JPH0556958B2

JPH0556958B2 -

Info

Publication number: JPH0556958B2
Application number: JP11285689A
Authority: JP
Inventors: Shigetaka Okada; Kenji Yoshikawa; Isao Kanbara
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd
Priority date: 1989-05-02
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1993-08-20
Also published as: JPH02291293A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、発酵法によりエチル−α−グルコシ
ドを製造する方法に関するものである。従来の技術とその課題エチル−α−グルコシドは調理食品の旨味や濃
厚味に関与する呈味成分であり、グルコース様の
さわかな甘味と独特の苦味を有しており、清酒や
みりん中にも微量に含まれている成分である。エチル−α−グルコシドに関する研究は少な
く、また有効な量産法がないことから未だ工業的
に利用されるに至つていない。因みに、各種のβ−グルコシダーゼは同様に、
エチル−α−グルコシドは生成するが、目的のα
体は生成しない。本発明者らは、カビ由来のグルコアミラーゼ又
はα−グルコシダーゼがエチル−α−グルコシド
を生産することを見出したが、これをもつてして
も到底工業的生産は不可能であつた。課題を解決するための手段及び作用本発明者等は、エチル−α−グルコシド高生産
能を有する酵素や微生物の検索を行つたところ、
カカオ豆のポツドから分離されたシゾサツカロミ
セス属に属する微生物を、エタノール及びマルト
ースを含む培地で生育させると、高いエチル−α
−グルコシド生産能を有することを見出し、本発
明を完成した。本発明では、シゾサツカロミセスに属する酵母
をマルトース等の糖質を含むエタノール溶液に添
加し、作用させることにより、エチル−α−グル
コシドを効率よく生成させるのである。以下にそ
の詳細を説明する。本発明において用いられる酵母シゾサツカロミ
セスポンベＧ−２株は新規の酵母であるが、
大むね次のような菌学的性質を有する。一培地上の成育状態 (1) 顕微鏡的所見栄養細胞の大きさ（注１）（4.0〜5.0）×（5.0
〜10.0）μｍ栄養細胞の形状（注１）円筒形ないし楕円形栄養細胞の増殖法（注１）分裂菌糸体（注２）無し（注１）……YM寒天培地に25℃、５日間培
養（注２）……ポテトグルコース寒天によるス
ライド培養 (2) 寒天斜面（YM寒天培地）成育良好光沢無し色調白色 (3) 液体培養（YM液体培地）成育良好。皮膜形成せず濁度透明沈査大二子のう胞子の形成ポテトグルコース寒天培地形成球状ないし
楕円形コーンミール寒天培地形成球状ないし楕円
形 YM寒天培地形成球状ないし楕円形ニンジンエキス寒天培地形成球状ないし楕
円形三生理学的性質酸素要求性好気的成育温度 15〜37℃ 最適成育温度 34℃ 成育PH 2.5〜9.5 最適成育PH 3.5〜8.5 KNO₃資化性（注３）無し（NH₄）₂SO₄資化性（注３）有り尿素の分解有りゼラチンの液化無しスクロースの成育可能最高濃度約60％（注４）スクロースの成育最適濃度約30％カロチノイドの生成無し有機酸の生成有りデンプン様物質の生成無しビタミンの要求性（注３）有り（注３）……Wickerhamの合成培地を用いた
J.Lodderらの方法による判定（注４）……本願において％はすべてＷ／Ｗ％
で示す。四糖の発酵性（注３）DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention relates to a method for producing ethyl-α-glucoside by a fermentation method. Conventional technology and its challenges Ethyl-α-glucoside is a flavoring component that contributes to the umami and rich taste of cooked foods. It has a refreshing sweetness similar to glucose and a unique bitterness, and is also found in sake and mirin. It is a component contained in trace amounts. There is little research on ethyl-α-glucoside, and there is no effective mass production method, so it has not yet been used industrially. Incidentally, various β-glucosidases are similarly
Ethyl-α-glucoside is produced, but the target α-glucoside is
The body does not generate. The present inventors discovered that glucoamylase or α-glucosidase derived from fungi produces ethyl-α-glucoside, but even with this, industrial production was impossible. Means and Effects for Solving the Problems The present inventors conducted a search for enzymes and microorganisms that have a high ability to produce ethyl-α-glucoside, and found that
When microorganisms belonging to the genus Schizosatucharomyces isolated from cacao bean pots are grown in a medium containing ethanol and maltose, ethyl-α
- It was discovered that it has the ability to produce glucosides, and the present invention was completed. In the present invention, ethyl-α-glucoside is efficiently produced by adding yeast belonging to Schizosatucharomyces to an ethanol solution containing carbohydrates such as maltose and allowing it to act. The details will be explained below. The yeast Schizosatucharomyces pombe strain G-2 used in the present invention is a new yeast,
Generally, it has the following mycological properties. (1) Growth status on medium (1) Microscopic findings Size of vegetative cells (Note 1) (4.0-5.0) x (5.0)
~10.0) μm Shape of vegetative cells (Note 1) Cylindrical or oval vegetative cell growth method (Note 1) Fission mycelium (Note 2) None (Note 1)...Culture on YM agar medium at 25℃ for 5 days (Note 2)... Slide culture on potato glucose agar (2) Agar slant (YM agar medium) Growth is good. No gloss. Color tone is white. (3) Liquid culture (YM liquid medium) Growth is good. No film formation, turbidity, clear sedimentation Large 2 Ascospore formation Potato glucose agar medium Formation Spherical or oval Cornmeal agar medium Formation Spherical or oval YM agar medium Formation Spherical or oval Carrot extract agar medium Formation Spherical or oval 3 Physiological properties Oxygen requirement Aerobic growth temperature 15-37℃ Optimum growth temperature 34℃ Growth PH 2.5-9.5 Optimum growth PH 3.5-8.5 KNO ₃ assimilation (Note 3) None (NH ₄ ) ₂ SO ₄ (Note 3) Yes Decomposition of urea Yes Liquefaction of gelatin None Maximum concentration of sucrose for growth Approx. 60% (Note 4) Optimum concentration of sucrose for growth Approx. 30% Production of carotenoids None Production of organic acids Yes Production of starch-like substances None Vitamin requirement (Note 3) Yes (Note 3)...Using Wickerham's synthetic medium
Determination by the method of J. Lodder et al. (Note 4)...In this application, all percentages are W/W%.
Indicated by Fermentability of tetrasaccharides (Note 3)

【表】五糖の資化性（注３）【table】 Pentasaccharide assimilation (Note 3)

【表】以上の結果をThe yeasts（N.J.W Kregervan
Rij：1984年）と照合して、本菌株はシゾサツカ
ロミセスポンベ（Schizosaccharomyces
pombe）と同定した。本発明におけるシゾサツカロミセスに属する酵
母の培養方法は特に指定しないが、通常液体培地
を用いて振とう培養による方法が望ましい。本発明では、便法として、まずエタノールを含
まない培地で酵母を培養（以下、前培養という）
し、ついでそれに糖質とエタノールを添加しその
まま引続いて培養（以下、本培養という）し、エ
チル−α−グルコシドを生成させる。かかる培養の場合、主炭酸源としては、グルコ
ース、マルトース、マルトトライオース、水飴、
デキストリン、各種起源のデンプン等が、殊に本
培養においてはこれらのうち、マルトース、マル
トトライオース又はこれらを主とする水飴が好適
に使用される。その使用量は、前培養では約１〜
２％、本培養での添加量は約10〜40％、就中20〜
30％の範囲が好ましい。本培養において添加されるエタノールは、培地
中のエタノール濃度が約５〜20％、好ましくは７
〜10％となるように配慮される。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、麦芽
エキス、コーンステイープリカーなどが使用され
るが、酵母エキス、ペプトンが特に好適である。培地に加えるべき無機塩類としては、例えばリ
ン酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄
などの塩類が使用される。さらに、必要に応じて酵母の生育に必要な各種
の有機物、無機物などを培地に添加してもよい。培養温度は酵母が生育しうる範囲、即ち約15〜
37℃、就中25〜35℃が好ましい。なお、培地のPHとしては、約3.5〜8.0であり、
殊に4.5〜5.5が好適である。培養期間は、前培養が２〜３日間、本培養が大
よそ１〜３日間である。本発明における培養は、培地の栄養源が最大限
に利用され、かつ培養液中のエチル−α−グルコ
シドの生成量が最高に達した時点で培養を終了さ
せることが好ましい。尚、培養液中のエチル−α−グルコシド生成量
はガスクロマトグラフイー、高速液体クロマトグ
ラフイーなどの方法を用いて速やかに測定するこ
とができる。かくして、培養液中に蓄積されたエ
チル−α−グルコシドは次いで培養液中から分離
される。かかる場合に通常使用されている手段と
して、例えばろ過、遠心分離、イオン交換クロマ
トグラフイー、吸着クロマトグラフイー、活性炭
処理又はカラムクロマトグラフイーなどの操作が
必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。一例
を挙げれば、培養液からろ過、遠心分離などによ
つて菌体を除去し、次いでこの液を活性炭で処理
して、着色物質などを除き、更にイオン交換樹脂
により脱イオンとした後、液を濃縮してシロツプ
とする。このエチル−α−グルコシド高含有シロ
ツプは、このまま食品に添加して、食品の風味や
味質の改良に利用可能である。このシロツプから
更に、活性炭カラムクロマトグラフイーと分取高
速液体クロマトグラフイーとを組み合わせること
によつて、エチル−α−グルコシドを精製分離
し、濃縮乾燥して、エチル−α−グルコシドの粉
末を得る。なおエチル−α−グルコシド生産能を有する酵
母は、下表に示す試験結果からも明らかなよう
に、シゾサツカロミセスポンベＧ−２株のほ
かシゾサツカロミセスポンベIFO 0340株とか、
同じくIFO 0358株が数えられる。[Table] The above results are summarized in The yeasts (NJW Kregervan).
Rij: 1984), this strain was confirmed to be Schizosaccharomyces pombe.
pombe). The method for culturing the yeast belonging to Schizosatucharomyces in the present invention is not particularly specified, but a method using shaking culture using a liquid medium is usually preferable. In the present invention, as a convenient method, yeast is first cultured in a medium that does not contain ethanol (hereinafter referred to as preculture).
Then, carbohydrates and ethanol are added thereto, followed by culturing (hereinafter referred to as main culture) to produce ethyl-α-glucoside. In the case of such culture, the main carbonate sources include glucose, maltose, maltotriose, starch syrup,
Dextrins, starches of various origins, and the like are preferably used, especially in the main culture, maltose, maltotriose, or starch syrup mainly containing these are preferably used. The amount used for pre-culture is approximately 1~
2%, the amount added in main culture is about 10-40%, especially 20-40%
A range of 30% is preferred. The ethanol added in the main culture is such that the ethanol concentration in the medium is approximately 5-20%, preferably 7%.
Consideration will be given to keep it at ~10%. As the nitrogen source, yeast extract, peptone, malt extract, cornstarch liquor, etc. are used, and yeast extract and peptone are particularly suitable. Examples of inorganic salts to be added to the medium include salts of phosphoric acid, magnesium, calcium, potassium, iron, and the like. Furthermore, various organic substances, inorganic substances, etc. necessary for the growth of yeast may be added to the medium as necessary. The culture temperature is within the range where yeast can grow, that is, approximately 15 to
37°C, particularly preferably 25-35°C. In addition, the pH of the medium is approximately 3.5 to 8.0,
Especially preferred is 4.5 to 5.5. The culture period is 2 to 3 days for preculture and approximately 1 to 3 days for main culture. The culture in the present invention is preferably terminated when the nutrient source of the medium is fully utilized and the amount of ethyl-α-glucoside produced in the culture solution reaches its maximum. The amount of ethyl-α-glucoside produced in the culture solution can be quickly measured using methods such as gas chromatography and high performance liquid chromatography. Ethyl-α-glucoside thus accumulated in the culture solution is then separated from the culture solution. In such cases, commonly used means include filtration, centrifugation, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, activated carbon treatment, column chromatography, etc., in combination as appropriate. For example, bacterial cells are removed from the culture solution by filtration, centrifugation, etc., then this solution is treated with activated carbon to remove colored substances, and then deionized with an ion exchange resin. Concentrate and make syrup. This syrup high in ethyl-α-glucoside can be added to foods as is and used to improve the flavor and taste quality of foods. Ethyl-α-glucoside is further purified and separated from this syrup by a combination of activated carbon column chromatography and preparative high performance liquid chromatography, and concentrated and dried to obtain ethyl-α-glucoside powder. . As is clear from the test results shown in the table below, yeasts that have the ability to produce ethyl-α-glucoside include Schizosatucharomyces pombe strain G-2, Schizosatucharomyces pombe IFO 0340 strain, etc.
Similarly, 0358 IFO shares are counted.

【表】すなわちエチル−α−グルコシドを生産する能
力は、シゾサツカロスポンベＧ−２株だけの
ものでなく、少なくともシゾサツカロミセスボ
ンベに属する菌株に一般的に見られる性質と考え
られる。実施例実施例１マルトース２％、ポリペプトン（日本製薬製）
0.5％、酵母エキス（Difco製）0.3％、
KH₂PO₄0.02％を含む培地50mlをPH5.5に調整し、
殺菌後シゾサツカロミセスポンベＧ−２株を
接種し、25℃48時間振とう培養した。これに16％
マルトース水溶液100mlとエタノール17mlを無菌
的に加え、マルトースとエタノールの終濃度が
各々10％になるように調整し、密栓後さらに25℃
24時間振とう培養した。その結果、この培養液中に1.4ｇのエチル−α
−グルコシドが蓄積した。投与したマルトースの
全糖量から計算されるエチル−α−グルコシドの
収率は8.4％である。この培養液を遠心分離し菌体を分離した後、濃
縮し、活性炭カラムクロマトグラフイーをおこな
つた。この操作を２回くり返し、濃縮して、25.6
％濃度の糖シラツプを得た。この糖組成はマルト
ース70.4％、エチル−α−グルコシド16.0％、グ
ルコース12.7％、その他の糖0.9％であつた。エ
チル−α−グルコシドの確認は、この糖シラツプ
を薄層クロマトグラフイーに供して、そのエチル
−α−グルコシド画分を分取し、そのアセテート
誘導体によるガスクロマトグラフイーの保持時間
による同定から行なつた。実施例２例１と同様の液体培地に、シゾサツカロミセス
ポンベＧ−２株を接種し、25℃48時間振とう
培養した。これに32％マルトース水溶液100mlと
エタノール11.5mlを無菌的に加え、その終濃度
が、マルトース20％、エタノール７％になるよう
に調整し、密栓後さらに25℃24時間振とう培養し
た。その結果、この培養液中に1.8ｇのエチル−
α−グルコシドが蓄積した。実施例３シゾサツカロミセスポンベＧ−２株のかわ
りにシゾサツカロミセスポンベIFO 0340株を
使用し、実施例１と全く同様に操作するとエチル
−α−グルコシド1.0ｇを得ることができた。投
与したマルトースから計算されるエチル−α−グ
ルコシドの収率は６％であつた。発明の効果本発明によりエチル−α−グルコシドを従来に
比しはるかに安価に多量に生産することができる
こととなつた。エチル−α−グルコシドは既述の
通り特異な呈味成分があるので、調理、調味用に
今後益々その広範な利用が期待される。[Table] That is, the ability to produce ethyl-α-glucoside is considered to be a property not only found in Schizosatucharos pombe strain G-2, but also generally found in at least strains belonging to Schizosatucharomyces bombe. Examples Example 1 Maltose 2%, polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical)
0.5%, yeast extract (manufactured by Difco) 0.3%,
50 ml of medium containing 0.02% KH ₂ PO ₄ was adjusted to pH 5.5,
After sterilization, Schizosatucharomyces pombe strain G-2 was inoculated and cultured with shaking at 25°C for 48 hours. 16% to this
Add 100 ml of maltose aqueous solution and 17 ml of ethanol in an aseptic manner, adjust the final concentrations of maltose and ethanol to 10% each, then seal and incubate at 25°C.
Cultured with shaking for 24 hours. As a result, 1.4 g of ethyl-α was found in this culture solution.
- Glucosides accumulated. The yield of ethyl-α-glucoside calculated from the total sugar content of the administered maltose was 8.4%. This culture solution was centrifuged to separate the bacterial cells, concentrated, and subjected to activated carbon column chromatography. Repeat this operation twice and concentrate to 25.6
% concentration of sugar syrup was obtained. The sugar composition was 70.4% maltose, 16.0% ethyl-α-glucoside, 12.7% glucose, and 0.9% other sugars. Confirmation of ethyl-α-glucoside is performed by subjecting this sugar syrup to thin layer chromatography, separating the ethyl-α-glucoside fraction, and identifying it by the retention time of its acetate derivative in gas chromatography. Ta. Example 2 Schizosatucharomyces pombe strain G-2 was inoculated into the same liquid medium as in Example 1, and cultured with shaking at 25°C for 48 hours. To this, 100 ml of a 32% maltose aqueous solution and 11.5 ml of ethanol were added aseptically, and the final concentration was adjusted to 20% maltose and 7% ethanol. After sealing, the mixture was further cultured with shaking at 25°C for 24 hours. As a result, 1.8g of ethyl-
α-glucoside accumulated. Example 3 Using Schizosatucharomyces pombe IFO 0340 strain instead of Schizosatucharomyces pombe strain G-2 and operating in exactly the same manner as in Example 1, 1.0 g of ethyl-α-glucoside could be obtained. Ta. The yield of ethyl-α-glucoside calculated from the administered maltose was 6%. Effects of the Invention According to the present invention, ethyl-α-glucoside can be produced in large quantities at a much lower cost than in the past. As mentioned above, ethyl-α-glucoside has a unique taste component, so it is expected that its use will become more widespread in the future for cooking and seasoning.

Claims

[Claims] 1. Schizosaccalomyces pombe (Schizosacc)
1. A method for producing ethyl-α-glucoside, which comprises causing a microorganism belonging to the genus Haromyces pombe and capable of producing ethyl-α-glucoside to act on an ethanol solution containing carbohydrates. 2 The ethyl-α-glucoside-producing bacterium is Schizosatucharomyces pompe strain G-2 (Feikokuken Bacteria Deposit No.
10700), the method for producing ethyl-α-glucoside according to claim 1. 3 Ethanol solution concentration is approximately 5-20% (W/W)
The method for producing ethyl-α-glucoside according to claim 1, characterized in that: