JPH0432835B2 - - Google Patents
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Description
（産業上の利用分野）
本発明は各種腎疾患の指標となる、Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下NAGア
ーゼと略す。）活性測定用基質およびそれを用い
た試薬に関する。 （従来の技術） NAGアーゼの活性測定用基質としてはｐ−ニ
トロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド［Biochemical Preparations，10，118
（1963）］および４−メチルウンベリフエリル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Clinica
chimica Acta，69（１），85〜91（1976）］が広く
用いられている。前者は検体ごとにブランクを測
定する必要があり、測定操作が煩雑であるなどの
欠点を有す。後者は蛍光光度計のような特殊な機
器が必要であるなどの欠点を有している。さらに
ブランクテストを行なわなくてもよいように改良
した基質として、ｍ−クレゾール スルホフタリ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが知
られている（特公昭63−7196）。しかし、これら
の基質はNAGアーゼの反応可能なPH領域即ちPH
3.5〜PH5.5ではNAGアーゼ反応後もほとんど発色
せず、そのままでは測定できない。これはNAG
アーゼにより基質から遊離した色素がPH5.5以上
でないとほとんど発色しないためである。そこで
NAGアーゼ反応後に反応停止剤と発色剤の目的
を兼ねて、アルカリ性溶液を添加し反応液をアル
カリ性として発色させ測定するエイドポイント法
を用いざるを得ず、操作が煩雑であり、厳密には
検体ブランクが必要となる。さらにブランクをと
らない場合は腎機能テストに用いるPSP（フエノ
ールスルホフタレイン）、肝機能テストに用いる
BSP（ベンゼンスルホフタレイン）などの影響を
受ける欠点がある。 （発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、前記した既知の基質の欠点を克
服し、高感度にして精密かつ短時間に多数の検体
を測定可能なNAGアーゼ測定試薬を提供するこ
とを目的として検討を行つた。 （課題を解決するための手段） 本発明は新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン誘導体および、これを基質として用いる
NAGアーゼ活性測定試薬に関する。本発明にお
ける新規Ｎ−アセチル−β−グルコサミン誘導体
は下記一般式（）で示される。 （式中R1およびR2のうち１つはハロゲン原子
であり、他の１つはニトロ基を示す） 従来のNAGアーゼ測定用基質はいずれも酵素
反応を行つた後に、反応停止液（アルカリ性溶
液）を加え発色させて測定するエンドポイント法
でなければ使用できない。例えば従来、公知のｐ
−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニドを基質としたキツト（PNP−NAG
法）およびｍ−クレゾール スルホフタリル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質とし
たキツト（MCP−NAG法）は15〜30分反応させ
た後、反応停止液を加え、反応停止液を加え、反
応液を発色させて吸光度を測定する必要がある。
本発明のNAGアーゼ測定用基質は反応停止液を
用いることなく、酵素反応進行中の一定時間間隔
のNAGアーゼ活性の吸光度差を測定するレート
法で測定できる。即ち、本発明の基質は酵素と反
応させると、直ち発色するので反応途中の任意の
２点の吸光度の差を測定すればよく、操作も簡単
で短時間測定が可能となる。また従来の測定法と
同様エンドポイント法でも測定することができ
る。 上記（）式においてハロゲン原子とはフツ素
原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を意
味する。具体的には２−クロロ−４−ニトロフエ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、
４−クロロ−２−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド、２−フルオロ−４−
ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニドがあげられる。 本発明化合物（）は、下記式（）で示され
る１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−
テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンと下記式
（）で示されるフエノール誘導体（アグリコン）
より容易に合成することができる。
ル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下NAGア
ーゼと略す。）活性測定用基質およびそれを用い
た試薬に関する。 （従来の技術） NAGアーゼの活性測定用基質としてはｐ−ニ
トロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド［Biochemical Preparations，10，118
（1963）］および４−メチルウンベリフエリル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Clinica
chimica Acta，69（１），85〜91（1976）］が広く
用いられている。前者は検体ごとにブランクを測
定する必要があり、測定操作が煩雑であるなどの
欠点を有す。後者は蛍光光度計のような特殊な機
器が必要であるなどの欠点を有している。さらに
ブランクテストを行なわなくてもよいように改良
した基質として、ｍ−クレゾール スルホフタリ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが知
られている（特公昭63−7196）。しかし、これら
の基質はNAGアーゼの反応可能なPH領域即ちPH
3.5〜PH5.5ではNAGアーゼ反応後もほとんど発色
せず、そのままでは測定できない。これはNAG
アーゼにより基質から遊離した色素がPH5.5以上
でないとほとんど発色しないためである。そこで
NAGアーゼ反応後に反応停止剤と発色剤の目的
を兼ねて、アルカリ性溶液を添加し反応液をアル
カリ性として発色させ測定するエイドポイント法
を用いざるを得ず、操作が煩雑であり、厳密には
検体ブランクが必要となる。さらにブランクをと
らない場合は腎機能テストに用いるPSP（フエノ
ールスルホフタレイン）、肝機能テストに用いる
BSP（ベンゼンスルホフタレイン）などの影響を
受ける欠点がある。 （発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、前記した既知の基質の欠点を克
服し、高感度にして精密かつ短時間に多数の検体
を測定可能なNAGアーゼ測定試薬を提供するこ
とを目的として検討を行つた。 （課題を解決するための手段） 本発明は新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミン誘導体および、これを基質として用いる
NAGアーゼ活性測定試薬に関する。本発明にお
ける新規Ｎ−アセチル−β−グルコサミン誘導体
は下記一般式（）で示される。 （式中R1およびR2のうち１つはハロゲン原子
であり、他の１つはニトロ基を示す） 従来のNAGアーゼ測定用基質はいずれも酵素
反応を行つた後に、反応停止液（アルカリ性溶
液）を加え発色させて測定するエンドポイント法
でなければ使用できない。例えば従来、公知のｐ
−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニドを基質としたキツト（PNP−NAG
法）およびｍ−クレゾール スルホフタリル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質とし
たキツト（MCP−NAG法）は15〜30分反応させ
た後、反応停止液を加え、反応停止液を加え、反
応液を発色させて吸光度を測定する必要がある。
本発明のNAGアーゼ測定用基質は反応停止液を
用いることなく、酵素反応進行中の一定時間間隔
のNAGアーゼ活性の吸光度差を測定するレート
法で測定できる。即ち、本発明の基質は酵素と反
応させると、直ち発色するので反応途中の任意の
２点の吸光度の差を測定すればよく、操作も簡単
で短時間測定が可能となる。また従来の測定法と
同様エンドポイント法でも測定することができ
る。 上記（）式においてハロゲン原子とはフツ素
原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を意
味する。具体的には２−クロロ−４−ニトロフエ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、
４−クロロ−２−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド、２−フルオロ−４−
ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニドがあげられる。 本発明化合物（）は、下記式（）で示され
る１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−
テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミンと下記式
（）で示されるフエノール誘導体（アグリコン）
より容易に合成することができる。
【式】
（式中R1およびR2は前記と同意義であり、Ac
はアセチル基を示す。） 化合物（）は公知物質［Biochemical
preparations，10，118（1963）］であり、アグリ
コン（）は市販品として容易に入手することが
できる。（）と（）を反応させ縮合し、一部
アセチル基を常法により、脱離することにより、
目的化合物が得られる。 測定原理 緩衝液（PH4.5〜5.5）に化合物（）を溶解
し、検体と反応させると、検体中のNAGアーゼ
の作用により基質（）が加水分解されアグリコ
ン（）を遊離し、直ちに発色するのでレートア
ツセイ可能な装置を用いて定量する。また一定時
間反応後、アルカリ液、阻害剤などを加えて反応
を停止させ比色定量する、いわゆるエンドポイン
ト法で測定することもできる。 測定操作 測定操作としてレートアツセイ法及びエンドポ
イント法についてそれぞれ例を挙げるが、基質濃
度、液量、検体量、反応温度、測定波長などは、
測定の目的、必要な精度、測定機の性能、基質の
種類などにより異なるので、記載の数値に限定さ
れるものではない。 １ レートアツセイ法 市販の汎用測定機を用いて、一定量の基質液
（２〜5mM，50μ〜1.25ml）に一定量の検体
（尿または血清，2.5μ〜100μ）を加え、37℃
で一定時間（4.5分〜15分）反応させ、分光光度
計で405nm付近の吸光度の差を測定する。 ２ エンドポイント法 検体用および検体ブランク用に10ml試験管２本
を用意し、検体用に基質液（２〜5mM）、検体ブ
ランク用にブランク試薬（PH4.5〜5.5）を1.0mlづ
つ入れ、37℃で５分間加熱する。検体用試験管に
検体（尿または血清）100μを加えて37℃で15
分反応させる。反応後、反応停止液を加えて反応
を停止させる。試薬ブランク用試験管に精製水
100μを加え、同様に反応させた後反応停止液
を加える。反応停止液としては 、従来用いられ
たアルカリ性溶液の他、酵素阻害剤溶液でもよ
い。検体吸光度は基質ブランクを対照に、検体ブ
ランク吸光度は水を対照にして、遊離するフエノ
ール誘導体の最大吸収波長（405nm）で測定す
る。 基質の溶解性と感度の改良 ２−クロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド（以下2CNP−
NAGと略す）等本発明に係わる基質はNAGアー
ゼ活性を測定するのに適当な緩衝溶液にときとし
て難溶である場合がある。このことに対する改良
法として、前記基質を溶解する際、包接化合物と
水以外の溶媒中に溶解する方法がある。この方法
は基質の溶解性を高め感度を向上させる。 包接化合物は18−クラウン−６，15−クラウン
−５，12−クラウン−４などのクラウンエーテル
類、及びα−シクロデキストリン、β−シクロデ
キストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル
α−シクロデキストリン、ジメチルβ−シクロデ
キストリン、ジメチルγ−シクロデキストリン、
Ｌ−ポリ−β−シクロデキストリンなどのシクロ
デキストリン及びその誘導体を含み、これらを１
種あるいは２種以上を併せても用いることができ
る。使用する量は基質１分子当たり概ね３分子以
上好ましくは30〜150分子である。水以外の溶媒
としてエチレングリコール、ジエチレングリコー
ル、プロピレングリコールなどのグライコール類
及びエタノール、メタノール等のアリフアテイツ
クアルコール類が使用される。特にグライコール
類が好ましい。これらの溶媒は１種でも２種以上
を併せて用いることもできる。 実施例 １ ２−クロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド (1) アセトクロルグルコサミン［Biocheical
Preparations，10，118（1963）13.65g（10m
mol）と２−クロロ−４−ニトロフエノール
3.47g（20m mol）をアセトン80mlに溶かし、攪
拌下に1N−NaOH20mlを加え、室温で５時間
攪拌し、４℃で一夜放置する。反応液を減圧濃
縮し、残渣を水洗する。メタノールから再結し
て白色針状結晶の２−クロロ−４−ニトロフエ
ニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド2.1gを得る。 mp.196℃ IR（KBr）1760，1673，750cm-1 NMR δ（CDCl3）：1.96（ｓ，3H）、2.06（ｓ，
3H）、2.08（ｓ，6H）、3.9〜4.5（4H），5.18（ｔ，
Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.50（ｄ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、
5.52（ｔ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.85（ｄ，Ｊ＝
9.0Hz，1H）、7.24（ｄ，Ｊ＝9.2Hz，1H）、
8.06（dd，Ｊ＝3.5，9.2Hz，1H）、8.26（ｄ，Ｊ
＝3.5Hz，1H） (2) 上記(1)で得られた生成物2.1g（3.9m mol）を
乾燥メタノール50mlに加え、室温で28％ナトリ
ウムメトキシド0.4mlを滴下し、一夜放置する。
生成した結晶を濾取し、冷メタノールで洗う。
水から再結して白色針状結晶の２−クロロ−４
−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド1.0gを得る。 mp.168℃ IR（KBr）3280，1650，1530，754cm-1 実施例 ２ ４−クロロ−２−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド (1) 実施例１(1)に準じアセトクロルグルコサミン
3.65g（10m mol）、４−クロロ−２−ニトロフ
エノール（20m mol）、アセトン80mlと1N−
NaOH20mlを用い、処理して白色針状結晶の
４−クロロ−２−ニトロフエニル２，３，４，
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
2.6gを得る。 mp.173℃ IR（KBr）：1740，1658，730cm-1 NMR δ（CDCl3）：1.98（ｓ，3H）、2.07（ｓ，
3H）、2.08（ｓ，3H）、2.10（ｓ，3H）、3.7〜4.4
（4H），5.10（ｔ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.43（ｄ，
Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.56（ｔ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、
5.94（ｄ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、7.30（ｄ，Ｊ＝
9.2Hz，1H）、7.46（dd，Ｊ＝3.5，9.2Hz，
1H）、7.76（ｄ，Ｊ＝3.5Hz，1H） (2) 実施例１(2)に準じ、上記(1)で得られた生成物
2.0g（3.9m mol）、乾燥メタノール50mlを用い
処理して４−クロロ−２−ニトロフエニル Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド1.1gを得
る。 mp.179℃ IR（KBr）：3325，1650，1540，728cm-1 実施例 ３ 15−クラウン−５、エチレングルコールを用い
たNAGアーゼ活性の測定 (1) 試薬の調製 試薬１）2CNP−NAG5mg（基質）を15−クラ
ウン−５、500μ、エチレングリコール500μ
の混合液（溶解液）に加え透明になるまで充分
溶解する。次いで0.85％NaCl溶液（溶解液）
１mlを加えよく混合し基質液２mlとする。試薬
２）クエン酸（C6H8O7・H2Ｏ）0.861gと、クエ
ン酸ナトリウム（C6H5O7Na・2H2Ｏ）1.74gを約
48mlの蒸留水に溶解し、0.2Mクエン酸、あるい
はクエン酸ナトリウム液を用いてPH5.0（25℃）に
調整後、蒸留水を加え50mlとする。 (2) 測定操作 上記試薬２）1.5mlに検体0.1mlを加え約１〜５
分37℃で加温する。次ぎに予め37℃で予備加温し
ておいた試薬１）0.5mlを加え攪拌後、分光光度
計で405nmにおける単位時間当たりの吸光度の増
加を測定する。対照として既知の活性を有する酵
素溶液を同様にして測定し、各々の単位時間当た
りの吸光度の比から未知検体のNAGアーゼ活性
を求める。 15−クラウン−５の代わりに12−クラウン−４
または18−クラウン−６を使用し、エチレングリ
コールの代わりにプロピレングリコールを使用し
て同様にNAGアーゼ活性の測定をした。但し18
−クラウン−６は固体であるため予めエチレング
リコールに溶解しておく。 実施例 ４ α−シクロデキストリン、エチレングリコール
を用いたNAGアーゼ活性の測定。 (1) 試薬の調製 試薬１）クエン酸（C6H8O7・H2Ｏ）0.861g
と、クエン酸ナトリウム（C6H5O7Na・2H2Ｏ）
1.74g、α−シクロデキストリン0.4gを約48mlの
蒸留水に溶解し、0.2Mクエン酸、あるいはクエ
ン酸ナトリウム液を用いてPH5.0（25℃）に調整
後、蒸留水を加え50mlとする。 試薬２）2CNP−NAG10mg（基質）を３mlの
エチレングリコール（溶解液）に加え、透明に
なるまで充分溶解する。次いで0.85％NaCl溶液
５mlを加えよく混合し、基質液８mlとする。 (2) 測定操作 上記試薬１）1.0mlに検体0.1mlを加え約１〜５
分37℃で加温する。次ぎに予め37℃で予備加温し
ておいた試薬２）１mlを加え、攪拌後、分光光度
計で405nmにおける単位時間当たりの吸光度の増
加を測定する。以下実施例３と同様にNAGアー
ゼ活性を求める。 α−シクロデキストリンの代わりにβ−シクロ
デキストリンまたはγ−シクロデキストリンを使
用し、エチレングリコールの代わりにプロピレン
グリコールを使用して、実施例３と同様にNAG
アーゼ活性の測定をした。 実施例 ５ 12−クラウン−４とメタノールを用いたNAG
アーゼ活性の測定 (1) 試薬の調製 試薬１）クエン酸（C6H8O7・H2Ｏ）0.861gと、
クエン酸 ナトリウム（C6H5O7Na・2H2Ｏ）
1.74gを約48mlの蒸留水に溶解し、0.2Mクエン
酸、あるいはクエン酸ナトリウム液を用いてPH
5.0（25℃）に調整後、蒸留水を加え50mlとする。 試薬２）2CNP−NAG7.8mg（基質）を12−ク
ラウン−４、0.4ml、メタノール0.6ml、水１mlの
混合液に加え、透明になるまで充分溶解する。試
薬１）３mlと試薬２）２mlを混合し反応液５mlと
する。 （２）測定操作 予め37℃で予備加温しておいた上記反応液２ml
に検体0.1mlを加え攪拌後、分光光度計で405nm
における単位時間当たりの吸光度の増加を測定す
る。以下実施例３と同様にNAGアーゼ活性を求
める。 12−クラウン−４の代わりに18−クラウン−６
または15−クラウン−５を使用し、メタノールの
代わりにエタノールを使用し実施例３と同様に
NAGアーゼ活性を測定した。 （発明の効果） 本発明により、実用的なレートアツセイ可能な
NAGアーゼ測定用基質が見いだされ、それを用
いることにより、高感度にして、短時間に、多数
の検体を測定できるNAGアーゼ測定試薬が提供
された。
はアセチル基を示す。） 化合物（）は公知物質［Biochemical
preparations，10，118（1963）］であり、アグリ
コン（）は市販品として容易に入手することが
できる。（）と（）を反応させ縮合し、一部
アセチル基を常法により、脱離することにより、
目的化合物が得られる。 測定原理 緩衝液（PH4.5〜5.5）に化合物（）を溶解
し、検体と反応させると、検体中のNAGアーゼ
の作用により基質（）が加水分解されアグリコ
ン（）を遊離し、直ちに発色するのでレートア
ツセイ可能な装置を用いて定量する。また一定時
間反応後、アルカリ液、阻害剤などを加えて反応
を停止させ比色定量する、いわゆるエンドポイン
ト法で測定することもできる。 測定操作 測定操作としてレートアツセイ法及びエンドポ
イント法についてそれぞれ例を挙げるが、基質濃
度、液量、検体量、反応温度、測定波長などは、
測定の目的、必要な精度、測定機の性能、基質の
種類などにより異なるので、記載の数値に限定さ
れるものではない。 １ レートアツセイ法 市販の汎用測定機を用いて、一定量の基質液
（２〜5mM，50μ〜1.25ml）に一定量の検体
（尿または血清，2.5μ〜100μ）を加え、37℃
で一定時間（4.5分〜15分）反応させ、分光光度
計で405nm付近の吸光度の差を測定する。 ２ エンドポイント法 検体用および検体ブランク用に10ml試験管２本
を用意し、検体用に基質液（２〜5mM）、検体ブ
ランク用にブランク試薬（PH4.5〜5.5）を1.0mlづ
つ入れ、37℃で５分間加熱する。検体用試験管に
検体（尿または血清）100μを加えて37℃で15
分反応させる。反応後、反応停止液を加えて反応
を停止させる。試薬ブランク用試験管に精製水
100μを加え、同様に反応させた後反応停止液
を加える。反応停止液としては 、従来用いられ
たアルカリ性溶液の他、酵素阻害剤溶液でもよ
い。検体吸光度は基質ブランクを対照に、検体ブ
ランク吸光度は水を対照にして、遊離するフエノ
ール誘導体の最大吸収波長（405nm）で測定す
る。 基質の溶解性と感度の改良 ２−クロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド（以下2CNP−
NAGと略す）等本発明に係わる基質はNAGアー
ゼ活性を測定するのに適当な緩衝溶液にときとし
て難溶である場合がある。このことに対する改良
法として、前記基質を溶解する際、包接化合物と
水以外の溶媒中に溶解する方法がある。この方法
は基質の溶解性を高め感度を向上させる。 包接化合物は18−クラウン−６，15−クラウン
−５，12−クラウン−４などのクラウンエーテル
類、及びα−シクロデキストリン、β−シクロデ
キストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル
α−シクロデキストリン、ジメチルβ−シクロデ
キストリン、ジメチルγ−シクロデキストリン、
Ｌ−ポリ−β−シクロデキストリンなどのシクロ
デキストリン及びその誘導体を含み、これらを１
種あるいは２種以上を併せても用いることができ
る。使用する量は基質１分子当たり概ね３分子以
上好ましくは30〜150分子である。水以外の溶媒
としてエチレングリコール、ジエチレングリコー
ル、プロピレングリコールなどのグライコール類
及びエタノール、メタノール等のアリフアテイツ
クアルコール類が使用される。特にグライコール
類が好ましい。これらの溶媒は１種でも２種以上
を併せて用いることもできる。 実施例 １ ２−クロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド (1) アセトクロルグルコサミン［Biocheical
Preparations，10，118（1963）13.65g（10m
mol）と２−クロロ−４−ニトロフエノール
3.47g（20m mol）をアセトン80mlに溶かし、攪
拌下に1N−NaOH20mlを加え、室温で５時間
攪拌し、４℃で一夜放置する。反応液を減圧濃
縮し、残渣を水洗する。メタノールから再結し
て白色針状結晶の２−クロロ−４−ニトロフエ
ニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド2.1gを得る。 mp.196℃ IR（KBr）1760，1673，750cm-1 NMR δ（CDCl3）：1.96（ｓ，3H）、2.06（ｓ，
3H）、2.08（ｓ，6H）、3.9〜4.5（4H），5.18（ｔ，
Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.50（ｄ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、
5.52（ｔ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.85（ｄ，Ｊ＝
9.0Hz，1H）、7.24（ｄ，Ｊ＝9.2Hz，1H）、
8.06（dd，Ｊ＝3.5，9.2Hz，1H）、8.26（ｄ，Ｊ
＝3.5Hz，1H） (2) 上記(1)で得られた生成物2.1g（3.9m mol）を
乾燥メタノール50mlに加え、室温で28％ナトリ
ウムメトキシド0.4mlを滴下し、一夜放置する。
生成した結晶を濾取し、冷メタノールで洗う。
水から再結して白色針状結晶の２−クロロ−４
−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド1.0gを得る。 mp.168℃ IR（KBr）3280，1650，1530，754cm-1 実施例 ２ ４−クロロ−２−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミニド (1) 実施例１(1)に準じアセトクロルグルコサミン
3.65g（10m mol）、４−クロロ−２−ニトロフ
エノール（20m mol）、アセトン80mlと1N−
NaOH20mlを用い、処理して白色針状結晶の
４−クロロ−２−ニトロフエニル２，３，４，
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
2.6gを得る。 mp.173℃ IR（KBr）：1740，1658，730cm-1 NMR δ（CDCl3）：1.98（ｓ，3H）、2.07（ｓ，
3H）、2.08（ｓ，3H）、2.10（ｓ，3H）、3.7〜4.4
（4H），5.10（ｔ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.43（ｄ，
Ｊ＝9.0Hz，1H）、5.56（ｔ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、
5.94（ｄ，Ｊ＝9.0Hz，1H）、7.30（ｄ，Ｊ＝
9.2Hz，1H）、7.46（dd，Ｊ＝3.5，9.2Hz，
1H）、7.76（ｄ，Ｊ＝3.5Hz，1H） (2) 実施例１(2)に準じ、上記(1)で得られた生成物
2.0g（3.9m mol）、乾燥メタノール50mlを用い
処理して４−クロロ−２−ニトロフエニル Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド1.1gを得
る。 mp.179℃ IR（KBr）：3325，1650，1540，728cm-1 実施例 ３ 15−クラウン−５、エチレングルコールを用い
たNAGアーゼ活性の測定 (1) 試薬の調製 試薬１）2CNP−NAG5mg（基質）を15−クラ
ウン−５、500μ、エチレングリコール500μ
の混合液（溶解液）に加え透明になるまで充分
溶解する。次いで0.85％NaCl溶液（溶解液）
１mlを加えよく混合し基質液２mlとする。試薬
２）クエン酸（C6H8O7・H2Ｏ）0.861gと、クエ
ン酸ナトリウム（C6H5O7Na・2H2Ｏ）1.74gを約
48mlの蒸留水に溶解し、0.2Mクエン酸、あるい
はクエン酸ナトリウム液を用いてPH5.0（25℃）に
調整後、蒸留水を加え50mlとする。 (2) 測定操作 上記試薬２）1.5mlに検体0.1mlを加え約１〜５
分37℃で加温する。次ぎに予め37℃で予備加温し
ておいた試薬１）0.5mlを加え攪拌後、分光光度
計で405nmにおける単位時間当たりの吸光度の増
加を測定する。対照として既知の活性を有する酵
素溶液を同様にして測定し、各々の単位時間当た
りの吸光度の比から未知検体のNAGアーゼ活性
を求める。 15−クラウン−５の代わりに12−クラウン−４
または18−クラウン−６を使用し、エチレングリ
コールの代わりにプロピレングリコールを使用し
て同様にNAGアーゼ活性の測定をした。但し18
−クラウン−６は固体であるため予めエチレング
リコールに溶解しておく。 実施例 ４ α−シクロデキストリン、エチレングリコール
を用いたNAGアーゼ活性の測定。 (1) 試薬の調製 試薬１）クエン酸（C6H8O7・H2Ｏ）0.861g
と、クエン酸ナトリウム（C6H5O7Na・2H2Ｏ）
1.74g、α−シクロデキストリン0.4gを約48mlの
蒸留水に溶解し、0.2Mクエン酸、あるいはクエ
ン酸ナトリウム液を用いてPH5.0（25℃）に調整
後、蒸留水を加え50mlとする。 試薬２）2CNP−NAG10mg（基質）を３mlの
エチレングリコール（溶解液）に加え、透明に
なるまで充分溶解する。次いで0.85％NaCl溶液
５mlを加えよく混合し、基質液８mlとする。 (2) 測定操作 上記試薬１）1.0mlに検体0.1mlを加え約１〜５
分37℃で加温する。次ぎに予め37℃で予備加温し
ておいた試薬２）１mlを加え、攪拌後、分光光度
計で405nmにおける単位時間当たりの吸光度の増
加を測定する。以下実施例３と同様にNAGアー
ゼ活性を求める。 α−シクロデキストリンの代わりにβ−シクロ
デキストリンまたはγ−シクロデキストリンを使
用し、エチレングリコールの代わりにプロピレン
グリコールを使用して、実施例３と同様にNAG
アーゼ活性の測定をした。 実施例 ５ 12−クラウン−４とメタノールを用いたNAG
アーゼ活性の測定 (1) 試薬の調製 試薬１）クエン酸（C6H8O7・H2Ｏ）0.861gと、
クエン酸 ナトリウム（C6H5O7Na・2H2Ｏ）
1.74gを約48mlの蒸留水に溶解し、0.2Mクエン
酸、あるいはクエン酸ナトリウム液を用いてPH
5.0（25℃）に調整後、蒸留水を加え50mlとする。 試薬２）2CNP−NAG7.8mg（基質）を12−ク
ラウン−４、0.4ml、メタノール0.6ml、水１mlの
混合液に加え、透明になるまで充分溶解する。試
薬１）３mlと試薬２）２mlを混合し反応液５mlと
する。 （２）測定操作 予め37℃で予備加温しておいた上記反応液２ml
に検体0.1mlを加え攪拌後、分光光度計で405nm
における単位時間当たりの吸光度の増加を測定す
る。以下実施例３と同様にNAGアーゼ活性を求
める。 12−クラウン−４の代わりに18−クラウン−６
または15−クラウン−５を使用し、メタノールの
代わりにエタノールを使用し実施例３と同様に
NAGアーゼ活性を測定した。 （発明の効果） 本発明により、実用的なレートアツセイ可能な
NAGアーゼ測定用基質が見いだされ、それを用
いることにより、高感度にして、短時間に、多数
の検体を測定できるNAGアーゼ測定試薬が提供
された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式 （式中R1およびR2のうち１つはハロゲン原子
であり、他の１つはニトロ基を示す）で示される
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体。 ２ 下記一般式 （式中R1およびR2のうち１つはハロゲン原子
であり、他の１つはニトロ基を示す）で示される
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を含
有するＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
ゼ測定試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59233327A JPS61112092A (ja) | 1984-11-07 | 1984-11-07 | 新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬 |
| DE8585114070T DE3583002D1 (de) | 1984-11-07 | 1985-11-05 | Glucosaminderivate und reagenz zur bestimmung von n-acetyl-beta-d-glucosaminidase welche dieses derivat als substrat enthaelt. |
| EP85114070A EP0180961B1 (en) | 1984-11-07 | 1985-11-05 | Glucosamine derivatives and reagent for assaying n-acetyl-beta-d-glucosaminidase using the same as substrate |
| US06/795,954 US4754025A (en) | 1984-11-07 | 1985-11-07 | Glucosamine derivatives and reagent for assaying N-acetyl-β-D-glucosaminidase using the same as substrate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59233327A JPS61112092A (ja) | 1984-11-07 | 1984-11-07 | 新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61112092A JPS61112092A (ja) | 1986-05-30 |
| JPH0432835B2 true JPH0432835B2 (ja) | 1992-06-01 |
Family
ID=16953401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59233327A Granted JPS61112092A (ja) | 1984-11-07 | 1984-11-07 | 新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0180961B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61112092A (ja) |
| DE (1) | DE3583002D1 (ja) |
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| US5068180A (en) * | 1987-05-21 | 1991-11-26 | Technicon Instruments Corporation | Substrates for β-galactosidase |
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| US5350677A (en) * | 1989-02-23 | 1994-09-27 | Iatron Laboratories, Inc. | Method of assaying phosphatase with 3,4-dinitrophenylphosphate |
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-
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- 1984-11-07 JP JP59233327A patent/JPS61112092A/ja active Granted
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- 1985-11-05 EP EP85114070A patent/EP0180961B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-07 US US06/795,954 patent/US4754025A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEMICAL & PHARMASEUTICAL BULLETIN=1976 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| JPS61112092A (ja) | 1986-05-30 |
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| DE3583002D1 (de) | 1991-07-04 |
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