JPH0620364B2

JPH0620364B2 - 凍結乾燥微生物による種子の接種法

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Publication number: JPH0620364B2
Application number: JP58101841A
Authority: JP
Inventors: ステイ−ブン・ダブリユ−・カル; デリンダ・エル・メツセンジヤ−
Original assignee: MORAN SHIIZU Inc
Current assignee: MORAN SHIIZU Inc
Priority date: 1982-06-11
Filing date: 1983-06-09
Publication date: 1994-03-23
Anticipated expiration: 2009-03-23
Also published as: CA1203087A; EP0097459A1; NZ204507A; AU1563583A; IE55186B1; PT76842B; DK157049B; DK263483A; IE831360L; ES523113A0; EP0097459B1; AU562627B2; DE3368370D1; BR8303076A; DK263483D0; NO165052B; PT76842A; ES8500007A1; NO832091L; DK157049C

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、生産力を高めるための農業および園芸用種子
の微生物処理に関する。

植物種子に微生物を接種して、種子からの植物の成長を
向上させることが、多年にわたって行われている。たと
えば、窒素固定微生物を使用してマメ科植物を処理し、
発芽した植物の成育が土壌硝酸塩により左右されるのを
小さくすることが行われてきた。

接種技術は種子と微生物との接触を必要とする。このよ
うな接触には、微生物培養液を水中に分散させたような
接種液が多く使用される。微生物に加えて、表面張力低
下剤、成長促進物質などの有益な補助物質を接種液に存
在させることも時に行われてきた。ピート、炭素などの
担体に担持した菌を、希薄な水性シロップ中に分散させ
て接種液とすることも行われている。微生物、種子およ
び植物に対して有害あるいは破壊作用があると認められ
る物質は、接種液から排除されてきた。

接種液は、スラリー形成、噴霧および浸漬処理を始めと
する多様な方法により利用されてきた。種子の接種は、
種子をバレル内でタンブルさせながら、これに接種液を
噴霧するか、種子と接種液との混合物からなるスラリー
を形成することにより行われている。

種子の接種法においては、種子１粒当たりの有効菌量が
最小となる均一に接種された種子を生ずるように試みる
のが普通である。この最小有効菌量は、処理を受けたす
べての宿主植物において目的とする効果を生ずるのに必
要な最小微生物数である。この種子の菌個体数は、使用
する種子および菌の種類に応じて決まる。

米国特許第2,954,643 号では、流動床を使用して種子を
接種している。微生物を含有する接種液が、不活性ガス
により流動状態に保持されている種子の流動床に導入さ
れる。

米国特許第3,054,219 号には、最小有効菌量が種子上に
確実に保有されるように、種子に過剰量の微生物を接種
することが記載されている。

米国特許第2,313,057 号、米国特許第2,995,867 号およ
び米国特許第4,149,869 号には、植物に有益な物質を含
む材料による種子のペレット化、すなわち種子の被覆が
記載されている。

別の接種法が米国特許第3,499,748 号に記載されてい
る。この方法では、粒状の焼石膏をアゾトバクター（Az
otobacter ）またはリゾビウム（Rhizobium 根瘤菌）属
の細菌の培養液で処理する。この粒状物を次いで種子と
混合し、この混合物を土壌に播種する。

米国特許第4,155,737 号では、微生物をポリマーゲルに
混入する。このゲルを小粒子に粉砕し、これを種子とと
もに播く。

種子に適用する微生物の商品化は、乾燥種子上で微生物
生存能力を維持するのがが困難であることが障害となっ
ており、特にアクロモバクター（Achromobacter ）、ア
ルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクターおよ
びシュードモナス（Pseudomonas ）属の乾燥感受性のあ
る細菌ではそうであった〔ブラウン(Brown), Ann. Rev.
Phytopath，12：181-97（1974）；クレッパー(Kloeppe
r) and Schroth, Phytopath,71：590-92（1981）〕。

本発明は農業用種子に微生物を接種する方法およびその
方法から得られた接種された種子に関する。別の側面で
は、本発明は凍結乾燥した微生物を種子に接種する方法
に関する。さらに別の側面では、本発明は凍結乾燥した
微生物を含有するコーティングを種子に被覆する方法に
関する。

本発明を実施する場合、有用微生物を凍結乾燥し、これ
を結合剤とともに農業用種子に被覆し、植物の種類に応
じて３〜８重量％の水分含有量になるまで、約４５℃よ
り低温で乾燥する。別法として、凍結乾燥した微生物を
結合剤および充填剤とともに農業用種子に被覆してもよ
い。さらに別の方法として、農業用種子を予め結合剤お
よび充填剤により被覆ないしペレット化し、この種子に
凍結乾燥した微生物を追加の結合剤とともに接種するこ
ともできる。

本発明で使用しうる微生物は、植物に有利な根域作用を
及ぼす土壌微生物として記載されたことのあるものであ
る。この種の微生物およびその作用については、米国特
許第4,155,737 号に記載されている。

有用微生物の例としては、リゾビウム、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）、スピリルム（Spirillum ）、バシ
ラス（Bacillus）、シュードモナス、アゾトバクター、
アルスロバクター、アクロモバクターおよび放線菌類
（Actinomycetes ）に属するものが挙げられるが、これ
らに限定されるわけではない。真菌の例としては、ペニ
シリウム（Penicillium ）、トリコデルマ（Trichoderm
a ）、ケトミウム（Chaetomium）、ならびに外菌根およ
び胞状（vesicular ）−アルバスキュラー（arbuscula
r）菌根を形成するものが挙げられる。別の微生物は、
菌寄生真菌（mycoparastic fungi）、線虫捕捉菌ならび
に関連植物病原体により引き起こされる病気を抑制する
ことができる病原真菌もしくは細菌の無毒隔離物であ
る。

本発明の方法により被覆することができる種子として
は、すべての農業用または園芸用種子が包含される。
「農業用種子」という用語は、本明細書においては、農
業用および園芸用のいずれの種子をも包含する広い意味
で使用している。このような種子の例としては、レタ
ス、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、セロリ、に
んじん、たまねぎ、ラディシュ、トマト、とうもろこ
し、カラス麦、マメ科植物、イネ科植物、および観賞用
花卉が挙げられる。

微生物の凍結乾燥は、任意の市販各種凍結乾燥機により
実施することができる。凍結乾燥機の１例は、ラブコン
コ社（Labconco、米国ミズーリ州カンザスシチー）製の
凍結乾燥機５型である。

凍結乾燥操作は約−40℃未満、好ましくは約−76℃〜−
65℃の凝縮機温度で実施しうる。有用な圧力範囲は約0.
25トル以下、好ましくは約0.025 トル以下である。

凍結乾燥操作を実施する場合、微生物を含有する培養液
を直接凍結乾燥してもよい。しかし、菌体から過剰の培
地を例えば遠心分離または濾過により除去し、次いで菌
体を別の液体に懸濁させるのが好ましい。懸濁用液体と
して水を使用してもよいが、菌体を凍結保護剤中に懸濁
させるのが好ましい。凍結保護剤の例としては、グリセ
リン、スキムミルク、しょ糖およびジメチルスルホキシ
ドが挙げられる。好ましい凍結保護剤の１例は、0.1Mし
ょ糖、0.05M グリセリン、0.07M 安息香酸ナトリウムお
よび0.01M 硫酸マグネシウムの水溶液から調製されたも
のである。菌体は、凍結保護剤：菌体の体積比で約３：
１ないし約１：１、好ましくは約２：１となる量の凍結
保護剤中に懸濁させる。凍結乾燥すると、微生物は乾燥
粉末状で回収される。凍結乾燥した生成物は、一般に、
１ｇ当たり１０¹²のオーダーでコロニー形成単位（ｃｆ
ｕ）を含んでいる。微生物の凍結乾燥および凍結乾燥操
作に使用する凍結保護剤についての詳細は、米国メリー
ランド州ロックビル所在のＡＴＣＣの「アメリカ模式菌
培養蒐集法」に説明されているので、参照されたい。

凍結乾燥した微生物を、一般には少量の結合剤ととも
に、好ましくは結合剤および充填剤とともに、種子に均
一に被覆する。この被覆は、回転皿もしくは回転式セメ
ントミキサーあるいは流動床で実施することができる。
微生物を直接種子に被覆する場合、微生物粉末が種子を
均一に被覆するように種子と微生物を一緒にタンブルさ
せる。次いで、微生物を種子に付着させるために、タン
ブル中の種子に少量の結合剤を噴霧する。接種された種
子を、その後約２０〜４５℃の温度で強制空気流によ
り、接種された種子の重量に基づいて約３〜８重量％の
水分含有量になるまで乾燥する。

好ましくは、凍結乾燥した微生物を、ペレット化種子、
すなわち、結合剤と充填剤を被覆する種子に適用する。
ペレット化操作では、種子を回転装置内でタンブルさせ
ながら、適当な大きさのペレット化種子が得られるま
で、結合剤と充填剤とを交互に添加する。ペレット化し
た種子を、次いで、約３０〜４５℃の温度で、ペレット
化種子の重量に基づいて約３〜８重量％の水分含有量に
なるまで、強制空気流中で乾燥する。この方法では、上
記操作中の任意の時点で微生物を種子混合物に添加する
ことができる。好ましくは、微生物が被膜のほぼ中央に
くるように微生物の添加を行う。

既にペレット化した種子に対して微生物を被覆すること
もできる。これは、ペレット化された種子をタンブルさ
せ、結合剤の軽い噴霧を行いながら凍結乾燥した微生物
を添加し、次いで接種したペレット化種子を前述のよう
にして乾燥することにより実施される。

種子への接種物の被覆量は、微生物、種子および土壌の
種類により異なる。一般に、この接種物の量は、約１０
^２〜１０^８ｃｆｕ／種子の程度であろう。ｃｆｕ／種子
で表した量を重量で表す場合、１０^６ｃｆｕ／種子が１
種子あたり約１〜５マイクログラムの接種物に相当す
る。これは、実際の種子に換算すると、レタス種子１ｋ
ｇ当たり0.56〜1.12ｇの接種物、またはラディシュ種子
１ｋｇ当たり0.06〜0.11ｇの接種物という量になる。

接種および被覆操作に使用できる結合剤は、水溶性また
は水分散性合成ポリマーまたは天然ガム製品の希薄溶液
である。このような結合剤物質の例は、メチルセルロー
ス、メチルエチルセルロース、アラビアゴム、グアー、
カゼイン、ゼラチン加水分解物、ポリビニルアルコー
ル、ポリオキシエチレングリコール、澱粉、ヒドロキシ
エチルセルロース、カラヤゴム、トラガカントゴム、ポ
リ酢酸ビニルなどである。

有用な充填剤は、種子に悪影響を与えずに種子上に被膜
を堆積するのに使用できる、有機および無機粉末であ
る。このような充填剤の例は、ベントナイト、二酸化チ
タン、炭素、バーミキュライト、サンド、ケイソウ土、
クレー、シリカ、マイカなどである。

肥料および保湿剤などの他の成分も、所望により被覆操
作に際に添加しうる。

ペレット化した種子に微生物を被覆する最初の試みで
は、野菜の種子のペレット化の操作中に、シュードモナ
ス属の菌株の微生物の水性懸濁液を、ポリビニルアルコ
ール（結合剤）およびケイソウ土（充填剤）とともに噴
霧した。この微生物はペレット化工程中は生存していた
が、２０〜４５℃の範囲内で変化させた乾燥温度および
時間には関係なく乾燥工程中に死滅した。水分含有量３
０％未満のペレット化種子からは生存能力のある菌を回
収することができなかった。ペレット化種子の水分含有
量は、一般に約３〜８重量％、好ましくは約４〜６重量
％の範囲内に保たれる。

メチルセルロース／ケイソウ土の組成の被覆に菌を存在
させた場合、ペレット化種子を４３℃で乾燥すると、菌
の生存は全く認められなかった。M．N．シュロス（Schr
oth)研究室により調製された接種物中のシュードモナス
属の１菌種〔Phytopath 71:590-92（1981）〕は、ペレ
ット化および乾燥工程で生存することができなかった。

クレッパー(Kloepper)およびシュロス(Schroth)の方法
〔Phytopath 71：590-92（1981）〕により、約３×１０
^８ｃｆｕ／ｇの菌含有量を有するキサンタンゴム／ケイ
ソウ土混合物中の接種物を調製した。この接種物を、ラ
ディシュの種子のペレット化中に、２×１０^６ｃｆｕ／
種子の測定値が得られるべき量で適用した。しかし、ペ
レット化した種子を強制空気循環乾燥機により２０℃で
乾燥した場合でも、種子上の菌個体数は３×１０^４ｃｆ
ｕ／種子に減少していた。また、このような低温で乾燥
したにもかかわらず、種子上の被覆はひび割れし、種子
から剥脱していた。

実施例１シュードモナスMCB-1A菌株をキング（King）ブロスで２
日間振盪培養した培養液を遠心分離し、捕集された菌体
を蒸溜水で２回洗浄した。２のブロス培養液から集め
た洗浄菌体を100 ml の蒸溜水に懸濁し、0.25トル、−
76℃で８時間凍結乾燥した。得られた粉末を分析したと
ころ、５×１０^９cfu ／g の菌を含有していることが判
明した。この粉末２ｇを、ポリビニルアルコールとケイ
ソウ土でペレット化中のブロッコリ種子２８ｇ（〜9750
粒）に被覆した。ペレット化が済んだ種子の試料を乾燥
の前に分析すると、計算上の理論量である１×10^６cfu
／種子の菌個体数を有していることが判明した。強制空
気循環乾燥機で20℃において５〜６重量％の水分含有量
になるまで乾燥した後、乾燥種子上の細菌の個体数を測
定すると、５×10^５cfu ／種子であった。同様に被覆し
た種子を43℃の温度で乾燥した場合にも、種子上の細菌
の量は同じであった。

実施例２シュードモナスMCB-170 菌株（MCB-1A菌株より乾燥感受
性が高い）の培養液１５０mlを遠心分離し、捕集された
菌体を蒸溜水で２回洗浄した。洗浄した菌体（細胞数５
×10¹²）を、0.1Mしょ糖、0.05M グリセリン、0.01M Mg
SO_４および0.07M 安息香酸ナトリウムを含有する水溶液
６mlに懸濁させた。0.25トル、−76℃で８時間凍結乾燥
すると、得られた乾燥粉末は３×10¹¹cfu ／g の菌を含
有することが判明した。この粉末0.77 gを、ポリビニル
アルコールとケイソウ土でペレット化中のレタスの種子
７ｇに被覆した。強制空気循環乾燥機により４３℃で５
〜６重量％の水分含有量になるまで乾燥した後、乾燥種
子上の菌個体数を測定すると、4.7 ×10^５cfu ／種子で
あった。

実施例３実施例２に記載の方法にしたがって、シュードモナスMC
B-170 菌株の凍結乾燥粉末を、実施例２に記載の凍結保
護剤水溶液を懸濁媒として利用して調製した。この粉末
を、ポリビニルアルコールとケイソウ土でペレット化中
のレタス種子に、３×10^７cfu ／種子の菌個体数を与え
る量で被覆した。その際、３種類の実験を行った。第１
の実験では、被覆すべき接種物を種子の近くに位置さ
せ、第２の実験では接種物を被膜の中間部に位置させ、
第３の実験では接種物を被膜の表面近くに位置させた。
最終的に得られたペレットの直径は３〜3.5mm であっ
た。43℃で強制空気流により６〜７重量％の水分含有量
になるまで乾燥した後、種子を分析すると、いずれの実
験でも種子の菌個体数は1.4 〜2.0 ×10^４cfu ／種子で
あることがわかった。接種した種子を野外土壌と滅菌鉢
植用混合土の両方に播種した。発根の個数の差異は非常
に小さかったが、被膜の中間部に接種した種子が発根の
個数がやや多いことが認められた。

実施例４シュードモナスMCB-170 菌株（乾燥感受性が非常に高
い）の培養液１４を遠心分離し、回収された菌体を実
施例２に記載の凍結保護剤水溶液560 mlに懸濁させ、0.
025 トルの圧力、−65℃の凝縮器温度で20時間凍結乾燥
した。凍結乾燥した接種物を、ポリビニルアルコールと
ケイソウ土でペレット化中のにんじんの種子に、1.5 ×
10^５cfu ／種子の菌個体数を与える量で添加した。その
際、３種類の実験を行った。第１の実験では、被覆すべ
き接種物を種子の近くに位置させ、第２の実験では接種
物を被膜の中間部に位置させ、第３の実験では接種物を
被膜の表面近くに位置させた。最終的に得られたペレッ
トの直径は2.0 〜2.4mm であった。43℃で強制空気流に
より４〜５重量％の水分含有量になるまで乾燥した後、
種子を分析すると、収支の菌個体数はそれぞれ3.6 ×10
^１cfu ／種子（接種物が種子の近くの場合）、1.3 ×10
^３cfu ／種子（同被膜の中間部）および1.9 ×10^２cfu
／種子（同被膜の外面付近）であることがわかった。

実施例５前記と同様にして製造したシュードモナスMCB-172 菌株
の凍結乾燥接種物を、ペレット化中のレタス種子に被覆
した。別に、予めペレット化して乾燥したレタス種子に
も、このペレットに凍結乾燥粉末を被覆し、これにポリ
ビニルアルコール結合剤を噴霧し、ペレットを43℃で乾
燥することにより、同じ接種物を被覆した。この両者の
方法の間で、菌生存率および発根数に差異は認められな
かった。

実施例６シュードモナスMCB-114 菌株の凍結乾燥接種物によるレ
タス種子の処理を、この接種物をポリビニルアルコール
結合剤の軽い噴霧とともに被覆した後、43℃で短時間乾
燥することにより行った。微生物の生存率は、ペレット
化中のレタス種子に同じ菌株を被覆した場合と同等であ
るか、あるいはそれより良かった。ペレット化中に接種
した場合と裸の種子に接種した場合とを比較すると、接
種後の種子の発根数に差異は認められなかった。

実施例７ペレット化種子上の凍結乾燥細菌の死滅率を検査した。
ブロッコリとラディシュの種子を、凍結乾燥したシュー
ドモナスMCB-1A菌株を添加しながらペレット化処理し
た。ペレット化種子を密閉プラスチック容器に入れて、
４℃、14℃および22℃で貯蔵し、３４週間にわたって定
期的に分析した。１０_７cfu ／種子の最初の菌個体数が
１０_５cfu ／種子まで減少する期間は、22℃では2.5 〜
３週間、14℃では４〜５週間、４℃では３４週間であっ
た。４℃で貯蔵した種子上のMCB-1A菌株では、ブロッコ
リとラディシュのいずれの種子についても、種子の菌個
体数は１８週で最初の約１０％に、３４週で最初の約１
％に減少した。

実施例８真菌のペニシリウムオギザリカム（Penicillium oxalic
um）MCF-6 菌株を、ＡＴＣＣ法に記載のように20％スキ
ムミルクの懸濁液中で凍結乾燥した。この真菌でレタス
の種子ペレットを充分に接種できた。トリコデルマスピ
ーシーズの菌株（MCF-20）も、上記と同様に処理し、ペ
レット化種子に適用して好結果を得た。

実施例９１のキングブロス（ｇ／単位で、Difco プロテオー
ゼペプトンNo.３を20；グリセリンを12.6；MgSO_４・７
Ｈ_２Ｏを1.5 ；および K₂HPＯ_４を1.5 含有）に、シュ
ードモナスMCB-121 菌株を接種し、回転式振盪機を使用
して、200rpmで20〜22℃において３日間培養した。その
後、遠心分離（５℃、10,000Ｘg で20分）により菌体を
培地から分離した。次いで菌体を凍結保護液（0.1Mしょ
糖および0.05M グリセリン）40mlに懸濁させ、0.05トル
の真空度および−76℃の凝縮器温度で６時間凍結乾燥し
た。得られた乾燥粉末を回収し、秤量すると4.54 gであ
った。接種物中の細菌個体数を測定するために、この粉
末0.01ｇを滅菌蒸溜水9.9 mlと試験管内で30分間振り混
ぜて、再水和させた。その希釈液を半固体のキングＢ寒
天（キングＢブロスを１５ｇ／の寒天で補足したも
の）で平板培養した。このようにして測定した菌個体数
は6.4 ×10¹¹cfu ／ｇであった。

残りの接種物（4.53 g）をペレット化中の種子に添加し
た。ラディシュの１変種チェリーベル（Cherry Belle）
の種子２ポンド（906g）（発芽率90％、78,775粒／ポン
ド）を用いて、ペレット化の実験を行った。15％ポリビ
ニルアルコールGelvatol 40-20（モンサント社製）およ
び１％グリセリンからなる結合剤と、ケイソウ土／セル
ロース繊維混合物（Fibracel 8A、Johns-Manville Cor
p.製）の充填剤とを使用した。乾燥は強制空気循環乾燥
機内で43℃の温度で1.5 時間行った。

種子の理論菌個体数は次式により求めた。

種子の実際の菌個体数は、種子10粒を9.9 mlの滅菌蒸溜
水中で30分間振盪した後、希釈液をキングＢ寒天で平板
培養することにより測定すると、５×10^５cfu ／種子で
あった。

これらのペレット化種子を、米国サリナスバレー(Salin
as Valley）から採取した３種類の野外土壌を入れた鉢
に温室内で播種した。播種後の成長は、夜間温度12〜17
℃、昼間温度18〜22℃で30〜35日間行った。接種した種
子から３種類の土壌中で成長したラディシュの根の重量
は、未接種のペレット化種子から同一条件下で成長させ
た根の重量のそれぞれ１１９％、１１９％および１５１
％であった。

以上に本発明の原理、好適態様および実施方式について
詳述したが、これらは単に例示であって、制限を意図し
たものではないので、本発明は以上の具体的開示内容に
限定されると解されるものではない。当業者により本発
明の範囲内で多くの変更がなされよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献米国特許 4149869（ＵＳ，Ａ) 「一般微生物学」山口辰良著，昭43−９ −10 技報堂発行Ｐ．24−25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被覆された種子の重量に基づいて約３〜８
重量％の水分含有量を有する、凍結乾燥した有用微生物
と水溶性もしくは水分散性結合剤とが被覆された農業用
種子。
【請求項２】約４〜６重量％の水分含有量を有する特許
請求の範囲第１項記載の種子。
【請求項３】有用微生物を接種した農業用種子を製造す
る方法であって、前記微生物を凍結乾燥し、これを水に
懸濁させることなく、水溶性もしくは水分散性結合剤被
覆とともに種子に被覆し、被覆した種子を約２０〜４５
℃の温度で、被覆した種子の重量に基づいて約３〜８重
量％の水分含有量になるまで乾燥することを特徴とする
方法。
【請求項４】温度が約３０〜４５℃で、水分含有量が約
４〜６重量％である特許請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】微生物の凍結乾燥を、−４０℃より低い温
度で、0.25トル以下の圧力において行う特許請求の範囲
第３項記載の方法。
【請求項６】温度が約−７６〜−６５℃、圧力が0.025
トル以下である特許請求の範囲第５項記載の方法。