JPH04506002A - 改良されたプライマー伸長反応 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良されたプライマー伸長反応 １１立且１ この発明は、エネルギー部門からの認可（認可番号ＤＥ−ＳＧ０２−８８ＥＲ６ ０６８８）及び公衆衛生局の認可第Ａｌ−０６０４５号を含む政府の援助により なされた。米国政府は、この発明に一定の権利を有する。

この出願は、Ｔａｂｏｒらの米国通し番号２１８．１０３（１９８８年７　′月 １２日出願、表題はＤＮＡ配列決定）の部分継続であり、それをこの明細書にお いて参考として援用する。

この発明は、ＤＮＡ配列決定又はポリメラーゼ饋反応等のプライマー伸長反応を 達成するための方法に関係する。　′ プライマー伸長反応において、−木調テンプレートＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮ Ａ）に相同性を有するオリゴヌクレオチドブライマーは、テンプレートＤＮＡへ のアニーリングを生じる。アニールした混合物に、次いで。

ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長してテンブレー）ＤＮＡに相補的なりＮ Ａ＃ＩＩを形成する条件において、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポ リメラーゼを与える。ＤＮＡ配列決定反応において、このプライマーは、塩基特 異的なプライマー伸長の停止を引き起こす鎖終結因子（ｃｈａｉｎ−ｔ＠ｒｍｉ ｎａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ　）　（例えば、ジデオキシヌクレオシド三リン酸） の存在下において伸長するｍ　Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、、７４．５４６３．１９７７年、ポリメラーゼ饋反応においては、 ２つのプライマーを提供するが、そのそれぞれは、２本鎖ＤＮＡ分子の反対側の 鎖に相補性を有する。プライマーが伸長した後、それらはそれらのテンプレート から分離され、追加のプライマーがテンプレート及び伸長したプライマーにアニ ールされる。追加のプライマーが、次いで、伸長する。

分離、アニーリング及び伸長のステップを、テンブレー）ＤＮＡのコピー数を増 幅するために繰り返す。

５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ２３９．４８７．１９８８年。

１し」上 第−の面において、この発明は、第二の一本鎖領域を有するテンプレート分子上 の第一の一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドプライマーの伸長において利用 するための溶液又はキットを叙述するが、この第−及び第二領域は相同である。

この溶液又はキットは、反応混合物においてこのテンプレートの第二の一本鎖領 域上のプライマーの第一の一本鎖領域の伸長を引き起こし得る第一の因子、及び 反応混合物中のどロリン酸のレベルを、第二の因子の存在しないときの伸長にお いて生じるレベルより下げることが出来る第二の因子を含む。

溶液とは、任意の水性及び／又は緩衝された、上記の成分を含む液体を意味する 。これらの成分は、それらの所望の機能を達成するのに十分な濃度で溶液中に存 在する０例えば、第一の因子は、溶液中のビロリン酸のレベルを下げるのに十分 な濃度で存在する。キットとは、この溶液の１つ以上の成分を別々に保持する容 器を意味する１例えば、篇−及び第二の因子はべつべつの容器中に、混合するの に適した溶液中に保持される。

オリゴヌクレオチドブライマーの伸長を引き起こすとは、一本鋼領域を有するオ リゴヌクレオチドブライマーが、テンプレートとして作用し、ヌクレオシド三リ ン酸の添加によりその上でオリゴヌクレオチドブライマーが伸長してテンプレー ト核酸と相同な核酸を形成し得る他の核酸分子とアニールするか、又は自然にア ニールした状態が生じる反応を達成することを意味する。一般に、伸長は、ＤＮ Ａポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼを与えて、共有結合的に、ヌクレオチド をプライマーに加えることを含意する。

反応混合物は、伸長反応を達成するのに適した任意の溶液又は固相である。一般 に、それは、伸長反応に必要なヌクレオシド又はデオキシヌクレオシド三リン酸 、及び金属イオンを含む液体！！＃液である。この混合物は、ＤＮＡ配列決定反 応に対する任意の標準緩衝因子又は等量の鎖終結因子をも含み得る。

ビロリン酸のレベルを下げるとは、反応混合物中のビロリン酸の量を、テンプレ ート上でのプライマーの伸長に殆ど又は有意の影響を与えない量に減らすことを 意味する、即ち、ビロリン酸のレベルはビロホスホロリシスを微々たるレベルに 下げるのに十分なだけ低い（３００μＭビロリン酸の存在において１０％より少 ないビロホスホロリシスのレベル）＠好ましくは、ビロリン酸のレベルは、２５ μＭ（より好ましくは、５μＭ）を下回るまで減じる。この段階は、ビロリン酸 の形成を阻害し、並びにそれを溶液から除去するように作用するピロホスファタ ーゼ等の因子の利用を含むことを意味する。

相同とは、２つの一本鎖領域が、それぞれのヌクレオチド間で十分な非共有結合 を形成して安定な２本鎖構造を、核酸のアニーリングに対して及びプライマー伸 長反応を達成するために通常用いられる条件下で形成し得ることを意味する。

好ましい実施態様において、第一の因子はＤＮＡポリメラーゼ（最も好ましくは フレノウから選択する）、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼ（即 ち、ファージ内におけるものと同様に、ＤＮＡポリメラーゼが宿主のチオレドキ シンをサブユニットとして必要とするポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメ ラーゼ又はＴ３、ΦＩ、ΦＩＩ、Ｈ，Ｗ３１、ｇｈ−１、Ｙ１ＡＡ１１２２又は Ｓｐ６のＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラ ーゼ、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素であり；第二の因子は、酵素（ 最も好ましくは、ピロホスファターゼ、例えば、６０〜９５℃での加熱に耐性の ピロホスファターゼ）である。

第二の面において、この発明は、第二の一本鎖領域を有するテンプレート分子上 の第一の一本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドブライマーを伸長させるための 改良された方法（テンプレート上のプライマーの伸長を引き起こし得る第一の因 子を供給することを含む）を叙述する。この改良は、第二の因子のないときの伸 長に際して生じる量を下回るまでビロリン酸の量を減じることの出来る第二の因 子により与えられる。

好ましい実施態様において、この方法は、少な（とも１つ又は２つの一本鎖領域 を有するオリゴヌクレオチドプライマー及び少なくとも１つ又は２つの一本鎖領 域を有するテンプレート分子を供給するステップ、及びプライマーとテンプレー トの一本鎖領域をアニールしてアニールした混合物を形成するステップを含む。

生成したアニールした混合物に第−及び第二の因子を供給してプライマーの伸長 を引き起こす。アニールした混合物に、ジデオキシヌクレオシド三リン酸をも与 えて良い、この方法は、更に、伸長の後で、テンプレートからプライマーを分離 するステップを含み、このプライマーの供給、伸長及び分離のステップを繰り返 す。

関連する面において、この発明は、反応においてビロリン酸塩の量を、因子が存 在しない場合のポリメラーゼ鎖反応に際して生じる量を下回るように減じること の出来る因子の存在下においてのポリメラーゼ鎖反応を達成することを含むＤＮ Ａの増幅方法を叙述する。好ましくは、その因子はピロホスファターゼである。

他の関連する面において、この発明は、Φ２９　ＤＮＡポリメラーゼ、増幅すべ きＤＮＡ、及びビロリン酸の量を因子が存在しない場合に生じる量を下回るよう に減じることの出来る因子を供給することを含むＤＮＡを増幅する方法を叙述す る。

出願人は、ビロホスホロリシス（オリゴヌクレオチド鎖の長さを減じる）はプラ イマー伸長反応に有害であるということを測定した。ビロホスホロリシスは、ビ ロリン酸塩の有効性により引き起こされる。例えば、ポリメラーゼ鎖反応は、Ｃ ｅｔｕｓ　（欧州特許出願０，２５８，０１７）及び５ａＬｋｉら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３９，４８７．１９８８により記載されたように、非常に低い濃度であ っても、ビロリン酸塩の添加により阻害される。このビロホスホロリシスは、ビ ロリン酸塩を除去することの出来る因子（例えば、ピロホスファターゼ）を供給 することにより阻止することが出来る。ポリメラーゼ鎖反応へのピロホスファタ ーゼの添加は、その反応の進行を大いに増大させ、ピロホスファターゼを伴わな い方法を用いた場合と比較してより優れた結果を与える。同様に、ピロホスファ ターゼのＤＮＡ配列決定反応への添加は、配列決定反応の生成物を同定するため に用いるポリアクリルアミドゲルにおいて形成されるバンドの強度においてより 一層の一様さを与える。この一様さは、ビロホスホロリシスによる特定のＤＮＡ 生成物の分解の阻止によるものである。

この発明の他の特徴及び利点は、下記の好ましい実施態様の説明から明らかとな るであろう。

ましい　熊　の百日 ピロホスホロリシス反応を阻止することの出来る任意の因子はこの発明において 有用である。ビロホスホロリシスを阻止する１つの方法は、ポリメラーゼ反応の 間に生成する如何なるビロリン酸塩をも、酵素ピロホスファターゼの添加により 分解することである。プライマー伸長反応への痕跡量のピロホスファターゼの添 加（溶液中のＤＮＡポリメラーゼ分子の十分の−のモル比）でさえ、ビロホスホ ロリシスを阻止することによりポリメラーゼ反応において生成されるオリゴヌク レオチド断片を完全に安定化する。この因子は、反応混合物中のどロリン酸塩の 加水分解を触媒し、ビロホスホロリシスへ導くであろうレベルにまでビロリン酸 塩が蓄積するのを阻止するであろう程度に、又は任意の他の方法におけるビロリ ン酸塩の蓄積を阻止するのに十分な濃度で添加されるべきである。この必要とさ れる因子の量は、標準技術により容易に決定することが出来る。

下記は、ポリメラーゼ鎖反応におけるピロホスファターゼの利用の実施例である 。この実施例は、この発明を制限しない二当業者は、任意のプライマー伸長反応 が上述の因子の添加により恩恵を受けるであろうことを認めるであろう。同様に 、下記の実施例におけるピロホスファターゼの利用は、この発明を制限せず、プ ライマー伸長反応における過剰のビロリン酸塩の効果を減じるのに適した他の因 子は、当業者により容易に同定される。この発明に適したプライマー、ＤＮＡポ リメラーゼ及びピロホスファターゼの相対的濃度は、常例的実験により容易に決 定することが出来、当業者には良く知られている。

ポリメラーゼ鎖反応においては高温（例えば、（６５〜９５℃の温度も普通に用 いられるが）９５〜１００℃の温度）が用いられるので、この発明において用い られるピロホスファターゼは高温での加熱に耐性であることが好ましい。従って 、６５〜９５℃での加熱に耐性のビロリン酸塩を供給することは有利である。そ のようなピロホスファターゼは、天然に、高温で生長し繁茂することの出来る任 意の細菌（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ　社田二」）から容易に得ることが出来る。

殆どの細菌は自然に生じるピロホスファターゼを有し、それ故、自然環境におい て高温で存在するそれらはこの酵素の適当な源である。

下記のようにＴａｑポリメラーゼを用いるポリメラーゼ鎮反応におけるピロホス ファターゼの利用は、反応を完全に行なう（即ち、供給したデオキシヌクレオシ ド三リン酸すべての消耗を引き起こす）ことを可能にする。

これは、ポリメラーゼ鎮反応を利用する診断技術を自動化することを可能にする 。反応の進行のアッセイは、デオキシヌクレオシド三リン酸からのリン酸塩の生 成又はＤＮＡの生成の測定（例えば、酸沈殿による）を含意し得る。その両者と も簡単且つ迅速なアッセイであり、ポリメラーゼ鎖反応の生成物を検出するため のゲルを行なうことの必要性の代わりである。

ＬＬｆＬＬ：ピロホスファターゼ　ＰＣＲ応この実施例においては、Ｍ１３Ｔｒ ｘ−Ｆと呼ばれるＤＮＡ　（実際の用いられるＤＮＡはこの発明においては重要 でない）を順方向及び逆方向プライマーを与えることにより、下記のポリメラー ゼ鎖反応を用いて増幅した。この方法は、一般に、５ａｉｋｉら（前掲）により 記載されている。０．４ピコモルの濃度におけるＴｒｘ−ＦＤＮＡを５１μｍト リス（ＬＭ、ｐＨ８，５）、ｔｏμｍ塩化マグネシウム（１５ｍＭ）、６．７μ ｌの４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（３ｍＭ）、１０μｌの順方向プライ マー（１０ピコモル、ＡＬＮより）、２０μ逆方向プライマー（１０ピコモル： 　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ　）　、　２　μｍゼラチン（０，５ ％）及び５５μｍ蒸留水と混合した。０．５μｍのＴａｑポリメラーゼ（１２ユ ニ　ッ　ト　、　Ｕ、Ｓ、Ｂ４ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、オ ハイオ　）を、次いで、加え、溶液を９４℃に１分間、５０℃に１分間そして７ ２℃に２分間加熱し、この加熱のサイクルを４０回繰り返した。同一の反応を、 様々な濃度（１２μｍ、３７μｍ、３３３μ１．及び１ｍＭ）のビロリン酸塩の 存在下で又は非存在下で、そしてピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ社製酵母無機 ピロホスファターゼ、カタログ番号ｌ−４５０３を精製しないで又はＦＰＬＣモ ノＱカラム上で精製してから用いた）の存在下で行なった。

他のピロホスファターゼの由来は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ酵母無機ピロホスフ ァターゼ（更なる精製はしない）である。

一般に、０．００１ユニツトの酵母無機ビロリン酸塩（４％ｇ）が、上記の反応 において適している。この量は、当然、かなり多くても良いし少なくても良い。

その濃度の範囲は、常例的実験により容易に決定される。必要な濃度は、ビロリ ン酸塩のレベルを約５５−５０ｕより低くまで下げるのに十分でありさえすれば 良い。

上記の反応において、ビロリン酸塩は、２５μＭ以上のレベルにおいてポリメラ ーゼ鎖反応を阻害した。ピロホスファターゼは、この阻害を逆転させ、ポリメラ ーゼ鎖反応生成物の生産を約２倍に刺激した。

及ｉ土ユニ　熱・　ピロホスファターゼの・これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｕ」工１ ｃｕｓの細胞からの無機ピロホスファターゼの精製の実施例である。Ｔ、　ｕ旦 且」の細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎから入手した。

１０リツトルの細胞を、Ｃｈｉｅｎら１．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２７．１５ ５０、（１９７６）の生長培地を用いて７０℃で生長させた。細胞を採集（〜２ ０ｇｍ）し、４０ｍ１の１０％シュークロース、５０　ｍ　Ｍ　トリスＨＣＩ、 ｐＨ７，５，５ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁（３回フレンチプレスを通して溶かす） し、そして細胞片を、Ｂｅｃｋｍａｎ　５０Ｔｉローターにおいての６０分間３ ０．Ｏ，ＯＯｒｐｍの遠心分離により除去した。上清をストレプトマイシン硫酸 塩で処理してＤＮＡを除去した。４ｍｌの４０％ストレプトマイシン溶液を４０ ｍ１の上清に加え、３０分間混合し、そして３０分間８．０００ｒｐｍで遠心分 離した。その結果の上清を、次いで、硫酸アンモニウムで処理した。６０％硫酸 アンモニウムではピロホスファターゼ活性は沈殿しなかったが、７０％硫酸アン モニウムによりすべて沈殿した：１９ｍ１の上清に７．２ｇｍの硫酸アンモニウ ムを加え（６０％）、３０分間混合し、８．ＯＯＯｒｐｍで３０分間回転させた 。その上清に、３ｇｍ硫酸アンモニウムを加え（７０％）、３０分間混合し、そ して８，０００ｒｐｍで３０分間回転させた。ペレットを２０ｍ１の　２　０　 ｍ　Ｍ　ト　リ　ス　−　Ｈｅｌ　ｐ　Ｈ７，５、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリ セロール、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）に再懸濁し、次いで 、２リツトルの緩衝液Ａに対して一晩透析した。透析物を、緩衝液Ａ中で平衡化 したＤＥＡＥＤＥ５２カラムを通し、３００ｍ１の緩衝液Ａ＋５０ｍＭＮａＣ１ で洗い、次いで、５０〜５００ｍＭＮａＣ１を含む緩衝液Ａの１リツトル勾配に おいて流した。ピロホスファターゼを１２５ｍＭＮａＣ１を含む緩衝液Ａにて溶 出した。溶出物（６０ｍＬ）を２リツトルの２０ｍＭＫＰＯ４ｐＨ７，４，１ｍ ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール（緩衝液 Ｂ）に対して透析し、緩衝液Ｂで平衡化したホスホセルロースカラム（ｌｏＯｍ ｌ）に載せた。すべてのピロホスファターゼ活性なカラムを通して流出させた。

この流出物を、次いで、２０ｍＭ）リスＨＣｌｐＨ７，０，１ｍＭＥＤ’ＴＡ、 ’　１０％グリセロール（緩衝液Ｃ）に対して透粧し、緩衝液ＣにおけるＦＰＬ ＣモノＱカラムにかけた。緩衝液Ｃにおいて、１００〜２５０ｍＭＮａＣ１を含 む勾配で分画し、ピロホスファターゼ活性を１８０ｍＭＮａＣＬにおいて溶出し た。ピロホスファターゼ活性を有する画分を２０ｍＭＫＰＯａ　ｐＨ７，４，０ ，１ｍＭＥＤＴＡ、５０％グリセロールに対して透析し、−２０℃において貯蔵 した。

このピロホスファターゼ活性は、４０サイクルのポリメラーゼ饋反応（各サイク ルは９５℃、１分間の加熱ステップを含む）によって影響を受けなかった。更に 、このピロホスファターゼは、ｄＮＴＰを加水分解せず、又、反応混合物中にお いて、ｄＮＴＰによって阻害されなかった。ピロホスファターゼ活性は、一般的 に、Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ、Ｃｈａｍ、２８．１７５６（１９５６）　及びＪｏ ｓｓａｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、、２４１．１９３ｇ　（１９６６１に記載され たようにしてアッセイした。

九五五１１１ 他の実施態様は下記の請求の範囲内にある０例えば、ＤＮＡプライマーよりも蛋 白質プライマーを利用する酵素、例えば、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（２本鎖Ｄ ＮＡを重合させる）を用いて、変性加熱ステップ又は再アニーリングステップを 必要とせずにＤＮＡを増幅することが出来るａ　Ｂｌａｎｃｏら、ＤＮＡ複製と 突然変異誘発、Ａ、Ｓ、Ｍ、１２章、　１９８ｇ。そのような増幅反応にピロホ スファターゼ（又はそれと同等の物）を含めることは、その系における増幅され たＤＮＡの収率を増大させるであろう。

国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．第一の１本鎖領域に相同な第二の１本鎖領域を有するテンプレート分子上の 第一の１本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドプライマーの伸長において用いる ための溶液であって、反応混合物中の前記のテンプレートの前記の第二の１本鎖 領域上の前記のプライマーの前記の第一の１本領領域の伸長を引き起こすことの 出来るＴａｑポリメラーゼ、Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラー ゼ、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素から選 択されるＤＮＡポリメラーゼ、及び前記の反応混合物中のピロリン酸塩の量を、 その因子の存在しない場合の前記の伸長に際して生じる量を下回るように減じる ことの出来る因子を含む溶液。
2. ２．前記のＴ７型ＤＮＡポリメラーゼがＴ７ＤＮＡポリメラーゼである、請求項 １に記載の溶液。
3. ３．前記の因子が酵素である、請求項１に記載の溶液。
4. ４．前記の酵素がピロホスファターゼである、請求項３に記載の溶液。
5. ５．前記のビロホスファターゼが６０〜９５℃の温度で前記の反応混合物中でピ ロリン酸塩の量を減じるのに十分な活性を保持する、請求項４に記載の溶液。
6. ６．第一の１本鎖領域に相同な第二の１本鎖領域を有するテンプレート分子上の 第一の１本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドプライマーの伸長において用いる ためのキットであって、反応混合物中の前記のテンプレートの前記の第二の１本 鎖領域上の前記のプライマーの前記の第一の１本韻領域の伸長を引き起こすこと の出来るＴａｑポリメラーゼ、Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラ ーゼ、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素から 選択されるＤＮＡポリメラーゼ、及び前記の反応混合物中のピロリン酸塩の量を 、その因子の存在しない場合の前記の伸長に際して生じる量を下回るように減じ ることの出来る因子を含むキット。
7. ７．前記のＴ７型ＤＮＡポリメラーゼがＴ７ＤＮＡポリメラーゼである、請求項 ６に記載のキット。
8. ８．前記の因子が酵素である、請求項６に記載のキット。
9. ９．前記の酵素がピロホスファクーゼである、請求項８に記載のキット。
10. １０．前記のピロホスファターゼが６０〜９５℃の温度で前記の反応混合物中で ビロリン酸塩の量を減じるのに十分な活性を保持する、請求項９に記載の溶液。
11. １１．第一の１本鎖領域に相同な第二の１本領領域を有するテンプレート分子上 の第一の１本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるための 改良された方法であって、前記のテンプレート上の前記のプライマーの伸長を引 き起こすことの出来るＴａｑポリメラーゼ、Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４Ｄ ＮＡポリメラーゼ、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ及び逆 転写酵素から選択されるＤＮＡポリメラーゼを供給することを含み、その改良が ： ビロリン酸塩のレベルを、その因子の存在しない場合の前記の伸長に際して生じ る量を下回るように減じることの出来る因子を供給することを含む、改良された 方法。
12. １２．前記の方法が、更に、第一の１本鎖領域を有する２つのオリゴヌクレオチ ドプライマー及び前記の第一の１本鎖領域に相同な第二の１本領領域を有する２ つの相同なテンプレート分子を供給するステップ及び前記のプライマーを前記の テンプレート分子にアニールさせてアニールした混合物を形成するステップを含 む、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記の方法が、更に、前記のアニールした混合物に前記のＤＮＡポリメラ ーゼ及び前記のプライマーの伸長を引き起こす因子を供給することを含む、請求 項１２に記載の方法。
14. １４．前記の方法が、更に、前記のプライマーを前記のテンプレート分子から前 記の伸長の後に分離させて１本鎖分子を与えるステップを含む、請求項１２に記 載の方法。
15. １５．２つのプライマーオリゴヌクレオチドを供給し、前記のプライマーを伸長 さゼ、そして前記のプライマーを分離させるステップを操り返す事を、更に、含 む、請求項１４に記載の方法。