JPH06102029B2

JPH06102029B2 - Ｌ−トリプトフアンの製造法

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Publication number: JPH06102029B2
Application number: JP59161217A
Authority: JP
Inventors: 雅昭石田; 清志三輪; 茂中森; 孝之輔佐野
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1984-07-31
Filing date: 1984-07-31
Publication date: 1994-12-14
Anticipated expiration: 2009-12-14
Also published as: EP0170257B1; US4885245A; DE3585855D1; JPS6140797A; EP0170257A2; EP0170257A3

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野この発明は、組換えDNA技術によって育成されたコリネ
型細菌を用いるＬ−トリプトファンの製造法に関する。

従来の技術微生物を用いるＬ−トリプトファンの製造法として、グ
ルコース等の炭水化物を原料としてＬ−トリプトファン
を製造しようとする場合には、野性株は殆んど菌体外に
L-トリプトファンを生産しないので、野性株に人工的に
突然変異を生起せしめてL-トリプトファン生産能を付与
する方法がとられている。

従来知られているL-トリプトファン生産能を有する人工
変異株としては、ブレビバクテリウム、ミクロバクテリ
ウム又はコリネバクテリウム属の5-メチルトリプトファ
ンに耐性を有する変異株（米国特許3700539）、コリネ
バテリウム属のチロシンとフェニルアラニンを要求し、
フェニルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異株
（特公昭51-19037）、バチルス属の5-フルオロトリプト
ファンに耐性を有する変異株（特開昭49-85289）、ブレ
ビバクテリウム属の5-メチルトリプトファン及びm-フル
オロトリプトファンに耐性を有する変異株（特開昭50-4
2091）等が知られている。

一方、最近上述のような人工変異による育種と異なると
ころの組換えDNA技術をL-トリプトファン生産菌の育種
に利用する試みもいくつか報告されている。例えば、Ap
pl.Environ.Microbiol.38,（２）,181-190,（1979）に
はエシェリヒア・コリのtrp E472遺伝子をもつプラスミ
ドを含有するエシェリヒア・コリの特定の変異株が、約
1.3g/lのL-トリプトファンを生産したことが記載されて
いる。又、「日本発酵工学会昭和55年度大会講演要旨
集170頁（1980）」にもやはりエシェリヒア・コリのト
リプトファンオペロンを組み込んだプラスミドを含有す
るエシェリヒア・コリの変異株が360mg/lのL-トリプト
ファンを生産したことが記載されている。

更に特開昭57-208994には、組換えDNA技術によって育成
されたバチルス属の微生物を用いてL-トリプトファンを
生産することが記載されている。

一方、イッドール又はアンスラニル酸を原料とするL-ト
リプトファンの製造法も多く知られている。（例えば特
公昭43-20711、特公昭46-16955、特公昭47-46348、特公
昭47-29584、特開昭48-80785、特開昭48-87085、特開昭
50-95484等）。

また、組換えDNA技術を用いて育成されたバチルス属の
細菌によりインドール又はアンスラニル酸よりL-トリプ
トファンを製造する方法も知られている（特開昭58-891
94）。

発明が解決しようとする問題点本発明は、これらの従来の技術に比べより効率のよいL-
トリプトファンの製造法を見い出すことを目的とするも
のである。

問題点を解決するための手段本発明者らは、コリネ型細菌由来のトリプトファンシン
セターゼ（L-tryptophan synthetase（４、２、１、2
0），以下「TS」と記す）をコードする遺伝子がコリネ
型細菌内で増殖し得るプラスミドベクターに接続されて
いる組換えDNAを有する５−フルオロトリプトファンに
耐性を示すコリネ型細菌を育成することに成功し、かつ
このようなコリネ型細菌を用いて、炭水化物、アンスラ
ニル酸又はインドールよりL-トリプトファンを効率よく
生産するプロセスを開発することに成功した。

すなわち本願発明は、コリネ型細菌に属するDNA供与菌
より得られ、トリプトファンシンセターゼをコードする
遺伝子を含むDNA断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律
複製できるベクタープラスミドに接続されて、コリネ型
細菌に属し５−フルオロトリプトファンに耐性を示すDN
A受容菌に導入されて得られるＬ−トリプトファン生産
能を有する微生物を培養液に培養し、培養液中に蓄積さ
れたＬ−トリプトファンを採取することを特徴とするＬ
−トリプトファンの製造法、および培養液が、アンスラ
ニル酸あるいはインドールが添加されたものである上記
の製造法である。

さらに本願発明は、コリネ型細菌に属するDNA供与菌よ
り得られ、トリプトファンシンセターゼをコードする遺
伝子を含むDNA断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律複
製できるペクタープラスミドに接続されて、コリネ型細
菌に属し５−フルオロトリプトファンに耐性を示すDNA
受容菌に導入されて得られるＬ−トリプトファン生産能
を有する微生物を培養液に培養し、得られた菌体あるい
はその処理物を水性媒体中でアンスラニル酸あるいはイ
ンドールに接触せしめることを特徴とするＬ−トリプト
ファンの製造法である。

本発明でいうコリネ型細菌は、バーヂース・マニュアル
・オブ・デターミネイティブバクテリオロジー第８版59
9頁（1974）に記載されているところの好気性、非抗酸
性、ダラム陽性桿菌である。その内特に以下に例示する
ようなL-グルタミン酸を大量に生産するものが知られて
いる。これらの菌株はいずれも同一属に属するものと考
えられる。

ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 コリネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有
するもののほかにグルタミン酸生産性を失った変異株及
び他の変異株も含まれる。

TS遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌のTS遺伝子を
有している菌株よりまず染色体遺伝子を抽出し（例えば
H.Saito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta 72,619,
（1963）に記載されている方法が使用できる）、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌で増
殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のTS欠損変異株を形質転換せ
しめ、TS生成活性を保有するにいたった菌株を単離し、
これよりTS遺伝子を分離できる。

染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間等を調節
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。

本発明にて使用されるコリネ型細菌内で増殖し得るプラ
スミドベクターは、コリネ型細菌細胞内において増殖し
得るものであればどのようなものでも良い。具体的に例
示すれば以下のものがある。

（１）pAM 330 特開昭58-67699参照（２）pAM 1519 特開昭58-77895参照（３）pAJ 655 特開昭58-216199参照（４）pAJ 611 同上（５）pAJ 1844 同上（６）pCG １特開昭57-134500参照（７）pCG ２特開昭58-35197参照（８）pCG ４特開昭57-183799参照（９）pCG 11 同上これらはいずれも当然使用可能であろう。

ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際に用いられ
た制限酵素により切断され、または染色体DNA切断フラ
グメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれの両端
に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続
せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体DNAフラ
グメントとのライゲーション反応に付される。

このようにして得られた、染色体DNAとベクタープラス
ミドとの組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌へ導
入するには、エシェリヒア・コリK-12について報告され
ている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,1
59（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNA
の透過性を増す方法、またはバラルス・ズブチルスにつ
いて報告されている様に（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and
Young,F.E.,Gene,1,153（1977））細胞がDNAを取り込
み得るようになる増殖段階（いわゆるコンピテントセ
ル）に導入する方法により可能である。あるいは、バチ
ルス・ズプチリス、放線菌類および酵母について知られ
ている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.,Gene
t.,168.111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hoowood,
O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hicks,J.B.an
d Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929（197
8））、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込む
プロドプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミ
ドをDNA受容菌に導入することも可能である。

プロトプラスト法では上記のバチルス・ズプチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57-183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはプレビバクテリウム属のプロトプラスト
にポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコール
と二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込ませる方法
も当然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリ
ビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチルセルロ
ース、デキストラン、フイコール、ブルロニックF68
（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込みを促進
させる方法でも同等の結果が得られる。

形質転換の後、TS生産性を獲得し、または、さらにプラ
スミドベクターが有しているマーカーとしての性質を発
現する菌株を所望の形質転換株として分離する。このよ
うな形質転換株は、TS遺伝子が組み込まれている組換え
DNAを有している。組換えDNAを単離する方法は、例えば
菌体をリゾチームSDS処理により溶菌させ、フェノール
処理ののち、２容のエタノールを加えてDNAを沈澱回収
する。

得られた組換えDNAを有するコリネ型細菌を用いてL-ト
リプトファンを製造する方法は大別して以下のものがあ
る。しかしこれらを分けて説明したのは、発明の理解を
より容易にするためであり、厳密にいえば、以下のいず
れのケースに分類できるのか明確でないこともありう
る。

第一の方法は、炭水化物を原料としてL-トリプトファン
を製造する方法である。即ち、培地としては、炭素源で
ある炭水化物、窒素源、無機イオン、更に必要に応じア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の
ものである。炭水化物としては、グルコース、シュクロ
ース、フラクトース、ラクトース等及びこれらを含有す
る澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素
源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニ
ウム塩その他が使用できる。

培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にL-トリプトファンの生産蓄積が停止するま
で通常２日ないし４日間行なわれる。かくして培地中に
著量のL-トリプトファンが生成、蓄積される。

第二の方法は、第一の方法における培地に、又は培養の
間の培地に、インドール又はアンスラニル酸を添加する
ものである。この方法は組換えDNAを有するコリネ型細
菌が増殖しうるような条件下でL-トリプトファンが生成
される点で、第一の方法と共通しているが、L-トリプト
ファンの原料としてアンスラニル酸又はインドールが更
に使用される点で第一の方法とは異なる。

アンスラニル酸又はインドールは培養開始時より培地に
添加しても良いが、培養の間、特にコリネ型細菌の増殖
を阻害しないようコリネ型細菌が充分増殖して後、培地
に添加しても良い。アンスラニル酸又はインドールの培
地への添加量は、コリネ型細菌コリネ型細菌の増殖を阻
害する培地中の濃度を超えないような量とすることが望
ましく、そのためには、アンスラニル酸又はインドール
の少量を連続的に又は数回に分けて培地に添加してもよ
い。更に培地には、後述のリボース供与体及びアラニン
側鎖供与体の１又は２以上を添加すれば、よりよい結果
が得られることがある。

コリネ型細菌の培養は、第一の方法と上記以外の点では
実質的に相違しない方法で行なわれる。

第三の方法と第二の方法は、アンスラニル酸とインドー
ルがL-トリプトファンの原料として使用される点で、両
者は良く似た方法であるが、コリネ型細菌の増殖が必要
でないような又はコリネ型細菌が増殖しない条件下でL-
トリプトファンが生産される点で、第一の方法とは異な
っている。即ち、第三の方法は、コリネ型細菌の増殖と
L-トリプトファンの生産が実質的に分けて行なわれる点
で第一及び第二の方法とは異なる。

コリネ型細菌を増殖せしめる培地は、先に述べた炭素
源、窒素源、無機イオン更に必要に応じアミノ酸、ビタ
ミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用で
きる。培地には、少量のアンスラニル酸又はインドール
を添加した方がよりL-トリプトファン生成活性の高い菌
体を得られる場合が多い。培養方法についても先に述べ
たような好気的条件下で行うとよい。

培養後、コリネ型細菌菌体を一旦分離する。菌体として
は培養液そのままでもよいが、濾過又は遠心分離等によ
り培養液より分離されたもの、分離された菌体を水、ア
セトン、界面活性剤等で洗浄されたものも用いられる。
更に、上記の菌体を、固定化したもの、破砕又は摩砕し
たもの又はこれより蛋白分画分を適宜分離したもの、更
には、分離されたTS蛋白等の菌体処理物も使用できる。

これらの菌体又は菌体処理物は、L-トリプトファンを生
成させるための水性媒体中にアンスラニル酸又はインド
ールと共に添加される。菌体又は菌体処理物の使用量
は、菌体量に換算して0.5〜5g/dl（乾物換算）が良好で
ある。菌体として培養液そのままを用いるときは培養液
又は培養液を水等で希釈したもの、一旦分離された菌体
又は菌体処理物を用いるときは燐酸バッファーのような
バッファーでも良いが単に水であっても良い。

けん濁液には更に亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン
四酢酸、ピリドキサル燐酸あるいはアセトン、エタノー
ル等の有機溶媒、界面活性剤等を添加すれば、より好ま
しい結果が得られる場合が多い。また水性媒体にイノシ
ンを添加しておくと、難溶性のトリプトファン・イオシ
ン複合体を形成して、トリプトファンは反応液より除か
れるので、反応はL-トリプトファンの生成により向うこ
とになる。

アンスラニル酸又はインドールの水性媒体中の好ましい
濃度は、アンスラニル酸は0.1〜5g/dl、インドールのと
き0.1〜4.5g/dlである。

原料としてアンスラニル酸を使用するときは、水性媒体
には更に、リボース、5-ホスホリボース、1-ホスホリボ
ース又は5-ホスホリボースピロリン酸より選ばれるリボ
ース供与体が水性媒体に添加される。添加量は、何れも
0.1〜5g/dlが良く、アンスラニル酸が基質として高濃度
に添加するときは、それに応じてこれらの添加物濃度を
高めることが望ましい。

原料としてインドールを使用するときは、アラニン側鎖
供与体又はピルビル酸とアンモニウムイオンが水性媒体
に添加される。アラニン側鎖供与体は次の一般式で示さ
れるものである。

X-CH₂‐CH(NH₂)CO₂H （Ｘはヒドロキシル基、ハロゲン、アルキルメルカプト
基、メルカプト基、アルコキシ基、ベンジルオキシ基、
又はチオベンジル基である）アラニン側鎖供与体及びピルビン酸の添加量はそれぞれ
0.1M〜1Mである。L-トリプトファン生成反応は、アンス
ラニル酸のときは、水性媒体を25〜45℃、10〜48時間振
盪反応させるとよい。又、インドールのときは、水性媒
体を、25〜45℃、５〜48時間静置又はゆるやかに振盪反
応させるのがよい。

第一、第二又は第三の方法により得られた培養液又は水
性媒体中に生成されたL-トリプトファンは通常の方法で
分離、採取できる。

実施例１（１）TSの遺伝子を含む染色体DNAの調製 L-トリプトファンによるフィードバック阻害耐性である
TS遺伝子を有するブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムAJ12030 FERM-BP 276を１のCMG培地（ベプトン
1g/dl、酵母エキス1g/dl、グルコース0.5g/dl、及びNaC
l0.5g/dlを含み、pH7.2に調整したもの）に植菌し、30
℃で約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集
めた。この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、
通常のフェノール処理法により、染色体DNAを抽出精製
し、最終的に3.5mgのDNAを得た。

（２）ベクターDNAの調製ベクターとしてpAJ 1844（分子量5.4メガダルトン）を
用い、そのDNAを次の様にして調製した。

まずpAJ 1844をプラスミドとして保有するブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 12037（FERM P−723
4,FERM BP−577）を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対
数増殖期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理に
より溶菌させ、30,000×g30分の超遠心により上清を得
た。フェノール処理ののち、２容のエタノールを加えて
DNAを沈澱回収した。これを少量のTEN緩衝液（20mMトリ
ス塩酸塩、20mM NaCl、1 mM EDTA（pH8.0）に溶解後、
アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ
1844プラスミドDNA約12μｇを得た。

（３）染色体DNA断片のベクターへの挿入（１）で得た染色体DNA20μｇと（２）で得たプラスミ
ドDNA10μｇとを制限エンドヌクレアーゼPstIでそれぞ
れを37℃、１時間処理し、完全に切断した。65℃10分の
熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレイト
ール存在下、T₄ファージ由来のDNAリガーゼによって10
℃、24時間DNA鎖の連結反応を行った。65℃５分の熱処
理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終
了後のDNAを沈澱採取した。

（４）TS遺伝子のクローニング TSのαサブユニット（以下TSAと略す）の遺伝子が欠損
したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムNo.21
株を受容菌として用いた。

形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を5mlのCMG液体培
地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを0.6
ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分
離により菌株を集め、菌体を0.5Mシュークロース、20mM
マレイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナッセイ
ブロス（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗
浄した。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に
懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000×
ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し
0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様にして得られたプ
ロトプラストと（３）で調製したDNA10μｇを5mM EDTA
存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取
り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロトプラ
ストをSMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁し、
形質発現の為、30℃で２時間培養した。この培養液をpH
7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプ
ラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、M
gCl₂・6H₂O8.1g、CaCl₂・2H₂O2.2g、ペプトン4g、粉末酵
母エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K₂HPO₄0.2g、
コハク酸ナトリウム135g、寒天8g及びクロラムフェニコ
ール３μg/mlを含む。

30℃で２週間培養後、約10,000個のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが出現してきたのでこれをスレオニンを
含まない培地（Thr欠培地）（グルコース２％、硫酸ア
ンモニウム１％、尿素0.25％、りん酸二水素カリウム0.
1％、硫酸マグネシウム７水塩0.04％、FeSO₄・7H₂O1mg/d
l、MnSO₄・4H₂O1mg/dl、サイアミン塩酸塩200μg/l、ビ
オチン50μg/l、pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、ク
ロラムフェニコール耐性であってかつトリプトファン要
求性が消失した菌株３株を得た。

（５）形質転換株のプラスミド解析これらの株より（２）で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、ベクターのpAJ 1844よりも大きな
プラスミドを有する形質転換株１株を得、本株保有の組
換えプラスミド上にTSA遺伝子が存在することを確認し
た。本株をAJ12140（FERM P−7749,FERM BP−846）、本
組換えプラスミドをpAJ319と命名した。

またpAJ319をTSのβサブユニット（以下TSBと略す）欠
損のB-5株に導入すると上述と同様に、トリプトファン
要求性が消失することより、pAJ1844のPst Iサイトに挿
入された3.0Kbフラグメント上にtrp A及びtrp B遺伝子
が存在することが判明した。

（６）形質転換株のTS活性被検株をL-トリプトファン生産培地（後述）20mlで培養
した菌体より、超音波処理により、溶菌液を調製し、こ
れを32,000×g30分遠心分離して上清を得た。この上清
を粗酵素液として用い、100mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
8）、0.4mMインドール、30mM L-セリン、40μＭピリド
キサール‐５′‐リン酸、180mM食塩から成る酵素反応
液（総量1ml）を用い、TSB活性を測定した。反応は30
℃、30分で1N NaOH0.1ml添加し、残存インドールをトル
エン抽出後インドール試薬で発色後分光光度計で測定し
た。（540nm）結果を第１表に示す。

形質転換株AJ 12139（FERM−P 7750,FERM BP−847）株
では野生株（AJ 12036（FERM−P 7559,FERM BP−73
4））の約11倍の増大が観察され、20mM L-トリプトファ
ン存在下でも阻害を受けにくくなっていることを確認し
た。

（７）形質転換株のL-トリプトファン生産能上記のAJ 12139株よりpAT 319を（２）の方法で抽出
し、（４）に記載したトランスホーメーション法によ
り、AJ 12036株より5-フルオロトリプトファン耐性株と
して誘導した、L-トリプトファン生産株M-274株に導入
し、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換株を選
択した。

かくして得られたAJ 12140及びM-274を培養しL-トリプ
トファン生産能を調べたところ第２表に示す結果を得
た。培養はグルコース130g,(NH₄)₂SO₄25g,フマル酸12
g、酢酸3g、KH₂PO₄1g、MnSO₄・4H₂O8mg、MgSO₄・7H₂O1g、
ビオチン50μｇ、サイアミン塩酸塩2000μｇ、L-チロシ
ン650mg、DL-メチオニン400mg及びCaCO₃50gを水１に
含むpH6.5の培地3mlを試験管ないし、20mlを肩付フラス
コに分注したものに被検株を植え30℃にて72時間振盪下
で行なった。培養後遠心上清中のL-トリプトファンをマ
イクロバイオアッセイにより定量した。結果を第２表に
示す。

実施例２（１）pAJ 319のコリネバクテリウム属細菌への導入 pAJ 319プラスミドを、実施例１と同様の方法でコリネ
バクテリウム・グルタミカムの野生株AJ 11560（FERM-P
5485）に導入した。クロラムフェニコール耐性で選択
し形成転換株AJ12141（FERM P−7748,FERM BP−845）を
得た。本株がpAJ319を有していることをアガロース電気
泳動により確認した。

（２）形質転換株のL-トリプトファン生産性実施例１で行なった培養条件で本形質転換株AJ12141（F
ERM−P 7748）を培養した。結果を第３表に示す。尚培
地としては、グルコース100g、(NH₄)₂SO₄40g、KH₂PO₄1
g、MgSO₄・7H₂O0.4g、Mn²⁺2ppm、ビオチン300μｇ、サイ
アミン塩酸塩200μｇ、カザミノ酸1g、味液10ml、及びC
aCO₃50gを水１に溶かしpH7.2に調整したものを使用し
た。

実施例３実施例１及び２で各々得られたAJ12140及びAJ12141株を
アンスラニル酸あるいはインドールを添加した培地で培
養した結果を第４表に示す。培養条件は実施例１の
（７）と同様にした。アンスラニル酸は培養開始後48時
間目に0.5％添加した。他方、インドールは48〜72時間
のあいだに、少量ずつフィードし、全量で0.5％添加し
た。対照として実施例１及び２で使用した原株M-274及
びAJ11560株を同様の条件で発酵を行なった。また各々
の株を用いて条件でアンスラニル酸もインドールも添加
せずに培養した結果も第４表に示した。

実施例４第５表に示す各菌株を各々500ml容肩付フラスコに注入
したCMG培地50mlに１白金耳接種し、30℃にて20時間培
養した。但し形質転換株であるAJ12140及びAJ12141株を
培養する培地にはクロラムフェニコール（10μg/ml）を
添加した。培養液１を遠心分離して菌体を集め、これ
を、アンスラニル酸20g、5-ホスホリボシルピロホスフ
ェート20gを含有する0.1％‐NH₄Cl-NH₄OH緩衝液（pH8.
0）１に添加し、37℃にて20時間振盪しながら反応さ
せたところ、反応終了液中に第５表に示すようなL-トリ
プトファンが生成した。

実施例５第６表に示す各菌株を実施例４と同じ培養条件で培養し
た培養液１を遠心分離して菌体を集めこれを第６表に
化合物にNa₂SO₃0.1g/dl、EDTA0.3g/dl、ピリドキサルリ
ン酸0.01g/dl、イノシン5.4g/dl（pH8.5）の組成をもつ
反応液100mlに懸濁し、30℃で48時間反応を行なった。
第６表に結果を示した。

尚、本発明にベクターとして用いたプラスミドpAJ1844
はエシェリヒア・コリAJ11883に導入された形で微工研
に寄託されており（（FERM−P 6518＝FERM−BP 137））
AJ11883株を対数増殖後期まで生育させた後、リゾチー
ム及びSDSに溶菌せしめ30,000×ｇで遠心分離して得ら
れた上清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させた
DNAを塩化セシウム・エチジウムブロミド平衡密度勾配
遠心で分画することにより精製することができる。

また、実施例１で用いたNo.21株はAJ12139よりM-247株
はAJ12140より以下の手法で宿主細胞を損うことなく宿
主細胞中の複合プラスミドを除去することにより取得す
ることができる。プラスミドは宿主より自然に失なわれ
ることもあるし、「除去」操作によって除くこともでき
る（Bact.Rev.,36.p361-405（1972））。除去操作の一
例は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害する
濃度（2-50μg/ml）のアクリジンオレンジを含む培地
に、1ml当り約10⁴細胞程度になる様に少量の菌株を接種
し宿主菌の生育を不完全に阻害してから27-35℃で一夜
培養する（J.Bacteriol.,88.261（1964））。培養液を
寒天培地に塗布し、27-42℃で一夜培養する。培地上に
出現したコロニーの内、クロラムフェニコール耐性を失
ったものかプラスミドが除去されているものである。

また、No.21株はAJ12139より、M-247株はAJ12140より、
以下の手法で取得することができる。即ち寄託された各
形質転換株を、CMG培地プレートで数回植え継ぎ、コロ
ニー分離し、各々のころにーをクロラムフェニコール耐
性試験を調べる。得られたクロラムフェニコール感受性
株は、（２）で述べた方法でプラスミドを調べ、プラス
ミドを有しないものがNo.21株又はM-247株である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型細菌に属するDNA供与菌より得ら
れ、トリプトファンシンセターゼをコードする遺伝子を
含むDNA断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律複製でき
るベクタープラスミドに接続されて、コリネ型細菌に属
し５−フルオロトリプトファンに耐性を示すDNA受容菌
に導入されて得られるＬ−トリプトファン生産能を有す
る微生物を培養液に培養し、培養液中に蓄積されたＬ−
トリプトファンを採取することを特徴とするＬ−トリプ
トファンの製造法。
【請求項２】培養液が、アンスラニル酸あるいはインド
ールが添加されたものである特許請求の範囲第１項記載
の製造法。
【請求項３】コリネ型細菌に属するDNA供与菌より得ら
れ、トリプトファンシンセターゼをコードする遺伝子を
含むDNA断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律複製でき
るベクタープラスミドに接続されて、コリネ型細菌に属
し５−フルオロトリプトファンに耐性を示すDNA受容菌
に導入されて得られるＬ−トリプトファン生産能を有す
る微生物を培養液に培養し、得られた菌体あるいはその
処理物を水性媒体中でアンスラニル酸あるいはインドー
ルに接触せしめることを特徴とするＬ−トリプトファン
の製造法。