JPH0630797A - 遺伝子多型解析方法 - Google Patents
遺伝子多型解析方法Info
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- JPH0630797A JPH0630797A JP18658192A JP18658192A JPH0630797A JP H0630797 A JPH0630797 A JP H0630797A JP 18658192 A JP18658192 A JP 18658192A JP 18658192 A JP18658192 A JP 18658192A JP H0630797 A JPH0630797 A JP H0630797A
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- Japan
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- stranded
- polymorphism
- sample
- nucleic acid
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 一塩基以上の配列の違いによってできる遺伝
子多型の解析方法の提案。 【構成】 非対称核酸増幅反応によって得られた一本鎖
ＤＮＡを適当な条件下で非変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行うことにより、ある遺伝子部位の持つ変異
および多型を、簡便、迅速、高感度に検出することを可
能とするものである。また既知の多型配列について、上
記のように非対称核酸増幅を行った一本鎖ＤＮＡを混合
したものをマーカとし、該マーカと多数の実サンプルを
同時に泳動することにより、高スループットの多型分類
を可能とするものである。
子多型の解析方法の提案。 【構成】 非対称核酸増幅反応によって得られた一本鎖
ＤＮＡを適当な条件下で非変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行うことにより、ある遺伝子部位の持つ変異
および多型を、簡便、迅速、高感度に検出することを可
能とするものである。また既知の多型配列について、上
記のように非対称核酸増幅を行った一本鎖ＤＮＡを混合
したものをマーカとし、該マーカと多数の実サンプルを
同時に泳動することにより、高スループットの多型分類
を可能とするものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子診断もしくは医
療上必要な遺伝子検査上有用な遺伝子多型解析方法に関
する。
療上必要な遺伝子検査上有用な遺伝子多型解析方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトおよびその他の生物の遺伝子中に蓄
積された多型は、遺伝病や免疫機構などと関連して医学
的情報を多く含み、その迅速かつ正確な解析方法が望ま
れている。
積された多型は、遺伝病や免疫機構などと関連して医学
的情報を多く含み、その迅速かつ正確な解析方法が望ま
れている。
【０００３】例えば、免疫機構と非常に関係の深い組織
適合性抗原（ＨＬＡ）遺伝子中には４００種類以上の多
型が蓄積されており、これらの組み合わせにより１００
００種類以上の抗原型が存在する。この抗原型の決定
は、臓器移植の場合など特に重要な問題であるほか、多
くの疾病との関係が示唆されており、ＨＬＡ抗原型の決
定は今後診断や医療検査の分野で非常に重要になってく
る。
適合性抗原（ＨＬＡ）遺伝子中には４００種類以上の多
型が蓄積されており、これらの組み合わせにより１００
００種類以上の抗原型が存在する。この抗原型の決定
は、臓器移植の場合など特に重要な問題であるほか、多
くの疾病との関係が示唆されており、ＨＬＡ抗原型の決
定は今後診断や医療検査の分野で非常に重要になってく
る。
【０００４】また一塩基レベルの遺伝子多型の検出は、
遺伝子配列中の突然変異の検出を意味し、癌を始めとす
る多くの疾病の診断につながる。発癌や転移のメカニズ
ムに関しては遺伝子変異の寄与が示唆されており、多数
の検体に対して迅速に遺伝子多型および変異の分類決定
が可能となれば、診断や癌種の同定に非常に役立つと考
えられる。
遺伝子配列中の突然変異の検出を意味し、癌を始めとす
る多くの疾病の診断につながる。発癌や転移のメカニズ
ムに関しては遺伝子変異の寄与が示唆されており、多数
の検体に対して迅速に遺伝子多型および変異の分類決定
が可能となれば、診断や癌種の同定に非常に役立つと考
えられる。
【０００５】上記のような一塩基レベルの遺伝子多型を
好感度に検出する手段として、一本鎖ＤＮＡがとる高次
構造の違いを利用してＤＮＡの塩基配列多型を解析する
方法（Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ）が、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミイ オブ サイエンス オブ ユ
ーエスエ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆＮａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆＵ．
Ｓ．Ａ．）Ｖｏｌ．８６，ｐｐ２７６６〜２７７０（１
９８９）にあるようにＭ．Ｏｒｉｔａ等によって提案さ
れた。
好感度に検出する手段として、一本鎖ＤＮＡがとる高次
構造の違いを利用してＤＮＡの塩基配列多型を解析する
方法（Ｓ．Ｓ．Ｃ．Ｐ）が、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミイ オブ サイエンス オブ ユ
ーエスエ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆＮａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆＵ．
Ｓ．Ａ．）Ｖｏｌ．８６，ｐｐ２７６６〜２７７０（１
９８９）にあるようにＭ．Ｏｒｉｔａ等によって提案さ
れた。
【０００６】この方法は、適当な方法によって抽出され
たＤＮＡ塩基配列上の標的部分を、適当な変性手段によ
って互いに相補的な一組の一本鎖ＤＮＡに解離し、それ
らを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。
この時にそれぞれの一本鎖ＤＮＡの泳動速度は、該一本
鎖ＤＮＡがとる高次構造の影響を受けて変化し、しかも
この高次構造は該一本鎖ＤＮＡの配列によって特異的に
決まるので、この性質を利用して少なくとも一塩基の違
いによる配列多型を検出するものである。
たＤＮＡ塩基配列上の標的部分を、適当な変性手段によ
って互いに相補的な一組の一本鎖ＤＮＡに解離し、それ
らを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。
この時にそれぞれの一本鎖ＤＮＡの泳動速度は、該一本
鎖ＤＮＡがとる高次構造の影響を受けて変化し、しかも
この高次構造は該一本鎖ＤＮＡの配列によって特異的に
決まるので、この性質を利用して少なくとも一塩基の違
いによる配列多型を検出するものである。
【０００７】この方法は非常に簡便で、しかも一塩基の
違いによる多型も感度良く検出することが可能であるの
で、以前に発明されていた制限酵素切断多型解析法や、
配列特異的ＤＮＡプローブによる多型解析法に比べて非
常に有利であると考えられ、最近は、核酸増幅法（以下
ＰＣＲ法と略称する）と組み合わせて、多型解析や遺伝
子変異の同定にしばしば用いられている。
違いによる多型も感度良く検出することが可能であるの
で、以前に発明されていた制限酵素切断多型解析法や、
配列特異的ＤＮＡプローブによる多型解析法に比べて非
常に有利であると考えられ、最近は、核酸増幅法（以下
ＰＣＲ法と略称する）と組み合わせて、多型解析や遺伝
子変異の同定にしばしば用いられている。
【０００８】しかしこの方法においては、試料を一本鎖
に変性後、非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
を行なっている間に、ゲル中で一本鎖内部での高次構造
化と相補的な一本鎖ＤＮＡ同志での再会合が競合するた
め、最適条件の選定が煩雑となり、その為に上記方法の
適用範囲が制限を受けていた。
に変性後、非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
を行なっている間に、ゲル中で一本鎖内部での高次構造
化と相補的な一本鎖ＤＮＡ同志での再会合が競合するた
め、最適条件の選定が煩雑となり、その為に上記方法の
適用範囲が制限を受けていた。
【０００９】例えば、泳動時のゲルの温度や泳動に供す
る試料の量が多くなると、一本鎖の高次構造化よりも相
補的な一本鎖ＤＮＡ同志での再会合が優先的に起こり、
その結果多型の検出が困難となっていた。
る試料の量が多くなると、一本鎖の高次構造化よりも相
補的な一本鎖ＤＮＡ同志での再会合が優先的に起こり、
その結果多型の検出が困難となっていた。
【００１０】また、互いに相補的な一組の一本鎖ＤＮＡ
を同時に泳動するので、それぞれの一本鎖のバンドが非
常に接近して検出され、泳動パタンの分離が悪く、加え
てヘテロ接合型の遺伝子の場合４本のバンドが検出され
バンドパタンが複雑化する。
を同時に泳動するので、それぞれの一本鎖のバンドが非
常に接近して検出され、泳動パタンの分離が悪く、加え
てヘテロ接合型の遺伝子の場合４本のバンドが検出され
バンドパタンが複雑化する。
【００１１】一方、この短所を解決する手段として、も
ともと一本鎖であるＲＮＡを用いて電気泳動を行い、高
次構造多型を検出する方法がゴビンダ サーカー等（Ｇ
ｏｂｉｎｄａ Ｓａｒｋａｒ ｅｔ． ａｌ．）によっ
て示されている（ヌクレック アシド リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ））Ｖｏｌ．
２０、Ｎｏ．４，ｐｐ８７１〜８７８（１９９２）が、
この方法では、核酸増幅時のプライマ配列中にＲＮＡ転
写用のプロモータ配列を組み込むことや、増幅反応後に
ＲＮＡ転写反応を行わなければならないなど、手順が複
雑化することに加えて、ＲＮＡが分解しやすいことに注
意を払わなければならないという欠点がある。
ともと一本鎖であるＲＮＡを用いて電気泳動を行い、高
次構造多型を検出する方法がゴビンダ サーカー等（Ｇ
ｏｂｉｎｄａ Ｓａｒｋａｒ ｅｔ． ａｌ．）によっ
て示されている（ヌクレック アシド リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ））Ｖｏｌ．
２０、Ｎｏ．４，ｐｐ８７１〜８７８（１９９２）が、
この方法では、核酸増幅時のプライマ配列中にＲＮＡ転
写用のプロモータ配列を組み込むことや、増幅反応後に
ＲＮＡ転写反応を行わなければならないなど、手順が複
雑化することに加えて、ＲＮＡが分解しやすいことに注
意を払わなければならないという欠点がある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、一塩
基レベルまでの遺伝子配列の多型を簡便かつ迅速に検出
する方法を提供することである。
基レベルまでの遺伝子配列の多型を簡便かつ迅速に検出
する方法を提供することである。
【００１３】本発明の他の目的は、従来の方法よりも広
い範囲の試料に対して有効な多型解析方法を提供し、か
つ、得られる情報量の最適化を図ることである。
い範囲の試料に対して有効な多型解析方法を提供し、か
つ、得られる情報量の最適化を図ることである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明では、実質的に解析の対象とする一本鎖Ｄ
ＮＡのみを解析試料として用いるようにした。
めに、本発明では、実質的に解析の対象とする一本鎖Ｄ
ＮＡのみを解析試料として用いるようにした。
【００１５】また、配列のわかっている多型部位の配列
のうちの少なくとも二種類以上の配列の一本鎖ＤＮＡを
混合したものを、多型マーカとして用い、検体試料と同
時に泳動して、泳動パタンのパタン認識により多型分類
が可能となるようにした。
のうちの少なくとも二種類以上の配列の一本鎖ＤＮＡを
混合したものを、多型マーカとして用い、検体試料と同
時に泳動して、泳動パタンのパタン認識により多型分類
が可能となるようにした。
【００１６】
【作用】実質的に相補鎖を持たない一本鎖ＤＮＡのみを
用いることにより、ゲル電気泳動前の変性過程を取り除
くことが出来る。また、相補鎖との再会合反応が起こら
ないため、泳動条件の違いによって多型検出の可不可が
影響を受けにくい。加えて、再会合反応との競合が起こ
らないため、電気泳動にかける試料の量を多くすること
が可能となり、その結果非放射性の検出系、例えばエチ
ヂウムブロミド染色法で、バンドパタンを検出すること
も可能となる。
用いることにより、ゲル電気泳動前の変性過程を取り除
くことが出来る。また、相補鎖との再会合反応が起こら
ないため、泳動条件の違いによって多型検出の可不可が
影響を受けにくい。加えて、再会合反応との競合が起こ
らないため、電気泳動にかける試料の量を多くすること
が可能となり、その結果非放射性の検出系、例えばエチ
ヂウムブロミド染色法で、バンドパタンを検出すること
も可能となる。
【００１７】実質的に相補鎖を持たない一本鎖ＤＮＡの
みからなる被解析試料を作る一つの方法として、非対称
核酸増幅法（以下非対称ＰＣＲ法という）は極めて有用
である。非対称ＰＣＲ法は、ＰＣＲ増幅のときに使用す
る二つのプライマの一方を過剰、他方を制限量とするこ
とにより増幅産物である相補的な一組の一本鎖ＤＮＡの
産物量比をコントロールするもので、通常のＰＣＲ（対
称ＰＣＲ）とほとんど同様な反応操作により安定な目標
一本鎖ＤＮＡを十分量得ることが出来る。また非対称Ｐ
ＣＲの反応条件を制御することにより、実質的に相補鎖
を持たない一本鎖ＤＮＡのみからなる被解析試料を得る
ことができる。この場合、電気泳動後のバンドパタン
は、ホモ接合型の場合一本となり、ヘテロ接合型の場
合、二本となる。
みからなる被解析試料を作る一つの方法として、非対称
核酸増幅法（以下非対称ＰＣＲ法という）は極めて有用
である。非対称ＰＣＲ法は、ＰＣＲ増幅のときに使用す
る二つのプライマの一方を過剰、他方を制限量とするこ
とにより増幅産物である相補的な一組の一本鎖ＤＮＡの
産物量比をコントロールするもので、通常のＰＣＲ（対
称ＰＣＲ）とほとんど同様な反応操作により安定な目標
一本鎖ＤＮＡを十分量得ることが出来る。また非対称Ｐ
ＣＲの反応条件を制御することにより、実質的に相補鎖
を持たない一本鎖ＤＮＡのみからなる被解析試料を得る
ことができる。この場合、電気泳動後のバンドパタン
は、ホモ接合型の場合一本となり、ヘテロ接合型の場
合、二本となる。
【００１８】一方、産物量比をコントロールして、相補
鎖も検出感度程度に増幅するようにすれば、すべての対
立遺伝子の一本鎖のバンドを検出し、多型分類における
パタンマッチングの精度を向上させることができる。こ
のようにすれば、ヘテロ接合型の場合四本のバンドが検
出され、しかも、目標一本鎖ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡ
の産物量の違いによって生ずるバンドの濃淡の情報か
ら、より正確なパタンマッチングが可能になる。
鎖も検出感度程度に増幅するようにすれば、すべての対
立遺伝子の一本鎖のバンドを検出し、多型分類における
パタンマッチングの精度を向上させることができる。こ
のようにすれば、ヘテロ接合型の場合四本のバンドが検
出され、しかも、目標一本鎖ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡ
の産物量の違いによって生ずるバンドの濃淡の情報か
ら、より正確なパタンマッチングが可能になる。
【００１９】実質的に相補鎖を持たない一本鎖ＤＮＡの
みからなる被解析試料を作る他の方法として、ヒグチ等
（Ｒ．Ｇ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ． ａｌ．）によって
紹介されるようなλ法（ヌクレック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）Ｖ
ｏｌ．１７、Ｎｏ．１４，ｐｐ５８６５（１９８９））
が採用できる。この方法は、通常のＰＣＲ（対称ＰＣ
Ｒ）によって相補的な一本鎖ＤＮＡを得た後、目標一本
鎖ＤＮＡでない一本鎖ＤＮＡをλエキソヌクレアーゼに
より消化してしまう方法であり、実質的に目標一本鎖Ｄ
ＮＡのみを十分量得ることが出来る。
みからなる被解析試料を作る他の方法として、ヒグチ等
（Ｒ．Ｇ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ． ａｌ．）によって
紹介されるようなλ法（ヌクレック アシド リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）Ｖ
ｏｌ．１７、Ｎｏ．１４，ｐｐ５８６５（１９８９））
が採用できる。この方法は、通常のＰＣＲ（対称ＰＣ
Ｒ）によって相補的な一本鎖ＤＮＡを得た後、目標一本
鎖ＤＮＡでない一本鎖ＤＮＡをλエキソヌクレアーゼに
より消化してしまう方法であり、実質的に目標一本鎖Ｄ
ＮＡのみを十分量得ることが出来る。
【００２０】この方法においても、消化の程度をコント
ロールすることによって、上述の非対象ＰＣＲ法とほと
んど同様に相補的な一本鎖ＤＮＡを必要な程度だけ残す
ことが出来、同様な使い方が出来る。
ロールすることによって、上述の非対象ＰＣＲ法とほと
んど同様に相補的な一本鎖ＤＮＡを必要な程度だけ残す
ことが出来、同様な使い方が出来る。
【００２１】
【実施例】以下に本発明の実施例を一塩基レベルの突然
変異配列の検出例を用いて説明する。
変異配列の検出例を用いて説明する。
【００２２】検出する目標多型部位としてはヒトのｆａ
ｃｔｏｒΙΧ遺伝子中から１７１ｂｐの領域を選んだ。
この遺伝子部位には１２種類の点突然変異による多型が
存在することが知られている（Ｇｏｂｉｎｄａ Ｓａｒ
ｋａｒ ｅｔ．ａｌ ；Ｎｕｃｌｅａｔｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２０，Ｎｏ．
４， ｐ ８７１―８７８）。
ｃｔｏｒΙΧ遺伝子中から１７１ｂｐの領域を選んだ。
この遺伝子部位には１２種類の点突然変異による多型が
存在することが知られている（Ｇｏｂｉｎｄａ Ｓａｒ
ｋａｒ ｅｔ．ａｌ ；Ｎｕｃｌｅａｔｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２０，Ｎｏ．
４， ｐ ８７１―８７８）。
【００２３】解析したヒトのＤＮＡはＭａｎｉａｔｉｓ
の方法（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉｎｇ ｐ ２８
０―２８１（１９８２））に従って検体細胞から抽出し
た。１μｇの上記ゲノムＤＮＡを１００μｌの５０ｍＭ
ＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ ８．
３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液中に、各２００μＭ
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、１００ｐ
ｍｏｌ：１ｐｍｏｌのモル比で非対称に調製したオリゴ
ヌクレオチドプライマとともに溶解し、その中にサーマ
ス・アクアティカスからのポリメラーゼ（Ｔａｑ―Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ）を２．５ｕｎｉｔ加えた。これに４
０μｌの鉱油を重層した後、９２℃で２分，５５℃で２
分，７２℃で２分のサイクルを４０回繰り返すことによ
り、目標部位の一本鎖ＤＮＡを特異的に増幅した。この
反応液から鉱油を取り除いた後、２５０μｌの５Ｍ Ｃ
Ｈ3ＣＯＯＮＨ4エタノールを加え０℃，１４０００×ｇ
で３０分間遠心分離を行い、上層部の溶液を取り除いた
（エタノール沈殿）後、沈殿物を１０μｌの０．３Ｍ
ＮａＯＨ，１ｍＭＥＤＴＡ，１０％グリセロール溶液に
溶解し、該溶液の内１０μｌについて、１０％のグリセ
ロールを含む５％の非変性ポリアクリルアミドゲルによ
って電気泳動を行った。本実施例において、ゲルの大き
さは、２０×４０×０．１ｃｍである。また泳動用のバ
ッファとしては、９０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ｂｏｒａｔｅ
（ｐＨ ８．３），４ｍＭ ＥＤＴＡを用い、３０Ｗで
５時間泳動を行った。ゲル及び泳動板の冷却装置として
は、冷却器付き水流循環式恒温槽を用い、ゲル板および
ゲルの温度が２０℃となるように温度制御を行なった。
の方法（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉｎｇ ｐ ２８
０―２８１（１９８２））に従って検体細胞から抽出し
た。１μｇの上記ゲノムＤＮＡを１００μｌの５０ｍＭ
ＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ ８．
３），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液中に、各２００μＭ
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、１００ｐ
ｍｏｌ：１ｐｍｏｌのモル比で非対称に調製したオリゴ
ヌクレオチドプライマとともに溶解し、その中にサーマ
ス・アクアティカスからのポリメラーゼ（Ｔａｑ―Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ）を２．５ｕｎｉｔ加えた。これに４
０μｌの鉱油を重層した後、９２℃で２分，５５℃で２
分，７２℃で２分のサイクルを４０回繰り返すことによ
り、目標部位の一本鎖ＤＮＡを特異的に増幅した。この
反応液から鉱油を取り除いた後、２５０μｌの５Ｍ Ｃ
Ｈ3ＣＯＯＮＨ4エタノールを加え０℃，１４０００×ｇ
で３０分間遠心分離を行い、上層部の溶液を取り除いた
（エタノール沈殿）後、沈殿物を１０μｌの０．３Ｍ
ＮａＯＨ，１ｍＭＥＤＴＡ，１０％グリセロール溶液に
溶解し、該溶液の内１０μｌについて、１０％のグリセ
ロールを含む５％の非変性ポリアクリルアミドゲルによ
って電気泳動を行った。本実施例において、ゲルの大き
さは、２０×４０×０．１ｃｍである。また泳動用のバ
ッファとしては、９０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ｂｏｒａｔｅ
（ｐＨ ８．３），４ｍＭ ＥＤＴＡを用い、３０Ｗで
５時間泳動を行った。ゲル及び泳動板の冷却装置として
は、冷却器付き水流循環式恒温槽を用い、ゲル板および
ゲルの温度が２０℃となるように温度制御を行なった。
【００２４】泳動結果を模式的に図１に示す。バンドの
検出手段として、泳動したゲルをエチヂウム・ブロミド
染色しＵＶ蛍光下で写真撮影を行った。図中レーンＮは
ノーマル（Ｎ；正常）検体からのサンプルであり、レー
ンＳ１〜Ｓ６が変異を有する検体からのサンプルであ
る。点変異の存在によって泳動距離に差が生じ、正常検
体との違いを良好に検出することが可能となっている。
また、Ｓ３およびＳ８では、バンドが２本検出されてい
るが、これはこれらの検体の遺伝子が、ヘテロ接合型で
あることを表わしており、Ｓ３は正常型と変異型のヘテ
ロ接合型、Ｓ８は２種類の変異型のヘテロ接合型である
ことを表わしている。バンドが一本のものはホモ接合型
であり、バンドの太さの違いは、ホモ接合型の場合一つ
のバンド当たりにヘテロ接合型の場合の２倍量のＤＮＡ
が存在することによる。
検出手段として、泳動したゲルをエチヂウム・ブロミド
染色しＵＶ蛍光下で写真撮影を行った。図中レーンＮは
ノーマル（Ｎ；正常）検体からのサンプルであり、レー
ンＳ１〜Ｓ６が変異を有する検体からのサンプルであ
る。点変異の存在によって泳動距離に差が生じ、正常検
体との違いを良好に検出することが可能となっている。
また、Ｓ３およびＳ８では、バンドが２本検出されてい
るが、これはこれらの検体の遺伝子が、ヘテロ接合型で
あることを表わしており、Ｓ３は正常型と変異型のヘテ
ロ接合型、Ｓ８は２種類の変異型のヘテロ接合型である
ことを表わしている。バンドが一本のものはホモ接合型
であり、バンドの太さの違いは、ホモ接合型の場合一つ
のバンド当たりにヘテロ接合型の場合の２倍量のＤＮＡ
が存在することによる。
【００２５】このように本発明によれば、一つの対立遺
伝子に対する少なくとも一塩基以上の変異を明確な一本
の電気泳動バンドの泳動距離の差として検出することが
可能であった。
伝子に対する少なくとも一塩基以上の変異を明確な一本
の電気泳動バンドの泳動距離の差として検出することが
可能であった。
【００２６】加えて本発明によれば、図１に示したよう
なバンドパタンを、ＲＩプローブなどの標識済みプロー
ブを用いずに、エチヂウムブロミド染色という非常に簡
便な検出手段で、十分に良好なバンドパタンを得ること
が出来た。
なバンドパタンを、ＲＩプローブなどの標識済みプロー
ブを用いずに、エチヂウムブロミド染色という非常に簡
便な検出手段で、十分に良好なバンドパタンを得ること
が出来た。
【００２７】次に、パタンマッチング法による多型検出
の一例を図２に示す。図中レーンＭは、上記Ｓ１〜Ｓ６
の試料を適当な濃度で混合したものを泳動しており、他
のレーン（レーンＳ１〜Ｓ６）はそれぞれサンプルＳ１
〜Ｓ６を泳動している。
の一例を図２に示す。図中レーンＭは、上記Ｓ１〜Ｓ６
の試料を適当な濃度で混合したものを泳動しており、他
のレーン（レーンＳ１〜Ｓ６）はそれぞれサンプルＳ１
〜Ｓ６を泳動している。
【００２８】図にあるようにレーンＭのパタンと実サン
プルのパタンを比較することにより、実サンプルＳ１〜
Ｓ６の変異の種類、すなわち多型を分類することが可能
であった。
プルのパタンを比較することにより、実サンプルＳ１〜
Ｓ６の変異の種類、すなわち多型を分類することが可能
であった。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、少なくとも一塩基以上
の配列の違いによる遺伝子多型を、従来用いられてきた
二本鎖ＤＮＡを試料とするＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ．法やＲＮＡ
を試料とするＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ．法に比べて、高感度に、
かつより簡便・迅速に検出することが可能となる。また
既知の遺伝子多型に関しては、多数の実サンプルに対し
て、泳動パタンのパタンマッチング法を適用することに
よって、迅速に遺伝子多型の分類が可能となる。この事
により、癌などに対する遺伝子診断の分野や、臓器移植
時に行う遺伝子多型の検査の分野などの発展に寄与でき
る。
の配列の違いによる遺伝子多型を、従来用いられてきた
二本鎖ＤＮＡを試料とするＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ．法やＲＮＡ
を試料とするＳ．Ｓ．Ｃ．Ｐ．法に比べて、高感度に、
かつより簡便・迅速に検出することが可能となる。また
既知の遺伝子多型に関しては、多数の実サンプルに対し
て、泳動パタンのパタンマッチング法を適用することに
よって、迅速に遺伝子多型の分類が可能となる。この事
により、癌などに対する遺伝子診断の分野や、臓器移植
時に行う遺伝子多型の検査の分野などの発展に寄与でき
る。
【００３０】再会合反応との競合が起こらないことは、
検体試料の多型検出を容易にするだけでなく、効率的な
多型マーカを調製することも可能とする。再会合反応が
起こる状況では、電気泳動を行う場合に一つのレーンに
流すＤＮＡの量が多くなると、再会合反応が起こってし
まうので、たくさんの多型マーカを混合して一つのレー
ンに流すことが不可能であるが、再会合反応が起こらな
ければ、幾種類かの多型を含んだ配列を混合して一つの
レーンに流し、現在市販されている分子量マーカのよう
に、多型マーカを使用することが可能となる。このよう
な多型マーカを使うことにより、パタンマッチングによ
る多型分類が可能となり、迅速で高スループットな多型
解析が可能となる。
検体試料の多型検出を容易にするだけでなく、効率的な
多型マーカを調製することも可能とする。再会合反応が
起こる状況では、電気泳動を行う場合に一つのレーンに
流すＤＮＡの量が多くなると、再会合反応が起こってし
まうので、たくさんの多型マーカを混合して一つのレー
ンに流すことが不可能であるが、再会合反応が起こらな
ければ、幾種類かの多型を含んだ配列を混合して一つの
レーンに流し、現在市販されている分子量マーカのよう
に、多型マーカを使用することが可能となる。このよう
な多型マーカを使うことにより、パタンマッチングによ
る多型分類が可能となり、迅速で高スループットな多型
解析が可能となる。
【図１】本発明の方法により行った電気泳動パタンの模
式図。
式図。
【図２】本発明の方法により行った電気泳動パタンの模
式図。
式図。
Ｎ … 正常検体およびそのサンプルの泳動レーン Ｓ１〜Ｓ６ … 遺伝子変異による多型を有する実サン
プル検体およびそのサンプルの泳動レーン
プル検体およびそのサンプルの泳動レーン
Claims (3)
- 【請求項１】生物又はウイルスの核酸を含む二本鎖ＤＮ
Ａの所定の領域について、この領域を一組みの相補的な
一本鎖ＤＮＡに解離すること、該解離された相補的な一
本鎖ＤＮＡの一方を、結果として、他方に対して非対象
になるように増幅すること、該増幅された一本鎖ＤＮＡ
を非変性ゲル電気泳動に供することを特徴とする一本鎖
ＤＮＡが配列多型に特異的に取る高次構造多型を利用し
て該ＤＮＡの配列多型を解析する方法。 - 【請求項２】非対称核酸増幅法により増幅した一本鎖Ｄ
ＮＡを試料として用いることを特徴とする請求項１記載
の解析方法。 - 【請求項３】多型部位中の既知の配列の内の少なくとも
二種類以上の配列をあらかじめ非対称増幅しておき、そ
れらの増幅産物を混合したものを多型マーカとして用
い、実サンプルと同時に泳動することを特徴とする請求
項１記載の遺伝子多型解析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18658192A JPH0630797A (ja) | 1992-07-14 | 1992-07-14 | 遺伝子多型解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18658192A JPH0630797A (ja) | 1992-07-14 | 1992-07-14 | 遺伝子多型解析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0630797A true JPH0630797A (ja) | 1994-02-08 |
Family
ID=16191049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18658192A Pending JPH0630797A (ja) | 1992-07-14 | 1992-07-14 | 遺伝子多型解析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630797A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050581A1 (en) * | 1997-05-08 | 1998-11-12 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Method for detecting target nucleotide sequence |
| JP2007334140A (ja) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Sekisui Chem Co Ltd | 位相差フィルム |
-
1992
- 1992-07-14 JP JP18658192A patent/JPH0630797A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050581A1 (en) * | 1997-05-08 | 1998-11-12 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Method for detecting target nucleotide sequence |
| US6391546B1 (en) | 1997-05-08 | 2002-05-21 | Isao Karube | Method for detecting target nucleotide sequence |
| JP2007334140A (ja) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Sekisui Chem Co Ltd | 位相差フィルム |
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