JPH04203968A - 化学発光免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、化学発光免疫測定法に関し、更に詳しくは体
液、特に血清、血漿、尿中の特定成分を高感度で迅速に
定量できる免疫測定法に関するものである。体液中の特
定成分としては、腫瘍マーカー、ホルモン、薬物、抗体
、及び病原体由来抗原などあらゆる物質が包含される。

【従来の技術】

免疫学的測定法は、ホモシニアス法とへテロジニアス法
とに大別される。腫瘍マーカー、ホルモン等の微量成分
を測定するためには、より高感度なヘテロジニアス法が
一般的に採用される。ヘテロジニアス法では、通常抗原
または抗体を予め固相に固定化しておきＢ／Ｆ分離を行
なう必要がある。しかしこの方法では、抗原または抗体
の一方が固相化されているため、液相系の反応よりも反
応速度が遅くなる。この点が反応時間の短縮に大きな障
害となっている。反応時間を短縮し、測定結果を迅速に
出すことは、臨床検査の場において、患者の待ち時間の
短縮、あるいは医師の迅速な診断と治療にとって極めて
重要である。 この点を改善するために、特開昭６２−３０９６３号公
報には、試料をビオチン標識抗体および検出可能となる
よう標識化された抗体と共に液相中で反応させた後、ア
ビジンを不溶化したポリスチレンビーズなどの担体上に
、アビジン−ビオチン反応を介して免疫複合体を捕捉し
、Ｂ／Ｆ分離後、標識を検出する方法が開示されている
。しかし、この方法も、固相として一般的なヒース、試
験管、マイクロプレート等を用いているため、固相の表
面積が不足し、免疫複合体を固相に捕捉する反応の時間
を短縮することができず、免疫測定の迅速化にとって充
分ではなかった。 特開平１−２０９３７０号公報には、免疫活性物質とビ
オチンを結合したレセプター、標識化レセプター（いず
れのレセプターも免疫活性物質と特異的に結合する）及
びビオチンを結合した固相を共に液相中で恒温保持した
後、アビジンを添加することで免疫活性物質と２種のレ
セプターから形成された結合体を固相に固定する方法に
より免疫反応時間を大幅に短縮し得ることが示されてい
る。しかし、この方法では複数の前記結合体のビオチン
が液相中でアビジンと結合することにより、前記結合体
が固相に固定できなくなり、検出感度を低下させる問題
点があった。 また、標識物質としては放射性同位体および酵素が一般
的に使用されるが、取扱いに安全な酵素の方が望ましい
。しかしながら、酵素は比色、蛍光、発光のいずれの基
質を用いても、酵素−基質間の反応にある一定の時間が
必要であり、反応時間の短縮に障害となっていた。この
点を改善するのに有効な標識物質としては、酵素による
増幅を必要としないアクリジニウムエステル、ルミノー
ル、イソルミノール等の化学発光物質がある。これらの
物質は一般的に知られており、アクリジニウムエステル
の使用に関しては、クリニカル・ケミストリー（ｃＬＩ
Ｎ、ＣＨＥＭ、）２９／８．１４７４−１４７９（１９
８３）：ｒアクリジニウム・エスターズ・アズ・ハイ−
スペシフィック−アクティビティ・ラベルズ・イン・イ
ムノアッセイ」（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｅｓｔｅｒｓ
　ａｓ　Ｈｉｇｈ　−５ｐｅｃｉｆｉｃ　−Ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ　Ｌａｂｅｌｓ　ｉｎ　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）に記載されており、■１２５と同等あるいはそれ以
上に高感度であるとされている。しかし、化学発光物質
は疎水性が強く、酵素などに比べると固相表面への非特
異吸着が起こり易い。またアビジンを固相に結合する方
法によっては固相そのものが発光するという現象があり
、表面積の大きい固相（アビジンの結合量が多い固相）
を用いる場合、特に大きな障害となる。

【発明が解決しようとする課題】

一般に流体試料、たとえば体液中の特定成分を高感度で
迅速に測定するためには、少な（とも２つの問題点を解
決しなければならない。その第１は、迅速な測定に関す
るものである。抗原抗体反応は、液相中で行うのが最も
速い。次に、生成した免疫複合体をＢ／Ｆ分離の為に、
固相に捕捉する必要がある。この際、固相として上記従
来技術のようにビーズ、試験管、マイクロプレート等を
用いると、固相表面積が小さく、更に、拡散距離が長く
なる為、反応に長時間を要してしまう。 第２の問題点は、感度に関するものである。測定系をよ
り高感度にするには、検出の為の標識物質を結合した抗
体または抗原が遊離形のまま固相表面へ非特異的に吸着
するのをできる限り抑える必要がある。しかし、化学発
光物質は先にも述べたように、疎水性が強（、酵素に比
べると非特異的吸着が大きい。またアビジンを固相に結
合する方法によってはＢ／Ｆ分離後、固相に捕捉された
化学発光物質を発光させる際、固相そのものが発光する
という現象がある。これらは、表面積の大きい固相を用
いる場合、特に大きな障害となる。 遊離標識抗原または抗体の非特異的吸着および固相その
ものの発光の程度は、アビジンの固相への結合法によっ
て異なる。一般的な結合法の多くでは、非特異的吸着が
高いか、あるいは固相そのものが発光する結果になり、
目的を達成することができない。 本発明は、上記２つの問題点を解決できる化学発光免疫
測定法を提供しようとするものである。

【課題を解決するための手段］ 本発明においては、測定の迅速化の為、固相として微細
なガラス繊維の集合体を用いる。これにより、固相表面
積を拡大し、拡散距離を短くし、さらにアビジン−ビオ
チン間の強い反応により、免疫複合体を固相に捕捉する
。たとえば抗原または抗体をビオチンで標識しておき、
アビジンを固相に結合しておくことにより免疫複合体を
捕捉することによって、液相反応に匹敵する反応速度を
達成することができる。また検出の為の標識物質として
は酵素による増幅反応を必要とせず、単に発光開始試薬
を添加することにより瞬時に発光反応が起こるアクリジ
ニウムエステル、ルミノール、イソルミノールなどの化
学発光物質を用い、測定の迅速化を図っている。 なお、本発明においてガラス繊維集合体とは、複数のガ
ラス繊維が集まった塊を意味し、その形状は問わない。 たとえばガラス繊維濾紙のようなシート状のものであっ
ても、ガラス繊維を集合した球状のものでもよく、さら
にはガラス繊維を管や容器に詰め込んだものでもよい。 更に、本発明では、抗原抗体反応を迅速に行うためにこ
の反応を液相中で行う。即ち、第１の態様では、抗原を
含む流体試料を、試料中の該抗原に対して特異的に反応
する、ビオチンで標識した第１の抗体及び試料中の該抗
原に対して特異的に反応する、化学発光物質で標識した
第２の抗体と共にインキュベートし、第１の抗体−抗原
一第２の抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第２の態様では、抗原を含む流体試料を、試料中の該抗
原に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発光
物質の一方で標識した抗体及びビオチンおよび化学発光
物質の他方で標識した抗原と共にインキュベートして競
合的に抗原抗体反応を行わせ、試料中杭原体または標識
抗原と標識抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第３の態様では、抗体を含む流体試料を、試料中の該抗
体に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発光
物質の一方で標識した抗原及び該抗体に対して特異的に
反応するビオチンおよび化学発光物質の他方で標識した
抗体と共にインキュベートし、標識抗原−試料抗体−標
識抗体から成る免疫複合体を形成させる。 第４の態様では、抗体を含む流体試料を、試料中の該抗
体に対して特異的に反応する、ビオチンおよび化学発光
物質の一方で標識した抗原及び該標識抗原と特異的に反
応する、ビオチンおよび化学発光物質の他方で標識した
抗体と共にインキュベートし、競合的に反応させ、標識
抗原と試料抗体または標識抗体とから成る免疫複合体を
形成させる。 次にＢ／Ｆ分離のために形成された免疫複合体を含む反
応混合物を、アビジンまたはストレプトアビジンを結合
した、表面積が太き（かつ光透過性のあるガラス繊維集
合体に含浸させ、アビジン−ビオチンの強固な結合反応
（結合定数　１０＋５１／ａｔｏｌｅ）を利用し、該免
疫複合体を捕捉する。 洗浄液によりＢ／Ｆ分離を行った後、直ちにカラス繊維
集合体に発光反応開始試薬を適用し、化学発光物質を発
光させて発光量を測定する。 ガラス繊維集合体の中でもガラス繊維濾紙は、微細な繊
維の網目構造の故、表面積が非常に大きく、たとえば東
洋濾紙ＧＡ−１００では滑面の固相の表面積の約１００
倍の表面積を有しており、免疫複合体の固相への拡散距
離が短（なり、反応速度は液相中の反応に匹敵するので
好ましい。またガラス繊維濾紙は光透過性が良く、水分
を含んだ状態ではほぼ１００％の透過率を持ち、発光を
効率良く検出できる。 化学発光物質としては、アクリンニウムエステル、ルミ
ノール、イソルミノール等が例示できる。 ところで、アビジンまたはストレプトアビジンをガラス
繊維集合体に、−船釣に行われているグルタルアルデヒ
ドによって結合した場合、結合部分が発光するあるいは
標識抗体の固相表面への非特異的吸着が増大するという
問題が生じる。ガラス繊維集合体という非常に表面積の
大きい固相を用いるため、固相自体の発光や非特異的吸
着の増大が、通常の滑面の固相を用いる場合よりもバッ
クグラウンドに太き（影響する。バックグラウンドが大
きくなると、Ｓ／Ｎ比は小さくなり、検出感度は低下す
る。 これまで、蛋白質等の固相への結合方法が化学発光法の
観点から検討されたことはなかった。そこで、アビジン
またはストレプトアビジンとガラス繊維集合体との結合
方法を、生化学分野で一般的に行われている蛋白、ペプ
チドの架橋法や酵素の固定化法を参考にし、検討したと
ころ、固相自体の発光や非特異的吸着の程度は、結合方
法によって異なることが判明した。その中で固相自体の
発光が小さ（かつ非特異的吸着の小さい２つの結合方法
を見い出した。本発明は、この２つの結合方法により上
記第２の問題点である非特異的吸着を解決するものであ
る。 最適な結合方法の一つは、ガラス繊維集合体をアミノ基
を有するシランカップリング剤（例えば、３−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン）で処理し、導入したアミノ
基にＮ−ヒドロキンスクシンイミド（ＮＨ３）基を導入
したビオチン（例えば、ＮＨ３−ビオチンまたはＮＨ３
とビオチンの間にスペーサの入ったもの）を反応させ、
次いで導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
ビジンを結合させる方法（ＮＨ８−ビオチン法という）
である。 また、ＮＨ３−ビオチン法は、固相自体の発光及び非特
異的吸着を低減させる効果に加え、不溶化アビジンとビ
オチン標識抗体（または抗原）との反応性を著しく向上
させる効果がある。該結合方法によって不溶化したアビ
ジンと一般的な結合方法（たとえば、グルタルアルデヒ
ドを用いる方法）によって不溶化したアビジンのビオチ
ン標識抗体（または抗原）との反応時間を比較すると、
該結合方法の場合、アビジン・ビオチン反応が平衡に達
する時間は、グルタルアルデヒドを用いる方法に比べ、
１０分の１以下に短縮される。 この原因として、次の理由が考えられる。−船釣な固相
へのアビジンの結合方法は、アビジンのアミノ基を無作
為に用いる為、アビジンのビオチン結合部位が修飾を受
け、アビジンとビオチンとの反応性が低下する。一方、
ＮＨ３−ビオチン法では、アビジンが持つ４つのビオチ
ン結合部位の内の１つを用いるので、他のビオチン結合
部位は修飾を受けず、アビジンとビオチンとの反応性は
低下しない。従って、ＮＨ３−ビオチン法は、本発明の
測定方法の高感度化のみならず、迅速化にも大きく寄与
している。 もう一つの結合方法は、カラス繊維集合体をアミノ基を
有するシランカップリング剤（例えば、３−アミノブロ
ビルトリエドキンンラン）で処理し、導入したアミノ基
に無水コハク酸を作用させてカルボキシル基を導入する
。次いで、カルボキシル基にジンクロヘキノルカルボジ
イミドとＮ−ヒドロキンスクンンイミドを反応させ、Ｎ
Ｈ５基を導入する。次に導入したＮＨ３基にアビジンま
たはストレプトアビジンを結合させる方法（ＮＨＳエス
テル法という）である。 このいずれかの結合方法によって調製したアビジンまた
はストレプトアビジン結合ガラス繊維集合体を用いるこ
とによってバックグラウンドは低下し、検出感度が上昇
する。これによって、迅速かつ高感度な化学発光免疫測
定が可能となる。 この２つの結合方法を含め各種結合法によって調製した
アビジン結合ガラス繊維濾紙の濾紙自体の発光および非
特異的吸着に関するデータは後記実施例１に示されてい
る。 【実施例】 以下実施例を示し、本発明の化学発光免疫測定法をより
詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるも
のではない。 実施例１ 各種結合法によって調製したアビノン結合ガラス繊維濾
紙の発光および非特異的吸着の比較１）ＮＨ３−ビオチ
ン法 ガラス繊維濾紙（東洋濾紙ＧＡ−１００、直径１３冨冨
、厚さ０，４５舅冨）を３−アミノプロピルトリエトキ
シシランの２％アセトン溶液中に、室温で１時間浸漬し
てガラスと３−アミノプロピルトリメトキシシランを反
応させ、アミノ化ガラス繊維濾紙を得た。アミノ化ガラ
ス繊維濾紙を、ＮＨ３−ＬＣ−ビオチン（ピアース（Ｐ
ＩＥＲＣＥ）製）０．０１２５翼ｇ／翼ｌを含む０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（以下、ＮａＰＢという。）
（ｐＨ８，０）中に、室温で１時間浸漬し、反応させた
。蒸留水で洗浄した後、ビオチンを導入したガラス繊維
濾紙をアビジン溶液（アビジン０．１ｍｇ／ｍＡ、ｐＨ
７゜０、Ｏ，１Ｍ、ＮａＰＢ）に４℃で３０分以上浸漬
した。この場合の結合様式を模式的に示せば次の通りで
ある。 また、スクシンイミジル６−（ビオチンサミド）ヘキサ
ネートを用いることにより、ＮＨ５とビオチンとの間に
スペーサーが挿入された次のような結合様式のものも調
製できる。 （ｎ＝１〜５） ２）ＮＨ３−エステル法 ＮＨ３−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、０．８Ｍ無水コハク酸（飽和四ホウ酸
ナトリウム溶液中）により４℃で５時間処理した。蒸留
水で洗浄した後、カルボキシル基が導入されたガラス繊
維濾紙を鉤ＩＭシンクロペキンルカルボンイミド及び鉤
ＩＭ　　Ｎ−ヒドロキンスクシンイミドのジオキサン溶
液中、室温で２時間処理した。蒸留水で洗浄した後、Ｎ
Ｈ８基を導入したガラス繊維濾紙をアビジン溶液（０，
ｌｕ／＋＋Ａ、ｐＨ６，５，０，１Ｍ、ＮａＰＢ）に４
℃で一夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に示せ
ば次の通りである。 ３）グルタルアルデヒド法（比較） ＮＨ８−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、５％グルタルアルデヒド水溶液中に室
温で３時間浸漬した。水で洗浄した後、グルタルアルデ
ヒドにより活性化したガラス繊維濾紙をアビジン溶液（
０，１ｍｇ／ｍＡ、ｐＨ１０，０，０，１Ｍ、カーボネ
ート緩衝液）中に４℃で一夜浸漬した。この場合の結合
様式を模式的に示せば次の通りである。 ４）トリレン−２，４−ジイソシアネート（ＴＤＩＣ）
法（比較） ＮＨ３−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、２％ＴＤＩＣ（ｐＨ９゜５．０．１Ｍ
、ボレート緩衝液中）溶液中に０℃で３０分浸漬した。 水で洗浄した後、ＴＤＩＣ結合ガラス繊維濾紙を鉤１１
１９／ｍｌアビジン溶液（ボレート緩衝液に溶解）中に
４℃で一夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に示
せば次の通りである。 ５）塩化シアヌル法（比較） ＮＨ８−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガ
ラス繊維濾紙を、２％塩化シアヌルのベンゼン溶液中に
室温で２時間浸漬した。水で洗浄した後、塩化シアヌル
結合ガラス繊維濾紙を領１ｍｑ／ｍ１１７ビシン溶液（
ｐＨ８，０、Ｑ、１Ｍ、ＮａＰＢに溶解）中に４℃で一
夜浸漬した。この場合の結合様式を模式的に示せば次の
通りである。 較） ＮＨ３−ビオチン法の場合と同様に調製したアミン化ガ
ラス繊維濾紙を、１ｍＭ　　ＤＳＳのＤＭＳＯ中溶液中
室液で１時間浸漬した。水で洗浄した後、ＤＳＳ結合ガ
ラス繊維濾紙を０．１１１９／ｍｌアビジン溶液（ｐＨ
７，５、Ｏ，ＬＭ、ＮａＰＢに溶解）中に４℃で一夜浸
漬した。この場合の結合様式を模式的に示せば次の通り
である。 ７）ヘキサメチレンジイソシアネート法（比較）ＮＨ３
−ビオチン法の場合と同様に調製したアミノ化ガラス繊
維濾紙を、０５％へキサメチレンジイソシアネート溶液
（ｐＨ９，５，０，１Ｍ、ボレート緩衝液に溶解）中に
室温で２時間浸漬した。 水で洗浄した後、ヘキサメチレンジイソシアネート結合
ガラス繊維濾紙を０．１寵ｑ／ｍｌアビジン溶液（ボレ
ート緩衝液に溶解）中に４℃で一夜浸漬した。この場合
の結合様式を模式的に示せば次の通りである。 上記１）〜７）の結合法によって調製したアビジン結合
ガラス繊維濾紙の濾紙自体の発光および非特異吸着率を
測定した。非特異的吸着は次のようにして測定した。ア
クリジニウムエステル（４−（２−スクシニミジルオキ
シカルボニルエチル）フェニル−１０−メチル−アクリ
ジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート
：同仁化学株式会社製アクリジニウムエ）により標識し
た抗体１μ９を各ガラス繊維濾紙に添加し、１０分間反
応させる。０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０を含
むリン酸緩衝化生理食塩水（以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
という。）により洗浄した後、ガラス繊維濾紙上に残っ
ている残存発光量を測定する。添加した標識抗体全量か
らの発光量も測定しておく（＝添加発光量）。非特異吸
着率は、（残存発光量／添加発光量）Ｘ１００％で表わ
す。 尚、対照としてアビジンを結合していないガラス繊維濾
紙についても同様に濾紙自体の発光と非特異吸着率を測
定した。また、すべてのガラス繊維濾紙には適当な蛋白
質によりブロッキングを施した。 アクリジニウムＩの発光は、０．３％過酸化水素溶液（
ＩＮＮａＯＨ水溶液中）をガラス繊維濾紙に添加するこ
とにより行った。また、発光量の測定は、ルミフォトメ
ーターＴＤ−４０００（シグマテクニカ製）を用いて行
った。 表１に結果を示す。本発明のアビジン−ガラス繊維濾紙
結合法であるＮＨ３−ビオチン法およびＮＨＳエステル
法では、対照のアビジン未結合のものと同程度に、濾紙
自体の発光および非特異吸着率は共に低い値であったが
、比較の他の結合方法では明らかに濾紙自体の発光も非
特異吸着率も高い値を示した。 表１ 濾紙自体の　非特異 ジイソシアネート法 また３）〜７）にすべての結合法において、非特異的吸
着がＮＨ３−ビオチン法やＮＨＳエステル法に比べると
相当大きかった。原因としてはアルキル鎖、ベンゼン環
、トリアジン環などの疎水性基を多く含んでいることが
考えられる。非特異的吸着は主に疎水性相互作用により
起こるからである。逆にＮＨ基、ＣＯ基などの親水基が
少ないということも非特異的吸着を高める原因になると
考えられる。 従って、短いアルキル鎖に対してＮＨ基、ｃ。 基の割合が多く、アミド結合を形成するＮＨ６−ビオチ
ン法およびＮＨＳエステル法では濾紙自体の発光がほと
んどなく、非特異的吸着も極めて低い結合方法を可能に
する。 実施例２ ＮＨＳエステル法及びグルタルアルデヒド法によって調
製したアビジン結合ガラス繊維濾紙を用いたＣＥＡ（カ
ルシノエンプリオニックアンチゲン：癌胎児性抗原）検
量線の作成 １）ＣＥＡ濃度既知の試料３０μ！、ビオチニル化抗Ｃ
ＥＡモノクロナール抗体５μｇ（１ｏｌｌｌ）及びアク
リジニウムエステル（アクリジニウムＩ）標識抗ＣＥＡ
モノクロナール抗体０１μｇ（１０μｌ）を混合し、室
温５分間インキュベートする。 ２）上記反応液５０μｌを、直径１３＊ｎ、厚さ０４５
１のアビジン結合ガラス繊維濾紙に含浸させ、室温で１
０分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
により洗浄しくＢ／Ｆ分離）、これに発光開始試薬とし
て０，３％過酸化水素溶液（ＩＮＮａＯＨ水溶液中）を
濾紙に添加することによりアクリジニウムエを発光させ
、濾紙上の発光量をルミフォトメーターＴＤ〜４０００
により測定する。 以上の測定を２種類アビジン結合ガラス繊維濾紙（ＮＨ
Ｓエステル法及びグルタルアルデヒド法）を用いて行っ
た。 第１図に各々の結合法による検量線を示した。 グルタルアルデヒド法では、最小検出感度は２０ｎｇ／
ｍｌであったが、ＮＨ３−エステル法では０゜３ｎｇ／
ｍＡ’の最小検出感度が得られている。このように結合
法としてＮＨ３−エステル法を用いることにより高感度
化が可能となる。 実施例３ 抗原抗体反応及びアビジン−ビオチン反応のタイムコー
ス 抗原抗体反応のタイムコース・ １）所定のＡＦＰ（アルファフェトプロティン）濃度の
試料３０μ１１ヒオチニル化抗ＡＦＰモノクロナ一ル抗
体５μｇ（１０μｌ）及びアクリジニウムエステル（ア
クリジニウムＩ）標識抗ＡＦＰポリクロナール抗体０１
μｇ（１０μｌ）を混合し、室温で経時的に反応させる
。 ２）上記反応液５０μｌを、直径１３１、厚さ０．４５
冨真のアビジン結合ガラス繊維濾紙（ＮＨＳエステル法
）に含浸させ、室温１０分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
により洗浄しくＢ／Ｆ分離）、実施例２と同様にアクリ
ジニウムＩを発光させ、濾紙上の発光量を自社製フォト
ンカウンターにより測定する。 アビジン−ビオチン反応タイムコース：１）所定のＡＦ
Ｐ濃度の試料３０μ１１　ビオチニル化抗ＡＦＰモノク
ロナール抗体５μ９（１０μｌ）及びアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウムエ）標識抗ＡＦＰポリクロナー
ル抗体０．１μｇ（１０μ！りを混合し、室温１０分間
インキュベートする。 ２）上記反応液５０μｌを直径１３ｇ友のアビジン結合
ガラス繊維濾紙（ＮＨＳエステル法）に含浸させ、室温
で経時的に反応させる。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
により洗浄しくＢ／Ｆ分離）、上記と同様に発光させ、
濾紙上の発光量を測定する。 第２図および第３図に各反応のタイムコースを示した。 抗原抗体反応は３分前後で、アビジン−ビオチン反応は
１分前後で平衡に達している。マイクロプレートやビー
ズを用いた通常の固相上での反応では平衡に達するのに
数時間を要するのに比べ、極めて顕著な反応速度の向上
である。 この結果から抗原抗体反応３分、アビジン−ビオチン反
応１分（発光の測定は数秒）という非常に迅速な免疫測
定系が構成できる。 実施例４ ＡＦＰ検量線 １）ＡＦＰ濃度既知の試料６μ／、ＰＢＳ（リン酸緩衝
化生理食塩水）２４μ！、ビオチニル化抗ＡＦＰモノク
ロナール抗体４μｇ（１０μＩ）及びアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウムエ）標識抗ＡＦＰモノクロナー
ル抗体０．１μｇ（１０μｌ）を混合し、室温で３分間
インキュベートする。 ２）上記反応液５０μｌを、直径１３翼冨、厚さ０．４
５＋＋ｍのアビジン結合ガラス繊維濾紙（ＮＨＳ−ビオ
チン法）に含浸させ、室温１分間インキュベーションす
る。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
により洗浄（Ｂ／Ｆ分離）し、実施例２と同様にアクリ
ジニウムＩを発光させ、濾紙上の発光量を、自社製フォ
トンカウンターにより測定する。 実施例５ インスリン検量線 １）インスリン濃度既知の試料１０μｆＰＢ３２０μ１
１　ビオチニル化抗インスリンモノクロナール抗体０．
１μｇ（１０μ７り、アクリジニウムエステル（アクリ
ジニウムＩ）標識抗インスリンモノクロナール抗体０．
０５μｇ（１０μｌ）を混合し、室温で３分間インキュ
ベートする。 ２）上記反応液５０μｌを直径１３菖肩のアビジン結合
ガラス繊維濾紙（ＮＨ８−ビオチン法）に含浸させ、室
温１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
により洗浄しくＢ／Ｆ分離）、実施例２と同様に発光さ
せ、濾紙上の発光量を、自社製フォトンカウンターによ
り測定する。 第４図および第５図にＡＦＰ及びインスリンの検量線を
示した。 実施例６ Ｔ４検量線 １）Ｔ４（サイロキシン）濃度既知の試料５μｌ、ＡＮ
Ｓ（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸）を含む
ＰＢ８２５μｌ、ビオチニル化抗Ｔ４ポリクロナール抗
体０．１μｇ（１０μｌ）、アクリジニウムエステル（
アクリジニウムエ）標ｍ７．１０μｌを混合し、室温で
５分間インキュベートする。 ２）上記反応液５０μｌを、直径１３ｍｍ、厚さ０．４
５ｍｍのアビジン結合ガラス繊維濾紙（ＮＨ８−ビオチ
ン法）に含浸させ、室温で１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
により洗浄しくＢ／’Ｆ分離）、実施例２と同様に発光
させ、濾紙上の発光量を自社製フォトンカウンターによ
り測定する。 第６図にＴ４の検量線を示した。 実施例７ ＨＢＳ抗体検量線 １）ＨＢＳ抗体陽性の試料（ＰＢＳにより段階希釈した
もの）３０μ１１ビオチニル化ＨＢＳ抗原１０μ１１ア
クリジニウムエステル（アクリジニウムエ）標識抗ＨＢ
Ｓポリクロナール抗体１０μｌを混合し、室温で５分間
インキュベートする。 ２）上記反応液５０μｌを、直径１３友真、厚さ０．４
５ｍｍのアビジン結合ガラス繊維濾紙（ＮＨ８−ビオチ
ン法）に含浸させ、室温で１分間インキュベートする。 ３）反応終了後のガラス繊維濾紙をＰＢＳ−ＴＷｅｅｎ
により洗浄しくＢ／Ｆ分離）、実施例２と同様に発光さ
せ、濾紙上の発光量を自社製フォトンカウンターにより
測定する。 第７図にＨＢＳ抗体の検量線を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２で得たＣＥＡ検量線である。 第２図は、実施例３での抗原抗体反応のタイムコースで
ある。 第３図は、実施例３でのアビジン−ビオチン反応のタイ
ムコースである。 第４図は、実施例４で得たＡＦＰ検量線である。 第５図は、実施例５で得たインスリン検量線である。 第６図は、実施例６で得たＴ４検量線である。 第７図は、実施例７で得たＨＢｓ抗体検量線である。 特許出願人株式会社京都第一科学 代理　人　弁理士　青　山　葆　はか１名第１図 ＣＥＡ　（ｎｇ／ｍｌ　） 図面の浄書（内容に変更なし） 第２図 反底゛時間（付） 図面の浄書（内容に変更なし） 第３図 反応四間（ケ） 第４図 ＡＦＰ　（ｎｇ／ｍｌ　） 第５図 イン又り／（νＶ／ｍｌ） 第６図 Ｔ４．ｕｇ／ｄｌ 第７図 ×１０４ き戊　Ｆ＋４釈イ色数 手続補正書 平成　３年　２月　４日 平成　２年　　特許願　　第３３ｉ５８６３号２　発明
の名称 化学発光免疫測定法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　株式会社京都第一科学 ４、代理人 ５、補正命令の日付 自　　発 ６　補正の対象 委任状並びに図面の第２図および第３図７、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、流体試料中の抗原を測定する方法において、（ａ）
   該流体試料を、流体試料中の該抗原に対して特異的に反
   応する、ビオチンで標識した第１の抗体、および該抗原
   に対して特異的に反応する、化学発光物質で標識した第
   ２の抗体と共にインキュベートし、第１の抗体−抗原−
   第２の抗体から成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
   ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
   させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
   オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
   たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
   発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
   光量を測定することを特徴とする化学発光免疫測定法。 ２、流体試料中の抗原を測定する方法において、（ａ）
   該流体試料を、流体試料中の該抗原に対して特異的に反
   応する、ビオチンおよび化学発光物質の一方で標識した
   抗体、およびビオチンおよび化学発光物質の他方で標識
   した抗原と共にインキュベートして、試料中の抗原と標
   識抗原を競合的に標識抗体と反応させて、抗体と試料中
   の抗原または標識抗原とから成る免疫複合体を形成し、
   （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
   ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
   させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
   オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
   たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
   発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
   光量を測定することを特徴とする化学発光免疫測定法。 ３、流体試料中の抗体を測定する方法において、（ａ）
   該流体試料を、流体試料中の該抗体に対して特異的に反
   応する、ビオチンおよび化学発光物質の一方で標識した
   抗原、および該抗体に対して特異的に反応する、ビオチ
   ンおよび化学発光物質の他方で標識した抗体と共にイン
   キュベートし、標識抗原−試料抗体−標識抗体から成る
   免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
   ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
   させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
   オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
   たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
   発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
   光量を測定することを特徴とする化学発光免疫測定法。 ４、流体試料中の抗体を測定する方法において、（ａ）
   該流体試料を、流体試料中の該抗体に対して特異的に反
   応する、ビオチンおよび化学発光物質の一方で標識した
   抗原、および該標識抗原に対して特異的に反応する、ビ
   オチンおよび化学発光物質の他方で標識した抗体と共に
   インキュベートし、試料抗体と標識抗体を競合的に標識
   抗原と反応させて、標識抗原と試料抗体または標識抗体
   から成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
   ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
   させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
   オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
   たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
   発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
   光量を測定することを特徴とする化学発光免疫測定法。 ５、流体試料中の抗体を測定する方法において、（ａ）
   該流体試料を、流体試料中の該抗体に対して特異的に反
   応する、ビオチンで標識した抗体、および流体試料中の
   抗体に対して特異的に反応する、化学発光物質で標識し
   た抗原と共にインキュベートし、標識抗体−試料抗体−
   標識抗原から成る免疫複合体を形成し、 （ｂ）前記（ａ）工程の反応混合物を、アビジンまたは
   ストレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体に含浸
   させてインキュベートし、該免疫複合体をアビジン・ビ
   オチン反応によりガラス繊維集合体上に捕捉し、 （ｃ）形成された不溶化アビジン−免疫複合体を保持し
   たガラス繊維集合体を該反応混合物から分離し、 （ｄ）不溶化アビジン−免疫複合体中の化学発光物質を
   発光開始試薬により発光させ、ガラス繊維集合体上で発
   光量を測定することを特徴とする化学発光免疫測定法。 ６、（イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシラ
   ンカップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基にＮ−ヒドロキシスクシンイミ
   ド基を導入したビオチンを反応させて、ガラス繊維上に
   ビオチンを導入し、 （ハ）導入したビオチンにアビジンまたはストレプトア
   ビジンを反応させることにより得た、アビジンまたはス
   トレプトアビジンを結合したガラス繊維集合体を用いる
   請求項１〜５のいずれかに記載の化学発光免疫測定法。 ７、（イ）ガラス繊維集合体を、アミノ基を有するシラ
   ンカップリング剤で処理し、 （ロ）導入したアミノ基に無水コハク酸を作用させてカ
   ルボキシル基を導入し、 （ハ）導入したカルボキシル基にジシクロヘキシルカル
   ボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンと
   を反応させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入
   し、 （ニ）導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基にアビ
   ジンまたはストレプトアビジンを反応させることにより
   得た、アビジンまたはストレプトアビジンを結合したガ
   ラス繊維集合体を用いる請求項１〜５のいずれかに記載
   の化学発光免疫測定法。