JPH0614865B2 - α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 - Google Patents
α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス ＩＦＯ
１３５３４が産生するようなα−アセト乳酸脱炭酸酵素
α−ＡＬＤＣａｓｅ（以下α−ＡＬＤＣａｓｅという）
の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖、およびこのＤＮ
Ａ鎖より形質転換されてそのα−アセト乳酸（α−Ａ
Ｌ）産生能が抑制されているサッカロマイセス・セレビ
シエに属する酵母、に関するものである。
１３５３４が産生するようなα−アセト乳酸脱炭酸酵素
α−ＡＬＤＣａｓｅ（以下α−ＡＬＤＣａｓｅという）
の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖、およびこのＤＮ
Ａ鎖より形質転換されてそのα−アセト乳酸（α−Ａ
Ｌ）産生能が抑制されているサッカロマイセス・セレビ
シエに属する酵母、に関するものである。
先行技術 ビール、清酒、ワイン等の酒類は、一般に、麦汁、果汁
等の醸造原料液にサッカロマイセス・セレビシエに属す
る酵母を加え、これをアルコール発酵させることにより
製造される。この発酵過程において、酵母は自己の増殖
に必要なある種のアミノ酸の生合成の中間物質としてα
−ＡＬを産生し、これを不可避的に細胞外、すなわち発
酵液中、に漏出する。このようにして発酵液中に存在す
るに到ったα−ＡＬは、発酵液中において非生物学的な
反応により、自動的にダイアセチル（ＤＡ）へと変化す
る。
等の醸造原料液にサッカロマイセス・セレビシエに属す
る酵母を加え、これをアルコール発酵させることにより
製造される。この発酵過程において、酵母は自己の増殖
に必要なある種のアミノ酸の生合成の中間物質としてα
−ＡＬを産生し、これを不可避的に細胞外、すなわち発
酵液中、に漏出する。このようにして発酵液中に存在す
るに到ったα−ＡＬは、発酵液中において非生物学的な
反応により、自動的にダイアセチル（ＤＡ）へと変化す
る。
ＤＡは一般に「スエ臭」または「ＤＡ臭」と呼ばれる強
烈な不快臭を有する物質であり、香味的にすぐれた（す
なわちＤＡ臭のない）酒類を製造するためには、発酵液
中のα−ＡＬおよびＤＡ含量を、最終的には、仮にその
α−ＡＬが全てＤＡに変化したとしてもその全ＤＡ含量
が酒類中のＤＡ臭の弁別閾（例えば、ビールでは０．０
５〜０．１mg／リットル）を超えることがないように、
低下させることが必要である。
烈な不快臭を有する物質であり、香味的にすぐれた（す
なわちＤＡ臭のない）酒類を製造するためには、発酵液
中のα−ＡＬおよびＤＡ含量を、最終的には、仮にその
α−ＡＬが全てＤＡに変化したとしてもその全ＤＡ含量
が酒類中のＤＡ臭の弁別閾（例えば、ビールでは０．０
５〜０．１mg／リットル）を超えることがないように、
低下させることが必要である。
発酵液中のＤＡは酵母の共存中では比較的すみやかに無
味無臭のアセトインへと変換されるが、発酵液中のα−
ＡＬは酵母によっては変化を受けず、それが非生物学的
な化学反応によりＤＡに変化したときにはじめて酵母に
よって分解されるようになる。しかし、発酵液中におけ
るα−ＡＬからＤＡへの変換反応は非常にゆっくりとし
た速度で進行するため、この反応が律速となってα−Ａ
ＬおよびＤＡ含量の低い（すなわちＤＡ臭のない）酒類
を製造するためには、発酵液を長期間酵母の共存下で熟
成させることが必要であった。
味無臭のアセトインへと変換されるが、発酵液中のα−
ＡＬは酵母によっては変化を受けず、それが非生物学的
な化学反応によりＤＡに変化したときにはじめて酵母に
よって分解されるようになる。しかし、発酵液中におけ
るα−ＡＬからＤＡへの変換反応は非常にゆっくりとし
た速度で進行するため、この反応が律速となってα−Ａ
ＬおよびＤＡ含量の低い（すなわちＤＡ臭のない）酒類
を製造するためには、発酵液を長期間酵母の共存下で熟
成させることが必要であった。
α−ＡＬＤＣａｓｅはα−ＡＬをアセトインに分解する
性質を有する酵素であって、一般的には種々の細菌、例
えばエンテロバクター・アエロゲネス、バシラス・リケ
ニフォルミス、ラクトバシラス・ケーセイ、バシラス・
ブレビス、エンテロバクター・クロアカエ、アセトバク
ター属細菌（アセトバクター・ランセンス、アセトバク
ター・アセチ等）等により産生されることが知られてい
る。
性質を有する酵素であって、一般的には種々の細菌、例
えばエンテロバクター・アエロゲネス、バシラス・リケ
ニフォルミス、ラクトバシラス・ケーセイ、バシラス・
ブレビス、エンテロバクター・クロアカエ、アセトバク
ター属細菌（アセトバクター・ランセンス、アセトバク
ター・アセチ等）等により産生されることが知られてい
る。
エンテロバクター・アエロゲネスが産生するα−ＡＬＤ
Ｃａｓｅの酵素学的性質の主なものについて本発明者ら
が検討した結果を示すと次の通りである。
Ｃａｓｅの酵素学的性質の主なものについて本発明者ら
が検討した結果を示すと次の通りである。
分 子 量：２８，０００〜２９，０００ 等 電 点：ｐＨ５．０〜６．０ 作用至適ｐＨ：６．５〜７．５ 〃 温度：４０〜５０℃ 熱安定性：６０℃付近まで安定 なお、エンテロバクター・アエロゲネスが産生するα−
ＡＬＤＣａｓｅの酵素学的性質については、報告〔ユー
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eu
r.J.Biochem.14(1970)133-137〕もある。
ＡＬＤＣａｓｅの酵素学的性質については、報告〔ユー
ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eu
r.J.Biochem.14(1970)133-137〕もある。
要 旨 本発明は、ＤＡ臭のない酒類を従来法に比べてはるかに
短期間のうちに製造するのに有用な、α−ＡＬＤＣａｓ
ｅの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖およびこのＤＮ
Ａ鎖により形質転換されることによりそのα−ＡＬ産生
能が抑制された酵母を提供するものである。
短期間のうちに製造するのに有用な、α−ＡＬＤＣａｓ
ｅの生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖およびこのＤＮ
Ａ鎖により形質転換されることによりそのα−ＡＬ産生
能が抑制された酵母を提供するものである。
すなわち、本発明による、α−ＡＬＤＣａｓｅの生物工
学的産生能を有するＤＮＡ鎖は、第１図ＡからＢまでの
塩基配列を有するＤＮＡ鎖またはその縮重異性体を含ん
でなること、を特徴とするものである。
学的産生能を有するＤＮＡ鎖は、第１図ＡからＢまでの
塩基配列を有するＤＮＡ鎖またはその縮重異性体を含ん
でなること、を特徴とするものである。
また、本発明によるサッカロマイセス・セレビシエに属
する酵母は、第１図のＡからＢまでの塩基配列を有する
ＤＮＡ鎖またはその縮重異性体を含んでなるα−アセト
乳酸脱炭酸酵素の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖に
よって形質転換され、そのα−ＡＬ産生能が抑制されて
いること、を特徴とするものである。
する酵母は、第１図のＡからＢまでの塩基配列を有する
ＤＮＡ鎖またはその縮重異性体を含んでなるα−アセト
乳酸脱炭酸酵素の生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖に
よって形質転換され、そのα−ＡＬ産生能が抑制されて
いること、を特徴とするものである。
効 果 本発明によるＤＮＡ鎖は、種々の微生物、例えばサッカ
ロマイセス・セレビシエにα−ＡＬＤＣａｓｅの産生能
を付与してそのα−ＡＬの産生能を抑制したり（詳細後
記）、あるいはα−ＡＬＤＣａｓｅの生物工学的産生に
おいて有効に利用することができる。
ロマイセス・セレビシエにα−ＡＬＤＣａｓｅの産生能
を付与してそのα−ＡＬの産生能を抑制したり（詳細後
記）、あるいはα−ＡＬＤＣａｓｅの生物工学的産生に
おいて有効に利用することができる。
また、本発明による酵母は、そのα−ＡＬの産生能（正
確にはα−ＡＬの細胞外への漏出）が抑制されているの
で、これにより醸造原料液を発酵させれば、発酵液中の
α−ＡＬのレベルはきわめて低くなり、その結果として
発酵液中のα−ＡＬの処理に要する熟成期間、ひいては
酒類の醸造期間、を著しく短縮することができる。
確にはα−ＡＬの細胞外への漏出）が抑制されているの
で、これにより醸造原料液を発酵させれば、発酵液中の
α−ＡＬのレベルはきわめて低くなり、その結果として
発酵液中のα−ＡＬの処理に要する熟成期間、ひいては
酒類の醸造期間、を著しく短縮することができる。
なお、本発明の酵母においてそのα−ＡＬの産生能が抑
制されるのは、発酵過程において細胞内にα−ＡＬが産
生されても、同じく細胞内に産生されたα−ＡＬＤＣａ
ｓｅによりα−ＡＬがアセトインに変換されるためであ
ると考えられる。
制されるのは、発酵過程において細胞内にα−ＡＬが産
生されても、同じく細胞内に産生されたα−ＡＬＤＣａ
ｓｅによりα−ＡＬがアセトインに変換されるためであ
ると考えられる。
α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子 定 義 本発明によるα−ＡＬＤＣａｓｅの生物工学的産生能を
有するＤＮＡ鎖すなわちα−ＡＬＤＣａｓｅの遺伝子
は、特許請求の範囲に記載された塩基配列を有するもの
ならびにその縮重異性体（詳細後記）を含んでなるが、
それを一般化した表現でいえば（以下においては、この
一般化した表現によって本発明を説明するものとす
る）、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ酸配
列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列のうち
ＡからＢまでのものであるポリペプチド、をコードする
もの、である。
有するＤＮＡ鎖すなわちα−ＡＬＤＣａｓｅの遺伝子
は、特許請求の範囲に記載された塩基配列を有するもの
ならびにその縮重異性体（詳細後記）を含んでなるが、
それを一般化した表現でいえば（以下においては、この
一般化した表現によって本発明を説明するものとす
る）、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ酸配
列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列のうち
ＡからＢまでのものであるポリペプチド、をコードする
もの、である。
ここで「ＤＮＡ鎖」とはある長さを有するポリデオキシ
リボ核酸の相補的２本鎖を意味するものである。そし
て、本発明ではこの「ＤＮＡ鎖」はそれがコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペプチドは上記のように有限の長さのもの
であるから、このＤＮＡ鎖も有限の長さのものである。
しかし、このＤＮＡ鎖は、α−ＡＬＤＣａｓｅをコード
する遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工学的
産生を行わせるのに有用なものであるところ、この有限
の長さのＤＮＡ鎖のみによってこのような生物工学的産
生が行なえるのでなく、その５′−側上流および（また
は）３′−側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖が結合した状
態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能となる訳
である。
リボ核酸の相補的２本鎖を意味するものである。そし
て、本発明ではこの「ＤＮＡ鎖」はそれがコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列によって特定されているとこ
ろ、このポリペプチドは上記のように有限の長さのもの
であるから、このＤＮＡ鎖も有限の長さのものである。
しかし、このＤＮＡ鎖は、α−ＡＬＤＣａｓｅをコード
する遺伝子を含んでいてこのポリペプチドの生物工学的
産生を行わせるのに有用なものであるところ、この有限
の長さのＤＮＡ鎖のみによってこのような生物工学的産
生が行なえるのでなく、その５′−側上流および（また
は）３′−側下流に適当な長さのＤＮＡ鎖が結合した状
態でこのポリペプチドの生物工学的産生が可能となる訳
である。
従って、本発明で「ＤＮＡ鎖」というときは、この特定
の長さのもの（第１図の対応アミノ酸配列でいえばＡ〜
Ｂの長さ）の外に、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員
とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含
するものとする。
の長さのもの（第１図の対応アミノ酸配列でいえばＡ〜
Ｂの長さ）の外に、この特定の長さのＤＮＡ鎖を構成員
とする鎖状または環状ＤＮＡ鎖の形態にあるものを包含
するものとする。
本発明によるＤＮＡ鎖の存在形態のうち代表的なもの
は、このＤＮＡ鎖を構成員の一部とするプラスミドの形
態ならびにプラスミドとしてあるいはゲノムに挿入され
た形で微生物、特に大腸菌および酵母菌、中に存在する
形態である。
は、このＤＮＡ鎖を構成員の一部とするプラスミドの形
態ならびにプラスミドとしてあるいはゲノムに挿入され
た形で微生物、特に大腸菌および酵母菌、中に存在する
形態である。
本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい存在形態は、α−ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子が微生物中で安定に発現しうるように
外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖とプロモーターお
よびターミネーターとが一体に結合して、これがプラス
ミドとしてあるいはゲノムに挿入された形態で微生物中
に存在するものである。プロモーターおよびターミネー
ターとしては、公知のものを適宜組合わせて用いること
ができる。
ＤＣａｓｅ遺伝子が微生物中で安定に発現しうるように
外来遺伝子としての本発明のＤＮＡ鎖とプロモーターお
よびターミネーターとが一体に結合して、これがプラス
ミドとしてあるいはゲノムに挿入された形態で微生物中
に存在するものである。プロモーターおよびターミネー
ターとしては、公知のものを適宜組合わせて用いること
ができる。
この遺伝子がコードするポリペプチド 上記のように、本発明によるＤＮＡ鎖は、これがコード
するアミノ酸配列によって特定されている。このポリペ
プチドは、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ
酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
うちＡからＢまでのものである。ここで、「アミノ酸配
列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列のうち
ＡからＢまでのもの」ということは、このペプチドがα
−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有する限りアミノ酸のいくつか
について欠失、置換、付加等があってもよいことを示す
ものである。
するアミノ酸配列によって特定されている。このポリペ
プチドは、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有していてアミノ
酸配列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列の
うちＡからＢまでのものである。ここで、「アミノ酸配
列が実質的に第１図に示されているアミノ酸配列のうち
ＡからＢまでのもの」ということは、このペプチドがα
−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有する限りアミノ酸のいくつか
について欠失、置換、付加等があってもよいことを示す
ものである。
本発明での典型的なα−ＡＬＤＣａｓｅ活性を有するポ
リペプチドは第１図のアミノ酸配列のうちＡ〜Ｂのもの
であって、２６０個のアミノ酸からなるものであり、従
来そのアミノ酸配列は知られていなかったものである。
リペプチドは第１図のアミノ酸配列のうちＡ〜Ｂのもの
であって、２６０個のアミノ酸からなるものであり、従
来そのアミノ酸配列は知られていなかったものである。
ＤＮＡ鎖の塩基配列 α−ＡＬＤＣａｓｅをコードするＤＮＡ鎖は、第１図の
Ａ〜Ｂの塩基配列を持つものまたはその縮重異性体なら
びに上記のようなα−ＡＬＤＣａｓｅのアミノ酸配列の
変化に対応する塩基配列を持つものまたはその縮重異性
体、である。ここで「縮重異性体」とは、縮重コードン
においてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコード
することのできるＤＮＡ鎖を意味する。たとえば第１図
のＡ〜Ｂの塩基配列をもつＤＮＡ鎖に対して、そのアミ
ノ酸のどれかに対応するコードンたとえばＣ−末端のＡ
ｓｎに対応するコードン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係
にあるたとえばＡＡＴに変ったものを本発明では縮重異
性体と呼ぶものとする。
Ａ〜Ｂの塩基配列を持つものまたはその縮重異性体なら
びに上記のようなα−ＡＬＤＣａｓｅのアミノ酸配列の
変化に対応する塩基配列を持つものまたはその縮重異性
体、である。ここで「縮重異性体」とは、縮重コードン
においてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコード
することのできるＤＮＡ鎖を意味する。たとえば第１図
のＡ〜Ｂの塩基配列をもつＤＮＡ鎖に対して、そのアミ
ノ酸のどれかに対応するコードンたとえばＣ−末端のＡ
ｓｎに対応するコードン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係
にあるたとえばＡＡＴに変ったものを本発明では縮重異
性体と呼ぶものとする。
本発明によるＤＮＡ鎖の好ましい具体例は、３′−側末
端に接して停止コードンを少なくとも１個（例えばＴＡ
Ａ）をもつものである。
端に接して停止コードンを少なくとも１個（例えばＴＡ
Ａ）をもつものである。
さらに本発明のＤＮＡ鎖の５′−側上流および（また
は）３′−側下流には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖
（３′−側下流の最初の部分は、ＴＡＡのような停止コ
ードンであることがふつうである）がある長さで続いて
いてもよい。
は）３′−側下流には、非翻訳領域としてのＤＮＡ鎖
（３′−側下流の最初の部分は、ＴＡＡのような停止コ
ードンであることがふつうである）がある長さで続いて
いてもよい。
なお、第１図に示したＤＮＡ鎖の塩基配列は、エンテロ
バクターアエロゲネスＩＦＯ １３５３４より取得した
α−ＡＬＤＣａｓｅをコードする遺伝子について、マキ
サム・キルバート法およびダイデオキシ法によって決定
したものである。
バクターアエロゲネスＩＦＯ １３５３４より取得した
α−ＡＬＤＣａｓｅをコードする遺伝子について、マキ
サム・キルバート法およびダイデオキシ法によって決定
したものである。
ＤＮＡ鎖の取得 上記のα−ＡＬＤＣａｓｅのアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は、核
酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも一部を化学
合成することである。
塩基配列を有するＤＮＡ鎖を取得する一つの手段は、核
酸合成の方法に従ってその鎖長の少なくとも一部を化学
合成することである。
結合アミノ酸が少なくとも２６０個であるということを
考えれば、この化学合成法よりも、エンテロバクター・
アエロゲネスＩＦＯ １３５３４の染色体遺伝子ライブ
ラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法例え
ば適当なプローブによるハイブリダイゼーション法によ
り取得する方が好ましいといえる。
考えれば、この化学合成法よりも、エンテロバクター・
アエロゲネスＩＦＯ １３５３４の染色体遺伝子ライブ
ラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法例え
ば適当なプローブによるハイブリダイゼーション法によ
り取得する方が好ましいといえる。
なお、本発明者らはエンテロバクター・アエロゲネスＩ
ＦＯ １３５３４のα−ＡＬＤＣａｓｅをコードする塩
基配列およびアミノ酸配列が未知であったため、ショッ
トガン法を用いて前記の遺伝子ライブラリーより本発明
のＤＮＡ鎖を取得した（詳細後記実施例参照）。
ＦＯ １３５３４のα−ＡＬＤＣａｓｅをコードする塩
基配列およびアミノ酸配列が未知であったため、ショッ
トガン法を用いて前記の遺伝子ライブラリーより本発明
のＤＮＡ鎖を取得した（詳細後記実施例参照）。
α−アセト乳酸産生能が抑制された酵母 上記のようにして取得される本発明のＤＮＡ鎖はα−Ａ
ＬＤＣａｓｅをつくるための遺伝情報を含んでいるの
で、これを生物工学的手法により、一般に酒類の醸造用
酵母として使用されている酵母（サッカロマイセス・セ
レビシエ）に導入してこれを形質転換させれば、α−Ａ
Ｌ産生能の抑制された醸造用酵母を得ることができる。
ＬＤＣａｓｅをつくるための遺伝情報を含んでいるの
で、これを生物工学的手法により、一般に酒類の醸造用
酵母として使用されている酵母（サッカロマイセス・セ
レビシエ）に導入してこれを形質転換させれば、α−Ａ
Ｌ産生能の抑制された醸造用酵母を得ることができる。
酵 母 本発明における形質転換の対象とする酵母は、「ザ・イ
ースツ・ア・タクソノーミック・スタディ」(The yeast
s,a taxonomic Study,)3rd Ed.(Yarrow,D.,ed. by N.J.
W.Kreger-Van Rij.Elsevier Science Publishers B.V.,
Amsterdam(1984)、p379)記載のサッカロマイセス・セレ
ビシエに属する酵母およびそのシノニムないし変異株で
あるが、本発明の目的からすれば、サッカロマイセス・
セレビシエに属する酒類の醸造用酵母、具体的にはビー
ル酵母、ワイン酵母、清酒酵母等が好ましい。具体的に
は、たとえば、ワイン酵母：ＡＴＣＣ ３８６３７、Ａ
ＴＣＣ ３８６３８、ビール酵母：ＡＴＣＣ ２６２９
２、ＡＴＣＣ ２７０４、ＡＴＣＣ ３２６３４、清酒
酵母：ＡＴＣＣ ４１３４、ＡＴＣＣ ２６４２１があ
る。
ースツ・ア・タクソノーミック・スタディ」(The yeast
s,a taxonomic Study,)3rd Ed.(Yarrow,D.,ed. by N.J.
W.Kreger-Van Rij.Elsevier Science Publishers B.V.,
Amsterdam(1984)、p379)記載のサッカロマイセス・セレ
ビシエに属する酵母およびそのシノニムないし変異株で
あるが、本発明の目的からすれば、サッカロマイセス・
セレビシエに属する酒類の醸造用酵母、具体的にはビー
ル酵母、ワイン酵母、清酒酵母等が好ましい。具体的に
は、たとえば、ワイン酵母：ＡＴＣＣ ３８６３７、Ａ
ＴＣＣ ３８６３８、ビール酵母：ＡＴＣＣ ２６２９
２、ＡＴＣＣ ２７０４、ＡＴＣＣ ３２６３４、清酒
酵母：ＡＴＣＣ ４１３４、ＡＴＣＣ ２６４２１があ
る。
なお、これらの醸造用酵母の性質についてさらに付言す
るならば、これらは長年にわたって醸造に適する形質、
すなわち醸造原料液を効率よく発酵すること、香味の良
い酒類をつくること、遺伝学的形質が安定していること
等を指標として選抜、純粋培養が重ねられてきた結果、
遺伝学的には交雑・分離が極めて起こり難い高次倍数体
となっており、生胞子形成能は殆んど完全に失われてい
る。因みに、実用ビール酵母についてみるならば、麦汁
中の糖成分であるマルトース、マルトトリオースの資化
能が高まっている一方クリスタルバイオレット感受性で
ある等、野性味を失っている。
るならば、これらは長年にわたって醸造に適する形質、
すなわち醸造原料液を効率よく発酵すること、香味の良
い酒類をつくること、遺伝学的形質が安定していること
等を指標として選抜、純粋培養が重ねられてきた結果、
遺伝学的には交雑・分離が極めて起こり難い高次倍数体
となっており、生胞子形成能は殆んど完全に失われてい
る。因みに、実用ビール酵母についてみるならば、麦汁
中の糖成分であるマルトース、マルトトリオースの資化
能が高まっている一方クリスタルバイオレット感受性で
ある等、野性味を失っている。
形質転換 本発明のＤＮＡ鎖により酵母を形質転換させたときにそ
のα−ＡＬの産生能が抑制されたということは本発明者
らによってはじめて確認されたことであるが、形質転換
体の作成のための手順ないし方法そのものは、分子生物
学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用され
ているものでありうるので、本発明においても下記した
ところ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実
施すればよい。
のα−ＡＬの産生能が抑制されたということは本発明者
らによってはじめて確認されたことであるが、形質転換
体の作成のための手順ないし方法そのものは、分子生物
学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用され
ているものでありうるので、本発明においても下記した
ところ以外のものについてはこれら慣用技術に準じて実
施すればよい。
酵母中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現させるために
は、まず酵母中で安定に存在するプラスミドベクター中
にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。この際に用い
られるプラスミドベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ
系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系等種々知られているものすべて
を用いることができる。これらのプラスミドベクター
は、文献上公知であるばかりでなく、容易に作成するこ
とができるものである。
は、まず酵母中で安定に存在するプラスミドベクター中
にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。この際に用い
られるプラスミドベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ
系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系等種々知られているものすべて
を用いることができる。これらのプラスミドベクター
は、文献上公知であるばかりでなく、容易に作成するこ
とができるものである。
一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を酵母中で発現させるた
めには、それが有する遺伝情報を転写・翻訳させる必要
がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニット
にあたるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′−側上流
に、ターミネーターを３′−側下流に、それぞれ組み込
めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとし
ては、すでにＡＤＨ、ＧＡＰＤＨ，ＰＨＯ，ＧＡＬ、Ｐ
ＧＫ、ＥＮＯ、ＴＲＰ、ＨＩＰ等のものが知られてお
り、本発明でもこれらのいずれをも利用することができ
る。これらは文献上公知であるばかりでなく、容易に作
成することができるものである。
めには、それが有する遺伝情報を転写・翻訳させる必要
がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニット
にあたるプロモーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′−側上流
に、ターミネーターを３′−側下流に、それぞれ組み込
めばよい。このプロモーターおよびターミネーターとし
ては、すでにＡＤＨ、ＧＡＰＤＨ，ＰＨＯ，ＧＡＬ、Ｐ
ＧＫ、ＥＮＯ、ＴＲＰ、ＨＩＰ等のものが知られてお
り、本発明でもこれらのいずれをも利用することができ
る。これらは文献上公知であるばかりでなく、容易に作
成することができるものである。
本発明によって得られるべき形質転換体を選択するため
のマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、
メソトレキセートとスルファニルアミドとの組合せ、ツ
ニカマイシン、エチオニン、コンパクチン、銅イオンな
どに対する耐性遺伝子を用いることができる。
のマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、
メソトレキセートとスルファニルアミドとの組合せ、ツ
ニカマイシン、エチオニン、コンパクチン、銅イオンな
どに対する耐性遺伝子を用いることができる。
本発明のＤＮＡ鎖をより安定的に酵母に保持させるため
に、これを酵母のゲノムに挿入することもできる。この
場合には、プラスミドベクターに組み込まれた本発明Ｄ
ＮＡ鎖のゲノムＤＮＡへの挿入を容易にするために別途
このプラスミドベクターにゲノムＤＮＡと高い相同性を
有するＤＮＡを導入しておくことが望ましいところ、こ
のためのＤＮＡとしてはｒＲＮＡ遺伝子、ＨＯ遺伝子等
を例示することができる。
に、これを酵母のゲノムに挿入することもできる。この
場合には、プラスミドベクターに組み込まれた本発明Ｄ
ＮＡ鎖のゲノムＤＮＡへの挿入を容易にするために別途
このプラスミドベクターにゲノムＤＮＡと高い相同性を
有するＤＮＡを導入しておくことが望ましいところ、こ
のためのＤＮＡとしてはｒＲＮＡ遺伝子、ＨＯ遺伝子等
を例示することができる。
このうち、ｒＲＮＡ遺伝子は、１倍体酵母ゲノム中に約
１４０回縦列に反復していることが明らかにされている
（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４
０、２６１−２７７（１９６９））。この特徴により、
この配列を組み換えのターゲット配列として利用した場
合は、他の遺伝子配列を利用した場合と比較して以下の
様な利点がある。
１４０回縦列に反復していることが明らかにされている
（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４
０、２６１−２７７（１９６９））。この特徴により、
この配列を組み換えのターゲット配列として利用した場
合は、他の遺伝子配列を利用した場合と比較して以下の
様な利点がある。
（１）形質転換頻度が上昇することが期待される。
（２）組み込みによるターゲット配列の対応形質の変化
は無視できると考えられる。（３）実施例に示した様な
構造のプラスミド（ｐＩＡＲＬ１）を使用することによ
り、プラスミドの組み込み、ベクター配列の削除という
一連の操作のくり返しで、外来遺伝子を複数個ゲノム中
へ組み込むことが可能となる。
（２）組み込みによるターゲット配列の対応形質の変化
は無視できると考えられる。（３）実施例に示した様な
構造のプラスミド（ｐＩＡＲＬ１）を使用することによ
り、プラスミドの組み込み、ベクター配列の削除という
一連の操作のくり返しで、外来遺伝子を複数個ゲノム中
へ組み込むことが可能となる。
また、本発明において酵母の形質転換に使用し得るＤＮ
Ａ鎖は、それがコードするポリペプチドが、α−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ活性を有する限りにおいては、第１図に示され
ているＡ〜Ｂのポリペプチドと異なるポリペプチドをコ
ードするものであってもよいことは前記したところであ
る。
Ａ鎖は、それがコードするポリペプチドが、α−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ活性を有する限りにおいては、第１図に示され
ているＡ〜Ｂのポリペプチドと異なるポリペプチドをコ
ードするものであってもよいことは前記したところであ
る。
このようなポリペプチドの具体例としては、第１図に示
されているＡ〜Ｂのポリペプチドに１つ以上のアミノ酸
が挿入または付加したもの、１つ以上のアミノ酸が欠如
するか別のアミノ酸で置換されたもの、ならびに前記し
たバシラス・リケニフォルミス、ラクトバシラス・ケー
セイ、バシラス・ブレビス、エンテロバクター・クロア
カエ、アセトバクター属細菌（アセトバクター・ランセ
ンス、アセトバクター・アセチ等）等が産生するα−Ａ
ＬＤＣａｓｅを、例示することができる。このようなＤ
ＮＡ鎖は現在の遺伝子工学技術をもってすれば容易に入
手することができよう。
されているＡ〜Ｂのポリペプチドに１つ以上のアミノ酸
が挿入または付加したもの、１つ以上のアミノ酸が欠如
するか別のアミノ酸で置換されたもの、ならびに前記し
たバシラス・リケニフォルミス、ラクトバシラス・ケー
セイ、バシラス・ブレビス、エンテロバクター・クロア
カエ、アセトバクター属細菌（アセトバクター・ランセ
ンス、アセトバクター・アセチ等）等が産生するα−Ａ
ＬＤＣａｓｅを、例示することができる。このようなＤ
ＮＡ鎖は現在の遺伝子工学技術をもってすれば容易に入
手することができよう。
このようにしてつくったプラスミドによる酵母の形質転
換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されてい
る合目的的な任意の方法、例えばスフェロプラスト法
（プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
ーツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Sci.USA)、75、1929(19
78)〕、リチウムアセテート法〔ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー(J.Bacteriol.)、153163(1983)〕等によ
って行うことができる。
換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されてい
る合目的的な任意の方法、例えばスフェロプラスト法
（プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
ーツ・オブ・アメリカ(Proc.Natl.Sci.USA)、75、1929(19
78)〕、リチウムアセテート法〔ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー(J.Bacteriol.)、153163(1983)〕等によ
って行うことができる。
このようにして得られる本発明の酵母は、本発明ＤＮＡ
鎖によって導入された遺伝情報による新しい形質（すな
わちα−ＡＬＤＣａｓｅの産生能が付与され、その結
果、細胞内のα−ＡＬが分解されて、α−ＡＬの細胞外
への漏出量が低下する）および使用ベクター由来の形質
ならびに場合によって生じているかも知れない遺伝子組
換時の一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を除
けば、そのゼノタイプないしフェノタイプにおいて形質
転換前の酵母と同じである。さらに、ＹＩｐ型プラスミ
ドを用いて本発明ＤＮＡ鎖を酵母染色体へと導入した
後、不要ベクター配列を削除したビール酵母（詳細後記
実施例（６）参照）は、使用ベクター由来の形質を持た
ない。従って、本発明による酵母は、従来の醸造用酵母
と同じである。
鎖によって導入された遺伝情報による新しい形質（すな
わちα−ＡＬＤＣａｓｅの産生能が付与され、その結
果、細胞内のα−ＡＬが分解されて、α−ＡＬの細胞外
への漏出量が低下する）および使用ベクター由来の形質
ならびに場合によって生じているかも知れない遺伝子組
換時の一部の遺伝情報の欠落による対応形質の欠落を除
けば、そのゼノタイプないしフェノタイプにおいて形質
転換前の酵母と同じである。さらに、ＹＩｐ型プラスミ
ドを用いて本発明ＤＮＡ鎖を酵母染色体へと導入した
後、不要ベクター配列を削除したビール酵母（詳細後記
実施例（６）参照）は、使用ベクター由来の形質を持た
ない。従って、本発明による酵母は、従来の醸造用酵母
と同じである。
従って、本発明による酵母は、従来の醸造用酵母と本質
的には全く同一の発酵条件で使用することが可能であ
り、一方で発酵液中でのα−ＡＬの産生能が抑制されて
いるので、結果として発酵液のα−ＡＬ含量が低く、従
ってその処理に要する発酵液の熟成期間を著しく短縮す
ることができる。
的には全く同一の発酵条件で使用することが可能であ
り、一方で発酵液中でのα−ＡＬの産生能が抑制されて
いるので、結果として発酵液のα−ＡＬ含量が低く、従
ってその処理に要する発酵液の熟成期間を著しく短縮す
ることができる。
実 験 例 (1)α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の調製 (i)α−ＡＬＤＣａｓｅ生産株染色体ＤＮＡの精製 エンテロバクター・アエロゲネスＩＦＯ １３５３４
〔財団法人 発酵研究所より入手〕を０．５％ブドウ糖
を含むＬ−倍地で３７℃で１０時間通気培養することに
より、０．５ｇの湿菌体を得た。
〔財団法人 発酵研究所より入手〕を０．５％ブドウ糖
を含むＬ−倍地で３７℃で１０時間通気培養することに
より、０．５ｇの湿菌体を得た。
これを、５mlのサリンＥＤＴＡ緩衝液〔０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕に再懸濁
させた。次いで、４００μｇ／mlのリゾチーム（生化学
工業製）、２０μｇ／mlのリボヌクレアーゼＡ（シグマ
社製）で３７℃で２０分間処理した。次に、０．５％の
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および５００μｇ／
mlのプロテイナーゼＫ（シグマ社製）で６５℃で４時間
処理した。これを、予め調製した蔗糖密度勾配溶液（５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、５〜２０％蔗
糖）に重層し、日立超遠心ローターＲＰＳ２７で２５ｋ
ｒｐｍ（２０℃）で３時間遠心処理した。２．５mlずつ
分画後、０．４％アガロース電気泳動法によって分子量
を調べることにより、高分子ＤＮＡを含む画分を集め
た。これをエタノール沈殿後、１mlのＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）
に溶かし、１リットルのＴＥ緩衝液に対して透析した。
ａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕に再懸濁
させた。次いで、４００μｇ／mlのリゾチーム（生化学
工業製）、２０μｇ／mlのリボヌクレアーゼＡ（シグマ
社製）で３７℃で２０分間処理した。次に、０．５％の
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および５００μｇ／
mlのプロテイナーゼＫ（シグマ社製）で６５℃で４時間
処理した。これを、予め調製した蔗糖密度勾配溶液（５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、５〜２０％蔗
糖）に重層し、日立超遠心ローターＲＰＳ２７で２５ｋ
ｒｐｍ（２０℃）で３時間遠心処理した。２．５mlずつ
分画後、０．４％アガロース電気泳動法によって分子量
を調べることにより、高分子ＤＮＡを含む画分を集め
た。これをエタノール沈殿後、１mlのＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）
に溶かし、１リットルのＴＥ緩衝液に対して透析した。
３００μｇの染色体ＤＮＡを得た。
(ii)コスミド・ライブラリーの作成 (i)で得た染色体ＤＮＡ１２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩで約４０ｋｂｐになるように部分分解した。これ
を、予め調製した蔗糖密度勾配溶液（２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴ
Ａ、１０〜４０％蔗糖）に重層し、日立超遠心ローター
ＲＰＳ２７で２６ｋｒｐｍ（２０℃）で２２時間遠心処
理した。０．５mlずつ分画後、０．４％アガロース電気
泳動法によって分子量を調べることにより、約４０ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を含む画分を集めた。これをエタノール
沈殿後、５００μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、１リットル
のＴＥ緩衝液に対して透析した。
ＡＩで約４０ｋｂｐになるように部分分解した。これ
を、予め調製した蔗糖密度勾配溶液（２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴ
Ａ、１０〜４０％蔗糖）に重層し、日立超遠心ローター
ＲＰＳ２７で２６ｋｒｐｍ（２０℃）で２２時間遠心処
理した。０．５mlずつ分画後、０．４％アガロース電気
泳動法によって分子量を調べることにより、約４０ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を含む画分を集めた。これをエタノール
沈殿後、５００μｌのＴＥ緩衝液に溶かし、１リットル
のＴＥ緩衝液に対して透析した。
得られた約４０ｋｂｐのＤＮＡ断片０．２μｇを、コス
ミドｐＪＢ８アーム（アマーシャム社製）０．３μｇと
Ｔ４リガーゼにより連結した。このＤＮＡをλＤＮＡ・
インビトロ・パッケージング・キット（アマーシャム社
製）を用いてインビトロ・パッケージングして大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（Ｆ−、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃ
Ａ１、ｒｅｌＡ１？、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄ
Ｒ１７、ｓｕｐＥ４４、λ−）〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、１６６ ５
５７−５８０（１９８３）：ＡＴＣＣ ３３８４９〕に
形質導入して、コスミド・ライブラリーを得た。
ミドｐＪＢ８アーム（アマーシャム社製）０．３μｇと
Ｔ４リガーゼにより連結した。このＤＮＡをλＤＮＡ・
インビトロ・パッケージング・キット（アマーシャム社
製）を用いてインビトロ・パッケージングして大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１（Ｆ−、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃ
Ａ１、ｒｅｌＡ１？、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ−１、ｈｓｄ
Ｒ１７、ｓｕｐＥ４４、λ−）〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、１６６ ５
５７−５８０（１９８３）：ＡＴＣＣ ３３８４９〕に
形質導入して、コスミド・ライブラリーを得た。
(iii)α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子保持株のスクリーニン
グ (ii)で得たコスミド・ライブラリーより、α−ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性を示す株を選び出すことによって、α−ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子保持株を得た。
グ (ii)で得たコスミド・ライブラリーより、α−ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性を示す株を選び出すことによって、α−ＡＬ
ＤＣａｓｅ遺伝子保持株を得た。
具体的には、コスミド・ライブラリーより３００株を１
株ずつ５０μｇ／mlアンピシリンおよび０．５％ブドウ
糖を含むＬ−寒天培地に植菌し、３７℃で８時間培養し
て、それぞれについて酵素活性を測定した。すなわち、
各株を１mlの３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．
２）に懸濁させ、１０μｌのトルエンを加えて３０秒間
激しく撹拌した。この細胞懸濁液についてα−ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性をゴットフレドセン(Godfredsen)らの方法
〔カールスバーグ・リサーチ・コミュニケーション(Car
lsberg.Res.Commun.,47、93(1982)〕に従って、測定し
た。この結果、２株のα−ＡＬＤＣａｓｅ活性保持株を
得た。得られたクローンのプラスミドをそれぞれｐＣＡ
３およびｐＣＡ１３と命名した。
株ずつ５０μｇ／mlアンピシリンおよび０．５％ブドウ
糖を含むＬ−寒天培地に植菌し、３７℃で８時間培養し
て、それぞれについて酵素活性を測定した。すなわち、
各株を１mlの３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．
２）に懸濁させ、１０μｌのトルエンを加えて３０秒間
激しく撹拌した。この細胞懸濁液についてα−ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性をゴットフレドセン(Godfredsen)らの方法
〔カールスバーグ・リサーチ・コミュニケーション(Car
lsberg.Res.Commun.,47、93(1982)〕に従って、測定し
た。この結果、２株のα−ＡＬＤＣａｓｅ活性保持株を
得た。得られたクローンのプラスミドをそれぞれｐＣＡ
３およびｐＣＡ１３と命名した。
(iv)α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子ＤＮＡ塩基配列決定 ｐＣＡ１３からサブクローニングを行なうことにより、
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで切り出される１．
４ｋｂｐのＤＮＡ断片がα−ＡＬＤＣａｓｅをコードし
ていることが示された。このＥｃｏＲＶ切断点にＨｉｎ
ｄIIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒造社製）を
連結し、プラスミドｐＵＣ９（ファルマシア社製）のＢ
ａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII切断点の間に挿入したプラス
ミドを、ｐＵＡＲ５と命名した。
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで切り出される１．
４ｋｂｐのＤＮＡ断片がα−ＡＬＤＣａｓｅをコードし
ていることが示された。このＥｃｏＲＶ切断点にＨｉｎ
ｄIIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒造社製）を
連結し、プラスミドｐＵＣ９（ファルマシア社製）のＢ
ａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII切断点の間に挿入したプラス
ミドを、ｐＵＡＲ５と命名した。
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片について、ダイデオキシ法
〔プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・
ステーツ・オブ・アメリカProc.Natl.Acad.Sci.USA,74、
5463(1977)〕及びマクサム・ギルバート法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,74、560(1977)〕によりＤＮＡ塩基配列を
決定した（第１図）。これを解析した結果、７８０ｂｐ
のオープンリーディングフレームが存在した。ここに
は、アミノ酸２６０個、分子量２万９千の蛋白質がコー
ドされていると推定され、この分子量は前記のα−ＡＬ
ＤＣａｓｅの分子量とほぼ一致した。
〔プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・
ステーツ・オブ・アメリカProc.Natl.Acad.Sci.USA,74、
5463(1977)〕及びマクサム・ギルバート法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,74、560(1977)〕によりＤＮＡ塩基配列を
決定した（第１図）。これを解析した結果、７８０ｂｐ
のオープンリーディングフレームが存在した。ここに
は、アミノ酸２６０個、分子量２万９千の蛋白質がコー
ドされていると推定され、この分子量は前記のα−ＡＬ
ＤＣａｓｅの分子量とほぼ一致した。
(2)α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の酵母への導入 (i)ＡＤＨ１プロモータの取得 サッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ〔（α、suc
２、mal、gal ２、ＣＵＰ１）：バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ(Biochem.Biophys.Res.Commun.)、５０、１８６−１
９１（１９７３）：ＡＴＣＣ ２６１０８〕より、常法
に従って染色体ＤＮＡを調製した。実施例(1)(ii)と同
様な手法で制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ部分分解によって約１
０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断したｐＢＲ３２２とＴ４リガーゼによって連結
し、ライブラリーを作成した。ＡＤＨ１遺伝子〔ジャー
ナル・オグ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C)25
7、3018(1982)〕のコーディング領域の７番目から３６番
目の塩基に対応する合成オリゴマーを32Ｐで末端標識
し、これをプローブとしてライブラリーよりＡＤＨ１遺
伝子を得た。さらに、これを制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａ
ｕ３ＡＩで切断して、ＡＤＨ１遺伝子のプロモーター及
びコーディング領域の一部を含む５４２ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。この断片のＳａｕ３ＡＩ末端をエンドヌクレ
アーゼＢａｌ３１で処理してコーディング領域を完全に
欠失させた後、ＨｉｎｄIIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴ
ＴＧ：宝酒造社製）を付加した。このＤＮＡ断片を、Ａ
ＤＨ１プロモーターとして用いた。
２、mal、gal ２、ＣＵＰ１）：バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ(Biochem.Biophys.Res.Commun.)、５０、１８６−１
９１（１９７３）：ＡＴＣＣ ２６１０８〕より、常法
に従って染色体ＤＮＡを調製した。実施例(1)(ii)と同
様な手法で制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ部分分解によって約１
０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断したｐＢＲ３２２とＴ４リガーゼによって連結
し、ライブラリーを作成した。ＡＤＨ１遺伝子〔ジャー
ナル・オグ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C)25
7、3018(1982)〕のコーディング領域の７番目から３６番
目の塩基に対応する合成オリゴマーを32Ｐで末端標識
し、これをプローブとしてライブラリーよりＡＤＨ１遺
伝子を得た。さらに、これを制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａ
ｕ３ＡＩで切断して、ＡＤＨ１遺伝子のプロモーター及
びコーディング領域の一部を含む５４２ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。この断片のＳａｕ３ＡＩ末端をエンドヌクレ
アーゼＢａｌ３１で処理してコーディング領域を完全に
欠失させた後、ＨｉｎｄIIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴ
ＴＧ：宝酒造社製）を付加した。このＤＮＡ断片を、Ａ
ＤＨ１プロモーターとして用いた。
(ii)発現ベクターの構築及び酵母への導入 酵母内で複製可能なプラスミドＹＥｐ１３〔ジーン(Gen
e)、８、121(1979)：ＡＴＣＣ 37115〕を基本的に用い
て、以下の手順で発現ベクターを作成した。
e)、８、121(1979)：ＡＴＣＣ 37115〕を基本的に用い
て、以下の手順で発現ベクターを作成した。
まず、ＹＥｐ１３のＬＥＵ２遺伝子の両端にあるＳａｌ
Ｉ−ＳａｃＩ断片及びＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片を欠失さ
せた。これにより、当プラスミドは制限酵素ＸｈｏＩ、
ＳａｃＩ、ＳｍａＩおよびＢｇｌIIによる切断部位をも
たず、制限酵素ＳａｌＩによる切断部位をただ１箇所も
つものとなった。次に、このプラスミド中のｐＢＲ３２
２由来の制限酵素ＨｉｎｄIII切断点と、２μｍＤＮＡ
由来の制限酵素ＨｉｎｄIII切断点との間に合成オリゴ
ヌクレオチド４１ｍｅｒを挿入した。この合成オリゴヌ
クレオチドは、制限酵素ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、ＢｇｌII
およびＸｈｏＩ切断点をもち、また下記の塩基配列をも
つ。本発明では、このプラスミドを、ＹＥｐ１３Ｋと命
名した。
Ｉ−ＳａｃＩ断片及びＸｈｏＩ−ＳｍａＩ断片を欠失さ
せた。これにより、当プラスミドは制限酵素ＸｈｏＩ、
ＳａｃＩ、ＳｍａＩおよびＢｇｌIIによる切断部位をも
たず、制限酵素ＳａｌＩによる切断部位をただ１箇所も
つものとなった。次に、このプラスミド中のｐＢＲ３２
２由来の制限酵素ＨｉｎｄIII切断点と、２μｍＤＮＡ
由来の制限酵素ＨｉｎｄIII切断点との間に合成オリゴ
ヌクレオチド４１ｍｅｒを挿入した。この合成オリゴヌ
クレオチドは、制限酵素ＳａｃＩ、ＳｍａＩ、ＢｇｌII
およびＸｈｏＩ切断点をもち、また下記の塩基配列をも
つ。本発明では、このプラスミドを、ＹＥｐ１３Ｋと命
名した。
AGCTTATGATTACGAGCTCCCGGGCAGATCTCGGCCTCGAG ATACTAATGCTCGAGGGCCCGTCTAGAGCCGGAGCTCTCGA 次に、ＹＥｐ１３ＫのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄIII断片を(i)
で作成したＡＤＨ１プロモーターと置換して、発現プラ
スミドベクターｐＡＫ５０３を得た。
で作成したＡＤＨ１プロモーターと置換して、発現プラ
スミドベクターｐＡＫ５０３を得た。
(1)(iv)で得られたα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片を有
するプラスミドｐＵＡＲ５を制限酵素ＨｉｎｃIIで切断
し、ＨｉｎｄIIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒
造社製）を付加した後、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢ
ａｍＨＩで切断した。得られた９４０ｂｐのα−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ遺伝子断片をｐＡＫ５０３のＨｉｎｄIII−Ｂ
ｇｌII断片と置換して、プラスミドｐＡＬ ５０３を得
た。
するプラスミドｐＵＡＲ５を制限酵素ＨｉｎｃIIで切断
し、ＨｉｎｄIIIリンカー（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ：宝酒
造社製）を付加した後、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢ
ａｍＨＩで切断した。得られた９４０ｂｐのα−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ遺伝子断片をｐＡＫ５０３のＨｉｎｄIII−Ｂ
ｇｌII断片と置換して、プラスミドｐＡＬ ５０３を得
た。
さらに、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むｐＵＣ−４Ｋ（ファ
ルマシア社製）を制限酵素ＳａｌＩで切断し、得られた
Ｇ４１８耐性遺伝子を含む断片をｐＡＬ５０３のＳａｌ
Ｉ切断点に挿入して、目的とするプラスミドｐＡＬＧ５
０３４を得た。
ルマシア社製）を制限酵素ＳａｌＩで切断し、得られた
Ｇ４１８耐性遺伝子を含む断片をｐＡＬ５０３のＳａｌ
Ｉ切断点に挿入して、目的とするプラスミドｐＡＬＧ５
０３４を得た。
ｐＡＬＧ５０３４をリチウムアセテート法〔ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.)153、163、(198
3)〕によって酵母〔サッカロミセス・セレビシエＳ２８
８Ｃの変異株であるＴＤ４（ａ、ｈｉｓ、ｕｒａ、ｌｅ
ｕ、ｔｒｐ）株及びビール酵母ＩＦＯ ０７５１株〕に
導入したところ、それぞれ１．９〜３．３Ｕ／mgタンパ
クおよび１．８〜３．５Ｕ／mgタンパクのα−ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性を示した。
・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.)153、163、(198
3)〕によって酵母〔サッカロミセス・セレビシエＳ２８
８Ｃの変異株であるＴＤ４（ａ、ｈｉｓ、ｕｒａ、ｌｅ
ｕ、ｔｒｐ）株及びビール酵母ＩＦＯ ０７５１株〕に
導入したところ、それぞれ１．９〜３．３Ｕ／mgタンパ
クおよび１．８〜３．５Ｕ／mgタンパクのα−ＡＬＤＣ
ａｓｅ活性を示した。
ｐＡＬＧ５０３４を含むＩＦＯ ０７５１株をＳＫＢ１
０１と、またｐＡＬＧ５０３４を含むＴＤ４株をＳＫＢ
１０２と、呼ぶこととする。
０１と、またｐＡＬＧ５０３４を含むＴＤ４株をＳＫＢ
１０２と、呼ぶこととする。
α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子はそのコーディング領域の
５′末端に翻訳開始コードンであるＡＴＧが３個連続し
ているが、α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片の５′側Ｈｉ
ｎｃII切断点からエンドヌクレアーゼＢａｌ３１で処理
し、３個のＡＴＧのうち、５′側から１個あるいは２個
除去し、酵母ＴＤ４内で発現させて活性に対する影響を
みた。その結果、得られたα−ＡＬＤＣａｓｅの酵素活
性に大きな差異は認められなかった。
５′末端に翻訳開始コードンであるＡＴＧが３個連続し
ているが、α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片の５′側Ｈｉ
ｎｃII切断点からエンドヌクレアーゼＢａｌ３１で処理
し、３個のＡＴＧのうち、５′側から１個あるいは２個
除去し、酵母ＴＤ４内で発現させて活性に対する影響を
みた。その結果、得られたα−ＡＬＤＣａｓｅの酵素活
性に大きな差異は認められなかった。
(3)醗酵試験によるダイアセチル生成量低減の確認 ＴＤ４株ならびにＩＦＯ ０７５１株にα−ＡＬＤＣａ
ｓｅ遺伝子を導入した２種類の酵母（（２）−(ii)参
照）について醗酵試験を行い、これら導入株の全ダイア
セチル（ＴＤＡ：ＴＤＡは、ビシナルジケトン及びアセ
トハイドロキシ酸、主としてＤＡ及びその前記物質のα
−ＡＬ、より成る）生成量が低減することを以下の方法
で確認した。
ｓｅ遺伝子を導入した２種類の酵母（（２）−(ii)参
照）について醗酵試験を行い、これら導入株の全ダイア
セチル（ＴＤＡ：ＴＤＡは、ビシナルジケトン及びアセ
トハイドロキシ酸、主としてＤＡ及びその前記物質のα
−ＡＬ、より成る）生成量が低減することを以下の方法
で確認した。
(i)α−ＡＬＤＣａｓｅ産生酵母の取得 上述のようなα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を導入した２種
類の酵母（ＳＫＢ１０１株およびＳＫＢ１０２株）およ
びｐＡＬＧ５０３４導入前のそれぞれ原株（ＩＦＯ ０
７５１株およびＴＤ４株）をＹＰＤ培地で培養した。ｐ
ＡＬＧ５０３４導入株については、培地に６００μｇ／
mlとなるようにＧ４１８を添加した。
類の酵母（ＳＫＢ１０１株およびＳＫＢ１０２株）およ
びｐＡＬＧ５０３４導入前のそれぞれ原株（ＩＦＯ ０
７５１株およびＴＤ４株）をＹＰＤ培地で培養した。ｐ
ＡＬＧ５０３４導入株については、培地に６００μｇ／
mlとなるようにＧ４１８を添加した。
３０℃で１６時間の振盪培養で生育した各々の菌体を３
０００×ｇで１０分間の遠心分離で集菌し、蒸留水で洗
浄してから、醗酵試験に供した。
０００×ｇで１０分間の遠心分離で集菌し、蒸留水で洗
浄してから、醗酵試験に供した。
(ii)醗酵試験 １１°Ｐに調製した麦汁に酵母添加率０．５％（ｗｅ
ｔ．ｗ／ｖ）になるように(i)で得た酵母を添加し、充
分に通気したのち、８℃で７日間静置醗酵させた。醗酵
終了後、３０００×ｇで１０分間の遠心処理及び過に
よって、菌体を除いた液について、ＴＤＡ量（全ダイ
アセチル量）を測定した。
ｔ．ｗ／ｖ）になるように(i)で得た酵母を添加し、充
分に通気したのち、８℃で７日間静置醗酵させた。醗酵
終了後、３０００×ｇで１０分間の遠心処理及び過に
よって、菌体を除いた液について、ＴＤＡ量（全ダイ
アセチル量）を測定した。
結果は、下表に示す通りであった。本発明の酵母を用い
た醗酵では、対照株の時と比較して、ＴＤＡ生成量が大
幅に減少したことがわかる。
た醗酵では、対照株の時と比較して、ＴＤＡ生成量が大
幅に減少したことがわかる。
(4)組み込み型プラスミドの構築 (i)プラスミドｐＩＡＲＬ１の構造と特徴 α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を酵母内で安定保持させるた
めに、自律増殖能をもたず、染色体に組み込まれること
によってのみ酵母に保持されうるプラスミドｐＩＡＲＬ
１を作成した。このプラスミドは、酵母内マーカーとし
て、Ｇ４１８耐性遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を有し、また相同的組換えにより、プラスミドが染色
体ＤＮＡに組み込まれるのに必要な配列として、ｒＲＮ
Ａ遺伝子配列を有する。α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子は、
その５′端及び３′端をそれぞれＡＤＨ１プロモーター
およびＨＩＰ１ターミネーターにはさまれて、ｒＲＮＡ
遺伝子配列内に組み込まれている。このプラスミドは、
これを染色体上のｒＲＮＡ遺伝子内に効率的に組み込む
ために、予めｒＲＮＡ遺伝子配列内にあるＫｐｎＩ切断
点で切断してから形質転換に用いる。その結果、得られ
る形質転換体においては、プラスミド由来及びもともと
染色体に存在したｒＲＮＡ遺伝子配列が重複することに
なる。したがって、この形質転換体を完全培地で増殖さ
せた場合には、重複した配列において遺伝子の再組み換
えがおこって、Ｇ４１８感受性およびＬａｃ−の菌が出
現する。このうち一部はα−ＡＬＤＣ ａｓｅ活性を示
し、これらの菌ではＡＤＨ１プロモーター、α−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ遺伝子およびＨＩＰ１ターミネーターのみが染
色体上に残り、他のベクター部分は欠失していることに
なる。
めに、自律増殖能をもたず、染色体に組み込まれること
によってのみ酵母に保持されうるプラスミドｐＩＡＲＬ
１を作成した。このプラスミドは、酵母内マーカーとし
て、Ｇ４１８耐性遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を有し、また相同的組換えにより、プラスミドが染色
体ＤＮＡに組み込まれるのに必要な配列として、ｒＲＮ
Ａ遺伝子配列を有する。α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子は、
その５′端及び３′端をそれぞれＡＤＨ１プロモーター
およびＨＩＰ１ターミネーターにはさまれて、ｒＲＮＡ
遺伝子配列内に組み込まれている。このプラスミドは、
これを染色体上のｒＲＮＡ遺伝子内に効率的に組み込む
ために、予めｒＲＮＡ遺伝子配列内にあるＫｐｎＩ切断
点で切断してから形質転換に用いる。その結果、得られ
る形質転換体においては、プラスミド由来及びもともと
染色体に存在したｒＲＮＡ遺伝子配列が重複することに
なる。したがって、この形質転換体を完全培地で増殖さ
せた場合には、重複した配列において遺伝子の再組み換
えがおこって、Ｇ４１８感受性およびＬａｃ−の菌が出
現する。このうち一部はα−ＡＬＤＣ ａｓｅ活性を示
し、これらの菌ではＡＤＨ１プロモーター、α−ＡＬＤ
Ｃａｓｅ遺伝子およびＨＩＰ１ターミネーターのみが染
色体上に残り、他のベクター部分は欠失していることに
なる。
(ii)ｐＩＡＲＬ１の構築 ｐＩＡＲＬ１は、酵母の組み込み型プラスミドであるＹ
Ｉｐ５(Prot.Natl.Acad.Sci.USA、76、1035-1039(1979))
をもとに作成した。
Ｉｐ５(Prot.Natl.Acad.Sci.USA、76、1035-1039(1979))
をもとに作成した。
まず、Ｇ４１８耐性遺伝子を、ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシ
ア社製）よりＳａｌＩで切り出し、ＹＩｐ５のＳａｌＩ
切断点に挿入して、プラスミドｐＩＧ７を作成した。
ア社製）よりＳａｌＩで切り出し、ＹＩｐ５のＳａｌＩ
切断点に挿入して、プラスミドｐＩＧ７を作成した。
続いて、ＨＩＰ１遺伝子プロモーター＋ｌａｃＺ遺伝子
断片としては、酵母ＨＩＰ１遺伝子(Gene、38、205-214(1
985))の５′非翻訳領域約０．６ｋｂと翻訳領域約０．
４ｋｂを含むＢｇｌII断片に、プラスミドｐＭＣ１８７
１（ファルマシア社製）からＢａｍＨＩ断片として得ら
れたｌａｃＺ遺伝子を連結したＢｇｌII−ＢａｍＨＩ断
片を調製し、これをｐＩＧ７のＢａｍＨＩ切断点に挿入
して、プラスミドｐＩＬＧ２を作成した。
断片としては、酵母ＨＩＰ１遺伝子(Gene、38、205-214(1
985))の５′非翻訳領域約０．６ｋｂと翻訳領域約０．
４ｋｂを含むＢｇｌII断片に、プラスミドｐＭＣ１８７
１（ファルマシア社製）からＢａｍＨＩ断片として得ら
れたｌａｃＺ遺伝子を連結したＢｇｌII−ＢａｍＨＩ断
片を調製し、これをｐＩＧ７のＢａｍＨＩ切断点に挿入
して、プラスミドｐＩＬＧ２を作成した。
ｒＲＮＡ遺伝子は、ＡＤＨ１遺伝子取得に用いたライブ
ラリーより、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子(J.B.C.、252、8118
-8125(1977))の５′末端４〜３２番目の塩基に対応する
オリゴマーを５′末端標識したものをプローブとして用
いて取得した。このうち、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子およ
び２５ＳｒＲＮＡ遺伝子のそれぞれ一部を含む約３ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片を、ｐＩＬＧ２のｐＢＲ３２２由来の
ＥｃｏＲＩ切断点に導入して、プラスミドｐＩＲＬ９を
作成した。
ラリーより、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子(J.B.C.、252、8118
-8125(1977))の５′末端４〜３２番目の塩基に対応する
オリゴマーを５′末端標識したものをプローブとして用
いて取得した。このうち、５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子およ
び２５ＳｒＲＮＡ遺伝子のそれぞれ一部を含む約３ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片を、ｐＩＬＧ２のｐＢＲ３２２由来の
ＥｃｏＲＩ切断点に導入して、プラスミドｐＩＲＬ９を
作成した。
ＡＤＨ１プロモーター＋αＡＬＤＣａｓｅ遺伝子＋ＨＩ
Ｐ１ターミネーター断片は、以下に示した方法で取得し
た。
Ｐ１ターミネーター断片は、以下に示した方法で取得し
た。
α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子を有するプラスミドｐＵＡＲ
５をＨｉｎｃIIで切断後、Ｂａｌ３１で処理し、Ｈｉｎ
ｄIIIリンカーを付加したのち、ＨｉｎｄIII及びＢａｍ
ＨＩ切断により得られるα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片
をｐＵＣ１２（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄIII切断部位に挿入し、塩基配列を決定し、α−Ａ
ＬＤＣａｓｅ遺伝子の５′上流約４０ｂｐ及び最初のＡ
ＴＧを欠失したプラスミドｐＡＬＤＣ３を得た。
５をＨｉｎｃIIで切断後、Ｂａｌ３１で処理し、Ｈｉｎ
ｄIIIリンカーを付加したのち、ＨｉｎｄIII及びＢａｍ
ＨＩ切断により得られるα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子断片
をｐＵＣ１２（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄIII切断部位に挿入し、塩基配列を決定し、α−Ａ
ＬＤＣａｓｅ遺伝子の５′上流約４０ｂｐ及び最初のＡ
ＴＧを欠失したプラスミドｐＡＬＤＣ３を得た。
ｐＡＬＤＣ３をＢａｍＨＩで分解し、Ｋｌｅｎｏｗ断片
により平滑末端とした後、ＨｉｎｄIII分解により得た
α−ＡＬＤＣ遺伝子断片をｐＡＫ５０３のＨｉｎｄIII
−ＳｍａＩ断片と置換して、プラスミドｐＡＬ５０３−
３を作成した。さらに、ｐａＬ５０３−３のＳｐｈＩ切
断点を、ＳｐｈＩ分解後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理、Ｂａ
ｍＨＩリンカー付加により、ＢａｍＨＩ切断点に変換し
た後、ＡＤＨ１プロモーター＋α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝
子断片をＢａｍＨＩ−ＢｇｌII断片として得た。
により平滑末端とした後、ＨｉｎｄIII分解により得た
α−ＡＬＤＣ遺伝子断片をｐＡＫ５０３のＨｉｎｄIII
−ＳｍａＩ断片と置換して、プラスミドｐＡＬ５０３−
３を作成した。さらに、ｐａＬ５０３−３のＳｐｈＩ切
断点を、ＳｐｈＩ分解後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理、Ｂａ
ｍＨＩリンカー付加により、ＢａｍＨＩ切断点に変換し
た後、ＡＤＨ１プロモーター＋α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝
子断片をＢａｍＨＩ−ＢｇｌII断片として得た。
また、ＨＩＰ１遺伝子の３′末端非翻訳領域約０．９ｋ
ｂと３′翻訳領域約０．１ｋｂを含むＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｌＩ断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片と
置換したプラスミドを作成し、このプラスミドのＢａｍ
ＨＩ切断点に、上記のＡＤＨ１プロモーター＋α−ＡＬ
ＤＣ遺伝子断片を挿入して、ＡＤＨ１プロモーター＋α
−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子＋ＨＩＰ１ターミネーターの順
序で連結されたプラスミドｐＡＬＴ１８を作成した。
ｂと３′翻訳領域約０．１ｋｂを含むＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｌＩ断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片と
置換したプラスミドを作成し、このプラスミドのＢａｍ
ＨＩ切断点に、上記のＡＤＨ１プロモーター＋α−ＡＬ
ＤＣ遺伝子断片を挿入して、ＡＤＨ１プロモーター＋α
−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子＋ＨＩＰ１ターミネーターの順
序で連結されたプラスミドｐＡＬＴ１８を作成した。
ＡＤＨ１プロモーター＋α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子＋Ｈ
ＩＰ１ターミネーター断片は、ｐＡＬＴ１８をＳａｌＩ
分解後、Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑末端とし、Ｂａｍ
ＨＩリンカーを付加した後、ＢａｍＨＩ分解により、Ｂ
ａｍＨＩ断片として得、ｐＩＲＬ９のＢｇｌII切断点に
挿入して、目的とするプラスミドｐＩＡＲＬ１を作成し
た。
ＩＰ１ターミネーター断片は、ｐＡＬＴ１８をＳａｌＩ
分解後、Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑末端とし、Ｂａｍ
ＨＩリンカーを付加した後、ＢａｍＨＩ分解により、Ｂ
ａｍＨＩ断片として得、ｐＩＲＬ９のＢｇｌII切断点に
挿入して、目的とするプラスミドｐＩＡＲＬ１を作成し
た。
(5)酵母へのｐＩＡＲＬ１の導入とα−ＡＬＤＣａｓｅ
遺伝子の発現 前述のようにして作製したｐＩＡＲＬ１を用いて、次の
ようにして酵母を形質転換した。ビール酵母ＩＦＯ ０
７５１株をＹＰＤ培地でＯＤ600＝１．０になるまで３
０℃で培養し、集菌してリチウムアセテート法によりｐ
ＩＡＲＬ１に接触させた。ｒＲＮＡ遺伝子配列での組換
えを促進するために、形質転換前にｐＩＡＲＬ１をｒＲ
ＮＡ遺伝子配列内のＫｐｎＩ切断点で完全分解し、直線
化してから用いた。ｐＩＡＲＬ１へ接触の後、酵母細胞
１０８個をＹＰＤ培地１mlに懸濁し、１８時間／３０℃
で振とうした後、抗生物質Ｇ４１８（５００ μｇ／m
l）を含むＹＰＤ寒天培地上に接種した。ついで、プレ
ートを３０℃で３〜５日間インキュベートして、コロニ
ーを得た。これらのコロニー中には、形質転換された細
胞の他に、ｐＩＡＲＬ１非依存的にＧ４１８耐性を獲得
した細胞が含まれているため、つまようじでＸ−ｇａ１
色素（５′−ブロモ−４′−クロロ−３′−インドイル
−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＲｕｂｙらの寒天培地
（メソッド・イン・エンザイモロジー、vol.101、p.253
(1983)に接種し、３０℃で２〜５日インキュベートし
た。このプレートで青く発色し、β−ガラクトシダーゼ
活性を示したもの（Ｌａｃ＋株）を形質転換体と判断し
た。このような細胞は、全て０．８〜１．８Ｕ／mgタン
パクのα−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した。最も高いα−
ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した形質転換体（ＳＫＢ１０３
株）をＹＰＤ培地で非選択的に８０世代培養した。培養
後のα−ＡＬＤＣａｓｅ活性は０．９Ｕ／mgタンパクで
あり、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示す遺伝子が染色体に
安定に組み込まれていることを示した。
遺伝子の発現 前述のようにして作製したｐＩＡＲＬ１を用いて、次の
ようにして酵母を形質転換した。ビール酵母ＩＦＯ ０
７５１株をＹＰＤ培地でＯＤ600＝１．０になるまで３
０℃で培養し、集菌してリチウムアセテート法によりｐ
ＩＡＲＬ１に接触させた。ｒＲＮＡ遺伝子配列での組換
えを促進するために、形質転換前にｐＩＡＲＬ１をｒＲ
ＮＡ遺伝子配列内のＫｐｎＩ切断点で完全分解し、直線
化してから用いた。ｐＩＡＲＬ１へ接触の後、酵母細胞
１０８個をＹＰＤ培地１mlに懸濁し、１８時間／３０℃
で振とうした後、抗生物質Ｇ４１８（５００ μｇ／m
l）を含むＹＰＤ寒天培地上に接種した。ついで、プレ
ートを３０℃で３〜５日間インキュベートして、コロニ
ーを得た。これらのコロニー中には、形質転換された細
胞の他に、ｐＩＡＲＬ１非依存的にＧ４１８耐性を獲得
した細胞が含まれているため、つまようじでＸ−ｇａ１
色素（５′−ブロモ−４′−クロロ−３′−インドイル
−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＲｕｂｙらの寒天培地
（メソッド・イン・エンザイモロジー、vol.101、p.253
(1983)に接種し、３０℃で２〜５日インキュベートし
た。このプレートで青く発色し、β−ガラクトシダーゼ
活性を示したもの（Ｌａｃ＋株）を形質転換体と判断し
た。このような細胞は、全て０．８〜１．８Ｕ／mgタン
パクのα−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した。最も高いα−
ＡＬＤＣａｓｅ活性を示した形質転換体（ＳＫＢ１０３
株）をＹＰＤ培地で非選択的に８０世代培養した。培養
後のα−ＡＬＤＣａｓｅ活性は０．９Ｕ／mgタンパクで
あり、α−ＡＬＤＣａｓｅ活性を示す遺伝子が染色体に
安定に組み込まれていることを示した。
(6)不要配列の削除とα−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子の発現 (5)で得た形質転換体（ＳＫＢ１０３株）をＹＰＤ培地
で２０〜３０世代非選択的に培養した後、適宜希釈して
前述のＸ−ｇａｌを含むＲｕｂｙらの寒天培地に接種し
た。このプレートを３０℃で５〜７日間培養し、青色を
発色しない株（Ｌａｃ−株）を分離した。これらの細胞
のうち、５００μｇ／mlのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天培
地でＧ４１８感受性を示すものを選択した。さらにα−
ＡＬＤＣａｓｅ活性を示す細胞を得た。
で２０〜３０世代非選択的に培養した後、適宜希釈して
前述のＸ−ｇａｌを含むＲｕｂｙらの寒天培地に接種し
た。このプレートを３０℃で５〜７日間培養し、青色を
発色しない株（Ｌａｃ−株）を分離した。これらの細胞
のうち、５００μｇ／mlのＧ４１８を含むＹＰＤ寒天培
地でＧ４１８感受性を示すものを選択した。さらにα−
ＡＬＤＣａｓｅ活性を示す細胞を得た。
これらの細胞に於いては、(4)-(i)に示したように、重
複したｒＲＮＡ遺伝子配列に於いて組換えが生じ、ＡＤ
Ｈ１プロモーター、α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子およびＨ
ＩＰ１ターミネーターのみが染色体上に残り、他のベク
ター部分は欠失していると考えられる。これらの細胞の
うち、０．２Ｕ／mgタンパクのα−ＡＬＤＣａｓｅ活性
を示した細胞（ＳＫＢ１０４株）を４０世代ＹＰＤ培地
で培養したが、活性は８０％以上維持された。
複したｒＲＮＡ遺伝子配列に於いて組換えが生じ、ＡＤ
Ｈ１プロモーター、α−ＡＬＤＣａｓｅ遺伝子およびＨ
ＩＰ１ターミネーターのみが染色体上に残り、他のベク
ター部分は欠失していると考えられる。これらの細胞の
うち、０．２Ｕ／mgタンパクのα−ＡＬＤＣａｓｅ活性
を示した細胞（ＳＫＢ１０４株）を４０世代ＹＰＤ培地
で培養したが、活性は８０％以上維持された。
(7)発酵試験 (5)で得たＳＫＢ１０３株ならびに、(6)で得たＳＫＢ１
０４株について醗酵試験を行ない、ＴＤＡ生成量が低減
することを以下の方法で確認した。２種の酵母を２０℃
で３日間、１０℃で１０日間ＹＰＤ培地で非選択的に静
置培養し、各々の菌体を３０００×ｇで１０分間の遠心
分離で集菌し、蒸留水で洗浄してから、醗酵試験に供し
た。
０４株について醗酵試験を行ない、ＴＤＡ生成量が低減
することを以下の方法で確認した。２種の酵母を２０℃
で３日間、１０℃で１０日間ＹＰＤ培地で非選択的に静
置培養し、各々の菌体を３０００×ｇで１０分間の遠心
分離で集菌し、蒸留水で洗浄してから、醗酵試験に供し
た。
１１°Ｐに調整した麦汁に酵母添加率０．６％(wet.w/
v)になるように酵母を添加し、充分に通気したのち、１
０℃で８〜１０日間静置醗酵させた。醗酵終了後、３０
００×ｇで１０分間の遠心処理及び過によって菌体を
のぞいた液について、ＴＤＡ量及び糖度を測定した。
結果は、下表に示すとおりであった。培養、醗酵とも非
選択条件下で行なったにもかかわらず、対照株に比して
顕著なＴＤＡ生成量の減少が見られ、α−ＡＬＤＣａｓ
ｅ活性が安定に発現していることが示された。
v)になるように酵母を添加し、充分に通気したのち、１
０℃で８〜１０日間静置醗酵させた。醗酵終了後、３０
００×ｇで１０分間の遠心処理及び過によって菌体を
のぞいた液について、ＴＤＡ量及び糖度を測定した。
結果は、下表に示すとおりであった。培養、醗酵とも非
選択条件下で行なったにもかかわらず、対照株に比して
顕著なＴＤＡ生成量の減少が見られ、α−ＡＬＤＣａｓ
ｅ活性が安定に発現していることが示された。
微生物の寄託 本発明に関係する下記の微生物は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されて次の受託番号を得
ている。
院微生物工業技術研究所に寄託されて次の受託番号を得
ている。
(1)ＳＫＢ１０１（ｐＡＬＧ５０３４を含む）………微
工研条寄第１２２８号 (2)ＳＫＢ１０２（ｐＡＬＧ５０３４を含む）………微
工研条寄第１２２９号 （１）および（２）の受託日は、いずれも、昭和６０年
１２月１１日である。
工研条寄第１２２８号 (2)ＳＫＢ１０２（ｐＡＬＧ５０３４を含む）………微
工研条寄第１２２９号 （１）および（２）の受託日は、いずれも、昭和６０年
１２月１１日である。
(3)ＳＫＢ１０４………微工研条寄第１２２７号 （３）の受託日は、昭和６１年１２月２日である。
第１図は、本発明によるＤＮＡ鎖およびアミノ酸配列を
示す説明図である。 第２図は、ｐＡＬＧ５０３４の構造を示す説明図であ
る。 第３図は、ｐＩＡＲＬ１の構造を示す説明図である。
示す説明図である。 第２図は、ｐＡＬＧ５０３４の構造を示す説明図であ
る。 第３図は、ｐＩＡＲＬ１の構造を示す説明図である。
フロントページの続き (72)発明者 井上 喬 群馬県高崎市宮原町３ 麒麟麦酒株式会社 麦酒科学研究所内 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，14 （1970）Ｐ．133−137
Claims (3)
- 【請求項１】下記の塩基配列を有するＤＮＡ鎖またはそ
の縮重異性体を含んでなることを特徴とする、α−アセ
ト乳酸脱炭酸酵素の生物工学的産生能を有するＤＮＡ
鎖。 - 【請求項２】下記の塩基配列を有するＤＮＡ鎖またはそ
の縮重異性体を含んでなるα−アセト乳酸脱炭酸酵素の
生物工学的産生能を有するＤＮＡ鎖によって形質転換さ
れ、そのα−アセト乳酸産生能が抑制されていることを
特徴とする、サッカロマイセス・セレビシエに属する酵
母。 - 【請求項３】形質転換が、該ＤＮＡ鎖をその遺伝情報が
発現可能な状態で含むプラスミドによってなされてい
る、特許請求の範囲第２項に記載の酵母。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61289571A JPH0614865B2 (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-04 | α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 |
| US06/940,596 US4895802A (en) | 1985-12-13 | 1986-12-11 | DNA strand coding for α-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the DNA strand |
| DK198606001A DK175566B1 (da) | 1985-12-13 | 1986-12-12 | DNA-Streng, der koder for alfa-acetolactat-decarboxylase, gærsvamp transformeret med DNA-strengen, fremgangsmåde til fremstilling af en gærsvamp med nedsat alfa-acetolactat-producerende evne og fremgangsmåde til fremstilling..... |
| AU66454/86A AU589238B2 (en) | 1985-12-13 | 1986-12-12 | DNA strand coding for alpha-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the DNA strand |
| DE8686117404T DE3684268D1 (de) | 1985-12-13 | 1986-12-15 | Alpha-acetolactatdecarboxylase kodierender dns-strang und damit transformierte hefen. |
| EP86117404A EP0228009B1 (en) | 1985-12-13 | 1986-12-15 | Dna strand coding for alpha-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the dna strand |
| CA000532171A CA1296276C (en) | 1986-12-04 | 1987-01-30 | DNA STRAND CODING FOR .alpha.-ACETOLACTATE DECARBOXYLASE AND YEAST TRANSFORMED WITH THE DNA STRAND |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-280289 | 1985-12-13 | ||
| JP28028985 | 1985-12-13 | ||
| JP61289571A JPH0614865B2 (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-04 | α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25552592A Division JPH07121215B2 (ja) | 1985-12-13 | 1992-08-31 | 酒類の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62228282A JPS62228282A (ja) | 1987-10-07 |
| JPH0614865B2 true JPH0614865B2 (ja) | 1994-03-02 |
Family
ID=26553712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61289571A Expired - Lifetime JPH0614865B2 (ja) | 1985-12-13 | 1986-12-04 | α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖およびこのＤＮＡ鎖により形質転換された酵母 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4895802A (ja) |
| EP (1) | EP0228009B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0614865B2 (ja) |
| AU (1) | AU589238B2 (ja) |
| DE (1) | DE3684268D1 (ja) |
| DK (1) | DK175566B1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI92333C (fi) * | 1987-03-17 | 1994-10-25 | Panimolaboratorio Bryggerilabo | -asetolaktaattidekarboksylaasiaktiivisuutta omaavaa entsyymiä koodaava DNA-sekvenssi ja sen käyttö nopeutettuun oluen valmistukseen soveltuvien hiivakantojen rakentamiseksi |
| JPH02265488A (ja) * | 1988-04-22 | 1990-10-30 | Kirin Brewery Co Ltd | α―アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするＤＮＡ鎖、このＤＮＡ鎖により形質転換された酵母、およびこの酵母を用いる酒類の製造法 |
| US5043276A (en) * | 1988-04-22 | 1991-08-27 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | DNA strand coding for alpha-acetolactate decarboxylase and yeast transformed with the DNA strand |
| US6004776A (en) * | 1989-07-07 | 1999-12-21 | Unilever Patent Holdings, B.V. | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
| CA2063592C (en) * | 1989-07-07 | 2003-01-21 | Marco L. F. Giuseppin | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector |
| DK194990D0 (da) * | 1990-08-16 | 1990-08-16 | Novo Nordisk As | Aldc-derivat og anvendelse deraf |
| US5856928A (en) * | 1992-03-13 | 1999-01-05 | Yan; Johnson F. | Gene and protein representation, characterization and interpretation process |
| FR2696191B1 (fr) * | 1992-09-25 | 1994-11-25 | Agronomique Inst Nat Rech | Acide nucléique codant pour une alpha-acétolactate décarboxylase et ses applications. |
| FR2750703B1 (fr) * | 1996-07-08 | 1998-11-06 | Kronenbourg Brasseries | Souches de levure de fermentation brassicole |
| JP2001321160A (ja) * | 2000-05-12 | 2001-11-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | パンの製造方法 |
| CN100386419C (zh) * | 2002-11-07 | 2008-05-07 | 三得利株式会社 | 发酵饮料的制造方法 |
| EP2210952A1 (en) * | 2009-01-27 | 2010-07-28 | Rijksuniversiteit Groningen | Process for the production of a compound or a composition employing a culture of microorganisms under circadian cultivation conditions |
| WO2020058914A1 (en) | 2018-09-19 | 2020-03-26 | Danstar Ferment Ag | Expression of heterologous enzymes in yeast for reducing diacetyl and dextrin |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK252483D0 (da) * | 1983-06-03 | 1983-06-03 | Novo Industri As | Alpha-acetolactate decarboxylaseemzymprodukt og fremstilling deraf |
| IL75210A0 (en) * | 1984-05-22 | 1985-09-29 | Bioteknika International | Yeast vector |
-
1986
- 1986-12-04 JP JP61289571A patent/JPH0614865B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-11 US US06/940,596 patent/US4895802A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-12 DK DK198606001A patent/DK175566B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-12-12 AU AU66454/86A patent/AU589238B2/en not_active Expired
- 1986-12-15 EP EP86117404A patent/EP0228009B1/en not_active Expired
- 1986-12-15 DE DE8686117404T patent/DE3684268D1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４（１９７０）Ｐ．１３３−１３７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK600186D0 (da) | 1986-12-12 |
| AU589238B2 (en) | 1989-10-05 |
| EP0228009B1 (en) | 1992-03-11 |
| JPS62228282A (ja) | 1987-10-07 |
| DE3684268D1 (de) | 1992-04-16 |
| US4895802A (en) | 1990-01-23 |
| EP0228009A2 (en) | 1987-07-08 |
| AU6645486A (en) | 1987-06-18 |
| EP0228009A3 (en) | 1988-10-05 |
| DK600186A (da) | 1987-06-14 |
| DK175566B1 (da) | 2004-12-06 |
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