JPH06104058B2

JPH06104058B2 - アベルメクチンアグリコンの製造法およびそのための培養菌株

Info

Publication number: JPH06104058B2
Application number: JP63265943A
Authority: JP
Inventors: ラピューエン・ハリー・ラム; ハミッシュ・アラステア・アーヴィン・マッカーサー; リチャード・ジェラルド・ワックス
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Corp SRL
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1994-12-21
Anticipated expiration: 2009-12-21
Also published as: DK586988A; DK586988D0; EP0313297B1; IE61806B1; JPH01153083A; PT88826B; IE883192L; DE3881147T2; EP0313297A2; DE3881147D1; ES2054822T3; EP0313297A3; CA1337757C; ATE89604T1

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はグリコシル化アベルメクチン生成能力を欠き、
および分枝２−オキソ産デヒドロゲナーゼ活性を持たな
いストレプトミセスアベルミチリス（Streptomyces a
vermitilis）の突然変異体、前記S．アベルミチリス（S
treptomyces avermitilis）を製造する方法および天然
および非天然アベルメクチンアグリコンの製造におけ
るそれらの利用に関する。

従来の技術米国特許4,310,519号および4,429,042号は強力な抗寄生
虫活性を持つ関連薬剤の複合体であるアベルメクチン
類、およびストレプトミセスアベルミチリス株（即ち
ATCC番号31267,31271および31272号のS．アベルミチリ
ス）の好気的醗酵によるそれらの生成について記載して
いる。引用した後の２つの株は各々ATCC番号31267号の
S．アベルミチリスの紫外線照射により得られた培養物
の凍結バイアルおよび凍結乾燥チューブを表わしてい
る。

1986年７月16日付で出願された米国特許申請第866,867
号に相当するヨーロッパ特許214,731号（1987年３月18
日付特許公開）は、天然または既知のアベルメクチンに
関連はしているが、25位に新規置換基を持つ多数の化合
物（本明細書では非天然アベルメクチンと称する）、お
よびある種の特定のカルボン酸またはそれらの前駆体の
誘導体存在下におけるアベルメクチン生成微生物の醗酵
によるそれらの製造のための過程について記載してい
る。また前記アベルメクチンのアグリコンおよび非天然
アベルメクチンの緩和な酸化水分解によるそれらの製造
法についても記載している。前記新規Ｃ−25置換アベル
メクチンの生成に用いるS．アベルミチリス微生物はATC
C番号31267,31271,31272およびNCIB番号12121号のS．ア
ベルミチリスである。ATCC番号31271号のS．アベルミチ
リスから誘導された後者の微生物はある程度規定した培
地で培養した場合新規Ｃ−25置換アベルメクチンの収量
が上がる。ATCC番号31267,31271,31272およびNCIB番号1
2121の各々はまた新規Ｃ−25置換アベルメクチンに加
え、種々の量の既知または天然のアベルメクチン〔25−
置換基はイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル（１
−メチルプロピル）〕を産生する。

アベルメクチンの炭素骨核（式（Ｉ）に示した）は酢酸
塩およびプロピオン酸塩から、および天然アベルメクチ
ンのＣ−25置換基はＬ−イソロイシン（Ｒ＝（Ｓ）−se
c−ブチル）またはＬ−パリン（Ｒ＝イソプロピル）か
ら誘導される〔フィッシャーおよびムロジック“マクロ
ライド抗生物質”アカデミックプレス（1984）,14
章〕。

“既知の”または“天然の”アベルメクチンとはATCC番
号31267,31271および31272号のS．アベルミチリスによ
り生成され、25位の置換基がイソプロピルまたは（Ｓ）
‐sec-ブチル（１−メチルプロピル）であるアベルメク
チンを意味する。25位の置換基がイソプロピルまたはse
c-ブチル（Ｓ−型）以外のアベルメクチンは本明細書で
は新規または非天然のアベルメクチンと称する。

前述の特許において引用したS．アベルミチリス株は一
般にC-076と記述される部類の物質を生成する。これに
は、はっきり異ったしかし、A1a,A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,
B2aおよびB2bと記述される非常に相関した８つの種類が
ある。“a"系列の化合物は25位の置換基が（Ｓ）‐sec-
ブチル、“b"系列は25位の置換基がイソプロピルである
天然アベルメクチンを意味する。各称“A"および“B"は
各々５位置換基がメトキシまたはホドロキシのアベルメ
クチンを意味する。最後に番号“1"は22−23位に二重結
合が存在するアベルメクチンを意味し；および番号“2"
は22−位に水素を、23位に水酸基を持つアベルメクチン
を意味する。

本明細書においては同定記号“a"および“b"は脱落して
いる。同定記号A1,A2,B1およびB2は先に記載したごとき
天然アベルメクチンの構造様相に対応する構造様相を持
つ非天然アベルメクチンを表わするために残してある。

分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く突然変異
体の発生は、枯草菌〔ヴィレッケおよびパーディ、ジャ
ーナルオブバイオロジカルケミストリー245,5264
-72（1971）〕およびシュードモナスプチダ〔マーチ
ンら、ジャーナルオブバクテリオロジー,115198-20
4（1973）〕に対しては報告があるがストレプトミセス
属では報告されていない。

米国特許第4,206,205号はC-076の単糖およびアグリコン
誘導体について記載している；即ち、マクロライド環の
C-13位に結合している４−（アルファ−Ｌ−オレアンド
ロシル）−アルファ−Ｌ−オレアンドロース二糖官能基
の一つまたは二つの炭化水素部分が酸存在下（良好なの
は硫酸）水性非求核性有機溶媒中の加水分解により除去
されている。

ほとんどアベルメクチンアグリコンA1aおよびA2aのみ
を生成する突然変異体、S．アベルミチリスAgly-1、が
シュルマンらにより報告されている〔ジャーナルオブ
アンチビオティクス38（11）,1494-1498（1985）〕。
シネフンジン存在下でのS．アベルミチリスAgly-1の醗
酵ではアベルメクチンアグリコンＢ組成物の生成が増
大した事も報告されている。アベルメクチンの高産生株
S．アベルミチリス08同様にO-メチルトランスフェラー
ゼの阻害剤としてのシネフンジン存在下では、C-5およ
びオレアンドロース二糖部分のＯ−メチル基を欠くアベ
ルメクチンを生成する。

米国特許第4,378,353号はC-076関連化合物およびS．ア
ベルミチリスATCC 31272の紫外線照射により得られる突
然変異株MA-5218の培養によるそれらの製造について記
載している。突然変異体はATCC 31780号と同定された。
前記突然変異体により生成されるC-076関連化合物はC-0
76化合物とは大きな構造相違がある。全ての生成物でC-
076フラン環が欠除している。さらに、報告されている
ある種の化合物においては一つまたは両方のオレアンド
ロース糖部分が切断されており、一方他の化合物におい
ては５位がケトン基に酸化されている。

ラビーら（“放射菌の生物学”についての第６回国際シ
ンポジウム、デブレセン、ハンガリー、1985年８月26日
−30日）およびシュルマンら〔アンティマイクロバイア
ルエージェンツアンドケモセラピー31,744-7（19
87）〕により、Ｏ−メチル基が欠除したアベルメクチン
を生成する３つの種類のS．アベルミチリスのＯ−メチ
ルトランスフェラーゼ変異体が報告されている。第一の
種類は大環状ラクトン環のC-5水酸基をメチル化する能
力がないので根本的にＢアベルメクチンを生成する。第
二の種類はデメチルアベルメクチンと称される３′−
０、３″−０−ビス−デメチルアベルメクチン（両方の
オレアンドロース単糖残基の３位に０−メチル置換基を
欠くアベルメクチン）を生成する。第三の種類のものは
どの位置もメチル化する事ができない。

シュルマンらは〔フェデレーションプロシーディング
44,931（1985）〕酵素アベルメクチンＢ−Ｏ−メチル
トランスフェラーゼによるアグリコン部分のC-5水酸基
のメチル化を阻害するシネフンジン、S-アデノシルエチ
オニンおよびS-アデノシルホモシスティンのごとき物質
存在下でのS．アベルミチリス醗酵によるＢアベルメク
チンの生成の増加について記載している。O-メチルトラ
ンスフェラーゼ活性がないため、アベルメクチンＢ組成
物を多く生成するストレプトミセスアベルミチリス変異
体についてもシュルマンら〔アンチマイクロバイアル
エージェンツアンドケモセラピイ 29,620-624（19
86）〕により記載および参照されている。

分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠くS．アベ
ルミチリス変異株の突然変異形成により突然変異株が産
生され、それは適当な培地で培養するとアベルメクチン
アグリコンを産生する事が明らかになってきた。この
変異体はRCOOH〔式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）‐s
ec-ブチル〕または醗酵過程中にRCOOHに転換できる化合
物の添加がない場合は天然アベルメクチンアグリコン
を生成する能力を持っていない。しかしながら、期待さ
れなかったことではあるが驚くべき事に、RCOOH化合物
〔式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチルまた
は本明細書に記載した他の基）または前記RCOOHの前駆
体を添加して醗酵せしめると天然および非天然のアベル
メクチンアグリコンが生成される事が観察された。さ
らに驚くべきことには、ここに記載した突然変異体は
（Ｌ−イソロイシンまたはＬ−バリンを分解する事がで
きない）広範囲の化合物をアベルメクチン生合成経路へ
同化せしめる事が可能で、天然アベルメクチンアグリ
コンを全く含まない非天然アベルメクチンアグリコン
を生成する。

発明が解決しようとする問題点ある種の天然アベルメクチンアグリコン（A1aおよびA
2a）は前記のごとくS．アベルミチリスAg1y-1により生
成される。しかしながら残りの天然アベルメクチンのア
グリコンと一緒で、それらは通常対応するアベルメクチ
ンの酸加水分解により製造される。この過程は醗酵ブロ
スからの天然アベルメクチンの単離を必要とする。天然
アベルメクチンは実質的に純粋な形で単離されているが
（米国特許第4,429,042号参照）、その方法論はかなり
困難である。それゆえ、この方法によるアベルメクチン
アグリコンの全製造は更に加水分解工程が加わる為よ
り困難である。生成物の数および複雑さを最小にするよ
うに天然または非天然アベルメクチンアグリコンのど
ちらかを生成するように選択する能力が目的のゴールで
あり、そうする事により、選択されたアベルメクチン
アグリコンの純度が増し、それにより分離工程が簡素化
される。

問題を解決する為の手段分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠き、適当な
栄養培地で醗酵せしめた場合アグリコンを生成できる
S．アベルミチリス株は分枝２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性を欠くS．アベルミチリス株の突然変異により
得られる。ここに記載した本発明の突然変異体はイソプ
ロピルまたはsec-ブチル（Ｓ−型）基を持った脂肪酸ま
たはそれへの前駆体を突然変異体を醗酵せしめる培地中
へ添加した場合を除いて天然アベルメクチンアグリコ
ンを合成する事ができない。これらは適当なプライマー
酸または醗酵過程においてそれらに転換できる化合物を
含有する栄養培地中、水性好気性条件下醗酵せしめた場
合、天然および非天然アベルメクチンアグリコンを生
成する事ができる。必要な分枝２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ欠損株〔例えばS．アベルミチリスＩ−３（ATCC
53567）〕はS．アベルミチリスのアベルメクチン産生株
の突然変異、特にS．アベルミチリス ATCC 31267,ATCC
31271,ATCC 31272またはMCIB12121の突然変異により製
造される。

分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の欠除を特徴と
する突然変異体は突然変異せしめたコロニーの中から¹⁴
CO₂検定に基づいて選択される。この過程においては、
〔¹⁴C‐１〕−２−オキソカプロン酸、〔^14C‐１〕−２
−オキソ−３−メチル吉草酸または〔¹⁴C‐１〕−２−
オキソ−３−メチル酪酸などの基質から透過コロニーに
よる¹⁴CO₂発生がない事が分枝２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性が欠除している事を示している。このように
して製造された突然変異体を第二の突然変異操作にかけ
る。適当なプライマー酸の存在下適当な培地で培養し、
薄層クロマトグラフィー（TLC）および／または高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）により醗酵生成物中のア
グリコンを検査する。もしくは、逆の順序でも二重に阻
害された突然変異体を製造できる事をこの分野に精通す
る者は認識するであろう；即ち、分枝２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼ阻害を第一工程ではなく第二工程で導入で
きる。

予期されなかった事であるが驚くべき事に、分枝２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠除した本明細書の変異
体はアベルメクチンアグリコン、特に非天然アベルメ
クチンアグリコンを生成する能力があった。通常の培
地で生育せしめた場合、天然脂肪酸アシル補酵素Ａ誘導
体を生成する事ができない本発明の変異体の無能力さは
もし膜の完全さが前記誘導体に依存したり、変異体によ
るオキソ酸の蓄積が細胞毒性であったならば致命的突然
変異であったであろう。さらに、Ｌ−イソロイシンおよ
びＬ−バリン分解代謝によるアセチル−CoAおよびプロ
ピオニル−CoAの合成は本変異体が失った酵素活性を必
要とするので本変異体では合成できないと予期されてい
た。先に指摘したごとくアベルメクチン生合成のための
これらのアシル−CoA誘導体の必要性は本変異体の非天
然アベルメクチンアグリコン生成が重度に害されるで
あろうと予想させるが驚くことにそうではなかった。

本明細書に記載した変異体は２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性が欠除しているのでＬ−イソロイシンおよびＬ
−バリンの分解による分枝脂肪酸アシル−CoA合成およ
びそれによる天然アベルメクチンの合成が阻害される事
になる。同様にして、S．アベルメクチンの分枝アミノ
酸トランスアミナーゼ陰性突然変異体はおそらく天然ア
ベルメクチンを生成する能力が妨げられているであろう
と予期される。そのようなトランスアミナーゼ陰性変異
体は通常のアミノ基転移反応経路ではイソロイシンおよ
びバリンから分枝２−オキソ酸を合成できないであろ
う。活性分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ酵素の基質
であるこれらの２−オキソ酸が減少すると、分枝脂肪酸
アシルCoA合成を有効に阻害できる。本発明はまたその
ようなトランスアミナーゼ陰性変異体単独の使用および
分枝トランスアミナーゼ陰性および２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ陰性の突然変異が組み合わさった変異体の使
用も包含する。

本明細書に記載した種からの拡酸または相当物を使用
し、形質転換、形質導入、遺伝子組換えまたはいくつか
の他の遺伝子操作により発展させられ、それによりここ
に記載した変異体の特徴を得た任意の微生物も、その外
観または生理学的挙動にかかわらず本発明に包含される
ものである。

本明細書で使用される術語“アベルメクチン”または
“アベルメクチン類”とは下に示す式（Ｉ）を持つ化合
物を称するが、式中25位の置換基（Ｒ）は本発明のS．
アベルミチリスにより前記の位置で任意の基に同化され
ることもある。アベルメクチンアグリコンは式（II）
の化合物を称し、式中C-13の二糖エーテル部分、４−
（アルファ−Ｌ−オレアンドロシル）−アルファ−Ｌ−
オレアンドロシルオキシ基がOHで置換されている。

本明細書に記載された突然変異体はここに記載および例
示された方法による非天然アベルメクチンアグリコン
の生成に非常に有用である。これらは好ましいアベルメ
クチンアグリコン、即ち、式（II）の化合物（式中C-
25置換基は随意にC₁−C₄アルキルで置換されたC₄−C₆シ
クロアルキルまたはシクロアルケニル;1−メチルチオエ
チルまたは５−または６員環の酸素または硫黄複素環
基、特に３−チエニルまたは３−フリルである）の生成
に非常に有効である。ストレプトミセスアベルミチリス種のアベルメクチン
産生株の突然変異は紫外線照射、Ｘ−線照射、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン、エチルメタ
ンスルホナート、亜硫酸およびナイトロジェンマスター
ド、例えばＮ−メチルビス（２−クロロエチル）アミ
ン、または類似の処理からなる種々の突然変異誘発剤の
任意のものを用いる既知の過程に従って実施する。突然
変異は、例えばS．アベルミチリス ATCC 31272のごと
き天然アベルメクチンを生成できるS．アベルミチリス
の胞子または栄養生殖培養上に実施する。

この分野に精通する者にはよく知られた方法に従い、〔
¹⁴C‐１〕−２−オキソ酸から¹⁴CO₂を産生している多数
の無作意に突然変異した殺菌コロニーをスクリーニング
する事が可能な生化学検定法に基づき突然変異したコロ
ニーを選択する（タボールら、ジャーナルオブバク
テリオロジー128 485-486,1976）。

方法論は、適当な栄養培地上ミクロタイタープレートの
くぼみの中で変異株のコロニーを増殖せしめ、トルエン
で細胞を透過性となし、続いて各々のくぼみに〔¹⁴C‐
１〕−２−オキソ酸（例えば３−オキソイソカプロン
酸）を添加し、醗酵液の上部の大気の¹⁴CO₂を検査す
る。もしくは、〔¹⁴C‐１〕−２−オキソ−イソカプロ
ン酸の代わりに〔¹⁴C‐１〕−２−オキソ−３−メチル
吉草酸または¹⁴C‐１〕−２−オキソ−３−メチル酪酸
も使用できる。放出されたすべての¹⁴CO₂を捕捉するた
め個々のくぼみの上にBa(OH)₂飽和液で湿らせた濾液を
置き、もしあればBa¹⁴CO₃をオートラジオフラフィーに
て検出する事により¹⁴CO₂の生成は便利に試験される。
分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く変異体は
ブランク対照物のオートラジオグラムに近いそれを与え
る；即ちBa¹⁴CO₃は変異体により生成されない。

このようにして得た突然変異体は、前に記載した突然変
異誘発剤を用いて更なる突然変異生成を行う。突然変異
したコロニーは適当な培地で培養した時アベルメクチン
アグリコンを生成する能力があるものを選択する。

本発明の突然変異体の形態的および培養特性は一般的に
米国特許第4,429,042号に記載されているごとくである
が、ある種の例外もある。本発明の突然変異体の顕著な
特徴はそれらが分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
がない事、およびここに記載したごとく通した培地中で
培養した場合のアベルメクチンアグリコン生成能力で
ある。これらの特徴によると脂肪酸RCOOH（式中Ｒはイ
ソプロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチルである）または醗
酵中に前記RCOOHへ転換できる化合物が実質的に存在し
ない規定された培地で増殖せしめた場合本変異体は天然
アベルメクチンアグリコンを生成しないという事であ
る。アメリカンタイプカルチャーコレクションに
より実施された分類学的調査はそれ自身突然変異体であ
る（前記¹⁴CO₂検定により選択された）親株S．アベルミ
チリスＩ−３の特徴は米国特許第4,429,042号に記載さ
れている祖父母ATCC 31372の特徴と密接な関係を持つ事
が確認されている。しかしながら、突然変異株Ｉ−３
（ATCC 53567）は、ATCC 31272より形成する胞子鎖が著
しく少ない；一方、米国特許第4,429,042号においてメ
ルクにより記載されているATCC 31272の記述とは反対
に、単一炭素源としてショ糖のみで本変異体またはATCC
31272が増殖する事が検出できた。

突然変異体Ｉ−３は分枝２−オキソ酸デカルボキシラー
ゼ活性が欠損しているのみである。Ｉ−３の更なる突然
変異およびそのアベルメクチンアグリコン生成能によ
り選択された二重阻害突然変異体S-2805は突然変異株Ｉ
−３同様にATCC31272に対し分類上の関連を持ってい
る。ストレプトミセスアベルミチリスＩ−３およびS-2805
は永久に供託ができる認可された供託所アメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーラ
ンド）にブタペスト条約のもと供託されており、もし本
申請書の特許が承認されるとだれでも容易に入手可能で
ある。各々ストレプトミセスアベルミチリス ATCC 5
3567およびATCC 53677号の名称が与えられている。本申
請が未決の間は米国特許および商標庁長官により37 CP
R1.14および35 USC 122の名称で決定されれば、および
本申請の副本またはその写しが提出されている国におい
ては外国特許法に従って供託物は入手可能である。特許
が承認されればすべての制限が最終的に取り除かれ、供
託された微生物は一般にも入手可能となるであろう。S ．アベルミチリス ATCC 31267、ATCC 31271、ATCC 31
272およびNCIB 12121の各々は天然アベルメクチン、式
（Ｉ）の化合物、（式中、22−23位の被線は随意の二重結合を表わし； R¹は二重結合がない場合のみに存在する水酸基であり； R²は式の４′−（アルファ−Ｌ−オレアンドロシル）−アルフ
ァ−Ｌ−オレアンドロシルオキシであり； R³は水素またはメチルであり；およびＲはイソプロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチルである。）を生成する。米国特許4,285,963は式中25−位がメチル
およびエチル基により置換され、R¹が水酸基であり、R³
がメチルであるアベルメクチンについて記載している。

ここで非天然アベルメクチンと称するものはＲがイソプ
ロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチル以外の基であり、以下
に定義するごとくである。

本発明の突然変異体は式（II）のアベルメクチンアグ
リコンを生成する；即ち式（Ｉ）の化合物であるが式中
R²は水酸基である。本発明の突然変異体により生成され
るアベルメクチンアグリコン中のＲの価値は天然アベ
ルメクチンに存在する基（イソプロピルまたは（Ｓ）‐
sec-ブチル）に相当し、イソプロピルまたは（Ｓ）‐se
c-ブチル以外であり、ここに記載されている変異体によ
り25の位置で同化可能である。

天然アベルメクチンおよびそのアグリコン〔式（Ｉ）お
よび（II）〕の生合成に必須な化合物Ｌ−バリンおよび
Ｌ−イソロイシンはS．アベルミチリスの細胞に存在す
る。これらの化合物は２−オキソ酸への変換および分枝
２−オキソ酸デヒドロゲナーゼによる脱炭酸、付随する
生成物の補酵素Ａとの結合によりアベルメクチンの生合
成経路へ入ると信じられている。その存在は式（Ｉ）お
よび（II）のイソプロピルおよび（Ｓ）‐sec-ブチル化
合物両方の同時生成を説明する。もちろんこの事は
（Ｓ）‐sec-ブチル誘導体からのイソプロピル型の分離
の問題を生じせしめる。

適当なプライマー化合物を含む栄養培地で醗酵せしめた
場合、本発明の突然変異体は式（II）の化合物、より普
遍的な場合としては式（II）の化合物の２つまたはそれ
以上の混合物を生成する（式中Ｒは使用したプライマー
化合物に対応する）。便宜上、平凡にＲ−アベルメクチ
ンA1アグリコン、A2アグリコン、B1アグリコンおよびB2
アグリコンと称する４つまでの生成物が生成される。も
ちろん“R-"基はC-25置換基を意味する。例えばＲがシ
クロペンチルの場合４つの可能なアベルメクチンアグリ
コンは以下のごとくである：非天然アベルメクチンアグリコンにおいてC-25置換基
“R"はイソプロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチル以外の基
である。

二重結合が存在しOHが存在しない式（II）の化合物はR¹
がOHであり二重結合が存在しない式（II）の対応する化
合物から脱水反応によっても合成されるであろう。第一
に５および13位の水酸基を選択的に例えばｔ−ブチルジ
メチルシリルオキシアセチル誘導体として保護し、次に
（４−メチルフェノキシ）チオカルボニルクロリドの
ごとき置換チオカルボニルハライドと反応せしめ、続
いて例えばトリクロロベンゼンのごとき高沸点溶媒中で
加熱する事により反応を実行し、米国特許第4,328,335
号に記載されている過程に従った脱水反応を達成する。
生成物は最後に保護基を脱離せしめて不飽和化合物を得
る。

式中R³がＨである式（II）の化合物はまたR³がCH₃であ
る対応する化合物から脱メチル化反応により合成される
であろう。この反応は５−メトキシ化合物またはその適
切に保護された誘導体を酢酸水銀で処理し、生じる３−
アセトキシエノールエーテルを希酸で加水分解して５
−ケト化合物を得る事により達成される。このものは次
に例えば水素化ホウ素ナトリウムなどを用いて還元し、
５−ヒドロキシ誘導体を得る。これらの工程についての
適切な試薬および反応条件については米国特許第4,423,
209号に記載してある。

R¹がＨであり二重結合が存在しない式（II）の化合物は
二重結合が存在するがR¹が存在しない対応する化合物か
ら、適切な触媒を用いる選択的接触水素添加反応により
合成できる。例えばヨーロッパ特許出願No.0001689に記
載してあるごとくトリス（トリスフェニルホスフィン）
ロジウム（Ｉ）クロリドを用いてこの還元は達成され
る。

式（II）のアグリコンはまた対応する式（Ｉ）の化合物
（R²は４′−（アルファ−Ｌ−オレアンドロシル）−ア
ルファ−Ｌ−オレアンドロシルオキシである）から水性
有機溶媒中酸による温和な加水分解により４′−（アル
ファ−Ｌ−オレアンドロシル）−アルファ−Ｌ−オレア
ンドロース基を除去する事により13位に水酸基を持つア
グリコンが得られるので合成できる。

本発明のS．アベルミチリスが天然および非天然のアベ
ルメクチンの生合成に利用できる化合物は式（III−
Ａ）Ｒ−COOH （III−Ａ）の化合物であり、醗酵過程の間に（III−Ａ）へ転換で
きる化合物も含まれる。前記化合物は本明細書において
は“プライマー化合物”と称される。

式（III−Ａ）においてＲはアルファー分枝鎖状基であ
り、−COOH基が結合しているその炭素原子はまた少くと
も２つの水素以外の原子または基と結合している。もち
ろんこの定義は飽和および不飽和非環式および環状の基
を包含し、任意に硫黄または酸素の異種分子を非環式直
鎖または環の一員として持つ基も含まれる。

特にC-25置換基となるＲは、アルファ分枝C₃−C₈アルキ
ル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキルまた
はアルキルチオアルキル基；アルキル基がアルファー分
枝C₂−C₅アルキル基であるC₅−C₈シクロアルキルアルキ
ル基；メチレンまたは一つあるいはそれ以上のC₁−C₄ア
ルキル基またはハロゲン原子（フッ素、塩素、ヨードま
たは臭素）で任意に置換されているC₃−C₈シクロアルキ
ルまたはC₅−C₈シクロアルケニル基；または酸素または
硫黄を含む３から６員環の複素環でそれは飽和されてい
ても、完全または部分的に不飽和でもよく、任意に一つ
またはそれ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子
で置換されていてもよい。

醗酵過程中にRCOOH（III−Ａ）に転換できる化合物；即
ち前駆体は式（III−Ｂ）：Ｒ−(CH₂)_n−Ｚ（III−Ｂ）〔式中Ｒは前に定義したとおり、ｎは0,2,4または6;お
よびＺは−CH₂OH、−CHO、−CH₂NH₂、−COOR⁵または−C
ONHR⁶（式中R⁵はＨまたは（C_1-6）アルキルであり；R⁶
は水素（C_1-4）アルキルまたはアミノ酸、特にアスパラ
ギン酸、グルタミン酸およびメチオニンの残基、例えば
各々−CH（COOH）CH₂COOH、−CH（COOH）(CH₂)₂COOHお
よび−CH（COOH）(CH₂)₂SCH₃である）である〕の化合物である。

式（III−Ａ）および（III−Ｂ）の化合物の異性体形お
よび醗酵過程の間にそれらに転換可能な化合物も本発明
に包含されており、C-25における異性体のアベルメクチ
ンアグリコンは本明細書に記載した過程においてそれ
らを使用する事により生じる。

本発明の方法は同化可能な窒素、炭素源、無機塩および
式RCOOHの化合物または醗酵過程の間に前記化合物に転
換可能な化合物（即ち前駆体）からなる水性栄養培地
中、グリコシル化アベルメクチン生成能および分枝2-オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いたS．アベルミチリ
ス株を好気的醗酵せしめる事により実施する。酸または
それに転換可能な化合物は接種時または醗酵中一定間隔
で醗酵液に添加する。アベルメクチンアグリコン生成
物の産生は醗酵液から試料を取り、有機溶媒で抽出し、
例えば高速液体クロマトグラフィーを用いるクロマトグ
ラフィーにより生成物の発現を追跡する事によりモニタ
ーする。生成物の収量が最大になるまで、一般的に４か
ら15日の期間インキュベーションを続ける。

プライマー化合物（カルボン酸またはそれに転換される
化合物）の各々の添加の良好な濃度はリットル当り0.05
および3.0グラムの間である。プライマー化合物は醗酵
液へ連続的、断続的または全部一度に添加する事ができ
る。酸（RCOOH）はそのままでまたはナトリウム塩、リ
チウム塩、またはアンモニウム塩のごとき塩として、ま
たは前に定義したごとく酸へ転換可能な化合物として添
加される。もし酸が固体ならば水または（C_1-4）アルコ
ールのごとき適切な溶媒に溶解せしめるのが良好であ
る。

醗酵のために使用する培地は（特にC-25置換基がイソプ
ロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチルであるべき場合）同化
可能な炭素、窒素および微量元素源を含む通常培地であ
る。C-25置換基が非天然の基であるべき場合：即ちイソ
プロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチルでない場合、醗酵培
地は選択された成分が欠除しているかまたはＲ部分がイ
ソプロピルまたは（Ｓ）‐sec-ブチルであるプライマー
化合物を最小量含むものである。

良好には24から33℃の範囲の温度で数日間の期間醗酵せ
しめた後、醗酵ブロスを遠心分離するか濾過し、菌糸の
かたまりを良好にはアセトンまたはメタノールで抽出す
る。抽出溶媒を濃縮し、所望の生成物は次にメチレンク
ロリド、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノールまたは
メチルイソブチルケトンのごとき水と混和しない有機溶
媒中へ抽出する。抽出溶媒を濃縮し、粗生成物は必要な
ら例えば分取用逆相高速液コロマトグラフィーのごとき
クロマトグラフィーにより更に精製する。

生成物は一般的にR¹がOHで二重結合が存在しないものま
たはR¹が存在せず二重結合が存在するものかおよびR³が
ＨまたはCH₃である式（II）の化合物の混合物として得
られる；しかしながらその比率は特定の突然変異体およ
び使用したプライマー化合物および使用した条件に依存
して変化できる。

Ｒ基の源は；即ちそれがR-COOHから直接来ても、または
前記の前駆体の一つから、または任意の前駆体から生成
されても、アベルメクチンアグリコンの生成には重要
でない。その生成のための本発明の方法の決定的必要条
件は、醗酵過程において所望のＲ基が本発明のS．アベ
ルミチリス株に役立つという事である。

適した化合物を以下に示す： 2,3-ジメチル酪酸２−メチルヘキサン酸２−メチルペンタ−４−エノン酸２−シクロプロピルプロピオン酸 4,4-ジフルオロシクロヘキサンカルボン酸リチウム塩４−メチレンシクロヘキサンカルボン酸３−メチルシクロヘキサンカルボン酸（シス／トランス）１−シクロペンテンカルボン酸１−シクロヘキセンカルボン酸テトラヒドロピラン−４−カルボン酸チオフェン−２−カルボン酸３−焦性粘液酸２−クロロチオフェン−４−カルボン酸シクロブタンカルボン酸シクロペンタンカルボン酸シクロヘキサンカルボン酸シクロヘプタンカルボン酸２−メチルシクロプロパンカルボン酸３−シクロヘキセン−１−カルボン酸２−メチルチオプロピオン酸２−メチル−４−メトキシ酪酸チオフェン−３−カルボン酸ヒドロキシメチルシクロペンタン３−チオフェンカルボキサアルデヒド３−シクロヘキシルプロピオン酸３−シクロペンチルプロピオン酸ヒドロキシメチルシクロブタンテトラヒドロチオフェン−３−カルボン酸３−シクロペンチル−１−プロパノール３−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩３−フルオロシクロブタンカルボン酸３−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩２−メチル−４−メチルチオ酪酸テトラヒドロチオピラン−４−カルボン酸シクロブチルメチルアミンシクロブタンカルボン酸エチル４−ヒドロキシメチルシクロペンテン２−（３−チオフェンカルボニル）プロピオン酸エチル
エステルＳ−２−メチルペンタン酸Ｒ−２−メチルペンタン酸、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ変異体はここに記載した
分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性、アグリコン産
生変異体から得る事ができる。分枝２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性の活性な方への突然変異とＯ−メチルト
ランスフェラーゼ突然変異の組合せにより得られるS．
アベルミチリスは、RCOOH化合物または醗酵過程の間にR
COOHに転換できる化合物を与えた場合、基本的にＢアベ
ルメクチンを生成する。前記突然変異体はここに記載し
た分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いた突然
変異体の紫外線および／またはＮ−メチル−Ｎ−ニトロ
ソウレタン、ニトロソグアニジンまたは前に列挙したの
のごとき突然変異誘発化学物質による突然変異生成によ
り得られる。もしくは、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
を欠いた分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陽性の変異
体をUV光線または分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰
性、アグリコン産生変異体を生成する突然変異誘発剤処
理により突然変異を起こす事ができる。

突然変異生成による微生物の与えられた株の所望の対立
遺伝子の生成に加え、原形質体融合はある株で生成／同
定される所望の対立遺伝子の他の株の染色体への導入を
可能にする。例えば分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ
が欠除しているがグリコシル化アベルメクチンを生成す
る能力を持つS．アベルミチリス株は５−Ｏ−メチルト
ランスフェラーゼ欠除S．アベルミチリス株との原形質
融合によりアベルメクチンＢアグリコンのみを合成でき
るS．アベルミチリス株を生じる事ができる。

そのような突然変異体により産生された非天然アベルメ
クチンアグリコンはアグリコン部分のC-5位の水酸基
の存在により特徴付けられる。

前記の突然変異体はシュルマンらにより記載された方法
論に従って同定される〔アンチミクロバイアルエージ
ェントアンドケモセラピィ、29,620-624（198
6）〕。それは既知のアベルメクチンアグリコンと同
じ方法であり、同一の目的には有用である。

もしくは、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を阻害す
るシネフンジン、Ｓ−アデノシルエチオニンまたはＳ−
アデノシルホモシステインのごとき物質の存在下では、
分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ不活性の本発明の突
然変異体の醗酵により生成されるＢアベルメクチンの量
が増加する。

作用本発明の化合物は抗寄生虫剤として非常に活性であり、
駆虫剤、外部寄生虫剤、殺虫剤および抗だに剤としての
特別の有用性を持つ。特に、線虫類として記述される寄
生虫群により最も頻繁に起こされ、家畜および家禽を冒
すのみならず豚、羊、馬および畜牛の重大な経済的損失
を生じせしめる事ができる蠕虫病を含む外部寄生虫によ
り起こされる種々の状態の調節（即ち予防および治療）
に有効である。本化合物は種々の哺乳類（ヒトおよび動
物）を冒す他の線虫類に対してもまた有効であり、例え
ば犬のジロフィラリアおよびアンサイロストーマ属鉤
虫、ネカトール属鉤虫、回虫、糞線虫、施毛虫、毛頭
虫、鞭虫、蟯虫のごとき胃腸寄生虫および血液または他
の組織および器官で発見される糞線虫および施毛虫の子
虫および腸外段階のごとき寄生虫でヒトに感染できる種
々の寄生虫が挙げられる。

本化合物はまた、マダニ、ダニ、シラミ、ノミ、アオバ
エ、食いつく昆虫および畜牛および馬につく移動性双翅
類の幼虫のごとき動物および鳥類の特定の節虫動物外部
寄生虫を含む外部寄生虫感染の処置にも有効である。

本化合物はまた、クモダニ、あぶらむし、いも虫のごと
き農業プラントの貯蔵穀物の害虫およびばったのごとき
移動性直翅目昆虫に有効であるのと同様に、ごきぶり、
いが、ひめまるかつおぶしむしおよび家ばえのごとき家
の中の害虫に対しても殺虫剤として活性がある。

式（II）の化合物は直面している特定の使用法、処置す
る特定の種の宿主動物および含まれる寄生虫または昆虫
に適切な処方で投与される。虫下しとして使用するには
本化合物はカプセル、丸薬、錠剤または液状水薬の形で
経口で投与でき、もしくは、注射または挿入で投与して
もよい。そのような処方は標準の獣医業務に従い通常の
方法で調整される。このようなカプセル、丸薬および錠
剤は活性成分を、崩解剤および／またはデンプン、乳
糖、タルク、ステアリン酸マグネシウムその他のごとき
結合剤をさらに含む、適切にきれいに分割された希釈剤
または担体と混合する事により調整する。水薬処方は活
性成分を分散剤または浸潤剤その他と水溶液に分散せし
める事により調製し、および注射可能処方は溶液を血液
と等張するのに十分量の塩またはグルコースなどの他の
物質を含む無菌溶液の形で調製される。これらの処方は
処置する宿主動物の種、感染の型および重度、および宿
主の体重に依存して活性化合物の重量に関して変化する
であろう。経口投与においては一般的に、動物体重kg当
り約0.02から10mgの用量を一回量として、または１から
５日の期間で分割した量を与えるのが良好であろうが、
しかしもちろん示した用量範囲より多いまたは少い例も
できるであろう、そのような事も本発明の範囲に含まれ
る。

もしくは本化合物は動物の飼料と一緒に投与されてもよ
く、この目的には通常の動物飼料と混合するため濃縮飼
料添加物または前もって混合した物を調製する。

殺虫剤および農業害虫処置の為に使用するにはスプレ
ー、粉末、乳化剤または標準農業業務に従った類似のも
ので本化合物を応用する。

実施例S ．アベルミチリスＩ−３（ATCC 53567）の製造工程１
S．アベルミチリスATCC 31272をニューパッチアガー
培地上30℃にて12日間コンフルエントローンとして増殖
せしめる。培地は以下に示す組成から成る： V-8ジュース^＊ 200ml CaCO₃ ３グラム寒天 15グラム H₂O 1000mlになるまで栄養ブロス 1.0グラム/L 酢酸ナトリウム・３H₂O 1.4グラム/L イソ吉草酸 50mg/L イソ酪酸 50mg/L ２−メチル酪酸 50mg/L イソロイシン 250mg/L ロイシン 250mg/L バリン 250mg/L 微量元素溶液^＊＊ 1mg/L ＊８つの野菜ジュース（トマト、ニンジン、セロリ、ビ
ート、パセリ、レタス、オランダがらし、およびホウレ
ン草）の混合物に塩、アルコルビン酸、クエン酸および
天然芳香剤を加えたもの。キャムベルスープカンパ
ニー（キャムデン,NJ）から入手可能。

＊＊微量元素溶液の組成： FeCl₃・6H₂O 2.7g MnSO₄・H₂O 4.2 CuSO₄・5H₂O 0.5 CaCl₂ 11.0 H₃BO₃ 0.62 CoCl₂・6H₂O 0.24 ZnCl₂ 0.68 Na₂MoO₄ 0.24 上記のものを0.1N HCl1リットルに溶解。

３つのそのようなプレートから胞子を採取し、0.05Mト
リス−マレイン酸緩衝液（pH9.0）20mlに懸濁せしめ
る。

工程２ 10mgのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン（NTG）を含むバイアルに10mlの胞子懸濁
液を添加する。28℃で60分間バイアルをインキュベート
および振とうした後、１％NaCl溶液にて胞子を存分に洗
う。

工程３洗った胞子を１％NaClに懸濁し、等量の80％エ
チレングリコールと混合する。この懸濁液を−20℃で保
存し、突然変異体をスクリーニングのための細胞源とし
て使用する。発芽させた場合約10⁴コロニー/mlであっ
た。

この胞子貯蔵物をYPDプレート上に拡げプレート当り約1
00ケのコロニーとする（YPD培地は各々10g/lの酵母抽出
物、バクトペプトン^＊およびデキストロース；および15
g/lのバクト寒天^＊から成り、オートクレーブにかける
前にpH6.9に調整する）。アステリスクで印を付けた成
分はディフコラボラトリー、デトロイト、ミシガン
48238から入手可能である。

工程４ 28℃にて２〜３週間後プレートから単一のコロ
ニーを取り、標準の96穴ミクロタイタープレートの個々
の穴へ置く。またコロニーの少量を新鮮な寒天培地へ接
種し、突然変異体が同定された場合の生存可能な細胞源
となす。

工程５各々の穴へ１％のグルコース、0.1％カサミノ
酸、および各々0.01％のイソ吉草酸、イソ酪酸および２
−メチル酪酸を含有する液状M9塩培地を約75マイクロリ
ットル添加する。28℃にて数日インキュベートした後細
胞に分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼが存在するかど
うかを検定する（M9塩培地１リットルは、6gのNa₂HP
O₄、3gのKH₂PO₄、0.5gのNaClおよび1gのNH₄Clを含む。
培地をオートクレーブにかけ、1mlづつの無菌1M MgSO₄
および0.1M CaCl₂を無菌的に加える）。

工程６短時間超音波処理する事により、M9塩培地の５
％トルエン微小懸濁液を調製する。25mlのこの懸濁液に
〔¹⁴C‐１〕−２−オキソ−イソカプロン酸（2.5マイク
ロキューリー/mlおよび10.0マイクロキューリー／マイ
クロモル）含有溶液を1.2ml添加する。この全部の混合
物の50マイクロリットルを検定されるべきコロニーを含
むマイクロタイタープレートの各々の穴に添加する。

工程７各々の穴から産生される¹⁴CO₂は、タボールら
により記載されている方法により捕捉および視覚化され
る〔ジャーナルオブバクテリオロジー128 485-486
（1976）、“多数の試料中の¹⁴CO₂を検出する簡便な方
法：突然変異体の迅速スクリーニングへの応用”と題さ
れている〕分枝2-オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く
突然変異体では対照で観測されるBa¹⁴CO₃の量を超える
事はない。

Ba¹⁴CO₃の結果としてのオートラジオグラム上の濃いス
ポットで示される¹⁴CO₃の陽性検定とスポットがないか
または非常に薄いスポットにより示される陰性検定の間
の対照を改良したより洗練された方法は以下の改良スク
リーンを特徴とする。

７〜14日の増殖後（２〜３週間よりもむしろ早く取り、
前記工程６および７で直接検定する）寒天培地から単一
コロニーを取る（前記工程４）。前記過程の工程５は省
略する。¹⁴ CO₂放出に関して事実上定量的であるより洗練された
検定法は１％グルコースおよび0.1％“Syncasa-bcaa"
（市販のカサミノ酸とほとんど同じ組成を持つＬ−アミ
ノ酸の合成混合物であるが、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイ
シンおよびＬ−ロイシンを含まない。下記参照）を含む
M9塩培地からなる適切な培地上で前記スクリーンにより
突然変異体が検出できるまで増殖せしめる事を特徴とす
る。

“Syncasa-bcaa"の組成、100倍濃縮液グラム／リットルＬ−アラニン３Ｌ−アルギニン４Ｌ−アスパラギン酸６Ｌ−シスチン１Ｌ−グルタミン酸 20 グリシン１Ｌ−ヒスチジン２Ｌ−リジン７Ｌ−メチオニン３Ｌ−フェニルアラニン６Ｌ−プロリン 10 Ｌ−セリン６Ｌ−スレオニン４Ｌ−チロシン４Ｌ−トリプトファン１混合物をpH7に調整しろ過殺菌する。１容量の濃縮液を9
9容量の培地に加え標準使用濃度を達成する。

高細胞密度に増殖せしめた後細胞をM9塩培地で洗浄し、
前もって超音波処理してトルエンを乳状白色分散液とし
た１％トルエン含有冷M9塩培地に再懸濁せしめる。細胞
／緩衝液／トルエン懸濁液を30℃にて40分インキュベー
トして細胞を透過性となす。透過性細胞をM9塩培地中で
洗浄し、元の５分の１の容量のM9培地緩衝液に最終的に
再懸濁せしめる。検定に180マイクロリットルの本懸濁
液を使用する。

トルエン化細胞、チアミンピロホスフェート（TPP）、
0.4mM;補酵素Ａ（CoA）,0.11mM;ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NAD）,0.68mM;ジチオスレイト
ール（DTT）,2.6mM;MgCl₂,4.1mM;トリス‐HCl,60mM,pH
7.5;および〔¹⁴C‐１〕−アルファ−ケトイソカプロン
酸塩（6.000cpm,マイクロモル当り１マイクロキューリ
ー）が300マイクロリットルの反応液に含有されてい
る。計数の効率は73％であった。２×2cmワットマン♯
４濾紙がバイアルのスクリューキャップ内へがっちりと
押し込まれている15mlのシンチレーションバイアル中で
反応を実施する。濾紙は30マイクロリットルの1M水酸化
ハイアミン（水酸化メチルベンゼトニウムの1Mメタノー
ル溶液；シグマケミカルCo,セントルイス、MO63178か
ら入手可能）を含み、それが反応で発生する¹⁴CO₂を捕
捉する。２時間インキュベートした後、濾紙を10mlのベ
ックマンアクアゾールII（普遍的なLSC（液体シンチレ
ーションカウンター）でニューイングランドヌクレア
リサーチプロダクトボストン MA02118から入手
可能〕に浸し、４時間またはそれ以上たって平衡にした
後液体シンチレーションカウンターの放射活性を測定す
る。空対照反応（即ち細胞なし）では50−300cpmであっ
た。

突然変異体Ｉ−３およびそれと類似のものは空対照反応
と等しいかまたはそれ以下の計数値を与えたが、一方親
株は、空対照値より数倍多い計数値であった。S ．アベルミチリスS-2805（ATCC 53677）の単離工程１新鮮SAMM寒天プレート上で４日間増殖せしめた
約100mgのS．アベルミチリスI-3（ATCC 53567）を50ml
のSCM培地（pH7.2）を含む300mlのフラスコ内へ接種す
る。フラスコは30℃にて200RPMで24時間振とうする（最
終pH＝8.2）。

工程２振そう器よりフラスコを除き、全ブロスの10ml
を無菌チューブにとり2000RPMで遠心分離する。細胞は3
00mlの無菌三角フラスコ中の50mlのSCM培地に再懸濁
し、フラスコは回転式振とう器上30℃にて２時間振とう
する。

工程３ 10mlの懸濁液を無菌チューブに移す。

工程４換気の良いフード内でエチルメタンスルホナー
トをチューブに添加し、中味を十分に混合せしめた後30
0mlの無菌フラスコに注ぎ、フラスコは回転式振とう器
にて30℃で３時間振とうする。

工程５新鮮な無菌SCM培地（40ml）をフラスコに添加
し、総計70時間になるまで30℃にて振とうを続ける。

工程６フラスコを取り、内容物は20℃にて10分間8000
RPMにて遠心分離する。細胞はSCM培地に再懸濁する事に
より洗浄し、再び遠心分離し、10mlのSCM培地に再懸濁
する。

SCM培地酵母自己溶菌物 10g/l 牛肉抽出物 5g/l カゼイン酵素的加水分解物 10g/l 1M MgSO₄ 3g/l 1M K₂HPO₄;pH7.0（HCl） 100g/l 工程７突然変異生成集団を希釈し、単一コロニーを取
るためSAMM寒天上に拡げる。

SAMM寒天 g/l Na₂HPO₄ 6.0 KH₂PO₄ 3.0 NaCl 0.5 NH₄Cl 1.0 1M MgSO₄ 1.0 0.1M CaCl₂ 1.0 デキストロース 8.0 カサミノ酸 20.0 寒天 20.0 工程８ストレプトミセスアベルミチリス株Ｉ−３
（ATCC 53567）の突然変異生成集団（３％エチルメタン
スルホナート）のコロニーを取り、以下のごとくして
調製した寒天培地上にパッチ状に拡げる（リットル当り
のグラム数）：細かくしたでんぷん,80;K₂HPO₄,1;MgSO₄
・7H₂O,1;アルダミンpH,5;CaCO₃,5;P-2000,1ml;FeSO₄・
7H₂O,0.01;MnCl₂・4H₂O,0.001;ZnSO₄・7H₂O,0.001;バク
ト寒天17;蒸留水で980mlとする。121℃で20分間オート
クレーブする直前にNaOHにてpHを7.0に調整する。オー
トクレーブ後、20mlの無菌５％（±）−２−メチル酪酸
貯蔵溶液（pH7.0）を加える。

寒天培養物を28℃にて８から12日間インキュベートす
る。細胞（菌糸体）を寒天表面から取り、250マイクロ
リットルのアセトン中に入れる。25マイクロリットルの
アセトン抽出物を、アナルテクシリカゲルGFでコート
してある薄層クロマトグラフィープレート上にスポット
する。酢酸エチルを展開溶媒として30から40分クロマト
グラムを行い、乾燥し、３％バニリンのエタノール溶液
を噴霧する。プレートを100℃のオーブン内へ１から３
分入れ、３％硫酸のエタノール溶液を噴霧し、再び100
℃のオーブンに10から15分入れる。アグリコン生成培養
物は新規スポット（Rf約0.63）の発現で同定される。こ
の動きはA2aの酸加水分解（１％H₂SO₄メタノール溶液、
25℃、18時間）で合成されるA2アグリコンと一致する。

実施例1-5S ．アベルミチリスS-2805（ATCC 53677）培養物の凍結
バイアルを、500mlの三重にじゃま板を付けたフラスコ
中、100mlのAS-7培地内へ接種する。フラスコは回転式
振とう器上28−30℃にて200rpmでかきまぜながらインキ
ュベートする。24時間のインキュベーション後、全ブロ
スの1mlを40mlのAP-5培地を含む300mlのフラスコ内へ接
種する。

各々440ppmの下に褐げたプライマー化合物の存在下、28
−30℃にて二重の40ml醗酵を行う。醗酵培地へのプライ
マー化合物（RCOOH）添加の時間は右側の欄に示してあ
る。プライマー化合物添加の時間シクロヘキサンカルボン酸 24時間シクロペンタンカルボン酸 96時間３−チオフェンカルボン酸 96時間２−メチルチオプロピオン酸 24時間２−メチル酪酸 96時間 264時間後、全ブロス試料を水（10ml）で希釈し、メチ
レンクロリド（２×20ml）で抽出する。有機抽出液は
乾燥後（MgSO₄）蒸発乾固せしめる。得られる残留物は
メタノール（1ml）に溶解し、溶液の30μｌをベックマ
ンウルトラスフェアODSカラム（3.9 250mm）に注入す
る。メタノールおよび0.1M酢酸アンモニウム（85:15）
の混合液を用い一分間1mlの流速でカラムを溶出する。
カラム溶出液は直接VG12−250サーモスプレーマス分光
計へ流入している。

AS-7 培地 g/l 細かくしたでんぷん^a 20 アルダミン pH^b ５ファルマメジア^C 15 CaCO₃ ２ａバチルスリチェニホルミスからのアルファーアミ
ラーゼ（ノボエンザイム，ウィルトン,CTから入手可能
で“テルマミル”の登録商標で販売されている）により
デキストロース当量40％＋５％まででんぷんを加水分解
する事により調整される。

ｂイーストプロダクト Inc.,クリフトン,NJ 0701
2よりｃトレダーズプロテイン，メンフィス,TN 38108よ
り 25％NaOHでpHを7.2に調整。

AP-5 培地 g/l 細かくしたでんぷん^a 80 アルダミン pH^b ５ K₂HPO₄ １ MgSO₄・7H₂O １ NaCl １ CaCO₃ ７ FeSO₄・7H₂O 0.01 MnCl₂・7H₂O 0.001 ZnSO₄・7H₂O 0.001 P-2000（アンチ型） 1ml/l 25％NaOHにてpHを6.9に調整。

実施例６ 25−シクロペンチルアベルメクチンA2アグリコンスト
レプトミセスアベルミチリス突然変異体微生物ATCC 5
3677の培養液の凍結接種物（2ml）を300mlのフラスコ
中、でんぷん（1g）、ファーマメディア（登録商標）
（0.75g）、アルダミンpH（0.25g）および炭酸カルシウ
ム（0.1g）を含む培地内へ接種し28℃にて２日間インキ
ュベートする。この接種物（50ml）をでんぷん（12
g）、ファーマメディア（8g）、アルダミンpH（3g）お
よび炭酸カルシウム（1.2g）を含む第２の接種フラスコ
に移し、28℃にて更に２日間インキュベートする。この
接種物は15リットルの広口の醗酵びん内のでんぷん（1.
5kg）、硫酸マグネシウム（15g）、ファーマメディア
（75g）、リン酸水素二カリウム（15g）、硫酸第一鉄
（0.12g）、炭酸カルシウム（105g）、グルタミン酸（9
g）、硫酸亜鉛（0.015g）および硫酸マンガン（0.015
g）含有の15リットルの培地に接種する。醗酵物は28℃
にて、350r.p.mでかきまぜながらインキュベートし、そ
の間１分間当り15リットルの通気を行う。シクロペンタ
ンカルボン酸を96時間後（6g）および216時間後（6g）
に再び添加する。240時間後に菌糸体を濾過して採取
し、アセトンで抽出する（5L＋0.75L洗液）。アセトン
抽出液を約1.5Lまで濃縮し、酢酸エチル（3L）で２度抽
出する。得られた酢酸エチル層を合併し、蒸発せしめる
と褐色油状物を得る（1.2g）。

前記油状物をジエチルエーテルに溶解せしめ、シリカゲ
ルのカラム（40g）にかける。カラムはジエチルエーテ
ルで溶出し、15mlづつの文画を集める。分画４−６を合
併し、蒸発せしめると部分的に精製された物質（135m
g）を得る。生成物をメタノール（0.5ml）に溶解し、C1
8ゾルバックスODS（デュポンの登録商標）カラム（21mm
×25cm）上、メタノールおよび水（75:25）の混合物を
用い、１分当り9mlの流速で溶出するクロマトグラフィ
ーを行う。適切な分画を合併し、溶媒を留去すると式
（Ｉ）（式中、R¹はOHであり、二重結合は存在せず、R²
がシクロペンチルであり、R³がCH₃であり、およびR⁴がO
Hである）の化合物を白色粉末（9mg）として、（mp.131
-133℃）得る。

生成物の構造は以下のごとくしてマス分光光度法にて確
認した： VGモデル7070Eマス分光計にて固体塩化ナトリウムとト
リエチレングリコールの試料マトリックスを用い、高速
原子衝撃（FAB）マス分光光度法を実施した。(M+Na)⁺が
m/e651（計算値651）に観察された。

VGモデル7070Fマス分光計を用い電子線衝撃マス分光光
度法を実施した。主なフラグメントのm/e値は以下のご
とくである。:628（M⁺）,610,468,335,317,275,251,23
3,223,179。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者リチャード・ジェラルド・ワックスアメリカ合衆国コネチカット州ウォーターフォード，ビーコン・ヒル，ドライブ 29 (56)参考文献米国特許4310519（ＵＳ，Ａ) 米国特許4429042（ＵＳ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グリコシル化アベルメクチン産性能力が欠
除しおよび分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠
いたストレプトミセスアベルミチリス（Streptomyces
avermitilis）であって：好気的条件下に同化可能な炭素、窒素および無機塩源お
よび式 RCOOH （式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルで
ある）の酸または前記S．アベルミチリス（Streptomyce
s avermitilis）により前記の酸へ転換可能な化合物か
らなる水性栄養培地で醗酵せしめた場合次式の化合物を
産生するもの。（式中、22−23位の点線は任意の二重結合を表わし； R¹はヒドロキシであり、上記二重結合がないときのみ存
在し； R²はヒドロキシであり； R³は水素またはメチルであり；Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである）
【請求項２】透過性細胞が、添加した［¹⁴C−１］−２
−オキソ−イソカプロン酸から¹⁴CO₂を生成する能力が
ないことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のスト
レプトミセスアベルミチリス（Streptomyces avermit
ilis）。
【請求項３】ストレプトミセスアベルミチリス（Stre
ptomyces avermitilis）ATCC 53677である特許請求の
範囲第１項記載のストレプトミセスアベルミチリス。
【請求項４】好気的条件下、同化可能な炭素、窒素およ
び無機塩源からなる水性栄養培地で醗酵せしめた場合、
実質的に次式の化合物（式中、22−23位の点線は任意の二重結合を表わし； R¹はヒドロキシであり、上記二重結合がないときのみ存
在し； R²はヒドロキシであり； R³は水素またはメチルであり；Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである）を産生できない、アベルメクチンアグリコン産生スト
レプトミセスアベルミチリス（Streptomyces avermi
tilis）であって：前記培地は式 RCOOH （式中、Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル
である）の酸またはS．アベルミチリス（Streptomyces
avermitilis）により前記酸へ転換可能な化合物を実質
的に含有しないが、前記培地が式RCOOH（式中Ｒはイソ
プロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである）の酸また
はS．アベルミチリスにより前記酸へ転換可能な化合物
を含む場合前記培地で醗酵せしめると上記式（II）の化
合物が産生可能となるもの。
【請求項５】同化可能な窒素、炭素および無機塩源およ
び式（II′）の化合物の生合成で利用できる化合物から
なる水性栄養培地中、特許請求の範囲第１項記載のスト
レプトミセスアベルミチリス（Streptomyces avermi
tilis）菌株を好気的に醗酵させることからなる式（I
I′）（式中、22−23位の点線は任意の二重結合を表わし； R¹はヒドロキシであり、上記二重結合がないときのみ存
在し； R²はヒドロキシであり； R³は水素またはメチルであり；Ｒはアルファー分枝鎖基である）の化合物の製造方法。
【請求項６】S．アベルミチリス（Streptomyces avermi
tilis）がS．アベルミチリス（Streptomyces avermitil
is）ATCC 53677である特許請求の範囲第５項記載の方
法。
【請求項７】化合物が式 RCOOH （式中、Ｒはアルファー分枝鎖基であり、−COOH基が結
合している炭素原子はまた少くとも２つの水素以外の原
子または基と結合している）の化合物であるか、または醗酵過程の間に前記化合物へ
転換可能な化合物である特許請求の範囲第５項記載の方
法。
【請求項８】化合物が、Ｒとしてアルファー分枝C₃−C₈
アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキ
ルまたはアルキルチオアルキル基；アルキル基がアルフ
ァー分枝C₂−C₅アルキル基であるC₅−C₈シクロアルキル
アルキル基；各々、メチレンまたは１つまたはそれ以上
のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子で任意に置換さ
れているC₃−C₈シクロアルキルまたはC₅−C₈シクロアル
ケニル基；または飽和または完全または部分的に不飽和
で、１つまたはそれ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロ
ゲン原子で任意に置換されている３から６員の酸素また
は硫黄含有複素環を有する、かまたは醗酵過程の間に前
記化合物へ転換可能な化合物である特許請求の範囲第７
項記載の方法。
【請求項９】基質RCOOHへ転換可能な化合物が式Ｒ−（CH₂）ｎ−Ｚ［式中Ｒは前に定義したとおりであり;nは0,2,4または
６であり；およびＺは CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、−CH₂
NH₂または−CONHR⁶（式中R⁵はＨまたは（C_1-6）アルキ
ルであり；R⁶は水素、（C_1-4）アルキル、−CH（COOH）
CH₂COOH、−CH（COOH）(CH₂)₂COOHまたは−CH（COOH）
(CH₂)₂SCH₃である）である］の化合物である特許請求の範囲第７項記載の方法。
【請求項１０】Ｒがシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、２−メチルシクロプロピル、３−シクロヘキセニル、１−シクロペンテニル、１−シクロヘキセニル、３−メチルシクロヘキシル（シス／トランス）、４−メチレンシクロヘキシル、３−メチルシクロブチル、３−メチレンシクロブチル、３−シクロペンテニル、１−シクロプロピルエチル、３−フルオロシクロブチル、 4,4−ジフルオロシクロヘキシル、イソプロピル、 sec−ブチル、２−ペンチル、 2,3−ジメチルプロピル、２−ヘキシル、２−ペント−４−エニル、２−メチルチオエチル、Ｓ−２−ペンチル、Ｒ−２−ペンチル、２−チエニル、３−チエニル、４−テトラヒドロピラニル、３−フリル、２−クロロチエニル、３−テトラヒドロチエニル、４−メチルチオ−２−ブチル、４−テトラヒドロチオピラニル、４−メトキシ−２−ブチルまたは４−メチルチオ−２ブチルである特許請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１１】Ｒが式Ｒ−COOHのカルボン酸から誘導さ
れる特許請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１２】Ｒがシクロペンチル、シクロヘキシルま
たはチエニルである特許請求の範囲第11項記載の方法。
【請求項１３】醗酵中Ｒ−COOHへ転換可能な化合物から
Ｒが誘導され、前記化合物は式Ｒ−（CH₂）ｎ−Ｚ［式中Ｒは前に定義したとおりであり;nは0,2,4または
６であり;Zは−CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、−CH₂NH₂また
は−CONHR⁶（式中R⁵は（C_1-6）アルキルであり；R⁶は水
素、（C_1-4）アルキル、−CH（COOH）CH₂COOH、−CH（C
OOH）(CH₂)₂COOHまたは−CH（COOH）(CH₂)₂SCH₃であ
る）である］の化合物である特許請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１４】Ｒがアルファー分枝C₃−C₈アルキル基で
ある場合、それはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブ
チルではない特許請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１５】S．アベルミチリス（Streptomyces aver
mitilis）菌株がS．アベルミチリス（Streptomyces ave
rmitilis）ATCC 53677である特許請求の範囲第８項記
載の方法。
【請求項１６】アベルメクチンアグリコン産生ストレ
プトミセスアベルミチリス（Streptomyces avermitil
is）の新規菌株であつって；前記菌株はストレプトミセスアベルミチリス（Strept
omyces avermitilis）ATCC 53567を突然変異する事に
より得られ、好気的条件下、同化可能な炭素、窒素およ
び無機塩源からなり、式 RCOOH （式中、Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチル
である）の酸またはストレプトミセス（Streptomyces）
属菌により前記酸へ転換可能な化合物を実質的に含んで
いない水素栄養培地中で醗酵せしめた場合、実質的に下
記式（II）の化合物を産生できないもの。（式中、22−23位の点線は任意の二重結合を表わし； R¹はヒドロキシであり、上記二重結合がないときのみ存
在し； R²はヒドロキシであり； R³は水素またはメチルであり；Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−sec−ブチルである）