JPH05137600A - ビブリオ属細菌を検出するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ビブリオ菌の特異的検出のための核酸組成物
及びその使用方法を提供する。 【構成】 非ビブリオ菌のrRNA又はrDNAよりもビブリオ
菌のrRNA又はrDNAに優先的にハイブリダイズできる、10
ないし 250ヌクレオチドを含む核酸組成物を、サンプル
中のビブリオ菌を検出する方法に使用する。該方法は、 ａ）該核酸組成物にサンプルを接触させること； ｂ）該サンプル及び核酸組成物をハイブリダイゼーショ
ン条件にして、ビブリオ菌のrRNA又はrDNAの存在下でハ
イブリダイゼーション産物を形成させること；及び ｃ）当該ハイブリダイゼーション産物の存在を、ビブリ
オ菌の存在を指示するものとして検出すること、 を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビブリオ（Vibrio）属
に属する細菌を検出するための組成物及び方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】以下の定義は、本発明の理解を容易にす
るために提供するものである。

【０００３】ここで用いる“ビブリオ”という用語は、
バーゲイ（Bergey）の細菌分類学マニュアル（N.R.クリ
ーグ（N.R.Krieg)編、1984年、第516-538 頁、ウイリア
ムズアンドウイルキンズ社）に分類されているような細
菌を言う。ビブリオの検出は多様な医療及び公衆衛生関
係において重要である。ビブリオはヒトの疾病の重要な
病原体である。ビブリオ菌は、単純な胃腸炎から重症の
疾患に及ぶ多様な病理学的状態をもたらしうる。

【０００４】“標的”又は“標的分子”という用語は、
診断上では、興味を引く分子、すなわち、人がその存在
を知りたがっている分子を意味する。治療上では、“標
的”又は“標的分子”という用語は疾病又は疾病を引き
起こす微生物に関連する分子を意味する。

【０００５】本出願で用いる“生物学的結合ペア”とい
う用語は、相互に親和性又は結合力を示す何らかの分子
ペアを意味する。生物学的結合ペアは結合条件下では複
合体を形成する事ができる。本出願の目的において、
“リガンド”という用語は生物学的結合ペアの一方の分
子を意味し、“アンチリガンド”又は“受容体”という
用語は該生物学的結合ペアのもう一方の分子を意味する
ことになる。例えば、非限定的に、本発明の態様は生物
学的結合ペアが二個の相補的核酸を含む核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイに応用できる。一方の核酸がリガ
ンドとされ、他方の核酸がアンチリガンド又は受容体と
される。該核酸の一方が標的分子であってもよい。リガ
ンド又はアンチリガンドの指定は任意の便宜上の問題で
ある。生物学的結合ペアは、ごく数例を挙げると、抗原
と抗体、薬物と薬物受容体部位、及び酵素と酵素基質等
を含んでもよい。

【０００６】“プローブ”という用語は標的アンチリガ
ンド又は受容体に選択的に結合できる周知の特性を持つ
リガンドを意味する。核酸に応用すると、“プローブ”
という用語は標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸
を意味する。プローブと標的は、結合条件下でプローブ
標的複合体を形成することができる。“プローブ”とい
う用語はここでは、診断上及び治療上の両方で用いら
れ、診断上では人がその存在の有無を知りたがっている
分子を結合できることを意味して、治療上では疾病に関
連する分子を結合できることを意味して用いられるであ
ろう。

【０００７】“ラベル”という用語は、非限定的な例と
して、放射性同位元素、酵素、発光剤、沈澱剤、及び染
料を含む、検出可能な化学的部分を意味する。この
“剤”という用語は、検出可能な応答を導く反応に参加
する何らかの化学的部分を含む、広い意味で用いられ
る。“コファクター”という用語は、該ラベルとの反応
に参加する何らかに化学的部分を含んで広く用いられ
る。

【０００８】“増幅する”という用語は広い意味で増幅
産物を作成することを言うのに用いられ、該増幅産物は
例えば、該標的分子に似た様式で機能することができる
他の標的分子若しくは標的様分子、又は該標的分子の代
わりに検出方法の対象となる分子を含んでもよく、これ
らの分子はサンプル中の該標的分子の存在によって作成
される。該標的がポリヌクレオチドである場合には、他
の標的分子若しくは標的様分子、又は検出の対象となる
分子は DNA又は RNAポリメラーゼで酵素的に作ることが
できる。

【０００９】“近接する”という用語は分子に隣接する
区域を意味する。例えば、第一のリガンドが受容体標的
分子に結合する生物学的結合ペアの場合、該第一のリガ
ンドに隣接し包囲する区域は開いており、第一のリガン
ドに近接する第二のリガンドに結合することができる。
核酸の分野では、第一のプローブがより大きな核酸標的
分子区域に結合すると、該標的分子の長さに沿った相互
に排他的な近接する区域が第二のプローブに結合するこ
とができ、該第二のプローブが第一のプローブに近接す
ることになる。該標的分子は鋳型として機能し、第一の
プローブ及び第二のプローブの位置を指示する。“実質
的に近接する”という用語は、機能的な意味として、接
触しなくとも隣接しなくともよく、又は部分的に重なり
合ってもよいが、部分、区域、断片等を協同関係にさせ
るよう機能する空間的配向を含むように使用される。

【００１０】“捕獲リガンド”という用語は、担体に結
合している捕獲アンチリガンドに特異的に結合すること
ができるリガンドを意味する。

【００１１】“担体”という用語は、単独で用いられる
場合、回収可能な担体とともにフィルター、ディップス
ティック及び膜等の通常の担体を含む。

【００１２】遺伝情報は生きた細胞中の DNAの糸状分子
中に保存されている。インビボでは、 DNA分子は二本の
相補的 DNA鎖の二重らせんであり、その各鎖はヌクレオ
チドの鎖である。各ヌクレオチドは四塩基：アデニン
(A) 、グアニン(G) 、チミン(T) 及びシトシン(C) ：の
うちの一個により示される。該塩基類は、官能基の配向
により一定の塩基対が水素結合及びπ−スタッキング
（π−stacking）相互作用を通じて互いに引き寄せ合い
結合するという意味において、相補的である。一方の D
NA鎖中のアデニンは反対側の相補鎖中のチミンと対を成
す。一方の DNA鎖中のグアニンは反対側の相補鎖中のシ
トシンと対を成す。 RNA中では、チミン塩基がウラシル
(U) で置き換えられ、ウラシルが反対側の相補鎖中のア
デニンと対を成す。生きた微生物の遺伝コードは DNA鎖
上の塩基対配列中に伝えられる。

【００１３】DNA分子は共有結合したデオキシリボヌク
レオチド鎖から成り、 RNA分子は共有結合したリボヌク
レオチド鎖から成る。各核酸はヌクレオチドの糖の 5´
−水酸基と隣接するヌクレオチドの糖の 3´−水酸基の
間のホスホジエステル架橋によって結合している。核酸
の末端はしばしば末端官能基に関して、 5´−末端又は
3´−末端と呼ばれる。 DNA及び RNAの相補鎖は、一方
の鎖の 3´−末端が反対側の鎖の 5´−末端に向いてい
る逆平行複合体を形成する。

【００１４】核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、
その相補的領域で対を成しハイブリッドを形成する二本
の核酸鎖の性質に基づく。そのようなハイブリッドの構
成はこのハイブリダイゼーションが行われる条件（時に
よりストリンジェンシィ（stringency）と呼ばれる）を
該配列が正確に相補的でなければハイブリダイゼーショ
ンが起こらないように調整することにより、非常に特異
的に作ることができる。サンプルからの全核酸がニトロ
セルロース膜等の固体担体上に固定される場合、該サン
プル中の特定の“標的”配列の存在は、ラベルを持つ相
補的核酸“プローブ”の結合により測定することができ
る。該担体の洗浄によってハイブリダイズしていないプ
ローブを除去した後、標的の量を存在する検出可能部分
の量によって測定する。

【００１５】核酸プローブは設計又は選択により、ハイ
ブリダイゼーション条件下で特異的且つ優先的にそれら
を標的核酸配列にハイブリダイズさせる特異的ヌクレオ
チド配列を含む。“優先的”という用語は、あるハイブ
リダイゼーション反応産物が同等の条件下で別の一個よ
りも安定であるという相対的な意味で用いる。幾つかの
条件下で、ある標的に関してハイブリダイゼーション反
応産物を形成することができるが、別の潜在的な結合パ
ートナーに関しては形成できない。

【００１６】最大2500ヌクレオチドまでの非常に長い核
酸組成物がプローブとしての使用を示唆されてきたが、
より小さな核酸のほうが有利であることを示唆する実際
的な考察がなされている。最低10ヌクレオチドが統計的
に特異性を得て安定なハイブリダイゼーション産物を形
成するために必要である。最大 250ヌクレオチドは、不
適当に組み合わされた配列及び優先的なハイブリダイゼ
ーションを測定するために反応パラメーターを現時点で
容易に調整及び調節することができるほぼ上限の配列を
表す。最大 250ヌクレオチドは、大抵の DNA及び RNA合
成装置の上限も表している。最も好ましくは、プローブ
配列は20ないし60ヌクレオチドを有する。

【００１７】ハイブリダイゼーション条件は、二核酸間
の誤った対のレベル及び外形とともに、プローブ／標的
二本鎖の塩基組成によって規定される。10ないし 250塩
基の核酸に対する通常のハイブリダイゼーション条件
は、1.08M 塩化ナトリウム、60mMリン酸ナトリウム、及
び６mMエチレンジアミン四酢酸（pH 7.4）の存在中で約
60℃の温度である。

【００１８】通常調整される反応パラメーターには、該
ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン核種の
濃度と型、存在する変性剤の型と濃度、及びハイブリダ
イゼーション温度が含まれる。一般に、ハイブリダイゼ
ーション条件がよりストリンジェントになるほど、安定
なハイブリッドを形成すべき場合にはより長いプローブ
が好ましい。当然の結果として、ハイブリダイゼーショ
ンが行われることになる条件のストリンジェンシィが
（例えば、行われるアッセイの型に基づいて）使用され
る好ましいプローブの一定の性質を指定することになろ
う。このような関係は当業者には周知であり、容易に操
作できる。

【００１９】リボゾームは全ての生物にとって非常に重
要である。リボゾームは遺伝情報を、生命の主要な構造
要素及び触媒要素である細胞蛋白に翻訳する、唯一の既
知の手段として働く。この重要性を明らかに示すのが、
あらゆる細胞がリボゾームを持っているという観察であ
る。

【００２０】細菌性リボゾームは三個の別個の RNA分子
を含み、それらは少なくともエシェリヒア・コリ（大腸
菌；Escherichia coli）では5S、16S 及び 23S rRNA と
呼ばれる。真核生物では、四個の別個のrRNA種があり、
一般に5S、18S、28S 及び5.8Sと呼ばれる。これらの命
名は歴史的に、沈降速度によって決定される RNA分子の
サイズに相関している。しかしながら実際上は、リボゾ
ームRNA 分子は生物間でサイズが実質的に異なってい
る。それでも、5S、16S 及び 23S rRNA が相同のRNA 分
子に対する属名としてどの細菌でも使用されており、こ
こでもこの慣例に従うことにする。本発明のプローブは
生殖性マイコプラズマの16S及び23S rRNA分子を標的と
する。 16S及び23S rRNAの一次及び二次構造に関する詳
細な考察は、ギューテルら（Gutell,et al.)（プログレ
ス・イン・ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Progres
s in Nucleic Acid Research) 、32巻、1985年）及びギ
ューテルとフォックス（Gutell and Fox）（ヌクレイッ
ク・アシッヅ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、16
巻付録、1988年）に見ることができよう。

【００２１】コーネら（Kohne et al.，バイオフィジカ
ル・ジャーナル（Biophysical Journal)、８巻、第1104
-1118 頁、1968年）はrRNA配列に対するプローブの一製
造法を考察している。

【００２２】ペースとキャンベル（Pace and Campbell,
ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ（Journal of Bac
teriology)、 107巻、第 543-547頁、1971年）は多様な
細菌種からのリボゾームリボ核酸の相同性及びそのよう
な相同性レベルを定量するためのハイブリダイゼーショ
ン法を考察している。同様に、ソギンら（Sogin et a
l., ジャーナル・オブ・モリキュラー・エボリューショ
ン（Journal of Molecular Evolution）、１巻、第 173
-184頁、1972年）は、系統発生関係の評価において種々
のリボゾームRNA 分子の一次構造特性を使用する際の理
論面と実際面を考察している。

【００２３】フォックスら（Fox et al., インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジィ（International Journal of Systematic Ba
cteriology）、1977年）は原核生物分類法へのアプロー
チとして 16SリボゾームRNAの比較目録を考察してい
る。

【００２４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ビブリオ属
に属する細菌の検出に関する。より詳しく言えば、本発
明の態様はビブリオ菌の特異的検出のための核酸組成物
及びその使用方法を提供する。

【００２５】

【課題を解決するための手段】本発明の一態様は、非ビ
ブリオ菌のrRNA又はrDNAよりもビブリオ菌のrRNA又はrD
NAに優先的にハイブリダイズすることができる、10ない
し 250ヌクレオチドを含む核酸組成物を特徴とする。

【００２６】好ましくは、該核酸は 132-154、154-167
、446-488 、580-761 、614-626 、896-903 及び1123-
1149 から成る領域群から選択された 16S rRNA 又はrDN
Aの領域に優先的にハイブリダイズすることができる。
本発明の組成物は一個以上のビブリオ菌、ビブリオ・ア
ルギノリティクス（V.alginolyticus)、ビブリオ・キャ
ンベリイ（V.campbellii）、ビブリオ・プロテオリティ
クス（V.proteolyticus)、ビブリオ・パラヘモリティク
ス（V.parahaemolyticus）、ビブリオ・ホリセ（V.holl
isae）、ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)、ビ
ブリオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）、ビ
ブリオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）、ビブリオ・
ハーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲンス
（V.natriegens）、に優先的にハイブリダイズすること
ができる。

【００２７】本発明の別の態様は、ビブリオ・アルギノ
リティクス（V.alginolyticus)、ビブリオ・キャンベリ
イ（V.campbellii）、ビブリオ・プロテオリティクス
（V.proteolyticus)、ビブリオ・パラヘモリティクス
（V.parahaemolyticus）、ビブリオ・ホリセ（V.hollis
ae）、ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)、ビブ
リオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）、ビブ
リオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハ
ーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲンス
（V.natriegens）から成るビブリオ菌群から選択された
一個以上のビブリオ菌のrRNA又はrDNAに、同じ群の選択
されていないビブリオ菌のそれよりも優先的にハイブリ
ダイズすることができる、10ないし 250ヌクレオチドを
含む核酸組成物を特徴とする。該核酸は、73-100、180-
196 及び455-477 から成る領域群から選択された16S rR
NA又はrDNAの領域に優先的にハイブリダイズすることが
できる。

【００２８】本発明の別の態様は、非ビブリオ菌のrRNA
又はrDNAよりもビブリオ菌のrRNA又はrDNAに優先的にハ
イブリダイズすることができる、10ないし 250ヌクレオ
チドを含む核酸にサンプルを接触させる処理を含む、サ
ンプル中のビブリオ菌を検出する方法を特徴とする。サ
ンプル及び核酸をハイブリダイゼーション条件にして、
ビブリオ菌のrRNA又はrDNAの存在下でハイブリダイゼー
ション産物を形成させる。該ハイブリダイゼーション産
物は、ビブリオ菌の存在を指示するものとして検出され
る。

【００２９】好ましくは、本方法の核酸は 132-154、15
4-167 、446-488 、580-761 、614-626 、896-903 及び
1123-1149 から成る領域群から選択された 16S rRNA 又
はrDNAの領域に優先的にハイブリダイズすることができ
る。本発明の態様はビブリオ・アルギノリティクス（V.
alginolyticus)、ビブリオ・キャンベリイ（V.campbell
ii）、ビブリオ・プロテオリティクス（V.proteolyticu
s)、ビブリオ・パラへモリティクス（V.parahaemolytic
us）、ビブリオ・ホリセ（V.hollisae）、ビブリオ・ア
ンギラルム（V.anguillarum)、ビブリオ・ジアゾトロフ
ィクス（V.diazotrophicus）、ビブリオ・ブルニフィク
ス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハーベイイ（V.harvey
i)及びビブリオ・ナトリーゲンス（V.natriegens）の存
在を検出することができる。

【００３０】本発明の別の態様は、ビブリオ・アルギノ
リティクス（V.alginolyticus)、ビブリオ・キャンベリ
イ（V.campbellii）、ビブリオ・プロテオリティクス
（V.proteolyticus)、ビブリオ・パラヘモリティクス
（V.parahaemolyticus）、ビブリオ・ホリセ（V.hollis
ae）、ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)、ビブ
リオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）、ビブ
リオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハ
ーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲンス
（V.natriegens）から成るビブリオ菌群から選択された
一個以上のビブリオ菌を、同じ群の選択されていないビ
ブリオ菌よりも優先的に、サンプル中に検出するための
方法を特徴とする。該方法は、選択されたビブリオ菌の
rRNA又はrDNAに、同じ群の選択されていないビブリオ菌
よりも優先的にハイブリダイズすることができる、10な
いし 250ヌクレオチドを有する核酸にサンプルを接触さ
せる処理を含む。サンプル及び該核酸組成物をハイブリ
ダイゼーション条件にして、選択されたビブリオ菌の存
在下でハイブリダイゼーション産物を形成させる。該ハ
イブリダイゼーション産物の検出は、選択されたビブリ
オ菌の存在を指示するものである。好ましくは、該核酸
は73-100、180-196 及び455-477 から成る群から選択さ
れた16S rRNA又はrDNAの一個以上の領域に優先的にハイ
ブリダイズすることができる。

【００３１】本発明の組成物はあらかじめ組立ててキッ
トの形態をとることができる。このようなキットはビブ
リオ菌の存在を検出するために使用してもよい。このよ
うなキットは通常、適当な収納容器中に保存された試
薬、付属装置及び使用説明書を含む。試薬はここで述べ
る組成物を含むことになる。

【００３２】本発明の他の面及び利点は、現時点におけ
る本発明の好ましい態様による以下の詳細な説明を考察
すれば明らかになるであろう。

【００３３】以下の実施例は、一定の好ましい手順に従
った本発明の実際の例を示すものである。

【００３４】

【実施例】

材料及び方法 微生物：検査する菌株を表１に掲げた。

【００３５】

【表１】 菌株はATCC要覧で推薦されている標準培地を用いて、GE
NE-TRAK システムズ社、フラミンガム、マサチューセッ
ツ、USA で培養した。培養条件を以下に簡単に示す： ビブリオ・キャンベリイ（V.campbellii） 海洋寒天培
地、室温、一晩 ビブリオ・ハーベイイ（V.harveyi) フォトバク
テリウム寒天培地、室温一晩 ビブリオ・アルギノリティクス（V.alginolyticus)３％
塩添加トリプチカーゼ大豆寒天培地（バクトビル塩［１
g/l ］プラス３％NaCl）、37℃、一晩 ビブリオ・ナトリーゲンス（V.natriegens）1.5%NaCl添
加栄養寒天培地、室温、一晩 ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum) 強化栄養寒
天培地、室温、一晩 ビブリオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）海
洋寒天培地、室温、一晩 ビブリオ・プロテオリティクス（V.proteolyticus)３％
NaCl添加栄養寒天培地、室温、一晩 ビブリオ・パラヘモリティクス（V.parahaemolyticus）
３％NaCl添加栄養寒天培地、37℃、一晩 ビブリオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）海洋寒天培
地、30℃、一晩 ビブリオ・ホリセ（V.hollisae） 海洋寒天培
地、30℃、一晩 16S rRNAの分離、抽出及び分析は先に述べられている
（レーン(Lane)、1991年）ように行い、凍結乾燥粉末と
して輸送し保存した。分離及び配列分析は先に述べられ
ている方法（レーンら（Lane etal.)、1985年；スタッ
ケブランド及びチャーフレイターグ（Stackebrandt and
Charfreitag）、1990年）に従った。配列を数種の対照
菌：ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)（バーレ
ら（Valleet al.）、1990年）、エシェリヒア・コリ（E
scherichia coli）、プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaris）、ルミノバクター・アミロフィルス（Rumin
obacter amylophilus）、シュードモナス・アエルギノ
ーザ（Pseudomonas aeruginosa）（デワヒターら（DeWa
chter et al.）、1990年）及び二種のバロフィリック株
（受託番号 X54744 及び X54745 、リーザックら（Lies
ack et al.）、1990年）からの配列の相同領域に合わせ
て整列した。系統発生分析を、IBM XT/AT 及び互換性の
あるコンピューター用に設計されたプログラムパッケー
ジ SAGE （テクノーマ、ハイデルベルグ、F.R.G.）の一
部として実行される計算法を用いてネイバリネス（neig
hborliness）法（フィッチ（Fitch)、1981年；サタス及
びトゥベルスキイ（Sattath and Tversky)、1977年）に
よって行った。

【００３６】結果及び考察 ８ビブリオ種の模式株及びビブリオ・ハーベイイ（V.ha
rveyi)ATCC 14084の16S rRNAの一次構造を、逆転写中の
cDNAの配列分析によって決定した。ビブリオ・アンギラ
ルム（V.anguillarum)の16S rRNAの配列（バーレら（Va
lleet al.）、1990年）は全分析に含まれた。この配列
は 418位にＣ残基を入れることにより補正されている
（R.ウィイク（R.Wiik) 、私文書）。表１に示す EMBL
受託番号で寄託されている配列は、完全なイー・コリ
（大腸菌； E.coli)の 16S rRNA 配列（ブロシウスら
（Brosius et al.) 、1978年）の約95.5％に対応する、
1463 及び 1481 の範囲のヌクレオチドが変異する連続
的区間から成る。

【００３７】属間関係を決定するために、該配列をガン
マサブクラスのプロテオバクテリアの６メンバーの相同
配列に合わせて整列した。基底は、ベータサブクラスの
メンバーを対照に用いて決定した。配列が未確定の領域
（76から111位、1008から1034位及び1446から1486位；
イー・コリ（E.coli）の命名法（ブロシウスら(Brosius
et al.、1978年）による）は分析から除外した。得ら
れた対式（pair-wise)間隔を表２の右上三角形に掲げて
いる。

【００３８】

【表２】 次に図１を見ると、全てのビブリオ属はガンマ-3微生物
（ウーズら（Woese etal.) 、1984年、による定義）の
核である他の二メンバー、すなわちイー・コリ（E.col
i) 及びプロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）
に近接する緊密な集団を形成する。北大西洋からのバロ
フィリックアイソレーツ（リーザックら（Liesack et a
l.）、1990年）、ルミノバクター・アミロフィルス（Ru
minobacteramylophilus）及びシュードモナス・アエル
ギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、このうち後者の
二種はガンマ-3サブクラスの周辺標本と考えられている
が、これら三種はより離れた関係にある。この枝分かれ
パターンは、 16S rRNA 目録（スタッケブランド及びウ
ーズ（Stackebrandt and Woese）、1981年；ウーズら
（Woese et al.) 、1984年）及び 5S rRNA配列（マクド
ネルら（MacDonell et al.) 、1986年）に由来するもの
に調和している。 5S rRNAデータについて既に考察され
ているように（マクドネルら（MacDonell et al.) 、19
86年）、ビブリオ集団の系統発生的な奥行きは、エシェ
リヒア（Escherichia ）及びプロテウス（Proteus)がこ
の族の中で系統発生的に最も異なった属であること（ブ
レナーら（Brenner et al.) 、1981年；マクドネルら
（MacDonell et al.) 、1986年）を考えると、エンテロ
バクテリアセア（Enterobacteriaceae）集団のそれに匹
敵する。

【００３９】多少の関係を持つ属からビブリオ属が明白
に分離されていることは、 16S rRNA の二次構造に属特
異性の特徴が現れることでも表現される（後掲の表３参
照）。しかしながら、ガンマ-3微生物の公表されている
16S rRNA 配列のデータベースが小さいことが思い出さ
れ、いわゆる“特異的”特徴は他の配列が得られるにつ
れて薄れるかもしれない。

【００４０】系統発生枝分かれパターンを決定するため
に、イー・コリ（E.coli) 配列をグループ外対照として
使用した。該対式間隔（ハミング）を表２の左下三角形
に示す。これらの十ビブリオ配列の間の全体の類似性は
85.6%である。七種は非常に関係が強いようであり、全
体の配列類似性は 91.3%である。これらの七種のうち、
ビブリオ・パラヘモリティクス（V.parahaemolyticus）
及びビブリオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）と同様
に、ビブリオ・アルギノリティクス（V.alginolyticu
s)、ビブリオ・キャンベリイ（V.campbellii）、ビブリ
オ・ハーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲ
ンス（V.natriegens）は系統発生的により強固なグルー
プを形成し、ビブリオ・プロテオリティクス（V.proteo
lyticus)はこれらの二グループの中間に枝分かれしてい
る。ビブリオ（リストネラ）・アンギラルム（V(Liston
ella).anguillarum)、ビブリオ・ジアゾトロフィクス
（V.diazotrophicus）及びビブリオ・ホリセ（V.hollis
ae）は独立した系統サブラインを表しており、後者の種
はビブリオ属の中で最も新しい枝分かれを表している。

【００４１】ビブリオの核となる微生物の集団分けは全
般的に DNA再結合実験の結果に相関する。特にビブリオ
・ハーベイイ（V.harveyi)、ビブリオ・キャンベリイ
（V.campbellii）及びビブリオ・アルギノリティクス
（V.alginolyticus)がグループを成すことは、ビブリオ
・ブルニフィクス（V.vulnificus）及びビブリオ・プロ
テオリティクス（V.proteolyticus)がより分離した位置
を占めることと同様に、確認される（ライヘルトら（Re
ichelt et al.)、1976年；バウマンら（Bauman eta
l.)、1983年も参照のこと）。ビブリオ・パラヘモリテ
ィクス（V.parahaemolyticus）の位置ははっきりしな
い。この種はビブリオ・アルギノリティクス（V.algino
lyticus)と非常に関係が深いことが示されているが（ 6
5%の DNA類似性；ライヘルトら（Reichelt et al.)、19
78年、による）、 16S rRNA の類似性によれば、それは
ビブリオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）と集団を成
す。より最近の DNA/DNAハイブリダイゼーション試験
（モリトリスら（Molitoris et al.) 、1989年）では、
しかしながら、ビブリオ・パラヘモリティクス（V.para
haemolyticus）及びビブリオ・アルギノリティクス（V.
alginolyticus)はさほど近い関係にないこと、すなわち
最適且つストリンジェントな再結合条件下でそれぞれ約
45％及び22％であることが見出された。スーパーオキシ
ドジスムターゼの免疫学的関係では、独自のグループを
形成するビブリオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）を
例外として、rRNA分析により検査されたビブリオ属の核
となる微生物は全て同じ集団を成す（バウマンら（Baum
an et al.)、1983年）。ビブリオ属の核となる微生物の
16S及び5S rRNA 枝分かれパターンの比較から、DNA 対
合及び 16S rRNA 分析からの結果の比較で見出された、
より重大な相違点が明らかにされる。マクドネルら（Ma
cDonell et al.) 、1986年、により作られた5SrRNA 樹
の位相は、ビブリオ・パラヘモリティクス（V.parahaem
olyticus）、ビブリオ・アルギノリティクス（V.algino
lyticus)、ビブリオ・ナトリーゲンス（V.natriegens）
及びビブリオ・プロテオリティクス（V.proteolyticus)
のみがビブリオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophic
us）と同様に緊密な集団を形成すると見なしている。主
要成分分析における類似度を用いると、該関係はビブリ
オ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）が、ビブ
リオ・ハーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ブルニフ
ィクス（V.vulnificus）と同じ位、核となる種との関係
が薄いという点において変化してくる。より最近の樹
（コレウェルら（Colewell et al.)、1990年）では、ビ
ブリオ・ハーベイイ（V.harveyi)は核となる微生物と集
団を成す（16S rRNA 分析と同様）。

【００４２】分子分類試験における一貫した知見は、ビ
ブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)と核となる該微
生物類の間には近縁関係はない、というものである。主
要成分分析（マクドネルら（MacDonell et al.) 、1986
年）及び DNA再結合実験から、この種が分離した位置に
あることが明らかになり、これによりビブリオ・アンギ
ラルム（V.anguillarum)及び関連する種、すなわちビブ
リオ・ダムセルズ（V.damsels)及びリストネラ・ペラギ
ア（L.pelagia)を収容する新しい属、リストネラ（List
onella）の記載を導いた（マクドネル及びコルウェル
（MacDonell andColwell)、1985年）。しかしながら、
ヒトの下痢の原因らしいと述べられている（Hickman et
al.、1982年) ビブリオ・ホリセ（V.hollisae）は、他
のビブリオ種に対して有意な DNAの類似性がないこと
（Hickman et al.、1982年) 及び本試験の結果から示さ
れるように、進化論的に、核となる該微生物類からビブ
リオ・アンギラルム（V.anguillarum)よりもさらに離れ
ている。系統発生学的見地から見ると、属としてのリス
トネラが分類学者に認められるならば、ビブリオ・ホリ
セ（V.hollisae）は属のランクに格上げすべきである。

【００４３】16S rRNA 樹におけるビブリオ・ジアゾト
ロフィクス（V.diazotrophicus）の位置は議論の予知が
ある。この種は先に述べたように主要成分分析ではビブ
リオ属の核となる微生物の枠の外にグループを成す（マ
クドネルら（MacDonell et al.) 、1986年）が、5S rRN
A の類似性データにフィッチ及びマーゴリアシュ（Fitc
h and Margoliash，1968年）の計算法を使用すると、こ
の種はビブリオ・プロテオリティクス（V.proteolyticu
s)と近縁関係にあるらしい。低い DNA類似度（ゲーリノ
ットら（Guerinot et al.)、1982年）及び表現学的数値
分析の結果（ウェストら（West et al.)、1985年；1986
年）からビブリオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotroph
icus）の分離した位置が確認された。この種が核となる
微生物類に属さないという結論の証拠は脂肪酸組成物の
分析に基づいている。ウルダシら（Urdaci et al. 、19
90年）は、ビブリオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotro
phicus）にはビブリオ・アンギラルム（V.anguillaru
m)、ビブリオ・フィシェリ（V.fischeri）、ビブリオ・
ガゾゲネス（V.gazogenes)、ビブリオ・ダムセラ（V.da
msela)及びビブリオ・オルダリイ（V.ordalii)と同様
に、ビブリオ属の核となるメンバーには単独又は互いの
組合せとして存在する12:0- 、17:0- 及び17:1-型の脂
肪酸が存在しないことを示した。

【００４４】水、魚、マッセル及びカキに由来するヒト
病原菌（ブレイクら（Blake et al.) 、1984年; フッド
及びネス(Hood and Ness) 、1984年) に対する迅速な診
断方法が必要であることから、可変性の 16S rRNA 領域
は、合成オリゴヌクレオチドプローブ及び PCRプライマ
ーにとって魅力的な標的となる。

【００４５】

【表３】 次に表３を見ると、16S リボゾーム RNAの領域はビブリ
オ属に独特の特徴を持つことが期待される。該領域は 1
32位から 154位の範囲である。特に、 222位ないし 226
位の間に位置する区域とらせん構造の一部を形成する、
ヌクレオチド 137から 141(CUGAU) を含む区域を、相補
的核酸が非ビブリオ菌の rRNA及び rDNA よりも優先的
にハイブリダイズすることになる標的として使用しても
よい。このような核酸は 137から 141の配列又はその相
補物、及びそのような核酸にそのような標的区域への安
定で優先的なハイブリダイゼーションを行わせるような
他のヌイクレオチドを含むであろう。好ましくは、該核
酸は、その位置がビブリオ菌に特異的である 132位から
154位にわたる配列を含む。

【００４６】16S rRNA に基づく最初のビブリオに対す
る種特異的プローブは、ビブリオ・アンギラルム（V.an
guillarum)に対して（レーンスタンら（Rehnstam et a
l.)、1988年） 431位及び 455位（イー・コリ（E.coli)
における番号）の範囲を標的として設計されていた。
他のビブリオ種の相同領域と比較すると、唯一の相違点
はビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)の配列中の
434位にＵ残基が存在することである。他のビブリオ種
は全てＣ残基を有する（ 408位及び 434位における G-C
から A-Uへのトランジション）。該プローブは本試験に
含まれるいずれの種に対しても試験されてはいないが、
変化したヌクレオチドの位置が該プローブの 3´末端近
くであることは、それが他の種株の rRNAに結合するの
を非常に困難にしている。

【００４７】

【表４】 次に表４を見ると、三個のより高度に可変性の領域が73
位から 100位、 180位から 196位及び 455位から 477位
に見出される。一定のペアは同等の又は非常に類似性の
高い配列を有しているが、これらの領域が本試験で検査
される各種間の識別を可能にする。これらの差異は、そ
の選択性が予想できるほど十分に大きく見える（20マー
のプローブ内の一個のヌクレオチドの差異が、近縁種間
のストレプトミセス属（ウィットら（Witt et al.)、19
90年) 及びミコバクテリウム・レプラ（M.leprae) （リ
ーザックら（Liesack et al.);スタッケブラントら（St
ackebrandt et al.)を選択的に検出するのに用いられて
きた。興味深いことに、ユーバクテリアの 16S rRNA の
最も可変性の高い領域のひとつ、すなわち 465位（イー
・コリ（E.coli) における番号）付近は、ビブリオ・キ
ャンベリイ（V.campbellii）、ビブリオ・アルギノリテ
ィクス（V.alginolyticus)、ビブリオ・ハーベイイ（V.
harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲンス（V.natriegen
s）において同じ配列を示す。

【００４８】三個の可変領域間の 100、180 及び 280ヌ
クレオチドのいずれかである距離は、いずれか二つの領
域が PCRプライマーの標的部位として機能する PCR診断
に利用するのに十分なだけ大きい（ボーディングハウス
ら（Boeddinghaus et al.)、1990年）。少なくとも一定
の菌株については、該標的領域間の差異は、この最新の
同定用具の利用を奨励するのに十分なだけ大きい。グラ
ム陰性菌から DNAが容易に抽出できることが、環境中の
病原ビブリオ種の迅速な診断を容易にするであろう。

【００４９】さらに、本発明のプローブは組み合わせて
サンドイッチアッセイに使用することができる。典型的
なサンドイッチアッセイでは、検出プローブ及び捕獲プ
ローブをサンプルに接触させる。捕獲プローブは、担体
上のアンチリガンドに結合することができるリガンドを
含む。検出プローブはラベルを含む。該捕獲プローブ及
び検出プローブのうちの最低一プローブが、ビブリオ菌
の rRNA 又は rDNA に優先的にハイブリダイズすること
ができる。残りのプローブはビブリオ菌の rRNA 又は r
DNA に優先的にハイブリダイズしてもよいが、或いは最
低一プローブが望ましい特異性を持つならば、残りのプ
ローブは多数の微生物の rRNA 又は rDNA に結合できて
もよい。

【００５０】該検出プローブ及び捕獲プローブは、ビブ
リオ rRNA 又は rDNA の存在下で、検出プローブ−捕獲
プローブ−標的複合体を含むハイブリダイゼーション産
物を形成させられる。該検出プローブ及び捕獲プローブ
は、該標的の実質的に近接する区域に結合する。該複合
体は担体上に捕獲され、該担体の非結合物質を洗い落と
す。

【００５１】該担体、又は該複合体の一部としての検出
プローブを含む該担体からの溶出液をモニターして、該
標的の存在を指示するものとして該検出プローブを検出
する。

【００５２】該ラベルは、通常利用されている検出可能
ないずれの手段を含んでもよい。さらに、該プローブ配
列は増幅可能な核酸中に含まれていてもよい。そのよう
な核酸の例には、酵素Q-ベータレプリカーゼによって複
製できるMDV-1配列が含まれる。

【００５３】このように、本発明はビブリオ属の細菌を
検出するための組成物及び方法を提供する。当業者は、
本発明が修正及び変更の対象となり、該修正及び変更が
特許請求の範囲で示される本発明の範囲内にあるものと
考えるべきであることを、容易に認めるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】ビブリオ菌の、エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgar
is）、バロフィリック・アイソレーツ（Barophilic iso
lates)、ルミノバクター・アミロフィルス（Ruminobact
er amylophilus）及びシュードモナス・アエルギノーザ
（Pseudomonas aeruginosa）との関係を示す概略図であ
る。

【図２】ビブリオ・アルギノリティクス（V.alginolyti
cus)、ビブリオ・キャンベリイ（V.campbellii）、ビブ
リオ・ハーベイイ（V.harveyi)、ビブリオ・ナトリーゲ
ンス（V.natriegens）、ビブリオ・プロテオリティクス
（V.proteolyticus)、ビブリオ・ブルニフィクス（V.vu
lnificus）、ビブリオ・パラヘモリティクス（V.paraha
emolyticus）、ビブリオ・アンギラルム（V.anguillaru
m)、ビブリオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicu
s）及びビブリオ・ホリセ（V.hollisae）を含む種々の
ビブリオ種の関係を示す概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デービツド・ジヨセフ・レーン アメリカ合衆国マサチユーセツツ州01757， ミルフオード，オリオール・ドライブ ９

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非ビブリオ菌のrRNA又はrDNAよりもビブ
   リオ菌のrRNA又はrDNAに優先的にハイブリダイズするこ
   とができる、10ないし 250ヌクレオチドを含む核酸組成
   物。
2. 【請求項２】 当該核酸が 132-154、154-167 、446-48
   8 、580-761 、614-626 、896-903 及び1123-1149 から
   成る領域群から選択された16S rRNA 又はrDNAの領域に
   優先的にハイブリダイズすることができる、請求項１記
   載の組成物。
3. 【請求項３】 当該ビブリオ菌が、ビブリオ・アルギノ
   リティクス（V.alginolyticus)、ビブリオ・キャンベリ
   イ（V.campbellii）、ビブリオ・プロテオリティクス
   （V.proteolyticus)、ビブリオ・パラヘモリティクス
   （V.parahaemolyticus）、ビブリオ・ホリセ（V.hollis
   ae）、ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)、ビブ
   リオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）、ビブ
   リオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハ
   ーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲンス
   （V.natriegens）を含む、請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 ビブリオ・アルギノリティクス（V.algi
   nolyticus)、ビブリオ・キャンベリイ（V.campbelli
   i）、ビブリオ・プロテオリティクス（V.proteolyticu
   s)、ビブリオ・パラヘモリティクス（V.parahaemolytic
   us）、ビブリオ・ホリセ（V.hollisae）、ビブリオ・ア
   ンギラルム（V.anguillarum)、ビブリオ・ジアゾトロフ
   ィクス（V.diazotrophicus）、ビブリオ・ブルニフィク
   ス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハーベイイ（V.harvey
   i)及びビブリオ・ナトリーゲンス（V.natriegens）から
   成るビブリオ菌群から選択された一個以上のビブリオ菌
   のrRNA又はrDNAに、同じ群の選択されていないビブリオ
   菌のそれよりも優先的にハイブリダイズすることができ
   る、10ないし 250ヌクレオチドを含む核酸であって、73
   -100、180-196 及び455-477 から成る領域群から選択さ
   れた16S rRNA又はrDNAの領域に優先的にハイブリダイズ
   することができる核酸組成物。
5. 【請求項５】 サンプル中のビブリオ菌を検出する方法
   であって、以下の処理： ａ）非ビブリオ菌のrRNA又はrDNAよりもビブリオ菌のrR
   NA又はrDNAに優先的にハイブリダイズすることができ
   る、10ないし 250ヌクレオチドを含む核酸に該サンプル
   を接触させること； ｂ）該サンプル及び核酸をハイブリダイゼーション条件
   にして、ビブリオ菌のrRNA又はrDNAの存在下でハイブリ
   ダイゼーション産物を形成させること；及び ｃ）当該ハイブリダイゼーション産物の存在を、ビブリ
   オ菌の存在を指示するものとして検出すること、 を含む方法。
6. 【請求項６】 当該核酸が 132-154、154-167 、446-48
   8 、580-761 、614-626 、896-903 及び1123-1149 から
   成る領域群から選択された16S rRNA 又はrDNAの領域に
   優先的にハイブリダイズすることができる、請求項５記
   載の方法。
7. 【請求項７】 当該ビブリオ菌が、ビブリオ・アルギノ
   リティクス（V.alginolyticus)、ビブリオ・キャンベリ
   イ（V.campbellii）、ビブリオ・プロテオリティクス
   （V.proteolyticus)、ビブリオ・パラヘモリティクス
   （V.parahaemolyticus）、ビブリオ・ホリセ（V.hollis
   ae）、ビブリオ・アンギラルム（V.anguillarum)、ビブ
   リオ・ジアゾトロフィクス（V.diazotrophicus）、ビブ
   リオ・ブルニフィクス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハ
   ーベイイ（V.harveyi)及びビブリオ・ナトリーゲンス
   （V.natriegens）を含む、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 ビブリオ・アルギノリティクス（V.algi
   nolyticus)、ビブリオ・キャンベリイ（V.campbelli
   i）、ビブリオ・プロテオリティクス（V.proteolyticu
   s)、ビブリオ・パラヘモリティクス（V.parahaemolytic
   us）、ビブリオ・ホリセ（V.hollisae）、ビブリオ・ア
   ンギラルム（V.anguillarum)、ビブリオ・ジアゾトロフ
   ィクス（V.diazotrophicus）、ビブリオ・ブルニフィク
   ス（V.vulnificus）、ビブリオ・ハーベイイ（V.harvey
   i)及びビブリオ・ナトリーゲンス（V.natriegens）から
   成るビブリオ菌群から選択された一個以上のビブリオ菌
   を、同じ群の選択されていないビブリオ菌よりも優先的
   に、サンプル中に検出するための方法であって、以下の
   処理： ａ）上記の群の選択されていないビブリオ菌よりも選択
   されたビブリオ菌のrRNA又はrDNAに優先的にハイブリダ
   イズすることができる、10ないし 250ヌクレオチドを含
   む核酸に該サンプルを接触させること、ここで、当該核
   酸は73-100、180-196 及び455-477 から成る領域群から
   選択された16S rRNA又はrDNAの一個以上の領域に優先的
   にハイブリダイズすることができる； ｂ）該サンプル及び核酸をハイブリダイゼーション条件
   にして、選択されたビブリオ菌の存在下でハイブリダイ
   ゼーション産物を形成させること；及び ｃ）当該ハイブリダイゼーション産物を、選択されたビ
   ブリオ菌の存在を指示するものとして検出すること、 を含む方法。