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JP7738035B2 - 改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤 - Google Patents

改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤

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JP7738035B2 JP2023118423A JP2023118423A JP7738035B2 JP 7738035 B2 JP7738035 B2 JP 7738035B2 JP 2023118423 A JP2023118423 A JP 2023118423A JP 2023118423 A JP2023118423 A JP 2023118423A JP 7738035 B2 JP7738035 B2 JP 7738035B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１４年３月４日出願の米国仮特許出願第６１／９４７，９７９号の利益を主張する。
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＦＡＴＥ＿１２２＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、８ＫＢであり、２０１５年３月４日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
本発明は、概して、多能性細胞を製造するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、基底状態多能性を有する多能性細胞を製造するための改善された培養基盤に関する。
今日の多能性幹細胞に基づく疾患及び毒性学のスクリーニング研究、ならびに将来の自家／同種多能性幹細胞治療は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の細胞株生成及び拡大の、堅牢で再現性のある方法を必要とする。ｈｉＰＳＣは、ゲノムに組み込まれたレトロ及びレンチウイルス発現系を介して導入された多能性因子の異所性発現により生成されている。可能な限り多くの組み込みイベントを排除するための研究は、いくつかの再プログラミング因子を小分子阻害剤で置き換えることを含んでいた。さらに、非組み込み型の方法は、非効率的及び労働集約的であり、追加的な再プログラミング因子を必要とする、または全ての体細胞の再プログラムにおいて効果的ではないことが証明されている（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
細胞を将来の産業的及び臨床的用途に好適とならしめるためには、多能性幹細胞の培養に関連したいくつかの課題が依然として対処されなければならない。最も一般的に使用されている従来の培養系では、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣはフィーダー細胞上に維持されながら塊として継代され、広範囲の細胞死及びゲノム異常が防止される（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。フィーダーを含まない（ＦＦ）環境内でｈｉＰＳＣの単一細胞培養を行えないことは、潜在的な産業規模でのスクリーニングまたは細胞治療用途を大幅に制限する（Ｓｋｏｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｖａｌａｍｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、ｈｉＰＳＣの改善に関する最近の研究は、導入遺伝子不含ではないレンチウイルス誘導ｈｉＰＳＣに焦点を置いており、そのような研究の治療上の関連性が制限されている。
ゲノム修飾以外の依然として成功裏に対処されるべき別の課題は、培養中のヒト多能性幹細胞の自発的分化の傾向である（Ｐｅｒａ ａｎｄ Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，２００４；Ｓａｔｈａｎａｎｔｈａｎ ａｎｄ Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，２００５；Ｖａｌａｍｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおける研究が説明されているが、ゲノム修飾ヒト多能性幹細胞をもたらす基底状態を維持するためには、多能性遺伝子の連続的異所性発現が必要であり（Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ）、これは産業及び臨床グレードの多能性細胞には不適切である。
したがって、ヒト多能性細胞生成物の、ハイスループットの導入遺伝子またはフットプリントを使用しない生成のための組成物及び方法が存在しないことは、これまで、将来の多能性幹細胞治療の開発及び商業化における大きな障害であることが明らかとなっている。
本発明は、概して、改善された細胞培養基盤を提供する。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、（ａ）Ｗｎｔ経路アゴニストと；（ｂ）ＭＥＫ阻害剤と；（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない組成物を企図する。
具体的実施形態において、Ｗｎｔ経路アゴニストは、ＧＳＫ３阻害剤である。
ある特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯである。
追加的実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２９０１である。
さらなる実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。
いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２９０１であり、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
ある特定の実施形態において、上記組成物のいずれかは、ｂＦＧＦまたはＬＩＦをさらに含む。
さらなる実施形態において、上記組成物のいずれかは、ｂＦＧＦ及びＬＩＦをさらに含む。
様々な実施形態において、上記組成物のいずれかを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない培養培地が提供される。
いくつかの実施形態において、１つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、１つ以上の多能性細胞を、上記培養培地のいずれかに従う細胞培養培地中で培養することを含む方法。
追加的実施形態において、１つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞は、ｉＰＳＣである。
ある特定の実施形態において、組成物は、多能性細胞の集団を含む。
さらなる実施形態において、多能性細胞の集団は、多能性細胞の均質集団である。
具体的実施形態において、多能性細胞の集団の少なくとも９５％は、ＳＳＥＡ４－ＦＩＴＣ及びＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０を発現する。
いくつかの実施形態において、多能性細胞の集団の最大５％は、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＴＵＪ１、またはＦｏｘＡ２を発現する。
具体的実施形態において、多能性細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている。
追加的実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、培養された細胞の自発的分化を低減する。
一実施形態において、培養された細胞における１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される。
別の実施形態において、１つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される。
さらに別の実施形態において、培養された細胞において、２つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における２つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される。
さらに別の実施形態において、２つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される。
具体的実施形態において、培養された細胞において、３つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における３つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ
ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、３つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される。
追加的実施形態において、培養された細胞において、５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ
ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される。
さらなる実施形態において、５つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する。
具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも５継代の間維持される。
ある特定の具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも１０継代の間維持される。
さらなる具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも５０継代の間維持される。
追加的な具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも１００継代の間維持される。
様々な実施形態において、上記方法は、継代の間、１つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む。
ある特定の実施形態において、継代の間、１つ以上の多能性細胞の生存能力が維持される。
ある特定の具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む。
ある特定の追加的実施形態において、１つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される。
ある特定のさらなる実施形態において、１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも１０継代の間維持される。
ある特定の関連した実施形態において、１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも５０継代の間維持される。
ある特定の他の実施形態において、１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも１００継代の間維持される。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、（ａ）フィーダー細胞の存在下で培養される１つ以上の多能性細胞を単離することと、（ｂ）１つ以上の多能性細胞を、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む方法を企図する。
様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、（ａ）１つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと；（ｂ）フィーダーを含まない環境内で単一多能性細胞を培養することと；（ｃ）Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、単一多能性細胞を培養することとを含む方法を企図する。
様々なある特定の実施形態において、本発明は、部分的に、１つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、（ａ）フィーダーを含まない環境内で１つ以上の多能性細胞を培養することと；（ｂ）Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、１つ以上の多能性細胞を培養することとを含む方法を企図する。
様々な追加的実施形態において、本発明は、部分的に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法であって、（ａ）１つ以上の非多能性細胞を得ることと；（ｂ）１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと；（ｃ）ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない細胞培養培地中で多能性細胞を培養し、それによりｉＰＳＣを生成することとを含む方法を企図する。
具体的実施形態において、１つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む。
ある特定の実施形態において、１つ以上の非多能性細胞は、細胞内の内在性ＯＣＴ４の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる。
さらなる実施形態において、１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
追加的実施形態において、１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
ある特定の実施形態において、１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
ある特定の実施形態において、１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、及びＥＳＲＲＢからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
ある特定の実施形態において、１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１からなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。
具体的実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである。
関連した具体的実施形態において、細胞培養培地は、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含む。
さらなる具体的実施形態において、１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、１つ以上の非多能性細胞を、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔアゴニスト；ＭＥＫ阻害剤；及びＴＧＦβＲ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤と接触させることを含む。
追加的実施形態において、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの集団を含む。
具体的実施形態において、ｉＰＳＣの集団は、ｉＰＳＣの均質集団である。
具体的実施形態において、ｉＰＳＣの集団の少なくとも９５％は、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０を発現する。
ある特定の実施形態において、多能性細胞の集団の最大５％は、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＴＵＪ１、またはＦｏｘＡ２を発現する。
ある特定の実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する。
追加的実施形態において、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ｉＰＳＣにおいて、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養されたｉＰＳＣにおける１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される。
具体的実施形態において、１つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも５継代の間維持される。
他の実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも１０継代の間維持される。
具体的実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも５０継代の間維持される。
追加的実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも１００継代の間維持される。
さらなる実施形態において、上記方法は、継代の間、ｉＰＳＣを解離させることを含む。
追加的実施形態において、ｉＰＳＣの生存能力は、継代の間維持される。
ある特定の実施形態において、ｉＰＳＣは、正常核型を含む。
他の実施形態において、ｉＰＳＣは、フィーダーを含まない環境内で培養される。
具体的実施形態において、ｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１０継代の間維持される。
追加的実施形態において、ｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも５０継代の間維持される。
具体的な追加的実施形態において、ｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１００継代の間維持される。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか１つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する。
様々なある特定の実施形態において、本発明は、部分的に、基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まないｉＰＳＣを提供する。
様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法であって、（ａ）１つ以上の多能性幹細胞を得ることと；（ｂ）ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない細胞培養培地中で１つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態ｉＰＳＣを生成することとを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、再プログラムされた体細胞を含む。
追加的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、再プログラムされた成体幹細胞を含む。
他の実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、１つ以上のｉＰＳＣ内の内在性ＯＣＴ４の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている。
具体的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
ある特定の具体的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている。
追加的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
追加的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、及びＥＳＲＲＢからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
別の実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１からなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。
様々な実施形態において、レンチウイルスベクターは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
具体的実施形態において、エピソームベクターは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、細胞培養培地は、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含む。
ある特定の実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣを得ることは、１つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔアゴニスト；ＭＥＫ阻害剤；及びＴＧＦβＲ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤と接触させ、１つ以上のｉＰＳＣを生成することを含む。
追加的実施形態において、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの集団を含む。
追加的実施形態において、ｉＰＳＣの集団は、ｉＰＳＣの均質集団である。
具体的実施形態において、ｉＰＳＣの集団の少なくとも９５％は、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０を発現する。
具体的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の集団の最大５％は、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＴＵＪ１、またはＦｏｘＡ２を発現する。
さらなる実施形態において、上記方法は、１つ以上のｉＰＳＣを細胞培養培地中で培養することを含み、これは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する。
ある特定の実施形態において、自発的分化が低減されたｉＰＳＣは、遺伝子発現を含み、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養されたｉＰＳＣにおける１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される。
追加的実施形態において、１つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される。
他の実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも５継代の間維持される。
ある特定の実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも１０継代の間維持される。
追加的実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも５０継代の間維持される。
具体的実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも１００継代の間維持される。
さらなる実施形態において、上記方法は、継代の間、１つ以上のｉＰＳＣを解離させることを含む。
具体的実施形態において、継代の間、１つ以上のｉＰＳＣの生存能力が維持される。
他の実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、正常核型を含む。
追加的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣは、フィーダーを含まない環境内で培養される。
ある特定の実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１０継代の間維持される。
追加的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも５０継代の間維持される。
具体的実施形態において、１つ以上のｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１００継代の間維持される。
様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか１つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する。
様々な実施形態において、本発明は、部分的に、基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まないｉＰＳＣを提供する。
いくつかの実施形態において、非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、非多能性細胞に、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、１つ以上のポリヌクレオチド、または、（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを導入し、それにより非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む方法が提供される。
具体的実施形態において、導入することは、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドを導入することを含む。
別の実施形態において、導入することは、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または（ｉｉ）ＯＣＴ－４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドを導入することを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにより導入される。
具体的実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
別の実施形態において、多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ＣＲＥ媒介切断により切断される。
いくつかの実施形態において、方法は、非多能性細胞に、（ｉ）ＳＶ４０ＬＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＳＶ４０ＬＴポリペプチドを導入することをさらに含む。
一実施形態において、方法は、非多能性細胞を、ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の少なくとも１つと接触させることを含み、Ｗｎｔ経路アゴニストは、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である。
別の実施形態において、非多能性細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ＭＥＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤と接触させられ、Ｗｎｔ経路アゴニストは、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である。
具体的実施形態において、方法は、Ｗｎｔ経路アゴニストと、ＭＥＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培養培地中で多能性細胞を培養することをさらに含み、Ｗｎｔ経路アゴニストは、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であり、培養培地は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含有しない。
いくつかの実施形態において、Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンもしくはＹ２７６３２であり、ＴＧＦβＲ阻害剤は、Ａ－８３－０１もしくはＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１もしくはＢＩＯであり、または、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９もしくはＰＤ０３２９０１である。
別の実施形態において、多能性細胞の多能性は、少なくとも５回の細胞分裂または少なくとも１０回の細胞分裂の間維持される。
具体的実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２Ａペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。
一実施形態において、多シストロン性ベクターは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、多能性細胞内のＯＣＴ４発現のために選択することにより、多能性細胞を同定することを含む。
一実施形態において、ＯＣＴ４発現のために選択することは、異所性Ｏｃｔ－４発現のために選択することを含む。
別の実施形態において、培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する。
別の実施形態において、多能性幹細胞の集団は、少なくとも７０％均質、少なくとも８０％均質、または少なくとも９０％均質である。
さらに別の実施形態において、多能性細胞の集団の少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、ＳＳＥＡ及びＴｒａ－１８１を発現する。
ある実施形態において、多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である。
一実施形態において、単一細胞継代により生成された細胞は、正常核型を有する。
一実施形態において、本発明は、上記方法のいずれか１つに従って生成される多能性細胞を提供する。
別の実施形態において、本発明は、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドから選択される少なくとも１つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物を提供する。
一実施形態において、細胞は、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドの少なくとも２つをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドから選択される少なくとも２つの外因性ポリペプチドを含む。
別の実施形態において、細胞は、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドの少なくとも３つをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドから選択される少なくとも３つの外因性ポリペプチドを含む。
１つの具体的実施形態において、細胞は、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）外因性ＯＣＴ４ポリペプチド、外因性ＥＣＡＴ１ポリペプチド、外因性ＵＴＦ１ポリペプチド、外因性ＮＡＮＯＧポリペプチド、及び外因性ＥＳＲＲＢポリペプチドを含む。
別の実施形態において、細胞は、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または外因性ＯＣＴ４ポリペプチド、外因性ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及び外因性ＵＴＦ１ポリペプチドを含む。
一実施形態において、細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の少なくとも１つと接触させられている。
別の実施形態において、細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路活性化因子、ＭＥＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤と接触させられており、Ｗｎｔ経路活性化因子は、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である。
具体的実施形態において、Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンもしくはＹ２７６３２であり、ＴＧＦβＲ阻害剤は、Ａ－８３－０１もしくはＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１もしくはＢＩＯであり、または、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９もしくはＰＤ０３２９０１である。
別の実施形態において、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにより非多能性細胞に導入される。
別の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
具体的実施形態において、細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない。
ある実施形態において、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＲＥ媒介切断により除去される。
別の実施形態において、細胞は、ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または外因性ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドを含む。
一実施形態において、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２Ａペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。
別の実施形態において、多シストロン性ベクターは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している。
１つの具体的実施形態において、本発明は、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｉ）ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｉｉ）ＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｖ）ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及び（ｖ）ＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つからなる組成物を提供する。
ある実施形態において、組成物は、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡからなる。
別の実施形態において、組成物は、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡからなる。
具体的実施形態において、各ｃＤＮＡは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにコードされる。
一実施形態において、本発明は、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
ある実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする。
別の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする。
別の具体的実施形態において、ベクターは、ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
一実施形態において、ベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡである。
一実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
１つの具体的実施形態において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、もしくはＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド；またはＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、もしくはＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチド；ならびにＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路活性化因子、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の少なくとも１つを備え、Ｗｎｔ経路活性化因子は、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるキットを提供する。
ある実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする、または、少なくとも１つのポリペプチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドを含む。
別の実施形態において、１つ以上の１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする、または、少なくとも１つのポリペプチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドを含む。
一実施形態において、キットは、ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドを備える。
別の実施形態において、キットは、ＴＧＦβＲ阻害剤と、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＭＥＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを備え、Ｗｎｔ経路活性化因子は、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である。
一実施形態において、Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンもしくはＹ２７６３２であり、ＴＧＦβＲ阻害剤は、Ａ－８３－０１もしくはＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１もしくはＢＩＯであり、または、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９もしくはＰＤ０３２９０１である。
別の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにコードされる。
別の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
一実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、２Ａペプチドにより隔てられている。
さらに別の実施形態において、多シストロン性ベクターは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む。
具体的実施形態において、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している。
別の具体的実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、非多能性細胞の集団を提供することと；非多能性細胞の集団に、選択可能マーカーに連結したＯＣＴ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと；非多能性細胞の集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の集団をポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと；選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む方法を提供する。
別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。
一実施形態において、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２Ａペプチドにより隔てられる。
さらに別の実施形態において、細胞の集団内の細胞の少なくとも１０％は、ＳＳＥＡ及びＴＲＡ－１８１を発現する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）Ｗｎｔ経路アゴニストと；
（ｂ）ＭＥＫ阻害剤と；
（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、
ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない組成物。
（項目２）
前記Ｗｎｔ経路アゴニストは、ＧＳＫ３阻害剤である、項目１に記載の前記組成物。
（項目３）
前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯである、項目２に記載の前記組成物。
（項目４）
前記ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２９０１である、項目１に記載の前記組成物。
（項目５）
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である、項目１に記載の前記組成物。
（項目６）
前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２９０１であり、前記ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである、項目１に記載の前記組成物。
（項目７）
ｂＦＧＦまたはＬＩＦをさらに備える、項目１から６のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目８）
ｂＦＧＦ及びＬＩＦをさらに含む、項目１から６のいずれか一項に記載の前記組成物。（項目９）
項目１に記載の前記組成物を含み、
ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない培養培地。
（項目１０）
１つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、前記１つ以上の多能性細胞を、項目９に記載の細胞培養培地中で培養することを含む前記方法。
（項目１１）
前記１つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項目１０に記載の前記方法。
（項目１２）
前記１つ以上の多能性細胞は、ｉＰＳＣである、項目１０に記載の前記方法。
（項目１３）
前記組成物は、多能性細胞の集団を含む、項目１０に記載の前記方法。
（項目１４）
多能性細胞の前記集団は、多能性細胞の均質集団である、項目１３に記載の前記方法。（項目１５）
多能性細胞の前記集団の少なくとも９５％は、ＳＳＥＡ４－ＦＩＴＣ及びＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０を発現する、項目１３に記載の前記方法。
（項目１６）
多能性細胞の前記集団の最大５％は、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＴＵＪ１、またはＦｏｘＡ２を発現する、項目１３に記載の前記方法。
（項目１７）
前記多能性細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている、項目１０に記載の前記方法。
（項目１８）
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、前記培養された細胞の自発的分化を低減する、項目１３に記載の前記方法。
（項目１９）
前記培養された細胞における１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、前記分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される、項目１８に記載の前記方法。
（項目２０）
前記１つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される、項目１９に記載の前記方法。
（項目２１）
前記培養された細胞において、２つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における２つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、前記分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される、項目１８に記載の前記方法。
（項目２２）
前記２つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される、項目２１に記載の前記方法。
（項目２３）
前記培養された細胞において、３つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における３つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、前記分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される、項目１８に記載の前記方法。
（項目２４）
前記３つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される、項目２３に記載の前記方法。
（項目２５）
前記培養された細胞において、５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、前記分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される、項目１８に記載の前記方法。
（項目２６）
前記５つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される、項目２５に記載の前記方法。
（項目２７）
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する、項目１８に記載の前記方法。
（項目２８）
前記１つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも５継代の間維持される、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
前記１つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも１０継代の間維持される、項目２７に記載の前記方法。
（項目３０）
前記１つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも５０継代の間維持される、項目２７に記載の前記方法。
（項目３１）
前記１つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも１００継代の間維持される、項目２７に記載の前記方法。
（項目３２）
継代の間、前記１つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む、項目１０から３１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目３３）
継代の間、前記１つ以上の多能性細胞の生存率が維持される、項目３２に記載の前記方法。
（項目３４）
前記１つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む、項目１０から３３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目３５）
前記１つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目１０から３４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目３６）
前記１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも１０継代の間維持される、項目１０から３５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目３７）
前記１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも５０継代の間維持される、項目１０から３５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目３８）
前記１つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも１００継代の間維持される、項目１０から３５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目３９）
多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、
（ａ）フィーダー細胞の存在下で培養される１つ以上の多能性細胞を単離することと、
（ｂ）前記１つ以上の多能性細胞を、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む前記方法。（項目４０）
単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、
（ａ）１つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと；
（ｂ）フィーダーを含まない環境内で前記単一多能性細胞を培養することと；
（ｃ）Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記単一多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
（項目４１）
１つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、
（ａ）フィーダーを含まない環境内で前記１つ以上の多能性細胞を培養することと；
（ｂ）Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であるＷｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記１つ以上の多能性細胞を培養することとを含む前記方法。（項目４２）
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法であって、
（ａ）１つ以上の非多能性細胞を得ることと；
（ｂ）前記１つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと；
（ｃ）ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記多能性細胞を培養し、それによりｉＰＳＣを生成することとを含む前記方法。
（項目４３）
前記１つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目４４）
前記１つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目４５）
前記１つ以上の非多能性細胞は、前記細胞内の内在性ＯＣＴ４の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる、項目４２に記載の前記方法。
（項目４６）
前記１つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目４７）
前記１つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目４８）
前記１つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目４９）
前記１つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、及びＥＳＲＲＢからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目５０）
前記１つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１からなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目５１）
前記１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである、項目４６から５０のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５２）
前記１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである、項目４６から５０のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５３）
前記細胞培養培地は、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である前記Ｗｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含む、項目４２から５２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５４）
前記１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、前記１つ以上の非多能性細胞を、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である前記Ｗｎｔアゴニスト；ＭＥＫ阻害剤；及びＴＧＦβＲ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤と接触させることを含む、項目４２から５３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目５５）
前記ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの集団を含む、項目４２に記載の前記方法。
（項目５６）
ｉＰＳＣの前記集団は、ｉＰＳＣの均質集団である、項目５５に記載の前記方法。
（項目５７）
ｉＰＳＣの前記集団の少なくとも９５％は、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０を発現する、項目５５に記載の前記方法。
（項目５８）
多能性細胞の前記集団の最大５％は、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＴＵＪ１、またはＦｏｘＡ２を発現する、項目５５に記載の前記方法。
（項目５９）
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目４２から５８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目６０）
１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、前記ｉＰＳＣにおいて、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養されたｉＰＳＣにおける１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、前記分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される、項目５９に記載の前記方法。
（項目６１）
前記１つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される、項目６０に記載の前記方法。
（項目６２）
自発的分化の前記低減は、少なくとも５継代の間維持される、項目６０に記載の前記方法。
（項目６３）
自発的分化の前記低減は、少なくとも１０継代の間維持される、項目６０に記載の前記方法。
（項目６４）
自発的分化の前記低減は、少なくとも５０継代の間維持される、項目６０に記載の前記方法。
（項目６５）
自発的分化の前記低減は、少なくとも１００継代の間維持される、項目６０に記載の前記方法。
（項目６６）
継代の間、前記ｉＰＳＣを解離させることを含む、項目４２から６５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目６７）
前記ｉＰＳＣの前記生存率は、継代の間維持される、項目６６に記載の前記方法。
（項目６８）
前記ｉＰＳＣは、正常核型を含む、項目４２から６７のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目６９）
前記ｉＰＳＣは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目４２から６８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７０）
前記ｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１０継代の間維持される、項目４２から６９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７１）
前記ｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも５０継代の間維持される、項目４２から６９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７２）
前記ｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１００継代の間維持される、項目４２から６９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７３）
項目４２から７２のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。
（項目７４）
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記ｉＰＳＣ。
（項目７５）
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法であって、
（ａ）１つ以上の多能性幹細胞を得ることと；
（ｂ）ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記１つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態ｉＰＳＣを生成することとを含む前記方法。
（項目７６）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、再プログラムされた体細胞を含む、項目７５に記載の前記方法。
（項目７７）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、再プログラムされた成体幹細胞を含む、項目７５に記載の前記方法。
（項目７８）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、前記１つ以上のｉＰＳＣ内の内在性ＯＣＴ４の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている、項目７５に記載の前記方法。（項目７９）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目７５に記載の前記方法。
（項目８０）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている、項目７５に記載の前記方法。
（項目８１）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目７５に記載の前記方法。
（項目８２）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、及びＥＳＲＲＢからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目７５に記載の前記方法。
（項目８３）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１からなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、前記１つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目７５に記載の前記方法。
（項目８４）
レンチウイルスベクターは、前記１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目７９から８３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目８５）
エピソームベクターは、前記１つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目７９から８３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目８６）
前記細胞培養培地は、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である前記Ｗｎｔ経路アゴニストと；ＭＥＫ阻害剤と；ＲＯＣＫ阻害剤とを含む、項目７５に記載の前記方法。
（項目８７）
前記１つ以上のｉＰＳＣ得ることは、前記１つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Ｗｎｔ経路アゴニストであって、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である前記Ｗｎｔアゴニスト；ＭＥＫ阻害剤；及びＴＧＦβＲ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤と接触させ、前記１つ以上のｉＰＳＣを生成することを含む、項目７５から８６のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目８８）
前記ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの集団を含む、項目７５に記載の前記方法。
（項目８９）
ｉＰＳＣの前記集団は、ｉＰＳＣの均質集団である、項目８８に記載の前記方法。
（項目９０）
ｉＰＳＣの前記集団の少なくとも９５％は、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０を発現する、項目８８に記載の前記方法。
（項目９１）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の前記集団の最大５％は、α－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、ＴＵＪ１、またはＦｏｘＡ２を発現する、項目８８に記載の前記方法。
（項目９２）
前記１つ以上のｉＰＳＣを前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目７５に記載の前記方法。
（項目９３）
自発的分化が低減された前記ｉＰＳＣは、遺伝子発現を含み、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含む培地中で培養されたｉＰＳＣにおける１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少され、前記分化マーカー遺伝子は、ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１からなる群から選択される、項目９２に記載の前記方法。
（項目９４）
前記１つ以上の分化マーカー遺伝子は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１からなる群から選択される、項目９３に記載の前記方法。
（項目９５）
前記低減された自発的分化は、少なくとも５継代の間維持される、項目９３に記載の前記方法。
（項目９６）
前記低減された自発的分化は、少なくとも１０継代の間維持される、項目９３に記載の前記方法。
（項目９７）
前記低減された自発的分化は、少なくとも５０継代の間維持される、項目９３に記載の前記方法。
（項目９８）
前記低減された自発的分化は、少なくとも１００継代の間維持される、項目９３に記載の前記方法。
（項目９９）
継代の間、前記１つ以上のｉＰＳＣを解離させることを含む、項目７５から９８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１００）
継代の間、前記１つ以上のｉＰＳＣの生存率が維持される、項目９０に記載の前記方法。
（項目１０１）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、正常核型を含む、項目７５から１００のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１０２）
前記１つ以上のｉＰＳＣは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目７５から１０１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１０３）
前記１つ以上のｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１０継代の間維持される、項目７５から１０２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１０４）
前記１つ以上のｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも５０継代の間維持される、項目７５から１０２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１０５）
前記１つ以上のｉＰＳＣのゲノム安定性は、少なくとも１００継代の間維持される、項目７５から１０２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１０６）
項目７５から１０５のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。
（項目１０７）
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記ｉＰＳＣ。
（項目１０８）
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、前記非多能性細胞に、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、１つ以上のポリヌクレオチド、または、（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを導入し、それにより前記非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む前記方法。
（項目１０９）
導入することは、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドを導入することを含む、項目１０８に記載の前記方法。
（項目１１０）
導入することは、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または（ｉｉ）ＯＣＴ－４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドを導入することを含む、項目１０８に記載の前記方法。
（項目１１１）
前記１つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにより導入される、項目１０８から１１０のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１１２）
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目１１１に記載の前記方法。
（項目１１３）
前記多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目１１１に記載の前記方法。
（項目１１４）
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＣＲＥ媒介切断により切断される、項目１１３に記載の前記方法。
（項目１１５）
前記非多能性細胞に、（ｉ）ＳＶ４０ＬＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＳＶ４０ＬＴポリペプチドを導入することをさらに含む、項目１０８から１１４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１１６）
前記非多能性細胞を、ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の少なくとも１つと接触させることをさらに含み、前記Ｗｎｔ経路アゴニストは、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である、項目１０８から１１５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１１７）
前記非多能性細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ＭＥＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤と接触させられ、前記Ｗｎｔ経路アゴニストは、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である、項目１１６に記載の前記方法。
（項目１１８）
Ｗｎｔ経路アゴニストと、ＭＥＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培養培地中で前記多能性細胞を培養することをさらに含み、前記Ｗｎｔ経路アゴニストは、任意選択でＧＳＫ３阻害剤であり、前記培養培地は、ＴＧＦβＲ阻害剤を含有しない、項目１０８から１１７のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１１９）
（ａ）前記Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンもしくはＹ２７６３２であり、（ｂ）前記ＴＧＦβＲ阻害剤は、Ａ－８３－０１もしくはＳＢ４３１５４２であり、（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１もしくはＢＩＯであり、または（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９もしくはＰＤ０３２９０１である、項目１１６から１１８のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２０）
前記多能性細胞の多能性は、少なくとも５回の細胞分裂または少なくとも１０回の細胞分裂の間維持される、項目１１８または１１９に記載の前記方法。
（項目１２１）
前記１つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２Ａペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目１０８から１２０のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２２）
前記多シストロン性ベクターは、Ｏｃｔ４ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目１２１に記載の前記方法。
（項目１２３）
前記多能性細胞内のＯｃｔ３４発現のために選択することにより、前記多能性細胞を同定することをさらに含む、項目１０８から１２２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２４）
Ｏｃｔ４発現のために選択することは、異所性Ｏｃｔ４発現のために選択することを含む、項目１２３に記載の前記方法。
（項目１２５）
培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する、項目１１８から１２４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２６）
多能性幹細胞の前記集団は、少なくとも７０％均質、少なくとも８０％均質、または少なくとも９０％均質である、項目１２５に記載の前記方法。
（項目１２７）
多能性細胞の前記集団の少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、ＳＳＥＡ及びＴｒａ－１８１を発現する、項目１２５または１２６に記載の前記方法。
（項目１２８）
前記多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である、項目１０８から１２７のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２９）
単一細胞継代により生成された前記細胞は、正常核型を有する、項目１２８に記載の前記方法。
（項目１３０）
項目１０８から１２９のいずれか一項に記載の前記方法に従って生成される多能性細胞。
（項目１３１）
（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドから選択される少なくとも１つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物。
（項目１３２）
前記細胞が、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドの少なくとも２つをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドから選択される少なくとも２つの外因性ポリペプチドを含む、項目１３１に記載の前記組成物。
（項目１３３）
前記細胞が、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドの少なくとも３つをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドから選択される少なくとも３つの外因性ポリペプチドを含む、項目１３１に記載の前記組成物。
（項目１３４）
前記細胞が、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）外因性ＯＣＴ４ポリペプチド、外因性ＥＣＡＴ１ポリペプチド、外因性ＵＴＦ１ポリペプチド、外因性ＮＡＮＯＧポリペプチド、及び外因性ＥＳＲＲＢポリペプチドを含む、項目１３１に記載の前記組成物。
（項目１３５）
前記細胞が、（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）外因性ＯＣＴ４ポリペプチド、外因性ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及び外因性ＵＴＦ１ポリペプチドを含む、項目１３１に記載の前記組成物。
（項目１３６）
前記細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の少なくとも１つと接触させられている、項目１２１から１３５のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目１３７）
前記細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路活性化因子、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤と接触せられており、前記Ｗｎｔ経路活性化因子は、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である、項目１３６に記載の前記組成物。
（項目１３８）
（ａ）前記Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンもしくはＹ２７６３２であり、（ｂ）前記ＴＧＦβＲ阻害剤は、Ａ－８３－０１もしくはＳＢ４３１５４２であり、（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１もしくはＢＩＯであり、または（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９もしくはＰＤ０３２９０１である、項目１３６または１３７に記載の前記組成物。
（項目１３９）
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにより前記非多能性細胞に導入される、項目１３１から１３８のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目１４０）
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目１３９に記載の前記方法。
（項目１４１）
前記細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目１３９に記載の前記組成物。
（項目１４２）
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＲＥ媒介切断により除去される、項目１４１に記載の前記方法。
（項目１４３）
前記細胞は、（ｉ）ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または（ｉｉ）外因性ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをさらに含む、項目１３１から１４２のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目１４４）
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２Ａペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目１３１から１４３のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目１４５）
前記多シストロン性ベクターは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目１４４に記載の前記組成物。
（項目１４６）
ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目１３１から１４５のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目１４７）
（ｉ）ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｉ）ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｉｉ）ＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ｉｖ）ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及び（ｖ）ＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つからなる組成物。
（項目１４８）
ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＮＡＮＯＧポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードするｃＤＮＡからなる、項目１４７に記載の前記組成物。
（項目１４９）
ＯＣＴ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＥＣＡＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡからなる、項目１４８に記載の前記組成物。
（項目１５０）
各ｃＤＮＡは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにコードされる、項目１４７から１４９のいずれか一項に記載の前記組成物。
（項目１５１）
ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目１５２）
前記１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードする、項目１５１に記載の前記ベクター。
（項目１５３）
前記１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする、項目１５２に記載の前記ベクター。
（項目１５４）
前記ベクターは、ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１５１から１５３のいずれか一項に記載の前記ベクター。
（項目１５５）
レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡである、項目１５１から１５４のいずれか一項に記載の前記ベクター。
（項目１５６）
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目１５５に記載の前記ベクター。
（項目１５７）
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、
（ａ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、もしくはＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする、１つ以上のポリヌクレオチド；または
（ｂ）ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、もしくはＥＳＲＲＢポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチド；ならびに
（ｃ）ＴＧＦβＲ阻害剤、Ｗｎｔ経路活性化因子、ＭＥＫ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の少なくとも１つを備え、前記Ｗｎｔ経路活性化因子は、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である、前記キット。
（項目１５８）
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドをコードし、または、（ｉｉ）前記少なくとも１つのポリペプチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、ＵＴＦ１ポリペプチド、ＮＡＮＯＧポリペプチド、及びＥＳＲＲＢポリペプチドを含む、項目１５７に記載の前記キット。
（項目１５９）
（ｉ）前記１つ以上の１つ以上のポリヌクレオチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドをコードする、または、（ｉｉ）前記少なくとも１つのポリペプチドは、ＯＣＴ４ポリペプチド、ＥＣＡＴ１ポリペプチド、及びＵＴＦ１ポリペプチドを含む、項目１５７に記載の前記キット。
（項目１６０）
（ｉ）ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）ＳＶ４０ＬＴ抗原ポリペプチドをさらに備える、項目１５７から１５９のいずれか一項に記載の前記キット。
（項目１６１）
前記キットは、ＴＧＦβＲ阻害剤と、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＭＥＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを備え、前記Ｗｎｔ経路活性化因子は、任意選択でＧＳＫ３阻害剤である、項目１５７から１６０のいずれか一項に記載の前記キット。
（項目１６２）
（ａ）前記Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンもしくはＹ２７６３２であり、（ｂ）前記ＴＧＦβＲ阻害剤は、Ａ－８３－０１もしくはＳＢ４３１５４２であり、（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１もしくはＢＩＯであり、または（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９もしくはＰＤ０３２９０１である、項目１５７から１６１のいずれか一項に記載の前記キット。
（項目１６３）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにコードされる、項目１５７から１６２のいずれか一項に記載の前記キット。
（項目１６４）
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目１６３に記載の前記キット。
（項目１６５）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、２Ａペプチドにより隔てられている、項目１５７から１６４のいずれか一項に記載の前記キット。
（項目１６６）
前記多シストロン性ベクターは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目１６５に記載の前記キット。
（項目１６７）
ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする前記少なくとも１つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目１５７から１６６のいずれか一項に記載の前記キット。
（項目１６８）
多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、
ａ）非多能性細胞の集団を提供することと；
ｂ）非多能性細胞の前記集団に、選択可能マーカーに連結したＯＣＴ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと；
ｃ）非多能性細胞の前記集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の前記集団を前記ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと；
ｄ）前記選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む前記方法。
（項目１６９）
前記ポリヌクレオチドは、ＯＣＴ４ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目１６８に記載の前記方法。
（項目１７０）
前記複数のポリヌクレオチドは、２Ａペプチドにより隔てられている、項目１６９に記載の前記方法。
（項目１７１）
細胞の前記集団内の細胞の少なくとも１０％は、ＳＳＥＡ及びＴＲＡ－１８１を発現する、項目１６９に記載の前記方法。
図１Ａ～１Ｅ。向上した再プログラム及びｈｉＰＳＣ維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。（１Ａ）レンチウイルス生成ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ０８８は、ＳＭＣ４において未分化細胞の均質集団を維持し、一方ＳＭＣ４において培養されたレンチウイルス生成ｈｉＰＳＣ株ＦＴｉ０９６においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態（上パネル）ならびにＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー（下パネル）により示されるように、ＦＴｉ０９６が３継代培養のＦＭＭに移行した際に最小限となった。（１Ｂ）ウイルス様配列ＷＰＲＥの導入遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現は、ＧＡＰＤＨに対して、及びレンチウイルス感染から４日後（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）の親線維芽細胞株のＷＰＲＥ発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株（線維芽細胞）及びヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ９を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。（１Ｃ）１０継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング；ＳＢ４３１５４２（－ＴＧＦβＲｉ）の除去、１０から１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの増加、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦの添加。（１Ｄ）線維芽細胞株は、遺伝子セットＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地（従来の培地；Ｃｏｎｖ．）中に分割し、１７日間培養し、１７日目にＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、ＦＭＭ及びＳＭＣ４に分割されたＳＭＣ４セットを除いて、それぞれの培地中でさらに１０日間培養した。２７日目に、培養物をＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに９日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。３６日目に、各培養物を、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。（１Ｅ）（１Ｄ）において議論された３６日目の染色のコロニー数。エラーバーは、ＦＲＭからＦＭＭ及びＦＲＭに対して３つ、ならびにＦＭＭ及びｈＥＳＣに対して２つを示している。 図１Ａ～１Ｅ。向上した再プログラム及びｈｉＰＳＣ維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。（１Ａ）レンチウイルス生成ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ０８８は、ＳＭＣ４において未分化細胞の均質集団を維持し、一方ＳＭＣ４において培養されたレンチウイルス生成ｈｉＰＳＣ株ＦＴｉ０９６においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態（上パネル）ならびにＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー（下パネル）により示されるように、ＦＴｉ０９６が３継代培養のＦＭＭに移行した際に最小限となった。（１Ｂ）ウイルス様配列ＷＰＲＥの導入遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現は、ＧＡＰＤＨに対して、及びレンチウイルス感染から４日後（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）の親線維芽細胞株のＷＰＲＥ発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株（線維芽細胞）及びヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ９を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。（１Ｃ）１０継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング；ＳＢ４３１５４２（－ＴＧＦβＲｉ）の除去、１０から１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの増加、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦの添加。（１Ｄ）線維芽細胞株は、遺伝子セットＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地（従来の培地；Ｃｏｎｖ．）中に分割し、１７日間培養し、１７日目にＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、ＦＭＭ及びＳＭＣ４に分割されたＳＭＣ４セットを除いて、それぞれの培地中でさらに１０日間培養した。２７日目に、培養物をＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに９日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。３６日目に、各培養物を、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。（１Ｅ）（１Ｄ）において議論された３６日目の染色のコロニー数。エラーバーは、ＦＲＭからＦＭＭ及びＦＲＭに対して３つ、ならびにＦＭＭ及びｈＥＳＣに対して２つを示している。 図１Ａ～１Ｅ。向上した再プログラム及びｈｉＰＳＣ維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。（１Ａ）レンチウイルス生成ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ０８８は、ＳＭＣ４において未分化細胞の均質集団を維持し、一方ＳＭＣ４において培養されたレンチウイルス生成ｈｉＰＳＣ株ＦＴｉ０９６においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態（上パネル）ならびにＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー（下パネル）により示されるように、ＦＴｉ０９６が３継代培養のＦＭＭに移行した際に最小限となった。（１Ｂ）ウイルス様配列ＷＰＲＥの導入遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現は、ＧＡＰＤＨに対して、及びレンチウイルス感染から４日後（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）の親線維芽細胞株のＷＰＲＥ発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株（線維芽細胞）及びヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ９を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。（１Ｃ）１０継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング；ＳＢ４３１５４２（－ＴＧＦβＲｉ）の除去、１０から１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの増加、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦの添加。（１Ｄ）線維芽細胞株は、遺伝子セットＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地（従来の培地；Ｃｏｎｖ．）中に分割し、１７日間培養し、１７日目にＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、ＦＭＭ及びＳＭＣ４に分割されたＳＭＣ４セットを除いて、それぞれの培地中でさらに１０日間培養した。２７日目に、培養物をＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに９日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。３６日目に、各培養物を、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。（１Ｅ）（１Ｄ）において議論された３６日目の染色のコロニー数。エラーバーは、ＦＲＭからＦＭＭ及びＦＲＭに対して３つ、ならびにＦＭＭ及びｈＥＳＣに対して２つを示している。 図１Ａ～１Ｅ。向上した再プログラム及びｈｉＰＳＣ維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。（１Ａ）レンチウイルス生成ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ０８８は、ＳＭＣ４において未分化細胞の均質集団を維持し、一方ＳＭＣ４において培養されたレンチウイルス生成ｈｉＰＳＣ株ＦＴｉ０９６においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態（上パネル）ならびにＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー（下パネル）により示されるように、ＦＴｉ０９６が３継代培養のＦＭＭに移行した際に最小限となった。（１Ｂ）ウイルス様配列ＷＰＲＥの導入遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現は、ＧＡＰＤＨに対して、及びレンチウイルス感染から４日後（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）の親線維芽細胞株のＷＰＲＥ発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株（線維芽細胞）及びヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ９を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。（１Ｃ）１０継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング；ＳＢ４３１５４２（－ＴＧＦβＲｉ）の除去、１０から１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの増加、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦの添加。（１Ｄ）線維芽細胞株は、遺伝子セットＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地（従来の培地；Ｃｏｎｖ．）中に分割し、１７日間培養し、１７日目にＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、ＦＭＭ及びＳＭＣ４に分割されたＳＭＣ４セットを除いて、それぞれの培地中でさらに１０日間培養した。２７日目に、培養物をＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに９日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。３６日目に、各培養物を、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。（１Ｅ）（１Ｄ）において議論された３６日目の染色のコロニー数。エラーバーは、ＦＲＭからＦＭＭ及びＦＲＭに対して３つ、ならびにＦＭＭ及びｈＥＳＣに対して２つを示している。 図１Ａ～１Ｅ。向上した再プログラム及びｈｉＰＳＣ維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。（１Ａ）レンチウイルス生成ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ０８８は、ＳＭＣ４において未分化細胞の均質集団を維持し、一方ＳＭＣ４において培養されたレンチウイルス生成ｈｉＰＳＣ株ＦＴｉ０９６においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態（上パネル）ならびにＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー（下パネル）により示されるように、ＦＴｉ０９６が３継代培養のＦＭＭに移行した際に最小限となった。（１Ｂ）ウイルス様配列ＷＰＲＥの導入遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現は、ＧＡＰＤＨに対して、及びレンチウイルス感染から４日後（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）の親線維芽細胞株のＷＰＲＥ発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株（線維芽細胞）及びヒトＥＳＣ株ＨＵＥＳ９を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。（１Ｃ）１０継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング；ＳＢ４３１５４２（－ＴＧＦβＲｉ）の除去、１０から１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの増加、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦの添加。（１Ｄ）線維芽細胞株は、遺伝子セットＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地（従来の培地；Ｃｏｎｖ．）中に分割し、１７日間培養し、１７日目にＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、ＦＭＭ及びＳＭＣ４に分割されたＳＭＣ４セットを除いて、それぞれの培地中でさらに１０日間培養した。２７日目に、培養物をＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに９日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。３６日目に、各培養物を、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。（１Ｅ）（１Ｄ）において議論された３６日目の染色のコロニー数。エラーバーは、ＦＲＭからＦＭＭ及びＦＲＭに対して３つ、ならびにＦＭＭ及びｈＥＳＣに対して２つを示している。 図２Ａ～２Ｅ。個々のエピソーム再プログラムｈｉＰＳＣが効率的に選択され、クローン拡大のために９６ウェルプレート内に播種されることを示す図である。（２Ａ）エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。（２Ｂ）トランスフェクション後の示された日数における、ＦＦ培養物（２Ａで概説される）中でのＦＲＭからＦＭＭへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１－８１＋／ＣＤ３０＋集団）に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のｈｉＰＳＣクローンを含有する９６ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。（２Ｃ）ＭＥＦ細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから１９日後に再プログラムするように誘引されたＦＴＣ００７のフロープロファイル。誘引された集団は、（２Ｂ）におけるＦＴＣ００７の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。（２Ｄ）９６ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、ＤＡＰＩ染色を表す。（２Ｅ）ウェル当たり３細胞でのＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０直接ソーティング（ＦＡＣＳ）９６ウェルプレートの各ウェルにおけるＮＡＮＯＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現範囲は、凡例において説明されるように、Ｈ１ヒトＥＳＣに対してゼロから４回の発現の間であり、ＧＡＰＤＨに正規化されている。 図２Ａ～２Ｅ。個々のエピソーム再プログラムｈｉＰＳＣが効率的に選択され、クローン拡大のために９６ウェルプレート内に播種されることを示す図である。（２Ａ）エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。（２Ｂ）トランスフェクション後の示された日数における、ＦＦ培養物（２Ａで概説される）中でのＦＲＭからＦＭＭへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１－８１＋／ＣＤ３０＋集団）に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のｈｉＰＳＣクローンを含有する９６ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。（２Ｃ）ＭＥＦ細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから１９日後に再プログラムするように誘引されたＦＴＣ００７のフロープロファイル。誘引された集団は、（２Ｂ）におけるＦＴＣ００７の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。（２Ｄ）９６ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、ＤＡＰＩ染色を表す。（２Ｅ）ウェル当たり３細胞でのＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０直接ソーティング（ＦＡＣＳ）９６ウェルプレートの各ウェルにおけるＮＡＮＯＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現範囲は、凡例において説明されるように、Ｈ１ヒトＥＳＣに対してゼロから４回の発現の間であり、ＧＡＰＤＨに正規化されている。 図２Ａ～２Ｅ。個々のエピソーム再プログラムｈｉＰＳＣが効率的に選択され、クローン拡大のために９６ウェルプレート内に播種されることを示す図である。（２Ａ）エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。（２Ｂ）トランスフェクション後の示された日数における、ＦＦ培養物（２Ａで概説される）中でのＦＲＭからＦＭＭへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１－８１＋／ＣＤ３０＋集団）に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のｈｉＰＳＣクローンを含有する９６ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。（２Ｃ）ＭＥＦ細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから１９日後に再プログラムするように誘引されたＦＴＣ００７のフロープロファイル。誘引された集団は、（２Ｂ）におけるＦＴＣ００７の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。（２Ｄ）９６ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、ＤＡＰＩ染色を表す。（２Ｅ）ウェル当たり３細胞でのＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０直接ソーティング（ＦＡＣＳ）９６ウェルプレートの各ウェルにおけるＮＡＮＯＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現範囲は、凡例において説明されるように、Ｈ１ヒトＥＳＣに対してゼロから４回の発現の間であり、ＧＡＰＤＨに正規化されている。 図２Ａ～２Ｅ。個々のエピソーム再プログラムｈｉＰＳＣが効率的に選択され、クローン拡大のために９６ウェルプレート内に播種されることを示す図である。（２Ａ）エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。（２Ｂ）トランスフェクション後の示された日数における、ＦＦ培養物（２Ａで概説される）中でのＦＲＭからＦＭＭへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１－８１＋／ＣＤ３０＋集団）に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のｈｉＰＳＣクローンを含有する９６ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。（２Ｃ）ＭＥＦ細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから１９日後に再プログラムするように誘引されたＦＴＣ００７のフロープロファイル。誘引された集団は、（２Ｂ）におけるＦＴＣ００７の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。（２Ｄ）９６ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、ＤＡＰＩ染色を表す。（２Ｅ）ウェル当たり３細胞でのＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０直接ソーティング（ＦＡＣＳ）９６ウェルプレートの各ウェルにおけるＮＡＮＯＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現範囲は、凡例において説明されるように、Ｈ１ヒトＥＳＣに対してゼロから４回の発現の間であり、ＧＡＰＤＨに正規化されている。 図２Ａ～２Ｅ。個々のエピソーム再プログラムｈｉＰＳＣが効率的に選択され、クローン拡大のために９６ウェルプレート内に播種されることを示す図である。（２Ａ）エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。（２Ｂ）トランスフェクション後の示された日数における、ＦＦ培養物（２Ａで概説される）中でのＦＲＭからＦＭＭへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１－８１＋／ＣＤ３０＋集団）に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のｈｉＰＳＣクローンを含有する９６ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。（２Ｃ）ＭＥＦ細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから１９日後に再プログラムするように誘引されたＦＴＣ００７のフロープロファイル。誘引された集団は、（２Ｂ）におけるＦＴＣ００７の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。（２Ｄ）９６ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、ＤＡＰＩ染色を表す。（２Ｅ）ウェル当たり３細胞でのＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０直接ソーティング（ＦＡＣＳ）９６ウェルプレートの各ウェルにおけるＮＡＮＯＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現範囲は、凡例において説明されるように、Ｈ１ヒトＥＳＣに対してゼロから４回の発現の間であり、ＧＡＰＤＨに正規化されている。 図３Ａ～３Ｆ。エピソーム再プログラムｈｉＰＳＣクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。（３Ａ）単一細胞継代から２４時間後のｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（３Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表的な画像。（３Ｃ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７－ｃ１ ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７－ｃ２１ ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６－ｃ２５ ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６－ｃ３６ ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７－ｃ１１ ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７－ｃ１４ ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７－ｃ１７ ｐ６（エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ（二次汚染に対する対照として役立つ）；レーン１０、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（３Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。（３Ｅ）様々な親株からの選択されたｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（３Ｆ）内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣと比較して正規化された。ＫＬＦ４発現の場合、２つのデータ点がＨＵＥＳ９の１５倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。 図３Ａ～３Ｆ。エピソーム再プログラムｈｉＰＳＣクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。（３Ａ）単一細胞継代から２４時間後のｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（３Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表的な画像。（３Ｃ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７－ｃ１ ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７－ｃ２１ ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６－ｃ２５ ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６－ｃ３６ ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７－ｃ１１ ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７－ｃ１４ ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７－ｃ１７ ｐ６（エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ（二次汚染に対する対照として役立つ）；レーン１０、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（３Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。（３Ｅ）様々な親株からの選択されたｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（３Ｆ）内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣと比較して正規化された。ＫＬＦ４発現の場合、２つのデータ点がＨＵＥＳ９の１５倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。 図３Ａ～３Ｆ。エピソーム再プログラムｈｉＰＳＣクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。（３Ａ）単一細胞継代から２４時間後のｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（３Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表的な画像。（３Ｃ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７－ｃ１ ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７－ｃ２１ ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６－ｃ２５ ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６－ｃ３６ ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７－ｃ１１ ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７－ｃ１４ ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７－ｃ１７ ｐ６（エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ（二次汚染に対する対照として役立つ）；レーン１０、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（３Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。（３Ｅ）様々な親株からの選択されたｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（３Ｆ）内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣと比較して正規化された。ＫＬＦ４発現の場合、２つのデータ点がＨＵＥＳ９の１５倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。 図３Ａ～３Ｆ。エピソーム再プログラムｈｉＰＳＣクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。（３Ａ）単一細胞継代から２４時間後のｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（３Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表的な画像。（３Ｃ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７－ｃ１ ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７－ｃ２１ ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６－ｃ２５ ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６－ｃ３６ ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７－ｃ１１ ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７－ｃ１４ ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７－ｃ１７ ｐ６（エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ（二次汚染に対する対照として役立つ）；レーン１０、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（３Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。（３Ｅ）様々な親株からの選択されたｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（３Ｆ）内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣと比較して正規化された。ＫＬＦ４発現の場合、２つのデータ点がＨＵＥＳ９の１５倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。 図３Ａ～３Ｆ。エピソーム再プログラムｈｉＰＳＣクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。（３Ａ）単一細胞継代から２４時間後のｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（３Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表的な画像。（３Ｃ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７－ｃ１ ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７－ｃ２１ ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６－ｃ２５ ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６－ｃ３６ ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７－ｃ１１ ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７－ｃ１４ ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７－ｃ１７ ｐ６（エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ（二次汚染に対する対照として役立つ）；レーン１０、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（３Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。（３Ｅ）様々な親株からの選択されたｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（３Ｆ）内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣと比較して正規化された。ＫＬＦ４発現の場合、２つのデータ点がＨＵＥＳ９の１５倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。 図３Ａ～３Ｆ。エピソーム再プログラムｈｉＰＳＣクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。（３Ａ）単一細胞継代から２４時間後のｈｉＰＳＣクローンの典型的な形態。（３Ｂ）培養中のｈｉＰＳＣクローンの代表的な画像。（３Ｃ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、ＦＴＣ００７－ｃ１ ｐ４；レーン２、ＦＴＣ００７－ｃ２１ ｐ４；レーン３、ＦＴＣ０１６－ｃ２５ ｐ５；レーン４、ＦＴＣ０１６－ｃ３６ ｐ５；レーン５、ＦＴＣ０１７－ｃ１１ ｐ７；レーン６、ＦＴＣ０１７－ｃ１４ ｐ７；レーン７、ＦＴＣ０１７－ｃ１７ ｐ６（エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した）；レーン８、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン９、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ（二次汚染に対する対照として役立つ）；レーン１０、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（３Ｄ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。（３Ｅ）様々な親株からの選択されたｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（３Ｆ）内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣと比較して正規化された。ＫＬＦ４発現の場合、２つのデータ点がＨＵＥＳ９の１５倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。 図４Ａ～４Ｅ。継続的単一細胞及びＦＦ培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。（４Ａ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、２０～４０のＧバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。（４Ｂ）ＦＦ及び単一細胞培養における、長期継代（ｐ２５～３０）ｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。（４Ｃ）３～４日のＦＴＣ０１７－ｃ１１の一定方向分化。（４Ｄ）三胚葉分化を示すｈｉＰＳＣクローンの胚様体形成及び分化。分化から２８日後に行われた免疫細胞化学分析：外胚葉、ＴＵＪ１；中胚葉、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）；内胚葉、ＡＦＰ。（４Ｅ）各体細胞系を表すＦＴＣ００７－ｃ２１及びＦＴＣ０１６－ｃ２５から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉；白矢印、外胚葉；灰色矢印、中胚葉。 図４Ａ～４Ｅ。継続的単一細胞及びＦＦ培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。（４Ａ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、２０～４０のＧバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。（４Ｂ）ＦＦ及び単一細胞培養における、長期継代（ｐ２５～３０）ｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。（４Ｃ）３～４日のＦＴＣ０１７－ｃ１１の一定方向分化。（４Ｄ）三胚葉分化を示すｈｉＰＳＣクローンの胚様体形成及び分化。分化から２８日後に行われた免疫細胞化学分析：外胚葉、ＴＵＪ１；中胚葉、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）；内胚葉、ＡＦＰ。（４Ｅ）各体細胞系を表すＦＴＣ００７－ｃ２１及びＦＴＣ０１６－ｃ２５から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉；白矢印、外胚葉；灰色矢印、中胚葉。 図４Ａ～４Ｅ。継続的単一細胞及びＦＦ培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。（４Ａ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、２０～４０のＧバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。（４Ｂ）ＦＦ及び単一細胞培養における、長期継代（ｐ２５～３０）ｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。（４Ｃ）３～４日のＦＴＣ０１７－ｃ１１の一定方向分化。（４Ｄ）三胚葉分化を示すｈｉＰＳＣクローンの胚様体形成及び分化。分化から２８日後に行われた免疫細胞化学分析：外胚葉、ＴＵＪ１；中胚葉、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）；内胚葉、ＡＦＰ。（４Ｅ）各体細胞系を表すＦＴＣ００７－ｃ２１及びＦＴＣ０１６－ｃ２５から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉；白矢印、外胚葉；灰色矢印、中胚葉。 図４Ａ～４Ｅ。継続的単一細胞及びＦＦ培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。（４Ａ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、２０～４０のＧバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。（４Ｂ）ＦＦ及び単一細胞培養における、長期継代（ｐ２５～３０）ｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。（４Ｃ）３～４日のＦＴＣ０１７－ｃ１１の一定方向分化。（４Ｄ）三胚葉分化を示すｈｉＰＳＣクローンの胚様体形成及び分化。分化から２８日後に行われた免疫細胞化学分析：外胚葉、ＴＵＪ１；中胚葉、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）；内胚葉、ＡＦＰ。（４Ｅ）各体細胞系を表すＦＴＣ００７－ｃ２１及びＦＴＣ０１６－ｃ２５から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉；白矢印、外胚葉；灰色矢印、中胚葉。 図４Ａ～４Ｅ。継続的単一細胞及びＦＦ培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。（４Ａ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、２０～４０のＧバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。（４Ｂ）ＦＦ及び単一細胞培養における、長期継代（ｐ２５～３０）ｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。（４Ｃ）３～４日のＦＴＣ０１７－ｃ１１の一定方向分化。（４Ｄ）三胚葉分化を示すｈｉＰＳＣクローンの胚様体形成及び分化。分化から２８日後に行われた免疫細胞化学分析：外胚葉、ＴＵＪ１；中胚葉、α平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）；内胚葉、ＡＦＰ。（４Ｅ）各体細胞系を表すＦＴＣ００７－ｃ２１及びＦＴＣ０１６－ｃ２５から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉；白矢印、外胚葉；灰色矢印、中胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図５Ａ～５Ｊ。最小限の数の再プログラミング因子によるｈｉＰＳＣクローンの誘導物を示す図である。（５Ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧを、様々な形態でｐＣＥＰ４にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。（５Ｂ）誘引から１３日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フローサイトメトリープロファイル。（５Ｃ）ウェル当たり３つ及び９つの細胞での９６ウェルプレートのウェル内のＴＲＡ１－８１陽性ｈｉＰＳＣクローンの存在を表す効率ヒストグラム。（５Ｄ）様々なｈｉＰＳＣクローンから誘導されたエピソームＤＮＡのＰＣＲ分析。レーン１、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ６；レーン２、２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０ ｐ６；レーン３、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ５ ｐ５；レーン４、２ｘＯ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ５；レーン５、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ７ ｐ７；レーン６、２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ－ｃ９ ｐ６；レーン７、非トランスフェクトＦＴＣ００７；レーン８、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたｈｉＰＳＣ；レーン９、陽性対照として使用されたエピソームベクター。１００ｎｇのゲノムＤＮＡの投入及び３５ＰＣＲサイクルを、全てのセットに対して使用した。（５Ｅ）２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔから誘導されたクローン９の形態。（５Ｆ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－８１及びＴＲＡ１６０の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は１０倍の倍率で撮影された。（５Ｇ）選択された遺伝子セットから誘導されたｈｉＰＳＣクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１表面発現である。下の行のプロファイルは、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ細胞内発現である。（５Ｈ）誘引からおよそ７２～９６時間後の選択されたｈｉＰＳＣクローンの一定方向分化。（５Ｉ）ＦＦ及び単一細胞培養において維持された様々なｈｉＰＳＣクローンからの、Ｇバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。（５Ｊ）各体細胞系を表すｈｉＰＳＣクローン２ｘＯ＋ＯＳ＋ＯＮＳ＋Ｔ－ｃ１０から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉；中央パネル、中胚葉；右パネル、外胚葉。 図６Ａ～６Ｂ。ＦＭＭにおける最小限の因子のエピソーム誘引ｈｉＰＳＣの相対的遺伝子発現プロファイルを示す図である。従来通り維持されたｈｉＰＳＣ株、従来通り維持されたＨ１ ｈＥＳＣ、及びＦＭＭ中で維持された様々な遺伝子の組合せを使用して誘導されたエピソームｈｉＰＳＣ株の、多能性（６Ａ）及び分化（６Ｂ）遺伝子の相対的遺伝子発現レベル（ＲＱ）を示す、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ動的配列から得られたヒートマップの結果。各株の相対的遺伝子発現は、各ボックス内に記され、凡例（右下）にまとめられた３つの発現レベルに基づいて色分けされている。全てのセットは２回行われ、２つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴ１）の平均発現に対して正規化され、１×値を表す６つの対照従来株（ＭＥＦ上のＯＳＫ ｈｉＰＳＣ及びＨ１ ｈＥＳＣ）の中央発現レベルが参照されている。 図６Ａ～６Ｂ。ＦＭＭにおける最小限の因子のエピソーム誘引ｈｉＰＳＣの相対的遺伝子発現プロファイルを示す図である。従来通り維持されたｈｉＰＳＣ株、従来通り維持されたＨ１ ｈＥＳＣ、及びＦＭＭ中で維持された様々な遺伝子の組合せを使用して誘導されたエピソームｈｉＰＳＣ株の、多能性（６Ａ）及び分化（６Ｂ）遺伝子の相対的遺伝子発現レベル（ＲＱ）を示す、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ動的配列から得られたヒートマップの結果。各株の相対的遺伝子発現は、各ボックス内に記され、凡例（右下）にまとめられた３つの発現レベルに基づいて色分けされている。全てのセットは２回行われ、２つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴ１）の平均発現に対して正規化され、１×値を表す６つの対照従来株（ＭＥＦ上のＯＳＫ ｈｉＰＳＣ及びＨ１ ｈＥＳＣ）の中央発現レベルが参照されている。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ～７Ｇ。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。（７Ａ）合計３３９のプローブセットが、従来の培養とＦＭＭ培養との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３３９のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（７Ｂ）従来の培養により（ＦＭＭ培養と比較して）２．５倍以上上方制御された２１３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（７Ｃ）基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。７（Ｄ）ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、（７Ｃ）における遺伝子に対応する２３１のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。（７Ｅ）（７Ｃ）における遺伝子に対応するプローブセットのＲＭＡ（ｌｏｇ２）強度。左パネルは、基底状態の３９のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の１８８のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがＸ軸上にプロットされ、平均ＦＭＭ／ＳＭＣ４強度がＹ軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。（７Ｆ）従来の培養培地中で誘導及び培養されたｈｉＰＳＣクローンと、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットを使用してＳＭＣ４に適合されたその対応物との間の、Ｘ染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。ＸＩＳＴ遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。（７Ｇ）５継代の間ＦＭＭ中で維持された、または従来の培養に適合されたｈｉＰＳＣクローン上のＨＥＫ２７ｍｅ３の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。ＦＭＭ培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー＝５０μｍ。 図８Ａ～８Ｄ。ＦＲＭ及びＦＭＭによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。（８Ａ）再プログラムプールの１０日目のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フロープロファイル。（８Ｂ）再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから１３日後に撮影された。（８Ｃ）最初の１４日間ＦＲＭ中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、ＦＲＭ中に維持するか、またはＦＭＭに切り替えた。次いで、トランスフェクションから２１日後に、再プログラム培養物をＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０にソーティングし、さらに１０日間ＦＲＭまたはＦＭＭ中に維持してから分析した。（８Ｄ）ＦＲＭまたはＦＭＭ中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。ＦＳＣ；前方側方散乱。 図８Ａ～８Ｄ。ＦＲＭ及びＦＭＭによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。（８Ａ）再プログラムプールの１０日目のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フロープロファイル。（８Ｂ）再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから１３日後に撮影された。（８Ｃ）最初の１４日間ＦＲＭ中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、ＦＲＭ中に維持するか、またはＦＭＭに切り替えた。次いで、トランスフェクションから２１日後に、再プログラム培養物をＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０にソーティングし、さらに１０日間ＦＲＭまたはＦＭＭ中に維持してから分析した。（８Ｄ）ＦＲＭまたはＦＭＭ中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。ＦＳＣ；前方側方散乱。 図８Ａ～８Ｄ。ＦＲＭ及びＦＭＭによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。（８Ａ）再プログラムプールの１０日目のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フロープロファイル。（８Ｂ）再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから１３日後に撮影された。（８Ｃ）最初の１４日間ＦＲＭ中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、ＦＲＭ中に維持するか、またはＦＭＭに切り替えた。次いで、トランスフェクションから２１日後に、再プログラム培養物をＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０にソーティングし、さらに１０日間ＦＲＭまたはＦＭＭ中に維持してから分析した。（８Ｄ）ＦＲＭまたはＦＭＭ中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。ＦＳＣ；前方側方散乱。 図８Ａ～８Ｄ。ＦＲＭ及びＦＭＭによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。（８Ａ）再プログラムプールの１０日目のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１フロープロファイル。（８Ｂ）再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから１３日後に撮影された。（８Ｃ）最初の１４日間ＦＲＭ中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、ＦＲＭ中に維持するか、またはＦＭＭに切り替えた。次いで、トランスフェクションから２１日後に、再プログラム培養物をＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０にソーティングし、さらに１０日間ＦＲＭまたはＦＭＭ中に維持してから分析した。（８Ｄ）ＦＲＭまたはＦＭＭ中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。ＦＳＣ；前方側方散乱。 図９Ａ～９Ｂ。様々な親株の再プログラムを示す図である。（９Ａ）この試験において使用された出発細胞株の要約表である。各株に関連した特定情報に加えて、エピソームトランスフェクション後のソーティング時点での陽性ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０集団のパーセントが示されている。（９Ｂ）高ＣＤ３４臍帯血細胞のソーティング及び培養を示す図である。事前にバンク内で維持された０．５ｍｌの体積の臍帯血を使用して、６５，０００ ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋Ｌｉｎ－細胞を抽出し、これをエピソームトランスフェクションの前に懸濁液中で６日間培養した。 図９Ａ～９Ｂ。様々な親株の再プログラムを示す図である。（９Ａ）この試験において使用された出発細胞株の要約表である。各株に関連した特定情報に加えて、エピソームトランスフェクション後のソーティング時点での陽性ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０集団のパーセントが示されている。（９Ｂ）高ＣＤ３４臍帯血細胞のソーティング及び培養を示す図である。事前にバンク内で維持された０．５ｍｌの体積の臍帯血を使用して、６５，０００ ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋Ｌｉｎ－細胞を抽出し、これをエピソームトランスフェクションの前に懸濁液中で６日間培養した。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１０Ａ～１０Ｇ。再プログラム及び維持プロセスの間のｈｉＰＳＣの特性決定を示す図である。（１０Ａ）単一細胞９６ウェルプレートソーティングから３日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、４００μｍを示す。（１０Ｂ）様々な出発細胞からのソーティングから７～９日後の単一細胞誘導ｈｉＰＳＣ様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、１０００μｍを示す。（１０Ｃ）９６ウェルプレートにおけるｈｉＰＳＣ様コロニーのＮＡＮＯＧ発現の免疫細胞化学分析。（１０Ｄ）再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたＦＴＣ００７の、１６日目のフロープロファイル分析。（１０Ｅ）明視野像、（１０Ｆ）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光、または（１０Ｇ）マトリゲル上で継続的に、または５継代ビトロネクチンの間ＦＭＭ中で維持されたＦＴＣ０１６－ｃ２８のＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１のフローサイトメトリー分析。 図１１Ａ～１１Ｃ。ＦＭＭ培養基盤による最小限の遺伝子再プログラムの例を示す図である。（１１Ａ）ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソームコンストラクトによるトランスフェクションから２～５日後の、ハイグロマイシンで処理された細胞の形態。（１１Ｂ）再プログラムプールを、より長期間維持し、トランスフェクションから１６日後にプロファイリングした。（１１Ｃ）マトリゲルまたはビトロネクチン上で維持された培養物の外観。 図１１Ａ～１１Ｃ。ＦＭＭ培養基盤による最小限の遺伝子再プログラムの例を示す図である。（１１Ａ）ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソームコンストラクトによるトランスフェクションから２～５日後の、ハイグロマイシンで処理された細胞の形態。（１１Ｂ）再プログラムプールを、より長期間維持し、トランスフェクションから１６日後にプロファイリングした。（１１Ｃ）マトリゲルまたはビトロネクチン上で維持された培養物の外観。 図１１Ａ～１１Ｃ。ＦＭＭ培養基盤による最小限の遺伝子再プログラムの例を示す図である。（１１Ａ）ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソームコンストラクトによるトランスフェクションから２～５日後の、ハイグロマイシンで処理された細胞の形態。（１１Ｂ）再プログラムプールを、より長期間維持し、トランスフェクションから１６日後にプロファイリングした。（１１Ｃ）マトリゲルまたはビトロネクチン上で維持された培養物の外観。 図１２Ａ～１２Ｅ。複数の条件下で培養されたｈｉＰＳＣの特性を示す図である。（１２Ａ）レンチウイルス誘導及びＳＭＣ４維持ＦＴｉ１１１は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。（１２Ｂ）ＦＴｉ１１１ ｐ４３の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような４つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養（これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された）を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。（１２Ｃ）解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。（１２Ｄ）解凍後３継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、１０００μｍである。（１２Ｅ）各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨ１ ｈＥＳＣと比較して正規化された。 図１２Ａ～１２Ｅ。複数の条件下で培養されたｈｉＰＳＣの特性を示す図である。（１２Ａ）レンチウイルス誘導及びＳＭＣ４維持ＦＴｉ１１１は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。（１２Ｂ）ＦＴｉ１１１ ｐ４３の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような４つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養（これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された）を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。（１２Ｃ）解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。（１２Ｄ）解凍後３継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、１０００μｍである。（１２Ｅ）各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨ１ ｈＥＳＣと比較して正規化された。 図１２Ａ～１２Ｅ。複数の条件下で培養されたｈｉＰＳＣの特性を示す図である。（１２Ａ）レンチウイルス誘導及びＳＭＣ４維持ＦＴｉ１１１は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。（１２Ｂ）ＦＴｉ１１１ ｐ４３の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような４つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養（これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された）を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。（１２Ｃ）解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。（１２Ｄ）解凍後３継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、１０００μｍである。（１２Ｅ）各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨ１ ｈＥＳＣと比較して正規化された。 図１２Ａ～１２Ｅ。複数の条件下で培養されたｈｉＰＳＣの特性を示す図である。（１２Ａ）レンチウイルス誘導及びＳＭＣ４維持ＦＴｉ１１１は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。（１２Ｂ）ＦＴｉ１１１ ｐ４３の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような４つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養（これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された）を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。（１２Ｃ）解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。（１２Ｄ）解凍後３継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、１０００μｍである。（１２Ｅ）各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨ１ ｈＥＳＣと比較して正規化された。 図１２Ａ～１２Ｅ。複数の条件下で培養されたｈｉＰＳＣの特性を示す図である。（１２Ａ）レンチウイルス誘導及びＳＭＣ４維持ＦＴｉ１１１は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。（１２Ｂ）ＦＴｉ１１１ ｐ４３の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような４つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養（これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された）を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。（１２Ｃ）解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。（１２Ｄ）解凍後３継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、１０００μｍである。（１２Ｅ）各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。データは、ＧＡＰＤＨに対して、及びＨ１ ｈＥＳＣと比較して正規化された。 図１３Ａ～１３Ｅ。様々な条件下で培養されたｈｉＰＳＣの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。（１３Ａ）包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。（１３Ｂ）合計３００のプローブセットが、従来の培養条件と小分子（ＦＭＭ及びＳＭＣ４）培養条件との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３００のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（１３Ｃ）従来の培養により（小分子培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１３３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｄ）小分子培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１６７のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｅ）ＦＭＭ培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１２６のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。 図１３Ａ～１３Ｅ。様々な条件下で培養されたｈｉＰＳＣの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。（１３Ａ）包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。（１３Ｂ）合計３００のプローブセットが、従来の培養条件と小分子（ＦＭＭ及びＳＭＣ４）培養条件との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３００のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（１３Ｃ）従来の培養により（小分子培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１３３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｄ）小分子培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１６７のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｅ）ＦＭＭ培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１２６のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。 図１３Ａ～１３Ｅ。様々な条件下で培養されたｈｉＰＳＣの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。（１３Ａ）包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。（１３Ｂ）合計３００のプローブセットが、従来の培養条件と小分子（ＦＭＭ及びＳＭＣ４）培養条件との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３００のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（１３Ｃ）従来の培養により（小分子培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１３３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｄ）小分子培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１６７のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｅ）ＦＭＭ培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１２６のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。 図１３Ａ～１３Ｅ。様々な条件下で培養されたｈｉＰＳＣの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。（１３Ａ）包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。（１３Ｂ）合計３００のプローブセットが、従来の培養条件と小分子（ＦＭＭ及びＳＭＣ４）培養条件との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３００のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（１３Ｃ）従来の培養により（小分子培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１３３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｄ）小分子培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１６７のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｅ）ＦＭＭ培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１２６のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。 図１３Ａ～１３Ｅ。様々な条件下で培養されたｈｉＰＳＣの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。（１３Ａ）包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。（１３Ｂ）合計３００のプローブセットが、従来の培養条件と小分子（ＦＭＭ及びＳＭＣ４）培養条件との間で、２．５倍超、または２．５倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した３００のプローブセットに対する階層的クラス多分析。（１３Ｃ）従来の培養により（小分子培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１３３のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｄ）小分子培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１６７のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析（Ｄ．Ａ．Ｖ．Ｉ．Ｄ．）。（１３Ｅ）ＦＭＭ培養により（従来の培養と比較して）２．５倍以上上方制御された１２６のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。 図１４Ａ～１４Ｆ。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト（１４Ａ～１４Ｂ）及びエピソームコンストラクト（１４Ｃ～１４Ｆ）の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター、及び導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断のためのＬＯＸＰ部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。 図１４Ａ～１４Ｆ。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト（１４Ａ～１４Ｂ）及びエピソームコンストラクト（１４Ｃ～１４Ｆ）の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター、及び導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断のためのＬＯＸＰ部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。 図１４Ａ～１４Ｆ。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト（１４Ａ～１４Ｂ）及びエピソームコンストラクト（１４Ｃ～１４Ｆ）の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター、及び導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断のためのＬＯＸＰ部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。 図１４Ａ～１４Ｆ。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト（１４Ａ～１４Ｂ）及びエピソームコンストラクト（１４Ｃ～１４Ｆ）の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター、及び導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断のためのＬＯＸＰ部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。 図１４Ａ～１４Ｆ。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト（１４Ａ～１４Ｂ）及びエピソームコンストラクト（１４Ｃ～１４Ｆ）の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター、及び導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断のためのＬＯＸＰ部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。 図１４Ａ～１４Ｆ。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト（１４Ａ～１４Ｂ）及びエピソームコンストラクト（１４Ｃ～１４Ｆ）の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター、及び導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断のためのＬＯＸＰ部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、ＥＦ１αプロモーターを含む。 図１５Ａ～１５Ｃ。８～１５日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析を示す図である。ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１を含むレンチウイルス媒介再プログラミング因子の様々な組み合わせで、ヒト線維芽細胞を誘引した。 図１５Ａ～１５Ｃ。８～１５日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析を示す図である。ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１を含むレンチウイルス媒介再プログラミング因子の様々な組み合わせで、ヒト線維芽細胞を誘引した。 図１５Ａ～１５Ｃ。８～１５日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析を示す図である。ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、及びＵＴＦ１を含むレンチウイルス媒介再プログラミング因子の様々な組み合わせで、ヒト線維芽細胞を誘引した。 図１６Ａ～１６Ｄ。２１～２７日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びｉＰＳＣ形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋ｈｉＰＳＣを誘導することができることを示している。 図１６Ａ～１６Ｄ。２１～２７日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びｉＰＳＣ形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋ｈｉＰＳＣを誘導することができることを示している。 図１６Ａ～１６Ｄ。２１～２７日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びｉＰＳＣ形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋ｈｉＰＳＣを誘導することができることを示している。 図１６Ａ～１６Ｄ。２１～２７日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びｉＰＳＣ形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋ｈｉＰＳＣを誘導することができることを示している。 図１７Ａ～１７Ｂ。フロー分析（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋及びＣＤ３０＋集団）ならびにｉＰＳＣ形態の特性により示されるような、極めて向上したレンチウイルス再プログラム効率を示す図である。ヒト線維芽細胞を、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＮＡＮＯＧで再プログラムした。細胞は、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。 図１７Ａ～１７Ｂ。フロー分析（ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋及びＣＤ３０＋集団）ならびにｉＰＳＣ形態の特性により示されるような、極めて向上したレンチウイルス再プログラム効率を示す図である。ヒト線維芽細胞を、ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＮＡＮＯＧで再プログラムした。細胞は、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。 図１８Ａ～１８Ｄ。９６ウェルソーティング後７～９継代後の樹立された４つのｉＰＳＣクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、ＦＲＭを用いてレンチウイルス再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＮＡＮＯＧ）により生成し、ＦＭＭ中で維持した。高いＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋を発現する集団は、多能性を示す。 図１８Ａ～１８Ｄ。９６ウェルソーティング後７～９継代後の樹立された４つのｉＰＳＣクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、ＦＲＭを用いてレンチウイルス再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＮＡＮＯＧ）により生成し、ＦＭＭ中で維持した。高いＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋を発現する集団は、多能性を示す。 図１８Ａ～１８Ｄ。９６ウェルソーティング後７～９継代後の樹立された４つのｉＰＳＣクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、ＦＲＭを用いてレンチウイルス再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＮＡＮＯＧ）により生成し、ＦＭＭ中で維持した。高いＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋を発現する集団は、多能性を示す。 図１８Ａ～１８Ｄ。９６ウェルソーティング後７～９継代後の樹立された４つのｉＰＳＣクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、ＦＲＭを用いてレンチウイルス再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、及びＮＡＮＯＧ）により生成し、ＦＭＭ中で維持した。高いＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋を発現する集団は、多能性を示す。 図１９Ａ～１９Ｂ。レンチウイルス再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより再プログラムされたヒト線維芽細胞における、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現の代表的フロー分析を示す図である。クローンは、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。高いＯＣＴ４＋／ＮＡＮＯＧ＋を発現する集団は、多能性を示す。 図１９Ａ～１９Ｂ。レンチウイルス再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより再プログラムされたヒト線維芽細胞における、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現の代表的フロー分析を示す図である。クローンは、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。高いＯＣＴ４＋／ＮＡＮＯＧ＋を発現する集団は、多能性を示す。 レンチウイルス再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより再プログラムされたヒト線維芽細胞から誘導されたｈＩＰＳＣクローンの核型分析を示す図である。クローンは、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。クローンは、正常男性核型を示す。 レンチウイルス再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより再プログラムされたヒト線維芽細胞から誘導されたｈＩＰＳＣクローンの核型分析を示す図である。クローンは、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。クローンは、正常男性核型を示す。 レンチウイルス再プログラミング因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ及びＥＳＲＲＢにより再プログラムされたヒト線維芽細胞から誘導されたｈＩＰＳＣクローンの核型分析を示す図である。クローンは、ＦＲＭを使用して再プログラムし、ＦＭＭ中で維持した。クローンは、正常男性核型を示す。 再プログラミング因子の組み合わせＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２／ＬＡＲＧＥ Ｔと比較した、再プログラミング因子の組み合わせＯＣＴ４／ＥＳＲＲＢ／ＮＡＮＯＧ／ＥＣＡＴ１／ＵＴＦ１の９６ウェルプレートソーティング効率を示す図である。 図２２Ａ～２２Ｂ。（２２Ａ）４、６及び１１日目のＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ－Ｐ２Ａ－ＥＳＲＲＢ－Ｔ２Ａ－ＬＩＮ２８／ＥＣＡＴ１－Ｔ２Ａ－ＵＴＦ１、ならびに（２２Ｂ）７日目の２つのウェル、及び１０日目の１つのウェルにおけるＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＥＳＲＲＢ／ＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ／ＥＣＡＴ１－Ｔ２Ａ－ＵＴＦ１で再プログラムされた細胞に対する、９６ウェルからの拡大中のコロニーの画像を示す図である。 図２２Ａ～２２Ｂ。（２２Ａ）４、６及び１１日目のＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ－Ｐ２Ａ－ＥＳＲＲＢ－Ｔ２Ａ－ＬＩＮ２８／ＥＣＡＴ１－Ｔ２Ａ－ＵＴＦ１、ならびに（２２Ｂ）７日目の２つのウェル、及び１０日目の１つのウェルにおけるＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＥＳＲＲＢ／ＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ／ＥＣＡＴ１－Ｔ２Ａ－ＵＴＦ１で再プログラムされた細胞に対する、９６ウェルからの拡大中のコロニーの画像を示す図である。 図２３Ａ～２３Ｃ。（２３Ａ）再プログラミング因子の化学量論、及び異所性ＯＣＴ４発現による細胞の選択のための遺伝子マーカーの使用の効果を示すフロー分析、（２３Ｂ）ＯＣＴ４の選択のないエピソームＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原により再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析、ならびに（２３Ｃ）エピソームＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原／ＯＣＴ２－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４－ピューロマイシンにより再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析の結果の要約を示す図である。 図２３Ａ～２３Ｃ。（２３Ａ）再プログラミング因子の化学量論、及び異所性ＯＣＴ４発現による細胞の選択のための遺伝子マーカーの使用の効果を示すフロー分析、（２３Ｂ）ＯＣＴ４の選択のないエピソームＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原により再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析、ならびに（２３Ｃ）エピソームＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原／ＯＣＴ２－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４－ピューロマイシンにより再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析の結果の要約を示す図である。 図２３Ａ～２３Ｃ。（２３Ａ）再プログラミング因子の化学量論、及び異所性ＯＣＴ４発現による細胞の選択のための遺伝子マーカーの使用の効果を示すフロー分析、（２３Ｂ）ＯＣＴ４の選択のないエピソームＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原により再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析、ならびに（２３Ｃ）エピソームＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２／ＳＶ４０ラージＴ抗原／ＯＣＴ２－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４－ピューロマイシンにより再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析の結果の要約を示す図である。 青色のＤＡＰＩにより多能性マーカーＯＣＴ４（緑）及びＴＲＡ１８１（赤）に関して染色された誘導ｉＰＳＣクローンの免疫蛍光分析を示す図である。 ＣＲＥ媒介切断後のＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋／ＣＤ３０＋９６ウェルプレートソーティングクローンの画像を示す図である。コロニーは、元々ヒト線維芽細胞から誘導され、レンチウイルス因子ＯＣＴ４、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＮＡＮＯＧ、及びＥＳＲＲＢで再プログラムされ、次いで導入遺伝子のために切断されたｉＰＳＣクローンからソーティングされた。ソーティングされたコロニーは、ｉＰＳＣ表現型を示す。
Ａ．概要
多能性細胞の生成及び維持のための現行の方法は、自発的分化がなく、高分解能／高クローン性単一細胞継代及び大規模拡大が容易なフットプリントを含まない多能性細胞の均質培養を、依然として実現していない。基底状態多能性細胞は、これらの課題を克服する品質及び特性をもたらし得る。しかしながら、現在まで、フィーダーを含まない条件下での基底状態多能性細胞のハイスループット生成のための、信頼性のある堅牢な方法は存在しない。したがって、現行の方法は、産業または臨床グレードの多能性細胞の生成には好適となり得ない。本明細書において企図される発明は、基底状態多能性の、またはその特性を有する安定した多能性細胞の堅牢な生成の必要性に対処し、産業及び臨床用途に好適な安定した多能性細胞の製造における問題を解決する。
概して、本発明は、多能性細胞、特に、基底状態多能性細胞を含む自発的分化が低減された細胞の改善された製造のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、段階特異的に細胞シグナル伝達経路の小分子モジュレータを利用し、培養方法及び多能性細胞の誘導方法が下流における使用の変動性及び／またはゲート活性の原因とならない点まで多能性細胞の誘導及び維持を可能にする、複数段階培養基盤に関する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、改善されたゲノム安定性、改善された未分化状態、低減された自発的分化、改善された培養物均質性、培養における改善された生残性、解離、及び単一多能性細胞の継代、ならびに、導入遺伝子またはフットプリントを使用しない基底状態多能性までの細胞の再プログラムを伴う、フィーダーを含まない条件下での多能性細胞の誘導及び維持を可能にする。したがって、本明細書において企図される組成物及び方法は、産業及び臨床用途に適切な多能性細胞、ならびに／または基底状態多能性細胞の製造を可能にする。
現在まで、小分子駆動基盤は、再プログラムを向上させ、ヒト細胞から誘導されたフットプリントを含まない人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の単一細胞及びＦＦ培養を補助することは示されていない（Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，２０１２）。本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、段階特異的な小分子阻害剤の特定の組み合わせの適用を提供し、多能性幹細胞の迅速及び堅牢な再プログラムならびに安定な長期培養を可能にする。様々な実施形態において、基底状態多能性を含む改善された未分化多能性状態を誘引または維持するための培養基盤が提供される。本明細書において企図される基盤はまた、ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）における基底状態多能性の生成及び維持のための堅牢な培養系を提供する。一実施形態において、培養基盤は、導入遺伝子またはフットプリントを使用しない再プログラム方法を可能にする。具体的実施形態において、本明細書において企図される基盤は、導入遺伝子を含まないｈｉＰＳＣの多重誘導及び維持における主要な課題を克服するｈｉＰＳＣの製造のための改善された方法を示す。
本発明の実践は、具体的に異なるように指定されない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコル、細胞培養及び遺伝子導入生物学の従来の方法を使用し、その多くは例示のめに以下に記載される。そのような技術は、文献中に十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，２００５）；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００５）；Ｅｎｇｅｌｋｅ，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｔｈｅ Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ，２００３）；Ｇｏｔｔ，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｅｄｉｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ； Ｈｕｍａｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００４）；Ｓｏｈａｉｌ，Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＣＲＣ，２００４）；Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｓａｎｓｅａｕ，ｍｉｃｒｏＲＮＡ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ＆Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ ｓｅｒｉｅｓ； ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ，２００６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００２）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００６）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ，Ｅｄ．，２００６）；Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ Ｅｄ．，２００６）；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｄａｒｗｉｎ Ｊ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄｏｎａｌｄ Ｇ．Ｐｈｉｎｎｅｙ，ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ
Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ Ｅｄｓ．，２００８）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ａ．Ｋｌｕｇ，ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｔ．Ｊｏｒｄａｎ Ｅｄｓ．，２００１）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｅｖｉｎ Ｄ．Ｂｕｎｔｉｎｇ Ｅｄ．，２００８） Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｌｉｅ Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ Ｅｄ．，２００８）；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｙｒｏ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２）、及びＴｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ
ｂｏｏｋ．Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ），４ｔｈ Ｅｄ．，（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２０００）を参照されたい。
本明細書において引用される全ての出版物、特許及び特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Ｂ．定義
別段に定義されていない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的において、以下の用語は、以下のように定義される。
冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な目的語の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すように使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
選択肢（例えば「または」）の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味するように理解されるべきである。
「及び／または」という用語は、選択肢のいずれか一方、または両方を意味するように理解されるべきである。
本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけ異なる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さ±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の範囲を指す。
本明細書において使用される場合、「実質的に」または「本質的に」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
本明細書において使用される場合、「～を実質的に含まない」及び「～を本質的に含まない」という用語は、交換可能に使用され、細胞集団または培養培地等の組成物を説明するために使用される場合、指定された物質を含まない、例えば指定された物質を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない、または従来の手段により測定した場合検出不可能である組成物を指す。組成物の特定の物質または構成成分の非存在を指す場合、「～が存在しない」という用語にも同様の意味が適用され得る。
本明細書において使用される場合、「認め得る」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さの範囲、または１つ以上の標準的方法により容易に検出可能であるイベントを指す。「認め得ない（ｎｏｔ－ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ）」及び「認め得ない（ｎｏｔ ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅ）」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さの範囲、または標準的方法により容易に検出可能でない、もしくは検出不可能であるイベントを指す。一実施形態において、イベントは、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％またはそれ未満の確率で生じる場合、認め得ない。
本出願全体を通して、文脈により別の意味が求められない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、示されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを暗示するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を暗示しないものとして理解される。具体的実施形態において、「含む」、「有する」、「含有する」、及び「備える」という用語は、同義的に使用される。
「～からなる」とは、「～からなる」とうい語句に付随するものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素は存在し得ないことを示す。
「本質的に～からなる」とは、その語句に付随して列挙された任意の要素を含み、列挙された要素に関して本開示において特定された活動または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的に～からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択ではなく、列挙された要素の活動または作用に影響するか否かに依存して、存在してもしなくてもよいことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「具体的実施形態」、「関連した実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせは、実施形態に関連して説明される具体的な特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して、上記の語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではない。さらに、具体的な特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされてもよい。
「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、概して、生物の外で生じる活動、例えば、好ましくは自然条件を最小限に改変した生物の外の人工的環境において、生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定を指す。具体的実施形態において、「ｅｘ ｖｉｖｏ」手順は、生物から取り出され、通常は無菌条件下で、また典型的には数時間から約２４時間までであるが、状況によっては４８時間または７２時間までの間実験室装置内で培養された生体細胞または組織を含む。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞は、回収及び凍結されてもよく、またその後ｅｘ ｖｉｖｏ処理のために解凍されてもよい。生体細胞または組織を使用した数日を超える期間続く組織培養実験または手順は、典型的には「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とみなされるが、ある特定の実施形態において、この用語はｅｘ ｖｉｖｏと交換可能に使用され得る。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、概して、生物内で生じる活動を指す。
本明細書において使用される場合、「再プログラム」または「脱分化」または「細胞能力の増加」または「発生能の増加」という用語は、細胞の能力を増加させる、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、増加した細胞能力を有する細胞は、非再プログラム状態における同じ細胞と比較して、発生上の可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化し得る）。換言すれば、再プログラムされた細胞は、非再プログラム状態の同じ細胞よりも分化していない状態にある細胞である。
本明細書において使用される場合、「能力」という用語は、細胞が利用し得る全ての発生上の選択肢の合計（すなわち、発生能）を指す。細胞能力は、最も高い発生能を有する最も可塑性の細胞である全能幹細胞から、最も低い発生能を有する最も非可塑性の細胞である最終分化細胞までの範囲の連続であることが、当業者に認識される。細胞能力の連続は、全能細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少分化能細胞、単分化能細胞、及び最終分化細胞を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「多能性」という用語は、体または身体（すなわち胚本体）の全ての系統を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚幹細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の３つの胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の種類である。
多能性は、部分的に、細胞の多能性特性を評価することにより決定され得る。多能性特性は、（ｉ）多能性幹細胞形態；（ｉｉ）無制限自己再生の可能性；（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４；ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１；ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／またはＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現；（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）への分化能力；（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫形成；ならびに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成を含むが、これらに限定されない。
後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライム」または「準安定」状態の多能性、及び初期／着床前胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」または「基底」状態の多能性の、２種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態が上述のような特性を示すが、ナイーブまたは基底状態は、さらに、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の事前不活性化または再活性化、（ｉｉ）単細胞培養中の改善されたクローン性及び生残性、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的低減、（ｉｖ）発生制御遺伝子プロモーターへのＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク堆積の低減、ならびに（ｖ）プライム状態多能性細胞に対する分化マーカーの発現の低減を示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、次いでサイレンシングまたは得られた多能性細胞から除去される細胞再プログラムの標準的方法は、概して、プライム状態の多能性の特性を有すると見られる。標準的多能性細胞培養条件下において、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限りプライム状態のままであり、基底状態の特性が観察される。
本明細書において使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚幹細胞の古典的な形態の特徴を指す。正常な胚幹細胞形態は、丸く小さい形状を特徴とし、高い核対細胞質比、顕著な核小体の存在、及び典型的な細胞間間隔を有する。
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現プロファイル」、「遺伝子発現シグニチャー」、「遺伝子発現パネル」、「遺伝子パネル」、または「遺伝子シグニチャー」という用語は、細胞または細胞の集団を別の細胞または細胞の集団から区別するのに役立つ、複数の遺伝子の発現または発現のレベルを指す。例えば、自発的分化を防止するために培地中に維持された多能性細胞の集団は、同じ培地中に維持されていない同じ起源の多能性細胞の対照集団と比較して、分化遺伝子の発現の低下を含む遺伝子発現プロファイルを示し得る。
本明細書において使用される場合、「分化マーカー遺伝子」または「分化遺伝子」という用語は、その発現が、多能性細胞等の細胞内で生じる細胞分化を示す遺伝子を指す。分化マーカー遺伝子は、次の遺伝子：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「分化マーカー遺伝子プロファイル」もしくは「分化遺伝子プロファイル」、「分化遺伝子発現プロファイル」、「分化遺伝子発現シグニチャー」、「分化遺伝子発現パネル」、「分化遺伝子パネル」、または「分化遺伝子シグニチャー」という用語は、複数の分化マーカー遺伝子の発現または発現のレベルを指す。
具体的実施形態において、自発的分化の減少を示す多能性細胞の集団は、分化マーカー遺伝子の発現の減少または分化マーカー遺伝子プロファイルにより特徴付けられ得る。例えば、多能性細胞または多能性細胞の集団における自発的分化の減少は、所与の培養条件のセットが、同じ培養条件を有さない対照多能性細胞または多能性細胞の集団の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現の少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の減少をもたらした場合に示され得る。
「遺伝子発現」は、本明細書において使用される場合、多能性細胞、または多能性細胞を含む細胞の集団等の生体試料における遺伝子の発現の相対的レベル及び／または発現のパターンを指す。具体的実施形態において、多能性細胞は、ｉＰＳＣである。
本発明の細胞を特徴付ける遺伝子の発現を検出するための、当該技術分野において利用可能な任意の方法が、本明細書において包含される。本明細書において使用される場合、「発現を検出する」という用語は、遺伝子のＲＮＡ転写産物またはその発現産物の数量または存在を決定することを意味する。遺伝子の発現を検出するための、すなわち遺伝子発現プロファイリングのための方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学的方法、及びプロテオミクスに基づく方法を含む。方法は、一般に、関心のある遺伝子の発現産物（例えばｍＲＮＡ）を検出する。いくつかの実施形態において、ＰＣＲに基づく方法、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ ８：２６３－６４，１９９２）、及びアレイに基づく方法、例えばマイクロアレイ（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７－７０，１９９５）が使用される。
「接着」は、槽に付着する細胞、例えば、適切な培養培地の存在下で無菌プラスチック（またはコーティングプラスチック）細胞培養皿またはフラスコに付着する細胞を指す。細胞のある特定のクラスは、それらが細胞培養槽に接着しない限り、培養物中で保持されない、または成長しない。細胞のある特定のクラス（「非接着細胞」）は、接着せずに培養物中で維持及び／または増殖される。
「培養」または「細胞培養」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境における細胞の維持、成長及び／または分化を指す。「細胞培養培地（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」、「培養培地（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」（それぞれの場合において単数形は「ｍｅｄｉｕｍ」）、「補充物」及び「培地補充物」は、細胞培養物を育成する栄養組成物を指す。
「育成する」は、組織または体の外での、例えば無菌プラスチック（またはコーティングプラスチック）細胞培養皿またはフラスコ内での細胞の保持、繁殖（成長）及び／または分化を指す。「育成」は、栄養物、ホルモンならびに／または細胞の繁殖及び／もしくは保持に役立つ他の因子の源として、培養培地を利用してもよい。
本明細書において使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞または表面（例えば培養プレート表面）から実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法により、動物または組織から解離され得る。代替として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで凝集する細胞は、例えば、クラスタ、単一細胞または単一細胞及びクラスタの混合物の懸濁液中に解離させることにより、互いから酵素的または機械的に解離され得る。さらに別の代替の実施形態において、接着細胞は、培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外基質（ＥＣＭ）及び基板（例えば培養表面）との細胞相互作用の破壊、または細胞間のＥＣＭの破壊を含み得る。
本明細書において使用される場合、「濃縮する」及び「濃縮すること」という用語は、細胞の組成物等の組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「濃縮された」は、細胞集団等の細胞の組成物を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量的割合が、濃縮される前の細胞の集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加した細胞の集団を指す。例えば、細胞の集団等の組成物は、標的細胞型（すなわち特定の特性を有する細胞）に関して濃縮されてもよく、したがって、濃縮される前の細胞の集団内に存在する標的細胞の割合と比較して、標的細胞型の割合またはパーセントが増加していてもよい。細胞の集団は、当該技術分野において知られている細胞選択及びソーティング方法により、標的細胞型に関して濃縮されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、本明細書の実施例において説明されるようなソーティングまたは選択プロセスにより濃縮される。具体的実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して少なくとも約２０％細胞集団を濃縮し、すなわち、濃縮された細胞集団は、比例して、集団が濃縮される前の集団内よりも約２０％多い標的細胞型を含む。一実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して、比例して少なくとも約３０＋％、４０＋％、５０＋％、６０＋％、７０＋％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％、または少なくとも約９８％、または具体的実施形態において約９９％細胞集団を濃縮する。
ある特定の実施形態において、細胞の集団は、多能性細胞、または多能性特性を示す細胞の量に関して濃縮される。本発明の具体的実施形態において、再プログラムを受ける細胞の集団は、多能性の特性、例えば、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ １－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ３０またはＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性マーカーの発現を有する標的細胞に関して濃縮される。
具体的実施形態において、細胞の集団、例えば再プログラムを受ける細胞の集団は、例えばＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７を含み得る、分化細胞系統または非多能性細胞に特異的な表面マーカーを使用して、非多能性細胞が枯渇している。したがって、得られる細胞集団は、多能性細胞が濃縮された細胞の集団であると説明され得る。
具体的実施形態において、濃縮された細胞は、異なる遺伝子またはタンパク質発現プロファイル、例えば、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ １－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ３０及びＣＤ５０等の少なくとも２つの多能性マーカーの細胞表面発現を有する。いくつかの実施形態において、濃縮された細胞は、２つ以上の多能性マーカーを含む。具体的実施形態において、濃縮された細胞は、ＴＲＡ－１８１またはＴＲＡ－１６０と組み合わせてＳＳＥＡ４を発現する。より具体的な実施形態において、濃縮された細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、及びＣＤ３０を発現する。一実施形態において、細胞の集団は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の濃縮された細胞、例えば多能性細胞を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、多能性細胞に関して細胞の集団を濃縮する方法は、細胞集団を、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ １－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ３０及びＣＤ５０等の多能性マーカーの細胞表面発現に基づいてソーティングすることと、そのようなマーカーを発現する細胞の分画を回収して、多能性細胞が濃縮された細胞の集団を得ることを含む。他の実施形態において、細胞の集団は、細胞集団を、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、及びＣＤ７等の、分化している、または分化した細胞のマーカーの細胞表面発現に基づいてソーティングすること、ならびに、そのような細胞の細胞集団を枯渇させて、多能性細胞が濃縮された細胞の集団を得ることにより、多能性細胞に関して濃縮される。具体的実施形態において、細胞集団は、ＣＤ１３の発現に基づいてソーティングされ、細胞集団からＣＤ１３＋細胞が除去されて、多能性細胞が濃縮された細胞の集団が得られる。
本明細書において使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第２の種類の細胞と共培養されて第２の種類の細胞が成長し得る環境を提供する（フィーダー細胞が第２の細胞型を補助するための成長因子及び栄養物を提供するため）１つの種類の細胞を説明するために使用される用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが補助している細胞とは異なる種からのものである。例えば、幹細胞を含むある特定の種類のヒト細胞は、マウス胎児線維芽細胞及び不死化マウス胎児線維芽細胞の初代培養物により補助され得る。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養される場合、それらが補助している細胞の過剰成長を防止するために、放射線照射またはマイトマイシンＣ等の抗分裂剤による処理によって不活性化され得る。上記に限定されず、１つの特定のフィーダー細胞の種類は、ヒトフィーダー、例えばヒト皮膚線維芽細胞であってもよい。別のフィーダー細胞の種類は、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）であってもよい。
本明細書において使用される場合、「フィーダーを含まない」（ＦＦ）環境は、例えば、フィーダー細胞を本質的に含まない、及び／またはフィーダー細胞の育成により事前に調整されていない細胞培養物または培養培地等の環境を指す。「事前に調整された」培地は、培地中で所定期間、例えば少なくとも１日フィーダー細胞が育成された後に採取された培地を指す。事前調整された培地は、培地中で育成されたフィーダー細胞により分泌された成長因子及びサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含有する。
ゲノム安定性は、ＤＮＡを忠実に複製し、ＤＮＡ複製プロセスの完全性を維持する細胞の能力を指す。本明細書において使用される場合、「ゲノム安定細胞」及び「ゲノム安定性を有する細胞」という用語は、正常ヒト体細胞に対する突然変異及び染色体異常の頻度に実質的に類似した突然変異及び染色体異常（例えば転座、異数性、複製数の多様性及び重複）の頻度を示す細胞を指す。
「成分」は、細胞の成長及び／または分化を維持及び／または促進するために細胞培養培地中に使用され得る、元来化学的または生物学的な任意の化合物または他の材料を指す。「構成成分」、「栄養物」及び「成分」という用語は、交換可能に使用され得る。細胞培養培地に使用される従来の成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等を含み得るが、これらに限定されない。ｅｘ ｖｉｖｏで細胞の育成を促進及び／または維持する他の成分は、所望の効果のために必要に応じて当業者により選択され得る。
「単離する」または「単離すること」は、その自然環境から組成物または材料を分離及び回収すること、例えば組織または体からの個々の細胞または細胞培養物の分離を指す。一態様において、細胞の集団または組成物は、細胞、及び細胞が自然において関連し得る材料を実質的に含まない。細胞の標的集団に関連して、「単離された」または「精製された」または「実質的に純粋な」は、全細胞集団を構成する標的細胞に関して、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、及び具体的実施形態において少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。細胞の集団または組成物の純度は、当該技術分野において周知の適切な方法により評価され得る。例えば、多能性細胞の実質的に純粋な集団は、全細胞集団を構成する多能性細胞に関して、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、及び具体的実施形態において少なくとも約９５％、及びある特定の実施形態において約９８％純粋である細胞の集団を指す。「本質的に純粋な」という用語は、本明細書において、「実質的に純粋な」と交換可能に使用される。
「継代」または「継代すること」は、細胞が所望の程度まで増殖した際に、複数の細胞培養表面または槽に細胞を小分け及び播種する行為を指す。いくつかの実施形態において、「継代」または「継代すること」は、細胞を小分け、希釈及び播種することを指す。細胞が初代培養表面または槽から表面または槽の後続のセットに継代されると、後続の培養は、本明細書において「二次培養」または「第１継代」等と呼ぶことができる。新たな培養槽への小分け及び播種の各行為は、１つの継代とみなされる。
「播種」は、細胞が細胞培養槽に接着する、またはそれに展着するように、細胞（複数を含む）を培養槽内に入れることを指す。
「多能性因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤をさす。多能性因子は、限定されることなく、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び細胞の発生能を増加させることができる小分子を含む。例示的な多能性因子は、例えば、転写因子及び小分子再プログラム剤を含む。
「増殖する」は、２つの本質的に同一の細胞に、または数が増加する（例えば再生する）細胞の集団に分裂する１つの細胞の性質を指す。
「繁殖」は、組織または体の外で、例えばプラスチック（またはコーティングプラスチック）細胞培養皿またはフラスコ等の無菌容器内で細胞を成長させる（例えば細胞増殖により再生する）ことを指す。
「初期培養物」は、単離された細胞が培養培地を有する第１の培養槽内に入れられる場合の細胞、組織及び／または培養物を指す。細胞、組織及び／または培養物は、保持されてもよく、及び／または増殖されてもよいが、細胞、組織及び／または培養物が第１の槽内に維持される限り、細胞、組織及び／または培養物は初期培養物と呼ばれる。
「小分子再プログラム剤」または「小分子再プログラム化合物」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、単独で、または他の多能性因子と組み合わせて細胞の発生能を増加させることができる小分子を指す。「小分子」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を有する薬剤を指す。小分子は、核酸、ペプチド模倣体、ペプトイド、炭水化物、脂質、または他の有機もしくは無機分子を含むが、これらに限定されない。真菌、細菌、または藻類抽出物等の化学的及び／または生物学的混合物のライブラリが当該技術分野において知られており、ある特定の実施形態において小分子の源として使用され得る。具体的実施形態において、本明細書において使用される小分子再プログラム剤は、１０，０００ダルトン未満、例えば８０００、６０００、４０００、２０００ダルトン未満、例えば５０～１５００、５００～１５００、２００～２０００、５００～５０００ダルトンの間の分子量を有する。
Ｃ．細胞
具体的実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、１つ以上の細胞が培養、解離、及び継代されてもよい。一実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、単一細胞が培養、解離、及び継代される。別の実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、細胞の集団または複数の細胞が培養、解離、及び継代される。
具体的実施形態における使用に好適な出発細胞集団は、本質的に任意の好適な源から誘導され得、細胞型または多能性の状態に関して不均質または均質であってもよい。好適な細胞は、胎児細胞及び成体細胞を含む。さらに、好適な細胞は、元来哺乳動物細胞であってもよく、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、または霊長類からのものであってもよい。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
細胞は、体細胞、非多能性細胞、不完全もしくは部分多能性幹細胞、多分化能細胞、少分化能細胞、単分化能細胞、最終分化細胞、または上記の任意の組み合わせを含む混合細胞集団であってもよい。具体的実施形態における使用に好適な多能性細胞は、自然発生的幹細胞、胚幹細胞、またはｉＰＳＣを含むが、これらに限定されない。「混合」細胞集団は、様々な程度の発生能を有する細胞の集団である。例えば、混合細胞集団は、再プログラムを受けている細胞を含んでもよく、したがって混合集団は多能性細胞、部分多能性細胞、及び非多能性細胞、例えば完全分化細胞を含む。
一実施形態において、出発細胞集団は、成体または新生児幹／前駆細胞から選択される。具体的実施形態において、出発幹／前駆体細胞集団は、中胚葉幹／前駆細胞、内胚葉幹／前駆細胞、及び外胚葉幹／前駆細胞からなる群から選択される。
中胚葉幹／前駆細胞の実例は、中胚葉幹／前駆細胞、内皮幹／前駆細胞、骨髄幹／前駆細胞、臍帯幹／前駆細胞、脂肪組織誘導幹／前駆細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）、間充織幹／前駆細胞、筋幹／前駆細胞、腎臓幹／前駆細胞、骨芽幹／前駆細胞、軟骨幹／前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。
外胚葉幹／前駆細胞の実例は、神経幹／前駆細胞、網膜幹／前駆細胞、皮膚幹／前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。
内胚葉幹／前駆細胞の実例は、肝臓幹／前駆細胞、膵臓幹／前駆細胞、上皮幹／前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、出発細胞集団は、膵島細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、肺細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、瀘胞細胞、血管細胞、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞等からなる群から選択される、不均質または均質細胞集団であってもよい。
Ｄ．自発的分化を低減するため、及び基底状態多能性を誘引するための培養基盤
細胞バンキング、疾患モデリング及び細胞治療用途は、高品質多能性細胞の製造に対して益々多くの要求を課している。例えば、ハイスループットのフットプリントを含まないｉＰＳＣの誘導、及び大規模生産を可能にするシステムにおけるその拡大は、技術的に実現しにくい状態が続いている。具体的実施形態において、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用した多能性細胞の迅速な並列生成、選択及び拡大を可能にする培養基盤が企図される。本明細書において企図される基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化された再プログラムを補助し、多能性細胞の単一細胞培養及び拡大を可能にしながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、遺伝的背景とは無関係に、及び導入遺伝子発現とは独立して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを含む多能性細胞を、自発的分化の低減された状態、及び一般的な多能性の基底状態まで培養することを提供する。
本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、培養における自発的分化が低減された産業または臨床グレード多能性細胞の生成に有用である。一実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、多能性を維持するように培養される。別の実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、培養における低減された自発的分化を達成及び／または維持するように培養される。別の実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、基底状態多能性を達成及び／または維持するように培養される。
様々な実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、１つ以上の多能性細胞の基底状態多能性、正常核型、及びゲノム安定性を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の継代（任意の介在する継代数を含む）の間維持する。
他の実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、１つ以上の多能性細胞における低減された自発的分化を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上の継代（任意の介在する継代数を含む）の間維持する。
一実施形態において、培養基盤は、細胞培養培地、ならびにＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む細胞培養培地を含む。様々な実施形態において、本明細書において企図される細胞培養培地は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤を含む、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない、またはそれを有さない。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、驚くべきことに、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤が再プログラムの効率を増加させる一方で、これらの阻害剤は多能性細胞集団の長期維持、品質及び均質性に反作用することを発見し、すなわち、ＴＧＦβ経路シグナル伝達の阻害は、細胞再プログラムの効率を改善したが、自発的分化が低減された均質多能性集団が好ましい場合、より具体的には導入遺伝子発現が存在しない場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系、特にフィーダー細胞を含まない単一細胞酵素的継代を使用した系における、多能性細胞集団のその後の維持には、この阻害からの解放が必要である。さらに、ＧＳＫ－３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない培地中での準安定多能性細胞の培養は、本明細書において開示されるように、多能性細胞を移行させ、自発的分化の低減を達成、及び／または基底状態多能性を達成する。本明細書において企図される培養培地基盤はまた、フィーダーを含まない環境内での多能性細胞の効率的な再プログラム及び長期培養を可能にする。さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４及び／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤、例えばＳＢ－４３１５４２等を包含するものとして理解されるべきである（例えば、Ｉｎｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（１）：６５－７４（２００２）を参照されたい）。
好ましい実施形態において、培養基盤は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏ Ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ならびに任意選択でＬＩＦ及び／またはｂＦＧＦを含む細胞培養培地を含み、ＴＧＦβＲまたはＡＬＫ５阻害剤を含むがこれらに限定されないＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含まない。
追加的実施形態において、細胞培養培地は、サイトカイン及び／または成長因子を実質的に含まず、任意選択でフィーダーを含まない環境である。他の実施形態において、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等の補充物を含有する。
１つの好ましい実施形態において、培養基盤は、フィーダーを含まない培養物を含む。
本明細書において企図される培養基盤はまた、自発的発現が低減され、及び／または基底状態多能性を達成する産業または臨床グレード多能性細胞の均質集団の製造等の、多くの利点を提供する。本明細書において使用される場合、「均質」という用語は、各細胞が集団内の他の細胞と同じ、または実質的に同じである細胞の集団を指す。一実施形態において、細胞は、各細胞が、本明細書において企図されるような同じ多能性マーカーの１つ以上、例えばＳＳＥＡ４及びＴＲＡ１－８１を発現する場合、集団内の他の細胞と同じである。一実施形態において、細胞の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上が、集団内の他の細胞と同じまたは実質的に同じである場合、集団は均質である。
１．ＴＧＦＢ受容体／ＡＬＫ５阻害剤
ＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びその発現を抑制するアンチセンス核酸を含み得る。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（例えば、Ｉｎｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６２（１）：６５－７４（２００２）を参照されたい）、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミドとしても知られるＡ－８３－０１（例えば、Ｔｏｊｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９６（１１）：７９１－８００（２００５）を参照されたく、例えばＴｏｉｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている）；２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）、ＢＭＰ４（Ｄａｌｔｏｎ、上記参照を参照されたい）、ＧＷ７８８３８８（－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド）（例えば、Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９（７）：２２１０－２２２１（２００６）を参照されたい）、ＳＭ１６（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（５）：２３５１－２３５９（２００７）を参照されたい）、ＩＮ－１１３０（３－（（５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（キノキサリン－６－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ３８（３）：３２５－３３９（２００８）を参照されたい）、ＧＷ６６０４（２－フェニル－４－（３－ピリジン－２－イル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン）（例えば、ｄｅ Ｇｏｕｖｉｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ １９（２）：８５－９０（２００６）を参照されたい）、ＳＢ－５０５１２４（２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩）（例えば、ＤａＣｏｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６５（３）：７４４－７５２（２００４）を参照されたい）及びピリミジン誘導体（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｉｅｆｌ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００８／００６５８３において列挙されているものを参照されたい）を含むが、これらに限定されない。さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４及び／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤、例えばＳＢ－４３１５４２等を包含するものとして理解されるべきである（例えば、Ｉｎｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２（１）：６５－７４（２００２）を参照されたい）。本発明の範囲を限定することを意図しないが、ＡＬＫ５阻害剤は、上皮間葉転換／移行（ＭＥＴ）プロセスに影響すると考えられる。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、間葉上皮移行（ＥＭＴ）の駆動機構である。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は、ＭＥＴ（すなわち再プログラム）プロセスを促進し得る。
ＡＬＫ５を阻害する効果を示す本明細書におけるデータを考慮して、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は、ＡＬＫ５の阻害の同様の効果を有すると考えられる。したがって、ＴＧＦβ／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば上流または下流）は、本明細書における各段落で説明されるようなＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、またはその代わりとして使用され得る。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストを含むが、これらに限定されない。さらに、以下で説明されるカテゴリー化は、単に体系化を目的としたものであり、化合物は経路内の１つ以上の点に影響し得ること、したがって化合物は定義されたカテゴリーの２つ以上において機能し得ることが、当業者に知られている。
ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれを標的化するｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含み得る。ＴＧＦβ受容体阻害剤の具体例は、ＳＵ５４１６；２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ－５０５１２４）；レルデリムマブ（ＣＡＴ－１５２）；メテリムマブ（ＣＡＴ－１９２）；ＧＣ－１００８；ＩＤ１１；ＡＰ－１２００９；ＡＰ－１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ－５０５１２４；ＳＢ－４３１５４２；ＳＤ－２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ－３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ－２０３５８０；ＳＤ－０９３；グリベック；３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフラボン（モリン）；アクチビン－Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ；及びＴＧＦβ受容体を標的化するアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３（１８）：５２６２－５２７０（２００７）；Ｋａｍｉｎｓｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ ５２（２）：３２９－３３７（２００５）；及びＣｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １２：４３９３－４４０１（２００７）を参照されたい）。
ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤は、ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれらを標的化するアンチセンス核酸を含み得る。阻害剤の具体例は、ＰＤ１６９３１６；ＳＢ２０３５８０；ＳＢ－４３１５４２；ＬＹ３６４９４７；Ａ７７－０１；及び３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフラボン（モリン）を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ，上記参照；Ｋａｍｉｎｓｋａ，上記参照；Ｓｈｉｍａｎｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６：３３１１－３３２０（２００７）；及びＫａｔａｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＰ１９９２３６０を参照されたい）。
ＳＭＡＤ２／３及びｓｍａｄ４の相互作用の阻害剤は、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３及び／またはｓｍａｄ４に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれらを標的化するアンチセンス核酸を含み得る。ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤の具体例は、Ｔｒｘ－ＳＡＲＡ、Ｔｒｘ－ｘＦｏｘＨ１ｂ及びＴｒｘ－Ｌｅｆ１を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｃｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２４：３８６４－３８７４（２００５）及びＺｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，１７：３８１９－３８３１（２００６）を参照されたい）。
ＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストは、ＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ７に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びそれらを標的化するアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。阻害剤の具体例は、ｓｍａｄ７－ａｓ ＰＴＯ－オリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない．（例えば、共に参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｙａｚｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６５３４４７６、及びＳｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００５１１９２０３を参照されたい）。
２．ＷＮＴ経路アゴニスト
本明細書において使用される場合、「Ｗｎｔシグナル促進剤」、「Ｗｎｔ経路活性化剤」、または「Ｗｎｔ経路アゴニスト」は、Ｗｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔｌ０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、またはＷｎｔ１６の１つ以上のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを指す。Ｗｎｔ経路アゴニストは、以下のポリペプチド：Ｄｋｋポリペプチド、三日月型ポリペプチド（ｃｒｅｓｃｅｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ケルベロスポリペプチド（ｃｅｒｂｅｒｕｓ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、アキシンポリペプチド（ａｘｉｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｆｒｚｂポリペプチド、Ｔ細胞因子ポリペプチド、もしくはドミナントネガティブ無秩序ポリペプチド（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）またはその断片の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
Ｗｎｔ経路アゴニストの限定されない例は、Ｗｎｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、活性化Ｗｎｔ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化Ｗｎｔ受容体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を促進する小有機分子、Ｗｎｔ拮抗剤の発現または活性を阻害する小有機分子、Ｗｎｔ拮抗剤の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｗｎｔ拮抗剤の発現を阻害するリボザイム、Ｗｎｔ拮抗剤の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔ拮抗剤に結合してその活性を阻害する抗体、β－カテニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、β－カテニンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｌｅｆ－１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｌｅｆ－１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドの１つ以上をさらに含む。
Ｗｎｔ経路アゴニストは、ＧＳＫ３阻害剤、例えばドミナントネガティブＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ドミナントネガティブＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βに結合してその発現または活性を阻害する小有機分子、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βに結合してその発現及び／または活性を阻害するＲＮＡｉコンストラクト、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βに結合してその発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βに結合してその発現及び／または活性を阻害する抗体、ＧＳＫ－３、ＧＳＫ３αまたはＧＳＫ３βに結合してその発現を阻害するリボザイム、ならびに、効果がＧＳＫ－３阻害に類似した、β－カテニン標的遺伝子を活性化する任意のＧＳＫ－３非依存性試薬等をさらに含む。
３．ＧＳＫ－３Ｂ阻害剤
ＧＳＫ－３β阻害剤は、本明細書において企図される組成物における使用に好適な、特定の例示的Ｗｎｔ経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含み得るが、これらに限定されない。本明細書において企図されるＧＳＫ－３β阻害剤は、ＧＳＫ－３β発現及び／またはＧＳＫ－３β活性を減少させ得る。本明細書において企図されるＧＳＫ－３β阻害剤の実例は、ＧＳＫ－３βを標的化する抗ＧＳＫ－３β抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ－３β変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
他の例示的ＧＳＫ－３β阻害剤は、ケンパウロン、ｌ－アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ ４１５２８６、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム錯体、ＴＤＺＤ－８ ４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル）－［１，３，４］－オキサゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、ＡＲ－ＡＯ １４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジオン；ＴＷＳｌ１９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３ Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２またはそのミリストイル化形態；２－クロロ－１－（４，５－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン；ＧＦ１０９２０３Ｘ；ＲＯ３１８２２０；ＴＤＺＤ－８；ＴＩＢＰＯ；及びＯＴＤＺＴを含むが、これらに限定されない。
具体的な例示的実施形態において、ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはケンパウロンである。
好ましい実施形態において、ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
４．ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤
本明細書において企図される組成物における使用に好適なＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫもしくはＥＲＫ発現及び／またはＭＥＫもしくはＥＲＫ活性を減少させ得る。本明細書において企図されるＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の実例は、ＭＥＫまたはＥＲＫを標的化する抗ＭＥＫまたは抗ＥＲＫ抗体、ドミナントネガティブＭＥＫまたはＥＲＫ変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
他の例示的ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、ＳＬ３２７、ＡＲＲＹ－１６２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ１８４３５２、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、ＧＳＫｌ １２０２１２、ＡＲＲＹ－４３８１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、ＡＺＤ８３３０、ＲＤＥＡｌ１９、ＡＺＤ６２４４、ＦＲ１８０２０４及びＰＴＫ７８７を含むが、これらに限定されない。
追加の例示的ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、国際特許出願公開第ＷＯ９９／０１４２６号、同第ＷＯ０２／０６２１３号、同第ＷＯ０３／０７７９１４号、同第ＷＯ０５／０５１３０１号及び同第ＷＯ２００７／０４４０８４号において開示される化合物を含む。
ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のさらなる実例は、以下の化合物：６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２，３－ジヒドロキシ－プロポキシ）－アミド；６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－ピラン－２－イルメチル）－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、１－［６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル］－２－ヒドロキシ－エタノン、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－１，１－ジメチル－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－フラン－２－イルメチル）－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（２，４－ジクロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド（以降でＭＥＫ阻害剤１と呼ばれる）；２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド（以降でＭＥＫ阻害剤２と呼ばれる）；及び４－（４－ブロモ－２－フルオロフェニルアミノ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリダジン－３－カルボキサミド、またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。
好ましい実施形態において、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９である。
５．ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、Ｒｈｏキナーゼ（そのうち、３つのアイソフォーム－ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及びＲｈｏＣが存在する）の下流エフェクターに作用するセリン／トレオニンキナーゼである。本明細書において企図される組成物における使用に好適なＲＯＣＫ阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ発現及び／またはＲＯＣＫ活性を減少させ得る。本明細書において企図されるＲＯＣＫ阻害剤の実例は、ＲＯＣＫを標的化する抗ＲＯＣＫ抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
本明細書において企図される例示的なＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２－８６、Ｙ２７６３２ Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ－７７２０７７－Ｂ、Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）尿素、３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール、及び（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、及び、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０４４，２０１号において開示されるＲＯＣＫ阻害剤を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、またはピリンテグリンである。
好ましい実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
本明細書において企図される組成物及び細胞培養培地中の小分子の量は変動し得、使用される特定の分子及び組み合わせ、培地中で培養されている細胞型、ならびに特定用途を含む、特定の培養条件に従って最適化され得る。一実施形態において、小分子は、多能性を誘引する、再プログラムの効率を改善する、細胞の能力を増加もしくは維持する、または基底状態多能性を誘引もしくは維持するのに十分な濃度で組成物中に存在する。
具体的実施形態において、本発明の細胞培養培地における小分子の好ましい濃度及び組み合わせは、表１において運命維持培地（Ｆａｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＭＭ））として示されている。培地の構成成分は、表１に示される最適濃度付近の最適範囲内の量で培地中に存在し得る。運命再プログラム培地（Ｆａｔｅ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＲＭ））は、細胞の再プログラムを含む本明細書において企図される培養基盤において有用であるが、基底状態多能性細胞の樹立及び長期維持に好適ではない。


６．サイトカイン及び成長因子
具体的実施形態において、本発明の細胞培養培地は、サイトカイン及び／または成長因子を実質的に含まない。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等を含むがこれらに限定されない１つ以上の補充物を含有する。
１つの例示的実施形態において、培養培地は、ＥＣＭタンパク質、ラミニン１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶアイソタイプ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、細胞表面接着タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、カドヘリン、塩化物細胞内チャネル１、膜貫通受容体ＰＴＫ７、インスリン様成長因子、またはインヒビンベータＡの１つ以上を含んでもよいが、ＴＧＦβ／アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達経路の誘引物質、及びアクチビンＡを含まない。他の実施形態において、培地は、ＴＧＦβ／アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達経路の誘引物質を含んでもよい。
別の例示的実施形態において、培養培地は、以下のサイトカインまたは成長因子：上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）トランスフェリン、各種インターロイキン（例えばＩＬ－１からＩＬ－１８）、各種コロニー刺激因子（例えば顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、各種インターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、ならびに幹細胞に影響する他のサイトカイン、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の１つ以上を含む。これらのサイトカインは、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．から商業的に入手可能であり、天然または組換えであってもよい。具体的実施形態において、成長因子及びサイトカインは、本明細書において企図される濃度で添加され得る。ある特定の実施形態において、成長因子及びサイトカインは、実験的に、または確立されたサイトカイン技術により導かれるように決定される濃度で添加され得る。
７．培養基材
任意の好適な槽または細胞培養容器が、基本培地及び／または細胞培養補充物中の細胞培養物の担体として使用され得る。担体上には基材コーティングは必要ない。しかしながら、接着促進物質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、ゼラチン等）で培養槽の表面をコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、具体的実施形態において、本明細書において開示される細胞培養培地及び補充物の効果が向上され得る。細胞の培養及び継代に好適な基材は、当該技術分野において知られており、限定されることなく、ビトロネクチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、自然発生的細胞株生成マトリックスの混合物、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに合成または人工表面、例えばポリアミン単一層及びカルボキシ末端単一層を含む。
一実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはビトロネクチンを含む基材を含む。
８．フィーダーを含まない環境
多能性細胞を培養するための現行の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞で事前に調整され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、そのような環境は、臨床及び治療用途の細胞を生成するには不適切となり得る。例えば、そのような外的に汚染された環境において繁殖された細胞は、動物構成成分への曝露が、免疫拒絶、及び未確認の病原体の治療患者への伝染の重大なリスクを呈する可能性があり、潜在的に動物レトロウイルスを再活性化し得るため、一般に、ヒト細胞移植には不適切であるとみなされる。本明細書において企図される、フィーダーを含まない環境等の動物成分を含まない細胞培地を使用した培養系は、臨床グレード細胞株、具体的にはｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ細胞株の製造を容易化する。
具体的実施形態において、フィーダーを含まない環境は、限定されることなく、マウス胎児線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、及び胚幹細胞を含むヒトフィーダー細胞を本質的に含まず、フィーダー細胞により事前に調整されない。フィーダーを含まない細胞培養培地は、多能性細胞の培養、細胞の再プログラム、単一細胞培養、解離、及び多能性細胞の継代、多能性細胞の細胞ソーティング、基底状態多能性細胞の生成、ならびに基底状態多能性の維持における使用に好適である。具体的実施形態において、フィーダーを含まない環境は、多能性を誘引するため、再プログラムの効率を改善するため、及び／または細胞の能力を維持するために使用される。ある特定の実施形態において、フィーダーを含まない環境は、サイトカイン及びｂＦＧＦを含む成長因子を実質的に含まない。
９．解離
本明細書において企図される培養基盤により提供される利点の１つは、培養、継代、及び解離する単一基底状態多能性細胞の向上した生存能力及び生残性である。単一細胞への、例えば単一細胞懸濁液への細胞の解離は、酵素的または機械的手段により達成され得る。単一細胞への細胞の解離を可能にするための当該技術分野において知られている任意の酵素剤が、本発明の方法において使用され得る。一実施形態において、解離剤は、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ－Ｓｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼＩＶ及びディスパーゼから選択される。
また、本明細書において企図される方法による細胞の解離において、ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、またはＡｃｃｕＭａｘ等のキレート剤が、単独で、または酵素剤と組み合わせて使用されてもよい。解離剤は、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ中に溶解されて、単一細胞への解離が促進されてもよい。
解離中または解離後の細胞の生残性を高めるために、生存促進物質、例えばチアゾビビン等のＲＯＣＫ阻害剤が添加されてもよい（例えば、成長因子、細胞死及びアポトーシスに関与する細胞経路の阻害剤、または調整培地）。
細胞培養物及び培地回収における技術は、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８，１９９７；Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７３，１９９１；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３７５，１９９１；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２５１，１９９０；「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．１９８７）；「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ」（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，ａｌ．，１９９３）において概説されている。
幹細胞の分化については、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：１７３，１９９７；及びＰｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：３１，１９９８において考察されている。
１０．濃縮及び枯渇戦略
具体的実施形態において、多能性細胞、例えばｉＰＳＣに関して細胞の集団を濃縮するための戦略が提供される。一実施形態において、濃縮は、クローンｉＰＳＣコロニーを比較的短時間で誘導し、それによりｉＰＳＣ生成の効率を改善するための方法を提供する。濃縮は、多能性のマーカーを発現する細胞を再プログラムする、同定する、及び得るように誘引された細胞の集団をソーティングし、それにより多能性細胞に関して濃縮された細胞の集団を得ることを含み得る。追加的な濃縮方法は、分化のマーカーを発現する細胞または非多能性細胞を枯渇させて、濃縮された多能性細胞の集団を得ることを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、再プログラムが約４～３０日間、約４～２４日間、約６～２２日間、または約８～約１２日間誘引された後に培養される。
一実施形態において、多能性細胞に関して細胞の集団を濃縮することは、集団内の細胞を解離し、細胞を再懸濁させることにより、単一細胞懸濁液を作製することを含む。解離した細胞は、細胞を維持する、または細胞ソーティングを行うための任意の好適な溶液または培地中に再懸濁され得る。具体的実施形態において、単一細胞懸濁液は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｏｃｋ阻害剤を含有し、ＴＦＧβ阻害剤を有さない。ある特定の実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であり、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
具体的実施形態において、細胞の集団は、多能性細胞を積極的に選択するようにソーティングされ、及び／または、集団は、非再プログラムもしくは非多能性細胞が枯渇され、それにより多能性細胞に関して濃縮された細胞の集団が得られる。一実施形態において、単一細胞懸濁液が調製され、次いで、例えば適切な抗体等を使用して多能性のマーカーを染色すること等により、単一細胞がソーティングのために調製される。細胞は、任意の好適な方法により、例えば磁性ビーズまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ソーティングによりソーティングされ得る。
細胞は、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０及びＣＤ５０の発現を含む、多能性の様々なマーカーに基づいてソーティングされ得る。様々な実施形態において、細胞は、多能性の少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのマーカーに基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態において、細胞は、ＳＳＥＡ４の発現に基づいてソーティングされ、ある特定の具体的実施形態において、ＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０と組み合わせてＳＳＥＡ４の発現に基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態において、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１またはＴＲＡ１－６０及びＣＤ３０発現に基づいてソーティングされる。ある特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７を含むがこれらに限定されない分化している細胞の表面マーカーを使用して、最初に非再プログラム細胞に関して枯渇され、次いでＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１及びＣＤ３０等の多能性マーカーに関して濃縮される。
多能性細胞に関して濃縮された集団は、従来のｈＥＳＣ培地または本発明の細胞培養培地等の細胞培養系内に入れられてもよい。細胞培養系は、フィーダー細胞が補充されてもよく、または任意選択でフィーダーを含まない環境であってもよい。いくつかの実施形態において、多能性のマーカーを発現するソーティングされた細胞は、フィーダー細胞が補充された培養系中に入れられ、次いでフィーダーを含まない環境に移される。一実施形態において、細胞培養培地は、フィーダーを含まない環境であり、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｏｃｋ阻害剤を含み、ＴＧＦβ阻害剤を有さない。具体的実施形態において、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であり、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。本発明の他の具体的実施形態において、細胞培養系は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティング組織プレートを含む、フィーダーを含まない環境である。一実施形態において、細胞培養系は、表１に示されるＦＭＭ培地を含む。
濃縮された細胞集団は、本明細書に記載の細胞培養系中で培養して、典型的にはソーティング後約３～約２５日後、ソーティング後約５～９日後、またはソーティング後約５～７日後に出現する基底状態ｉＰＳＣコロニーを得ることができる。ｉＰＳＣコロニーは、クローン拡大のために採取またはソーティングされ得る。本明細書において企図される濃縮戦略を使用して、細胞集団は、少なくとも約３倍、５倍、または１０倍以上、多能性細胞に関して濃縮される。
いくつかの実施形態において、再プログラムを受ける細胞の集団、または多能性細胞の集団は、分化細胞が枯渇される。一実施形態において、多能性細胞、または再プログラムするように誘引された細胞の集団は、分化細胞の細胞表面マーカーを有する細胞が枯渇され得る。分化している細胞の細胞表面マーカーの実例は、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７を含むが、これらに限定されない。具体的実施形態において、ＣＤ１３が分化している細胞の表面マーカーとして使用される。
他の実施形態において、分化している、または分化した細胞の濃縮集団を得るために、細胞の集団は、所望の系統に分化するように誘引され、多能性細胞が枯渇される。いくつかの実施形態において、分化細胞の集団は、特定の系統に分化するように誘引されたＥＳＣまたはｉＰＳＣ等の細胞の集団を含む。細胞の集団は、上述のネガティブ細胞ソーティング技術（「パニング」）、例えば多能性のマーカーに基づく磁性ビーズまたはＦＡＣに従う集団内の細胞のソーティングを使用して、多能性細胞が枯渇されてもよい。いくつかの実施形態において、分化細胞を含む細胞の集団は、多能性マーカーを使用してＦＡＣによりソーティングされ、多能性マーカーを発現する細胞が枯渇した分画が得られる。他の実施形態において、細胞の集団は、分化のマーカー、例えばＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７等の系統特異的マーカーに基づくＦＡＣによりソーティングされ、多能性のマーカーが枯渇した分画が得られる。ＣＤ１３は、本発明の具体的実施形態において、分化している細胞の表面マーカーとして使用される。Ｄ．細胞を再プログラムするための培養基盤
細胞において多能性を誘引するため、または能力を増加させるために（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１，８６１－８７２（２００７）；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７－１９２０（２００７）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，３８１－３８４（２００９）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，４７２－４７６（２００９）；Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓａｈａ，Ｋ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５，５８４－５９５（２００９））、及び再プログラムの効率を改善するために（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２，５２５－５２８（２００８ａ）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３，５６８－５７４（２００８ｂ）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，７９５－７９７（２００８ａ）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１２６９－１２７５（２００８ｂ）；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｂｉｏ ６，ｅ２５３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．００６０２５３（２００８）；Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０６，８９１２－８９１７（２００９）；Ｉｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５，４９１－５０３（２００９）；Ｍａｈｅｒａｌｉ，Ｎ．，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９，１７１８－１７２３（２００９ｂ）；Ｅｓｔｅｂａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６，７１－７９（２０１０）；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，３０１－３１２（２００９））、様々な戦略が追求されている。しかしながら、現行の方法は依然として、産業または臨床グレードの多能性細胞、すなわち均質な多能性を有し、顕著な自発的分化を有さず、規定外的不含フィーダー細胞培養系における単一細胞の酵素的継代を使用して細胞集団を培養及び拡大する能力を有するクローン導入遺伝子不含多能性細胞集団の製造のための、ハイスループットの解決策を実現する余地がある。
本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、ハイグレードの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成に有用である。一実施形態において、非多能性細胞が、多能性となるように再プログラムされ、多能性を維持するように培養される。別の実施形態において、ｉＰＳＣは、基底状態多能性となるように培養される。
様々な実施形態において、培養基盤は、導入遺伝子及び／またはフットプリントを使用しない再プログラム方法を可能にする。本明細書において企図される培養基盤は、ｈｉＰＳＣ生成に必要とされる時間及び労力が大幅に低減された、極めて効率的なエピソーム再プログラムを提供する。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、再プログラムプロセスの早期において分化の合図をブロックすること、ならびに特定経路（ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＴＧＦβ及びＲＯＣＫ）の小分子阻害を通して間葉上皮移行（ＭＥＴ）を促進することの両方によって、ｈｉＰＳＣ生成の効率は、ＦＦ及び単一細胞培養系において、エピソームベクターを使用して大幅に改善される。
一実施形態において、培養基盤は、細胞内の内因性ＯＣＴ４の発現を増加させることを含む、１つ以上の非多能性細胞を多能性状態に再プログラムすることを含む。細胞内の内在性ＯＣＴ４の発現は、１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはＯＣＴ４発現の小分子誘引物質を導入することにより増加され得る。一実施形態において、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドまたはＯＣＴ４ポリペプチドの細胞内への導入は、細胞内のＯＣＴ４の内因性発現を誘引するのに十分である。
一実施形態において、培養基盤は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、及びＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。別の実施形態において、培養基盤は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
一実施形態において、培養基盤は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。別の実施形態において、培養基盤は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＳＲＲＢ、ＥＣＡＴ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを、１つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
本明細書において使用される場合、具体的実施形態において、「導入する」という用語は、細胞をポリヌクレオチド、ポリペプチド、または小分子に接触させることを含むプロセスを指す。導入するステップはまた、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの細胞内へのマイクロインジェクション、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞内に送達するためのリポソームの使用、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞内に導入するためのそれらの細胞透過性部分への誘導を含み得る。
具体的実施形態において、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、細胞を再プログラムするために非多能性細胞内に導入されてもよい。細胞内に導入される各再プログラミング因子の複製数は、本明細書において企図されるような基底状態多能性を達成するのに好適な任意の組み合わせにおいて、同じまたは異なってもよい。
一実施形態において、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される再プログラミング因子の１つ以上の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧのそれぞれの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２のそれぞれの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、ＯＣＴ４の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
一実施形態において、ＯＣＴ４の２つの複製、ＳＯＸ２の２つの複製、及びＮＡＮＯＧの２つの複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入され、ＳＶ４０ＬＴは、任意選択で非多能性細胞内に導入される。
別の実施形態において、ＯＣＴ４の３つの複製、ＳＯＸ２の２つの複製、ＮＡＮＯＧの１つの複製、及びＵＴＦ１の１つの複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。
様々な例示的実施形態において、多能性細胞を再プログラムすることを含む培養基盤は、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドの１～５つの複製と、ＳＯＸ２をコードするポリヌクレオチドの１～３つの複製と、任意選択でＮＡＮＯＧをコードするポリヌクレオチドの１～２つの複製とを導入することを含む。ポリヌクレオチドは、１つ以上のより大きなポリヌクレオチドの任意の組み合わせとして細胞内に導入されてもよい。１つの限定されない例において、ＯＣＴ４の１～４つの複製、ＳＯＸ２の１つまたは２つの複製、及びＮＡＮＯＧの１つの複製をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、非多能性細胞内に導入される。別の限定されない例において、非多能性細胞を多能性状態に再プログラムすることは、ＯＣＴ４の２つの複製をコードする第１のポリヌクレオチドと、ＯＣＴ４の１つの複製及びＳＯＸ２の１つの複製をコードする第２のポリヌクレオチドと、ＯＣＴ４の１つの複製、ＳＯＸ２の１つの複製、及びＮＡＮＯＧの１つの複製をコードする第３のポリヌクレオチドとを、非多能性細胞内に導入することを含む。さらなる限定されない例において、１つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、ＯＣＴ４の２つの複製をコードする第１のポリヌクレオチドと、ＯＣＴ４の１つの複製、ＳＯＸ２の１つの複製、及びＮＡＮＯＧの１つの複製をコードする第２のポリヌクレオチドとを、１つ以上の非多能性細胞内に導入することを含む。さらなる限定されない例において、ＯＣＴ４の２つの複製をコードする第１のポリヌクレオチドと、ＯＣＴ４の１つの複製及びＳＯＸ２の１つの複製をコードする第２のポリヌクレオチドが、１つ以上の非多能性細胞内に導入されて、多能性細胞が生成される。
一実施形態において、本明細書において企図される再プログラミング因子の任意の数及び組み合わせを含むポリヌクレオチドを含む単一ベクターが、非多能性細胞内に導入され、細胞を多能性状態に再プログラムするのに十分である。
一実施形態において、本明細書において企図される再プログラミング因子の任意の数及び組み合わせを含む１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターが、非多能性細胞内に導入され、細胞を多能性状態に再プログラムするのに十分である。
好ましい実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドを細胞内に導入するために、非体細胞を再プログラムするための本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターが使用され、細胞を再プログラムするのに十分である。
最も好ましい実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドを細胞内に導入するために、非体細胞を再プログラムするための本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のエピソームベクターが使用され、細胞を再プログラムするのに十分である。低減された自発的分化及び／または基底状態を示す多能性細胞は、本明細書において企図されるようなエピソームベクターを用いて製造され得、次いで、再プログラミング因子をコードする外因性核酸を含まない、低減された自発的分化及び／または基底状態を示す多能性細胞を得るために、ベクターがなくなるまで培養される。
さらに、ポリヌクレオチドまたはそれを含むベクターが、少なくとも２つの再プログラミング因子、または再プログラミング因子の少なくとも２つの複製をコードするポリヌクレオチドを含む場合、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図されるような再プログラミング因子のそれぞれの間にＩＲＥＳ配列、または自己切断型ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むことが企図される。
いくつかの態様において、非多能性細胞の再プログラムの効率は、再プログラミング因子ポリヌクレオチドが非多能性細胞内に導入された後に、１つ以上の再プログラミング因子ポリヌクレオチドの異所性発現のために選択することにより増加される。そのような選択は、例えば、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの１つ以上を、選択可能マーカーに連結し、再プログラミング因子ポリヌクレオチド及び選択可能マーカーを、非多能性細胞内に導入し、選択可能マーカーを発現するそれらの細胞を選択することにより生じ得るが、選択は、マーカー及びその関連した再プログラミング因子ポリヌクレオチドの発現を有さない細胞に比べて増加した再プログラム効率を有する細胞を特定する。具体的実施形態において、非多能性細胞による導入された再プログラムポリヌクレオチドの発現を特定する任意の選択可能マーカーが使用され得ることが、当業者に認識される。
そのような選択可能マーカーの１つの限定されない例は、ピューロマイシン耐性等の抗生物質耐性遺伝子を含むが、これに限定されない。選択可能マーカーは、以下の再プログラミング因子ポリヌクレオチド：ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１の１つ以上に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせが、多シストロン性ベクターとして導入され、選択可能マーカーは、再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせに連結している。再プログラミング因子ポリヌクレオチドの特定の組み合わせは、本明細書において開示される再プログラミング因子ポリヌクレオチドの２つ以上の複製をコードし得る。
１つの限定されない実施形態において、多シストロン性ベクターは、ピューロマイシン耐性をコードする遺伝子等の選択可能マーカーに連結したＯＣＴ４ポリヌクレオチドの２つ以上の複製をコードする。
いくつかの態様において、１つ以上の再プログラミング因子ポリヌクレオチドをコードする多シストロン性ベクター及び選択可能マーカーは、１つ以上の別個の再プログラミング因子ポリヌクレオチドに加えて非多能性細胞に導入され、選択可能マーカーを発現する細胞のための選択は、選択可能マーカーの発現を有さない細胞よりも高い再プログラム効率を有する細胞の集団を生成する。
この選択プロセスの１つの限定されない例において、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２ポリヌクレオチドが、ピューロマイシン耐性遺伝子に連結したＯＣＴ４の２つ以上の複製をコードする多シストロン性ベクターに加えて非多能性細胞に導入される。選択可能マーカーを発現する非多能性マーカーのその後の選択は、選択可能マーカーを発現しない非多能性細胞に比べてより高い再プログラム効率を有する非多能性細胞を特定する。選択された細胞は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％の再プログラム効率を有し得る。
具体的な好ましい実施形態の再プログラムステップにおいて、小分子がしばしば含まれる。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、様々な分化経路の小分子阻害剤の含有は、再プログラムの効率及び反応速度を上昇させることが企図される。したがって、具体的実施形態において、非多能性細胞を再プログラムすることを含む培養基盤は、１つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入することと、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤と接触させることとを含む。
再プログラムの効率の改善は、（１）再プログラム及び多能性細胞の生成に必要な時間の減少（例えば、小分子を用いない同様もしくは同じプロセスと比較して、多能性細胞を生成するための時間を少なくとも１日短縮することによる）、または代替としてもしくは組み合わせて、（２）特定のプロセスにより生成される多能性細胞の数の増加（例えば、小分子を用いない同様もしくは同じプロセスと比較して、所与の期間で例えば少なくとも１０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％だけ再プログラムされる細胞の数を増加させること）により測定され得る。いくつかの実施形態において、再プログラム効率の２倍から２０倍の改善が観察される。いくつかの実施形態において、再プログラム効率は、２０倍超改善される。いくつかの実施形態において、小分子再プログラム剤を用いない方法の１００倍を超える効率の改善（例えば、生成される多能性細胞の数の１００倍を超える増加）が観察される。
一実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、１つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入し、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＴＧＦβＲ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤と接触させることにより、非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
１つの好ましい実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、１つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入し、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤と接触させることにより、非多能性細胞を再プログラムすることを含む。
より好ましい実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、１つ以上の再プログラミング因子を、本明細書において企図されるような細胞内に導入し、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤と接触させることにより、非多能性細胞を再プログラムすることを含み、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
しかしながら、自発的分化が低減された、もしくは著しくない、フィーダー細胞を含まない酵素的継代培養系における多能性細胞の長期培養を可能とするため、または、基底状態多能性を誘引及び／もしくは維持するためには、ｉＰＳＣは、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及び任意選択でＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む細胞培養培地中でのその後の培養を必要とし、細胞培養培地は、本明細書において企図されるように、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤を含む、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない、または有さない。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤との多能性細胞の長期培養は、培養された導入遺伝子を含まないｉＰＳＣの自発的分化、そして最終的には基底状態多能性の喪失をもたらすことが企図される。
様々な実施形態において、体細胞を安定して再プログラムし、基底状態多能性を含む培地中での低減された自発的分化を達成するように、２ステップ培養基盤が使用される。ある特定の実施形態において、非多能性細胞は、当該技術分野において開示されている任意の好適な方法により再プログラムされ、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、培養物中での低減された自発的分化を達成するように培養され、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない。いくつかの実施形態において、再プログラムされた体細胞は、基底状態多能性細胞を提供するように培養される。
具体的実施形態において、非多能性細胞は、本明細書において開示される方法により再プログラムされ、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、多能性の安定な基底状態まで培養され、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない。
いくつかの実施形態において、非多能性細胞は、１つ以上の再プログラミング因子を導入し、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、自発的分化が低減された細胞を提供するように培養され、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない。
いくつかの実施形態において、非多能性細胞は、１つ以上の再プログラミング因子を導入し、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、多能性の安定な基底状態まで培養され、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない。
好ましい実施形態において、非多能性細胞は、１つ以上の再プログラミング因子を導入し、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより、多能性の安定な基底状態まで培養され、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さず、再プログラム導入遺伝子の残留する著しい発現は存在しない。
一実施形態において、非多能性細胞は、本明細書の別の箇所で開示されるようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子を導入し、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で培養され、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない。
好ましい実施形態において、非多能性細胞は、本明細書の別の箇所で開示されるようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子を導入し、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含む培地中で細胞を培養することにより再プログラムされ、その後、再プログラムされた体細胞は、ＧＳＫ－３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で培養され、Ｒｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンであり、培地は、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を有さない。
様々な実施形態において、本明細書において企図される培養基盤を使用して、自発的分化が低減された多能性細胞、及び／または基底状態人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法が提供される。
具体的実施形態において、１つ以上の非多能性または部分多能性幹細胞を含む出発材料を使用し、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない培養培地中で、１つ以上の多能性または部分多能性幹細胞を培養して、自発的分化が低減された多能性細胞、及び／または基底状態人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が製造される。出発材料は、入手されてもよく、または形成されてもよい。例えば、非多能性または部分多能性幹細胞は、商業的供給者もしくは他の供給元から提供されてもよく、または新たに得られてもよく、非多能性細胞はまた、組織または器官から単離されてもよく、部分多能性細胞はまた、体細胞または成体幹細胞を再プログラムすることにより生成されてもよい。いくつかの実施形態において、多能性胚幹細胞、または体細胞核移植により得られた多能性細胞が、本明細書に記載の培養培地及び基盤を使用して基底状態多能性を達成するように誘引され得る。
具体的実施形態において、１つ以上のＩＰＳＣの集団は、再プログラムされた体細胞または再プログラムされた成体幹細胞を含んでもよい。具体的実施形態において、ＩＰＳＣは、方法を実行することによって、または方法により生成されたＩＰＳＣを得ることによって、任意の既知の方法により生成され得る。
ＩＰＳＣを生成する例示的方法は、非多能性細胞内の内因性ＯＣＴ４の発現を増加させること；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１からなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする、任意選択で１つ以上の複製としての１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞内に導入すること；または、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される１つ以上の再プログラミング因子をコードする、任意選択で１つ以上の複製としての１つ以上のポリヌクレオチドを、１つ以上の非多能性細胞内に導入することを含むが、これらに限定されない。ＩＰＳＣを生成する方法は、１つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＴＧＦβＲ阻害剤、ならびに任意選択でＲＯＣＫ阻害剤と接触させ、１つ以上のｉＰＳＣを生成することをさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む。
好ましい実施形態において、細胞培養培地は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
具体的実施形態において、１つ以上の多能性細胞、例えばＩＰＳＣを細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態、生存能力、正常核型、ゲノム安定性、及び自発的分化の低減された速度を維持または誘引し、これらは、少なくとも５継代、少なくとも１０継代、少なくとも５０継代、少なくとも１００継代、またはそれ以上（任意の介在する継代数を含む）の間維持され得る。
Ｅ．多能性細胞の特性決定
本明細書において企図される培養基盤を使用して製造される多能性細胞は、例えば、基底状態多能性細胞または自発的分化が低減された多能性細胞を含む多能性細胞生成物の選択または検証をさらに含んでもよい。多能性細胞は、再プログラム、ならびに本明細書において企図される組成物及び方法を用いたその後の培養の後、または、多能性細胞が再プログラムされなかった場合、多能性細胞が本明細書において企図される培養方法に移行した後に、選択及び／または検証されてもよい。細胞の多能性は、多能性に関連した、関係のある、及び検出可能な形態的、分子的及び／または生化学的変化に基づいて、特性決定及び／または選択されてもよい。
細胞の能力の評価において、別個に、または組み合わせて監視され得る細胞多能性の特定の特性は、遺伝子発現、メチル化、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ特性、例えば、ｉ）円形の多能性幹細胞形態；ｉｉ）ＳＳＥＡ３／４（ヒト多能性幹細胞）、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０及び／またはＣＤ５０、ならびに上記の組み合わせを含む、多能性幹細胞マーカーの発現；ｉｉｉ）多能性幹細胞の奇形腫形成；ｉｖ）胚様体の形成及びｉｎ ｖｉｔｒｏ三胚葉分化；ならびにｖ）不活性Ｘ染色体再活性化を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、上記特性のいずれかのサブセットが、細胞能力の監視に使用される。一実施形態において、多能性細胞は、円形のコロニー形態を有すること、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１、及びＯＣＴ４の発現、ならびに胚様体及び奇形腫を形成する能力により特徴付けられる。
別の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において低減された自発的分化を有する多能性細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤の存在下で培養された多能性細胞と比較して、以下の分化マーカー遺伝子の１つ以上の発現における少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少を含む遺伝子発現シグニチャーにより特定され得る：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）及びＺＩＣ１。
一実施形態において、低減された自発的分化を有する多能性細胞は、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、及びＴＵＪ１を含むがこれらに限定されない、１つ以上の分化マーカー遺伝子の発現の減少により特徴付けられる。具体的実施形態において、低減された自発的分化を有する多能性細胞は、ＴＧＦβＲ阻害剤の存在下で培養された多能性細胞と比較して、１つ以上の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＴＵＪ１）の発現における少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少を含む遺伝子発現シグニチャーにより特定され得る。別の実施形態において、低減された自発的分化を有する多能性細胞は、１つ以上の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｔ遺伝子、ＣＸＣＲ４、ＮＯＤＡＬ、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＴＵＪ１）の発現における少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少を含む遺伝子発現シグニチャーにより特定され得る。
具体的実施形態において、基底状態多能性細胞は、大幅に抑制されたＸｉｓｔ発現、ならびに分化細胞の初期マーカー、例えばＦｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、及びＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現を有し、一方従来の培養された多能性細胞は、Ｘｉｓｔ発現の中程度の抑制のみ、及び初期分化マーカーの顕著な発現を示す。
具体的実施形態において、基底状態多能性細胞は、複数の細胞継代の間、例えば少なくとも１、３、５、７、１０、１５、２０またはそれ以上の継代の間、基底状態多能性の特性を維持する。
Ｆ．ポリヌクレオチド
様々な例示的実施形態において、本発明は、部分的に、ポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び本明細書において企図される融合ポリペプチド、ならびにそれらを含む組成物を企図する。様々な他の例示的実施形態において、本発明は、部分的に、少なくとも１つの再プログラミング因子の１つ以上の複製をコードするポリヌクレオチドで非多能性細胞を再プログラムすることを企図する。本明細書に記載の培養基盤との使用のための再プログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ、ＳＡＬＬ４、ＧＬＩＳ、ＥＳＲＲＢ、ＤＰＰＡ２、ＥＣＡＴ１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、Ｌ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＬＲＨ１及びＵＴＦ１を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような再プログラミング因子の配列を含む。
本明細書において使用される場合、「遺伝子」は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エクソン等を含むポリヌクレオチド配列を指してもよい。具体的実施形態において、「遺伝子」という用語は、ポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするゲノム配列に同一であるかとは無関係に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。
「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、自然発生状態でそれに隣接する配列、例えば、通常断片の隣にある配列から除去されたＤＮＡ断片から精製されたポリヌクレオチドを指す。具体的実施形態において、「単離されたポリヌクレオチド」は、自然には存在せず、人間の手により作製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または他のポリヌクレオチドを指す。
具体的実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ベクター等のより大きなポリヌクレオチド内で、任意の好適な順序で配列していてもよい。好ましい実施形態において、ベクターは、エピソームベクターである。
本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さとは無関係に、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の別の箇所で開示されているような、または当該技術分野において知られているような発現制御配列、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終止シグナル、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグと組み合わされてもよく、したがってそれらの全体的長さは大きく変動し得る。ゆえに、ほぼいかなる長さのポリヌクレオチド断片も使用することができ、全長は、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用の容易性により制限されることが企図される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られ利用可能である様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、及び／または発現され得る。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクター内に挿入され得る。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、及び転位因子である。追加的な例示的ベクターは、限定されることなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１誘導人工染色体（ＰＡＣ）、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、及び動物ウイルスを含む。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例は、限定されることなく、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルス、及びパポバウイルス（例えばＳＶ４０）を含む。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；レンチウイルス媒介遺伝子移入及び哺乳動物細胞における発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。具体的実施形態において、本明細書において開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のために、そのような発現ベクター内にライゲーションされ得る。
具体的実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書において使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡへの統合なしで、また、分裂する宿主細胞からの段階的な喪失なしで複製することができるベクターを指し、これはまた、前記ベクターが染色体外で、またはエピソームとして複製することを意味する。ベクターは、リンパ球指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、または酵母からのＤＮＡ複製の源または「ｏｒｉ」、具体的にはＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ球指向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製源をコードする配列を有するように操作される。具体的態様において、リンパ球指向性ヘルペスウイルスは、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であってもよい。エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）はまた、ガンマヘルペスウイルスの例である。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製転写活性化タンパク質を含む。
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域、すなわち複製源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行する５’及び３’非翻訳領域である。そのような要素は、その長さ及び特異性において様々となり得る。使用されるベクター系及び宿主に依存して、普遍的プロモーター及び誘引性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写及び翻訳要素が使用され得る。
「作用可能に連結した」という用語は、説明される構成成分が、その意図される様式で機能することができる関係にある並列位置を指す。一実施形態において、この用語は、発現制御配列（例えばプロモーター及び／またはエンハンサー）と、第２のポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を方向付ける。
本発明の具体的実施形態における使用のための例示的な普遍的発現制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期もしくは後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクチニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／トリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ならびにβ－アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
誘引性プロモーター／系の実例は、ステロイド誘引性プロモーター、例えばグルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンでの処理により誘引可能）、メタロチオニンプロモーター（様々な重金属での処理により誘引可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンにより誘引可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート誘引性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系等を含むが、これらに限定されない。
条件付き発現もまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用して達成され得る。本発明のある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的には２つの）部位を含む。本明細書において使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つ以上の組換え部位（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上）が関与する組換え反応に関与する、切断または統合可能なタンパク質、酵素、共同因子または関連タンパク質を含み、これらは、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照されたい）、または突然変異、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列もしくはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、及びその変異体であってもよい。本発明の具体的実施形態における使用に好適なリコンビナーゼの実例は、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡを含むが、これらに限定されない。
具体的実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。具体的実施形態において、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列、または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により隔てられてもよい。本明細書において使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧ等の開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それにより遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照されたい。当業者により一般的に使用されるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載のものを含む。当該技術分野において知られている「ＩＲＥＳ」のさらなる例は、ピコルナウイルスから得ることができるＩＲＥＳを含むが、これに限定されない（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
Ｈ．ポリペプチド
本発明は、部分的に、ポリペプチド、融合ポリペプチド、及びポリペプチドを発現するベクターを含む組成物を企図する。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、異なるように指定されない限り、交換可能に、及び従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他の変異体を含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換え及び／または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに、自然発生的及び非自然発生的の両方の当該技術分野において知られている他の修飾を含んでもよい。
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」等は、本明細書において使用される場合、細胞環境からの、及び細胞の他の構成成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ単離及び／または精製を指し、すなわち、それは、ｉｎ ｖｉｖｏ物質と大きく関連してない。
２つ以上のポリペプチドの発現が望ましい一実施形態において、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の別の箇所で議論されるようにＩＲＥＳ配列により隔てられてもよい。別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間にポリペプチド切断シグナルを含む融合タンパク質として発現され得る。さらに、ポリペプチド部位は、任意のリンカーペプチド配列内に挿入され得る。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、及び自己切断型ウイルスオリゴペプチド等のポリペプチド切断認識部位を含む（ｄｅＦｅｌｉｐｅ
ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照されたい）。
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断型ペプチドは、当業者に知られている（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照されたい）。例示的プロテアーゼ切断部位は、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球形ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、Ｘａ因子及びエンテロキナーゼの切断部位を含むが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、一実施形態においてＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号：２９）、例えばＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：３０）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号：３１）（Ｘは、任意のアミノ酸を表す）が好ましい（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧとの間、またはＱとＳとの間で生じる）。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。具体的実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ
ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、ならびに脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
好ましい実施形態において、１つ以上の再プログラミング因子ポリペプチドをコードするベクターは、再プログラミング因子のそれぞれの間に、同じまたは異なるプロテアーゼ切断部位の１つ以上を含む。
本明細書において引用される全ての出版物、特許出願及び発行された特許は、個々の出版物、特許出願または発行された特許がそれぞれ参照により援用されることが具体的及び個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。
上記の発明は、明確な理解のために図及び例を用いてある程度詳細に説明されているが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、ある特定の変更及び修正が本発明になされてもよいことが容易に明らかとなる。以下の例は、例示のみを目的として提供されるものであり、限定を目的としない。当業者には、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る、様々な重要ではないパラメータが容易に認識される。
本明細書において開示される実施例は、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用したｈｉＰＳＣの迅速な並列生成、選択及び拡大のための基盤を特定した。基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化されたエピソーム再プログラムを補助した。得られたｈｉＰＳＣは、導入遺伝子を含まず、容易に培養され、単一細胞として拡大されながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持した。実施例において企図された培地組成物中で生成または維持されたｈｉＰＳＣは、多能性の基底状態に関連した特性を示し、均一な産業または臨床グレードｈｉＰＳＣの製造のための、堅牢なハイスループットシステムを表す。
実施例１
ｉＰＳＣの長期維持及び拡大のための培地基盤の特定
概要
ＳＭＣ４補充培養物中のレンチウイルス誘導ｈｉＰＳＣ株の大多数は、未分化細胞の均質集団を維持するが、株のサブセットにおける導入遺伝子再プログラミング因子のサイレンシングは、長期培養において様々な程度の自発的分化を示した（図１Ａ及びＢ）。したがって、残留導入遺伝子発現とは無関係の継続的ＦＦ培養及び単一細胞の酵素的継代中の多能性の維持のための条件を特定するために、様々な細胞培養構成成分を評価した。再プログラム及び維持プロセスの異なる段階における固有の経路を標的化する複数段階培養系が、ｈｉＰＳＣ生成の効率的及び堅牢な手法として特定された。
結果
長期維持の間のＴＧＦβ経路の阻害は、サイレンシングされた導入遺伝子発現を有するｈｉＰＳＣ株の自発的分化における重要な因子として特定された（図１Ｃ）。自発的発現を生じることが判明したｉＰＳＣ細胞株の１つを、新たな培地配合物、運命維持培地（Ｆａｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＭＭ））中での培養に移行した（表１）。自発的分化が排除され、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性細胞の均質集団が２～３継代以内に樹立された（図１Ａ）。
従来の培養物（ＭＥＦフィーダー細胞に対するｈＥＳＣ培地）、ＦＦ培養におけるＳＭＣ４補充培地、またはＦＦ培養における新たに配合したＦＭＭにおける、ＯＣＴ４／ＫＬＦ４／ＳＯＸ２（ＯＫＳ）レンチウイルス再プログラム（図１Ｄ）もまた比較した。レンチウイルス再プログラムの誘引から１７日後、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性細胞をＦＡＣにより選択し、比較のためにＳＭＣ４またはＦＭＭ中に再播種した（図１Ｄ）。ＳＭＣ４は、再プログラムの反応速度を改善し、誘引から１７日後に、ＦＭＭによる再プログラムよりも大幅に多くのＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性細胞をもたらした（ＦＭＭの０．７６％及び従来の培養の０．１０％に対して２．７２％；図１Ｄ）。
最初のソーティング後、細胞をそれぞれの条件下で１０日間維持し、続いて第２のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性フローサイトメトリー選択を行った（図１Ｄ）。培養物をさらに９日間維持し（感染から合計３６日後）、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ同時発現に基づいて未分化コロニーに関してスコア化した（図１Ｄ及び１Ｅ）。ＳＭＣ４における最初の再プログラムに続くＦＭＭへの移行の組み合わせは、最終的により多くのＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ陽性コロニー、及びＳＭＣ４における継続的維持に対して大幅に低減された数のＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ陰性コロニーをもたらした（図１Ｄ及び１Ｅ）。ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ陽性コロニーは、ＦＭＭにおいてのみ維持された培養物中において検出されたが、コロニーの数及びサイズは、段階特異的培地手法よりも低いようであった。
これらの結果は、再プログラム及び維持プロセスの異なる段階における固有の経路を標的化する新規の複数段階培養系が、高品質ｈｉＰＳＣの効率的製造をもたらしたことを示している。
実施例２
単一細胞継代及びＦＦ形式における導入遺伝子を含まないｈｉＰＳＣの製造のための基盤概要
エピソームベクター系を使用した非組み込み型再プログラム方法の効率は、特にＦＦ環境において極めて低い（＜０．００１％）（Ｎａｒｓｉｎｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＭＣ４及び再プログラムを改善することが示されている培地添加剤を含有する運命再プログラム培地（Ｆａｔｅ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＲＭ））、ならびにＦＭＭの２つの培地を含む複数段階培養系において、エピソーム誘引を試験した（図２Ａ及び表１）。
結果
ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＫＬＦ４／ＬＩＮ２８／ＭＹＣ／ＳＶ４０ＬＴ（ＯＳＮＫＬＭＴ）の遺伝子の組み合わせからなるエピソーム発現系を使用して、様々な線維芽細胞をトランスフェクトした。エピソーム発現の誘引から２４時間後、再プログラム培養物をＥＲＭに移行し、再プログラム反応速度を向上させる。最初の週以内に初期コロニー形成が観察され、１０日目までに、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性細胞の大規模な集団が検出された（＞１％）（図８Ａ及び８Ｂ）。１４日目に、ＦＲＭにより補助された再プログラム培養物を、ＦＲＭまたはＦＭＭ培地中に分割した。２１日目に、ＦＡＣＳを使用して、培養物中のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０陽性細胞を特定した（図８Ｃ）。ＦＲＭ維持培養物は、分化及び未分化細胞の両方を含有し、一方ＦＭＭ培養物は、ほぼ未分化細胞を含有していた（図８Ｄ）。
この手法のスループット及び堅牢性を、異なる年齢、性別及び民族のドナーからの最少量の臍帯血から拡大された線維芽細胞及びＣＤ３４＋細胞で試験した（図９Ａ及び９Ｂ）。エピソーム遺伝子組み合わせセットＯＳＮＫＬＭＴにより、図２Ａにおいて概説されるように体細胞再プログラムを誘引し、１６日目と２１日目との間の個々のｈｉＰＳＣに対して、９６ウェルプレートフローサイトメトリーソーティングを行った（図２Ｂ）。試験された株の大部分に対して、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１／ＣＤ３０陽性細胞の大規模集団が観察された。従来の培地及びフィーダー細胞を使用した並行再プログラム実験と比較して、ＦＲＭ及びＦＭＭ培地系は、ｈｉＰＳＣクローンの数の大幅な増加をもたらした（ＦＴＣ００７線維芽細胞株では、従来の培養の０．０２％に対してＦＲＭ／ＦＭＭにおいて８．５５％（図２Ａ及び２Ｂ））。平均して９６ウェルプレート当たり２２のクローンｈｉＰＳＣが、ＳＭＣ４培地を用いたレンチウイルス再プログラムに不応性であることが以前に観察されている線維芽細胞ＦＴＣ００８を含む各体細胞株に対して観察された（図２Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ）。コロニーは、その後、細胞内及び表面マーカー発現の分析、ならびにＮＡＮＯＧに対する直接ｑＲＴＰＣＲにより、真正ｈｉＰＳＣクローンとして確認された（図２Ｄ、２Ｅ及び１０Ｃ）。９６ウェルソーティング及び選択プロセスを使用した再プログラムの効率もまた増加した（図２Ｅ）。規定の表面コーティングビトロネクチンでも同様の再プログラム効率が観察された（図１０Ｄ）。
これらのデータは、基盤が、エピソーム再プログラムに適用された場合に堅牢で再現性があること、ならびに、最小限の労力で、及びｉＰＳＣ最終生成物の品質を低下させることなく、ハイスループットの様式で複数の再プログラム実験が並行して実行されることを可能にすることを示していた。
実施例３
ＦＭＭ中での導入遺伝子を含まないｈｉＰＳＣ株の長期継代及び拡大
概要
ＦＦ培養において単一細胞として拡大された実施例２からのｈｉＰＳＣクローンを使用して、ＦＲＭ及びＦＭＭの複数段階培地基盤を使用したｈｉＰＳＣの長期継代及び拡大を試験した（図３Ａ及び３Ｂ）。
結果
実施例２に従い再プログラムされたｈｉＰＳＣ株は、４～７継代までにエピソームＤＮＡを喪失し、したがって、導入遺伝子に基づく再プログラミング因子とは独立して多能性であった（図３Ｃ）。ｈｉＰＳＣ株は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－８１、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧに対して陽性である未分化細胞の均質集団を維持した。さらに、これらの株は、多能性培養において一般的に利用される任意の洗浄戦略なしに、多能性特性（図３Ｆ）を維持した（図３Ｄ及び３Ｅ）。慣例的な単一細胞継代培養中に、マトリゲルが規定表面コーティングビトロネクチンで置き換えられた場合、均一ｈｉＰＳＣ培養物の同様の拡大が観察された（図Ｓ１０Ｅ～１０Ｇ）。
ＦＦ環境において単一細胞として培養されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ株では、ゲノム異常がしばしば検出される（Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔａａｐｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。全ての分析されたｈｉＰＳＣ株の核型分析は、ＦＭＭ培養におけるゲノム安定性を示した（図４Ａ）。さらに、ＦＭＭにおいて長期間（２５～３０継代）維持された単一細胞及びＦＦ培養ｈｉＰＳＣクローンは、培養物洗浄または選択を必要とせずに、その未分化プロファイル及びゲノム安定性を維持し続けた（図４Ｂ）。
ＦＭＭにおいて維持されたエピソーム誘導ｈｉＰＳＣクローンはまた、３つ全ての体細胞系統、胚様体を介したｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、及び奇形腫形成によるｉｎ ｖｉｖｏ分化を容易に生じた（図４Ｃ～Ｅ）。
これらのデータは、ＦＲＭ及びＦＭＭ複数段階培地基盤によって、導入遺伝子を含まないｈｉＰＳＣクローンがＦＦ及び単一細胞の酵素的継代形式において容易に生成及び拡大されるのが可能となり、一方多能性及びゲノム安定性細胞の均質集団が維持されることを示していた。
実施例４
複数段階培地基盤は、最小限の遺伝子でエピソーム再プログラムを可能にする
概要
ＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＬＩＮ２８等のがん遺伝子に対する依存性、または再プログラムプロセスにおいてＰ５３をノックダウンする必要性が低減された効率的なフットプリントを含まない発現系は、多能性幹細胞治療にとって極めて有価値となるだろう（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。複数段階培地基盤は、ＯＳＮＫＬＭＴ再プログラミング因子を使用した導入遺伝子を含まないｈｉＰＳＣ細胞の生成及び拡大のための極めて効率的及び堅牢な基盤を示したため、基盤の堅牢性を、再プログラミング因子の必要性に対して測定した。
結果
遺伝子発現の組み合わせ及び用量を変更するために、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２（ＯＮＳ）、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２（ＯＳ）またはＯＣＴ４／ＯＣＴ４（２ｘＯ）を含む最小限の遺伝子セットを含有するいくつかのエピソーム発現カセットを構築した（図５Ａ）。線維芽細胞株をＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＳＶ４０ＬＴの組み合わせでトランスフェクトし、ＦＲＭ／ＦＭＭ基盤を使用して培養した。ＳＶ４０ＬＴ単独では、再プログラムの１３日目にいかなる真のＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性細胞も生成されなかったが、トランスフェクト後の細胞生残性が改善された（図５Ｂ及び１１Ａ）。様々な再プログラミング因子の組み合わせは、再プログラムプロセスの初期において、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性集団の発生により示されるように効率的な再プログラムをもたらした（１３日目までに、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＳＶ４０ＬＴの場合＞０．５％、ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２／ＳＶ４０ＬＴの場合＞３．５％；図５Ｂ）。さらなる日数再プログラムされた培養物は、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ１－８１陽性集団を大幅に増加させた（１６日目までに、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＳＶ４０ＬＴの場合＞４．０％；図１１Ｂ）。驚くべきことに、観察された再プログラムされた細胞のパーセンテージは、がん遺伝子ＫＬＦ４及びＭＹＣを含有するレンチウイルス及びエピソーム誘引系に匹敵した（図２Ｂ、５Ｂ及び１１Ｂ）。
いくつかの再プログラミング因子の組み合わせを繰り越し、ＦＭＭ培地に移行してから、個々のｈｉＰＳＣクローンのフローサイトメトリーソーティング及び選択を行った。ＯＳＮＫＬＭＴエピソーム再プログラムと同様に、クローンｈｉＰＳＣ株が、最小限の遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＳＶ４０ＬＴ（２ｘＯ＋ＯＳ＋Ｔ）を含有する組み合わせ、ならびに他の組み合わせ（図５Ｃ）から容易に誘導された。５～７継代までに導入遺伝子及びエピソームベクターマーカーを喪失したｈｉＰＳＣクローンを、さらなる分析に繰り越した（図５Ｄ）。選択されたクローンをＦＦ環境において単一細胞として継続的に継代したが、ゲノム安定性未分化細胞の均質集団を維持し、３つの体細胞系統に効率的に分化する能力を示した（図５Ｅ～Ｊ）。
総合的に、これらのデータは、ＦＲＭ／ＦＭＭ、フローサイトメトリーに基づく再プログラム基盤における最小限の再プログラミング遺伝子の一時的発現により、ｈｉＰＳＣが容易に生成されることを示していた。
実施例５
ＦＭＭ基盤は基底状態多能性を補助する
概要
ＦＭＭ基盤をさらに評価するために、現行の方法により再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性を、本明細書において企図されるＦＭＭ基盤を使用して再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性と比較した。小分子による培養物と従来通り維持されたｈｉＰＳＣ培養物（Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ；Ｓａｈａ ａｎｄ Ｊａｅｎｉｓｃｈ，２００９）との間の遺伝子発現の差を評価した。
結果
１組の実験において、小分子媒介培養と従来の培養との間で遺伝子発現パターンを評価した。小分子培養においてレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣクローンＦＴｉ１１１を生成及び維持したが、多能性であることが示された。ｉ）フィーダー細胞を有する従来の培地、及びｉｉ）フィーダー細胞を有する、またはＦＦ表面上の小分子阻害剤含有培地（図１２Ａ及び１２Ｂ）を含む様々な培養環境内に、クローンを直接解凍した。従来の培養におけるｈｉＰＳＣコロニーは、ＲＯＣＫ阻害剤であるチアゾビビンの存在下でのみ回収され、その後、回収された細胞を塊での培養に変換した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。培養条件の各セットは、固有のコロニー形態（図１２Ｄ）、及び多能性マーカーの遺伝子発現の異なるパターン（図１２Ｅ）を示した。フィーダー細胞上の従来通り支持された培養は、小分子において維持された対応する培養物よりも、従来の培養において維持されたｈＥＳＣ対照Ｈ１及びＨＵＥＳ９によく類似していた（図１２Ｅ）。これらのデータは、小分子媒介培養と従来の培養との間に異なる遺伝子発現パターンが存在することを示していた。
また、レンチウイルス誘引及び従来のＥＳＣ／フィーダー培養を使用したｈｉＰＳＣ誘導株と、エピソーム誘導系統との間、さらに、ＦＲＭ／ＦＭＭ基盤において維持された再プログラミング因子の異なる組み合わせで誘導されたエピソーム株との間で、遺伝子発現の差を評価した。高含量ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して、多能性及び分化に関連した遺伝子発現を定量した。調査された多能性遺伝子の大部分は、ＦＭＭ培養物またはフィーダー細胞を含有する従来の培養物において維持されたｈｉＰＳＣの間で、同等の発現パターンを示した（図６Ａ）。しかしながら、分化に関連した遺伝子の評価において、細胞株の間の差が観察された（図６Ｂ）。ＦＭＭ維持ｈｉＰＳＣは、従来の培地中及びフィーダー細胞上で維持されたｈｉＰＳＣ及びＨ１ ｈＥＳＣの両方と比較して、３つの体細胞系統に関連したほとんどの遺伝子のより低い発現を示した。エピソーム遺伝子セットＯＳＮＫＬＭＴにより誘引された株のサブセットは、外胚葉系統、ＯＴＸ２及びＴＵＪ１の発現を示すようであったが、この発現は、Ｌｉｎ２８、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣの使用なしでエピソーム誘導されたｈｉＰＳＣにおいては無視できた（図６Ｂ）。驚くべきことに、試験された全ての分化遺伝子の発現は、エピソーム最小限遺伝子セットから誘導されＦＭＭにおいて維持された全てのｈｉＰＳＣにおいては完全に抑制された（図６Ｂ）。総合して、これらのデータは、ＦＲＭ／ＦＭＭ基盤が僅かなエピソームに基づく再プログラミング因子で堅牢に細胞を再プログラムすることができること、及び、ｈｉＰＳＣを安定な基底多能性状態に維持することができることを示していた。
以下の方法から誘導されたｈｉＰＳＣに対して、全体的な遺伝子発現パターンを決定した：ｉ）ＦＭＭにおいて維持されるエピソーム誘引、ｉｉ）ＦＭＭにおいて維持されるが３継代の間従来の培地に切り替えられるエピソーム誘引、ｉｉｉ）ＳＭＣ４において維持されるレンチウイルス誘引；及びｉｖ）従来の培養において維持されるレンチウイルス誘引（図１３Ａ、１３Ｂ）。遺伝子発現プロファイルを評価する前に、全ての系統は多能性であり、ゲノム安定性であり、及び３つの体細胞系統全てに分化し得ることが決定された。小分子培養と従来の培養との間の差別的に発現した遺伝子のクラスタ分析では、ｈｉＰＳＣ株が、現在の培養条件に基づいてグループ化され、元の誘導法及び培養によってグループ化されないことが明らかとなった（図１３Ｂ）。２．５倍の発現差を示す３００の遺伝子の遺伝子オントロジー分類は、分化及び発生を従来の培養群において極めて濃縮された主要カテゴリーとして特定し、一方小分子培養群において上方調節された遺伝子は、ほとんど細胞増殖及び性分化の調節に関連していた（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。
遺伝子発現分析を繰り返し、ＦＭＭ、従来型、または移行培養系を直接比較した（ＦＭＭ、Ｃｏｎｖ、ＦＭＭ→Ｃｏｎｖ、Ｃｏｎｖ→ＦＭＭ；図１３Ａ）。クラスタ分析は、生成の方法または以前の培養系とは無関係に、現在の培養系に基づいて２つの群を生成した（図７Ａ）。例えば、ｈｉＰＳＣクローンＦＴＣ０１６－ｃ２８が生成され、従来の培養への移行の前に、ＦＲＭ／ＦＭＭ基盤の下で維持された。このクローンは、従来の培養においてのみ維持された培養物とグループ化され、ＦＭＭ中に維持されたその親株とグループ化されず；従来の培養において生成され、ＦＭＭへの移行まで従来セット内でグループ化され、その後ＦＭＭクラスタ内にグループ化されたＯＫＳレンチウイルス誘引ｈｉＰＳＣクローン等の株でも同等の結果が見られた（図７Ａ）。遺伝子オントロジーは、分化及び発生に関連した遺伝子で濃縮されるべき従来の培養物をカテゴリー化した（すなわち、ｐ値＝２．２Ｅ－１０、パターン指定プロセス；図７Ｂ及び１３Ｅ）。総合的に、これらのデータは、分化傾向に関連した遺伝子が、ＦＭＭ培養において大幅に低減され、ｈｉＰＳＣは、自発的分化能を低減するためにＦＭＭ培養基盤に適合され得ることを示していた。
ヒト多能性幹細胞の基底状態及び準安定状態を表す遺伝子リストをコンパイルした（Ｄｅ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ；Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，２０１２；Ｖａｌａｍｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（図７Ｃ）。これらの遺伝子リストに基づく遺伝子クラスタ分析を、ＦＭＭまたは従来の培養におけるｈｉＰＳＣ株に対して行った（図７Ｄ）。全体的遺伝子発現比較と同様に、集中遺伝子クラスタ分析は、相互交換可能と思われるプロファイルを有するその現在の培養条件に基づく細胞株の分離を示した。例えば、ｈｉＰＳＣクローンＦＴＣ０１６－ｃ２８は、ＦＭＭから、Ｈ１ ｈＥＳＣとグループ化され、ＦＭＭにおいて維持されたその親ｈｉＰＳＣ株とはグループ化されていない従来の培養に移行した（図７Ｄ）。同様に、従来の培養において維持された線維芽細胞株から誘導されたレンチウイルスｈｉＰＳＣクローンは、従来の培養におけるＨＵＥＳ９ ｈＥＳＣ及び他のｈｉＰＳＣクローンとグループ化されたが、ＦＭＭに切り替えられると、それは、臍帯血から誘導されたエピソームｈｉＰＳＣ及び他のＦＭＭ培養株とグループ化された（図７Ｄ）。２つのクラスタ内の基底及び準安定状態を表す遺伝子の分布は、小分子（ＳＭＣ４／ＦＭＭ）対従来の培養に関して、各プローブセットに対する平均強度をプロットすることにより決定された（図７Ｅ）。驚くべきことに、基底状態に関連した遺伝子のほとんどは、小分子培養クラスタにおける増加した発現を示し、準安定状態に関連した遺伝子の増加した発現は、従来の培養クラスタにおいて検出された（図７Ｅ）。
従来の培養において培養及び維持されたｈｉＰＳＣのＸ不活性化状態を、小分子培養に適合され、１０継代の間維持されたその対応物と比較した（図７Ｆ）。小分子培養において維持されたｈｉＰＳＣは、従来の培養と比較して、Ｘ染色体遺伝子発現において増加を示し、これは、サイレンシングされたＸ染色体の再活性化を示唆していた（図７Ｆ）。認め得る例外は、小分子培養への切り替えにおいて下方調節されたＸ不活性特異的転写（ＸＩＳＴ）であった（図７Ｆ）。Ｘ活性化のさらなる証拠は、従来の培地に適合されたその対応する培養に対する、ＦＭＭ中で培養されたｈｉＰＳＣのＨ３Ｋ２７ｍｅ３の分染により提供された（図７Ｇ）。ＦＭＭ中のｈｉＰＳＣの大部分は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色を有さず、一方、従来の培養におけるｈｉＰＳＣの大部分は、核サイズの低減と共にＨ３Ｋ２７ｍｅ３核内フォーカスを示し、これはＸ不活性化を示唆していた（従来の培地における＞９０％のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色と比較して、ＦＭＭにおける＜１０％のＨ３Ｋ２７ｍｅ３染色；図７Ｇ）。
実施例６
小分子培養におけるｈｉＰＳＣ維持
誘導ｈｉＰＳＣ（ＯＣＴ４／ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２、ＯＣＴ４／ＥＣＡＴ１／ＵＴＦ１、またはＯＣＴ４／ＥＣＡＴ１／ＵＴＦ１／ＥＳＲＲＢ／ＮＡＮＯＧを含む再プログラミング因子の様々な組み合わせで誘引された線維芽細胞または血球）を、培養物のコンフルエンスが７５～９０％に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。単一細胞解離のために、ｈｉＰＳＣをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３７℃で３～５分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、２２５ｇで４分間遠心分離し、運命維持培地（Ｆａｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＭＭ））中に再懸濁させ、ｈＥＳＣ定性マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティング表面上に播種した。マトリゲルは、製造者の指示に従って調製及び表面のコーティングに使用した。継代は典型的に１：３～１：６であり、組織培養プレートは事前にマトリゲルで３７℃で１～４時間コーティングし、２日から３日毎にＦＭＭを供給した。細胞培養物を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内に維持した。従来の培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２０％ノックアウト血清代替物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｇｌｕｔａｇｒｏ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１００μＭのβ－メルカプトエタノールからなる。ＦＭＭは、５μＭのチアゾビビン（施設内で合成）、０．４μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０ｎｇ／ｍＬのｈＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が補充された従来の培地からなる。ＦＭＭにおいて拡大された培養物のフロー分析及び形態を、図１８Ａ～Ｄ及び１９Ａ～Ｂに示す。ＦＭＭにおいて拡大された細胞はまた、図２０Ａ～Ｄに示されるように、複数の継代にわたって正常核型を示した。
実施例７
小分子培養における最小限の遺伝子を用いた再プログラム
再プログラムを開始させるために、伝統的な組み込みレンチウイルスであるＮＩＬを使用したレンチウイルス形質導入により、またはエピソームベクターによるエレクトロポレーションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。図１４Ａ～Ｂに示されるように、レンチウイルス発現系は、ＥＦ１αプロモーター、特異的遺伝子の組み合わせ（表３）、及び組み込まれた導入遺伝子のＣＲＥ媒介切断を可能とする３’末端におけるＬＯＸＰ部位を含む、いくつかの特徴からなっていた。ＣＲＥ切断後、誘導されたｈｉＰＳＣゲノムはもはや導入遺伝子を含有せず、本質的にフットプリントを含んでいなかった。図１４Ｃ～Ｆに示されるように、エピソームコンストラクトは、ＥＦ１αプロモーター及び固有の再プログラミング因子を含む、固有の特徴を有していた。トランスフェクト後、エピソームコンストラクトは核内に位置し、ゲノム内に組み込まれないトランス媒介様式で作用した。
レンチウイルス感染のために、出発ヒト線維芽細胞を、製造者の指示に従い、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた６ウェルプレートのウェル当たり７×１０４～１×１０５細胞で播種した。２９３Ｔ細胞からの新鮮なレンチウイルス上清を、出発細胞に、１：２（１部のレンチウイルス上清：１部の線維芽細胞培地）の希釈率で添加した。ＮＩＬウイルス上清は、１×濃度で使用し、希釈しなかった。以前に凍結されていたウイルスを使用する場合、希釈せずに１×濃度で使用した。様々な因子のウイルス上清を、６ウェル当たり全部で２ｍＬの培地まで合わせた（表３）。これに、５μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉｔｅｃｈ）を補充し、続いて遠心感染（ｓｐｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。６ウェルプレートをパラフィルムで封止し、６００ｇで９０分間、３２℃で遠心分離した。次いでプレートを３７℃及び５％ ＣＯ２のインキュベータに１２～１６時間移した。レンチウイルスでのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養培地を、１部の運命再プログラム培地（Ｆａｔｅ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦＲＭ））及び１部の線維芽細胞培地を含有する５０／５０培地に切り替えた。培地は、感染から４～６日後の間で完全にＦＲＭに切り替えられた。ＦＲＭは、５μＭのチアゾビビン（施設内で合成）、０．４μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、２μＭのＳＢ４３１５４２（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｎ２補充物質（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１×Ｂ２７補充物質（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充された従来の培地（上述）からなる。ウェルがコンフルエントとなったら、事前にマトリゲルでコーティングされた１０ｃｍの皿の上に細胞を継代する。継代は、マトリゲルコーティング表面上へのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による解離からなっていた（上述の通り）。１４日目から１８日目の間、またはｉＰＳＣコロニーが存在するようになったら、培養培地をＦＲＭからＦＭＭに切り替えた。単一細胞解離細胞を、ＦＭＭを有するマトリゲルコーティングプレート上に拡大し、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。ｈｉＰＳＣ表現型の発現の結果を、表３、図１５Ａ～Ｃ（８～１５日目）、及び図１６Ａ～Ｄ、図１７Ａ～Ｂ（４週目のＯｃｔ－４／Ｅｃａｔ１／ＵＴＦ１／Ｅｓｒｒｂ／Ｎａｎｏｇ）に示す。


エピソームベクター再プログラムのために、図１３に示されるプラスミドを使用した線維芽細胞または臍帯血細胞のトランスフェクションを、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。製品マニュアルにより説明されているように適切な緩衝液中で１６５０ｖ／１０ｍｓ／３パルスの設定を使用して、５×１０５線維芽細胞または２．５×１０５臍帯血細胞に、再プログラミング因子を含有する全部で約３μｇのエピソームプラスミドを、ＥＢＮＡ（ｍＲＮＡの形態で、またはクローニングプラスミドｐＣＤＮＡ内のカセットとして）と共トランスフェクトした。抗生物質を含まない４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が補充された線維芽細胞培地または臍帯血培養培地を含有する（細胞型に依存して）マトリゲルでコーティングされた６ウェルプレートのウェル上に、トランスフェクトされた細胞を直接播種した。臍帯血培養培地は、ＳＦＭＩＩ＋ＣＣ１１０（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる。トランスフェクションから２４時間後、ＦＲＭを培養物に同体積で添加する。線維芽細胞培養に対しては、トランスフェクションから４８時間後に、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を培養物に添加した。５日目に培養培地を完全にＦＲＭに切り替え、ハイグロマイシンはトランスフェクションから７日後に除去した。全ての再プログラム培養物は、トランスフェクションから１４日後にＦＭＭに切り替えた。臍帯血培養物に対しては、トランスフェクションから２４時間後に、ＦＲＭを同体積で添加し、トランスフェクション後１４日目まで数日毎に継続的に添加し、そこで培養物を吸引して完全にＦＭＭで置き換えた。両方の場合において、トランスフェクションから５～７日後に、接着性の円形細胞のクラスタが観察された。ＦＭＭ中となったら、全ての再プログラムクラスタを維持し、マトリゲルコーティング表面（上述）上でＡｃｃｕｔａｓｅを使用して単一細胞継代を行った。単一細胞解離細胞を、ＦＭＭを有するマトリゲルコーティングプレート上に拡大し、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。
実施例８
再プログラミング因子の影響及びそれらの化学量論
ヒト線維芽細胞を、いくつかの再プログラミング因子を含有するレンチウイルスに遠心感染させた。抗生物質選択因子を含有しないレンチウイルスプラスミドを使用して、全ての試料をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＳＶ４０ＬＴに感染させた。細胞を、ピューロマイシン選択カセット及び様々な再プログラミング因子を含有する単一レンチウイルスプラスミドに同時感染させた。これらの因子は、ＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＳＯＸ２、ＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２、またはＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４のいずれかを含んでいた。感染から２日後、５０／５０培地中の５００ｎｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加した。５日目、ピューロマイシン選択から３日後に、ピューロマイシンを含まないＦＲＭに培地を変更した。１４日目に、培地をＦＭＭに切り替えた。２４日目と２７日目との間に、ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋集団に対してフロー分析を行った。増加したＯＣＴ４発現が、再プログラム効率を大幅に改善することが観察された（図２３Ａ）。
実施例９
実験手順
従来の培養系におけるｈｉＰＳＣの維持
従来通り培養されたｈｉＰＳＣを、マイトマイシンＣ処理ＭＥＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィーダー細胞上で維持し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２０％ｖ／ｖのノックアウト血清代替物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１００μＭのβ－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する従来の培地（文章内では従来の培地と呼ばれる）で培養した。コンフルエントとなったら、従来通り培養されたｈｉＰＳＣを、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３７℃で７分間酵素的に解離させ、続いて小片まで機械的解離を行い（集塊継代（ｃｌｕｍｐ ｐａｓｓａｇｉｎｇ）と呼ばれる）、回収して、従来の培地を毎日添加しながら、５～７日毎に、新しく播種されたフィーダー細胞上に１：３～１：４で希釈継代した。過度の自発的分化が見られる場合、コロニーを手作業で採取し、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のチップを使用して小片に切断し、新しく播種されたフィーダー細胞に移した。細胞培養物を、３７℃及び５％ ＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内に維持した。
体細胞の再プログラム
再プログラムを開始させるために、レンチウイルス形質導入またはエピソームベクタートランスフェクションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。続いて、レンチウイルストランスフェクションを、以前に説明された通りに行った（Ｖａｌａｍｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。簡潔に説明すると、出発細胞を、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）コーティング表面上で、６ウェルプレートのウェル当たり１×１０５細胞で播種した。指定されない限り、全てのマトリゲルコーティングは、マトリゲル溶液（２５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁された１アリコートのマトリゲル）を組織培養表面に添加し、３７℃で２～４時間のインキュベーションを行うことからなる。レンチウイルス発現導入遺伝子ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を生成する２９３Ｔ細胞からの上清を、１：２（１部のレンチウイルス上清：１部の線維芽細胞培地）の希釈率で出発細胞に添加し、４μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充し、３７℃及び５％ ＣＯ２に１２～１６時間移した。線維芽細胞培地：ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）。レンチウイルスによるインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、線維芽細胞培地を供給した。トランスフェクションから４８時間後、１部のＦＲＭ（またはＳＭＣ４）及び１部の線維芽細胞培地を含有する５０／５０培地に培養培地を切り替えた。通常は感染後４日目から６日目の間に、培養物がより大きな槽に継代されると、培地は完全にＦＲＭ（またはＳＭＣ４）に切り替えられた。継代は、マトリゲルコーティング表面上へのＡｃｃｕｔａｓｅによる解離からなる（後述の通り）。培養物は、次の適用までＦＲＭ（またはＳＭＣ４）中で維持した。
エピソームベクター再プログラムのために、遺伝子セットＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＫＬＦ４／ＬＩＮ２８／ＭＹＣ／ＳＶ４０ＬＴ（Ａ１４７０３、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した線維芽細胞または臍帯血細胞のトランスフェクションを、ＮＥＯＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。製品マニュアルにより説明されているように適切な緩衝液中で１６５０ｖ／１０ｍｓ／３パルスの設定を使用して、約４μｇのベクターセットを５×１０５線維芽細胞または２．５×１０５臍帯血細胞内にトランスフェクトした。マトリゲルでコーティングされ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が補充された線維芽細胞培地または臍帯血培養培地を含有する（細胞型に依存して）、１０ｃｍの皿（線維芽細胞）または６ウェルプレートのウェル（臍帯血）内に、トランスフェクトされた細胞を直接播種した。臍帯血培養培地：ＳＦＭＩＩ＋ＣＣ１１０（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。トランスフェクションから２４時間後、ＦＲＭを培養物に同体積で添加する。線維芽細胞培養に対しては、トランスフェクションから４８時間後に、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を培養物に添加した。５日目に培養培地を完全にＦＲＭに切り替え、ハイグロマイシンはトランスフェクション後７日目に除去した。全ての再プログラム培養物は、トランスフェクション後１４日目にＦＭＭに切り替えた。臍帯血培養物に対しては、トランスフェクションから２４時間後に、ＦＲＭを同体積で添加し、トランスフェクション後１４日目まで数日毎に継続的に添加し、そこで培養物を吸引して完全にＦＭＭで置き換えた。両方の場合において、トランスフェクション後５～７日目に、接着性の円形細胞のクラスタが観察された。ＦＭＭ中となったら、全ての再プログラムクラスタを維持し、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して単一細胞継代を行った。単一細胞解離細胞を、ＦＭＭを有するマトリゲルコーティングプレート上に拡大し、フローサイトメトリーソーティングまで維持した。ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）表面コーティング試験においては、マトリゲルのビトロネクチンへの置換を除く全ての点が同じに保たれた。低減因子エピソーム再プログラムのために、ＥＦ１αプロモーターの調節下で、ＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＯＣＴ４、ＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＳＯＸ２またはＯＣＴ４－Ｐ２Ａ－ＮＡＮＯＧ－Ｔ２Ａ－ＳＯＸ２を含有するようにｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ベクター骨格を構築した。低減因子エピソームベクターのトランスフェクションに続き、わずかな変更を除いて上述と同じプロトコルを行った。ＥＢＮＡを、ＥＢＮＡ ｍＲＮＡ（２０μｇ）またはベクターカセット（２μｇ）として共トランスフェクトした（Ｈｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ハイグロマイシン選択を１０日間維持し、１６日目にＦＭＭを導入した。
レンチウイルスの生成
２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）を、抗生物質を含まない線維芽細胞培地中に維持し、８０％超のコンフルエンスに到達させなかった。線維芽細胞培地は、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｇｌｕｔａｇｒｏ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、及び１×ＮＥＡＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）からなっていた。まずＰＢＳで洗浄し、続いて０．０５％トリプシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）と共に３７℃で４分間インキュベーションすることにより、細胞を継代した。解離した細胞を線維芽細胞培地中に再懸濁させ、２２５ｇで４分間遠心分離し、所望のプレート上に播種した。組み込みレンチウイルスを生成するために、２９３Ｔを、１日目に各ウイルス調製用の１０ｃｍの皿当たり３．５×１０６細胞で継代した。２日目に、トランスフェクションの１時間前に培地を１０ｍＬの新鮮な線維芽細胞培地に変更した。ＣａｌＰｈｏｓ
Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションのために、関心のある遺伝子（複数を含む）を含有する５μｇのレンチウイルスクローニングプラスミド、３．２μｇのパッケージングプラスミドｐＰＡＸ、６３０ｎｇのパッケージングプラスミドｐＭＤＧ、８７μＬのカルシウム溶液、及び７００μＬまでの水を合わせた。１ｍＬの血清用ピペットを使用して気泡を形成しながら、７００μＬのＨＢＳ溶液を添加した。これを室温で１５分間インキュベートし、次いで２９３Ｔの１０ｃｍプレートに滴下により添加した。３日目に、ウイルス上清を除去し、廃棄し、１５ｍＬの新鮮な線維芽細胞培地をプレートに添加した。４日目、トランスフェクションから４８時間後に、ウイルス上清を回収し、４℃で保存した。１５ｍＬの線維芽細胞培地をプレートに添加した。５日目、トランスフェクションから７２時間後に、ウイルス上清を回収し、４日目の上清に添加した。０．４５μｍのフィルタを使用してこのウイルスプールを濾過し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＧｏＳｔｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して力価を確認した。ウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして－８０℃で凍結した。非組み込みレンチウイルス（ＮＩＬ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を生成するために、各ウイルス調製用のＴ７５フラスコを使用して、製造者の指示に従いプロトコルを行った。ウイルス上清を、トランスフェクションから４８、７２、及び９６時間後に回収し、プールし、濾過し、上述のように力価を測定した。ＮＩＬウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして－８０℃で凍結した。
小分子培養におけるｈｉＰＳＣ維持
誘導ｈｉＰＳＣを、培養物のコンフルエンスが７５～９０％に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。過度のコンフルエンスは、分化をもたらし得ることに留意されたい。単一細胞解離のために、ｈｉＰＳＣをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅで３７℃で３～５分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、２２５ｇで４分間遠心分離し、ＦＭＭ中に再懸濁させ、マトリゲルコーティング表面上に播種した。継代は典型的に１：４～１：８であり、移された組織培養プレートは事前にマトリゲルで３７℃で２～４時間コーティングし、１日おきにＦＭＭを供給した。細胞培養物を、３７℃及び５％ ＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内に維持した。ＦＭＭ及びＦＲＭ用の培地配合物を、表１に記載する。ＳＭＣ４培養は、以前に議論されている（Ｖａｌａｍｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。簡潔に説明すると、小分子０．４ｍＭのＰＤ０３２５９０１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、１ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、５ｍＭのチアゾビビン及び２ｍＭのＳＢ４３１５４２（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を、従来の培養培地に添加し、プロトコルに従って継代する。
フローサイトメトリー分析及びソーティング
単一細胞解離（上述）再プログラムプールを、ハンク平衡塩溶液（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）、４％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を含有する冷却された染色緩衝液中に再懸濁させた。ＳＳＥＡ４－ＦＩＴＣ、ＴＲＡ１－８１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７及びＣＤ３０－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む複合化した一次抗体を、細胞溶液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。全ての抗体は、１００万細胞当たり１００μＬの染色緩衝液中７～１０μＬで使用した。溶液を染色緩衝液中で１回洗浄し、２２５ｇで４分間遠心分離し、１０μＭ のチアゾビビンを含有する染色緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。上記のゲーティング戦略を使用して、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーソーティングを行った。ソーティングされた細胞は、ウェル当たり３及び９イベントの濃度で、１００μＭノズルを使用して９６ウェルプレート内に直接排出された。我々は、ソーティングされたイベントが必ずしもソーティング後の各ウェルにおいて観察される実際の細胞の数と相関するわけではないこと、及び、ウェル当たり３細胞が、個々のコロニーを含有する好ましい数のウェルの提供したことに気付いたため、ウェル当たり３細胞のソーティングが、我々にとって好ましい濃度であった。各ウェルを、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチン及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）が補充された２００μＬのＦＭＭで事前に充填し、５×マトリゲルで一晩事前にコーティングした。５×マトリゲル事前コーティングは、１アリコートのマトリゲルを５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に添加し、次いで一晩４℃でインキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェル当たり５０μＬで９６ウェルプレートに添加し、続いて３７℃で一晩インキュベートすることを含む。各ウェルに培地を添加する直前に、５×マトリゲルを吸引する。ソーティングの完了後、インキュベーションの前に、９６ウェルプレートを２２５ｇで１～２分間遠心分離する。プレートを、撹乱されない状態で７日間静置した。７日目に、１５０μＬの培地を各ウェルから除去し、１００μＬのＦＭＭで置き換えた。ソーティング後１０日目に、さらなる１００μＬのＦＭＭをウェルに再供給した。コロニー形成は、早くも２日目に検出され、ソーティングから７～１０日の間にほとんどのコロニーが拡大された。第１の継代において、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのＡｃｃｕｔａｓｅで３７℃で約１０分間解離させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ処理の延長の必要性は、長期間培養物中で待機状態であったコロニーの緊密度を反映している。細胞が解離していることが観察された後、２００μＬのＦＭＭを各ウェルに添加し、数回滴下してコロニーを分解する。解離したコロニーを、５×マトリゲルで事前にコーティングされた９６ウェルプレートの別のウェルに移し、次いで、インキュベーションの前に２２５ｇで２分間遠心分離する。この１：１の継代は、初期コロニーを広げるために行う。３～５分間のＡｃｃｕｔａｓｅ処理、及びＦＭＭ中の１×マトリゲルで事前にコーティングされたより大きなウェル内への１：４の拡大により、その後の継代を慣例的に行う。Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でフローサイトメトリー分析を行い、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析した。
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ及びＦｌｕｉｄｉｇｍ分析
Ｐｉｃｏ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を１００ｎｇの単離された全ＲＮＡから逆転写した。次いで、ｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．２×濃度のプールされたＴａｑＭａｎアッセイを使用した、２２の特異的標的遺伝子及び２つの参照対照遺伝子の事前増幅に使用した。製造者のプロトコルに記載の標準サイクリング条件による１４サイクルの増幅を使用して、ｃＤＮＡからの特異的標的増幅（ＳＴＡ）を行った。事前増幅されたｃＤＮＡ反応（ｎ＝４８）を１：５で希釈し（無菌水中）、リアルタイム定量ＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用した。４８．４８動的アレイ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）をＮａｎｏＦｌｅｘ ＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＭＸ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して投入し、ＴａｑＭａｎアッセイを２回投入し、ＢｉｏＭａｒｋ
Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用してリアルタイム反応を行った。ＢｉｏＭａｒｋ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して結果を分析した。３２を超えるサイクル閾値（Ｃｔ）を有する試料は、計算から除外した。２回のアッセイから平均Ｃｔを計算し、６つの対照ＭＥＦ細胞株（ＭＥＦ上のＯＳＫ ｈｉＰＳＣ及びＨ１ ＥＳＣ）の中央値に対する２つの参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴ１）の平均を使用して、デルタ－デルタＣｔｓ（ΔΔＣｔ）を計算した。相対的遺伝子発現（ＲＱ）の結果は、ヒートマップ形式でＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）で表示される。




導入遺伝子の存在の試験
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、導入遺伝子特異的プライマーセット（以下の表５）（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）を用いて１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、以下のように３５サイクルの間行った：９４℃で３０秒間（変性）、６０～６４℃で３０秒間（アニール）及び７２℃で１分間（伸長）。レンチウイルス法を用いて生成された線維芽細胞及びｈｉＰＳＣからのゲノムＤＮＡを、陰性対照として使用した。エピソームコンストラクトのＤＮＡを、陽性対照として使用した。


免疫細胞化学分析
４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を使用して細胞を固定し、０．２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中０．１５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して２５℃で１時間透過処理した。透過処理後、細胞をＰＢＳＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１％ｖ／ｖのＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＰＢＳＴＢ）で２５℃で３０分間ブロックした。ＰＢＳＴＢを穏やかに除去した後、細胞を、ＰＢＳＴＢ中の一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。この試験において使用された一次抗体は、ＯＣＴ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＮＡＮＯＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＴＲＡ１６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＲＡ１－８１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＳＥＡ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、β－ＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、α－平滑筋アクチン（Ｓｉｇｍａ）、ＦｏｘＡ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｏｘ１７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ネスチン（Ａｂｃａｍ）及びα－１－フェトプロテイン（Ｄａｋｏ）を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴＢ中に１：２５０で希釈された二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５５５；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、３７℃で１時間染色した。細胞をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３染色分析のために、ｈｉＰＳＣをカバースリップ上で７２～９６時間成長させ、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＥＭＳ）で２５℃で１５分間固定した。ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で２５℃で１時間細胞透過処理を行い、次いで細胞をブロック溶液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ）と共に、２５℃で３０分間インキュベートした。ブロック後、カバースリップを、ブロック溶液中の抗トリメチルヒストンＨ３（Ｌｙｓ２７）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０７－４４９、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）の１：１６００希釈物と共に、４℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１４２９）であった。核をＤＡＰＩで対比染色し、Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。画像をＡｘｉｏＶＳ４０ ｖ４．８．１．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｇｍｂｈ）で記録した。
実施例７に従って再プログラムされた細胞を、４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で固定し、ＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で洗浄し、ＰＢＳ中０．１５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、２５℃で１時間透過処理した。透過処理後、細胞をＰＢＳ中１％ｖ／ｖのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）（ＰＢＳＢ）で２５℃で３０分間ブロックした。ＰＢＳＢを穏やかに除去した後、細胞を、ＰＢＳＢ中の一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。この試験において使用された一次抗体は、ＯＣＴ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びＴＲＡ１８１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳＢ中に１：２５０で希釈された二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５５５；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、３７℃で１時間染色した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。染色された細胞を、Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。画像をＡｘｉｏＶＳ４０ ｖ４．８．１．０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｇｍｂｈ）で記録した。
分化分析（ＥＢ及び一定方向）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％の非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）及び１００μＭのβ－メルカプトエタノールを含有する分化培地中で、ｈｉＰＳＣをＥＢとして分化させた。簡潔に説明すると、ＥＢ形成のために、ｈｉＰＳＣを、ＦＭＭ中に播種し、翌日従来の培地に切り替え、細胞をプライミングした。従来の培地中で３～４日後、培養物を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で単一細胞解離し、１０μＭのＹ２７６３２を含む分化培地中に１００，０００細胞／ｍＬの最終濃度まで再懸濁させた。ＥＢ形成にはチアゾビビンの代わりにＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２が使用されることに留意されたい。Ｖ底９６ウェル非組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）内で１００μＬ／ウェルで細胞を播種し、９５０ｇで５分間遠心分離した。翌日、Ｐ１０００を使用して、緊密な「ボール状集塊」を、分化培地中約３０～４０ＥＢ／ウェルで超低結合性６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。７日後、ＥＢを１：１でマトリゲルコーティング６ウェルプレートに移し、３日毎に分化培地を供給した。培養物中で３週間後、細胞を固定及び染色した。一定方向単層分化のために、ｈｉＰＳＣをＦＭＭ中のマトリゲルコーティングウェル上に播種し、翌日５０％及び９０％のコンフルエンスとした。両方の密度を、分化するように誘引した。神経誘引のために、ＦＭＭ培地を、１０μＭのＳＢ４３１５４２及び１００ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９（共にＳＭＡＤ阻害剤、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）が補充されたｈＥＳＣ培地で置き換えた。２日後、分化培地に２つのＳＭＡＤ阻害剤に加えて３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を補充した。２日後、細胞を固定し、ネスチン（Ａｂｃａｍ）用に染色した。中胚葉分化のために、培地を、１×Ｂ２７培地添加剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４が補充されたＲＰＭＩ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で置き換えた。培地を１日おきに交換し、４日目に細胞を固定し、αＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ）用に染色した。Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、内胚葉分化を行った。ｈｉＰＳＣを内胚葉分化培地で３日間インキュベートし、固定し、ＳＯＸ１７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）用に染色した。
遺伝子発現分析
ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者の推奨プロトコルを用い、ＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全ＲＮＡを定量した。簡潔に説明すると、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ ａＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）用の標準プロトコルを使用し、任意選択の第２ラウンド増幅を利用して、およそ１００ｎｇの全ＲＮＡからビオチニル化ａＲＮＡを調製し、次いでＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ Ｂｉｏｔｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、ビオチン標識化ａＲＮＡ内に転写した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ推奨に従って、ビオチン標識化ａＲＮＡを精製及び断片化した。２０μｇの断片化ａＲＮＡを使用して、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３－ｐｌｕｓ－２．０チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に４５℃で１６時間ハイブリダイズした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０でアレイを洗浄及び染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇを使用して走査した。生の発現データファイルは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＳＥ５０８６８）上で利用可能である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを使用して、初期分析設定を用いて画像データを分析した。対数スケールのロバストマルチアレイ分析（ＲＭＡ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によりアレイを正規化し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４．５（Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で可視化した。Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ ｖ６．７）を使用して、差別的に発現したプローブの生物学的経路濃縮分析を、遺伝子オントロジー（ＧＯ）データベース（ＧＯ生物学的プロセスに対する単一濃縮及びｐ値＜０．０１）に対して行った。ユークリッド距離測定による完全連結クラスタリング法を使用して、Ｌｏｇ２発現レベルに基づいて試料間の遺伝子発現プロファイルを比較するために階層的クラスタ分析を行った（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４．５）。クラスタ分析用のプローブセットは、発現レベルにおける全体的差異（＞＜２．５倍）または基底もしくは準安定を定義する標的化遺伝子リスト上の存在により選択した。Ｘ染色体遺伝子発現比較のために、ＲＭＡ正規化Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ強度を、２＾［ＲＭＡ ｌｏｇ２強度］を考慮することにより一次式値に変換した。一次式比を、ナイーブ発現セットをプライミングした発現セットで除した値として計算した。Ｘ染色体にマッピングされた全てのプローブセットに対する発現比を、強調表示された２倍超または未満の濃縮比のプローブセットにより、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ４．５で可視化した。
核型分析
ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、２０から４０のＧバンド中期細胞に対して細胞遺伝学的分析が行われた。
奇形腫形成
２００μＬの溶液（１００μＬのＦＭＭ及び１００μＬのマトリゲル）当たり５０万及び３００万細胞の濃度の単一細胞解離ｈｉＰＳＣを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γヌルマウスに皮下注射した。５～６週間後（３００万細胞注射）及び７～８週間後（５０万細胞注射）、奇形腫をＰＢＳ中に採取し、４％パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後処理のために７０％エタノール中で室温で維持した。切片化ならびにヘマトキシリン及びエオシン染色のために、試料をＵＣＳＤ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出した。Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－Ｆｉ１カメラを装備したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００顕微鏡を使用して、切片の検査、解釈、及び撮像を行った。
統計分析：
標準偏差に関する統計評価にはスチューデントｔ検定を使用した。ＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｑＲＴＰＣＲデータに関するＲＱ最小及び最大値（エラーバー）を決定した。
一般に、以下の特許請求の範囲において、用語は、本明細書及び特許請求の範囲において開示される具体的実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲の対象となる均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (21)

  1. ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を培養する方法であって、該方法が、
    （ａ）第１の培養培地においてｈｉＰＳＣの前記集団を培養することであって、（ｉ）該培養することが、ＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＲＯＣＫのそれぞれを特異的に阻害することを含み、（ｉｉ）該培養することが、ＴＧＦβＲを特異的に阻害することを含まない、かつ（ｉｉｉ）該第１の培養培地がフィーダー細胞を含まない、ことと；
    （ｂ）培養されたｈｉＰＳＣの該集団を継代することと；
    （ｃ）第２の培養培地において継代されたｈｉＰＳＣの該集団を培養することであって、（ｉ）該培養することが、ＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＲＯＣＫのそれぞれを特異的に阻害することを含み、（ｉｉ）該培養することが、ＴＧＦβＲを特異的に阻害することを含まない、かつ（ｉｉｉ）該第２の培養培地がフィーダー細胞を含まない、ことと
    を含む、方法。
  2. 前記第１の培養培地および前記第２の培養培地において培養された前記ｈｉＰＳＣが、基底状態多能性を示す、請求項１に記載の方法。
  3. 基底状態多能性を有する前記ｈｉＰＳＣが、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７のうちの１つ以上の発現の抑制を示す、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第２の培養培地における前記ｈｉＰＳＣが、再プログラミング因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の方法。
  5. 前記継代することが、ｈｉＰＳＣの前記集団を解離させて、解離したｈｉＰＳＣの集団を製造することを含む、請求項１に記載の方法。
  6. （ｉ）継代されたｈｉＰＳＣの前記集団における少なくとも７０％の細胞が、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１－８１の両方について陽性であり、かつ、（ｉｉ）該継代されたｈｉＰＳＣが、基底状態多能性を維持する、請求項１に記載の方法。
  7. 継代されたｈｉＰＳＣの前記集団における少なくとも８０％または少なくとも９０％の細胞が、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１－８１の両方について陽性である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記解離することが、酵素的な解離を含む、請求項５に記載の方法。
  9. 前記継代することが、前記細胞をソーティングして、多能性の１つ以上のマーカーでｈｉＰＳＣについて濃縮することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 多能性の前記１つ以上のマーカーが、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１－８１を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記継代されたｈｉＰＳＣが、ゲノム安定性または正常核型のうちの１つ以上を維持する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記継代することが、少なくとも１０継代、少なくとも５０継代、または少なくとも１００継代を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  13. ｈｉＰＳＣの前記集団が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、およびＳＶ４０ＬＴのうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  14. ＧＳＫ３、ＭＥＫ、およびＲＯＣＫのそれぞれを特異的に阻害することが、（ａ）チアゾビビンまたはＹ２７６３２、（ｂ）Ａ－８３－０１またはＳＢ４３１５４２、および（ｃ）ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯと一緒に培養することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  15. 非多能性ヒト細胞を再プログラムして、ｈｉＰＳＣの前記集団を製造することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記再プログラムが、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つの再プログラミング因子の１つ以上のコピーを前記非多能性ヒト細胞に導入することを含み、該少なくとも１つの再プログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、およびＳＶ４０ＬＴからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記再プログラムが、再プログラム培地における前記非多能性ヒト細胞を培養することをさらに含み、前記再プログラム培地での培養が、ＧＳＫ３、ＭＥＫ、ＲＯＣＫ、およびＴＧＦβＲのそれぞれを特異的に阻害することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、
    （ａ）少なくとも２コピーのＯＣＴ４ポリヌクレオチド、１コピーのＥＣＡＴ１ポリヌクレオチド、１コピーのＵＴＦ１ポリヌクレオチド、１コピーのＮＡＮＯＧポリヌクレオチド、および１コピーのＥＳＲＲＢポリヌクレオチド；または
    （ｂ）少なくとも１コピーのＯＣＴ４ポリヌクレオチド、１コピーのＥＣＡＴ１ポリヌクレオチド、および１コピーのＵＴＦ１ポリヌクレオチド
    を含むベクターを含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、
    （ａ）レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはｍＲＮＡにより細胞に導入される；
    （ｂ）少なくとも１つの２Ａペプチドにより隔てられた多シストロン性ポリヌクレオチドを含む；または
    （ｃ）ＯＣＴ４ポリペプチドをそれぞれコードする多シストロン性ポリヌクレオチドを含む、
    請求項１６に記載の方法。
  20. ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を含む培養培地であって、
    （ａ）該培養培地が、ＴＧＦβＲ阻害剤を含まない；
    （ｂ）該培養培地が、フィーダーを含まない培地である；および
    （ｃ）該ｈｉＰＳＣが、基底状態多能性を有するｈｉＰＳＣを含む、
    培養培地。
  21. （ａ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯである；
    （ｂ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２５９０１である；
    （ｃ）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である；または
    （ｄ）前記培養培地が、ｂＦＧＦおよび／またはＬＩＦをさらに含む、
    請求項２０に記載の培養培地。
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