JPH0623761B2 - 配糖化した化合物を生産する細胞の検出方法 - Google Patents
配糖化した化合物を生産する細胞の検出方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、配糖化した有用成分を生産する植物細胞の検
出方法に関し、植物組織培養における有用物質生産細胞
の検出、選抜に好適である。
出方法に関し、植物組織培養における有用物質生産細胞
の検出、選抜に好適である。
植物組織培養により有用物質の生産を行う場合、その物
質を効率良く生産する細胞を検出し、選抜することが生
産性の向上を図る上で必須の要件となっている。しかし
ながら、現状ではあらゆる物質について、その物質を生
産する細胞を検出、あるいは選抜する技術が確立してい
る訳ではない。すなわち、その有用物質が色または螢光
を持つ場合は目視または紫外線を照射することにより、
多数の細胞の中から目的の細胞を検出し選抜することが
可能であるが、配糖化した低分子化合物である強心配糖
体のように有用物質が色や螢光を持たない場合はこのよ
うな方法で有用物質を生産する細胞を検出することは困
難であった。
質を効率良く生産する細胞を検出し、選抜することが生
産性の向上を図る上で必須の要件となっている。しかし
ながら、現状ではあらゆる物質について、その物質を生
産する細胞を検出、あるいは選抜する技術が確立してい
る訳ではない。すなわち、その有用物質が色または螢光
を持つ場合は目視または紫外線を照射することにより、
多数の細胞の中から目的の細胞を検出し選抜することが
可能であるが、配糖化した低分子化合物である強心配糖
体のように有用物質が色や螢光を持たない場合はこのよ
うな方法で有用物質を生産する細胞を検出することは困
難であった。
一方、特定の物質の局在を特異的に検出する方法として
は抗原抗体を利用した免疫組織化学的検出法がある。し
かし、この方法はタンパク質、ホリペプチドのような高
分子化合物を検出するための方法であり、強心配糖体の
ような配糖化した低分子化合物を免疫組織化学的手法に
よって検出した例はない。なお、従来公知の免疫組織化
学的手法に関して例えば渡辺慶一、中根一穂編の「改訂
版 酵素抗体法」（学際企画）に記載されている。
は抗原抗体を利用した免疫組織化学的検出法がある。し
かし、この方法はタンパク質、ホリペプチドのような高
分子化合物を検出するための方法であり、強心配糖体の
ような配糖化した低分子化合物を免疫組織化学的手法に
よって検出した例はない。なお、従来公知の免疫組織化
学的手法に関して例えば渡辺慶一、中根一穂編の「改訂
版 酵素抗体法」（学際企画）に記載されている。
植物組織において、強心配糖体などの配糖化した低分子
化合物を生産する細胞を検出する方法を確立するため
に、配糖化した低分子化合物を組織に固定させた後、免
疫組織化学的手法によって強心配糖体などの配糖化した
低分子化合物を生産する細胞を検出する方法について研
究した結果、次のような事実を見い出した。
化合物を生産する細胞を検出する方法を確立するため
に、配糖化した低分子化合物を組織に固定させた後、免
疫組織化学的手法によって強心配糖体などの配糖化した
低分子化合物を生産する細胞を検出する方法について研
究した結果、次のような事実を見い出した。
強心配糖体等の配糖化した化合物を生産する植物組織を
過ヨウ素酸を含む固定液で固定処理を行うことによって
配糖化した化合物が植物組織に固定化され、その後、抗
原抗体処理を利用した免疫組織化学的手法によって配糖
化した化合物を生産する細胞を検出できることを見い出
し、本発明を完成するに至った。
過ヨウ素酸を含む固定液で固定処理を行うことによって
配糖化した化合物が植物組織に固定化され、その後、抗
原抗体処理を利用した免疫組織化学的手法によって配糖
化した化合物を生産する細胞を検出できることを見い出
し、本発明を完成するに至った。
なお、過ヨウ素酸は糖の部分に作用して、ジアルデヒド
を生成しタンパクのε−アミノ基の複合体が形成される
ことが知られているが、過ヨウ素酸を使用して強心配糖
体などの配糖化した低分子化合物を組織に固定化させた
例はない。
を生成しタンパクのε−アミノ基の複合体が形成される
ことが知られているが、過ヨウ素酸を使用して強心配糖
体などの配糖化した低分子化合物を組織に固定化させた
例はない。
本発明の対象となる植物種としては特に制限はないが、
強心配糖体を生産するゴマノハグサ科のDigitalis lana
ta, Digitalis lutea,Digitalis purpurea,Digitalis g
randifloraなどのジギタリス属やステビオサイドを生産
するキク科のStevia rebaudianaなどのステビア属を例
示できる。
強心配糖体を生産するゴマノハグサ科のDigitalis lana
ta, Digitalis lutea,Digitalis purpurea,Digitalis g
randifloraなどのジギタリス属やステビオサイドを生産
するキク科のStevia rebaudianaなどのステビア属を例
示できる。
また配糖化した化合物としては非タンパク性の低分子化
合物があり、アークチイン、バニリンなどのフェノール
配糖体、アミグダリン、サンブニグリンなどのニトリル
配糖体、エスクリン、ケニリンなどのクマリン配糖体、
クリソファネイン、センノサイドなどのアントラセン配
糖体、ステビオサイド、ベルベナリンなどのテルペン配
糖体、ゲンチオピクリン、ゴンズランギンなどの苦味配
糖体、アカシイン、アピインなどのフラボン配糖体、イ
リジン、オノニンなどのイソフラボン配糖体、アストラ
ガリン、アビクラリンなどのフラボノール配糖体、エリ
オジクチン、サクラニンなどのフラバノン配糖体、イデ
イン、クリサンテミンなどのシアニジン配糖体、エニ
ン、デルフィニンなどのデルフィニジン配糖体、オスラ
ジン、ジギトゲニンなどのステロイド配糖体、アシアチ
コシド、グリチルリチンなどのトリテルペノイド配糖
体、ジギトキシン、ジゴキシンなどの強心配糖体、その
他のインドキシル配糖体、アゾキシ配糖体、アルカロイ
ド配糖体、ジベレリン配糖体、リグナン配糖体などを例
示できる。
合物があり、アークチイン、バニリンなどのフェノール
配糖体、アミグダリン、サンブニグリンなどのニトリル
配糖体、エスクリン、ケニリンなどのクマリン配糖体、
クリソファネイン、センノサイドなどのアントラセン配
糖体、ステビオサイド、ベルベナリンなどのテルペン配
糖体、ゲンチオピクリン、ゴンズランギンなどの苦味配
糖体、アカシイン、アピインなどのフラボン配糖体、イ
リジン、オノニンなどのイソフラボン配糖体、アストラ
ガリン、アビクラリンなどのフラボノール配糖体、エリ
オジクチン、サクラニンなどのフラバノン配糖体、イデ
イン、クリサンテミンなどのシアニジン配糖体、エニ
ン、デルフィニンなどのデルフィニジン配糖体、オスラ
ジン、ジギトゲニンなどのステロイド配糖体、アシアチ
コシド、グリチルリチンなどのトリテルペノイド配糖
体、ジギトキシン、ジゴキシンなどの強心配糖体、その
他のインドキシル配糖体、アゾキシ配糖体、アルカロイ
ド配糖体、ジベレリン配糖体、リグナン配糖体などを例
示できる。
上述した配糖化した化合物が存在する植物組織を過ヨウ
素酸を含む固定液に浸漬し、４℃で一晩以上放置するこ
とによって配糖化した化合物を組織に固定することがで
きる。なお、ここで用いる固定液としては、グルタルア
ルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドが例示で
きる。
素酸を含む固定液に浸漬し、４℃で一晩以上放置するこ
とによって配糖化した化合物を組織に固定することがで
きる。なお、ここで用いる固定液としては、グルタルア
ルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドが例示で
きる。
その後、常法に従って顕微鏡切片を作製し配糖化した化
合物に対する抗体を用いて免疫組織化学的手法によって
配糖化した化合物を特異的に染色する等の方法によって
配糖化した化合物を検出することができる。
合物に対する抗体を用いて免疫組織化学的手法によって
配糖化した化合物を特異的に染色する等の方法によって
配糖化した化合物を検出することができる。
なお、本発明の検出法は画像処理装置を使用することに
よって配糖化した化合物の局在をさらに明確にすること
もできる。
よって配糖化した化合物の局在をさらに明確にすること
もできる。
以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。
実施例１ Digitalis purpureaの苗条の培養組織を用いて強心配糖
体の局在を調べた。以下順を追って説明する。
体の局在を調べた。以下順を追って説明する。
(1) 組織の固定と凍結切片の作製 Digitalis purpureaの苗条培養の葉部組織を切り取り、
10mM NaIO4、5％パラホルムアルデヒド、0.1Ｍリン酸緩
衝液を含む固定液を含む固定液（pH6.2）に浸漬し、４
℃で24時間放置後、固定液10mlあたり21.4mgのNaIO4を
追加し、さらに24時間放置した後、組織を生理食塩水で
洗浄した後、液体窒素で凍結させ、厚さ20μｍ〜40μｍ
程度の凍結切片を作製した。なお、凍結切片の具体的作
製法については、渡辺慶一、中根一穂編集の「改訂版
酸素抗体法」（学際企画）に記載されている。
10mM NaIO4、5％パラホルムアルデヒド、0.1Ｍリン酸緩
衝液を含む固定液を含む固定液（pH6.2）に浸漬し、４
℃で24時間放置後、固定液10mlあたり21.4mgのNaIO4を
追加し、さらに24時間放置した後、組織を生理食塩水で
洗浄した後、液体窒素で凍結させ、厚さ20μｍ〜40μｍ
程度の凍結切片を作製した。なお、凍結切片の具体的作
製法については、渡辺慶一、中根一穂編集の「改訂版
酸素抗体法」（学際企画）に記載されている。
(2) 酸素抗体法による強心配糖体の染色 作製した凍結切片を(1)に記載の固定液に30分間浸
漬した後、生理食塩水で洗浄生理食塩水に10分間浸漬そ
して洗浄を３回繰り返した。
漬した後、生理食塩水で洗浄生理食塩水に10分間浸漬そ
して洗浄を３回繰り返した。
次にジギトキシン抗体（コスモバイオ社より購入）
の100倍希釈液を抵抗切片に滴下し、凍結切片を乾燥さ
せないように湿度100％のモイスチャーチャンバー内で
１時間、室温で反応させた。
の100倍希釈液を抵抗切片に滴下し、凍結切片を乾燥さ
せないように湿度100％のモイスチャーチャンバー内で
１時間、室温で反応させた。
１時間後、生理食塩水で洗浄後、生理食塩水に10分
間浸漬そして洗浄を３回繰り返した。
間浸漬そして洗浄を３回繰り返した。
パーオキシダーゼを標識した２次抗体（和光純薬よ
り購入）の 250倍希釈液を該凍結切片に滴下してモイス
チャーチャンバー内で１時間、室温で反応させた。
り購入）の 250倍希釈液を該凍結切片に滴下してモイス
チャーチャンバー内で１時間、室温で反応させた。
と同様の操作を行った。
パーオキシダーゼの発色反応液(DAB-H2O2液)に凍結
切片を浸漬して発色させた。
切片を浸漬して発色させた。
なお、発色反応液に関して、渡辺、中根編集の「改訂版
酵素抗体法」（学際企画）のP.70に記載されている。
酵素抗体法」（学際企画）のP.70に記載されている。
発色後、生理食塩水で洗浄し、カバーグラスで封入
し顕微鏡で観察した。
し顕微鏡で観察した。
染色部を明確にするためにネクサス製の画像処理装
置を用いて染色部を赤で着色した。
置を用いて染色部を赤で着色した。
画像処理の写真を第１図に示す。赤で着色した染色部は
第１図において黒色の部分であり、これはジキトキシン
抗体と反応する強心配糖体の局在を示す。
第１図において黒色の部分であり、これはジキトキシン
抗体と反応する強心配糖体の局在を示す。
本発明方法によれば、配糖化した化合物を生産する細胞
を効率よく検出しうる。
を効率よく検出しうる。
第１図はジキタリスペルプレアの葉部組織における強心
配糖体を生産する細胞の存在を示す写真である。 なお、第１図は生物の形態を示す写真である。
配糖体を生産する細胞の存在を示す写真である。 なお、第１図は生物の形態を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−132922（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−110289（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−275655（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−42654（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−280252（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】配糖化した化合物を生産する植物の組織を
過ヨウ素酸を含む固定液で処理し、次いで免疫組織化学
的検出法によって配糖化した化合物を生産する細胞を検
出することを特徴とする配糖化した化合物を生産する細
胞の検出方法。 - 【請求項２】配糖化した化合物が非タンパク性の低分子
化合物である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】配糖化した化合物が強心配糖体である請求
項２記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63310206A JPH0623761B2 (ja) | 1988-12-09 | 1988-12-09 | 配糖化した化合物を生産する細胞の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63310206A JPH0623761B2 (ja) | 1988-12-09 | 1988-12-09 | 配糖化した化合物を生産する細胞の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02157657A JPH02157657A (ja) | 1990-06-18 |
| JPH0623761B2 true JPH0623761B2 (ja) | 1994-03-30 |
Family
ID=18002465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63310206A Expired - Lifetime JPH0623761B2 (ja) | 1988-12-09 | 1988-12-09 | 配糖化した化合物を生産する細胞の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0623761B2 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6042654A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-03-06 | アイシ−エル サイエンテイフイツク | グルコ−スオキシダ−ゼ使用による抗核抗体の免疫組織化学的検査方法 |
| DE3330160A1 (de) * | 1983-08-20 | 1985-03-07 | Boehringer Ingelheim KG, 6507 Ingelheim | Monoklonaler antikoerper mit hoher affinitaet zum digoxin |
| DE3342870A1 (de) * | 1983-11-26 | 1985-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Digitalis-antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur therapie von digitalis-intoxikationen |
| EP0204922A3 (en) * | 1985-05-28 | 1987-09-30 | Abbott Laboratories | Immunohistochemical assay for detection of a tumor-associated marker (p53) |
| JPH01280252A (ja) * | 1988-05-02 | 1989-11-10 | P C C Technol:Kk | イムノアッセイによる配糖化した低分子化合物の検出方法 |
-
1988
- 1988-12-09 JP JP63310206A patent/JPH0623761B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02157657A (ja) | 1990-06-18 |
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