JPH04304900A - Detection of target nucleic acid sequence and reagent kit therefor - Google Patents
Detection of target nucleic acid sequence and reagent kit thereforInfo
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Abstract
Description
【０００１】0001
【産業上の利用分野】本発明は標的核酸配列の検出方法
およびそのための試薬キットに関する。この発明は特に
、塩基配列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比
較して、より大量に生成させることにより検体試料中か
ら検出する方法に関する。本発明を実施することにより
遺伝病、癌、感染症などの診断を行うことが容易となる
。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid sequence and a reagent kit therefor. The present invention particularly relates to a method for detecting a nucleic acid whose base sequence is known in a specimen sample by producing the nucleic acid in a larger amount than the amount initially present. By implementing the present invention, it becomes easy to diagnose genetic diseases, cancer, infectious diseases, and the like.
【０００２】0002
【従来技術】近年、ハイブリダイゼーションによる核酸
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
のわずかな部分である場合があり、非放射性標識プロー
ブや末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチド
プローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりそ
の検出が困難である。そのため、プローブ検出システム
の感度を向上させるための努力が多くなされている（Ｗ
Ｏ８７／０３６２２など）。また、感度向上の手段とし
て、目的とする核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅さ
せる方法（特開昭６１−２７４６９７ 号公報；以下「
ＰＣＲ」と略すことがある）が開示された。しかしこの
方法では、複雑な温度の調節が必要であり、専用の機器
を必要とするという欠点がある。ＤＮＡリガーゼを用い
る増幅法も開示されている（ＷＯ８９／１２６９６、特
開平２−２９３４号公報など）。しかし、この方法では
ＤＮＡリガーゼが平滑末端を連結する反応（ｂｌｕｎｔ
ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）により非特異的増幅が起
こる。これの回避法として、ＷＯ８９／１２６９６では
３組以上のプローブを用いているが、プローブ数が多く
コスト高となってしまう欠点がある。また、ＲＮＡポリ
メラーゼを用いてＤＮＡよりＲＮＡが生成されることは
周知であり、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸の増幅を
行う方法も開示されている（ＷＯ８９／０１０５０）。
しかしながら、この方法ではＲＮＡポリメラーゼによる
転写増幅のみでは充分な増幅は困難である。したがって
、生成したＲＮＡに再度逆転写酵素を作用させＤＮＡを
生成させる操作を実施している。一方、目的とする核酸
にプローブをハイブリダイズさせた後、正しくハイブリ
ダイズしたプローブのみを増幅する方法（ＢＩＯ／ＴＥ
ＣＨＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌ．６， １１９７，１９８
８）も知られている。しかしこの方法では、非特異反応
により結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇
をきたすという問題がある。BACKGROUND OF THE INVENTION In recent years, detection of nucleic acids by hybridization has become widely used as an effective means for diagnosing genetic diseases, cancer, infectious diseases, and the like. In nucleic acid detection methods, the target base sequence may be only a small portion of the target nucleic acid, and in detection methods that use non-radioactively labeled probes or oligonucleotide probes whose ends are labeled with radioactive isotopes, Detection is difficult due to sensitivity issues. Therefore, many efforts have been made to improve the sensitivity of probe detection systems (W
O87/03622 etc.). In addition, as a means of improving sensitivity, a method of amplifying the target nucleic acid with DNA polymerase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-274697; hereinafter referred to as "
(sometimes abbreviated as "PCR") was disclosed. However, this method has disadvantages in that it requires complicated temperature control and requires specialized equipment. Amplification methods using DNA ligase have also been disclosed (WO89/12696, JP-A-2-2934, etc.). However, this method involves a reaction in which DNA ligase joins blunt ends.
(end ligation), non-specific amplification occurs. As a way to avoid this, WO89/12696 uses three or more sets of probes, but this method has the drawback of increasing the cost due to the large number of probes. Furthermore, it is well known that RNA is produced from DNA using RNA polymerase, and a method for amplifying nucleic acids using RNA polymerase has also been disclosed (WO 89/01050). However, with this method, it is difficult to achieve sufficient amplification using only transcription amplification using RNA polymerase. Therefore, an operation is performed in which reverse transcriptase is applied to the generated RNA again to generate DNA. On the other hand, a method (BIO/TE
CHNOLOGY vol. 6, 1197, 198
8) is also known. However, this method has the problem that bound probes are also amplified due to non-specific reactions, resulting in an increase in the blank value.
【０００３】0003
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
となる核酸を簡単に増幅させることにより、目的である
核酸配列を検出する方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid sequence by simply amplifying the target nucleic acid.
【０００４】0004
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるにいたった。即ち、本発明は検
体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果として環状
化するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌ
クレオチド（Ｂ）と、少なくともこの直鎖状プローブヌ
クレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、標的核酸配列（Ａ
）に直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブリダイ
ズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環状化し
、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼとプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、鋳型と相補的な配
列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成させ、生
成した一本鎖核酸を測定することにより、検体試料中の
標的核酸配列を検出することを特徴とする標的核酸配列
の検出方法である。また本発明の核酸を検出するための
試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プローブ
ヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプ
ライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリメラ
ーゼ、ヌクレオチド三リン酸および標識されたモノヌク
レオチドもしくは標識された核酸プローブを含む標的核
酸配列検出用試薬キットである。[Means for Solving the Problems] As a result of intensive research aimed at solving these problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by using a nucleotide that can become circular only in the presence of a target nucleic acid as a probe. This discovery led to the completion of the present invention. That is, the present invention provides a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, and at least this linear probe nucleotide (B). ), a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to the target nucleic acid sequence (A
) is hybridized with a linear probe nucleotide (B), the linear probe nucleotide (B) is circularized, the generated circular probe nucleotide (B') is used as a template, and a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide are generated. Detecting the target nucleic acid sequence in the specimen sample by using (C) to generate a single-stranded nucleic acid having a repeated sequence complementary to the template and measuring the generated single-stranded nucleic acid. A method for detecting a target nucleic acid sequence is characterized in that: The reagent kit for detecting nucleic acids of the present invention also includes a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample; A target nucleic acid comprising a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to the linear probe nucleotide (B), a linking means, a nucleic acid polymerase, a nucleotide triphosphate, and a labeled mononucleotide or a labeled nucleic acid probe. This is a reagent kit for sequence detection.
【０００５】本発明では、検出したい標的核酸配列とハ
イブリッドを形成することにより、リガーゼを用いて環
状化することが可能となるように設計された核酸分子を
使用し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラ
ーゼ反応により核酸配列を増幅させる。本発明における
標的核酸配列（Ａ）は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較
的純粋な状態であっても、核酸の混合物の一成分であっ
てもよい。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造
等に特に制限されない。[0005] In the present invention, a nucleic acid molecule designed to be able to be circularized using a ligase by forming a hybrid with a target nucleic acid sequence to be detected is used, and the circularized nucleic acid molecule is As a template, a nucleic acid sequence is amplified by a polymerase reaction. The target nucleic acid sequence (A) in the present invention may be single-stranded or double-stranded, and may be in a relatively pure state or as a component of a mixture of nucleic acids. The sequence of the target nucleic acid related to the present invention is not particularly limited in length, structure, etc.
【０００６】本発明におけるプローブヌクレオチド（Ｂ
）とは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果
として環状化するように設計された配列を有する直鎖状
プローブヌクレオチドである（図１および図２のＢ参照
）。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
は図２に示されるように、標的核酸配列とアニールする
部分を有する。該アニール部分は、それぞれ６〜４０ヌ
クレオチド、好ましくは各々１０〜３０ヌクレオチドの
長さが使用される。５’末端と３’末端に位置する上記
アニール部分間を結ぶ配列の長さは一般的に１〜１００
０個、好ましくは１０〜１００個のヌクレオチドであれ
ばよい。また、この領域にＲＮＡポリメラーゼのアンチ
プロモーター配列を含ませることも可能である。このＲ
ＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプ
ローブヌクレオチドを用いた場合、プライマーヌクレオ
チドとしてＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持
つオリゴヌクレオチドを用いることにより、プロモータ
ーに応じたＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレオチ
ド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を作用させれば
、プローブヌクレオチドの相補鎖が繰り返し並んだＲＮ
Ａを合成することが可能である。[0006] The probe nucleotide (B
) is a linear probe nucleotide having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the analyte sample (see FIGS. 1 and 2B). As shown in FIG. 2, the 5' and 3' ends of the probe nucleotide (B) have portions that anneal to the target nucleic acid sequence. The annealing portions are each used to have a length of 6 to 40 nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides each. The length of the sequence connecting the above annealed portion located at the 5' end and the 3' end is generally 1 to 100.
The number of nucleotides may be 0, preferably 10 to 100. It is also possible to include an anti-promoter sequence for RNA polymerase in this region. This R
When using a probe nucleotide having an anti-promoter sequence of NA polymerase, using an oligonucleotide having a promoter sequence of RNA polymerase as a primer nucleotide allows RNA polymerase and ribonucleotides (ATP, CTP, GTP, When UTP) is applied, RN in which complementary strands of probe nucleotides are repeatedly arranged
It is possible to synthesize A.
【０００７】本発明のプライマーヌクレオチド（Ｃ）は
、プローブヌクレオチド（Ｂ）と少なくとも部分的に相
補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限され
ない。長さは一般的には、６〜４０ヌクレオチド、好ま
しくは１０〜３０ヌクレオチドが使用される。また、プ
ローブヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのアンチプロ
モーター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチド
にプロモーター配列を含ませたものを使用することが可
能である。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ）および（
Ｃ）は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９１
型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。他に
もリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホ
スファイト法等いかなる方法で合成してもよい。また、
生物学的起源、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物か
ら単離してもよい。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’
末端にはリン酸基を付加しておくことが好ましい。リン
酸基の付加は、例えばＡＴＰの存在下で、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼにより行うことができる。The primer nucleotide (C) of the present invention is not limited in structure, length, etc., as long as it has a sequence that is at least partially complementary to the probe nucleotide (B). Lengths of 6 to 40 nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides are generally used. Furthermore, when the probe nucleotide contains an anti-promoter sequence of RNA polymerase, it is possible to use a primer nucleotide containing a promoter sequence. These oligonucleotides (B) and (
C) is manufactured by ABI (Applied Biosys), for example.
stems Inc. ) DNA synthesizer 391
It can be synthesized by the phosphoramidite method using a mold. It may be synthesized by any other method such as the phosphoric acid triester method, the H-phosphonate method, or the thiophosphite method. Also,
It may also be isolated from biological sources, such as restriction endonuclease digests. 5' of probe nucleotide (B)
It is preferable to add a phosphoric acid group to the terminal. Addition of phosphate groups can be carried out, for example, by T4 polynucleotide kinase in the presence of ATP.
【０００８】本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、
ヘリカーゼ用活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、Ｄ
ＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である。（Ｊ
． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， ８９３５，
１９８９）。他にも、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼ、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼな
どが利用できる。[0008] The nucleic acid polymerase used in the present invention is
If it is a nucleic acid polymerase with helicase activity, D
It may be an NA polymerase or an RNA polymerase. For example, by using φ29 DNA polymerase, it is possible to synthesize a nucleic acid in which a sequence complementary to the template is repeatedly arranged using a circular nucleic acid molecule as a template. (J
．． Biol. Chem. , 264, 8935,
1989). In addition, M2 DNA polymerase, Escherichia coli DNA polymerase, T7 RNA polymerase,
T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, etc. can be used.
【０００９】本発明の標的核酸検出方法は、標的核酸配
列（Ａ）に上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハ
イブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）
を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’
）を鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本
鎖核酸生成させ、生成した一本鎖核酸を測定することに
より検体試料中の標的核酸配列を検出する。[0009] The method for detecting a target nucleic acid of the present invention involves hybridizing the linear probe nucleotide (B) to the target nucleic acid sequence (A).
was circularized to generate a circular probe nucleotide (B'
) as a template, a single-stranded nucleic acid having a repeated sequence complementary to the template is generated using primer nucleotide (C), and the generated single-stranded nucleic acid is measured to determine the target nucleic acid in the specimen sample. Detect sequences.
【００１０】本発明の標的核酸検出法としては、次のよ
うな実施形態が挙げられる。（１）検体試料中の標的核
酸配列（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計
された配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）
と、少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
部分的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド
（Ｃ）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うこと
を特徴とする標的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。
操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッドのプローブヌクレオチド（Ｂ
）とアニールさせる。
操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。
操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。
操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。The target nucleic acid detection method of the present invention includes the following embodiments. (1) A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample
and a primer nucleotide (C) having a sequence that is at least partially complementary to the linear probe nucleotide (B), and performing the following operations (a) to (f). How to detect sequences. Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): Operation (a) of the primer nucleotide (c)
) hybrid probe nucleotide (B
) and anneal. Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (c) is used as a template, and a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C) are used to generate a nucleic acid sequence. amplify. Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１１】（２）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。
操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を操作（
ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド
（Ｂ）とアニールさせる。
操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。
操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。
操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。(2) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): Manipulating the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample (
Anneal with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in a). Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (c) is used as a template, and a nucleic acid sequence is generated using a nucleic acid polymerase with helicase-like activity and a primer nucleotide (c). amplify. Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１２】（３）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
この直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補
的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする
標的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。
操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。
操作（ｃ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。
操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。(3) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (e) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
Target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C
) to form a hybrid. Operation (b): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (c) is used as a template, and a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C) are used to generate a nucleic acid sequence. amplify. Operation (d): If necessary, operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (c). Operation (e): Through operations (a) to (d), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１３】（４）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
と標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。
操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。
操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。
操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。
操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。(4) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
and the target nucleic acid sequence (A) to form a hybrid. Operation (b): The 5' and 3' ends of adjacent linear probe nucleotides (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): Manipulate the primer nucleotide (C) (b
) is annealed with the cyclic probe nucleotide (B') generated. Operation (d): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (b) is used as a template, and a nucleic acid sequence is generated using a nucleic acid polymerase with helicase-like activity and a primer nucleotide (C). amplify. Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
【００１４】（５）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。
操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。
操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて環状ヌクレオチド（Ｂ’）にする。操作（ｄ
）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を
鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼ
およびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配
列を増幅する。
操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回繰
り返す。
操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。
操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(5) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (g) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): Manipulate the primer nucleotide (C) (a
) in the hybrid generated by the probe nucleotide (
Anneal with B). Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d
): Using the cyclic nucleotide (B') produced in step (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
【００１５】（６）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。
操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。
操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。
操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。
操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。
操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(6) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (g) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d): The cyclic nucleotide (
Using B') as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
【００１６】（７）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。
操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。
操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。
操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。
操作（ｆ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(7) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
Target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C
) to form a hybrid. Operation (b): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): The cyclic nucleotide (
Using B') as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (d): If necessary, operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (c). Operation (e): Through operations (a) to (d), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (f): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
【００１７】（８）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。
操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。
操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。
操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。
操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。
操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。
操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。
操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。(8) a linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (g) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to B). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
A hybrid is formed with the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The 5' and 3' ends of adjacent linear probe nucleotides (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): Manipulate the primer nucleotide (C) (b
) is annealed with the cyclic probe nucleotide (B') generated. Operation (d): The cyclic nucleotide (
Using B') as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
【００１８】本発明の上記実施様態（３）の理解のため
に、図２に本発明の原理を模式的に示す。この図２に基
づいて、以下本発明を説明する。尚、図中Ａは標的核酸
、Ｂは直鎖状ブローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化プロ
ーブヌクレオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、Ｄは
核酸ポリメラーゼ、Ｅは標識されたモノヌクレオチドを
示す。In order to understand the above embodiment (3) of the present invention, the principle of the present invention is schematically shown in FIG. The present invention will be explained below based on FIG. 2. In the figure, A indicates a target nucleic acid, B indicates a linear probe nucleotide, B' indicates a circularized probe nucleotide, C indicates a primer nucleotide, D indicates a nucleic acid polymerase, and E indicates a labeled mononucleotide.
【００１９】操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド
（Ｂ）中の検出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列との
ハイブリッドを形成させる。同時に、または別々にプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド（
Ｂ）にアニールさせる（図２（ａ）参照）。標的核酸（
Ａ）が二重鎖の場合は加熱、アルカリ処理、酸処理など
により変性して一本鎖とする。加熱変性は例えば８０〜
１０５℃で１〜５分間処理することで実施できる。アル
カリ処理は例えば、０．２〜１規定のＮａＯＨ存在下で
、１〜３０分間処理し、等量のＨＣｌで中和して用いる
ことができる。酸処理は例えば０．０１〜１規定のＨＣ
ｌ存在下で、１〜３０分処理しＮａＯＨで中和して用い
ることができる。他の方法として酵素的に鎖分解を行な
うこともできる。アニールは、好ましくはプローブヌク
レオチド（Ｂ）、およびプライマーヌクレオチド（Ｃ）
について、それぞれ、最大のアニール選択性をもたらす
ように、選択された温度において行う。一般的には標的
核酸（Ａ）とプローブヌクレオチド（Ｂ）、およびプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）とプライマーヌクレオチド（Ｃ
）がそれぞれ特異的に結合し、且つミスマッチによる非
特異的結合が最小となるように、昇温させて行われる。Operation (a): Form a hybrid between the detection sequence in the linear probe nucleotide (B) and the target sequence in the target nucleic acid (A). Simultaneously or separately, the primer nucleotide (C) is added to the probe nucleotide (
B) (see FIG. 2(a)). Target nucleic acid (
If A) is a double strand, it is denatured into a single strand by heating, alkali treatment, acid treatment, etc. Heat denaturation is, for example, 80~
This can be carried out by processing at 105°C for 1 to 5 minutes. The alkali treatment can be carried out, for example, in the presence of 0.2 to 1N NaOH for 1 to 30 minutes, followed by neutralization with an equal amount of HCl. Acid treatment is, for example, 0.01 to 1N HC.
It can be used after being treated for 1 to 30 minutes in the presence of L and neutralized with NaOH. Alternatively, enzymatic chain cleavage can be performed. Annealing preferably involves the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C)
each at a temperature selected to provide maximum annealing selectivity. Generally, target nucleic acid (A) and probe nucleotide (B), and probe nucleotide (B) and primer nucleotide (C
) are specifically bound to each other, and non-specific binding due to mismatch is minimized.
【００２０】操作（ｂ）：上記プローブヌクレオチド（
Ｂ）の５’末端と３’末端を連結させ環状化プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）とする（図２（ｂ）参照）。該プロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハイブ
リッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮ
Ａリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素を使用する方法が好ま
しい。また互いに隣接していない場合、ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび／または逆転写酵素によりギャップを埋めた
後、連結酵素により連結することができる。この場合、
ギャップ部分がＡ−Ｔペアのみ、またはＣ−Ｇペアのみ
で構成されるようにプローブヌクレオチドを設計してお
けば、添加するモノヌクレオチドをそれぞれＡ、Ｔまた
はＣ、Ｇのみとすることでミスマッチによりアニールし
たオリゴヌクレオチドが間違って伸長されることを防止
する方法もとることができる。連結酵素を使用する連結
方法については、特開昭６３−２２１９７号公報および
ＷＯ９０／０１０６９に開示の方法等、公知の手法に
より行うことができる。本発明において、標的核酸とア
ニールするオリゴヌクレオチド部分は６〜４０ヌクレオ
チド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドの長さのもの
が使用される。Operation (b): The above probe nucleotide (
The 5' end and 3' end of B) are linked to form a circularization probe nucleotide (B') (see FIG. 2(b)). When the 5' end and 3' end of the probe nucleotide (B) are adjacent as a result of hybridization, T4 DNA ligase, T7 DNA ligase, E. coli DN
A ligase, Thermus thermophile
A method using a ligating enzyme such as s DNA ligase is preferred. If they are not adjacent to each other, the gaps can be filled with DNA polymerase and/or reverse transcriptase, and then linked using a ligating enzyme. in this case,
If the probe nucleotides are designed so that the gap part consists of only A-T pairs or only C-G pairs, mismatches can be avoided by adding only A, T or C, G mononucleotides, respectively. Methods can also be taken to prevent erroneous extension of annealed oligonucleotides. The ligation method using a ligation enzyme can be carried out by known methods such as those disclosed in JP-A-63-22197 and WO90/01069. In the present invention, the length of the oligonucleotide portion that anneals to the target nucleic acid is 6 to 40 nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides.
【００２１】操作（ｃ）：標識されたモノヌクレオチド
の存在下、操作（ｂ）で環状化したプローブヌクレオチ
ド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌクレオチド（Ｂ
’）にアニールしたプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利
用して核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用いて核酸合成反応を
行う（図２（ｃ）参照）。該操作は、例えばｄＮＴＰ（
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種のデオ
キシリボヌクレオチド）およびＤＮＡポリメラーゼ（例
えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕ
ａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ等の核
酸合成能力の高い酵素）を用いて、上記環状ヌクレオチ
ドを鋳型にして伸長反応を行わせることによって行われ
る。この方法は、例えばジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；５６，３４１−３６１，１
９７１．）に記載されている技術及び条件を用いること
ができる。これらの酵素は、ＤＮＡの二重鎖の部分を剥
しながらプライマー伸長物の合成をすすめていくことが
できるので、当該操作に先だって、必ずしも標的核酸（
Ａ）と環状化プローブヌクレオチド（Ｂ’）を分離する
必要はない。プライマー伸長物は、標的配列と相同な配
列を有するので、該伸長物は操作（ａ）における標的核
酸（Ａ）と同様にプローブヌクレオチド（Ｂ）の標的核
酸として利用されうる。この一連の操作を繰り返すこと
により核酸の特定の配列を簡便に大量に得ることができ
る。また、プローブヌクレオチド（Ｂ）、プライマーヌ
クレオチド（Ｃ）にそれぞれアンチプロモーター配列、
プロモーター配列が含まれている場合には、核酸ポリメ
ラーゼとして、プロモーターに応じたＲＮＡポリメラー
ゼを用いることができる。当該操作は、ＮＴＰ（ＡＴＰ
、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）の４種のリボヌクレオチド
）およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼなど）を用いて該環状ヌクレオチドを鋳型にし
てＲＮＡ合成反応を行わせることにより行われる。ＲＮ
Ａポリメラーゼ反応の結果として、プローブヌクレオチ
ド（Ｂ）の相補鎖が繰り返し並んだＲＮＡが合成される
が、このＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮ
Ａを合成し、このｃＤＮＡにプライマーヌクレオチド（
Ｃ）をアニールさせることにより繰り返しＲＮＡポリメ
ラーゼを作用させて大量にＲＮＡを合成することも可能
である。Operation (c): In the presence of a labeled mononucleotide, the probe nucleotide (B') circularized in operation (b) is used as a template, and the probe nucleotide (B') is used as a template.
A nucleic acid synthesis reaction is performed using a nucleic acid polymerase (D) using the primer nucleotide (C) annealed to the primer nucleotide (C) (see FIG. 2(c)). The operation may be performed using, for example, dNTP (
dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and DNA polymerases (e.g. φ29 DNA polymerase, M2 DNA polymerase, T4 DNA polymerase, Thermus aqu
atticus DNA polymerase, Thermus
The elongation reaction is carried out using an enzyme with high nucleic acid synthesis ability such as P. thermophilus DNA polymerase, using the above cyclic nucleotide as a template. This method is described, for example, in the Journal of Molecular Biology.
ular Biology; 56, 341-361, 1
971. ) can be used. These enzymes can proceed with the synthesis of primer extension products while stripping the double-stranded portion of DNA, so they do not necessarily require the target nucleic acid (
There is no need to separate A) and the circularization probe nucleotide (B'). Since the primer extension product has a sequence homologous to the target sequence, the extension product can be used as the target nucleic acid of the probe nucleotide (B) in the same way as the target nucleic acid (A) in operation (a). By repeating this series of operations, a large amount of a specific sequence of nucleic acids can be easily obtained. In addition, the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C) each have an antipromoter sequence,
When a promoter sequence is included, an RNA polymerase suitable for the promoter can be used as the nucleic acid polymerase. The operation is performed using NTP (ATP
, CTP, GTP, UTP) and an RNA polymerase (e.g., T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, etc.) to perform an RNA synthesis reaction using the cyclic nucleotide as a template. . R.N.
As a result of the A polymerase reaction, RNA in which complementary strands of probe nucleotides (B) are repeatedly arranged is synthesized, and this RNA is used as a template to generate cDNA using reverse transcriptase.
Synthesize A and add primer nucleotides (
By annealing C), it is also possible to repeatedly act on RNA polymerase to synthesize a large amount of RNA.
【００２２】操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生
成した増幅核酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少
なくとも一回繰り返す。
操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）の結果、生成した核酸
の標識量を測定する。Step (d): If necessary, repeat steps (a) to (c) at least once using the amplified nucleic acid sequence produced in step (c). Operation (e): Measure the amount of labeled nucleic acid produced as a result of operations (a) to (d).
【００２３】また本発明の上記実施様態（７）の理解の
ために、図３に本発明の原理を模式的に示す。この図３
に基づいて、以下本発明を説明する。尚、図中Ａは標的
核酸、Ｂは直鎖状ブローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化
プローブヌクレオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、
Ｄは核酸ポリメラーゼ、Ｅは標識されたモノヌクレオチ
ドを示す。Further, in order to understand the above embodiment (7) of the present invention, the principle of the present invention is schematically shown in FIG. This figure 3
The present invention will be explained below based on the following. In the figure, A is the target nucleic acid, B is the linear probe nucleotide, B' is the circularized probe nucleotide, C is the primer nucleotide,
D represents a nucleic acid polymerase, and E represents a labeled mononucleotide.
【００２４】操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド
（Ｂ）中の検出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列との
ハイブリッドを形成させる。同時に、または別々にプラ
イマーヌクレオチド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド（
Ｂ）にアニールさせる（図３（ａ）参照）。標的核酸（
Ａ）が二重鎖の場合は加熱、アルカリ処理、酸処理など
により変性して一本鎖とする。加熱変性は例えば８０〜
１０５℃で１〜５分間処理することで実施できる。アル
カリ処理は例えば、０．２〜１規定のＮａＯＨ存在下で
、１〜３０分間処理し、等量のＨＣｌで中和して用いる
ことができる。酸処理は例えば０．０１〜１規定のＨＣ
ｌ存在下で、１〜３０分処理しＮａＯＨで中和して用い
ることができる。他の方法として酵素的に鎖分解を行な
うこともできる。アニールは、好ましくはプローブヌク
レオチド（Ｂ）、およびプライマーヌクレオチド（Ｃ）
について、それぞれ、最大のアニール選択性をもたらす
ように、選択された温度において行う。一般的には標的
核酸（Ａ）とプローブヌクレオチド（Ｂ）、およびプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）とプライマーヌクレオチド（Ｃ
）がそれぞれ特異的に結合し、且つミスマッチによる非
特異的結合が最小となるように、昇温させて行われる。Operation (a): Form a hybrid between the detection sequence in the linear probe nucleotide (B) and the target sequence in the target nucleic acid (A). Simultaneously or separately, the primer nucleotide (C) is added to the probe nucleotide (
B) (see FIG. 3(a)). Target nucleic acid (
If A) is a double strand, it is denatured into a single strand by heating, alkali treatment, acid treatment, etc. Heat denaturation is, for example, 80~
This can be carried out by processing at 105°C for 1 to 5 minutes. The alkali treatment can be carried out, for example, in the presence of 0.2 to 1N NaOH for 1 to 30 minutes, followed by neutralization with an equal amount of HCl. Acid treatment is, for example, 0.01 to 1N HC.
It can be used after being treated for 1 to 30 minutes in the presence of L and neutralized with NaOH. Alternatively, enzymatic chain cleavage can be performed. Annealing preferably involves the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C)
each at a temperature selected to provide maximum annealing selectivity. Generally, target nucleic acid (A) and probe nucleotide (B), and probe nucleotide (B) and primer nucleotide (C
) are specifically bound to each other, and non-specific binding due to mismatch is minimized.
【００２５】操作（ｂ）：上記プローブヌクレオチド（
Ｂ）の５’’末端と３’末端を連結させ環状化プローブ
ヌクレオチド（Ｂ’）とする（図３（ｂ）参照）。該プ
ローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハイ
ブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）
ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素を使用する方法
が好ましい。また互いに隣接していない場合、ＤＮＡポ
リメラーゼおよび／または逆転写酵素によりギャップを
埋めた後、連結酵素により連結することができる。この
場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペアのみ、またはＣ−Ｇペ
アのみで構成されるようにプローブヌクレオチドを設計
しておけば、添加するモノヌクレオチドをそれぞれＡ、
ＴまたはＣ、Ｇのみとすることでミスマッチによりアニ
ールしたオリゴヌクレオチドが間違って伸長されること
を防止する方法もとることができる。連結酵素を使用す
る連結方法については、特開昭６３−２２１９７号公報
および ＷＯ９０／０１０６９ に開示の方法等、公知
の手法により行うことができる。本発明において、標的
核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は６〜４０
ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドの長
さのものが使用される。Operation (b): The above probe nucleotide (
The 5'' and 3' ends of B) are linked to form a circularization probe nucleotide (B') (see FIG. 3(b)). When the 5' end and 3' end of the probe nucleotide (B) are adjacent as a result of hybridization, T4 DNA ligase, T7 DNA ligase, E. coli
DNA ligase, Thermus thermophi
A method using a ligating enzyme such as lus DNA ligase is preferred. If they are not adjacent to each other, the gaps can be filled with DNA polymerase and/or reverse transcriptase, and then linked using a ligating enzyme. In this case, if the probe nucleotides are designed so that the gap portion consists of only A-T pairs or only C-G pairs, the mononucleotides to be added can be
By using only T, C, or G, it is possible to prevent the annealed oligonucleotide from being erroneously extended due to mismatches. The ligation method using a ligating enzyme can be carried out by known methods such as those disclosed in JP-A-63-22197 and WO90/01069. In the present invention, the number of oligonucleotide parts that anneal to the target nucleic acid is 6 to 40.
Nucleotides, preferably 10 to 30 nucleotides in length, are used.
【００２６】操作（ｃ）：操作（ｂ）で環状化したプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオ
チド（Ｃ）を利用して核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用いて
核酸合成反応を行う（図３（ｃ）参照）。該操作は、例
えばｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐの４種のデオキシリボヌクレオチド）およびＤＮＡポ
リメラーゼ（例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ２Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリ
メラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素）を用いて、上記
環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせること
によって行われる。この方法は、例えばジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；５６，３４
１−３６１，１９７１．）に記載されている技術及び条
件を用いることができる。これらの酵素は、ＤＮＡの二
重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成をすす
めていくことができるので、当該操作に先だって、必ず
しも標的核酸（Ａ）と環状化プローブヌクレオチド（Ｂ
’）を分離する必要はない。プライマー伸長物は、標的
配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操作（ａ）
における標的核酸（Ａ）と同様にプローブヌクレオチド
（Ｂ）の標的核酸として利用されうる。この一連の操作
を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便に大量に
得ることができる。 また、プローブヌクレオチド（
Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ）にそれぞれアンチ
プロモーター配列、プロモーター配列が含まれている場
合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに応じ
たＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。当該操作
は、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）の４種
のリボヌクレオチド）およびＲＮＡポリメラーゼ（例え
ば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ
、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなど）を用いて該環状ヌク
レオチドを鋳型にしてＲＮＡ合成反応を行わせることに
より行われる。ＲＮＡポリメラーゼ反応の結果として、
プローブヌクレオチド（Ｂ）の相補鎖が繰り返し並んだ
ＲＮＡが合成されるが、このＲＮＡを鋳型として逆転写
酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡにプライ
マーヌクレオチド（Ｃ）をアニールさせることにより繰
り返しＲＮＡポリメラーゼを作用させて大量にＲＮＡを
合成することも可能である。Operation (c): Using the probe nucleotide (B') circularized in operation (b) as a template and the primer nucleotide (C) annealed to the probe nucleotide (B'), nucleic acid polymerase (D ) to carry out a nucleic acid synthesis reaction (see FIG. 3(c)). The operation may include, for example, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTT
four deoxyribonucleotides of P) and DNA polymerases (e.g. φ29 DNA polymerase, M2D
NA polymerase, T4 DNA polymerase, Ther
mus aquaticus DNA polymerase, T
The elongation reaction is carried out using an enzyme with high nucleic acid synthesis ability, such as Hermus thermophilus DNA polymerase, using the above-mentioned cyclic nucleotide as a template. This method is described, for example, in the Journal of Molecular Biology.
f Molecular Biology; 56, 34
1-361, 1971. ) can be used. These enzymes can proceed with the synthesis of primer extension products while stripping the double-stranded portion of DNA, so they do not necessarily require the target nucleic acid (A) and the circularized probe nucleotide (B) to be synthesized prior to the operation.
') need not be separated. Since the primer extension product has a sequence homologous to the target sequence, the extension product is subjected to operation (a).
Similarly to the target nucleic acid (A) in , it can be used as the target nucleic acid of the probe nucleotide (B). By repeating this series of operations, a large amount of a specific sequence of nucleic acids can be easily obtained. In addition, the probe nucleotide (
B) When the primer nucleotide (C) contains an anti-promoter sequence and a promoter sequence, respectively, an RNA polymerase suitable for the promoter can be used as the nucleic acid polymerase. This operation involves performing an RNA synthesis reaction using the cyclic nucleotide as a template using NTP (four types of ribonucleotides: ATP, CTP, GTP, UTP) and RNA polymerase (e.g., T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, etc.). This is done by making the user perform the following steps. As a result of the RNA polymerase reaction,
RNA in which complementary strands of probe nucleotides (B) are repeatedly arranged is synthesized. Using this RNA as a template, cDNA is synthesized using reverse transcriptase, and by annealing primer nucleotides (C) to this cDNA, RNA is repeatedly synthesized. It is also possible to synthesize RNA in large quantities by using polymerase.
【００２７】操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生
成した増幅核酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少
なくとも一回繰り返す。Step (d): If necessary, repeat steps (a) to (c) at least once using the amplified nucleic acid sequence produced in step (c).
【００２８】操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、
生成した核酸と標識された核酸プローブとのハイブリッ
ドを形成させる。Operation (e): After operations (a) to (d),
A hybrid is formed between the generated nucleic acid and the labeled nucleic acid probe.
【００２９】操作（ｆ）：ハイブリッドを形成した標識
核酸プローブの標識量を測定する。Step (f): Measure the amount of labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
【００３０】標識核酸プローブは、標識物として放射性
同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ハプ
テン等の公知の標識物質を利用することができる。核酸
プローブはプローブヌクレオチド（Ｂ）の相同鎖の配列
を持つように設計し、該核酸プローブと合成された核酸
をハイブリダイズさせれば、該プローブを検出すること
で実施できる。この場合、標識プローブは該プローブヌ
クレオチド（Ｂ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ）
と相補的な配列部分を含まないように設計されているの
で、既に存在しているこれらのヌクレオチドの配列の影
響を受けることなく、該合成核酸を効率よく検出するこ
とができる。したがって、該合成核酸を該プライマーヌ
クレオチド（Ｃ）から分離して測定する必要がない。本
方法は、標的核酸の配列、構造等には特に制限されない
ので、その応用範囲は広い。The labeled nucleic acid probe can use known labeling substances such as radioactive isotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, biotin, and haptens. The nucleic acid probe is designed to have a sequence of a homologous strand of the probe nucleotide (B), and if the nucleic acid probe and the synthesized nucleic acid are hybridized, the probe can be detected. In this case, the labeled probe is the probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C).
Since the synthetic nucleic acid is designed not to contain any complementary sequence portion, the synthetic nucleic acid can be efficiently detected without being affected by the already existing nucleotide sequences. Therefore, it is not necessary to separate and measure the synthetic nucleic acid from the primer nucleotide (C). This method has a wide range of applications because it is not particularly limited by the sequence, structure, etc. of the target nucleic acid.
【００３１】[0031]
【発明の効果】本発明の検出法によれば、プローブヌク
レオチドの２つの末端が標的核酸にアニールして連結さ
れた場合にのみ増幅反応が行われ、標的核酸の有無が検
出される。従ってオリゴヌクレオチドの塩基配列による
特異性と、２つの末端が連結される条件を満たす特異性
の２つの特異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制
される。従って核酸の特定の配列の有無を特異的に検出
することが可能である。また、ヘリカーゼ様活性を有す
る核酸ポリメラーゼを用いることにより、環状化したプ
ローブヌクレオチド１分子から複数の核酸配列が生成さ
れるので、効率よく検出することが可能である。生成し
た核酸配列を利用して反応をサイクル化することにより
、より大量に増幅し、検出感度を高めることもまた可能
である。さらに、本発明はプローブを増幅する方法では
ないので、ミスマッチや非特異的ハイブリダイゼーショ
ンにより残存したプローブの増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Ｓｉ
ｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ）比を増加させることができる。According to the detection method of the present invention, the amplification reaction is performed only when the two ends of the probe nucleotide are annealed and linked to the target nucleic acid, and the presence or absence of the target nucleic acid is detected. Therefore, two specificities are required: specificity due to the base sequence of the oligonucleotide and specificity that satisfies the conditions for linking the two ends, and non-specific reactions are suppressed accordingly. Therefore, it is possible to specifically detect the presence or absence of a specific sequence of nucleic acids. Furthermore, by using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity, multiple nucleic acid sequences are generated from one molecule of circularized probe nucleotide, so that efficient detection is possible. It is also possible to amplify a larger amount and increase detection sensitivity by cycling the reaction using the generated nucleic acid sequence. Furthermore, since the present invention is not a method for amplifying probes, there is no amplification of probes remaining due to mismatches or non-specific hybridization, and S/N (Si
gnal/Noise) ratio can be increased.
【００３２】[0032]
【実施例】以下に、本発明の実施例及び比較例を例示す
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない
。
（参考例１）
各種オリゴヌクレオチドの合成
ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合
成した。
■プローブヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチド■）
：本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅ
ｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓ
ｉｎ）遺伝子の８７番目から１０４番目、および１０５
番目から１２６番目のヌクレオチド配列、Ｔ７プロモー
ター配列と相補的な配列を有する（配列表１）。また、
５’末端にリン酸基が結合している。
■プライマーヌクレオチド（第二オリゴヌクレオチド■
）：本オリゴヌクレオチドはＴ７プロモーターの配列を
有する（配列表２）。
■腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄ
ｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ）遺伝子の９５番目
から１１８番目の配列を有するオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（配列表３）。但し５’末端のリン酸基は３２Ｐが
標識されている。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、０
．２μＭスケールで実施した。各種オリゴヌクレオチド
の脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実施した。精製
はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラムにて実施した
。なお合成したオリゴヌクレオチドは必要により以下の
方法で５’末端にリン酸基を結合させた。
オリゴヌクレオチド
５ 〜 ２０ ｐｍｏｌｅｓ
１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
１０ μｌ １ ｍＭ Ａ
ＴＰ
１ μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製）
１０ 単位水を加えて全量を１００μｌとして、
３７℃で １時間反応させる。ここで １０×Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ緩衝液とは、
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．１Ｍ
ＭｇＣｌ２
０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを示す。EXAMPLES The effects of the present invention will be made clearer by illustrating Examples and Comparative Examples of the present invention, but the present invention is not limited by these Examples. (Reference Example 1) Synthesis of various oligonucleotides Oligonucleotides having the following sequences were synthesized by the phosphoramidite method using ABI DNA Synthesizer Model 391. ■Probe nucleotide (first oligonucleotide■)
: This oligonucleotide is used for Vibrio parahaemolyticus TDH (The
rmostable Direct Haemolys
in) gene positions 87 to 104, and 105
The nucleotide sequence from position 1 to 126 has a sequence complementary to the T7 promoter sequence (Sequence Listing 1). Also,
A phosphate group is attached to the 5' end. ■Primer nucleotide (second oligonucleotide■
): This oligonucleotide has a T7 promoter sequence (Sequence Listing 2). ■Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable D
An oligonucleotide probe having the sequence from position 95 to position 118 of the irect Haemolysin) gene (Sequence Listing 3). However, the phosphate group at the 5' end is labeled with 32P. The method is according to the ABI manual, 0
．． Performed on a 2 μM scale. Deprotection of various oligonucleotides was carried out with aqueous ammonia at 55°C overnight. Purification was performed using a reverse phase column using FPLC manufactured by Pharmacia. Note that the synthesized oligonucleotide was bonded with a phosphate group at its 5' end by the following method, if necessary. oligonucleotide
5 to 20 pmoles
10x T4 polynucleotide kinase buffer
10 μl 1 mM A
T.P.
1 μl
T4 polynucleotide kinase (manufactured by Toyobo)
Add 10 units of water to make the total volume 100μl,
Incubate at 37°C for 1 hour. Here, the 10xT4 polynucleotide kinase buffer is 0.5M Tris-HCl (pH 8.0) 0.1M
MgCl2 0.1M 2-mercaptoethanol is shown.
【００３３】（参考例２）
標的核酸を検出するためのキット
（ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド■（イ）実施
例１の第二オリゴヌクレオチド■（ウ）Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（東洋紡製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋
紡製）、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ(Reference Example 2) Kit for detecting target nucleic acid (a) First oligonucleotide of Example 1 ■ (B) Second oligonucleotide of Example 1 ■ (C) T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) , T7 RNA polymerase (manufactured by Toyobo), ATP, CTP, GTP, UTP
【００３４】
（参考例３）
標的核酸を検出するためのキット
（ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド■（イ）実施
例１の第二オリゴヌクレオチド■（ウ）Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（東洋紡製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋
紡製）、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（エ）実施例
１のオリゴヌクレオチドプローブ■[0034]
(Reference Example 3) Kit for detecting target nucleic acid (a) First oligonucleotide of Example 1 ■ (B) Second oligonucleotide of Example 1 ■ (C) T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo), T7 RNA Polymerase (manufactured by Toyobo), ATP, CTP, GTP, UTP (d) Oligonucleotide probe of Example 1■
【００３５】（参考
例４）
標的核酸を検出するためのキット
（ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド■（イ）実施
例１の第二オリゴヌクレオチド■（ウ）Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（東洋紡製） 、 Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ
（東洋紡製） 、ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ 、 ｄＴＴ
Ｐ（エ）実施例１のオリゴヌクレオチドプローブ■(Reference Example 4) Kit for detecting target nucleic acid (a) First oligonucleotide of Example 1 ■ (B) Second oligonucleotide of Example 1 ■ (C) T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) , Tth DNA polymerase (manufactured by Toyobo), dATP, dCTP, dTT
P(d) Oligonucleotide probe of Example 1■
【０
０３６】（実施例１）
実施例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
１）
操作（ａ）
参考例１の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌと
、ＴＤＨ産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸１μｇとを共に１０μｌのリガーゼ用
反応液に加えた。９４℃に２分間保った後５０℃に５分
間保温し、アニールさせた。対照として、ゲノム核酸を
混合しない反応液を用意した。
リガーゼ用反応液
６６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６
）６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ ｍＭ ジチオスレイトール６６ μＭ
ＡＴＰ
操作（ｂ）
上記反応液１０μｌに、第二オリゴヌクレオチド■０．
１ｎｍｏｌを加え、操作（ａ）と同様の操作により、環
状化した第一オリゴヌクレオチド■にアニールさせた。
操作（ｃ）
次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
５’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｄ）
上記反応液に水４０μｌ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反
応液５０μｌ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ １０
単位を加え、操作（ｃ）で連結した環状オリゴヌクレオ
チドを鋳型として、３７℃で３０分間保温することによ
り増幅反応を実施した。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応液
８０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
）１０ ｍＭ ジチオスレイトール４ ｍ
Ｍ スペルミジン
８ ｍＭ ＭｇＣｌ２
５０ ｍＭ ＮａＣｌ
１６０ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
０．０２ ％ トリトン Ｘ−１００２
ｍＭ ＡＴＰ， ＧＴＰ， ＵＴＰ２ ｍ
Ｍ ３２Ｐ−ｄＣＴＰ操作（ｅ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、Ｘ線フィルム
（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ， 富士写真工業）を密着させ
、−８０ ℃で１ 昼夜感光させた。その結果、ゲノム
核酸を加えた反応液では、高分子のＲＮＡ が合成され
ていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のＲ
ＮＡ の合成はみられなかった。0
(Example 1) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Example 2 (
1) Procedure (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide ■ of Reference Example 1 and 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus were added together to 10 μl of ligase reaction solution. . The temperature was maintained at 94°C for 2 minutes and then at 50°C for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Ligase reaction solution 66 mM Tris-HCl (pH 7.6
) 6.6 mM MgCl2 10 mM Dithiothreitol 66 μM
ATP operation (b) 0.0 μl of the second oligonucleotide was added to 10 μl of the above reaction solution.
1 nmol was added and annealed to the circularized first oligonucleotide (2) in the same manner as in step (a). Operation (c) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to link the 5' end and 3' end of the first oligonucleotide. Step (d) Add 40 μl of water, 50 μl of T7 RNA polymerase reaction solution, and 10 μl of T7 RNA polymerase to the above reaction solution.
An amplification reaction was carried out by adding the units and incubating at 37° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in step (c) as a template. T7 RNA polymerase reaction solution 80 mM Tris-HCl (pH 8.0
) 10mM dithiothreitol 4m
M Spermidine 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02% Triton X-1002
mM ATP, GTP, UTP2 m
M 32P-dCTP operation (e) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. After thoroughly washing the nylon membrane, it was dried, an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industries) was adhered to it, and it was exposed to light at -80°C for 1 day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution without genomic nucleic acid.
No synthesis of NA was observed.
【００３７】（実施例２）
参考例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
２）
操作（ａ）
参考例１ の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌ
と第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍｏｌとを１０
μｌのリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に２分間保っ
た後５０℃に５分間保温し、アニールさせた。
操作（ｂ）
上記反応液に、ＴＤＨ産性腸炎ビブリオの培養菌体から
分離、部分精製したゲノム核酸１μｇを加え第一オリゴ
ヌクレオチド とアニールさせ、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ１単位（東洋紡製）を加え３７℃で１時間反応させる
ことにより、第一オリゴヌクレオチドの５’末端と３’
末端を連結させた。
対照として、ゲノム核酸を混合しない反応液を用意した
。
操作（ｃ）
上記反応液１０μｌに水４０μｌ、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ反応液５０μｌ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼ １０単位を加え、操作（ｂ）で連結した環状オリゴ
ヌクレオチドを鋳型として、３７℃で３０分間保温する
ことにより増幅反応を実施した。
操作（ｄ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、Ｘ線フィルム
（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ， 富士写真工業）を密着させ
、−８０℃で１昼夜感光させた。その結果、ゲノム核酸
を加えた反応液では、高分子のＲＮＡが合成されていた
が、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のＲＮＡの
合成はみられなかった。(Example 2) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Reference Example 2 (
2) Operation (a) First oligonucleotide of Reference Example 1 ■0.1 nmol
and second oligonucleotide ■ 0.1 nmol and 10
It was added to μl of the ligase reaction solution. The temperature was maintained at 94°C for 2 minutes and then at 50°C for 5 minutes for annealing. Procedure (b) To the above reaction solution, 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus was added, annealed with the first oligonucleotide, and 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added at 37°C. By reacting for 1 hour at
The ends were ligated. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Step (c) Add 40 μl of water, 50 μl of T7 RNA polymerase reaction solution, and 10 units of T7 RNA polymerase to 10 μl of the above reaction solution, and incubate at 37° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in step (b) as a template. The amplification reaction was carried out by Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel, and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. After thoroughly washing the nylon membrane, it was dried, an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industries) was adhered to it, and it was exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but no synthesis of high-molecular RNA was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００３８】（実施例３）
参考例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
３）
操作（ａ）
参考例１の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌと
第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍｏｌとを、ＴＤ
Ｈ産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製した
ゲノム核酸１μｇと共に１０μｌのリガーゼ用反応液に
加えた。９４℃に２分間保った後５０℃に５分間保温し
、アニールさせた。対照として、ゲノム核酸を混合しな
い反応液を用意した。
操作（ｂ）
次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
５’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｃ）
上記反応液１０μｌに水４０μｌ、下記反応液５０μｌ
、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ１０単位を加え、操
作（ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型とし
て、増幅反応を実施した。
操作（ｄ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、Ｘ線フィルム
（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ， 富士写真工業）を密着させ
、−８０℃で１昼夜感光させた。その結果、ゲノム核酸
を加えた反応液では、高分子のＲＮＡが合成されていた
が、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のＲＮＡの
合成はみられなかった。(Example 3) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Reference Example 2 (
3) Operation (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide ■ of Reference Example 1 and 0.1 nmol of the second oligonucleotide ■ were added to TD
The mixture was added to 10 μl of a ligase reaction solution together with 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of H-producing Vibrio parahaemolyticus. The temperature was maintained at 94°C for 2 minutes and then at 50°C for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to link the 5' end and 3' end of the first oligonucleotide. Procedure (c) Add 10 μl of the above reaction solution, 40 μl of water, and 50 μl of the following reaction solution.
, and 10 units of T7 RNA polymerase were added, and an amplification reaction was performed using the circular oligonucleotide linked in step (b) as a template. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel, and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. After thoroughly washing the nylon membrane, it was dried, an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industries) was adhered to it, and it was exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but no synthesis of high-molecular RNA was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００３９】（実施例４）
実施例２のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
４）
操作（ａ）
参考例１ の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌ
と、ＴＤＨ産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分
精製したゲノム核酸１μｇとを共に１０μｌのリガーゼ
用反応液に加えた。９４℃に２分間保った後５０℃に５
分間保温し、アニールさせた。対照として、ゲノム核酸
を混合しない反応液を用意した。
操作（ｂ）
次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
５’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｃ）
上記反応液１０μｌに、第二オリゴヌクレオチド■０．
１ｎｍｏｌ を加え、操作（ａ）と同様の操作により、
環状化した第一オリゴヌクレオチド■にアニールさせた
。次に反応液に水４０μｌ、下記反応液５０μｌ、およ
びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ １０単位を加え、操作（
ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、
３７℃で３０分間保温することにより増幅反応を実施し
た。
操作（ｄ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させ、Ｘ線フィルム
（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ， 富士写真工業）を密着させ
、−８０℃で１昼夜感光させた。その結果、ゲノム核酸
を加えた反応液では、高分子のＲＮＡが合成されていた
が、ゲノム核酸を含まない反応液では高分子のＲＮＡの
合成はみられなかった。(Example 4) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Example 2 (
4) Operation (a) First oligonucleotide of Reference Example 1 ■0.1 nmol
and 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus were added to 10 μl of a ligase reaction solution. Hold at 94℃ for 2 minutes, then heat to 50℃ for 5 minutes.
It was kept warm for a minute to anneal. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to link the 5' end and 3' end of the first oligonucleotide. Operation (c) Add 0.0 μl of the second oligonucleotide to 10 μl of the above reaction solution.
Add 1 nmol and perform the same operation as step (a).
The circularized first oligonucleotide (■) was annealed. Next, 40 μl of water, 50 μl of the following reaction solution, and 10 units of T7 RNA polymerase were added to the reaction solution, and the procedure (
Using the cyclic oligonucleotide linked in b) as a template,
Amplification reaction was performed by incubating at 37°C for 30 minutes. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel, and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. After thoroughly washing the nylon membrane, it was dried, an X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industries) was adhered to it, and it was exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but no synthesis of high-molecular RNA was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４０】（実施例５）
参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
１）
操作（ａ）
参考例１の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌと
、ＴＤＨ産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸１μｇとを共に１０μｌのリガーゼ用
反応液に加えた。９４℃に２分間保った後５０℃に５分
間保温し、アニールさせた。対照として、ゲノム核酸を
混合しない反応液を用意した。
リガーゼ用反応液
６６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．
６）６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０ ｍＭ ジチオスレイトール６６μＭ
ＡＴＰ
操作（ｂ）
上記反応液１０μｌに、第二オリゴヌクレオチド■０．
１ｎｍｏｌを加え、操作（ａ）と同様の操作により、環
状化した第一オリゴヌクレオチド■にアニールさせた。
操作（ｃ）
次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
５’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｄ）
上記反応液に水４０μｌ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反
応液５０μｌ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ １０
単位を加え、操作（ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオ
チドを鋳型として、３７℃で３０分間保温することによ
り増幅反応を実施した。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応液
８０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
）１０ ｍＭ ジチオスレイトール４ ｍ
Ｍ スペルミジン
８ ｍＭ ＭｇＣｌ２
５０ ｍＭ ＮａＣｌ
１６０ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
０．０２ ％ トリトン Ｘ−１００２
ｍＭ ＡＴＰ， ＧＴＰ， ＵＴＰ， ＣＴ
Ｐ操作（ｅ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を６×ＳＳＣ、５×デーンハート液、１ｍＭ
ＥＤＴＡ 、１０μｇ の煮沸したサケ精子ＤＮＡ
（平均５００ 塩基）を含む液１００ μｌ中で、６
０℃、１時間、プレハイブリダイズした後、上記液に実
施例１で調製したオリゴヌクレオチドプローブ を加
え、６０℃で１時間、ハイブリダイズした。６０℃の６
×ＳＳＣ中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾燥させた
。Ｘ線フィルム（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ， 富士写真工
業）を密着させ、−８０℃で１昼夜感光させた。その結
果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子のＲＮＡが
合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反応液では高
分子のＲＮＡの合成はみられなかった。(Example 5) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Reference Example 3 (
1) Procedure (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide ■ of Reference Example 1 and 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus were added together to 10 μl of ligase reaction solution. . The temperature was maintained at 94°C for 2 minutes and then at 50°C for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Ligase reaction solution 66 mM Tris-HCl (pH 7.
6) 6.6mM MgCl2 10mM dithiothreitol 66μM
ATP operation (b) 0.0 μl of the second oligonucleotide was added to 10 μl of the above reaction solution.
1 nmol was added and annealed to the circularized first oligonucleotide (2) in the same manner as in step (a). Operation (c) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to link the 5' end and 3' end of the first oligonucleotide. Step (d) Add 40 μl of water, 50 μl of T7 RNA polymerase reaction solution, and 10 μl of T7 RNA polymerase to the above reaction solution.
An amplification reaction was carried out by adding the units and incubating at 37° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in step (b) as a template. T7 RNA polymerase reaction solution 80 mM Tris-HCl (pH 8.0
) 10mM dithiothreitol 4m
M Spermidine 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02% Triton X-1002
mM ATP, GTP, UTP, CT
P operation (e) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. Nylon membrane with 6x SSC, 5x Danehart's solution, 1mM
EDTA, 10 μg boiled salmon sperm DNA
(500 bases on average) in 100 μl of solution containing 6
After prehybridizing at 0°C for 1 hour, the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution, and hybridization was performed at 60°C for 1 hour. 6 at 60℃
After thoroughly washing the nylon membrane in ×SSC, it was dried. An X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industries) was brought into close contact with the film, and the film was exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but no synthesis of high-molecular RNA was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４１】（実施例６）
参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
２）
操作（ａ）
参考例１ の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌ
と第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍｏｌとを１
０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に２分間
保った後５０℃に５分間保温し、アニールさせた。
操作（ｂ）
上記反応液に、ＴＤＨ産性腸炎ビブリオの培養菌体から
分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ を加え、第一
オリゴヌクレオチド■とアニールさせ、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ １単位（東洋紡製）を加え３７℃で１時間反応
させることにより、第一オリゴヌクレオチドの５’末端
と３’末端を連結させた。対照として、ゲノム核酸を混
合しない反応液を用意した。
操作（ｃ）
上記反応液１０μｌ に水４０μｌ 、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼ反応液５０μｌ 、およびＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼ １０ 単位を加え、操作（ｂ）で連結した環
状オリゴヌクレオチドを鋳型として、３７℃で３０分間
保温することにより増幅反応を実施した。
操作（ｄ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を６ ×ＳＳＣ 、５ ×デーンハート液、
１ｍＭ ＥＤＴＡ 、１０μｇ の煮沸したサケ精子
ＤＮＡ （平均５００ 塩基）を含む液１００ μｌ中
で、６０℃、１ 時間、プレハイブリダイズした後、上
記液に実施例１で調製したオリゴヌクレオチドプローブ
を加え、６０℃で１時間、ハイブリダイズした。６
０℃の６×ＳＳＣ中でナイロン膜を十分洗浄した後、乾
燥させた。Ｘ線フィルム（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ， 富
士写真工業）を密着させ、−８０ ℃で１昼夜感光させ
た。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子
のＲＮＡ が合成されていたが、ゲノム核酸を含まない
反応液では高分子のＲＮＡ の合成はみられなかった。(Example 6) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Reference Example 3 (
2) Operation (a) First oligonucleotide of Reference Example 1 ■0.1 nmol
and second oligonucleotide ■ 0.1 nmol and 1
Added to 0 μl of ligase reaction solution. The temperature was maintained at 94°C for 2 minutes and then at 50°C for 5 minutes for annealing. Procedure (b) To the above reaction solution, 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus was added, annealed with the first oligonucleotide ■, and 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added. The 5' end and 3' end of the first oligonucleotide were linked by reacting at 37° C. for 1 hour. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Step (c) Add 40 μl of water, 50 μl of T7 RNA polymerase reaction solution, and 10 units of T7 RNA polymerase to 10 μl of the above reaction solution, and incubate at 37° C. for 30 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in step (b) as a template. The amplification reaction was carried out by Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel, and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. Nylon membrane with 6 x SSC, 5 x Danhardt's solution,
After prehybridizing for 1 hour at 60°C in 100 μl of a solution containing 1 mM EDTA and 10 μg of boiled salmon sperm DNA (500 bases on average), the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution. Hybridization was performed at 60°C for 1 hour. 6
The nylon membrane was thoroughly washed in 6×SSC at 0° C. and then dried. An X-ray film (New AIF RX, Fuji Photo Industries) was attached and exposed at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution to which genomic nucleic acid was added, but no synthesis of high-molecular-weight RNA was observed in the reaction solution that did not contain genomic nucleic acid.
【００４２】（実施例７）
参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
３）
操作（ａ）
参考例１ の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌ
と第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍｏｌとを、
ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸１ μｇ と共に１０μｌ のリガー
ゼ用反応液に加えた。９４℃に２分間保った後５０℃に
５ 分間保温し、アニールさせた。対照として、ゲノム
核酸を混合しない反応液を用意した。
操作（ｂ）
次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位（東洋紡製）を加え
３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの５
’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｃ）
上記反応液１０μｌに水４０μｌ、下記反応液５０μｌ
、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ１０ 単位を加え、
操作（ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型と
して、増幅反応を実施した。
操作（ｄ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を６×ＳＳＣ、５×デーンハート液、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０μｇの煮沸したサケ精子ＤＮＡ（平
均５００塩基）を含む液１００μｌ中で、６０℃、１時
間、プレハイブリダイズした後、上記液に実施例１で調
製したオリゴヌクレオチドプローブ を加え、６０℃
で１時間、ハイブリダイズした。
６０℃の６×ＳＳＣ中でナイロン膜を十分洗浄した後、
乾燥させた。Ｘ線フィルム（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ，
富士写真工業）を密着させ、−８０℃で１昼夜感光させ
た。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子
のＲＮＡが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反
応液では高分子のＲＮＡの合成はみられなかった。(Example 7) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Reference Example 3 (
3) Operation (a) First oligonucleotide of Reference Example 1 ■0.1 nmol
and second oligonucleotide ■ 0.1 nmol,
It was added to 10 μl of a ligase reaction solution together with 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus. It was kept at 94°C for 2 minutes and then kept at 50°C for 5 minutes to anneal. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to remove the 5-nucleotide of the first oligonucleotide.
The 'end and 3' end were ligated. Procedure (c) Add 10 μl of the above reaction solution, 40 μl of water, and 50 μl of the following reaction solution.
, and 10 units of T7 RNA polymerase,
An amplification reaction was performed using the cyclic oligonucleotide linked in step (b) as a template. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel, and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. Nylon membrane with 6x SSC, 5x Danehart's solution, 1mM
After prehybridizing for 1 hour at 60°C in 100 μl of a solution containing EDTA and 10 μg of boiled salmon sperm DNA (500 bases on average), the oligonucleotide probe prepared in Example 1 was added to the above solution and incubated at 60°C.
Hybridization was carried out for 1 hour. After thoroughly washing the nylon membrane in 6×SSC at 60°C,
Dry. X-ray film (New AIF RX,
Fuji Photo Industries) was brought into close contact with the film and exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but no synthesis of high-molecular RNA was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４３】（実施例８）
参考例３のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法（
４）
操作（ａ）
参考例１の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌと
、ＴＤＨ産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸１μｇとを共に１０μｌのリガーゼ用
反応液に加えた。９４℃に２分間保った後５０℃に５分
間保温し、アニールさせた。対照として、ゲノム核酸を
混合しない反応液を用意した。
操作（ｂ）
次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
５’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｃ）
上記反応液１０μｌに、第二オリゴヌクレオチド■０．
１ｎｍｏｌを加え、操作（ａ）と同様の操作により、環
状化した第一オリゴヌクレオチド にアニールさせた
。次に反応液に水４０μｌ、下記反応液５０μｌ、およ
びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ １０単位を加え、操作（
ｂ）で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、
３７℃で３０分間保温することにより増幅反応を実施し
た。
操作（ｄ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜ＧｅｎｅＳｃｅｅｎ ｐｌｕｓ（ＤｕＰｏｎｔ社
製）にブロットした。
ナイロン膜を６×ＳＳＣ、５×デーンハート液、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０μｇの煮沸したサケ精子ＤＮＡ（平
均５００塩基）を含む液１００μｌ中で、６０℃、１時
間、プレハイブリダイズした後、上記液に実施例１で調
製したオリゴヌクレオチドプローブ■を加え、６０℃で
１時間、ハイブリダイズした。
６０℃の６×ＳＳＣ中でナイロン膜を十分洗浄した後、
乾燥させた。Ｘ線フィルム（Ｎｅｗ ＡＩＦ ＲＸ，
富士写真工業）を密着させ、−８０℃で１昼夜感光させ
た。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、高分子
のＲＮＡが合成されていたが、ゲノム核酸を含まない反
応液では高分子のＲＮＡの合成はみられなかった。(Example 8) Target nucleic acid amplification and detection method using the kit of Reference Example 3 (
4) Procedure (a) 0.1 nmol of the first oligonucleotide ■ of Reference Example 1 and 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus were added together to 10 μl of ligase reaction solution. . The temperature was maintained at 94°C for 2 minutes and then at 50°C for 5 minutes for annealing. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Operation (b) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to link the 5' end and 3' end of the first oligonucleotide. Operation (c) Add 0.0 μl of the second oligonucleotide to 10 μl of the above reaction solution.
1 nmol was added and annealed to the circularized first oligonucleotide in the same manner as in step (a). Next, 40 μl of water, 50 μl of the following reaction solution, and 10 units of T7 RNA polymerase were added to the reaction solution, and the procedure (
Using the cyclic oligonucleotide linked in b) as a template,
Amplification reaction was performed by incubating at 37°C for 30 minutes. Operation (d) Thereafter, electrophoresis was performed on agarose gel, and blotted onto a nylon membrane GeneSceen plus (manufactured by DuPont) using a conventional method. Nylon membrane with 6x SSC, 5x Danehart's solution, 1mM
After prehybridizing for 1 hour at 60°C in 100 μl of a solution containing EDTA and 10 μg of boiled salmon sperm DNA (average 500 bases), oligonucleotide probe ■ prepared in Example 1 was added to the above solution, Hybridization was carried out for 1 hour at ℃. After thoroughly washing the nylon membrane in 6×SSC at 60°C,
Dry. X-ray film (New AIF RX,
Fuji Photo Industries) was brought into close contact with the film and exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, high-molecular RNA was synthesized in the reaction solution containing genomic nucleic acid, but no synthesis of high-molecular RNA was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４４】（実施例９）
参考例４のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法操
作（ａ）
参考例１の第一オリゴヌクレオチド■０．１ｎｍｏｌ
と、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部
分精製したゲノム核酸１μｇとを１０μｌ のリガーゼ
用反応液に加えた。９４℃に２分間保った後、５０℃に
５分間保温し、アニールさせた。対照として、ゲノム核
酸を混合しない反応液を用意した。
リガーゼ用反応液
６６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （Ｐｈ７．
６）６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０ ｍＭ
ジチオスレイトール６６ μＭ
ＡＴＰ
操作（ｂ）
上記反応液１０μｌ に、第二オリゴヌクレオチド■０
．１ｎｍｏｌを加え、操作（ａ）と同様の操作により、
環状化した第一オリゴヌクレオチド■にアニールさせた
。
操作（ｃ）
次に Ｔ４ ＤＮＡ リガーセ １単位（東洋紡製）を
加え、３７℃で１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチ
ドの５’末端と３’末端を連結させた。
操作（ｄ）
上記反応液に水４０μｌ 、Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラ
ーゼ反応液５０μｌ 、およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラ
ーゼ４単位を加え、操作（ｃ）で連結した環状オリゴヌ
クレオチドを鋳型として、７５℃で６０分間保温するこ
とにより増幅反応を実施した。
Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ反応液
６７ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．
８）１６．６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ６．
７ｍＭ ＭｇＣｌ２
２ ｍＭ ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴ
Ｐ２ ｍＭ ３２Ｐ−ｄＣＴＰ操作（ｅ）
その後、アガロースゲルで電気泳動し、常法によりナイ
ロン膜 ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎｐｌｕｓ （ＤｕＰｏｎ
ｔ社製） にブロットした。ナイロン膜を十分洗浄した
後、乾燥させ、Ｘ線フィルム （Ｎｅｗ ＡｌＦ ＲＸ
，富士写真工業） を密着させ、−８０ ℃で１昼夜感
光させた。その結果、ゲノム核酸を加えた反応液では、
高分子のＤＮＡ が合成されていたが、ゲノム核酸を含
まない反応液では高分子のＤＮＡ の合成は見られなか
った。(Example 9) Procedure for amplification and detection of target nucleic acid using the kit of Reference Example 4 (a) First oligonucleotide of Reference Example 1 0.1 nmol
and 1 μg of genomic nucleic acid isolated and partially purified from cultured cells of TDH-producing Vibrio parahaemolyticus were added to 10 μl of a ligase reaction solution. After being kept at 94°C for 2 minutes, it was kept at 50°C for 5 minutes to anneal. As a control, a reaction solution without genomic nucleic acid was prepared. Ligase reaction solution 66 mM Tris-HCl (Ph7.
6) 6.6mM MgCl2 10mM
Dithiothreitol 66 μM
ATP operation (b) Add the second oligonucleotide ■0 to 10 μl of the above reaction solution.
．． Add 1 nmol and perform the same operation as step (a).
The circularized first oligonucleotide (■) was annealed. Operation (c) Next, 1 unit of T4 DNA ligase (manufactured by Toyobo) was added and reacted at 37°C for 1 hour to link the 5' end and 3' end of the first oligonucleotide. Step (d) Add 40 μl of water, 50 μl of Tth DNA polymerase reaction solution, and 4 units of Tth DNA polymerase to the above reaction solution, and incubate at 75° C. for 60 minutes using the cyclic oligonucleotide linked in Step (c) as a template. Amplification reactions were performed. Tth DNA polymerase reaction solution 67 mM Tris-HCl (pH 8.
8) 16.6mM (NH4)2SO4 6.
7mM MgCl2 2mM dATP, dGTP, dTT
P2 mM 32P-dCTP operation (e) After that, electrophoresis was performed on agarose gel, and a nylon membrane GeneScreenplus (DuPon
(manufactured by T). After thoroughly washing the nylon membrane, it was dried and exposed to X-ray film (New AlF RX).
, Fuji Photo Industries) and exposed to light at -80°C for one day and night. As a result, in the reaction solution containing genomic nucleic acid,
Although high-molecular DNA was synthesized, no high-molecular DNA synthesis was observed in the reaction solution containing no genomic nucleic acid.
【００４５】配列番号：１
配列の長さ：１１３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ
存在位置：２２．．３８
特徴を決定した方法：Ｓ
他の特徴：Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列存在位
置：１．．１８
他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ）遺伝子の
１０５番目から１２６番目の配列存在位置：９２．．１
１３
他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ）遺伝子の
８７番目から１０４番目のヌクレオチド配列配列
ＧＡＴＧＡＧＡＴＡＴ ＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴ ＴＣＡ
ＡＡＴＣＴＣＣ ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧ ＴＣＧＴＡＴ
ＴＡＡＡ ＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴ ６０ＡＧＴ
ＧＴＣＡＣＣＴ ＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡ ＣＴＡＧＴＴ
ＣＴＡＧ ＡＧＣＧＧＴＴＴＣＣ ＴＧＣＣＣＣＣＧＧ
Ｔ ＴＣＴ １１３Sequence number: 1 Sequence length: 113 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence characteristics Symbols representing characteristics: promoter Location :22. ．． 38 Method for determining characteristics: S Other characteristics: Location of complementary sequence to T7 promoter sequence: 1. ．． 18 Other characteristics: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostab
Sequence position from 105th to 126th of the Direct Haemolysin) gene: 92. ．． 1
13 Other characteristics: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostab
87th to 104th nucleotide sequence of the Direct Haemolysin) gene GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCA
AATCTCC CTATAGTGAG TCGTAT
TAAA ACTATTCTAT 60AGT
GTCACCTAAATGATCCACTAGTT
CTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCG
T TCT 113
【００４６】配列番号：２
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ
存在位置：１．．１７
特徴を決定した方法：Ｓ
他の特徴：Ｔ７プロモーターの配列を有する配列
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡ
１７SEQ ID NO: 2 Sequence length: 17 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Characteristics of the sequence Symbol representing the characteristic: promoter Location: 1. ．． 17 Method of determining characteristics: S Other characteristics: Sequence with sequence of T7 promoter TAATACGACT CACTATA
17
【００
４７】配列番号：３
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
存在位置：１．．２５
特徴を決定した方法：Ｓ
他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ）遺伝子の
９５番目から１１８番目の配列と相補的な配列を有する
。
配列
ＣＣＣＣＧＧＴＴＣＴ ＧＡＴＧＡＧＡＴＡＴ ＴＧＴ
ＴＴ
２５00
47] Sequence number: 3 Sequence length: 25 Sequence type: Nucleic acid Topology: Single-stranded Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1. ．． 25 Method of determining characteristics: S Other characteristics: Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostab
It has a complementary sequence to the 95th to 118th sequences of the Direct Haemolysin) gene. Array CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGT
TT
25
【図１】第一オリゴヌクレオチド（プローブヌクレオチ
ド）の構造を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing the structure of a first oligonucleotide (probe nucleotide).
【図２】本発明の原理を模式的に示した図である。FIG. 2 is a diagram schematically showing the principle of the present invention.
【図３】本発明の原理を模式的に示した図である。FIG. 3 is a diagram schematically showing the principle of the present invention.
【図４】実施例１〜８において合成されたＲＮＡの検出
の結果を示す。FIG. 4 shows the results of detection of RNA synthesized in Examples 1 to 8.
【図５】実施例９において合成されたＤＮＡの検出の結
果を示す。FIG. 5 shows the results of detection of DNA synthesized in Example 9.
図２中、Ａは標的核酸、Ｂは第一オリゴヌクレオチド（
プローブヌクレオチド）、Ｂ’は環状化した第一オリゴ
ヌクレオチド、Ｃは第二オリゴヌクレオチド（プライマ
ーヌクレオチド）、Ｄは核酸ポリメラーゼ、Ｅは標識さ
れたモノヌクレオチドを示す。図３中、Ａは標的核酸、
Ｂは第一オリゴヌクレオチド（プローブヌクレオチド）
、Ｂ’は環状化した第一オリゴヌクレオチド、Ｃは第二
オリゴヌクレオチド（プライマーヌクレオチド）、Ｄは
核酸ポリメラーゼ、Ｅはオリゴヌクレオチドプローブを
示す。図４中、１、２、３、４、５、６、７、８はそれ
ぞれ実施例１、２、３、４、５、６、７、８の結果に対
応している。矢印は鋳型として用いたプローブヌクレオ
チド（Ｂ；１１３ｍｅｒ）の位置を示す。また、図中、
＋は反応液中にゲノム核酸を加えた場合、−は加えなか
った場合を示す。図５中、１のレーンは反応液中にゲノ
ム核酸を加えた場合、２のレーンは加えなかった場合を
示す。In Figure 2, A is the target nucleic acid, B is the first oligonucleotide (
B' is a circularized first oligonucleotide, C is a second oligonucleotide (primer nucleotide), D is a nucleic acid polymerase, and E is a labeled mononucleotide. In FIG. 3, A is the target nucleic acid,
B is the first oligonucleotide (probe nucleotide)
, B' is a circularized first oligonucleotide, C is a second oligonucleotide (primer nucleotide), D is a nucleic acid polymerase, and E is an oligonucleotide probe. In FIG. 4, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 correspond to the results of Examples 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and 8, respectively. The arrow indicates the position of the probe nucleotide (B; 113mer) used as a template. Also, in the figure,
+ indicates the case where genomic nucleic acid was added to the reaction solution, and - indicates the case not added. In FIG. 5, lane 1 shows the case where genomic nucleic acid was added to the reaction solution, and lane 2 shows the case where it was not added.
Claims (11)
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくともこ
の直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、標的核酸配列（Ａ）に直鎖状プローブヌクレオチド（
Ｂ）をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチ
ド（Ｂ）を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチ
ド（Ｂ’）を鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ
）を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有
する一本鎖核酸を生成させ、得られた一本鎖核酸を測定
することにより、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を検
出することを特徴とする標的核酸配列の検出方法。1. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of a target nucleic acid sequence (A) in an analyte sample; ) to the target nucleic acid sequence (A) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to the linear probe nucleotide (
B), the linear probe nucleotide (B) is circularized, and the generated circular probe nucleotide (B') is used as a template to generate the primer nucleotide (C
) to generate a single-stranded nucleic acid having a repeated sequence complementary to the template, and by measuring the resulting single-stranded nucleic acid, detect the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample. A method for detecting a target nucleic acid sequence, characterized by:
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッドのプローブヌクレオチド（Ｂ
）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。2. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in an analyte sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): Manipulate the primer nucleotide (C) (a
) hybrid probe nucleotide (B
) and anneal. Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (c) is used as a template, and a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C) are used to generate a nucleic acid sequence. amplify. Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を操作（
ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド
（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。3. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): Manipulating the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample (
Anneal with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in a). Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (c) is used as a template, and a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C) are used to generate a nucleic acid sequence. amplify. Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくともこ
の直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする標
的核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。4. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample, and at least this linear probe nucleotide (B). 1. A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (e) using a primer nucleotide (C) having a sequence partially complementary to ). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
Target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C
) to form a hybrid. Operation (b): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (c) is used as a template, and a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C) are used to generate a nucleic acid sequence. amplify. Operation (d): If necessary, operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (c). Operation (e): Through operations (a) to (d), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
と標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。 操作（ｄ）：標識されたモノヌクレオチドの存在下、操
作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼおよび
プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配列を増
幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列の標識量を測定することにより検体試料中の標的
核酸配列を検出する。5. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
and the target nucleic acid sequence (A) to form a hybrid. Operation (b): The 5' and 3' ends of adjacent linear probe nucleotides (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): Manipulate the primer nucleotide (C) (b
) is annealed with the cyclic probe nucleotide (B') generated. Operation (d): In the presence of a labeled mononucleotide, the cyclic nucleotide (B') produced in operation (b) is used as a template, and a nucleic acid sequence is generated using a nucleic acid polymerase with helicase-like activity and a primer nucleotide (C). amplify. Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), the target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the labeled amount of the generated nucleic acid sequence.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて環状ヌクレオチド（Ｂ’）にする。操作（ｄ
）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（Ｂ’）を
鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラーゼ
およびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用して核酸配
列を増幅する。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回繰
り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。6. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (g). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): Manipulate the primer nucleotide (C) (a
) in the hybrid generated by the probe nucleotide (
Anneal with B). Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d
): Using the cyclic nucleotide (B') produced in step (c) as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸配列（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。7. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in an analyte sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (g). Operation (a): Form a hybrid between the linear probe nucleotide (B) and the primer nucleotide (C). Operation (b): The target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample is annealed with the probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a). Operation (c): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the annealed product produced in operation (b) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (d): The cyclic nucleotide (
Using B') as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｆ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｅ）：操作（ａ）〜（ｄ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｆ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。8. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, which comprises performing the following operations (a) to (f). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
Target nucleic acid sequence (A) and primer nucleotide (C
) to form a hybrid. Operation (b): The 5' and 3' ends of the linear probe nucleotide (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): The cyclic nucleotide (
Using B') as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (d): If necessary, operations (a) to (c) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (c). Operation (e): Through operations (a) to (d), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (f): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｇ）を行うことを特徴とする標的
核酸配列の検出方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１回
繰り返す。 操作（ｆ）：操作（ａ）〜（ｅ）を経て、生成された核
酸配列と標識された核酸プローブとのハイブリッドを形
成させる。 操作（ｇ）：ハイブリッドを形成した標識核酸プローブ
の標識量を測定することにより検体試料中の標的核酸配
列を検出する。9. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in the specimen sample; ) using a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence to
A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising performing the following operations (a) to (g). Operation (a): the above linear probe nucleotide (B),
A hybrid is formed with the target nucleic acid sequence (A). Operation (b): The 5' and 3' ends of adjacent linear probe nucleotides (B) in the hybrid generated in operation (a) are linked to form a cyclic nucleotide (B'). Operation (c): Manipulate the primer nucleotide (C) (b
) is annealed with the cyclic probe nucleotide (B') generated. Operation (d): The cyclic nucleotide (
Using B') as a template, a nucleic acid sequence is amplified using a nucleic acid polymerase having helicase-like activity and a primer nucleotide (C). Operation (e): If necessary, operations (a) to (d) are repeated at least once using the amplified nucleic acid sequence generated in operation (d). Operation (f): Through operations (a) to (e), a hybrid is formed between the generated nucleic acid sequence and the labeled nucleic acid probe. Operation (g): The target nucleic acid sequence in the specimen sample is detected by measuring the amount of labeling of the labeled nucleic acid probe that has formed a hybrid.
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有す
るプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリ
メラーゼ、ヌクレオチド三リン酸および標識モノヌクレ
オチドを含む標的核酸配列検出用試薬キット。10. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, said linear probe nucleotide (B) A reagent kit for detecting a target nucleic acid sequence, comprising a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence, a linking means, a nucleic acid polymerase, a nucleotide triphosphate, and a labeled mononucleotide.
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有す
るプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリ
メラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、および標識された核
酸プローブを含む標的核酸配列検出用試薬キット。11. A linear probe nucleotide (B) having a sequence designed to circularize as a result of the presence of the target nucleic acid sequence (A) in a specimen sample, the linear probe nucleotide (B) A reagent kit for detecting a target nucleic acid sequence, comprising a primer nucleotide (C) having a partially complementary sequence, a linking means, a nucleic acid polymerase, a nucleotide triphosphate, and a labeled nucleic acid probe.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03093260A JP3085409B2 (en) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | Method for detecting target nucleic acid sequence and reagent kit therefor |
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|---|---|---|---|
| JP03093260A JP3085409B2 (en) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | Method for detecting target nucleic acid sequence and reagent kit therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH04304900A true JPH04304900A (en) | 1992-10-28 |
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ID=14077519
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| JP03093260A Expired - Lifetime JP3085409B2 (en) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | Method for detecting target nucleic acid sequence and reagent kit therefor |
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