JPH05500817A - マイコバクテリウムケロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マイコバクテリウム　ゲロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬 １叫立欠ヱ 本発明は、活性成分としてマイコバクテリウム　ケロナＬ止匹吐旦困し憇ユ鳳旦 ユ射の極性糖ペプチド脂質（ＧＰＬｐ）を有する新規な免疫刺激薬に関する。

九肌立！遣 本発明は、活性成分としてマイコバクテリウム　ケロナエ（Ｈ　ｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｌＩｌｃｈｅｌｏｎａｅ）の極性糖ペプチド脂質（ＧＰＬＩＩ）を有する 新規な免疫刺激薬に関する。

非定型マイコバクテリアの細胞壁に存在するＧＰＬＩ）は、高い種特異性を有す ることが知られている。

ＧＰＬは脂肪酸、ペプチドおよび糖を結合する化合物である。

ＧＰ［についての広範囲な研究が、マイコバクテリアを分類しかつ同定すること を自損して行われてきた。

において、非特異的マイトジェン（ｍｉｔｏｑｅｎ）によって引き起こされた増 殖応答の減少を示した（ブラウンバックおよびバロウ（Ｂｒｏｗｎｂａｃｋ　ａ ｎｄ　Ｂａｒｒｏｗ）、インフエクションアンド　イムニティ、第５６巻、１０ ４４〜１０５０頁、１９８８年（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｌｌｕｎｉｔｙ ，　５６．１０４４−１０５０．１９８８）参照）。同じ研究者らは、細胞かイ ン　ヒト口（ｉｎ　ＶｉｔｒＯ）で上記のＧＰ［ｐおよびマイトジェンで共同刺 激されたｆｃｏ−ｓｔｉｎｕ　ｌａｔｅｄ）ときに、これらの細胞の増殖応答の 減少を示した。

免疫適格細胞における生きたＭ．ケロナエの免疫刺激特性が証明された（ビオラ イ（Ｂｉｏｚｚｉ）ら、Ｒｅｖ．　Ｆｒａｎｃ。

Ｅｔｕｄｅｓ　Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．、　５，　８６７−８９０　（１９６０） 　；ビレットおよびゴレット（Ｐｉｌｅｔ　ａｎｄ　Ｇｏｒｅｔ）　−　Ｊ．Ｒ ｅｔｉＣＩＪＩＯｅｎｄＯｔｈ．　Ｓｏｃ．。

九五二！刃 本発明に関連して、Ｍ．アビウムとは違ってＭ．ケロナほとんどの非定型マイコ バクテリアのＧＰＬは、共通して次のような構造を有することが知られている： ＰｈｅーａＴｈｒ一八ｌａ−Ａｌａｎｉへｏｌここで、ＰｈｅのＮ−末端アミノ 基は長鎖脂肪酸でアシル化されており、アラニノール基は糖に結合しており、そ してアロ（ａｌｔｏ）一スレオニン基（ａＴｈｒ）は糖に結合しているかく非極 性ＧＰＬの場合》、またはオリゴ糖に結合している（　ＧＰＬｐ　の場合）、こ の糖ペプチド脂質構造は同じであり、特に１４ＡＩｓ　（マイコバクテリウム　 アビウム　ｌ１ｌｌ胞内　スクロフラセウム（ｓｃｒｏｆｕ　Ｉａｃｅｕｌｌ） 　）複合体におけるすべてのマイコバクテリアおよびマイコバクテリウム　ケロ ナエの２つの亜種においてそうである（ブレナンおよびゴーレン（Ｂｒｅｎｎａ ｎ　ａｎｄ　Ｇｏｒｅｎ）　、Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２５４．　４２０ ５−４２１１（１９７９）　；ブレナン［Ｂｒｅｎｎａｎ）　、Ｒｅｖ．　Ｉｎ ｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．、　３。

９０５−９１３　（１９８１）　；ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）−ザ　マイコバ クチ（κｕｂｉｃａ　ａｎｄ　Ｗａｙｎｅ）ｍ、マーセル　デツカ−（Ｈａｒｃ ｅｌＤｅｋｋｅｒ）　、ニューヨーク　アンド　バーゼル（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋａ ｎｄ　Ｂａｓｅｌ）、４６７−４８９　（１９８４）　、ファンＤｓａｎｇ）ら 、匪Ｊ．Ｓ　ｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、３４．３５−４４　；ならびにア セリニューアンド　アセリ：ーユ−（Ａｓｓｅｌｉｎｅａｕ　ａｎｄ　Ａｓｓｅ ｌｉｎｅａｕ）　−　＋Ｆ’マイコバクテリア：ア　ソース　ブック、クビカ　 アンド　ウニイン編、マーセル　デツカ−、ニューヨーク　アンド　バーゼル、 ３４５−３６０　、（１９８４）参照）。

Ｍ．ゲロナエのＧＰＬＤは、上記引用文中にファン（ＴＳａｎＱ）らによって述 べられた．非定型マイコバクテリアにおけるＧＰＬＤの種の変化はオシド部分（ ｏｓｉｄｉｃ　ｐａｒｔ）に関係するので、同じ著者はｙ．ゲロナエにおけるオ シド部分を研究し、オリゴ糖について次の構造を提示した：３，４ージー０ーメ チルラムノースー（１−＞？）一ラムノース−（α−１−）　２）−６−デソキ シタロース。

ａｐｔｐは、薄層クロマトグラフィ−（上記引用文中ファンら）およびＥＬＩＳ Ａ法（ヤナギハラら、１９８５　Ｊ．　ＣＩｉｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２１，　５６９−５７４）によって、Ｍ．７オーツイタ ムｆＨ，ｆｏｒｔｕｉｔｕｎ）　−Ｍ　、ケロナエ複合体においてＭ、ゲロナ玉 を同定および区別する際に用いられた。

本質的に、Ｍ、ゲロナエのＧＰＬＩＩは、式１に一致する；Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−０ ，−Ｐｈｅ−Ｄ−ａＴｈｒ−Ｄ−＾１ａ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｏｌ−０−糖オリゴ 糖 ここで、Ｐｈｅはフェニルアラニンを表し、ａＴｈｒはアロ（ａｌｌｏ）〜スレ オニンを表し、Ａｌａはアラニンを表し、 糖は３，４−ジー０−メチルラムノースであり、オリゴ糖は次の横道を有する： ３．４−ジー０−メチルラムノース−ラムノース−６−デソキシタロース、およ び Ｒ−ＣＯ−は脂肪酸のアシル基であり、ここで、３，４−ジー０−メチルラムノ ース基は、ａＴｈｒおよびアラニノールのそれぞれにグリコシド結合によって結 合され、そしてアラニンのＣ末端Ｃ０ＯＨ基はアミド結合によってアラニノール に結合される。

オリゴ糖についての最も正確な横道は、上記したようにファンらによって与えら れたものであるか、それにおいてラムノースとジメチルラムノースの間の結合の 位置は知られていない。

天然のＧＰＬｐにおいては、オリゴ糖部分の糖はアセチル化されている。

のＧＰＬにおけるように、脂肪酸の性質は培地、温度および培養期間に依存する （例えばラドレッジ（Ｒａｔ　１ｅｄａｅ）、１９８２−「リピッド：セル　コ ンポジション、ファティ　アシッドバイオシンセシスｆＬｉｐｉｄｓ：　Ｃｅ１ ｌ　Ｃｏ１ｐｏｓｉｔｉｏｎ、　Ｆａｔｔｙ＾ｃｉｄ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ ｓ）」、「サ　バイオロジー　オブ　ザマイコバクテリア（Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）　４中、第１巻、ラドレッジ 　アンド　スタンフォード（Ｒａｔｌｅｄｇｅ　ａｎｄ　５ｔａｎｆｏｒｄ）編 、アカデミツク　プレス（Ａｃａｄｅｒ６＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン（Ｌ ｏｎｄｏｎ）（１９８２）、５３−９３　、および上記に引用した参考文献を参 照）。

天然ＧＰＬＩ）は実際には式１の成分の混合物であり、ここで脂肪酸のアシル基 Ｒ−ＣＯ−は可変性である。これらの脂肪酸は少なくとも１６個のＣ原子、かつ 一般には３６個より少ないＣ原子を有する。

したかって、本発明の原則特許請求した内容は、活性成分として少なくとも１の 、Ｍ、ケロナエのＧＰＬＤまたはその誘導体が免疫刺激剤として活性なＭ、ケロ ナエのＧＰＬＤの誘導体を含む免疫刺激薬を含む。

本発明の薬に存在するＧＰＬＤは、少なくとも部分的に精製された、公知の方法 にしたがって得られたＭ、ケロナエの細胞壁からのＧＰＬｐの抽出画分を含むこ とができる。但し、本発明を、Ｍ、ケロナエからのＧＰＬｐの唯一の供給源とし て、生きているもしくは殺したＭ、ケロナエ、またはＭ５ゲロ力王の細胞壁全体 または細胞壁の断片を含む薬に広げるものではない。

少なくとも部分的に精製されたＧＰＬｐの抽出画分（この画分は本発明の薬にお いて活性成分として使用される）は−Ｍ、ゲロナエの細胞壁からのＧＰＬの抽出 物であることができ、この抽出物は例えは冷メタノール、特に＋４°Ｃのメタノ ールに可溶である。

これらは特に、１８〜５０°Ｃでクロロホルム対メタノールの比２：１の混合物 の助けによってＭ、ゲロナエの細胞もしくは細胞壁から抽出により得ることがで きるＧＰＬ画分であり、この両分は冷メタノールに可溶である。例えはメタノー ル対クロロホルムの体積比が少なくと６５：１であるように、冷メタノール（４ ℃）の添加後に可溶なままである。これらの両分はまた、先に示したように抽出 とそれに続くシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによる精製によって得るこ とができる。

本発明の目的は特に、活性成分として少なくと６１の式１の化合物またはその活 性誘導体を含む薬である。

本発明の薬に存在するＧＰＬＤは、単に天然にアセチル化されたＧＰＬＤである 必要はなく、ＧＰＬｐの活性誘導体、特に対応する脱アセチル化（ｄｅ−ａｃｅ ｔｙｌａｔｅｄ）誘導体であることかで本発明の薬の活性成分を構成するＧＰＬ ＯまたはＧＰＬＯの誘導ンから得られるニ ー−ＮＣＴＣ（ナショナル　コレクション　オブ　タイプ　力ルチャーズ（Ｎａ ｔ、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）　）−−ＡＴ ＣＣ（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（＾ｉｅｒ、　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　）　（米国）、寄−−ＣＩＰＴ　 （コレクション　インスティテユート　パスツール　チューバーキュｏ−ス（Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｅ））、（パリ、フランス）、寄託番号１４０４２００１９　（Ｍ　、ケロナエ 　ブスピーシーズゲロナｘ　（Ｈ，ｃｈｅｌｏｎａｅ　５ｕｂｓ　、　ｃｈｅｌ ｏｎａｅ）　）　；−−ＣＩＰＴ（コレクション　インスティテユート　パスツ ール　チューバーキュｏ−ス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＰａｓ ｔｅｕｒ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｅ））、（パリ、フランス）、寄託番号１４０ ４２００２０　（Ｍ　、ゲロナエ　サブスピーシーズ二Ａ立二之二区−上工匝旦 皿り旦迩ｌ」迫阻且且且）Ｍ、ゲロナエは、ローエンシュタインーイエンセン培 地（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ　ｌ１ｅｄｉｕ１１）　（パリのイン ステ、イテユートパスツール）に保持するこ・とができ、ルーボトル／Ｒｏｕｘ ｂｏｔｔｌｅ）においたサラトン培地（Ｓａｕｔｏｎ　１ｌｅｄｉｕ１１）に培 養することができ、次いで１．５％のバクトーアガー（Ｂａｃｔ。

−ａｇｅｒ）　（ディフコｆＤｉｆｃｏ）　）を添加することにより凝固させる ことができる０Ｍ、ケロナエはまた、発酵装置で、またはフィルム培養の助けに よって、または任意の他の類似の方法でも培養することができる４ Ｍ、ゲロナエからＧＰＬ（ｌを抽出する方法は、上記したようにそれ自体公知で ある。それは、生きているもしくは殺したバクテリアまたはバクテリ≠の壁から 脂質複合体の全体を抽出することから成る。抽出は、バクテリアまたは凍結乾燥 したバクテリアに接触される、例えばクロロホルムとメタノールの混合物の助け によって、成し遂げることができる。

次に、少なくとも部分的に糖脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質を除去するこ とができる９例えば、すべての脂質複合体のクロロホルム溶液に、多重の冷メタ ノールを添加することにより進めることができる。これによって、いくらかの糖 脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質の沈殿が引き起こされる。　ＧＰＬｐおよ び非極性ＧＰＬ　−リン脂質および残留している遊離の脂質が溶液中に残る。

この段階で、公知のやり方で、希釈したまたは穏やかなアルカリで処理すること （ＮａＯＨのメタノール溶液の添加）によって脱アセチル化を進めることは有効 である２例えば、０，２ＭのＮａＯＨのメタノール溶液を、複合体がクロロホル ムとメタノールの混合物（２：１）の溶液中にあるところの前段階から得た脂質 複合体に添加する。ここで、添加するＮａＯＨ−メタノール溶液の体積は、脂質 複合体の溶液の体積に等しい。脱アセチル化は、マイコバクテリアのＧＰＬに特 異的であり、これは脱アセチル化をさらに越えた分解（ｄｅｇｒａｄａｔ　１ｏ ｎ）に抵抗する。一方、除去したい他の脂質（リン脂質、カロチノイドおよび他 の望ましくない脂質）は分解される。このように脱アセチル化は、カラムもしく は薄層クロマトグラフィーにより所望のＧＰＬの分離およびさらに精製を促進す る。アルカリ処理の後、混合物を酸、例えば濃酢酸で中和する。この段階で有機 相を、クロロホルム、メタノールおよび水（４：２：１）の混合物または同様の 混合物で洗浄することは有利である。次に、洗浄した有機相を、カラムクロマト グラフィーにより、または上記引用文中のファンらの方法により、またはＪ、　 Ｃｈｒｏｎａｔｏ。

工３７７ユ３４５−３４９　（１９８６）のディミドリヤピッチ（Ｄｉｉｉｔｒ ｉｊｅｖｉｃｈ）らの方法により、精製に供することができる。

この方法でＭ、ゲロナエのＧＰＬＩ）を含む、部分的に精製された両分を得るこ とができる。カラムクロマトグラフィーにより、次のものを分離できる：アルカ リ処理による分解を逃れた望ましくない脂質、ＧＰＬＤおよび、場合により、ト レハロースを含む糖脂質（これらは冷メタノールでの沈殿を行わなかった場合に 存在する）。

Ｍ、ゲロナエの非極性糖ペプチド脂質は、溶媒の最前部近くの両分であり、ＴＬ Ｃのオルシノール試験で桃色がかった黄色に着色される。それらは種特異的では ない（例えば上記引用文中のファンら参照）。

種特異的であるＭ、ケロナエのＧＰＬｐは、溶媒の最前部から遠い画分てあり、 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でのオルシノール試験において、Ｍ、ケロナ エ　サブスピーシーズ　ケロナｘ　ｆＨ，ｃｈｅｌｏｎａｅ　５ｕｂｓｐ、　ｃ ｈｅｌｏｎａｅ）　ｃｆ）場合は金色がかった栗色に着色され、Ｍ、ゲロナエ　 サブスピーシーズ　アブセラシュス　（Ｈ，ｃｈｅｌｏｎａｅ　５ｕｂｓｏ、　 ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）の場合は暗橙色に着色される（例えば上記引用文中のファ ンら参照）。

本発明の組成物の活性成分はまた、少なくとも１の、ペプチドおよび糖合成の古 典的手法にしたがう合成もしくは半合成によって得られた式１の化合物であり得 る。

本発明の組成物は慣用のガレヌスの方法（ｑａｌｅｎｉｃ！１ｅｔｈｏｄ）にし たがって調製される。

ＧＰＬｏもしくはこれを含む抽出画分は、適当な液体媒質中で、波長８ミクロン およびａｐｔｐ濃度１〜２０　Ｂ／ｎｌで２０〜５０分間、超音波の作用にさら して生成物を均質化することができる。

本発明の組成物における活性成分（ＧＰＬＤ）は一般に、組成物の総重量に対し て０．０７〜８１量％の量で存在する。

本発明の組成物は、特に、適当な液体薬剤媒質中の懸濁物として提供され得る。

この懸濁物は、薬剤に使用し得る界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例え ばソルビタンポリオキシエチレンモノオレエート（例えば商標Ｔｗｅｅｎ８０） を含むことができる。液体組成物は、任意的に凍結乾燥前を添加して凍結乾燥に 供することができ、凍結乾燥しな形で貯蔵することができ、そして使用時に再構 成することができる。使用の準備かできた時の液体組成物は一般に、０．２〜８ ０１１ｇ／ｎｌのＧＰＬｐを含む（使用する投与の方法に依存する）。

懸濁物はまた、０．２体積％までの界面活性剤を含むことかできる５本発明の組 成物は一般に、有効量の通例の防腐剤、例えはメルチオレート（ｎｅｒｔｈｉｏ ｌａｔｅ）を含むことができる。

本発明の組成物は、特に、飲用に適したもしくは注射可能な懸濁物の形状のまた は局所用の施与のための組成物、または鼻もしくは結膜による投与のための組成 物であり得る。

本発明の組成物はまた、ゲルカプセル、錠剤、粉末、生薬、歯肉のペースト、ま たはクリームの形状でも提供されのＧＰＬＤは、有機体の非特異的防御の刺激剤 である。それはまた、特異的な免疫反応を非特異的に刺激することができる（補 足の効果）。

本発明の組成物はこのように、人間または動物において免疫刺激薬として使用可 能である。それはまた、特に、ワクチンにより与えられた免疫を促進するための アジュバントとして、および抗生物質療法の強化剤としても使用可能である。

本発明の組成物はまた、動物および人間における成長因子および／または同化因 子として使用できる。

それは特に、非経口の方法（例えば腹膜精織内の、皮下の、筋肉内の、静脈内の 、経皮の方法）により、口により、鼻により、結膜的に、直腸により、または舌 により（ｐｅｒｌ　ｉｒ＋ａｕａｌ　ｌｙ）投与され得る。

それはまた、特に口内の空洞の疾患（歯槽ｍ漏、歯肉炎、歯根膜炎（ｐｅｒ”１ ｄｏｒｉｔｉ　ｔ　ｉｓ）等）の非特異的免疫療法において、口内に入゛れると 分解する歯肉のペーストまたは錠剤の助けによって、局所的に使用されることも できる。

通常の薬量学では、１回以上の投与で例えば１日当たり０．１〜１２、好ましく は０．５〜１０　ｎｇ／ｋｇ体重でありうる０例えば最も頻繁の投与では、非経 口投与について０　、５〜３ｕ／ｌｔｇ　、０ニよれば４〜１０ｎｇ／ｋｇ　、 および鼻への投与では２〜４　ｕ／ｋｑである。本発明の薬は、特に、二次的な 免疫疾患の場合に免疫刺激処置として；局所または全身の伝染病において補助薬 処置として；特に抗ウイルス処置に関連してエイズの補助薬処置として；寄生虫 病または癌の状態の場合の補助薬処置として；および抗癌療法の免疫抑制効果（ 特に白血球減少症により証明されたもの）のための矯正的処置として、効果的な 投与量で投与される。

本発明の薬はまた、上記した種々の場合において、予防法として、特に耳鼻咽喉 科学領域での再発感染防止のために、また慢性病状態における感染の危険防止の ために、ならびにワクチンにおけるアジュバントとしても投与され得る。

それはまた、動物および人間の体重の増加または減少を促進するために使用する こともできる。

Ｍ、ケロナエのＧＰＬＩ）は、特に、成長および／または感染への抵抗を促進す ることを意図して、動物に食物添加物として使用することもできる。

本発明の主に特許請求された内容のさらなる要素は、非特異的免疫刺激薬または 同化作用薬の調製における活性成分としての、またはワクチ゛ン製造の際のもし くは栄餐組成物製造の際のアジュバントとしての、前記したような性エゲロナエ のＧＰｌｐの使用である。

本発明は特に、抗癌療法の免疫抑制効果（例えば化学的に誘発された白血球減少 症）を正すことを意図して、非特異的免疫刺激薬の調製における活性成分として 、Ｍ、ゲロ−ｆ−ｘのＧＰｌｐを使用することに関する。

以下の実施例により本発明を説明するが、いかなるやり方でも本発明を限定する ものではない：マイコバクテリウム　ケロナエ　サブスピーシーズ　ヶロナｌ− （ＨＣ０ｂａＣｔｅｒｉＬＩｌ　ｃｈｅｌｏｎａｅ　５ｕｂｓｐ、　ｃｈｅｌｏ ｎａｅ　を、上記した培地で３５゛Ｃで、安定した状態になるまで培養した９次 に、５ｅｏｏｘｕでの遠心分離によりこれを集め、洗浄した０次いで細胞を乾燥 しもしくは凍結乾燥し、その後できるたけ短い時間内に抽出を行った。

すべての脂質イ合物の抽出。

およびゴーレフ（Ｂｒｅｎｎａｎ　ａｎｄ　Ｇｏｒｅｎ）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、。

ｖｏｌ、２５４．　Ｎｏ、１０．４２０５−４２１１　（１９７９）により述べ られたのと同様の手法で行った。

抽出には、凍結乾燥したマイコバクテリア　グラム当たり混合物４０１１の量で 、クロロホルム：メタノール　２：１混合物を使用し、熱水浴中に浸したフラス コ中で５０°Ｃで１８時間行った。抽出物は、ワットマン紙Ｎｏ、３で濾過する ことにより回収した。残渣を、同様の方法だがたった４時間続けただけの方法に より、二次的な抽出に供した。

抽出物を一緒にして、溶媒を蒸発させた。乾燥抽出物を次の段階まで＋４℃で貯 蔵した。

糖脂　、カロチノイドおよび遊離の脂質の除去全脂質複合体を十分な量のクロロ ホルムで溶解し、実質量のメタノールを÷４°Ｃで添加した。沈殿が観察された 。

メタノールの量は、さらにメタノールを添加してもさらに沈殿を引き起こさない ほど十分でなければならない。この沈殿は糖脂質、力ロチノドおよび遊離の脂質 を含む。Ｇ　Ｐ　Ｌ　ｐ、非極性ＧＰＬ　、リン脂質および池の遊離の脂質が溶 液中に残存した。

遠心分離により沈殿を除去した後、上澄の溶媒を蒸発さ先の段階で生成物を蒸発 して得られな残渣を、穏やかなアルカリ処理（脱−アセチル化）に供し、得られ た混合物を、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物で洗浄しな。

この目的のために、前の段階で得られた残渣を−クロロホルム：メタノール　２ ：１の混合物に再び溶解させ一等量の０．２ＭのＮａＯＨメタノール溶液を添加 した。３７°Ｃで３０分後、この混合物を１２．５μｍ　／　ｍ　ｌの濃酢酸で 中和し、次いで洗浄した。洗浄混合物は、クロロホルム：メタノール：水　４： ２：１であった。撹拌および生成した気体の放出後、この混合物を１時間静置し た。水性相を捨て、有機相を抜き、蒸発に供した。残渣を４°Ｃで貯蔵した。

脂質複合体ｇ当たりシリカゲル６０（粒子径０．０６３−０．２００　ｍｌ）　 １００　ｇを含むガラスカラムを調製した。方法は、上記引用文中のファンらの 方法と同様であり、ここで、純クロロホルムから始めてクロロホルム中のメタノ ールの割合を増やしたものを使用することによって、成分を分離した。上記引用 文中のディミドリヤピッチらの方法を使用することも可能であり、そこでは、ク ロロホルム中のメタノールの割合を固定して（１０％）、クロマトグラフィーを 行う、流速は約１．５１１／分に固定した０画分を分析的ＴＩＣにて分析した。

同じ移動性の両分を合わせ、重量を測定し、そして好ましくは４℃で貯蔵した。

薄層クロマトクラフィー（ＴＬＣ）： 使用前に１１０°Ｃで３０分間加熱して活性化したＴＬＣグレート（２０ｘ２０ 　ｃｎで厚さｉｌｌのカラスプレート）（メルク（Ｈｅｒｋ））を使用した。

先の段階で得られた画分を、クロロホルム：メタノール２：１の混合物中にＬＯ ｎｇ／ｌに調整したう次にこの調製品を、グレートの低い方の端、がら１〜２ｃ ｌの位置に、等距離（最短でＬｃｍの距Ｍ）の点に置いた。この点は、両端を引 き伸し、曲げたパスツールピペットを用いて形成した。

このプレートを次に、移動溶媒（６０：１２：１　／クロロホルム：メタノール ：水）を含むトレーに置いた４この溶媒がプレートの上の端より１または２ｃｌ 下に移動したとき、移動を終えた。プレートを空気を通したフード中で乾燥し、 現像試薬（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎａ　ｒｅａｑｅｎｔ）を噴霧した。　ＧＰＬｐノ ための試薬は、２度蒸留した水での４０％硫酸水溶液中の０．１％の微粉状オル シノールである。加熱キャビネット中で１１０〜１３０°Ｃで３〜１ｏ分間加熱 した後、■、ゲロナエの特異的ＧＰＬＩ）か金色ががっな栗色に着色された。な お、非極性糖ペプチド脂質は桃色ががった黄色に着色された。クロマトグラフィ ーにより、単離した抽出物の純度を監視することができる。

ＧＰＬｐの同定および純度の監視のために、以下の分析的方法を使用することが できる： ＩＮ、ＨＣｌでの酸加　分解 ＩＮ　ＨＣＩの存在下でのＭ、ゲロナエの特異的ＧＰＬｐの酸加水分解により、 （ワットマン　Ｎｏ、１での）ペーパクロマトグラフィーおよびカスフェースク ロマトグラフィーによって同定することかできる特定の１！（メチルラムノース 、ラムノースおよびデツキシタロース）を遊離させることができる。

６Ｎ　ＨＣＩでの酸加水分解 先の段階の残渣の６Ｎ　ＨＣＩでの加水分解により、マイコバクテリアのＧＰＬ の特定のアミノ酸を遊離させることができる。このアミノ酸はＴＬＣにより同定 することかできる１Ｍ、ケロナエの場合、非定型のマイコバクテリアの場合のよ うに、これらのアミノ酸はフェニルアラニン、アラニン、アラニノールおよびア ロスレオニンである６ＩＲスペクトルによるＧＰＬｐの分析 Ｍ、ゲロナエの脱アセチル化したＧ　Ｐ、Ｌ　ｐの分析は、上記引用文中のブレ ナンおよびゴーレン（１９７９）により、および上記引用文中のブレナン（１９ ８４）により記載されたものと類似して、糖ペプチド脂質のペプチド結合の特性 ピークを示す。

Ｋ土璽ユ 注射可Ｆｆ、の　遣 実施例１で得たＧＰＬＤをクロロホルムに再度溶解し、超音波処理管中で、窒素 雰囲気下で２度蒸発した。

生理的血清（例えば無発熱源の（ａｐｙｒｏｇｅｎｌｃ）ｓ　、　５％ＮａＣｌ 溶液）のような注射可能な溶液の製造のために適した液体に残渣を懸濁した。非 経口投与に適合性の界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ　８０　（商標）もまた、０ ．１−０．２体積％の量で添加できる。この界面活性剤を添加する目的は、材料 の懸濁を促進するためである。

このようにして得られた懸濁物を次に、生成物を均質化する目的で、ＧＰＬＤＪ 度１〜２０ｎｏ／ｎ　ｌで、振幅８ミクロンにて約２０〜５０分間超音波処理に 供した。

注射可能な懸濁物は、他の許容できる媒質、例えは標準リン酸塩Ｍ養液または同 様の媒質を用いて調製することもできる。

ＧＰＬｐＬニア）４度は、投与に依存して、例えば０．２〜８０ｍｑ／ｎｌに調 整される。長期の貯蔵のためには、調製物は凍結乾燥した後、認め得る活性の損 失なしに生理的血清中に再構成されることができる６ 乱臣■ユ Ｍ、ゲロナエのＧＰＬＤの薬理“自試験実施例１で得られたＧＰＬＩ）を用いて これらの試験を行った。

１、リンパ　′″Ｆ−（ｌ　ｎｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｎａｔ ｉｏｎ）のための刺激的効果 この効果は、細胞における直接的効果（Ｍ、ケロナエのＧＰＬｆ）であらかじめ 処理したマウスの胛細胞および胸腺細胞のリンパ球芽球転換における増加によっ て）または間接的効果（マイトジェンに対する増殖応答における増加）によって 評価される。これらの効果は、トリチウム化したチミジンの組み込みを経て測定 される。

この試験は、メスのＢａ　ｌ　ｂ／ｃ　マウスに行った。

生成物を、動物５体の群に、経口により１２ｕ／ｋｇで、または皮下に２．５１ ′Ｏｇ／ｋｇで、各３日間隔で４投与（経口）または３日間隔で３投与（皮下） の方針で投与した。対照群は溶媒のみで処理した。

畝上： ＧＰＬｐは、皮下の処理（Ｐ≦０．００１）および経口処理（Ｐ≦０．０５）に おいてマウスの牌ＭＵ版のリンパ球芽球転換を刺激した。

マイトジェンに対するマウス牌細胞の応答は、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、Ｉ ＢＦ−ＬＫＢ）　（Ｐ≦０．０２）；植物性血球凝集素（ＰＨＡ；Ｄｉｆｃｏ） 　（Ｐ≦０．０１）　；およびリボ多糖Ｂ（ＬＰＳ。

Ｄｉｆｃｏ）（Ｐ≦０．００１）について、皮下刺激において増加した。

そのような増加はまた、同じ３種のマイトジェンについて、経口刺激においても 観察された（ＣｏｎＡ　、　ＰＨＡおよびＬＰＳについてＰ≦ｏ、ｏｏｉ）。

マイトジェンに対するマウスの胸腺細胞の応答もまた、コンカナバリン　Ａおよ びＬＰＳについて、著しく増加した（ＣｏｎＡ　、ＰＨＡおよびｔｐｓにライて Ｐ≦０．００１）。

マクロファージか免疫刺激効果を有する抗原またはマイトジェンと接触すると、 モノカイン（インターロイキン−１および腫瘍壊死因子、ＴＮＦ　）の分泌によ り応答する。腹膜マクロファージによるモノカインの誘発の試験はこのように、 これらの細胞における免疫刺激生成物の効果を評価する方法である。

級１： あらかじめＧＰＬＩＩで処理したマウスからの腹膜マクロファージのｔｐｓでの 活性化は、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊ　マウス（ＬＰＳに敏感でないマウス）の胸腺細胞の 転換において、インターロイキン−１（ＩＬ−１）の活性の非常に著しい誘発（ １０７単位／ｌｌに等しい）を示したう これらのマクロファージの上澄はまた、ＴＮＦの作用に敏感である、ｗ１＃Ｉｋ 系統［９２９の４ｆｌ胞に毒性効果を有する（　２００００単位／ｍｌに等しい 量）。

３日間隔で各３投与で、２．５ｎｇ／ｋａの投与量でのＧＰＬｐによるＢａ　ｌ 　ｂ／ｃ　マウスの腹膜組織内刺激は、これらの動物の血清にＴＮＦ活性の著し い誘発をもたらし、これはＩＩ癌糸系統９２９の細胞への毒性（３４０００単位 ／１に等しいＴＮＦの址に対応する毒性）により評価した。

イン　ビボまたはイン　ビトロで、１ＩＩＩ１１１１胞を免疫刺激効果を有する 抗原またはマイトジェンと接触させると、リンホカインの分泌により応答する。

最も知られているリンホカインはインターロイキン−２（Ｉｔ−２）であり、こ れはＩ［−２依存性細胞毒性Ｔリンパ球の系統（マウス胸腺腫）　（ＣＴＬＬ− ２）の生存および繁殖のために不可欠である。

虹１： ２．５ｕ／ｋｑの投与ｆｆ１（３日間隔で各３投与）でのａｐｔ、ｐによるＢａ １ｂ／ｃ　マウスの皮下の刺激は、４８時間後に牌細胞の上澄に測定されるＩｔ −２活性の著しい徴候を与えた＜５．５５単位／ｎｌに等しい量）。

遅延型過敏性反応＜Ｈ３Ｒ＞は１．初期の静脈感作に続いて、（足底の内証に） 局所的に注入されたアレルゲンにより誘発される。動物が、Ｔリンパ球に作用す る非特異的免疫刺激剤で処理されると、アレルゲンが２回目に局所的に導入され たときに、遅延型過敏性が増加することが観察される。

この試験では、アレルゲンの第２の注入に続く足底の内証の体積の増加を分析す る。使用したアレルゲンは羊の赤血球であった。（腹膜組織内または皮下に）研 究した生成物でマウスを最後に刺激した２日後、およびＤＨＲ試験試験前日前こ れらを静脈に注射した。刺激したマウスは試験生成物を（腹膜組織内または皮下 に）、−８日、−５日および一２日の各日に２　、５　ｉｇ／ｋｇの投与量で受 けた。対照マウスは、標準食塩水のみを受け入れた。０日には、すべてのマウス が静脈に百方の羊赤血球の単一投与を受けた。

＋４日には、マウスは足底の内証に注入した羊赤血球１０８３日間隔で３回投与 した生成物によるＣ５７ＢＬ／６マウスの腹膜組織内および皮下刺激は、（７２ 時間で１リ一デイングｆｒｅａｄｉｎｇ）を除いた）対照マウスに関してＤＨＲ を増加させ（Ｐ≦ｏ、ｏｏｉ　＞　、その増加量は、ＢＣＧによるものに匹抗体 応答の程度は、抗原の性質および免疫系の性質および条件に依存する。免疫系が 免疫！ｌＩｌ激剤によって、またはアジュバントの存在下での抗原によって刺激 されると、抗体応答は増加する。行った試験において、ＧＰＬｐのこの性質を、 Ｃ４７ＢＬ／６マウスの羊赤血球に対する抗体応答により分析した。ここで、マ ウスは試験生成物であらかじめ刺激しておいた。処理されたマウスは、−８日、 −５日および一２日の各日に２゜５　ｕ／ｋｇの投与量で、腹膜組織内および皮 下に試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清のみを受けな。

０日には、各マウスは羊赤血球１０６の単一静脈内投与を受けた２次いで０日〜 ＋４３日に血清試料を取り、これらを羊赤血球溶血能について試験した。

紅玉： ３日間隔で３回投与したＧＰＬＤによるＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈および皮下 刺激は、腹膜組織内刺激の場合には７．１１および２５日に取った血清試料につ いて、また皮下刺激の場合には７．２０および２５日に取った血清試料について 、羊赤血球の抗体応答の非常に著しい増加を引き起こした。

６、Ｑ先１肱１五工１ ａ）マウスにおけるタレブジーラ　ニューモニアエｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対する防護試＠：マウスに特に適合したに、ニ ューモニアエ（Ｋ、　ｐｎｅｕｌｏｎｉａｅ）の腹膜組織内への注入は−２４− ４８時間以内に致命的な敗血症を引き起こす、試験は一対照に比べて処理したマ ウスの生存時間を測定することにある。処理マウスは、−８日、−５日および一 ２日の各日に２．５１１ＣＩ／ｋｇの投与量で、腹膜組織内に試験生成物を受け た。対照マウスは生理的血清のみを受けた。０日に、すべてのマウスは１つの適 当なに、ニューモニアエの腹膜組織内投与を受けた。その後、続く５日間に死亡 数を観察した６１： ３日間隔で３回それぞれ２．５１（］／ｋｇの投与量でのＧＰＬＩ）による腹膜 組織内刺激は、Ｋ、ニューモニアエの５０ｘ　１０５０で感染したＣＤＩマウス を非常に著しく防護した。事実、動物は試験中病気の徴候を全く示さなかった。

試験は、対照マウスに対して処理したＢ６Ｄ２／Ｆｌマウスの生存時間を測定す ることからなる。

Ｌ−１２１０白血病細胞は、試験に先立って適切な培地で培養した。

処理マウスは、−８日、−５日および一２日の各日に２　、５　ｕ／ｋｑの投与 量で、腹膜組織内に試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清のみを受け入 れた。０日に各マウスは、生存能力のあるＬ−１２１０Ａｌ［ｌ胞を１０６の投 与量で腹膜組織内への１回投与を受けた。生存時間を測定した。

級迷： ３日間隔で３回それぞれ２　、５　ｕ／ｋｑの投与量でのＧＰＬＤによる腹膜組 織内刺激は、Ｌ−１２１０白血病細胞を接種したＢ６０２／Ｆ１マウスの生存時 間を非常に著しく延長した。延長は、対照マウスの生存時間に関して３３％であ った。

７、マウスへの　下投与における同化作用の効果（ａｎａｂｏｌｉｃ　ｅｌｅｃ ｔ）の評価３日間隔で３回それぞれ２　、５　ｎｇ／ｋｇの投与量で、生成物を 皮下に注入した。マウスの重量を１０日間毎日記録し、全体の重量増加を評価し た。処理マウスは、−１０、−７および−４の各日に２　、５１ｇ／ｋｇの投与 量でＧＰＬｔｌを受けた。

対照マウスは生理的血清のみを受けた。

（Ｉ： ３日間隔で３回それぞれ２　、５１ｇ／ｋｇの投与量でのＧＰＬｐによる皮下刺 激は、Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃマウスにおいて著しい同化作用効果を有していたくＰ≦ ０．０２）。

８、マウスのイ学的に；　された　血球２小症におけるＧＰＬＤの　白血球゛ノ １症　果 この試験は、まずアドリブラスチン（Ａｄｒｉｂｌａｓｔｉｎｅ）（ドクソルビ シン　クロロハイドレート　ラクトース（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ｃｈｌｏｒ ｈｙｄｒａｔｅ　１ａｃｔｏｓｅ）、アンスラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃ ｌｉｎｅｌ類の群の細胞増殖抑制性の生成物）の助けにより、マウスに白血球の 涸渇（ｄｅｐ　ｌｅｔ　１ｏｎ）を誘発することからなる。その後、同じマウス を、これらの血液細胞か標準状態に復帰するまで、ＧＰＬＤおよび正の対照とし て使用した池の生成物（ケンサイム（Ｇｅｎｚｙｌｅ）により提供されたマウス のＧＭ−Ｃ３Ｆ　’）で処理した。

Ｂａ１ｂ／ｃ７ウスを、０および＋１の各日に、５１ｇ！Ｊ／ｋｇ／日（体積５ ０μＬ）の量で静脈内に、アドリブラスチンで処理した。同じマウスは次に、０ ．１５　ｎｌの体積で、ＧＰＬｐ、ＧＭ−Ｃ３Ｆまたは生理的血清を受けた。こ の処理は、２．５．８．１１．１４．１７および２０日に行われた。それぞれの 動物において、０．２．５．８．１１．１４．１７．２０および２８日に、循環 する白血球の計測を行った。

綾１： Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃマウスのＧＰＬｐでの腹膜組織内刺激は、アドリブラスチンで の前処理により誘発された白血球減少症を、マウスＧＭ−ＣＳＦの場合に匹敵す る程度に非常に著しく緩和した。

９、食細　作用の試　−ｍ−コロイド状　素の除去におけＬ虹旦五遁１ この試験は、食細胞による血液からのコロイド状炭素の粒子の除去の動力学の研 究を可能にする４処理マウスは、−８日、−５日および−２日の各日に１２　ｕ ／ｋｑの経口投与で試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清のみを受けた 。０日に、各マウスはゼラチン中４％の懸濁物においてコロイド状炭素（ペリカ ン「エンフレ　デ　キネ」ブラック（Ｐｅｌｉｋａｎ　”Ｅｎｃｒｅ　ｄｅ　Ｃ ｈｉｎｅ”、ｂｌａｃｋ））の単一静脈内投与を受けた。投与量は、１６１（１ ／体重１００ｑであった。０．２．４．６．８．１０および１２分の時間に、血 液試料（各０．０２５１１）を取った。試料は、分光光度計により６３０ミクロ ンの波長で測定した。これは血液中の懸濁物に残存する炭素粒子の測定を可能に する。

級迷ニ −８日、−５日および一２日の各日に１２　Ｉｎ（１／ｋｌＪの経口投与で、ａ ｐｔｐでのＣＤＩマウスの刺激は、コロイド状炭素の清掃に著しい増加を引き起 こした。

ヰ・幻ネ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｈｅｌｏｎａｅ）の極性糖ペプチド脂質の少なくとも部分 的に精製された抽出画分を活性成分として含む薬剤組成物。この組成物は、人間 および動物における非特異的免疫を刺激するために特に使用することができる。

Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−ａＴｈｒ−Ｄ−Ａ　１ａ−Ｌ−Ａ　１ａｎｉ ｎｏ　１−０−糖オリゴ糖 国際調査報告 ″′″″″″″１°８°ｍ＊　ＨａρＣ工／ＦＲＱｌ　／１１＋１ｊｊＱ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．活性成分として、少なくとも部分的に精製された、マイコバクテリウムケロ ナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｍｃｈｅｌｏｎａｅ）からのＧＰＬｐの抽出画分 または、免疫刺激剤として活性な誘導体であるＭ．ケロナエのＧＰＬｐの誘導体 を含むことを特徴とする薬剤組成物。
2. ２．少なくとも部分的に精製された画分が＋４℃でメタノールに可溶な画分であ ることを特徴とする請求項１記載の組成物。
3. ３．上記画分が、１８〜５０℃の温度でクロロホルム：メタノール２：１の混合 物の助けによって、Ｍ．ケロナエの細胞もしくは細胞壁の抽出によって得ること ができる画分であり、この画分は４℃のメタノールに可溶であることを特徴とす る請求項１記載の組成物。
4. ４．活性成分として、少なくとも１つの次式１：【配列があります】（１） ここで、Ｐｈｅはフェニルアラニンを表し、ａＴｈｒはアロースレオニンを表し 、 Ａｌａはアラニンを表し、 糖は３，４−ジ−Ｏ−メチルラムノースであり、オリゴ糖は次の構造を有する： ３，４−ジ−Ｏ−メチルラムノース−ラムノース−６−デソキシタロース、そし て Ｒ−ＣＯ−は脂肪酸のアシル基であり、ここで、３，４−ジ−Ｏ−メチルラムノ ース基は、ａＴＨｒおよびアラエノールのそれぞれにグリコシド結合によって結 合され、そしてアラニンのＣ末端ＣＯＯＨ基はアミド結合によってアラエノール に結合される の糖ペプチド脂質を含むことを特徴とする前記請求項のいずれか１項に記載の組 成物。
5. ５．Ｒ−ＣＯ−が、少なくとも１６個の炭素原子を有する脂肪酸のアシル基を表 すことを特徴とする請求項４記載の組成物。
6. ６．Ｒ−ＣＯ−が、３６個未満の炭素原子を有する脂肪酸のアシル基を表すこと を特徴とする請求項５記載の組成物。
7. ７．該脂肪酸が、１以上の二重結合および／または分枝および／またはベータ− ヒドロキシもしくはベータ−メトキシ置換基を含むことを特徴とする請求項５ま たは６に記載の組成物。
8. ８．該誘導体が、脱アセチル化された誘導体であることを特徴とする前記請求項 のいずれか１項に記載の組成物。
9. ９．上記の少なくとも１つの式（１）の化合物が、合成または半合成によって得 られるものであることを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項に記載の組成物 。
10. １０．ゲルカプセル、錠剤、粉末、坐薬、歯肉のベースト、もしくはクリームま たは、鼻もしくは結膜による投与に適した組成物の形状に製造されることを特徴 とする前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
11. １１．液体薬剤媒体中の懸濁物の形状または凍結乾燥物の形状に製造される請求 項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
12. １２．有効量の防腐剤および／または界面活性剤をさらに含むことを特徴とする 前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
13. １３．活性成分を、組成物全重量に対して０．０２〜８％の量で含むことを特徴 とする前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
14. １４．非特異的免疫刺激薬もしくは同化作用薬の製造における活性成分として、 ワクチンの製造におけるアジュバントとしてまたは栄養組成物の製造における添 加物として、請求項１〜９のいずれか１項に記載の、Ｍ．ケロナエのＧＰＬｐの 少なくとも部分的に精製された画分を使用する方法。
15. １５．抗癌療法の免疫抑制効果を矯正することを意図した薬の製造における請求 項１４記載の方法。