト化方法のために選択した。

ヒト化ＨおよびＬ鎖を以下の通りに構築した。

（ｉ）　Ｌ鎖Ｌ！１！オリゴヌクレオチド・プライマーＡＬ　；配列番号１３ＢＬ　：配列番号１４ＣＬ　：配列番号１５Ｄ、：配列番号ｌ６ＥＬ　：配列番号１７Ｆ、：配列番号１８ＧＬ：配列番号１９Ｈｏ：配列番号２０ＰＣＲ反応は、温度サイクル（９４℃１分間、５０℃２分間、および７２℃３分間）２０回とそれに続＜７２℃での最後の１０分間の工程を用いて、プログラム可能な加熱ブロック（Ｈｙｂａｉｄ）内で行なった。製造者よって勧められる通り、各プライマー１μｇ１特定の量のテンプレート、およびＴｉｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｕ　Ｃｅ１ｕｓ）　２．５ユニツトを反応緩衝液で最終容積１００μｌとして用いた。

ＰＣＲの最初のテンプレートは、ＣＡＭＩ’ＡＴＨ−ＩＨＬ鎖（ＲＥＩ上のヒト化ＣＡ＋１ＰＡＴＨ−１；　Ｐａｇｅａｎｄ　Ｓ７ｄｓｎｈｘｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９、６４−６８．　（１９９１１）であった。４通りの初期ＰＣＲ反応を、各反応力たりテンプレート１０ｎｇを用い、各々プライマー対Ａ　とＢＣとＤＥ　とＦ　およびＧＬとＨ４を用Ｌ　Ｌ’Ｌ　Ｌ’Ｌ　Ｌいて行なった。これらのＰＣＲ反応の生成物、断片Ａ　Ｂ　ｔ　−ＣＤＬＳＥＦＬおよびＧＨＬを、製造者によって勧められるプロトコルに従って、Ｐｒｅｐ− Ａ−Ｇｅｎｅ　（Ｂｉｏ−Ｒｉｄ　）を用いて精製した。断片ＡＢ　とＣＤ、およびＥＦ、とＧＨ，を各精製り生成物の１／４を用いて結合させ、それぞれプライマーＡＬ１とＤＬおよびＥＬとＨＬを用いて組換えＰＣＲ反応を行なった。これらの反応の生成物、断片ＡＤＬおよびＥＨＬ、を上述の通り精製し、プライマーＡＬおよびＨ４を用いる組換えＰＣＲ反応において、各々の１／４を結合させた。ヒト化り鎖組換えＰＣＲ最終生成物、ＡＨＬを、Ｃｒｏｖｅ　亘（１９９１）の方法に従い、プライマーＡＬおよびＨＬ中のＨｉｎｄｎ１部位を利用してｐＵＣ−１８（ＢＲＬ）のＨｉｎｄＤＩ部位にクローニングした。

単離プラスミドをジデオキシ連鎖停止法によって配列決定し、適正な配列のクローンを選択した。

（ｉｉ）　Ｈ鎖Ｈ鎖オリゴヌクレオチド・プライマーＡ、Ａ＝配列番号２１ＢＨ：配列番号２２ＣＨ：配列番号２３ＤＥ：配列番号２４Ｅヨ：配列番号２５ＦＨ：配列番号２６ＧＨ：配列番号２７ＨＨ：配列番号２８ＰＣＲの最初のテンプレートはＣＡＭＰＡＴト１１　Ｈ鎖であった。

段落（ｉ）に記載の組換えＰＣＲ法ではあるがオリゴヌクレオチドブライマーＡ　ないしＨＨを用いる方法を利用して、■ 鰯歯類動物のＣＤＲ５をテンプレート上にグラフトした。最終ＰＣＲ，すなわち断片ＡＤ　およびＥＨＨとプライマー■ Ａ　およびＨｌ、では高い収率で生成物を得ることかできな■ いので、（断片ＡＤ　およびＥＦ、から）断片ＡＦＨを生成させ、断片ＥＨと共に、プライマーＡ　およびＨ，を用いＩＩ　ＨるＰＣＲに用いた。オリゴヌクレオチドＡ　およびＨＨは、それぞれ１ＩｉｎｄｎＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ヒト化可変部領域の初期クローニングが容易になるように設計し、かつ、次の可変部領域のクローニングを容易にするために、選択された適切な定常部領域と共にＳｐｔ　１部位をオリゴヌクレオチドＧＨのＮ　ＥＷＭフレームワーク４　（ＦＨ４）に導入した。Ｓｐｅ　Ｉ部位は、ヒト化Ｈ鎖テンプレートの位置１０９（前出のＫｘｂａｊ　旦によるナンバリング）のロイシン残基を変えないように選択した。６つのヒトＨ鎖Ｊ−ミニジーン（■ −ロｉｎｉｇｅｎｓ）のうちの４つはこの位置にロイシンを有している（前出のＫａｂａｔ　９）。

ヒト化Ｈ鎖可変部領域組換えＰＣＲ生成物を、Ｂｉｎｄｍ／」二Ｒ１切断ｐＵＣ −１８（ＢＲＬ　）にクローニングし、適性配列を有する単離プラスミドを選択した。ＣＡＭＰＡＴト１１Ｉ　Ｈ鎖のＦＨ４およびγ１１定部領域を、オリゴヌクレオチド・プライマーＸｌｌ　（配列番号２９）およびＹｌｌ　（配列番号３０）を用いてｐ　Ｕ　Ｃ−１８にＰＣＲクローニングした。プライマーＸＢはＳｐｅ　Ｉおよび肛ｏｄＩＩＩ部位を有し、ＹＢはＥｃｏＲ１部位を有する。

ローニングに用い、適性配列を有する単離プラスミドを選択した。続いて、加工ＦＲ４Ｓｌυ■部位を用いて、ヒト化可変部領域およびγ１１定部領域クローンから完全Ｈ鎖を再構築した。

配列表１．配列番号１の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　・　１４５７（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状ｉｉ）配列の種類　：　ｃＤＮＡｉｔ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ［？コーディング配列］（Ｂ）存在位置　＋　１．、．１４５７（Ｄ）他の情報　：　／生成物−“可変部類域Ｈ鎖”標準名糟 “ＨＵＭＤＸＣＨ，２３” ｉｔ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　ＭｉｔＣｆ＊ｘｊｕｒ！（Ｂ）存在位置　＋　１５６．、．１８２（Ｄ）他の情報　：　／機能−ＣＡＭＰＡＴＩＩ　ＩＨＦＲＨＩｉｔ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｃｅ　ｊｔｘ＋ｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　＋８３．、．１９７（Ｄ）他の情報　：　／機能−ＣＡＭＰＡＴＩＩ　ＩＩＩ　ＣＤＲ旧１り配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｗｉｓｅ　［ｅｘ＋ｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　１９８．、．２２４（Ｄ）他の情報　：　／機能−ＣＡＭＰＡＴＨｉｌｌ　ＦＲＢ２ｘｉ）配列の記載　：　配列番号１ＡＡＧ″′″ＡＣＡ　ＣＴＴＡＣ丁ＧＡＧＣ入ＣλＣλＧＧＡＣＣＴＣｉ％ＣＣＡＴＣコ８Ｍ！！ｔＴにＣＡＣＣＧＴＧ　ＴＣ’Ｔ　ＧＳＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡｃＣＧＡ’ｌ’　ＴＴ口τＡＣλＴＧ　ＭＣ１９７Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｔτ：；　シｐ　Ｐ１１！！　Ｔｌ／τ＊ａｔ　ｘｓｎＴＯＣＧＴＧ　ＡＧλ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣにＡ　ＧＧＴ　２２４Ｔ＝ｐ　Ｖｌｌ　Ａｒｇ　Ｇより　ｐｒ□　ｐ；□　ＧＩＹ　Ａｒｇ　ＧＩＹ１４コＯＣＣに　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＴＣ；ＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＡＡＧＣＴＴ　１５４７ｐｒｏ　Ｇユｌ／　Ｌ”ｉ’Ｓ２、配列番号２の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：２４塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状ｉｉ）配列の種類　：　５ｓＤＮＡｉｉｉ　）ハイポセティヵル配列　：ＮＯｉマ）アンチセンス　二Ｎ。

ｘｉ）配列の記載　：　配列番号２ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴτλＣＡＧＴＴＡＣＴ　ＧＡＧＣ２４３、配列番号３の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝４５塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状ｉｉ）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ！１１）ハイボセティカル配列　：Ｎ０ｉｖ）アンチセンス　：　Ｙｅｓｘｉ）配列の記載　：　配列番号３ＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＧλＡ　にＴＣｔｌ；ＴＣ；ＡＡＴＡ　ＣごλＴＡＣＣＣλＣ入ＣＣＣ５４５４、配列番号４の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：４５塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状ｉｉ）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ１１１）ハイポセティカル配列　：Ｎ０ｉｖ）アンチセンス　；Ｎ０ｘｉ）配列の記載　：　配列番号４ＡＣＴＴλＴＧＧＴＡ　ＴＣＧＧＴｃＴＧＧＣ−ＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡ　ＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧ　ＧＡＣＧＡ　４５５、配列番号５の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：２７塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状ｉｉ）配列の種類　：　５ｓＤＮＡｉｉｉ　）ハイポセティヵル配列　：Ｎ。

ｉｖ）アンチセンス　：　Ｙｅｓｘｉ）配列の記載　：　配列番号５ＣλＴＴＴＡＣＴＣＡ　ＣＣ；ＣＴＧＣＣＴＴＣＧＡＡＣＴＡＧ　２７６、配列番号６の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：２０７塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　二本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状五【）配列の種類　：　ｄｓＤＮＡｘｉ）配列の記載　：　配列番号６ＧＡＴＣλ入ＣＣτＴ　ＴＡＣＡＧＴＴＡＣＴ　ＧＡＧＣＡＣｋＣλＧ　ＧＡＣＣＴＣλＣＣλ　ＴＧ　４２１．−−０１００．、、、、、、、、、−、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、−、、、、、　１５９ＴｃｃｘｃｃｃＴｃ ’ｒ　ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＴ　ＴＡＴＧＧＴＡＴにＧ　ＧＴ（１；ＴＧＧＧＣ２０７７、配列番号７の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：　１２８５塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　二本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状 ■）配列の種類　：　ｄｓＤＮＡｘｉ）配列の記載　：　配列番号７人ＣＴＴＡＴＧＧＴＡ　ＴＧＧＣ；ＴＧＴＧＣＩ；Ｇ　ＣＴＧＧＣ；ＴＧＡＧＡ　Ｃ入ＧＣＣ入ｃｃＴｃ　ｃλＣにＡＧＧＴ　４３、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、　’２５４ＣＣＧＧＧＴλλＡＴ　ＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＴ　ＣＬ２ε５８、配列番号８の情報ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：　１４７１（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　二本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状ｉｉ）配列の種類　・　ｄ　ｓ　ＤＮＡ目）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　＋　１．、．１４７１（Ｄ）他の情報　：　／生成物−“可変部類域Ｈ鎖″皇工）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号＋　ＭｉＢ　１ｅａｔｕｎ（Ｂ）存在位置　：　１６０．、．１８６（Ｄ）他の情報　：　７機能　ＣＡＭＰＡＴＨ１１ＦＲ旧ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｗｉｓｅ　ｆｅｘｔｕｒｔ（Ｂ）存在位置　：　１７５．、．１７？（Ｄ）他の情報　二　点変異ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｃ　ｆｅｉ＋＋ｕｅ（Ｂ）存在位置　：　１８４．、．１８６（Ｄ）他の情報　二　点変異ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｃ　ｌｃｓ！ｕ＋ｅ（Ｂ）存在位置　：　１８７．、．２０７（Ｄ）他の情報　：　／機能−ＤＫ４８　ＣＤＲ旧ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｃ　ｆｅｓｊｏｔｔ（Ｂ）存在位置　：　２０８．、．２３４（Ｄ）他の情報　：　７機能　ＣＡＭＰＡＴＩＩ　１！！　ＦＲ１］２ｘｉ）配列の記載　：　配列番号８ＧＡＴＣＡＡＧｃＴ″：　τＡＣλＧＴＴλＣＴ　ＧＡＧ（入ＣλＣλＧＧλＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧ　４２ｔ、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、＋、、　１５９Ｔ（１；ＣＡｃｅ　ＧＴＧ　ＴＣ’！’　ＧＧＣＡにＣＡｃＣＴＴＣＡＧＣＡＣτ　Ｔ入Ｔ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　：Ｌ９８ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓａｗ　Ｇｌｙ　（Ｓａｒ）　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠（Ｓａｒ）　Ｔａｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＭａｔＧＧＴ　ＧＴＧ　ｃ、；こ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＧＡ　ＣＣτ　ＧＧＡ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　２コ４Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＧＬｙ　Ｔｒｐ　Ｖａｌλｒｇ　Ｇｉｎ　？ｒｏ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＧｌｙＣＣに　ＧＧＴ　入λλ　ＴＧλＧＴＧＣＧＡＣＧＧＡ入ＧＣＴＴＧλＴＣ１４７１Ｐｒｏ　ＧＩＹ　Ａｌａ（９）配列番号９の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：４１７塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　二本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（目）配列の種類　：　ｃＤＮＡ（マｉ）起源：（Ａ）生物名　：Ｒ１口ｕｓ　ｒｘＮｕｓ（１ｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：　１．、．４１７（Ｄ）他の情報　：　／生成物−“シグナル配列を有する可変部類域Ｈ鎖” ／標準名−’　ＹＦＣ５１゜１．１’ （ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｅ　ｓｉｇｎｘｌ（Ｂ）存在位置　：１．、．５７（Ｄ）他の情報　：　／機能−“シグナル配列”（１ｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉ＋ｃ　Ｉ！１ｔｕｒ！（Ｂ）存在位置　：　１４８．、．１６２（Ｄ）他の情報　：　／機能−“ＣＤＲＩ”（ｌり配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｅ　ｔｅｘｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　２０５．、．２５５（ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｅ　ｌ５ｘｌｕｒ！（Ｂ）存在位置　：　３５２．．１８４（ｘｉ）配列の記載　：　配列番号９フご＝＝？Ｔにコにλ＝にり久フご烏フ、１：　Ａ１％Ｃ＝コニ＝：丁＝フｒ’ −＋　Ｚ　Ｓ　’＋（１０）配列番号１０の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：１３９アミノ酸（Ｂ）配列の型　：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（ロ）配列の種類　：　蛋白質（！１）配列の記載　：　配列番号１０（１１）配列番号１１の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝３７５塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　二本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名　：　ＲｘＨｕｓ　ｒｘｆｔｕｓ（ｉｒ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：　１．、ｊ７５（Ｄ）他の情報　：　／生成物−“可変部領域り鎖”／標準名−“ＹＦＣ５１，１，１” （ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｕｓｅ　５Ｈｎｔｌ（Ｂ）存在位置　：１．、．６０（Ｄ）他の情報　：　／機能−“シグナル配列”（ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｃ　ｔｅｘｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　１３０．、．１６２（Ｄ）他の情報　：　／機能−“ＣＤＲ１”（ｉｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｕｓｅ　ｆｅｘｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　２０８．、．２２８（Ｄ）他の情報　：　／機能−“ＣＤＩ　２″（１ｘ）配列の特徴（Ａ）特徴を表わす記号：　Ｍｉｓｃ　ｔｅｘｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　＋　３２５．．１５１（Ｄ）他の情報　：　／機能−“ＣＤＲ３”（工１）配列の記載　：　配列番号１１（１２）配列番号１２の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：１２５アミノ酸（Ｂ）配列の型　：　アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　蛋白質（ｘｌ）配列の記載　：　配列番号１２（」１）配列の種類　：　ｃＤＮＡ（■１）ハイポセティカル配列　二Ｎ０（ｌマ）アンチセンス　：Ｎｏ（ｙｉ）起源：（Ａ）生物名　コＲ１目ｕｓ　ｒｘ目＋＋５（ｘｉ）配列の記載　：　配列番号１７λ＝；；：ミλ　ｃ６にに３ズセ（１３）配列番号１３の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　；３０塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖（Ｄ）トポロジー　・　直鎖状（１１）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（１目）ハイポセティカル配列　二Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス　：ＮＯ（工１）配列の記載　：　配列番号１３αシ罠λλス：Ｔσ工：Ｖλコズルコ℃ ＾ＧフＣλ（１４）配列番号１４の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：４３塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状：ｏ　（＋＋）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（目Ｉ）ハイポセティカル配列　二Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス　：　Ｙｅｓ（工１）配列の記載　：　配列番号１４α：λ品＝ｖＪｉχ＝υαα：゛Ｃ：λ 二ｉＸフτフ（λ；＝℃八π＝へ１５）配列番号１５の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝４３塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状コ０　（目）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（目１）ハイボセティカル配列　＝Ｎ。

（ｉｔ）アンチセンス　：Ｎ。

（ｘｌ）配列の記載　：　配列番号１５入り５；ご＝５σユコフ２−スαＩ＝α ＝１＝にに入り人ズ＝に石（２０）配列番号２０の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：３０塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（２）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（口１）ハイポセティカル配列　二Ｎ。

（１マ）アンチセンス　：　Ｙｅｓ（ｘｉ）配列の記載　：　配列番号２０Ｇにに３λズ＝ＴＣフ請Ｃ〜コｆｆ１ｅ工＝ロ＝工λ（２１）配列番号２Ｎの情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　：３１塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖ＣＤ）トポロジー　：　直鎖状（１１）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（１目）ハイポセティカル配列　＝ＮＯ（１ｖ）アンチセンス　＝Ｎ。

（ｘｌ）配列の記載　：　配列番号２１＝−に；ａ―＝コＣ，５コ＝にＣ（２２）配列番号２２の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝３６塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列　：Ｎ。

（エマ）アンチセンス　：　Ｙｅｓ（ｘｌ）配列の記載　２　配列番号２２３ｏ　ＧＴＧｃ＾ニλ＾Ｇ；：λλゴｃり；ＴＱ入ＡＧ５Ｔαλ＾Ｇ；；λＳλＣ八Ｃ（へ３）配列番号２３の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝３６塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　二　−重鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（百）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列　＝ＮＯ（１ｖ）アンチセンス　＝ＮＯ（ｔｉ）配列の記載　：　配列番号２３つ、　ズフごコニ＝ど二；蝉χα；：− （２８）配列番号２８の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝３６塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（目）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（百Ｉ）ハイポセティカル配列　＝Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス　：　Ｙｅｓ（ｘｉ）配列の記載　：　配列番号２８゛フロχ：口＝℃λχ石入に口てＧＧＡＣχχ７にＧ工℃（２９）配列番号２９の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝４８塩基対（Ｂ）配列の型　：　核酸（Ｃ）鎖の数　：　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（１１）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（目りハイポセティカル配列　：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス　＝Ｎ。

（ｘｉ）配列の記載　：　配列番号２９にズー＝：Ｗｚコバ；＝λ；πに；＝に；＝：（３０）配列番号３０の情報（ｉ）配列の特色：（Ａ）配列の長さ　＝３３塩基対（Ｂ）配列の型　、　核酸（Ｃ）鎖の数　二　一本鎖（Ｄ）トポロジー　：　直鎖状（ロ）配列の種類　：　５ｓＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセテイカル配列　＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス　：　Ｙｅｓ（ｘｉ）配列の記載　・　配列番号３０３６　詰＝：＝＝コにコごコ＝コ品α ａ図１０ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＮ　ＣＤＦＩＨＩ−ＤＸ４８　ＣＤＦＩＮ＋図３ＰＣＲＡＳ　ＰＣｊ’ｌＣＤ　ＰＣＲＥＦ　ＰＣＲＧＷＰＣＲＡＤ　ＰＣＲＥＨ図４補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）週平成５年４月１２日

Claims

【特許請求の範囲】１．抗体鎖もしくはそれらの断片をコードし、この抗体鎖の断片の可変部領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の少なくとも１つが第１の哺乳動物抗体に由来し、かつ可変領域のフレームワークが第２の異なる哺乳動物抗体に由来するものである、下記式で表わされる二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡの製造方法であって、５′Ｆ１−Ｍ−Ｆ２３′ ここで、Ｍは第２の抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡを含み、かつＦ１およびＦ２はそれぞれＭの側方に位置する５′および３′配列をコードし、（ｉ）下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡテンプレートを調製し、５′ｆ１−Ｈ−ｆ２３′ ここで、ＨはＭとは異なる特異性のＣＤＲをコードするＤＮＡを含み、かつｆ１およびｆ２は各々Ｆ１およびＦ２に実質的に相同であり、（ｉｉｉ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを得、ここで、Ａは、Ｆ１の５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配列Ｆ１の対応長さに等しい配列ａ１を含み、Ｈに向かって５′から３′の方向に指向し；Ｂは、配列５′ｂ１−ｂ２３′ からなり、ここで、ｂ１はＭの対応長さに相補的であり、かつＭの５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、ｂ２はＦ１における対応長さの配列に相補的であり、かつＦ１の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｃは、配列５′ｃ１−ｃ２３′ からなり、ここで、ｃ１は、Ｍの対応長さに等しく、かつＭの３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、ｃ２は、Ｆ２における対応長さの配列に等しく、かつＦ２の５′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｄは、Ｆ２の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつＦ２の対応長さに相補的である配列ｄ１を含み、およびＨに向かって５′から３′の方向に指向し；並びに、ｂ１およびｃ１は、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を実施可能な条件下において、それらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複しており、（ｉｉｉ）所望の順番で、プライマー対Ａ、ＢおよびＣ、Ｄを用いて、上記（ｉ）において調製されるテンプレートに対するＰＣＲ反応を行ない、および（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）において得られる生成物を混合し、プライマ−ＡおよびＤを用いてＰＣＲ反応を行なう、ことを包含する方法。２．Ｆ１およびＦ２が、各々少なくとも１種のヒト抗体フレームワーク領域、および任意に、さらにＣＤＲｓをコードする請求の範囲第１項記載の方法。３．Ｈが、前記第１抗体のＣＤＲをコードする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。４．Ｍが、非非とＣＤＲ領域をコードする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の方法。５．Ｍが、ネズミ科動物または■歯類動物のＣＤＲをコードする請求の範囲第４項記載の方法。６．プライマ−ＡおよびＢが、それらの５′末端の１０ヌクレオチド内に少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の方法。７．プライマ−ＢおよびＣにおいて、ｂ１およびｃ１が、その長さにおいて、ヌクレオチドの数が同じである請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。８．プライマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤが、それぞれ１５ないし３０ヌクレオチドの長さである請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の方法。９．プライマ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ各々のａ１、ｂ１、ｃ１およびｄ１が、それぞれ１５ないし３０ヌクレオチドの長さである請求の範囲第８項記載の方法。１０．ヒト抗体ＬまたはＨ鎖のＣＤＲ領域の少なくとも１つが請求の範囲第１項ないし第９項に記載の方法によって置き換えられるヒト化抗体の製造方法。１１．３つ全てのＣＤＲ領域が置き換えられる請求の範囲第１０項記載の方法。１２．得られたＤＮＡの発現ベクターへの導入をさらに含む請求の範囲第１項ないし第１１項記載の方法。１３．前記発現ベクターの宿主細胞への導入をさらに含む請求の範囲第１２項記載の方法。１４．前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞である請求の範囲第１３項記載の方法。１５．得られたＤＮＡの発現および発現した生成物の回収をさらに含む請求の範囲第１３項または第１４項記載の方法。１６．下記配列からなる、長さが３０ないし１１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。５′ｏ１−ｏ２３′ （ここで、ｏ１は非ヒト起源のＣＤＲ領域の少なくとも１５ヌクレオチドの配列を含み、かつｏ２はヒト起源のフレームワーク領域の少なくとも１５ヌクレオチドを含む）１７．抗体鎖もしくはそれらの断片をコードし、この抗体鎖の可変部領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）が第１の哺乳動物抗体に由来し、かつ可変部ドメインの４つのフレームワーク領域が第２の異なる哺乳動物抗体に由来するものである、下記式で表わされる二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡの製造方法であって、５′Ｆ１−Ｍ１−Ｆ２−Ｍ２−Ｆ３−Ｍ３−Ｆ４３′ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３は第２の抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡを含み、かつＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４はＣＤＲｓＭ１、Ｍ２およびＭ３の側方に位置するフレームワーク配列を含み、（ｉ）下記式で表わされる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡテンプレートを調製し、５′ｆ１−Ｈ１−ｆ２−Ｈ２−ｆ３−Ｈ３−ｆ４３′ここで、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３はＭ１、Ｍ２およびＭ３とは異なる特異性のＣＤＲｓをコードするＤＮＡを含み、かつｆ１、ｆ２、ｆ３およびｆ４は各々Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４と実質的に相同であり、（ｉｉ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを得、ここで、Ａは、Ｆ１の５′末端に対応する５′末端を有し、かつ配列Ｆ１の対応長さに等しい配列ａ１を含み、Ｈ１に向かって５′から３′の方向に指向し；Ｂは、配列５′ｂ１−ｂ２３′ からなり、ここで、ｂ１はＭ１の対応長さに相補的であり、かつＭ１の５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、ｂ２はＦ１における対応長さの配列に相補的であり、かつＦ１の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｃは、配列５′ｃ１−ｃ２３′ からなり、ここで、ｃ１は、Ｍ１の対応長さに等しく、かつＭ１の３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、ｃ２は、Ｆ２における対応長さの配列に等しく、かつＦ２の５ ′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｄは、配列５′ｄ１−ｄ２３′ からなり、ここで、ｄ１は、Ｍ２の対応長さに相補的であり、かつＭ２の５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、ｄ２は、Ｆ２における対応長さの配列的相補的であり、かつＦ２の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｅは、配列５′ｅ１−ｅ２３′ からなり、ここで、ｅ１は、Ｍ２の対応長さに等しく、かつＭ２の３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、ｅ２は、Ｆ３における対応長さの配列に等しく、かつＦ３の５ ′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｆは、配列５′ｆ１−ｆ２３′ からなり、ここで、ｆ１は、Ｍ３の対応長さに相補的であり、かつＭ３の５′末端に相補的な３′末端を有する配列を含み、ｆ２は、Ｆ３における対応長さの配列に相補的であり、かつＦ３の３′末端に相補的なヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｇは、配列５′ｇ１−ｇ２３′ からなり、ここで、ｇ１は、Ｍ３の対応長さに等しく、かつＭ３の３′末端に対応する３′末端を有する配列を含み、ｇ２は、Ｆ４における対応長さの配列に等しく、かつＦ４の５ ′末端に対応するヌクレオチドから始まる５′末端を有し；Ｈは、Ｆ４の３′末端に相補的な５′末端を有し、かつＦ４の対応長さに相補的である配列ｈ１を含み、およびＨ３に向かって５′から３′の方向に指向し；並びに、対ｂ１およびｃ１、ｄ１およびｅ１、およびｆ１およびｇ１は、ＰＣＲを実施可能な条件下において、それらの５′末端を互いにアニールし得るに十分な長さで重複しており、（ｉｉｉ）所望の順番で、プライマー対Ａ、Ｂ；Ｃ、Ｄ；Ｅ、ＦおよびＧ、Ｈを用いて、上記（ｉ）において調製されるテンプレートに対するＰＣＲ反応を行ない、ＤＮＡ断片ＡＢ、ＣＤ、ＥＦおよびＧＨを得、（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）において得られる断片を結合させ、所望のＤＮＡを得る、ことを包含する方法。１８．Ｆ４が、ＣＤＲＭ３の側方に位置するフレームワーク配列および抗体鎖の接触領域の全てもしくは一部をコードするＤＮＡを含む請求の範囲第１７項記載の方法。１９．前記工程（ｉｖ）が、（ｉｖａ）断片ＡＢおよびＣＤをプライマ−ＡおよびＤと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＡＤを得；（ｉｖｂ）上記工程（ｉｖａ）の前、その間またはそれに続いて、断片ＥＦおよびＧＨをプライマ−ＥおよびＨと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＥＨを得、並びに（ｉｖｃ）断片ＡＤおよびＥＨをプライマ− ＡおよびＨと混合し、所望のＤＮＡを得る、ことにより行なわれる請求の範囲第１７項または第１８項記載の方法。２１．工程（ｉｖ）が（ｉｖａ）断片ＣＤおよびＥＦをプライマ−ＣおよびＦと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＣＦを得、並びに（ｉｖｂ−１）断片ＡＢおよびＣＦをプライマ −ＡおよびＦと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＡＦを得、かつ（ｉｖｃ− １）断片ＡＦおよびＧＨをプライマ−ＡおよびＨと混合し、所望のＤＮＡを得るか、あるいは（ｉｖｂ−２）断片ＣＦおよびＧＨをプライマ−ＣおよびＨと混合し、ＰＣＲを行なってＤＮＡ断片ＣＨを得、かつ（ｉｖｃ−２）断片ＡＢおよびＣＨをプライマ−ＡおよびＨと混合し、所望のＤＮＡを得る、ことにより行なわれる請求の範囲第１７項または第１８項記載の方法。