JPH06165676A - マイコバクテリウム属の菌体からの核酸鎖抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来は核酸鎖抽出が困難であった結核菌等の
マイコバクテリウム属の菌体から迅速で効率良く核酸鎖
を抽出する方法を提供することを目的とする。 【構成】 マイコバクテリウム属の菌体に、α−リティ
ックプロテアーゼ又はβ−リティックプロテアーゼ或は
これらの混合物（以下、α−リティックプロテアーゼ等
と略す。）を作用させた後、界面活性剤により菌体を破
壊し、得られた核酸鎖を含む溶液をフェノール又はフェ
ノールと水不溶性の有機溶媒で処理して不純物を除去
し、然る後溶液中の核酸鎖をアルコール類により沈殿さ
せることを特徴とする、該菌体からの核酸鎖の抽出方
法。及び、該菌体をα−リティックプロテアーゼ等で処
理した後、界面活性剤を含む溶液と混合し、次いで、こ
れをカオトロピック剤と接触させて核酸鎖を遊離させ、
該遊離された核酸鎖を含む溶液に水溶性有機溶媒を加え
て溶液中の不溶物の一部を溶解し、然る後残存する不溶
物を除去し、得られた溶液にアルコール類を加えて核酸
鎖を沈殿させる、ことを特徴とする、該菌体からの核酸
鎖の抽出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】本発明はマイコバクテリウム（Myco
bacterium）属の菌体からのデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸鎖の抽出方法に関
する。

【発明の背景】結核菌は、抗酸性を有するマイコバクテ
リウム属に属する菌であり、これを正確に検出すること
は疾病の原因を知る上で重要である。

【０００２】従来から行われているこれの検出方法とし
ては、塗抹染色法と分離培養法が代表的なものとして挙
げられる（グラッドウォール，臨床検査学,第IV巻,微生
物学,松本慶蔵監訳,医歯薬出版社,1985年）が、何れの
方法も結核菌の検出方法として好ましいものとは言い難
い。即ち、塗抹染色法の代表的なものであるチール・ネ
ールゼン法は、塗抹標本を石炭酸フクシン液で加温染色
し、続いて酸とアルコールで脱色処理すると、普通の細
菌は該処理で脱色されてしまうが、結核菌は脱色され
ず、赤く染色されたまま残るという結核菌の抗酸性を利
用する方法である。しかしながら、該方法は迅速な結核
菌の検出は可能ではあっても、他の抗酸性を有する菌、
即ち他の非定型抗酸菌が共存する場合、該菌は結核菌と
同じように染色されてしまうため、結核菌と他の非定型
抗酸菌を鑑別することはできないという問題点を有して
いる。また、分離培養法は、塗抹染色法で見過される微
量の菌を検出することができ、結核菌と非定型抗酸菌の
鑑別や薬剤耐性検査も行えるという長所はあるが、結核
菌は遅発育型の菌であるため、最終結果を得るのに場合
によっては４〜８週間という時間を要し、治療方針の決
定や衛生対策の対応が遅れることもまれではないという
問題点を有している。

【０００３】そこで、これらの問題点を解決するため
に、近年染色や培養を行わずに生体試料より直接遺伝子
を取り出し、遺伝子レベルで結核菌を同定する方法、例
えばＤＮＡプローブ(特開平3-210199号公報)又はＰＣＲ
(Polymerase chain reaction)法（永井良三ら,実験医
学,8[9],1188-1191,1990）等を利用して結核菌ＤＮＡを
検出する方法が開発された。これらの方法は、前記した
如き分離培養法や塗抹染色法よりは、結核菌の迅速且つ
正確な診断が可能であるが、必ずしも満足し得る方法と
はいい難い。即ち、上記した如き方法を実施するために
は、菌体から核酸鎖を抽出する必要があるが、結核菌の
場合には従来から実施されている核酸鎖の抽出方法では
核酸鎖を充分に抽出できないという問題があるからであ
る。生体試料から核酸鎖を抽出する方法としては、例え
ば１）リゾチーム法、２）超音波法、３）ガラスビーズ
法等の方法が代表的なものとして挙げられるが、このう
ち２）或は３）の方法は物理的な方法により核酸を抽出
する方法であるため、該抽出時に核酸鎖が切断される確
率が高く、これらの方法により抽出された核酸鎖を試料
として上記した如き方法により目的の核酸鎖の検出を行
った場合には、検出の精度が低下するという問題点を有
している。これに対し１）の方法は、抽出操作時に核酸
が切断される可能性は低いので、上記した如き方法に利
用するための核酸鎖の抽出方法としては２）や３）の方
法より優れた方法で、一般によく用いられている。

【０００４】１）の方法をより具体的に示せば、例えば
下記の２通りの方法がその代表的なものとして挙げられ
る(T.IMAEDA et al.,J.Bacteriol.,vol.150[1],414-41
7,1982、P.RUBINA et al.,J.Gen.Microbiol.,vol.132
〔2〕,541-551,1986 等)。即ち、 １．a)菌体を、リゾチームで処理し、 b)該処理した菌体を、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)
等の界面活性剤を含む水溶液中に懸濁して核酸鎖を遊離
させ、 c)遊離した核酸鎖を含む水溶液から、水飽和フェノール
やクロロホルム等の有機溶媒を用いて不純物を除去し、 d)水溶液中の核酸鎖をアルコールで沈殿させて精製する
方法。 ２．a)菌体を、リゾチームで処理し、 b)該処理した菌体を、ＳＤＳ等の界面活性剤を含む水溶
液中に懸濁し、核酸鎖を遊離させ、 c)得られた核酸鎖を含む水溶液にカオトロピック剤を添
加して反応させた後、 d)水溶液中の核酸鎖をアルコールで沈殿させて精製する
方法。

【０００５】しかしながら、結核菌等のマイコバクテリ
ウム属の菌体は、該菌体膜に多量の脂質を含んでいるた
め、細胞壁がろう状となって該菌体膜表面は強い疎水性
を示すという性質を有している。そのため、これが障壁
となって上記した如き抽出方法を利用して該菌体の核酸
鎖の抽出を行っても、目的の核酸鎖を殆ど得ることがで
きないか、或は得られてもその絶対量が少ないか若しく
は不純物が多く上記した如き検出方法には利用し難いよ
うなものしか得られない。特に患者から得られる生体試
料中の菌体量は少ないので、核酸鎖の抽出効率が悪いと
いうことは、結核の臨床診断を遺伝子レベルで行う際の
重要な問題である。また、上記した如き抽出方法の抽出
の過程に於ては、細胞溶解液に含まれる水や各種有機溶
媒から菌体由来の不溶物を除去することが難しく、この
点も上記した如き抽出方法を利用して核酸鎖を精製する
際の問題点の一つである。以上述べた如く、現在用いら
れているマイコバクテリウム属の菌体から核酸鎖を抽
出、精製する方法は多くの問題点を有している。そのた
め、結核菌等のマイコバクテリウム属の菌体から、迅速
に、且つ効率良く核酸鎖を抽出する方法の開発が望まれ
ている現状にある。

【０００６】

【発明の目的】本発明は上記した如き状況に鑑みなされ
たもので、結核菌等のマイコバクテリウム属の菌体から
の迅速で効率の良い核酸鎖の抽出方法を提供することを
目的とする。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、マイコバクテリウム属の菌体
に、α−リティックプロテアーゼ又はβ−リティックプ
ロテアーゼ或はこれらの混合物を作用させた後、界面活
性剤により菌体を破壊し、次いで得られた核酸鎖を含む
溶液をフェノール又はフェノールと水不溶性の有機溶媒
で処理して不純物を除去し、然る後溶液中の核酸鎖をア
ルコール類により沈殿させることを特徴とする、マイコ
バクテリウム属の菌体からの核酸鎖の抽出方法である。
更に本発明は、Ａ．マイコバクテリウム属の菌体を、α
−リティックプロテアーゼ又はβ−リティックプロテア
ーゼ或はこれらの混合物で処理した後、Ｂ．上記処理を
した菌体を界面活性剤を含む溶液と混合し、Ｃ．次い
で、これをカオトロピック剤と接触させて、核酸鎖を遊
離させ、Ｄ．該遊離された核酸鎖を含む溶液に水溶性有
機溶媒を加えて溶液中の不溶物の一部を溶解し、Ｅ．然
る後、残存する不溶物を除去し、Ｆ．得られた溶液にア
ルコール類を加えて核酸鎖を沈殿させる、ことを特徴と
する、マイコバクテリウム属の菌体からの核酸鎖の抽出
方法である。

【０００８】即ち、本発明者らは、結核菌等のマイコバ
クテリウム属の菌体の核酸鎖を有効に抽出する方法につ
いて鋭意研究の結果、従来の抽出方法に於て溶菌用の酵
素として用いられていたリゾチームの代わりに、α−リ
ティックプロテアーゼ又はβ−リティックプロテアーゼ
或はこれらの混合物（以下、「α−リティックプロテア
ーゼ等」と略す。）を用いると、結核菌等のマイコバク
テリウム属菌体の、脂質を多量に含有する細胞壁を効率
良く可溶化できること、更に、カオトロピック剤を用い
る核酸鎖の抽出方法に於ては、α−リティックプロテア
ーゼ等を用い、且つアルコールによる核酸鎖の沈殿精製
前に、水溶性有機溶媒による不溶物の一部溶解操作並び
にその後の残存不溶物の除去操作を行うことにより、マ
イコバクテリウム属菌体からの核酸鎖の抽出をより効率
良く行い得ることを見出し本発明を完成するに到った。

【０００９】本発明に於て用いられるα−リティックプ
ロテアーゼ等は、リゾバクター(Lysobacter)属菌や、ア
クロモバクター（Achromobacter）属菌の産生する細胞
壁溶解作用を有する加水分解酵素であり、ミクロコッカ
ス(Micrococcus)属、バチルス(Bacillus)属、サルシナ
(Sarcina)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)
属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、クロスト
リジウム(Clostridium)属、ロイコノストック(Leuconos
toc)属の菌株等の細胞壁を溶解することは知られてい
た。しかしながら、該酵素がマイコバクテリウム属の菌
体からの核酸鎖の抽出に有効に利用し得るということ
は、本発明以前に於ては全く知られておらず、本発明者
らが初めて見出したことである。尚、α−リティックプ
ロテアーゼとβ−リティックプロテアーゼの混合物は、
アクロモペプチダーゼの商品名で和光純薬工業(株)から
販売されている。本発明に於けるα−リティックプロテ
アーゼ等の使用濃度としては、100〜100,000u/mg菌体、
好ましくは1,000〜10,000u/mg菌体の範囲が挙げられ
る。

【００１０】本発明に於て用いられる界面活性剤として
は、一般に菌体からの核酸鎖抽出の際に用いられるもの
であれば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性
剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等、特に限
定されることなく挙げられるが、具体的には例えばトリ
トンＸ-100（ローム アンド ハース社商品名）、トゥイ
ーン２０（花王(株)商品名）、トゥイーン８０（花王
(株)商品名）、オクチルグルコシド、3-[(3-コラミドプ
ロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート
(ＣＨＡＰＳ)、ホスファチジルエタノールアミン、N-ラ
ウロイルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム、ＳＤＳ等が好ましく挙げ
られ、特にＳＤＳが好ましく用いられる。これらの使用
濃度としては、使用する界面活性剤の種類により多少異
なるが、例えばこの中で一般によく使用されるＳＤＳで
あれば、溶液中の濃度として、通常約0.01〜3％の濃度
範囲が挙げられる。本発明に於て用いられる水不溶性の
有機溶媒としては、例えばクロロホルム、ジクロルメタ
ン、1,2-ジクロルエタン、ベンゼン、トルエン、ジエチ
ルエーテル等が挙げられる。

【００１１】本発明に於て用いられるカオトロピック剤
としては、水溶液に添加した際にカオトロピックイオン
（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生成し、疎水
性分子の水溶性を増加させる作用を有しているものであ
れば特に限定されることなく挙げられるが、具体的には
例えば沃化アルカリ、チオシアン酸グアニジン、過塩素
酸のアルカリ金属塩、トリフルオロ酢酸のアルカリ金属
塩、トリクロロ酢酸のアルカリ金属塩及びチオシアン酸
のアルカリ金属塩等が挙げられる。これらアルカリ金属
塩或は沃化アルカリに於けるアルカリ金属の例として
は、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等が挙げら
れる。これらカオトロピック剤の使用濃度は、用いるカ
オトロピック剤の種類により多少異なるが、例えば沃化
ナトリウムを使用する場合には、溶液中の濃度が、約3.
5〜5Ｍの範囲となるように使用するのが望ましい。これ
らカオトロピック剤を用いる本発明の核酸鎖の抽出方法
に於て使用される水溶性有機溶媒は、一般に水溶性有機
溶媒として知られているものであれば特に限定されるこ
となく挙げられるが、具体的には例えばイソプロパノー
ル、エタノール、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメ
チルホルムアミド(ＤＭＦ)、ホルムアミド、ジオキサ
ン、ジメチルスルホキシド等が好ましく挙げられる。ま
た、水溶性有機溶媒の添加量としては、核酸鎖が沈澱せ
ず、且つ本発明の抽出方法の操作により生じる不溶物の
一部が溶解される範囲であれば特に限定されないが、例
えばイソプロパノールの場合はカオトロピッック剤添加
後の核酸鎖を含む溶液に対して、その0.2〜0.5倍容の範
囲が挙げられる。

【００１２】本発明に於て抽出溶液中から核酸鎖を沈澱
させる際に用いられるアルコール類としては、核酸鎖を
特異的に沈殿し得る性質を有するものであれば特に限定
することなく挙げられるが、具体的には例えばイソプロ
パノール、エタノール等のアルコール類が挙げられ、特
にイソプロパノールが好ましく用いられる。これらの使
用濃度としては、核酸鎖が水溶液から沈殿するような濃
度であればよく、特に限定されない。本発明の核酸鎖抽
出方法に於て用いられる例えば緩衝剤等の試薬類として
は、従来この分野で用いられているものの中から適宜選
択して用いればよく、その使用濃度も通常この分野で用
いられる範囲から適宜選択すれば足りる。例えば緩衝剤
としては、例えばリン酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、グリシン等が好ましく挙
げられ、その使用濃度としては核酸鎖の遊離を妨げない
範囲であれば特に限定されないが、通常１〜500ｍＭの
範囲が好ましく挙げられる。また、抽出操作に於て用い
られる水(緩衝液も含む)のpHとしては、核酸鎖の遊離を
妨げない範囲であれば特に限定されないが、通常2〜12
の範囲、好ましくは7〜9の範囲から適宜選択される。更
に、本発明の抽出方法に於て用いられる緩衝液等の水溶
液中には、核酸鎖の分離効率を良くするために、例えば
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩
化リチウム等の塩類等、更に要すれば、例えばプロティ
ナーゼＫ、プロナーゼ又はリゾチーム等のプロテアーゼ
類が添加されていても良い。これらの該水溶液中の濃度
としては、核酸鎖の遊離を妨げない範囲であれば特に限
定されないが、該水溶液中の濃度として、塩類は通常１
〜500ｍＭの範囲で、プロテアーゼ類は通常１〜10mg/ml
の範囲で必要に応じて添加される。尚、本発明により核
酸鎖を抽出する際には、通常例えばエチレンジアミン四
酢酸(ＥＤＴＡ)等のＤＮａｓｅの阻害剤やヘパリン、プ
ロテインキナーゼＫ等のＲＮａｓｅの阻害剤の共存下で
実施することが望ましい。これら阻害剤の使用濃度とし
ては、阻害剤の種類により多少異なるが、例えばＥＤＴ
Ａを用いる場合には一連の核酸鎖抽出操作に於ける各溶
液中の濃度として、通常１〜200ｍＭの範囲が好ましく
挙げられる。

【００１３】本発明の核酸鎖抽出方法を、ＤＮＡの抽出
方法を例にとり具体的に示すと、例えば下記の如くにな
る。 ・方法１ 被検試料をアクロモペプチダーゼ（和光純薬工業(株)商
品名等）で処理し、該処理した菌体をＳＤＳ等の界面活
性剤を含む水溶液中に懸濁して核酸鎖を遊離させ、得ら
れた核酸鎖を含む水溶液から、水飽和フェノールとクロ
ロホルム等を用いて不純物を除去し、水溶液中の核酸鎖
をエタノール等のアルコール類で沈殿させてＤＮＡを精
製する。 ・方法２ 被検試料をアクロモペプチダーゼで処理し、該処理した
菌体をＳＤＳ等の界面活性剤を含む水溶液中に懸濁して
核酸鎖を遊離させ、得られた核酸鎖を含む水溶液中に沃
化ナトリウム等のカオトロピック剤を添加して反応させ
た後、イソプロパノール等の水溶性有機溶媒を加えて溶
液中の不溶物の一部を溶解し、更に残った不溶物を遠心
除去等の操作で除き、水溶液中の核酸鎖をイソプロパノ
ール等のアルコール類で沈殿させてＤＮＡを精製する。

【００１４】本発明のカオトロピック剤を用いる抽出方
法（上記方法２）に於ける不溶物を除去する方法として
は、例えばカラムクロマトグラフィー法、遠心分離法、
電気泳動法、ろ過法（遠心ろ過法、フィルターによるろ
過法等）、通常この分野で用いられている方法が全て挙
げられ、特に限定されないが、フィルターによりろ過す
る方法が操作性の面から好ましく挙げられる。フィルタ
ーを用いる場合、該フィルターとしては、菌体由来の核
酸鎖は通り抜けることができるが、その他の不溶物は通
り抜けることができない孔径を有するものであれば特に
限定されることなく挙げられるが、通常約0.22〜0.8μm
程度の孔径を有するものが好ましく用いられる。

【００１５】尚、上記方法２は従来法に比較して処理段
階が多いが、有害な有機溶媒等を使用することなく目的
の核酸鎖を高収率で抽出し得るという点で優れた方法で
ある。即ち、従来法等に於て用いられるフェノールや例
えばクロロホルムやジエチルエーテル等の有機溶媒は種
々の問題点を有しているため、病院等のルーチン検査に
利用するには問題が多いからである。より具体的に述べ
れば、例えばフェノールには、毒性があり、且つ強い
蛋白変性剤であるため、皮膚に接触すると薬傷を引き起
こす、また保存中にフェノールが変性して二価フェノ
ール、キノン等のフェノール性酸化物が生成した場合に
は、これら酸化物がホスホジエステル結合又はＤＮＡ鎖
の架橋結合を開裂させて、核酸鎖の変性を引き起こした
りする、フェノールを用いてマイコバクテリウム属菌
体からの核酸鎖の抽出操作を行うと、蛋白質の多くは抽
出の過程で白い毛房状の中間層として分離するため、核
酸鎖を含む水層を得る際に損失が生じ、得られる核酸鎖
の絶対量が少くなる等の問題点が、また、クロロホルム
やジエチルエーテルには麻酔作用があるため、使用時に
中毒を起こす可能性があるという問題点が、更にはフェ
ノールや上記有機溶媒を含む溶液は廃棄の際に制約を受
けるという問題点等があるためである。

【００１６】本発明の方法により抽出した核酸鎖は、Ｐ
ＣＲ法等に用いることができる。本発明は、結核の臨床
診断に於て有用性が高いことはもちろんであるが、今ま
で核酸鎖の抽出が困難であったマイコバクテリウム属菌
体からの核酸鎖の抽出を容易に行うことができるので、
臨床診断以外の分野に於ても利用することができること
は言うまでもない。本発明の抽出方法は、臨床検査で一
般に結核菌の検出に用いられている検査試料である喀
痰、培養細胞、うがい水、気管支洗浄液、胃洗浄液、大
便、尿、髄液、胸水、心のう液、腹水、臓器片等からの
核酸鎖の抽出に利用可能である。また、本発明を利用し
てマイコバクテリウム属菌体のＲＮＡを抽出することも
もちろん可能であり、その際には従来用いられているリ
ゾチームの代わりにα−リティックプロテアーゼ等を用
いること、更に要すればＲＮＡ抽出操作中に生じた不溶
物の一部を溶解した後、残りの不溶物を除去する操作を
行う以外は、従来法を適宜変更することにより容易に実
施できる。以下に実施例等を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例等によって何ら制限
されるものではない。

【００１７】

【実施例】

実施例１ 結核菌細胞をＴＥ緩衝液［１ｍＭ ＥＤＴＡを含む10ｍ
Ｍトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(以下、トリ
スと略称する。)−塩酸緩衝液，pH8.0］で洗浄した後、
8,000rpmで５分間遠心分離して菌体を回収した。得られ
た菌体２mgにアクロモペプチダーゼ（和光純薬工業(株)
商品名)2,000uと、10ｍＭ NaClを含む10ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（pH9.0）50μlとを添加した後、37℃で１時間
放置した。次いで該溶液に476ｍＭトリス−塩酸緩衝液
［pH9.0、ＳＤＳを4.762％、ＥＤＴＡを23.810ｍＭ及び
プロティナーゼＫ(メルク社製)を10μg含有］を12.6μl
添加した後、更に60℃で20分間放置した。その後、得ら
れた水溶液中の不純物をフェノール抽出除去し、水溶液
中のＤＮＡをエタノールで沈殿させたのち遠心分離し
て、目的のＤＮＡを得た。尚、得られたＤＮＡをＴＥ緩
衝液に再度溶解して得られた溶液の260nmに於ける吸光
度の測定結果から、1.05μgＤＮＡ/mg菌体の抽出効率で
あることが判った。また、この溶液を１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけて得られた電気泳動像を図１に示す。
図１から明らかな如く、本発明の方法により抽出された
ＤＮＡは、夾雑物のないクリアーな単一バンドであるこ
とが判る。

【００１８】参考例１ 従来法によるＤＮＡの抽出 結核菌をＴＥ緩衝液で洗浄した後、8,000rpmで５分間遠
心分離して菌体を回収した。得られた菌体２mgに25mM
トリス−塩酸緩衝液［pH8.0、リゾチーム（和光純薬工
業(株)製）を0.2mg、グルコースを10mM及びＥＤＴＡを1
0mM含有］を50μl添加した後、37℃で１時間放置した。
次いで該溶液に476ｍＭトリスー塩酸緩衝液（pH9.0、Ｓ
ＤＳを4.762％及びプロティナーゼＫを10μg含有）を1
2.6μl添加した後、更に60℃で20分間放置した。得られ
た水溶液中の不純物をフェノール抽出除去し、水溶液中
のＤＮＡをエタノールで沈殿させたのち遠心分離して、
目的のＤＮＡを得た。尚、得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液
に再度溶解して得られた溶液の260nmに於ける吸光度の
測定結果から、0.32μgＤＮＡ/mg菌体の抽出効率である
ことがわかった。また、この溶液を１％アガロースゲル
電気泳動にかけて得られた電気泳動像を図２に示す。以
上の結果より、アクロモペプチダーゼを用いた本発明の
方法（実施例１の方法）は、従来のリゾチームを用いた
ＤＮＡの抽出方法（参考例１の方法）に比較してＤＮＡ
の抽出効率が極めて高く、マイコバクテリウム属菌から
のＤＮＡ抽出方法として優れた方法であることが判る。

【００１９】実施例２ 結核菌をＴＥ緩衝液で洗浄した後、8,000rpmで５分間遠
心分離して菌体を回収した。得られた菌体２mgに10ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（pH9.0、アクロモペプチダーゼを
2,000u及びNaClを10mM含有）を50μl添加した後、37℃
で１時間放置した。次いで該溶液に 476ｍＭトリスー塩
酸緩衝液（pH9.0、ＳＤＳを4.762％及びＥＤＴＡを23.8
10ｍＭ含有）を12.6μl添加した後、更に60℃で20分間
放置した。この溶液に沃化ナトリウムを最終濃度4.5Ｍ
となるように加えて、60℃で、15分間放置した。その
後、該溶液にイソプロパノール 100μlを加えて混合し
たものを、孔径0.45μm（水系）遠心ろ過チューブ（日
本ミリポア工業製、ウルトラフリーＣ３ＨＶ）により、
10,000rpmで３分間遠心ろ過し、ろ液を回収した。ろ液
に、ろ液中のイソプロパノール濃度が50%v/vとなるよう
に更にイソプロパノールを添加し、室温で15分間静置し
た。続いて該溶液を12,000rpmにて15分間遠心分離し、
ＤＮＡを沈澱させた。上清を捨て、沈澱を10ｍＭトリス
ー塩酸緩衝液（pH8.0、イソプロパノールを40％、ＥＤ
ＴＡを１ｍＭ、グリコーゲン(飽和)を含有）で洗浄した
後乾燥処理し、目的のＤＮＡを得た。尚、得られたＤＮ
ＡをＴＥ緩衝液に再度溶解して得られた溶液の260nmに
於ける吸光度の測定結果から、1.15μgＤＮＡ/mg菌体の
抽出効率であることが判った。また、この溶液を１％ア
ガロースゲル電気泳動にかけて得られた電気泳動像を図
３に示す。図３から明らかな如く、本発明の方法により
抽出されたＤＮＡは、挟雑物のないクリアーな単一バン
ドであることが判る。以上の結果から、カオトロピック
剤(沃化ナトリウム)を用いる本発明のＤＮＡの抽出方法
により、アクロモペプチダーゼ処理とフェノール処理を
行う実施例１の場合よりも更に高い効率でＤＮＡを分離
精製することができることが判る。

【００２０】比較例１ 結核菌をＴＥ緩衝液で洗浄した後、8,000rpmで５分間遠
心分離して菌体を回収した。得られた菌体２mgに10ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（pH9.0、アクロモペプチダーゼを
2,000u及びNaClを10ｍＭ含有）を0.05ml添加した後、37
℃で１時間放置した。次いで該溶液に 476ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（pH9.0、ＳＤＳを4.762％及びＥＤＴＡを2
3.810ｍＭ含有）を12.6μl添加した後、60℃で20分間放
置し、次いで最終濃度が4.5Ｍとなるように沃化ナトリ
ウムを加え、更に60℃、15分間放置した。ここまでの操
作により溶液中に不溶物が生じたので、実施例２と同様
の操作により遠心ろ過を試みたが、ろ過チューブに不溶
物がつまってろ液を充分に回収することができず、その
結果ＤＮＡの回収率も著しく低くなった。また、沃化ナ
トリウム添加後の溶液についてエタノール沈澱を行った
が、得られた沈殿中にはＤＮＡ以外の夾雑物が多く混入
し、目的のＤＮＡのみを沈殿として分離できなかった。
以上の結果からアクロモペプチダーゼ及びカオトロピッ
ク剤を用いてＤＮＡの分離、精製を行う場合には、アル
コールによる核酸鎖の沈殿分離操作前に、水溶性有機溶
媒の添加による不溶物の一部の溶解処理、及びその後の
不溶物の除去操作（遠心分離法、ろ過法等）が不可欠で
あることが判る。

【００２１】比較例２ 結核菌をＴＥ緩衝液で洗浄した後、8,000rpmで５分間遠
心分離して菌体を回収した。得られた菌体２mgに、10ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH9.0、リゾチームを0.2mg及び
NaClを10ｍＭ含有）を50μl添加した後、37℃で１時間
放置した。得られた溶液について、以下実施例２と同様
に処理して目的のＤＮＡを得た。得られたＤＮＡをＴＥ
緩衝液に再度溶解して得られた溶液を１％アガロースゲ
ル電気泳動にかけて得られた電気泳動像を図４に示す。
図４から明らかなように、この方法により得られたＤＮ
Ａについては、クリアーな電気泳動像は得られないこ
と、言い換えれば、この方法により得られたＤＮＡ中に
はＤＮＡ以外の夾雑物が多く、且つ得られたＤＮＡ量も
非常に少ないことが判る。以上の結果より、カオトロピ
ック剤による処理を行うＤＮＡの抽出方法に於ても、菌
体を従来のリゾチームで処理した場合にはたとえその後
の不純物の除去操作を充分行っても、ＤＮＡの抽出効率
は低いことが判る。

【００２２】

【発明の効果】本発明は、マイコバクテリウム属菌体か
らの核酸鎖抽出方法を提供するものであり、本発明の方
法を利用することにより、従来は核酸鎖抽出が困難であ
ったマイコバクテリウム属菌体から迅速且つ効率良く核
酸鎖の抽出を行うことができるという顕著な効果を奏す
るものであり、また、本発明の方法により抽出された核
酸鎖は制限酵素切断反応用、ＰＣＲ法用等の核酸鎖とし
て利用することができるという効果も奏するものであ
り、斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に於て抽出されたＤＮＡについて１％
アガロースゲル電気泳動を行って得られた電気泳動像を
示す。

【図２】参考例１に於て抽出されたＤＮＡについて１％
アガロースゲル電気泳動を行って得られた電気泳動像を
示す。

【図３】実施例２に於て抽出されたＤＮＡについて１％
アガロースゲル電気泳動を行って得られた電気泳動像を
示す。

【図４】比較例２に於て抽出されたＤＮＡについて１％
アガロースゲル電気泳動を行って得られた電気泳動像を
示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マイコバクテリウム属の菌体に、α−リテ
   ィックプロテアーゼ又はβ−リティックプロテアーゼ或
   はこれらの混合物を作用させた後、界面活性剤により菌
   体を破壊し、次いで得られた核酸鎖を含む溶液をフェノ
   ール又はフェノールと水不溶性の有機溶媒で処理して不
   純物を除去し、然る後溶液中の核酸鎖をアルコール類に
   より沈殿させることを特徴とする、マイコバクテリウム
   属の菌体からの核酸鎖の抽出方法。
2. 【請求項２】Ａ．マイコバクテリウム属の菌体を、α−
   リティックプロテアーゼ又はβ−リティックプロテアー
   ゼ或はこれらの混合物で処理した後、 Ｂ．上記処理をした菌体を界面活性剤を含む溶液と混合
   し、 Ｃ．次いで、これをカオトロピック剤と接触させて、核
   酸鎖を遊離させ、 Ｄ．該遊離された核酸鎖を含む溶液に水溶性有機溶媒を
   加えて溶液中の不溶物の一部を溶解し、 Ｅ．然る後、残存する不溶物を除去し、 Ｆ．得られた溶液にアルコール類を加えて核酸鎖を沈殿
   させる、ことを特徴とする、マイコバクテリウム属の菌
   体からの核酸鎖の抽出方法。
3. 【請求項３】核酸鎖がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又は
   リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１又は２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
   ＤＳ）である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 【請求項５】カオトロピック剤が、沃化アルカリ、チオ
   シアン酸グアニジン、過塩素酸のアルカリ金属塩、トリ
   フルオロ酢酸のアルカリ金属塩、トリクロロ酢酸のアル
   カリ金属塩、及びチオシアン酸のアルカリ金属塩、より
   成る群から選ばれた少なくとも１種である、請求項２に
   記載の方法。
6. 【請求項６】カオトロピック剤が沃化ナトリウムであ
   る、請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】水溶性有機溶媒が、イソプロパノール、エ
   タノール、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホ
   ルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ジオキサン及び
   ジメチルホルムアミドから成る群より選ばれた少なくと
   も１種である、請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】水溶性有機溶媒がイソプロパノールであ
   る、請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】アルコール類がイソプロパノールである、
   請求項２に記載の方法。