JPH06508111A - 甲状腺由来の軟骨細胞刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 明細書 由来の　京激　− 畿亙立旦 本発明は、軟骨細胞および滑膜線維芽細胞のインビトロ刺激を含む、軟骨修復に 有用な因子に関する。より特定すれば、甲状腺組織から単離され得、無血清の条 件下で滑膜線維芽細胞および軟骨細胞の両者を刺激し、そしてジスルフィドを還 元する還元剤により安定化される因子に関する。

４１見よ話に１茨恵 種々様々の条件下で多様な細胞の成長を刺激する多くの因子が知られている。本 明細書に開示される因子に、骨および結合組織を特徴付ける細胞に関するその活 性において最も密接に関連する因子は、関節の軟骨細胞に刺激作用を有する因子 である。これらは、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、血小板由 来成長因子（ＰＤＧＦ）　、インスリン様成長因子Ｉおよび■型（Ｉ　ＧＦ−ｒ およびＩＧＦ−ＩＩ）、酸性および塩基性線維芽細胞成長図子（ＦＧＦ）および 表皮由来の成長因子（ＥＧＦ）を含む（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、ら、Ａｄｖ　Ｍｅｔ ａｂＤｉｓｏｒｄ　（１９７５）　ｉ：２６５−２８４：　Ｆｒｏｅｓｃｈ、Ｅ 、Ｒ，ら、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｈ５ｆｏｌ（１９８５）　４７：４４３−４６７ ；　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、Ｄ、ら、ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ （１９８７）　８：９５−１１４；　ＭｃＱｕｉｌｌａｎ、ＤＪ、ら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ　Ｊ　（１９８６）　２４０：４２３−４３０；　Ｒｏｓｓ、　Ｒ，らＣ ｅ１ｌ　（１９８６）　４６：１５５−１６９；Ｓ＋ｕｉｔｈ、　Ｒ，Ｌ、ら、 Ｊ　Ｏｒ工匣Ｌｌｅｓ　（１９８９）　７：１９８−２０７；　Ｔｕｃｋｅｒ。

Ｒ，Ｆ、ら−、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　（１９８３）　４３：１５８１−１５８ ６）。

既知の甲状腺ホルモン、３．３°、５−トリヨード−１，３−Ｌ−サイロニン（ Ｔ３）；サイロキシン（Ｔ４）およびカルシトニンは、結合組織代謝に作用する ことが知られている。しかし、それらは一般に未成熟細胞に作用する。Ｔ３およ びＴ４は、上皮軟骨二次骨化の成長および成熟、および骨格形成一般に重要であ る；カルシトニンは、胚軟骨と成長層板軟骨との肥厚および成熟を増加するが、 休止軟骨はカルシトニンに反応しない。

最近の刊行物で、出願人は、部分精製された甲状腺カルシトニンにおける活性の 存在を開示した。この活性は、無血清条件下、即ち、Ｔ３、Ｔ４またはカルシト ニンのいずれも刺激を提供しない条件下で、成体の関節軟骨増殖およびグルコサ ミノグリカフ合成の刺激を提供したこの文献、Ｊｏｎｅｓ、　Ｄ、Ｇ、およびＳ ｍ１ｔｈ、　Ｒ，Ｌ、　Ｊ　０ｒｔｈｏ　ｅｄ　Ｒｅｓ　（１９９０）　ｉ：２ ２７−２３３．の開示は、本明細書に参考によって援用されており、著者らはこ の活性がヘパリン−セファロースから低塩濃度（０，５Ｍ　ＮａＣ１）　−類似 の条件下で関節の軟骨細胞増殖を刺激することが知られている線維芽細胞成長因 子はこの支持体から溶出しない条件−で溶出し得ることを開示する。酸性ＦＧＦ は類似する条件下ＩＭ　ＮａＣ１で溶出し、そして塩基性ＦＧＦは類似する条件 下１．６Ｍ　ＮａＣ１で溶出する（Ｌｏｂｂ、　Ｒ，Ｒ，ら、Ａｎａｌ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ　（１９８６）　１５４：ｌ−１４）。この活性の性質はそれ以上特徴 付けられなかった。

甲状腺組織から得られ得る軟骨細胞刺激活性が、単離されたそして精製された形 態で調製し得る高分子量成分の複合体と関連していることが、今や見い出された 。

１豆旦鼠丞 本発明は、８Ｍ尿素によって活性なサブユニ、トに少な（とも部分的に解離し得 る、高分子量の複合体を提供する。複合体および解離したサブユニットの両者は 、軟骨細胞および滑膜線維芽細胞の成長をインビトロの無血清条件下で刺激し、 そしてそれ故これら細胞の培養で血清の代替品として使用し得る。さらに、この 複合体またはその解離部分は医療用途の移植物のインビトロ発達に有用であり、 そして結合組織成長の増強、および／または移植片または移植物の骨または軟骨 への統合を必要とする結合組織状態の治療においてインビボで有用である。

それ故、一つの局面では、本発明は、インビトロの血清のない条件下で軟骨細胞 または滑膜線維芽細胞増殖を刺激する活性を有する高分子量のタンパク質性複合 体に関する。この複合体は、８Ｍ尿素により複合体の部分に少なくとも部分的に 解離し得、この複合体の部分は、上記の活性を保持し、また高分子量（＞５００ 　ｋｄ）である。本発明はまた、これらのサブユニットに関する。この複合体お よびそのサブユニットは、集合的に甲状腺由来軟骨細胞刺激因子（ＴＤＣＳＦ） と呼ばれ、メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールのようなジフルフィ ド結合を還元し得る還元剤により安定化される。

それら（上記因子）は、酢酸で４°Ｃで一時間処理することによりおよびトリプ シン処理で不活性化される。この複合体およびそのサブユニットはまた、１時間 の間、１００℃に加熱することによって不活性化されるが、１時間の間、６０° Ｃに加熱することによっては不活性化されない。この因子は、ヘノでリン−セフ ァロースから０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出し得る。

別の局面では、本発明は、この因子を含む移植物組成物を含む薬学的組成物、お よびこの因子またはその組成物を用−）る結合組織系の疾病または退化状態を治 療する方法に関する。

さらに、本発明は、甲状腺組織からこの因子を得る方法、およびインビトロで移 植物組成物の開発にこの因子を使用する方法または軟骨細胞または線維芽細胞の 成長に血清の代替品として使用する方法に関する。本発明はまた、上記因子と特 異的に免疫反応性の抗体に関し、そしてこの因子と標識または他の作用因子との 結合体、そしてこれら抗体および結合体の使用法に関する。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の因子のセファクリルＳ−３００カラムカ）らの溶出パターンを 示す。

図２は、図１の溶出ノくターンに類似の溶出ノくターンであるが、５Ｍ尿素を含 む。

図３は、図１および２の溶出パターンに類似の溶出ノゞターンであるが、８Ｍ尿 素の存在下である。

図４は、図１．２および３の溶出パターンで示された排除された容量の非還元の ネイティブなゲル電気泳動の結果を示す。

発■を　るための形。

本発明の因子は甲状腺組織より単離され得、５００ｋｄを越える高分子量の複合 体として提供される。複合体は、８Ｍの尿素によって、少なくとも部分的にサブ ユニットに解離され得る。

このサブユニットは複合体の活性を保持し、やはり高分子量である。本明細書に おいて、本発明の「因子Ｊ　（ＴＤＣＳＦ）とは、非解離型の複合体と、上記の ように解離したサブユニットとの両方を含む。本因子のこれら両方の形態ともに 、無血清条件下で、溝膜の線維芽細胞、および成体の関節性軟骨細胞の成長を刺 激することが可能である。

本因子は甲状腺組織より、組織ホモジネートの上清からの４０〜８０％硫酸アン モニウム分画をヘパリン−セファロース上でのクロマトグラフィーにかけること によって入手し得る。

コノ因子は、約０．５Ｍ（７）　ＮａＣ１’Ｔ”溶出サセ、１ｍＭ（７）　２− ＭＥを含むＤＰＢＳに対して透析した後、試験に用いる。保存すべきサンプルは すべて、１ａＡ４の２−ＭＥを含む水に対して透析し、凍結乾燥する。

この因子は、ゲル濾過によってさらに精製し得る。ゲル濾過処理において、この 因子は、１０６〜１ｏ４ダルトンの分子量限界を有するセファクリルＳ−３００ カラムから排除される。この因子は、所望されれば、ネイティブの（ｎａｔｉｖ ｅ）ゲル電気泳動を用いてさらに精製し得る。

単離され精製された因子は、以下の特性を有する：１、この因子の複合体型は、 ８Ｍの尿素によって、少なくとも部分的にサブユニットに解離される。このサブ ユニットは、以下に示す複合体の特性を保持する。

２、この因子は酸性である。すなわち、以下の条件において、弱い（カルボキシ メチルセルロース）または強い（ｍｏｎｏ−Ｓ）カチオン交換カラムにはｐ）１ ７．２で結合しないが、弱い（ＤＥＡＥセルロース）または強い（ｍｏｎｏ−Ｑ ）アニオン交換カラムにはｐＨ７，２で結合する：候補物質を、１ｍＭのβ−メ ルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存在下でｐＨ７，２で１７１０のダルベツコ の（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）　！Ｊン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）の存在下で 、アニオンまたはカチオン交換基を含むカラムにかける。イオン交換樹脂は、予 め１／ｌ０ＤＰＢｓで平衡化させておく。次に、排除容量中に候補物質が存在す るかどうかを評価する。イオン交換樹脂は次に、塩のグラジェントで溶出させ、 溶出液中に候補物質が存在するかどうかを確認し得る。

３、本発明の因子は、以下のアッセイにおいて軟骨細胞の成長を刺激する。

成体の関節性軟骨細胞を、撓骨手根骨の関節からのウシ軟骨を採集することによ って調製し、ゲンタマイシン（５０ｕｇ／鱈）およびバクテリア出来コラゲナー ゼ（ＣＬＳ−ＩＩおよびＣＬＳ−［Ｖ）をそれぞれ０．５＋＋ｇ／ｍｌの濃度で 含む、ダルベツコの改変イーグル（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地（ＤＭＥＭ）　２０ｍ １中で分離させる（Ｋｏｈａｔｓｕ、Ｎ、　Ｄ、　、ら−、−Ｔｒａｎｓａｃｔ ｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　２７ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　。

ｆ　ｔｈｅ　０ｒｔｈｏｐｅｄｆｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｏｃｉｅｔｙ−（１ ９８１）、ｉ：２１４）　ｏ分離した細胞を、４５０ｇで１５分間の遠心分離に よって集め、ＤＰＢＳで２回、ＤＭＥＭで１回洗浄する。Ｎｙｔｅｘ濾過によっ て単細胞を得て、血球計での計測によって細胞数を測定し、トリパンブルー染色 排除法によって成育能力を評価した。無血清培地で希釈した後、細胞を１６−＋ ａｍプラスチックウェル（２４ウェル／ブレート）中にＺｘ１０５細胞／ｃＩ１ １２ノ濃度で分散させ、７％ｃｏ２．１００％湿度、３７℃でインキュベートす る。培地は、１：１の比で混合したＤＭＥＭおよびハムの（Ｈａｍ’ｓ）　Ｆ− １２培地からなる。この混合物の硫酸イオン濃度ｊ１７８．６Ｂ／１　’ｔ’あ る。ゲンタマイシン（５ｏｕｇ／ｍｌ）、セレン（２Ｘ１０−８Ｍ）　、および 脂質補助剤（Ｂｅｔ　ｔｇｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、　、ら、、　Ｐｒ。

ｃ　ＨａΩ」二疫ユ吐」鉦（１９８１）胆：５５８８−５５９２）もまた添加し た。

これらの脂質は、上記に参照したＪｏｎｅｓおよびＳｎ＋　ｉ　ｔｈの論文（Ｊ 　０ｒｔｈｏ　Ｒｅｓ　（１９９０）　８：２２７−２３３）に記載されたよう に、使用直前に調製したリポソームとして培地に移す。使用に先だって、調製済 みのリポソームを１：１でＤＭＥＭ中に希釈する。混合物を窒素下４℃で３分間 音波処理し、限外濾過（０，２２μ園）によって滅菌する。培養皿を、これらの 無血清条件下で細胞を培養する前に、ポリーＤ−リシン（０，ｌｒｒｒｇ／ｒｎ ｌ）で処理する。ポリリシンは、滅Ｗ１蒸留水で繰り返し洗浄することによって 除去する（　３ｘ１ｍｌ／ｌエル）。

上記の培養培地は３日ごとに交換し、すべての培養条件においてゲンタマイシン （５０Ｍｇ／ｍｌ）を維持する。各ウェルは０゜５ｍｌの培地を含む。

アッセイ自体においては、トリチウム化チミジン（メチル−３Ｈ−チミジン、２ ７．７Ｃｉ／ｇ）を０，５μＣｉ／ウエルで培地に添加し、このラベル化チミジ ンの存在下でウェルを７２時間３７°Ｃでインキュベートする。次に各ウェルか ら培地を除去し、ＬｍｌのＤＰＢＳで細胞層を穏やかに２回洗浄して、取り込ま れていないチミジンを除去する。０．５ｍｌのＩＮ水酸化ナトリウムを添加し６ ０°Ｃで１時間加熱することによって、細胞を可溶化する。次に可溶化したサン プルを計測する。

４、本発明のＴＤＣＳＦは、溝膜の線維芽細胞の成長を刺激する。

この因子が溝膜の線維芽細胞の成長を刺激する能力は、軟骨細胞の刺激の評価に 関して上述したものと同様の方法で、アッセイされる。ただし、細胞源として、 無菌条件下で解剖した５〜７歳の酪農用ウシからの、撓骨手根骨の関節の溝膜内 層を用いる。関節性軟骨細胞に関して上述したものと同様の方法で、溝膜を分離 し、細胞を調製し培養する。

５、本発明の因子は、上記のアッセイにおいて、その活性を保持する能力に関し て以下の特性を有する。

ａ）この因子を６０℃で１時間加熱しても活性は破壊されない。

ｂ）この因子を１００°Ｃて１時間加熱すると活性が破壊される。

Ｃ）この因子をＤＰＢＳ中１ｍＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存 在下でトリプシン（１００μｓ／ｍｌ）を用いて３０分間２５℃で処理し、その 後反応をトリプシン阻害剤（１００μｇ／ｍｌ）を用いて停止させると、活性が 破壊される。

ｄ）この因子をＤＰＢＳ中１ｍＭの２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存 在下で０．１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）　ヲ用いテ２２℃で３０分間処 理しても、活性は破壊されない。

ｅ）この因子をＤＰＢＳ中１ｍＭの２−ＭＥの存在下でＩＭの酢酸の存在下で４ °Ｃで３０分間処理すると、活性が破壊される。

後半の３つの条件においては、この因子は、まずＬｍＭの２−ＭＥを含むＤＰＢ Ｓに対して２４時間（１，２〜２ｋｄの透析チューブを用いて）透析し、その後 活性を試験する。

上記の基準を用いて、本発明の因子の特性を確認し証明し得る。

言ｌじＬ衷 本発明のＴＤＣＳＦは、ヒト、ウシ、ブタ、トリまたはヒツジを含む任意のを推 動物源の甲状腺組織から調製される。

代表的かつ簡便な方法としては、まずヒトまたはウシの甲状腺組織をホモジナイ ズして粗ホモジネートを得、これを次に遠心分離して上清を得る。遠心分離は高 いｇ（約３０．　ＯＯＯｇ）で３０〜６０分間行う。上清を次に、一連の硫酸ア ンモニウム濃度で処理する。

代表的な手法においては、ｐＨ７，２で４０％飽和の硫酸アンモニウムを添加し て、沈澱を除去する。次にｐＨ７，２で硫酸アンモニウム濃度を８０％飽和まで 増加させ、沈澱を回収する。回収された沈澱を、次に再溶解させ、透析して塩類 を除去し、ヘパリン−セファロース上でのクロマトグラフィーにかける。

カラムは、０．５Ｍ（７）ＮａＣ１，２５ｍＭのトリス−１（ＣＬ　ｐＨ７，２ 、および１ｍＭのＥＤＴＡで平衡化させる。本因子は、０．５ＭのＮａＣ１でカ ラムがら溶比する。このカラムは次に、わずかにより高濃度の塩、代表的には０ ．６５ＭのＮａＣ１で洗浄し得る。

この部分的に精製された因子は、上述のＴＤＣＳＦの特性を有する。活性を含む 分画をプールして、１ｍＭの２−ＭＥを含む水に対して徹底的に透析し、次に凍 結乾燥して一２０″Ｃで保存する。直ちに活性を試験すべきときには、１ｍＭの ２−ＭＥを含むＤＰＢＳに対して透析する。アッセイの前に、この因子を、１ｍ Ｍの２−ＭＥを含むＤＰＢＳ中に懸濁させる。

本因子は還元剤（例えば１ｍＭの２−ＭＥ）の存在下で１〜２年間保存し得る。

還元剤の非存在下で６ケ月より長期間保存すると、たとえ−２０’Ｃであっても 、この因子は活性を失う。

さらなる精製においては、ヘパリン−セファロースからの透析された溶出液を、 セファクリルＳ−３００にかける。これにより、高分子量物質を組成物の残りの 部分から、調製レベルで分離することが可能になる。カラムは、１ｍＭの２−Ｍ Ｅを含む１／１０　ＤＰＢＳで平衡化させる。本因子は、上記のようにしてカラ ムにかけたとき、または５Ｍもしくは８Ｍの尿素の存在下でカラムにかけたとき 、排除容量中に溶出する。

本因子は、非変性条件下でのゲル電気泳動にかけることによって、複合体として 、または解離型として、さらに精製し得る。

広遵！υ引毀 ヘパリン−セファロースカラムから溶出した部分精製因子、あるいはゲル濾過か ら得られるさらに精製された成分は、本発明のＴＤＣＳＦに対して特異的な抗体 を生産するための免疫原として使用し得る。これらの抗体は、標準的なイムノア ッセイ技術を用いる、生物学的流体中に天然に見いだされるＴＤＣＳＦのレベル 評価において有用である。この抗体は、必要であればアジュバントの存在下、適 切な哺乳動物の被験体、例えば、ウサギ、マウス、あるいはヒツジへ、反復した 免疫処置で調製物を注入すること、および注入した宿主の血清の力価を、標準の ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイを用いて測定することによる、従来の免疫処置 のプロトコルを用いて調製される。高力価の血清が得られる場合、この血清は、 免疫学的検定のための抗体源として、採取され得る。この抗体、またはこれらの 特異的な免疫反応性フラグメント、例えば、Ｆａｂ、　Ｆａｂ’、あるいはＦ　 （ａｂ）　’　２は、これらのアッセイに用いられ得る。酵素の、放射性の、ま たは蛍光の標識を用いる、イムノア、セイのためノプロトコルの特質は、当該分 野で周知である。さらに、固体の支持体に結合した抗体は、アフィニティクロマ トグラフィによって、ＴＤＣＳＦを精製することに用いられ得る。

ポリクローナル抗血清の調製のほかに、モノクローナル抗体は、本発明のＴＤＣ ＳＦは、例えば免疫化した動物の肺臓から採取すること、およびハイブリダイゼ ーションまたはウィルス感染によりこれらの細胞を不滅化することによって調製 され得る。不滅化された細胞が所望の抗体を分泌することは、本発明の部分的に 精製されたＴＤＣＳＦを抗原として用いるイムノアッセイに、上清を被験させる ことによって、確認される。次に、抗体−分泌コロニーは、インビトロまたは腹 水液中で培養される。

乱五二扛皇惣 因子はまた、固体の支持体、標識または他のエフェクター分子との結合物として 調製され得、軟骨細胞および溝膜の線維芽細胞を標的とする因子の能力を利用す るる。標的細胞の、代謝を改変する標識またはエフェクター分子は、標識または エフェクターを標的に送達すること、あるいは標的を固体の支持体に結合するこ とによる標準的な結合技術を用いて、本発明の因子と結合し得る。

例えば、関節の軟骨細胞の制御されない成長は、ゾシンＡまたはジフテリア毒素 のような毒と結合したＴＤＳＣＦを用いてこれらの細胞に毒素を送達することに より、制御され得る。さらに、本発明のＴＤＣＳＦにより代謝が影響される細胞 は、放射性のまたは蛍光の標識と結合した因子を用いることで、標識されおよび 位置を確認され得る。さらに、この因子は固体の支持体に結合し得、上述のよう に調製した抗体の精製のための、ＴＤＣＳＦと特異的に反応するレセプターを含 有する細胞集団の精製および単離のための、アフィニティカラムとして用いられ 得る。

五月」Ｌ廷孟二８え笠 本発明の因子は、インビトロおよびインビボの両方テ、軟骨細胞および溝膜の線 維芽細胞の増殖を刺激することに有用である。

第一に、上述したアッセイより明らかなように、因子はこれら細胞の培養物で血 清代用物として用いられ得る。従って、軟骨細胞および溝膜の線維芽細胞の両方 とも、本発明の因子を２００μｇ／ｍｌ培地くらいの濃度で培養物に添加される とき（甲状腺のホモジネートから約５倍に精製された成分として）、無血清条件 下で増殖し得る。

さらに、本発明の因子は、インビトロでの関節修復のための軟骨移植物の発達に 有用である。このような移植物では、軟骨細胞は、調製できるベースで、上述し た培地を用いて集密するように培養される。マトリックスはまた、軟骨細胞の凝 果を促進するように供給される。因子は、上述したように、一般的にインビトロ 培養に、有用な濃度と同等の濃度で供給される。

生じた移植物は、また骨および組織の修復に使用され得、そして因子の追加量は 、取り巻いている組織への移植を刺激するために、移植物を添加し得る。骨格系 にこのようなマトリックスを、外科的に移植することの意味は、当該分野に理解 されている。

さらに、本発明の因子は、外傷あるいは変性関節疾病の状態で、局部的なあるい は全身的に軟骨の修復を刺激し、および組織を維持するために標準の薬剤組成物 として投与され得る。従って、本発明の因子を有効に投与された被験者は、骨粗 しよう症、骨折、軟骨の変性疾病にかかっている被験者、または移植のために溝 膜の線維芽細胞または軟骨細胞で被覆された移植片を、供給された患者である。

好ましくは、本発明のＴＤＣＳＦは、関節への洗浄によって影響された組織に対 して、直接投与され得る。

以下の実施例は、例示であって本発明を限定するものではない。

亥ｍ上 甲　組　からの軟　細　刺激　の−１および　′ウシ脳から前立腺上皮細胞成長 因子を単離する方法の改変（Ｃｒａｂｂ、Ｊ、　Ｗ、　、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　 Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　（１９８６）　１３６：１１５５−１１６ １；ＭｃＫｅｅｈａｎ、Ｗ、Ｌ、ら、、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８７ ）　１６４＋５６３−５６９）を用いた。簡単に言えば、ウシ甲状腺組織（４５ ｇ）を、０、２５ｍＭ（７）フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ。

および１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含有する、４５０ｍ１の０．１５ＭＮａｃ ｌ中で、組織ブレンダーおよびポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）組織ホモジナイ ザー（５て１０分間にセット、モデルＰＴＩＯ１Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｌｕｃｅｒｎｅ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ ）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを、４５分間、３０．０００　Ｘ　 ｇで遠心分離し、そして、上清を、ｐＨ７，２の、４０％および８０％飽和の硫 酸アンモニウムで沈澱させた。４０％沈澱物をｌｏｏｍｌの水に懸濁し、そして ８０％沈澱物を３６ｍ１の水に懸濁した。両方の沈澱物を、６０時間にわたって 頻繁に変えて、２０リツトルの水に対して透析した。これらの透析された溶液を 、上述したように関節の軟骨細胞の成長を刺激する能力につぃて試験した。

８０％沈澱物は活性を示したが、４０％沈澱物は示さなかった。

ホモジネートの一部およびｐＨ７，２で４０−８０％飽和間で沈澱した硫酸アン モニウム画分の一部は、表１に示すように、総サンプルから算出した総Ｃｐｍに 関して、同等の活性を示した。

総タンパク質の約１７３であるが、全ての活性を、４０−８０％沈澱物中に回収 した。

さらなる精製において、８０％透析された硫酸アンモニウム画分＜７）　５ｍｌ 　（２３，５ｍｇ（７）　９７　ハ’）質）を、Ｏ，ＳＭ　ＮａＣ１，２５ｍＭ 　）　’ＪスーＨＣＩ（ｐＨ７，２）およびＬｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化した、１ ．５　ｘ　２２．　Ｏｃ＋ｎヘパリン−セファロース（ファルマシア）カラムへ 添加シた。

カラムを約２容量（８０ｍｌ）の平衡緩衝液で、洗浄した。ＵＶ吸収（２ａＯｎ ｍ）により測定したタンパク質を含有する溶出物の国分を、プールした。次にカ ラムを８０ｍ１＜７）　Ｏ，ＳＳＭ　ＮａＣ１，２５＋＋Ｍ　トＵスーＨＣＩ（ ｐＨ７，２）および１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液、および８０ｍ１の２．０ＭＮａＣ１ ，２５ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，２＞および１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で洗浄 した。両方の洗浄に続いて各々溶出物をプールし、ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測 定し、そして０．１０以下になるまで観察した。

各々３つの溶出物を、１６リノトルの水に対して１２時間毎にかえながら４８時 間にわたって透析し、次に、−晩凍結乾燥して乾燥し、５０ｍ１の水に再懸濁し 、そして−２０’Ｃで貯蔵した。最終タンパク質の測定をＢｉｏ−Ｒａｄタンパ ク質アッセイ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ 、ＣＡ）を用いて行った。貯蔵のために、溶出物をｌｄ　２−ＭＥの存在下でフ リーズドライ（凍結乾燥）しなければならない。０．６５Ｍ　ＮａＣ１または２ ．０Ｍ　ＮａＣ１溶出物はどちらもこのア・２セイで活性を含有していなかった が；しかしながら、０．５Ｍ　ＮａＣ１で取り除いた画分は、総活性の保持、お よびタンパク質の大部分を示した。これらの結果もまた表１に（以下余白） ふｂ セファクリルＳ−３００によるさらに精製した結果を、以下に述べる。

寒３Ｊ−工 ０、５Ｍ　淀　の　′　・　け 透析され、凍結乾燥された溶出物は、−２０°Ｃで６力月以上は保存できなかっ た：しかし、１ｍＭβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えると、活性が 安定し、２年間に渡って保存された。

Ａ、溶出物を２Ｍ　ＮａＣ１で１時間処理し、膜の孔のサイズが３０ｋｄの、セ ントリクロン−３０ミクロコンセントレータ−（Ｃｅｎｔｒｉｃｒｏｎ−３０ｍ １ｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いてサイズ分別を行った０活性はすべ て残存物中にあることが示され、これによって、活性因子が、ヘパリン−セファ ロース結合を抑制し得る、ＦＧＦヘパリン複合体（これであれば２Ｍの塩で解離 されたはずである）ではないということがわかる。

Ｂ、溶出物は、上述のようにテストすると、弱いカチオン交換カラムにも強いカ チオン交換カラムにも結合せず、弱イアニオン交換カラムおよび強いアニオン交 換カラムの双方に結合した。溶出物をアニオン交換で処理すると、塩化ナトリウ ムの濃度勾配による溶出で、活性が分散し広いピークとなった。

Ｃ１また、溶出物の、溝膜線維芽細胞による標識化チミジンの取り込みを刺激す る能力をテストしたところ、溶出物を過剰に用いると取り込みが２．４倍増加し た。陽性の対照とじての、１Ｍｇ／＋ｌのｂＦＧＦは、取り込みをほぼ同程度増 加させた。

Ｄ、再懸濁された因子を１ｍＭ　２−ＭＥを含有するＤＰＢＳで１，１で希釈し た、溶出物のみによる刺激活性（９０３ｃｐｍ）に比べると、透析された溶出物 による軟骨細胞への刺激活性（４０４ｅｐｍ）は減少したが、それでも対照（１ ７４ｃｐｍ）に比べると有意であった。

Ｅ、　１ｍＭ　２−ＭＥを含有する１ｍｌのＤＰＢＳ緩衝液を、透析され再懸濁 された０、　５ＭのＮａＣｌヘパリン−セファロース溶出物１ｍｌと混合し、希 釈溶液をテストすることによって、さらにテストを行った。

ｉ）コ（７）溶液ｓｏｏμｉを、０．１Ｍ　ｏＴＴ＋：ｇ整し、２２℃’？’３ ０分間保持すると、軟骨細胞アッセイでは活性の減少は見られなかった；実際、 透析された溶出物よりも、取り込みはわずかに高かった（５２６ｃｐｍ）。

ｉｔ）同容量の１：１希釈液をＩＮ酢酸に調整し、４°Ｃで３０分間保持し、そ の後アッセイでテストした；処理した溶出物をテストすると、放射能の取り込み は対照とほぼ同じであった（２３８ｃｐｍ）。

ｆｉｉ）１：１希釈液５００μｍを加えて、１００　μｇ／＋ａｌのトリプシン テ、２５℃で３０分間処理し、１００μｇ／ｍｌのトリプシンインヒビターで処 理を止めた。得られたものをテストすると、計測された取り込みは２０８ｃｐｍ まで減少し、これも有意でなかった。

ＤＴＴ−処理したサンプル、ＨＯＡｃ−処理したサンプル、およびトリプシン− 処理したサンプルを、孔サイズ１．２〜２ｋｄの透析チューブを用いて、１ｍＭ 　２−ＭＥを含有するＤＰＢＳ　２Ｌで、２４時間、透析し、アッセイでテスト した。

Ｆ、透析され、再懸濁された０、５Ｍ　ＮａＣ１溶出物の５０μｌのサンプル２ つを、それぞれ６０℃と１００℃とに１時間加熱した。１００℃に加熱したサン プルは、対照と同様のｃｐ＋ｎの取り込みを示した；６０℃に加熱したサンプル は、およそ４００ｃｐｍの取り込みを示した。

爽立五主 ０．５　Ｍ　ＮａＣ１１”　のさらなる　ｔヘパリン−セファロースカラムから 得た０、　５Ｍ　ＮａＣ１溶出物を、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ −３００を用いてさらに精製した。

セファクリルＳ−３００は、１０４〜１０′′ダルトンの分子量をカットオフし 得る。２．５　Ｋ　４１．０　ａｍのＳ−３００カラムを、１＋ａＭ　２−ＭＥ を含有する１／１０　ＤＰＢＳで平衡化した。０．５Ｍ　ＮａＣ１ヘパリン−セ ファロース溶出物４ｍ　ｌをカラムに加えた。このカラムを平衡緩衝液で洗浄し た。さらに、１ｍＭ　２−ＭＥを含有する１／１０　ＤＰＢＳ内で平衡されたこ のＳ−３００カラムを用いて、二次容量変化を考慮に入れて、カラムに載せる前 に５Ｍと８Ｍの尿素で処理した、０．５Ｍ　ＮａＣ１ヘパリン−セファロース溶 出物の一部を流した。流速は３つのカラムすべてにおいて１ｍ１７分であった。

未処理のサンプルおよび５Ｍの尿素で処理したサンプルについて、５ｍｌの画分 を収集し、８Ｍの尿素で処理したサンプルについては３＋ｎｌの画分を収集した 。これらの画分を、上記のようにアッセイのために、関節の軟骨細胞に直接加え た。タンパク質は、２８０ｎｍにおける吸光度によって決定された。

未処理の溶出物については、刺激活性の大部分がＶｏ（６５ｍｌ）またはその周 辺で溶出した（図１）。カラムに載せる前に５Ｍの尿素で溶出物を調整しても、 活性もタンパク質プロフィールも変わらなかったく図２）。８Ｍの尿素で調整し た溶出物も、第一ビークは同じ＜Ｖｏであったが（図３　）　、０．５Ｍ　Ｎａ Ｃｌヘパリン−セフ１０−ス溶出物（２４，ＯＯＯｃｐｍ／＋ｇ）の比活性に比 べると、１．９倍の比活性（４６，０００ｃｐｍ／ｍｇ）を有していた。処理を 行わなくても（４４，０００ｃｐｍ／＋ｇ）　、または５Ｍ尿素で処理しても（ ３３，０００ｃｐｍ／ｍｇ）　、同程度の比活性が観察された。

いずれの場合も、活性の第二ビークは１１５Ｉｌｌの溶出容量において見られた ；第二ビークは、たとえ２−ＭＥが存在していても、−２０℃で保存した後では 、刺激活性を維持できなかった。

上記の表１は、セファクリルＳ−３００の精製分別の効果を示している。セファ クリルカラムによる処理は、比活性を一般にかなり増加させた。

爽産匠土 ヱ丑」じ１１艶 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Ｌａｅｍｍｌ ｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２ユニ６８０−６８５の方 法によって行い、非変性不連続（天然）ゲル電気泳動を、Ｈａｉｅｓ、　Ｂ、Ｄ 、、ら、　−Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９８１）　ＩＰＩ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、、　Ｌｏｎｄｏｎ　ａｎｄ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ 、Ｃ，、１３ページの方法によって行った。およそ５〜１５μｇのタンパク質を 各ゲルに流した。

主要な活性を有する、セファクリルＳ−３００カラムから得たビークを、５％ゲ ル上の天然ＰＡＧＥにかけ、このゲルをクーマシー染色によって発色させた。結 果を図４に示す。

レーン１は、尿素による前処理をしない溶出物を流したカラムから得た、７５〜 ７９ｍ１で溶出した画分である。この発色ゲルは、高度に染色された、ゲルの最 高点の高分子量領域と、チログロブリンと同定される、６６０ｋｄでのノくンド とを有しても）る。

レーン２は、５Ｍの尿素で処理した溶出物からの同様の画分（溶出容量、８５〜 ８９ｍ１）を示しており、高分子量７　ＸＩンドのみを有している。

レーン３は、８Ｍの尿素での処理を行ったカラムから得られた、対応する溶出物 の結果を示している；レーン２（こ比べて、ゲルの最高点での強度が相対的に損 失しており、２つの分散した濃染色領域があることがわかる。このゲル１こ（ま 低分子量成分はない。これらの結果から、上述のようへ活性の損失はないものの 、本発明の因子を表わす複合体が、少なくとも部分的に分離されていることが、 明瞭にわかる。

Ｋ亘Δ旦 ｉ旦亘旦旦玉旦団途 上述のように、血清が存在しない時には、Ｔ３もＴ４もカルシトニンも関節の軟 骨細胞の成長を刺激しない、と（樋こと（ま周知である；そのため、甲状腺組織 の成分の、これらの付加的な成分は、新たに単離された因子の活性には関与しな Ｏ。

チログロブリンは、上記の軟骨細胞アッセイで直接テストされ、不活性であるこ とが確認された。関節の軟骨細胞を刺激する能力を有する、一般に公知の因子が 、本発明の因子とは異なっているということも示された。

上記のように、線維芽細胞成長因子は、酸性形態でも塩基形態でも、ヘパリン− セファ０−スで、ＴＤＣＳＦよりもかなり高い塩濃度で溶出する。本発明の因子 の低濃度での溶出は、ヘパリンと予め複合体を形成することにより、ヘパリン− セファロースへの結合が阻害されることとしては説明し得ない。なぜなら、この 複合体を分離するための条件は、ＦＧＦとして働く調製物から、どんな因子も遊 離させないためである。さらに、出願人は、ＦＧＦに対して免疫反応性である抗 体は、免疫プロット技術を用いて、本発明の甲状腺由来軟骨細胞刺激因子と交叉 反応しない、ということも示した。

インスリン様成長因子１　（、ＩＧＦ−１）は、わずか７．５ｋｄの分子量を有 し、本発明のＴＤＣＳＦに伴うものよりずっと低分子量の、１５０、ｋｄまたは ４０　ｋｄの結合タンパク質に複合される。さらに、ＩＣＦ−１は、ＴＤＳＣＦ とは異なり、酸に対して安定であることが知られている。ＩＧＦ−１１は、ＩＧ Ｆ−Ｉと類似であることが報告されている。

上皮成長因子（ＥＧＦ）も、低分子量であり、活性のためには分子内ジスルフィ ド結合を必要とする。このため、ＥＧＦは、本発明の因子とは異なり、ジスルフ ィド還元剤の存在下では不活性である。さらに、ＥＧＦは、酸に対して安定であ ることが知られている。ＥＧＦに対して調製される抗体は、ＴＤＣＳＦとは交叉 反応しない；さらに、抗ＥＧＦは、本明細書に記載の甲状腺由来因子の刺激活性 を抑制することはない。

ＴＧＦ−βも、低分子量であり、本発明の因子とは異なり、酸に対して安定であ る。ＴＧＦ−βもまた、活性のためにはジスルフィド結合を必要とし、ジスルフ ィドをスルフヒドリル基に還元し得る還元剤に対して不安定である。

最後に、ＰＤＧＦは、ジスルフィド還元剤の存在下では不活性であるという点に よって、本発明の甲状腺由来因子と区別され得る。

容量　（ｍｌ） 宕　蟇　（ｍｌ） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、ＣＬ　”　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｎ　９２８４−４ＣＣ０７Ｋ　３／２０　８３１８−４Ｈ ３／２４　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５１０６ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｅ　８３１０− ２ＪＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離され、精製された形態の甲状腺由来の軟骨細胞刺激因子（ＴＤＣＳＦ） であって、該ＴＤＣＳＦはタンパク質性の複合体あるいはその活性サブユニット であり；該複合体あるいはサブユニットは５００ｋｄより大きい分子量を有し、 および該複合体は、８Ｍ尿素により、少なくとも部分的に解離して活性サブユニ ットとなり得；該ＴＤＣＳＦは、成体軟骨細胞および滑膜線維芽細胞の増殖を無 血清条件下で刺激し； 該ＴＤＣＳＦは酸性であり、トリプシン消化に感受性があり、１Ｍ酢酸の４℃、 １時間の処理により、および１００℃、１時間の処理により不活化されるが、６ ０℃、１時間の処理により不活化されず； 該ＴＤＣＳＦはヘバリン−セファロースから０．５ＭＮａＣｌで溶出され；およ び、 該ＴＤＣＳＦはジスルフィド結合を還元し得る薬剤の存在下で安定化される、Ｔ ＤＣＳＦ。 ２．前記ＴＤＣＳＦが、哺乳動物の甲状腺組織から得られる、請求項１に記載の ＴＤＣＳＦ。 ３．請求項１に記載のＴＤＣＳＦを調製する方法であって、該方法は、以下の工 程を包含する； 甲状腺組織をホモジナイズする工程； 粒子を含まない第一の上澄を得るためにホモジネートから粒子を除去する工程； 第一の沈澱物および第二の上澄を得るために該上澄を４０％飽和の硫酸アンモニ ウムで処理する工程；核第二の上澄を回収する工程； 第二の沈澱物および第三の上澄を得るために該第二の上澄を８０％飽和の硫酸ア ンモニウム、ｐＨ７，２で処理する工程；該第二の沈澱物を再溶解し、およびそ れから硫酸アンモニウムを除去する工程； 該再溶解し、脱塩した第二の沈澱物を、該ＴＤＣＳＦがヘパリンーセファロース に吸着される条件下で、へパリン−セファローズで処理する工程； 該吸着したＴＤＣＳＦを含有するへパリン−セファロースを回収する工程；およ び 該ＴＤＣＳＦをヘパリン−セファロースカラムから溶出する工程。 ４．前記溶出が、０．５ＨＮａＣｌ、ｐＨ７．２で行われる、請求項３に記載の 方法。 ５．さらに該ＴＤＣＳＦを５００ｋｄより小さい分子量の物質から分離する工程 を含む、請求項３に記載の方法。 ６．前記分離が、少なくとも部分的に前記複合体を解離させ得る濃度の尿素の存 在下で行われる、請求項５に記載の方法。 ７．軟骨修復を刺激するのに有用な薬学的組成物であって、該組成物は、活性成 分として請求項１のＴＤＣＳＦを薬学的に受容可能な賦形材との混合物で包含す る。 ８．前記組成物が、骨または関節の移植物である、請求項７記載の薬学的組成物 。 ９．哺乳動物を対象として軟骨修復を刺激する方法であって、該方法は請求項１ に記載のＴＤＣＳＦあるいはその薬学的組成物の処理を必要とする対象に投与す る工程を包含する、方法。 １０．軟骨移植物をインビトロで発達させる方法であって、該方法は、成体軟骨 細胞の培養物を、該軟骨細胞が凝集して該移植物を提供する条件下で請求項１の ＴＤＣＳＦで処理する工程；および、該培養物から該移植物を回収する工程を包 含する、方法。 １１．前記培養物が、前記移植物を支持するためのマトリックスをさらに包含す る、請求項１０に記載の方法。 １２．インビトロで軟骨細胞あるいは滑膜線維芽細胞を培養する方法であって、 該方法は該軟骨細胞あるいは線維芽細胞を請求項１のＴＤＣＳＦの存在下、およ び請求項１のＴＤＣＳＦが存在しないときには成長しない程度に十分に低い量の 血清の存在下で培養する工程を包含する、方法。 １３．請求項１のＴＤＣＳＦと特異的に免疫反応性の抗体。 １４．前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１３に記載の抗体。 １５．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。 １６．請求項１のＴＤＣＳＦの存在、不存在、または量を決定するための方法で あって、該方法は、該ＴＤＣＳＦを含むことが推定される試料と該ＴＤＣＳＦと 特異的に免疫反応性のある抗体もしくは抗体の断片とを、該抗体あるいは断片と ＴＤＣＳＦとの間で複合体を形成し得る条件下で、接触させる工程；および該複 合体の存在、不存在、および量を検出する工程を包含する、方法。 １７．ＴＤＣＳＦを精製する方法であって、該方法は該ＴＤＣＳＦを含む試料と 固体支持体に結合した請求項１３の抗体とをＴＤＣＳＦが該固体支持体に結合し た抗体に吸着される条件下で、接触させる工程；および該支持体からＴＤＣＳＦ を回収する工程を包含する、方法。 １８．標識、固体支持体、およびエフエクター部位からなる群から選ばれる付加 的なリガンドと結合した請求項１のＴＤＣＳＦを包含する、結合物。 １９．前記リガンドが標識である、請求項１８に記載の結合物。 ２０．ＴＤＣＳＦに特異的なレセプターを有する細胞の存在を検出する方法であ って、該方法は該細胞を含むことが推定される環境と請求項１９の結合物とを接 触させる工程；該結合物を該細胞に接近させる工程；および該結合物の位置を検 出する工程、を包含する、方法。 ２１．前記リガンドがエフェクター部位である、請求項１８に記載の結合物。 ２２．前記エフェクター部位がトキシンである、請求項２１に記載の結合物。 ２３．軟骨細胞あるいは線維芽細胞を傷害しあるいは破壊する方法であって、該 方法は、該軟骨細胞あるいは線維芽細胞を含む環境に請求項２２の結合物を投与 する工程；および該結合物が該軟骨細胞あるいは線維芽細胞に接近させる工程； を包含し、 ここで該トキシンを該軟骨細胞あるいは線維芽細胞に送達させる、方法。 ２４．前記リガンドが固体支持体である、請求項１８に記載の結合物。 ２５．ＴＤＣＳＦと特異的に免疫反応性の抗体を精製する方法であって、該方法 は、該抗体を含有する試料と請求項２４の結合物とを、該抗体が該固体支持体に 吸着される条件下で接触させる工程；および、 該支持体から抗体を回収する工程、を包含する、方法。 ２６．その表面にＴＤＣＳＦに対して特異的なレセプターを有する細胞の集団を 単離する方法であって、該方法は該細胞を含有する試料と請求項２４の結合物と を、該細胞が該支持体に吸着される条件下で、接触させる工程；および、該支持 体から該細胞を回収する工程、を包含する、方法２７．請求項２６の方法で調製 された細胞の集団。 ２８．その表面に、ＴＤＣＳＦに対して特異的なレセプターを有する細胞の集団 。