JPH06288984A

JPH06288984A - 電気泳動装置および電気泳動キャピラリ管の処理方法

Info

Publication number: JPH06288984A
Application number: JP6067910A
Authority: JP
Inventors: Sally A Swedberg; サリー・エイ・スウェッドバーグ
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: HP Inc
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1994-10-18
Also published as: GB2276244A; US5314593A; GB2276244B; GB9404753D0

Abstract

(57)【要約】【目的】タンパク質の除去が容易におこなうことがで
き、使用寿命の長い電気泳動キャピラリ管を提供する。【構成】本願発明の一実施例は、キャピラリ・ゾーン電
気泳動装置に用いられるキャピラリ管であり、特にタン
パク質溶質の分離に適している。キャピラリ管の内側表
面にまず界面相をコーティングして、その内側表面をシ
リル化させ、そして、アガロースをその上にコーティン
グする。これにより、分離効率を劣化させることなく、
再現性のよいタンパク質の分離に成功し、さらに、使用
寿命も延ばすことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般的にはタンパク質溶
質に対して露出することが可能な固体表面に関し、特に
キャピラリ・ゾーン電気泳動による電気泳動分離に使用
されるキャピラリ管に関する。

【０００２】

【発明の背景】小径のキャピラリ管（75μmまたはそれ
以下）を用いたキャピラリ・ゾーン電気泳動はヨルゲン
ソンとルーカクスによって最初に紹介され、小さな溶質
を分離するための効率的な方法として有用であることを
実証した。J. Chromatog. 218(1981) 209頁、Anal. Che
m., 53(1981) 1298頁参照。検出の単一の点を通過する
荷電している種の物質輸送(mass transport)は、接線方
向に印加された電場の影響下で固体表面に接触している
液体の流れとして一般に説明される電気浸透効果に依存
している。キャピラリ・ゾーン電気泳動による電気泳動
分離の魅力的な要因は、サンプルのサイズが小さいこ
と、サンプルの前処理がほとんどまたは全くないことお
よび生物学的に活性なサンプルの定量と回収(recovery)
の可能性である。例えば、米国特許第4,675,300号で
は、レーザー励起けい光検出器を使用した界面動電分離
法のための理論および機器が記載されている。ここに記
載されたシステムでは、内径75μmのフューズドシリカ
キャピラリ管が用いられている。

【０００３】高性能キャピラリ電気泳動(HPCE)は、巨大
分子の特別に効率の高い分離の可能性を提供する。残念
ながら、最初に期待された高い効率は充填されていない
（開管）カラム技術において、巨大分子ーカラムの相互
作用に基づく項は存在しないという仮定に基づいてい
た。1989年に、サンディエゴの「Academic Press」で出
版されている「Techniques in Protein Chemistry」(Hu
gli編集)には、スウェードベルク等によって実験に基づ
く評価によって支持されている理論的研究によって、こ
の相互作用(K')は非常に小さく、HPCEによる巨大分子分
離の予期される効率に対して著な効果を与えることが示
唆されていた。

【０００４】1,000,000から2,000,000の理論段数の期待
値はHPCEについては非現実的であり、巨大分子の自動的
分離においてこの値はHPCEが有する効果を低下させな
い。バイオサイエンスの最近の刊行物には、他の伝統的
な技術によって解決できなかった特定の分離に関する問
題を解決するためのHPCEの利点が強調されている。例え
ば、J. Biol. Chem. 266(1991)、2474〜2479頁、J. Chr
om. 542(1991) 459〜471頁、Arch. Oral. Biol. 37(199
2) 7〜13頁。技術の有効性に対する主な障壁はカラム技
術の再現性(reproducibility)である。

【０００５】ヨルゲンソン等は未処理のフューズドシリ
カの中で、pH7のリン酸塩緩衝液を用いて、チトクロ
ム、リソチーム、リホヌクレアーゼＡなどのモデル・タ
ンパク質の分離をおこなうと、テーリングが強くあらわ
れ、これは正に荷電したタンパク質と負に荷電したキャ
ピラリ管壁とのクーロン相互作用によって起こることが
述べられている（Science 222(1983)、266頁参照）。

【０００６】Anal. Chem. 58(1986)の166頁には、いく
つかの理想化されたタンパク質とシリカ・キャピラリ管
のキャピラリ管壁との間のクーロン反発力がこれらのタ
ンパク質のキャピラリ管壁との吸着傾向にうちかつこと
が報告されている。溶液のpHをタンパク質の等電点(PI)
に関連させて変化させることによって、それらの実効電
荷を変化させ、モデル・タンパク質（13,000から77,000
の範囲の分子量）の分離を実証した。しかしながら、こ
のアプローチでは、以下に示す欠点があった。(1)シリ
カはpH7以上では溶解し始めることより、カラムの寿命
が短くなり、性能が劣化する。(2)緩衝液のpHよりも低
いpHを有するタンパク質だけが分析可能で、有用な分析
の範囲を著しくせまくする。(3)タンパク質の組成と構
造が複雑であるために、負の実効電荷を帯びたタンパク
質についてさえもクーロン力によるものではない相互作
用が依然として起こる可能性がある。

【０００７】生体高分子あるいはタンパク質の相互作用
の問題を解決するもう一つのアプローチはイオン強度を
大きくすることである。原則としてこの考え方は有効で
あるが、イオン強度が大きくなるにつれて熱(heating)
も増加する。この熱は分離の効率を低下させる。塩の増
加によって、同様の電荷および大きさを有するタンパク
質間の移動度の差も減少させる傾向があり、このため更
に分離効率を低下させることにとなる。

【０００８】しかし、キャピラリ管壁とのタンパク質の
好ましくない相互作用の問題を解決するもう一つのアプ
ローチは、非架橋重合体の単分子層を電気泳動管にコー
ティングすることであった。例えば、米国特許第4,680,
201号では、一方の官能基が特にガラス壁と反応し、他
方の官能基が重合過程に寄与する単量体と反応する２官
能性(bifunctional)化合物を用いることによって電気泳
動分離のための薄膜で径の小さいキャピラリ管を調製す
る方法が述べられている。この方法はポリアクリルアミ
ド・コーティングなどの重合体コーティングによって結
果得られ、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリド
ンなどの他の重合体のコーティングを使用する場合も可
能であることが考察されている。しかしながら、このキ
ャピラリ管の処理のこの方法は電気浸透流を破壊する傾
向があり、効率は依然として低い。比較的低い効率は、
タンパク質とキャピラリ管との好ましくない相互作用が
まだ起きていることを示している。

【０００９】最近では、米国特許第4,931,328号におい
て、電気泳動中のタンパク質の相互作用を減少させ、制
御可能な電気浸透流が示されているキャピラリ管を調製
するための方法が開示されている。キャピラリ管はキャ
ピラリ管の内壁に共有結合している界面層を備えてい
る。界面層は測定可能な等電点を有する水和性の両性相
を有し、溶液のpHを選択することによって電気浸透流の
制御を可能にする。この技術を利用して、タンパク質と
管壁の最小の相互作用による二つの不活性化されたキャ
ピラリ管におけるタンパク質の選択性の変化が示されて
いる（J. High Resol. Chromatog. 14(1991), 65から67
頁参照）。

【００１０】キャピラリ管の内側表面(bore surface)と
タンパク質溶質との相互作用を減少させるもう一つの最
近の方法は、米国特許第5,006,313号に開示されてい
る。ここでは、キャピラリ管の内側壁を複数のハロゲン
原子を有する相互作用の小さい相でコーティングされて
いる。

【００１１】

【発明の目的】本発明の目的は、巨大分子を含む溶質の
電気泳動分離に有用で、溶質と内径(inner bore)との相
互作用が可逆的である小径のキャピラリ管を提供するこ
とである。本発明の他の目的は、さまざまなpH条件下
で、一定の電気浸透流(EOF)を有するCZEを設計するた
め、キャピラリ管の内壁を処理する方法を提供すること
である。本発明のさらに別の目的は、カラムの使用寿命
を延ばし、CZEにおけるカラムの性能を向上させるアガ
ロースによってキャピラリ管の内壁を処理する方法を提
供することである。本発明のその他の目的および利点は
本願明細書および特許請求の範囲の記載より当業者にと
っては自明のことである。

【００１２】

【発明の概要】本発明の一態様では、タンパク質溶質の
電気泳動分離に有用な小径のキャピラリ管は、その内径
と共有結合している界面層を備えている。タンパク質溶
質は、CZEのあいだ、処理表面と容易に接着することは
なく、接着したタンパク質溶質を、分離効率の著しい低
下や電気浸透流の変更なしにキャピラリ管が繰返し使用
できるようにゆるやかな(mild)緩衝液洗浄で除去するこ
とができる。

【００１３】本発明のもう一つの態様では、タンパク質
溶質に対して露出することが可能な表面を処理するため
の方法は少なくとも単分子層のアガロースを表面に結合
させることによって表面を処理することを含む。シリカ
基材の表面については、アガロース層とキャピラリ管の
内部シリカ面との間に他の界面層も使用することができ
るが、アガロースをコーティングする前にシリカ面をシ
リル化することが好ましい。さらに、シリル化条件を制
御することによってEOFのレベルを制御することが可能
である。

【００１４】さらに、キャピラリ管内にアガロースを含
む層を使用することは界面層中のさまざまな化学組成を
使用する既存の電気泳動キャピラリ管と比較して独特の
選択性を有するキャピラリ管を組立てる方法を提供す
る。このため、本発明は通常のシステムが適切に分離す
ることができないタンパク質を分離することができる。

【００１５】タンパク質溶質の電気泳動分離に好適な本
発明の一実施例では、キャピラリ管の内壁表面と結合し
ている界面層を有するキャピラリ管を備えている。界面
層は表面と共有結合しているアガロースを含むものであ
る。本発明に係る調製されたキャピラリ管は、種々のタ
ンパク質混合物の分離に使用することができ、繰返し使
用に対しても良好な再現性と不変の性能を示す。

【００１６】

【発明の実施例】本発明はタンパク質溶質と可逆的な相
互作用(reversible condition)を有するように処理が施
される固体表面を提供する。「可逆的な相互作用」と
は、タンパク質分子が処理が施された表面に接着してい
るとき、これらの分子を緩やかな洗浄条件(mild wash c
onditions)の下で容易に除去することを意味する。緩や
かな条件とは、固体表面の構造的な一体性に悪影響を及
ぼさないが、合理的な時間内にタンパク質を除去するの
に効果的な条件である。詳細には、検出点を通過する前
に、キャピラリ電気泳動(CZE)中にタンパク質溶質が処
理が施されたキャピラリ管の壁に接着するとき、これら
のタンパク質を分離効率の著しい低下あるいは電気浸透
流の変更なしにキャピラリ管が繰返し使用できるように
緩衝液または他の緩和な溶媒(mild solvent)で洗浄する
ことにCZE後に除去することができる。

【００１７】一つの特に好適な適用例は、CZEに用いら
れる管のような径の小さいキャピラリ管である。これら
の管は、通常、内径が500μmまでで、より典型的には約
20μmから約200μmである。便宜上、本願明細書に開示
されるものは、本発明にしたがって処理が施された内径
(bore)を有する小径の（約500μm以下の）キャピラリ管
である。この処理はタンパク質と可逆的な相互作用が可
能な相で、キャピラリ管の内壁と使用時に存在するタン
パク質溶液との間の界面層として内壁に共有結合してい
る相によるものである。

【００１８】従来のHPCEにおいてはタンパク質の分離に
おける再現性に悪影響を及ぼす唯一つの最大の要因はキ
ャピラリ管内面とのタンパク質の非可逆的な相互作用で
あったので、本願発明はCZEに対して特に適している。
タンパク質分子がカラム表面と非可逆的に相互作用する
とき、この相互作用は界面層におけるゼータ電位を変え
ることが知られている。そして、電気浸透流(EOF)を有
するキャピラリ管にとっては、これがEOFを変化させ、
および／または表面選択性を変化させる。いずれの場合
にも再現性(reproducibility)は悪影響を受ける。

【００１９】本発明はある程度はキャピラリ管表面に共
有結合しているアガロースが可逆的なタンパク質ー表面
間の相互作用を提供する安定な界面層を生成するという
発見に基づいている。本発明の表面処理もカラムの使用
寿命を延ばすカラムの性能を向上させる。シリカ基材の
(silica based)キャピラリ管の内壁に共有結合している
可逆相互作用相を有する本発明に係るキャピラリ管を調
製するに際して、シリカ基材のカラムはいずれもここに
取入れられている1990年６月５日発行の米国特許第4,93
1,328号および1991年４月９日発行の米国特許第5,006,3
13号に全般的に記載されているように、前処理を施し(p
reconditions)、シリル化することが好ましい。シリル
化条件はキャピラリ管壁のバルク・コーティングにいく
つかの多層をディポジットさせるように選択することが
できる。さらに、EOFの量はシリル化の量を制御するこ
とによって減少あるいは解消することができる。

【００２０】処理が施される表面がシリカ基材であると
き、この基材をまず水和させ、次に二つの官能基を有す
るオルガノシランまたはクロロシランで処理することが
好ましい。一つの官能基は特にガラス壁と反応する。よ
って、一つまたは二つのアルコキシ基（例えば、メトキ
シ基、アセトキシ基、メトキシエトキシ基またはクロロ
基）はガラス壁のシラノール基と反応して安定な共有結
合を形成する。水溶液中での約0.1から約１重量％のシ
リル化剤濃度では約４から６分子の層が表面に結合する
結果になる。（バルク・ディポジションのためには約50
重量％までの比較的高い試薬濃度が必要である。）この
ような約４から６分子の中間層は未反応のシラノール基
が残留せず、しかも実質的な電気浸透流を可能にするの
で好ましい。シリル化剤の他の官能基は窒素求核試薬、
酸素求核試薬または炭素求電子試薬である。酸素求核試
薬を生成させるシリル化剤が好ましく、これらのシリル
化剤としては3−グリシドキシプロピルジメチルエトキ
シシラン、(3−グリシドキシプロピル)メチルジエトキ
シシラン、3−グリシドキシプロピルメチルジイソプロ
ペノキシシランおよび(3−グリシドキシプロピル)トリ
メトキシシランがある。窒素求核試薬、酸素求核試薬あ
るいは炭素求電子試薬を生成する好適なシリル化剤の例
として米国特許第5,006,313号に記載されている。

【００２１】ディポジット時間および／またはシリル化
剤の濃度を増加させることによって、中間層の厚さを、
EOFが所望のレベルにまで減少するように増加させるこ
とができる。一連の実験において中間層は15分間から２
時間の時間内に0.1％から50％の範囲の濃度の単量体を
重合させることによって形成された。印加された電場の
強度に依存するEOFは、電場の強度が約200から500V/cm
であるとき、約0.5から1.5mm/秒の範囲にある。さら
に、アガロースが中間層に結合した後では、流される緩
衝液のpHが約４から７より変動した場合でも陰極EOFの
大きさ(cathodic EOFmagnitude)は比較的一定に留まる
ことが明らかになった。

【００２２】実験例本発明に係るキャピラリ管を調製する好適な方法におい
ては、25から75μmの内径を有するシリカキャピラリ管
(Polymicro Technologies)に対して、約１から２μl/分
の速度で８から10時間、キャピラリ管の中へKOH溶液を
ポンプで連続的に流し込むことによって、まず0.1NのKO
Hで水和させる。それからキャピラリ管を脱イオン水で
２から３時間洗浄した。使用したシリル化溶液は、80％
エタノール中に１％のグリシドキシプロピルトリエトキ
シシラン(GOPS)を含むもので、約３から４のpHに酸性化
されている。シリル化溶液を１から２カラム体積／分で
0.5時間、キャピラリ管へ流しこみ、該溶液がキャピラ
リ管の各端部を通過するようにした。（GOPSによるバル
ク・ディポジションについては50％のGOPS溶液を使用
し、シリル化溶液を約１時間キャピラリ管の中へ連続的
に流し込み、その中を通過させる。）そして、乾燥ヘリ
ウムを一晩中管に通過させて、塗膜を硬化させた。その
後、ジオール表面を２官能性試薬グルタルアルデヒドに
よって活性化し、ここでは、グルタルアルデヒドの20％
水溶液を１から２カラム体積／分の流量で10から15分間
カラム中へ流した。そして、TEFLONスリーブを使用して
カラムを封止し、80℃で２時間定温放置した。キャピラ
リ管の封止をはずして、pH７で約500μlの0.1Nリン酸塩
緩衝液で過剰の試薬をキャピラリ管から洗い落とした。
その後、0.25％のアガロース溶液(IEFグレード、FMC
社）をキャピラリ管の中へ流し、再び、封止した。80℃
において一晩定温放置した後、キャピラリ管の封止をは
ずして過剰のアガロースを緩衝液でキャピラリ管から洗
い流した。使用する前に、キャピラリ管をカラム体積
(１ml)の数倍の緩衝液流によって平衡状態にした。

【００２３】タンパク質溶質との可逆的な相互作用に関
して本願発明に係るキャピラリ管の有効性を試験するた
めに、キャピラリ管のEOFと効率(N)をCZE装置について
タンパク質の注入前および注入後に測定した。該装置
は、ヒューレット・パッカード・カンパニー製のHP 3D
−CEという商標を有する製品あるいはカリフォルニア州
フレモントのSpectra−Physics Analytical製のSpectra
phoretic 500のどちらかより構成される。サンプル注入
は自動化されていた。

【００２４】二つの基本的なタンパク質、チトクロムＣ
とリソチームが「悪い場合」の例として選んだ。EOFの
決定には、タンパク質の決定を含むEOFマーカーとしてD
MSOを使用した。表１には、本願発明に係るアガロース
で処理が施されるカラムの調製される順々のカラムの特
性について述べている。具体的には、(1)内径25μmの未
処理（裸）シリカキャピラリ管で始まり、(2)GOPSでシ
リル化した後のキャピラリ管、最後に(3)アガロースに
よって処理が施された本発明に好適な一実施例のキャピ
ラリ管である。流す緩衝液はpHが7.0で30℃の20mMリン
酸塩である。各決定の後に流す緩衝液による３分間の洗
浄をおこなった。チトクロムＣをキャピラリ管に注入す
る前と後において、効率およびEOFを測定した。明らか
なことであるが、アガロースの処理が施されたキャピラ
リ管は、チトクロムＣが注入した後もEOFに余り変化が
生じなかった。

【００２５】

【表１】

【００２６】表２は第２のアガロースの処理が施された
キャピラリ管の調製される各過程のカラムの特性を示し
ている。(1)チトクロムＣ、(2)リソチーム、(3)緩衝
液、(4)チトクロムＣの注入前後に効率およびEOFを測定
した。各測定の後に緩衝液で３分間洗浄した。ここで
は、EOFはチトクロム注入でもあまり変化しなかった。
しかし、リソチームの注入後、３分間の緩衝液による洗
浄を行っても当初の応答は回復されなかった。しかしな
がら、さらに30分間の洗浄（ステップ３）によって、効
率および電気浸透流の両方が顕著に回復した。実際、洗
浄の後、効率はタンパク質の注入前のレベルまでほとん
ど回復した。これは洗浄ステップにおいて、表面からの
タンパク質溶質の効果的な除去とこれによるカラム性能
の回復を実証している。

【００２７】

【表２】

【００２８】表３には、疎水性の内表面を有する市販の
HPCEカラムに対する調製の過程のカラムの特性が示され
ている。効率およびEOFを(1)チトクロムＣが注入される
前と、(2)３分間の緩衝液による洗浄のあとのチトクロ
ムＣ注入後に測定した。明らかなように、それぞれのタ
ンパク質の注入後にはEOFは著しく変化した。

【００２９】

【表３】

【００３０】表１から表３は、アガロース処理キャピラ
リ管表面がHPCEのために必要なタンパク質注入後の再現
性を提供することが可能であることが示されている。

【００３１】本発明の利点は三つの異なるカラム、すな
わち(1)未処理のシリカキャピラリ管；(2)GOPSによって
処理されたキャピラリ管；(3)アガロースで処理された
本発明のキャピラリ管を用いた３回のタンパク質サンプ
ル注入(triplicate proteinsample injections)によるC
ZE分析で実証することができた。この実験では、単一の
電荷と4.5から10.0の範囲のpI（等電点）によって分離
される18種のタンパク質を含む標準サンプル混合物をCZ
E装置に注入し、分析した。３分間の緩衝液洗浄の後に
同じCZE装置で注入、CZE分析および洗浄を２回繰返し
た。三つの異なるカラムについて試験をおこなった。

【００３２】図１の(a)、(b)、(c)は、内径75μmの未処
理のシリカキャピラリ管を備えたCZE装置への３回の注
入により得られた三つの電気泳動図を示している。流さ
れる緩衝液は25mMのPi、NH4+、2Mの尿素を含むものであ
る。これより、明らかなようにタンパク質の分離はゼロ
であった。さらに(b)および(c)に示されるようにタンパ
ク質が漏れ出る二つの電気泳動分離については溶離時間
の再現性が悪かった。（最初に注入されたタンパク質は
引続いて注入されるタンパク質を点検出にまで漏れ出る
のに十分な程度にキャピラリ管表面を不活性化したこと
は明らかである。）

【００３３】図２の(a')、(b')、(c')は、GOPSによって
シリル化された内径75μmのシリカキャピラリ管を備え
たCZE装置への３回の注入より得られた電気泳動図を示
している。GOPSで処理されたカラムにおける分離は未処
理のシリカカラムにおける分離よりも良好であるが、電
気泳動図もそれぞれの後続の注入につれて減少すること
を示している。おそらく、分離の劣化は内径に非可逆的
に固着しているタンパク質溶質によって起こるものと考
えられる。さらに、(b')および(c')の電気泳動図は、
(a')の最初の電気泳動図と比較して溶離時間のシフトが
みられる。

【００３４】図３の(a")、(b")、(c")は、内径75μmの
アガロース処理キャピラリ管（GOPSによる前処理）を備
えたCZE装置への３回の注入より得られた電気泳動図を
示している。18種のタンパク質のすべてが分離されるわ
けではないが、電気泳動図は未処理のシリカキャピラリ
管とシリル化キャピラリ管の両方について分離の再現性
の向上を実証している。この他に、本発明のキャピラリ
管については最初の注入後に分離効率と溶離時間は比較
的一定に留まっていた。これは分析中にカラムに固着し
ていたタンパク質溶質の効果的な除去を示している。

【００３５】図４Ａおよび図４Ｂは、ウシ血清アルブミ
ン(BSA)（図４Ａ）かアガロース（）図４Ｂで処理され
た内径75μmのキャピラリ管を備えたCZE装置より得られ
た前述の18種類のタンパク質混合物の電気泳動図であ
る。どちらのキャピラリ管の内面もGOPSによって前処理
している。（BSAタンパク質は内面に沿って両性相を与
える。米国特許第4,931,328号を参照。）流される緩衝
液(pH5.0)は50mMのOACと18mMのノニルグルコシッドを含
んでいる。図４Ａと図４Ｂを比較すると、アガロース処
理対BSA処理はタンパク質分離で異なる表面選択性を示
すという本発明のもう一つの態様を示している。図４Ａ
の電気泳動図は、混合物のうち10種類のタンパク質がBS
A処理カラムで分離されている。これと対照的に、タン
パク質のうちの８種類だけが図４Ｂの電気泳動図に示さ
れるアガロース処理カラムで分離されている。BSA処理
カラムで分離される10種類のタンパク質は、アガロース
処理カラムで分離される８種類のタンパク質の全部を含
んでいないと考えられる。例えば、本発明のアガロース
処理カラムについては、そうでなければ幾つかの通常の
カラム中では分離されないタンパク質を分離することが
できる。

【００３６】特定のカラムについての表面選択性は溶質
の相対的な移動度を比較することによって特定のタンパ
ク質溶質に対して求めることができる。例えば、異なる
カラム中で、しかし同じCZE条件の下で分離される異な
るタンパク質溶質対の選択性（すなわち移動度比）を比
較すると、種々のタンパク質に関する夫々のカラムの選
択性に関する情報を得ることができる。J. High Resol.
Chromatog. 14(1991)66から67頁参照。

【００３７】図５には、典型的な、従来のCZE装置を示
す。分離カラム10の注入端部は、分析物14が維持されて
いる入口貯蔵器まで伸びており、そして、それを既知の
方法を用いてキャピラリ管へ注入あるいは流入させるこ
とを可能とする。既知の電源16よりキャピラリ管10の長
さ方向にわたって電界を印加しする。キャピラリ管10の
注入端部にはいると、分析物はキャピラリ管の中を通
り、従来の検出器18を経て出口貯蔵器20まで移動する。
本願発明によれば、前述する方法でアガロースをコーテ
ィングすることによってキャピラリ管10を提供する。

【００３８】図６はキャピラリ管10の断面図を示す。内
壁30はまず中間界面層32でコーティングされ、そして、
アガロース層34がコーティングされる。

【００３９】本発明は特定の好ましい実施態様と関連さ
せて以上のように記載されてきたが、説明および実施例
は例示するためのものであり、特許請求の範囲によって
規定される本発明の範囲を限定するためのものでないこ
とが理解されるべきである。

【００４０】以上、本発明の実施例について詳述した
が、以下に本願発明の各実施態様毎に列挙する。 (1)タンパク質溶質を電気泳動分離するための電気泳動
装置において、内壁を備えるキャピラリ管と、前記内壁
と結合している界面層と、前記界面層と共有結合してい
るアガロースを含む外側層を含み、前記タンパク質溶質
と前記内壁との間に可逆的な相互作用を提供することを
特徴とする電気泳動装置。 (2)前記界面層はシリル化剤とシラノール基の反応生成
物であることを特徴とする前記実施態様(1)の電気泳動
装置。 (3)界面層は、15分から２時間の範囲の時間で重合させ
て0.1％から50％の範囲の単量体濃度に相当するディポ
ジションの厚さを有し、よって、４から７の範囲のpHを
有する緩衝液に対して実質的に一定の大きさを有する、
キャピラリ管内に電気浸透流を提供することを特徴とす
る前記実施態様(2)の電気泳動装置。 (4)タンパク質溶質を含む分析物を保持する貯蔵器と前
記分析物を前記キャピラリ管へ注入する注入手段と、前
記キャピラリ管にそって電場を印加する電源と、キャピ
ラリ管内の分離された溶質を検出する検出器をさらに含
むことを特徴とする前記実施態様(1)の電気泳動装置。 (5)次の（イ）から（ハ）のステップを含むタンパク質
溶質と接触可能となる電気泳動キャピラリ管の固体シリ
カ内壁表面の処理方法。（イ）前記内壁表面に界面層をディポジットさせ、
（ロ）前記界面層の表面にアガロースを含む外層をディ
ポジットさせ、（ハ）前記タンパク質溶質と前記内壁表
面との間の相互作用を可逆的となる。 (6)前記界面層はアルコキシ基または塩素基からなる官
能基を有する２官能性シリル化剤であることを特徴とす
る前記実施態様(5)の電気泳動キャピラリ管の処理方
法。 (7)15分から２時間の範囲の重合時間中に0.1％から50％
の範囲の濃度の単量体として界面層をディポジットさせ
るステップをを含み、前記界面層によって、ディポジシ
ョンの厚さに対応し、実質的に一定の大きさを有する予
め決められた電気浸透流を提供する前記実施態様(6)の
電気泳動キャピラリ管の処理方法。 (8)界面層は、固体シリカ表面上のシラノール基とシリ
ル化剤の反応生成物であることを特徴とする前記実施態
様(7)の電気泳動キャピラリ管の処理方法。

【００４１】

【発明の効果】以上述べたように、本願発明にしたがっ
て電気泳動装置に用いるキャピラリ管を調製することに
より、タンパク質溶質の除去が容易となり、再現性を向
上させ、分離能を劣化させずに繰り返し使用することが
可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】未処理のシリカキャピラリ管を用いて三回の注
入の結果得られた同じタンパク質混合物の電気泳動図。

【図２】GOPSによってシリル化されたシリカキャピラリ
管を用いて三回の注入の結果同じタンパク質混合物の電
気泳動図。

【図３】本発明の一実施例であるアガロース処理による
キャピラリ管を用いて三回の注入の結果同じタンパク質
混合物の電気泳動図。

【図４Ａ】ウシ血清アルブミンによって処理されたキャ
ピラリ管を用いて得た同じタンパク質混合物の電気泳動
図。

【図４Ｂ】アガロースによって処理されたキャピラリ管
を用いて得た同じタンパク質混合物の電気泳動図。

【図５】従来のキャピラリ電気泳動装置の概略図。

【図６】本願発明に係るキャピラリ管の断面図。

【符号の説明】

10：キャピラリ管 12：入口貯蔵器 16：電源 18：検出器 20：出口貯蔵器 32：界面層 34：アガロース層

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質溶質を電気泳動分離するための
電気泳動装置において、内壁を備えるキャピラリ管と、
前記内壁と結合している界面層と、前記界面層と共有結
合しているアガロースを含む外側層を含み、前記タンパ
ク質溶質と前記内壁との間に可逆的な相互作用を提供す
ることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】前記界面層はシリル化剤とシラノール基の
反応生成物であることを特徴とする請求項１項記載の電
気泳動装置。
【請求項３】界面層は、15分から２時間の範囲の時間で
重合させて0.1％から50％の範囲の単量体濃度に相当す
るディポジションの厚さを有し、よって、４から７の範
囲のpHを有する緩衝液に対して実質的に一定の大きさを
有する、キャピラリ管内に電気浸透流を提供することを
特徴とする請求項第２項記載の電気泳動装置。
【請求項４】タンパク質溶質を含む分析物を保持する貯
蔵器と前記分析物を前記キャピラリ管へ注入する注入手
段と、前記キャピラリ管にそって電場を印加する電源
と、キャピラリ管内の分離された溶質を検出する検出器
をさらに含むことを特徴とする請求項第１項記載の電気
泳動装置。
【請求項５】次の（イ）から（ハ）のステップを含むタ
ンパク質溶質と接触可能となる電気泳動キャピラリ管の
固体シリカ内壁表面の処理方法。（イ）前記内壁表面に界面層をディポジットさせ、
（ロ）前記界面層の表面にアガロースを含む外層をディ
ポジットさせ、（ハ）前記タンパク質溶質と前記内壁表
面との間の相互作用を可逆的となる。
【請求項６】前記界面層はアルコキシ基または塩素基か
らなる官能基を有する２官能性シリル化剤であることを
特徴とする請求項第５項記載の電気泳動キャピラリ管の
処理方法。
【請求項７】15分から２時間の範囲の重合時間中に0.1
％から50％の範囲の濃度の単量体として界面層をディポ
ジットさせるステップをを含み、前記界面層によって、
ディポジションの厚さに対応し、実質的に一定の大きさ
を有する予め決められた電気浸透流を提供する請求項第
６項記載の電気泳動キャピラリ管の処理方法。
【請求項８】界面層は、固体シリカ表面上のシラノール
基とシリル化剤の反応生成物であることを特徴とする請
求項第７項記載の電気泳動キャピラリ管の処理方法。