JP7735022B1 - がん細胞の培養用および／または保存用の培地、がん細胞の初代培養方法、がん細胞の継代培養方法およびがん細胞の保存方法 - Google Patents

Abstract

がん細胞の初代培養に適した培地を提供することを課題とする。
がん細胞の培養用および／または保存用の培地であって、該培地は、
ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを少なくとも含む
培地、により課題を解決できる。

Description

本出願における開示は、がん細胞の培養用および／または保存用の培地、がん細胞の初代培養方法、がん細胞の継代培養方法およびがん細胞の保存方法に関する。

抗がん剤などの化学療法の基礎的研究には、一般的に、確立されたがん細胞株が用いられている。しかしながら、長年にわたり生体外で維持され培養され続けているがん細胞株は、もとの患者腫瘍組織と性質が変化しており、生体内での挙動を十分に反映していない可能性がある。そこで、より精度の高い抗がん剤開発や、患者ごとに最適な治療の選択のために、がん細胞の初代培養が有望視されている。

初代培養方法としては、既にいくつかの方法が知られている。例えば、特許文献１には、（１）特別に増殖因子や何らかの阻害剤を加えることなく、一般的な細胞培養に用いられる培養培地を用いて、生体から採取された組織（生体組織）中の細胞を初代培養するため、（２）間質を構成する細胞を含み、単層の又は２以上の細胞層が厚み方向に積層されている細胞構造体の天面に、生体から採取した組織中の細胞を播種し培養する、ことが記載されている。

特許文献２には、（ａ）生体由来のがん組織を細断化し、細断化されたがん組織から挟雑物を除去し、（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供することで、患者由来がん細胞を、インビトロで、簡便、短時間かつ安定に大量培養できる初代培養法が記載されている。

国際公開第２０１９／０３９４５７号 特開２０１８－０１１５７６号公報

ところで、患者のがん組織からのがん細胞の初代培養は、臓器よって培養の成功率が異なる。一般的に大腸がん、胃がん、肝臓がんなどの実質臓器からのがん細胞の初代培養成功率は、比較的高いが必ず初代培養が成功する訳ではない。一方、肺がんは、初代培養の最も難しいがん種の１つといわれており、肺がん組織からのがん細胞初代培養の成功率は、一般的に１０％程度といわれている（Giard DJ, et al., “In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors.”, J Natl Cancer Inst., 1973 Nov;51(5):1417-23. doi:10.1093/jnci/51.5.1417. PMID: 4357758.）。

しかしながら、上記特許文献１および２には、初代培養の成功率に着目して培地の組成を検討する旨の記載はない。がん細胞の初代培養の分野において、初代培養に適した培地の提供が望まれる。

本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたものである。本発明者らは鋭意研究を行ったところ、ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを少なくとも含む培地を用いることで、がん細胞の初代培養を好適に実施できることを新たに見出した。

すなわち、本出願における開示の目的は、がん細胞の初代培養に適した培地を提供することである。

本出願における開示は、以下に示すがん細胞の培養用および／または保存用の培地、がん細胞の初代培養方法、がん細胞の継代培養方法およびがん細胞の保存方法に関する。

（１）がん細胞の培養用および／または保存用の培地であって、該培地は、
ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを少なくとも含む
培地。
（２）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、
Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌ、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１０７７）ＨＣｌ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、Ａｚａｉｎｄｏｌｅ １（ＴＣ－Ｓ ７００１）、Ｙ－３９９８３ ＨＣｌ、Ｎｅｔａｒｓｕｄｉｌ（ＡＲ－１３３２４）２ＨＣｌ、Ｂｅｌｕｍｏｓｕｄｉｌ（ＫＤ０２５）およびＡＴ１３１４８からなる群から選択した少なくとも一種である
上記（１）に記載の培地。
（３）前記ロック阻害剤が、Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌおよびＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌからなる群から選択した少なくとも一種である
上記（２）に記載の培地。
（４）前記培地中のＲＯＣＫ阻害剤の最終濃度が、０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上、１００μｍｏｌ／Ｌ以下であり、
前記培地中のモノチオグリセロールの最終濃度が、１０μｍｏｌ／Ｌ以上、５０００μｍｏｌ／Ｌ以下である
上記（１）に記載の培地。
（５）前記培地中のＲＯＣＫ阻害剤の最終濃度が、０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上、１００μｍｏｌ／Ｌ以下であり、
前記培地中のモノチオグリセロールの最終濃度が、１０μｍｏｌ／Ｌ以上、５０００μｍｏｌ／Ｌ以下である
上記（３）に記載の培地。
（６）抗生物質および／または抗真菌剤を更に含む
上記（１）に記載の培地。
（７）がんが、肺がんである
上記（１）に記載の培地。
（８）前記培地が、がん細胞の保存用の培地であり、
がん細胞が常温で保存される
上記（１）～（７）のいずれか一つに記載の培地。
（９）がん細胞の初代培養方法であって、該初代培養方法は、
上記（１）～（７）のいずれか一つに記載の培地を用いて、生体から採取したがん細胞を培養する培養工程を含む
初代培養方法。
（１０）がん細胞の継代培養方法であって、該継代培養方法は、
上記（９）に記載の初代培養方法で培養したがん細胞を、継代時に、２価の金属イオンと結合するキレート剤を用いることで、がん細胞が培養容器の壁面に接着することを低下させた状態でがん細胞を培養容器から取り出し、新しい培地を含む培養容器に移し替える継代工程を含む
継代培養方法。
（１１）がん細胞の保存方法であって、該保存方法は、
上記（１）～（７）のいずれか一つに記載の培地に、生体から採取したがん細胞を浸漬し、常温で保存する保存工程を含む
保存方法。
（１２）培地がウシ胎児血清を含む
上記（１１）に記載の保存方法。

本出願で開示する培地を用いることで、がん細胞の初代培養を好適に実施できる。また、本出願で開示する培地は、継代培養、がん細胞の保存用の培地としても使用できる。

図１は図面代用写真で、実施例２において、初代培養で得られた肺がん細胞の写真である。 図２は図面代用写真で、実施例４において、継代培養で得られた肺がん細胞の第３世代の写真である。 図３は図面代用写真で、実施例４において、継代培養で得られた肺がん細胞の第４世代の写真である。 図４は図面代用写真で、実施例６において、３日間常温で保存した後に初代培養で得られた肺がん細胞の写真である。 図５は図面代用写真で、比較例４において、３日間冷蔵庫で保存した後に初代培養で得られた肺がん細胞の写真である。 図６は、実施例７において、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）から抽出したＤＮＡ、Ｒａｐｉｄ－ＦＦＰＥから抽出したＤＮＡ、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｌｌから抽出したＤＮＡの品質を調べた結果を示す電気泳動写真である。

以下に、本出願において開示する、がん細胞の培養用および／または保存用の培地（以下、単に「培地」と記載することがある。）、がん細胞の初代培養方法（以下、単に「初代培養方法」と記載することがある。）、がん細胞の継代培養方法（以下、単に「継代培養方法」と記載することがある。）およびがん細胞の保存方法（以下、単に「保存方法」と記載することがある。）について、詳しく説明する。

また、本明細書において、
（１）「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味し、
（２）数値、数値範囲、及び定性的な表現（例えば、「同一」、「同じ」等の表現）については、当該技術分野において一般的に許容される誤差を含む数値、数値範囲及び性質を示している、
（３）「略〇〇状」と記載した場合、正確な〇〇状に加え、凡そ〇〇状と把握される形状を含む、
と解釈される。

（培地の実施形態）
実施形態に係る培地は、ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを少なくとも含む。

ＲＯＣＫ（Ｒｈｏキナーゼ。Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白Ｒｈｏの標的蛋白質として同定されたセリン－スレオニン蛋白リン酸化酵素であり、平滑筋収縮や細胞の形態変化など様々な生理機能に関与している。ＲＯＣＫ阻害剤とは、上記ＲＯＣＫの活性を阻害する化合物である。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫの活性を阻害できるものであれば特に制限はない。限定されるものではないが、市販されているＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌ、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１０７７）ＨＣｌ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、Ａｚａｉｎｄｏｌｅ １（ＴＣ－Ｓ ７００１）、Ｙ－３９９８３ ＨＣｌ、Ｎｅｔａｒｓｕｄｉｌ（ＡＲ－１３３２４）２ＨＣｌ、Ｂｅｌｕｍｏｓｕｄｉｌ（ＫＤ０２５）、ＡＴ１３１４８等が挙げられる。培地に含まれるＲＯＣＫ阻害剤は、１種類であってもよいし、２種類以上を組み合わせてもよい。

上記に例示したＲＯＣＫ阻害剤は、それぞれ、以下に示す化合物である。

上記に例示したＲＯＣＫ阻害剤の中で、Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌ、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌがより好ましい。

モノチオグリセロールは、下記式（１５）で表される化合物で、抗生物質の安定剤・抗酸化剤、その優れた還元能力により毛髪のＳ－Ｓ結合を切断することからカーリング剤（パーマ液）、抗菌保存剤、等の用途に用いられる化合物である。

培地は、ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールが必須の成分として含まれる以外は、公知の細胞培養用の培地を基本培地として用いることができる。限定されるものではないが、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ′ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ：Ｆ－１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ′ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭα（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ－１６４０等が挙げられる。これらの培地に、必要に応じて細胞増殖因子等の各種成分を添加し、細胞種に合せて組成を調整した培地を用いればよい。

培地に一般的に添加される各種成分としては、例えば、ＦＧＦ－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）等の細胞増殖因子；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；亜セレン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機塩；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；分化抑制因子；デキサメタゾン、オンコスタチンＭ等の分化誘導因子；２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；などが挙げられる。

また、がんの種類（特に、胃がん、大腸がん）によっては、患者から採取した細胞をそのまま培養すると、採取したがん細胞に付着している細菌や真菌が増殖するおそれがある。したがって、培地には、必要に応じて抗生物質および／または抗真菌剤を添加してもよい。限定されるものではないが、抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等が挙げられ、抗真菌剤としては、アンフォテリシンＢ、フルコナゾール等が挙げられる。

がんは何れの種類であってもよい。例えば、大腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、肛門がん、膵がん、肝がん、胆管がん、消化器内分泌腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、乳がん、肺がん、中皮腫、胸腺がん、腎がん、尿路上皮がん、精巣腫瘍、前立腺がん、子宮体がん、子宮頚がん、子宮肉腫、卵巣悪性腫瘍、舌がん、歯肉がん、口腔底がん、咽頭がん、喉頭がん、唾液腺がん、甲状腺がん、骨肉種、Ｅｗｉｎｇ肉腫、軟部肉腫、骨髄異形成症候群、皮膚がん、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫（グリオブラストーマ）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などが例示されるが、これらに限定されない。

実施形態に係る培地は、胃がん、肝がん、膵がんの他、後述する実施例に示すとおり、従来は初代培養が難しいとされた肺がんについても、高い成功率で初代培養することができた。

培地に添加されるＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールの濃度は、がん細胞の初代培養を好適に実施できる範囲であれば特に制限はない。限定されるものではないが、培地中のＲＯＣＫ阻害剤の最終濃度は、培地１Ｌあたり、下限値は、０．０５μｍｏｌ以上、０．０６μｍｏｌ以上、０．０７μｍｏｌ以上、０．０８μｍｏｌ以上、０．１μｍｏｌ以上、０．２μｍｏｌ以上、０．４μｍｏｌ以上、０．６μｍｏｌ以上、０．８μｍｏｌ以上、１μｍｏｌ以上、２μｍｏｌ以上、３μｍｏｌ以上、４μｍｏｌ以上、５μｍｏｌ以上、６μｍｏｌ以上、７μｍｏｌ以上、８μｍｏｌ以上、９μｍｏｌ以上、１０μｍｏｌ以上等が挙げられ、上限値は、１００μｍｏｌ以下、９０μｍｏｌ以下、８０μｍｏｌ以下、７０μｍｏｌ以下、６０μｍｏｌ以下、５０μｍｏｌ以下等が挙げられる。

培地中のモノチオグリセロールの最終濃度は、限定されるものではないが、培地１Ｌあたり、下限値は、１０μｍｏｌ以上、２０μｍｏｌ以上、３０μｍｏｌ以上、４０μｍｏｌ以上、５０μｍｏｌ以上、６０μｍｏｌ以上、７０μｍｏｌ以上、８０μｍｏｌ以上、９０μｍｏｌ以上、１００μｍｏｌ以上等が挙げられ、上限値は、５０００μｍｏｌ以下、４０００μｍｏｌ以下、３０００μｍｏｌ以下、２０００μｍｏｌ以下、１０００μｍｏｌ以下、７５０μｍｏｌ以下、５００μｍｏｌ以下等が挙げられる。

また、実施形態に係る培地は、後述する実施例に示すとおり、初代培養に加え、継代培養や、患者から採取したがん細胞を保存する際にも好適に用いることができる。特に、がん細胞を保存する際には、冷蔵保存する必要はなく、常温で保存できる。したがって、採取したがん細胞の取り扱いの利便性が向上する。なお、本明細書において「常温」とは、冷却手段または加熱手段を用いずに保存する温度を意味し、季節により異なるものの約１５℃～３０℃を意味する。また、本明細書において「保存」とは、生体からがん細胞を採取してから初代培養方法を実施するまでの間（保存期間）、採取したがん細胞が死滅することを可能な限り抑制しつつ生存状態を維持することを意味する。なお、保存期間中のがん細胞は、同じ場所で静置されてもよいし、運搬（例えば、がん細胞を採取した病院から初代培養を実施する施設に運搬）されてもよい。

本出願で開示する培地は、以下の効果を奏する。
（１）従来は初代培養が難しいとされていた肺がんの初代培養の成功率を高くできる他、肺がん以外のがん細胞の初代培養に使用できる。したがって、がんの種類を問わずがん細胞を初代培養できることから、診断・治療のための遺伝子解析や抗がん剤の選択等の臨床応用、がんの分子メカニズム、遺伝子変異解析、創薬研究等の基礎研究に有用である。
（２）初代培養および継代培養に加え、がん細胞の保存用の培地としても使用できる。したがって、１種類の培地であっても異なる用途に使用できることから、臨床等の現場において有用である。

（初代培養方法の実施形態）
次に、実施形態に係る初代培養方法について説明する。初代培養方法は、上記培地の実施形態で説明をした何れかの培地を用いて、採取したがん細胞を培養する培養工程を含む。

がん細胞を採取すべき対象は、生体（生きた動物）であればよく、好ましくはがんを有するヒトである。生体のがん組織は、公知の方法で採取されればよい。限定されるものではないが、外科手術時に採取または摘出、あるいは生検等が挙げられる。

培養工程は、生体から採取したがん細胞が培養できれば培養方法に特に制限はない。通常、生体から採取したがん細胞を含む組織は、培養する前に細断化が行われる。細断化は、ナイフ、はさみ等を用いて、組織塊が肉眼で見えなくなる程度（約１ｍｍ角以下）まで細断すればよい。そして、培養方法は、細断したがん細胞を含む組織をそのまま培養するエクスプラント培養であってもよいし、細断したがん細胞を含む組織を酵素により細胞単位に分離して培養する酵素処理分散培養であってもよい。なお、本明細書において「がん細胞を培養する」と記載した場合、細断したがん細胞を含む組織を培養すること、および、細胞単位に分離したがん細胞を培養すること、の両方を含む概念である。また、本明細書において「がん細胞」と記載した場合、当該記載には「単離したがん細胞」および「がん細胞を含む組織」の両方が含まれる。酵素処理分散培養に用いる酵素は、細胞培養の分野で一般的に用いられている酵素であれば特に制限はなく、限定されるものではないが、コラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ディスパーゼ等が挙げられる。

また、がん細胞は、必要に応じて、洗浄、滅菌されたフィルターを用いて篩い分け等を行うことで、夾雑物の除去を行ってもよい。

がん細胞の培養方法としては、がん細胞を人工基質上で単層に成長させる接着培養、および、がん細胞を培地中で自由に浮遊させて成長させる浮遊培養が知られている。接着培養は初代培養を含むほとんどの細胞タイプに適しているが、浮遊培養は主に非接着性の細胞に適している。したがって、実施形態に係る初代培養方法では、接着培養が好ましい例として挙げられるが、最初は浮遊培養によりがん細胞を培養して細胞凝集体を形成してから接着培養してもよい。

培養工程で用いる培養容器は、細胞培養の分野で一般的に用いられている公知の容器を用いればよい。限定されるものではないが、接着培養は、表面に細胞または細胞塊が付着し易い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。がんの種類や組織型によってはラミニン５１１、ラミニン４１１、可溶性Ｅカドヘリン等を固層化したプレートに播種してもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。

浮遊培養で浮遊培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し難い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。

培養時間、温度等の培養条件は、がんの種類に応じて、培養を実施する者が適宜決定すればよい。

実施形態に係る初代培養方法は、以下の効果を奏する。
（１）培養工程で増殖したがん細胞の初代培養物は、採取した生体の臨床組織に類似する。つまり、生体内のがん組織の状態をインビトロで再現することができる。そのため、実施形態に係る初代培養方法により得られた初代培養物を用いて、がん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、採取した生体（患者）の適した医薬品のスクリーニング、がん細胞の遺伝子解析等に用いることができる。また、創薬などの研究開発にも用いることができる。
（２）本出願で開示する培地を用いることで、初代培養が特に難しいとされている肺がん細胞の成功率が７０％程度に向上する。なお、本明細書において「成功率」とは、初代培養により、がん細胞が１００倍程度増えることを意味する。成功率が向上することで、上記（１）に記載のがん分子メカニズムの解明、薬剤感受性試験、採取した生体（患者）の適した医薬品のスクリーニング、がん細胞の遺伝子解析等を実施できる確率が高くなる。したがって、患者に特化したオーダーメイド医療を実現することができる。
（３）手術等の際に採取したがん組織は、一般的にはホルマリン固定が行われ、パラフィンブロックを作製し、病理観察等に用いられる。ところで、組織固定に使用されるホルマリンは核酸（ＤＮＡなど）とタンパク質の架橋を引き起こすため、ＤＮＡは物理的ストレスを受けやすくなる。また、ホルマリンは酸化してギ酸になる場合があり、ギ酸はＤＮＡを脱プリン化し、ＤＮＡ鎖切断の原因となる。したがって、ホルマリン固定したがん組織を用いてＤＮＡ分析をしようとしても、ＤＮＡの品質が非常に悪いという問題がある。一方、初代培養方法により得られたがん細胞は後述する実施例に示すとおり、高品質なｇＤＮＡが得られることから、遺伝子解析の精度が向上する。

（継代培養方法の実施形態）
次に、実施形態に係る継代培養方法について説明する。継代培養方法は、上記初代培養方法により培養したがん細胞を、継代時に、２価の金属イオンと結合するキレート剤を用いることで、がん細胞が培養容器の壁面に接着することを低下させた状態でがん細胞を培養容器から取り出し、新しい培地を含む培養容器に移し替える継代工程を含む。

継代培養方法で用いる培地は、初代培養方法で用いた培地と同じでよい。代替的に、ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを含めば、継代培養方法で用いる培地成分が初代培養方法の培地成分と異なっていてもよい。また、継代工程後に実施する継代培養は、接着培養が好ましいが浮遊培養でも問題ない。継代工程および継代培養は複数回繰り返してもよい。

キレート剤としては、培地中に含まれる２価の金属イオン（カルシウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン等）と結合するものであれば特に制限はない。限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシド）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）等が挙げられる。

継代時に添加するキレート剤の濃度は、培養した細胞を培養容器から取り出すことができ、細胞に大きなダメージを与えない範囲であれば特に制限はない。限定されるものではないが、１ｍＭのキレート剤溶液を０．５～１ｍＬ程度添加すればよい。

従来の細胞培養方法では、継代時に、酵素を用いて細胞を培養容器から剥がしていた。しかしながら、酵素を用いると細胞膜や細胞膜表面の受容体などが脆弱となり、細胞が弱くなることから増殖性が低下することがある。また、細胞膜表面で発現の弱い受容体などが消失することがあり、細胞膜表面解析時に検出できなくなることがある。一方、実施形態に係る継代培養方法では、２価の金属イオンと結合するキレート剤を用いることでがん細胞を培養容器から容易に取り出しができる。換言すると、継代工程は、酵素を用いずに培養容器からがん細胞を取り出し、新しい培地を含む培養容器に移し替える工程ということができる。

実施形態に係る継代培養方法により、継代培養の効率が向上するとの効果が得られる。

（保存方法の実施形態）
次に、実施形態に係る保存方法について説明する。実施形態に係る保存方法は、培地の実施形態に記載の培地に、生体から採取したがん細胞を浸漬し、常温で保存する保存工程を含む。

培地に関しては上記培地の実施形態で説明済みであり、生体から採取したがん細胞に関しては上記初代培養方法の実施形態で説明済みである。したがって、重複記載となることから詳しい説明は省略する。

がん細胞を冷蔵庫に入れて保存すると細胞がダメージを受ける。そのため、冷蔵庫で保存したがん細胞を初代培養しても、がん細胞が増殖しない場合がある。一方、実施形態に係る保存方法は、本出願で開示する培地を用いることで、常温保存することができる。したがって、手術で採取したがん細胞を初代培養する際の細胞の取り扱いの利便性が向上するという効果が得られる。また、常温保存できることから、例えば、細胞培養施設を有しない診療所で採取したがん細胞を初代培養できる施設に常温で運搬できることから、運搬の利便性が向上するという効果が得られる。

保存期間は、保存中のがん細胞が死滅したり増殖能力が極端に低下しない範囲であれば特に制限はないが、約１日～４日間を目途にすることが好ましい。また、任意付加的に培地に、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の抗生物質を添加してもよい。

保存培地を用いて採取したがん細胞を長期間保存する場合、保存培地にはＦＢＳ（ウシ胎児血清）が含まれることが望ましい。また、ＦＢＳに加えて、ＫＳＲ等の血清代替品（無血清サプリメント）も含まれることが望ましい。ＦＢＳ（および無血清サプリメント）が含まれることで、がん細胞は安定的に保存される。保存培地に含まれるＦＢＳの濃度は、限定されるものではないが、下限値としては０．５体積％以上、０．７５体積％以上、１．０体積％以上、１．５体積％以上、２．０体積％以上、２．５体積％以上、３．０体積％以上等が挙げられ、上限値としては２０体積％以下、１８体積％以下、１６体積％以下、１４体積％以下、１２体積％以下、１０体積％以下等が挙げられる。

無血清サプリメントの濃度は、限定されるものではないが、下限値としては０．５体積％以上、０．７５体積％以上、１．０体積％以上、１．５体積％以上、２．０体積％以上、２．５体積％以上、３．０体積％以上等が挙げられ、上限値としては２０体積％以下、１８体積％以下、１６体積％以下、１４体積％以下、１２体積％以下、１０体積％以下等が挙げられる。

なお、動物由来の成分が保存培地に含まれると、培養したがん細胞にウイルス等がコンタミする恐れがある。ウイルスがコンタミしても、培養したがん細胞が研究用途や創薬等のスクリーニングに使用される場合は特段の問題はない。しかしながら、より安全性を高めるとの観点では、採取したがん細胞の保存期間が短い場合、保存培地にはＦＢＳ（および無血清サプリメント）が含まれないほうが望ましい。なお、本明細書において「長期保存」とは、３日以上保存することを意味し、短期とは３日未満保存することを意味する。

以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する技術的範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

［培地の作製］
＜実施例１＞
以下の組成で培地を作製した。
１．初代培養用、継代培養用の培地（接着培養、浮遊培養いずれも共通）、保存用培地（短期保存用）
・１μＭ Ａ８３－０１（ＴＧＦ－β阻害剤。富士フィルム和光純薬株式会社製）
・５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（上皮成長因子。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・２ｍＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ－３ 阻害剤。富士フィルム和光純薬株式会社製）
・１μｍｏｌ／Ｌ Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤。富士フィルム和光純薬株式会社製）
・×１００ Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・×５０ Ｂ２７サプリメント入り（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ^TM Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（グルタミン酸。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・５０μｍｏｌ／Ｌ モノチオグリセロール（富士フィルム和光純薬株式会社製）
・×１００ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン。富士フィルム和光純薬株式会社製）
・１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンＧ（富士フィルム和光純薬株式会社製）
・１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）

２．長期保存用培地
・５体積％ＦＢＳ（ウシ胎児血清。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・２．５体積％ＫＳＲ（無血清サプリメント。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・１ ｍｍｏｌ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・２．５体積％ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ^TM Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（グルタミン酸。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・１μｍｏｌ／Ｌ Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤。富士フィルム和光純薬株式会社製）
・５０ｎｇ／ｍＬ ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト。Ａｂｃａｍ社製）
・５０μｍｏｌ／Ｌ モノチオグリセロール（富士フィルム和光純薬株式会社製）
・ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）
・１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリンＧ（富士フィルム和光純薬株式会社製）
・１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩（富士フィルム和光純薬株式会社製）

［初代培養の実施］
＜実施例２＞
１．培養容器
実施例２では、以下の培養容器を用いた。
・接着培養用マルチウェルプレート（１／１２ ｗｅｌｌ）。なお、接着培養用のマルチウェルプレートは、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コート（タカラバイオ社製）を用いて冷蔵庫で一晩コーティングした。
培養用培地 １ｍＬ／ｗｅｌｌ。
・浮遊培養用 ＨｙｄｒｏＣｅｌｌプレート（２４ ｗｅｌｌ）。なお、浮遊培養用のプレートは、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コート（タカラバイオ社製）でコーティングされていない。
培養用培地 １ｍＬ／ｗｅｌｌ。

２．初代培養の手順
（１）手術で採取した肺がんの組織を、短期保存用培地２ｍＬを含む１５ｍＬチューブに入れて、２時間保存した。
（２）先太チップにて組織を１０ｃｍ ｄｉｓｈに移し、短期保存用を少量添加した。メス刃で組織を細切した（約０．５－１ｍｍ角）。細切した組織片を再び短期保存用に入れて３０分間、３７℃でインキュベーションした。
（３）ＰＢＳで１０ｍＬまでメスｕｐして、遠心洗浄（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。
（４）上清を吸引除去して酵素処理した。具体的には、０．１％ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｉを２ｍＬ添加し、Ｖｏｌｔｅｘ後、酵素反応（３７℃、２０～３０ｍｉｎ、振盪）した。なお、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｉ（ＳＩＧＭＡ）はＨＢＳＳ（Ｍｇ，Ｃａ入り）にて０．５％を５倍希釈した。
（５）ＰＢＳ ９ｍＬ＋ＣＥＬＬＯＴＩＯＮ（タカラバイオ社製）１ｍＬで１０ｍＬまでメスｕｐし、遠心洗浄（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。
（６）ＰＢＳを２ｍＬ添加し、ピペッティングにより組織を解した。解した２ｍＬ液を組織残渣ごと新しい１５ｍＬチューブにフィルトレーションし、フィルター上に残った組織残渣をピペットで軽くすりつぶした後、約７ｍＬのＰＢＳでチューブを共洗い、フィルトレーションした。ここにＣＥＬＬＯＴＩＯＮを１ｍＬ添加し遠心洗浄（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。
（７）上清をギリギリまで吸引除去し、溶血剤を３ｍＬ添加し、Ｖｏｌｔｅｘして溶血処理（４℃、１５ｍｉｎ）を行った。
（８）ＰＢＳとＣＥＬＬＯＴＩＯＮ１ｍＬで１０ｍＬまでメスｕｐし、遠心洗浄（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。
（９）上清を吸引除去し、再度ＰＢＳとＣＥＬＬＯＴＩＯＮ１ｍＬで１０ｍＬまでメスｕｐし、遠心洗浄（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。なお、遠心前に細胞懸濁液１２μＬを計算盤に添加し、細胞数をカウントした。
（１０）上清を１００μＬまで吸引除去し、がん細胞を初代培養用培地（上記「１．培養容器」に記載の接着培養用のウェルプレート、浮遊培養用のプレート）に播種した（播種数は適宜決定）。
（１１）３７℃、５％炭酸ガスの細胞培養用インキュベーターにて、約７日培養した。なお、培地交換は２～３日に１回程度行った。

なお、実施例２では、６２名の患者（Ｎ＝６２）から採取した肺がん組織を半分に分け、それぞれ、接着培養および浮遊培養で実験を行った。換言すると、同一症例のサンプルについて、接着培養および浮遊培養の２つの培養方法で検証を行った。結果は、接着培養および浮遊培養の両方で初代培養が成功した症例が３０、接着培養のみで初代培養が成功した症例が４、浮遊培養のみで初代培養が成功した症例が１２であった。つまり、６２症例の内、接着培養および浮遊培養の両方、または、いずれか一方で初代培養が成功（肺がんの細胞数が１００倍以上の増加）した症例は４６であり、生体から採取した肺がん組織の約７４％で初代培養が成功した。図１に初代培養（接着培養）で得られた肺がん細胞の写真を示す。

＜比較例１＞
実施例１の培地組成においてＲＯＣＫ阻害剤を添加しなかった以外は実施例２と同様の手順で実験を行ったところ（Ｎ＝１１）、接着培養および浮遊培養の何れにおいてもがん細胞は殆ど増殖しなかった。

＜比較例２＞
実施例１の培地組成においてモノチオグリセロールを添加しなかった以外は実施例２と同様に実験を行ったところ（Ｎ＝８）、接着培養および浮遊培養の何れにおいてもがん細胞は１週間で－２０％となった。

実施例２および比較例１、２の結果から、ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを組み合わせて添加した培地を用いることで、初代培養の成功率が非常に低いと言われている肺がん細胞であっても、高い成功率で初代培養できることを確認した。また、本出願で開示する培地は、接着培養および浮遊培養の何れにおいても有用であることを確認した。

＜実施例３＞
肺がん組織に代え、骨肉腫、胃がん、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、食道がんの手術の際に採取したがん組織を用いた以外は、実施例２と同様の手順（ただし、胃がんおよび大腸がんでは、２.５μｇ／ｍＬ アンフォテリシンＢ（富士フィルム和光純薬株式会社製）および５μｇ／ｍＬ フルコナゾール（富士フィルム和光純薬株式会社製）を添加した。）で初代培養を行った。初代培養の成功率（細胞数が１００倍以上に増殖）は以下のとおりであった。なお、接着培養および浮遊培養の両方で初代培養は成功したが、実施例２と異なり、成功率が高かった培養方法の結果のみを示す。
骨肉腫：４例中３例で成功。成功率７５％。
胃がん：１０例中７例で成功。成功率７０％。なお、失敗した３例は真菌がコンタミしたため中止したが、がん細胞が増殖したことは確認できた。
卵巣がん：３例中２例で成功。成功率６７％。
大腸がん：５例中４例で成功。成功率は８０％。
膵臓がん：１０例中６例で成功。成功率は６０％。なお、失敗した４例中、３例は切除した組織にがん細胞が入っていなかったことが別途確認された。
食道がん：２例中２例で成功。成功率１００％。

以上の結果から、本出願で開示する培地は、肺がんのみでなく、多くの種類のがんの初代培養に有用であることを確認した。特に、肺がん細胞の初代培養の成功率は、従来の方法では約１０％と報告されていたところ、本出願で開示する培地を用いることで成功率は約７４％と顕著に向上した。

［継代培養の実施］
＜実施例４＞
上記実施例２の初代培養に続き、以下の手順で継代培養を行った。なお、継代培養には、接着培養で初代培養した肺がん細胞を用いた。以下に、継代工程を示す。
（１）培地を吸引し、ＰＢＳにて洗浄した。
（２）キレート剤として、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液を１ｍＬ加えて、３７℃の炭酸ガスインキュベーターにて５～１５分反応させ、５分おきに顕微鏡で観察し、細胞がディッシュから剥がれ始めたら、ＰＢＳを加えてピペッティングを行い、細胞を回収した。
（３）１５ｍＬのチューブに移して、ＰＢＳとＣＥＬＬＯＴＩＯＮ１ｍＬで１０ｍＬまでメスｕｐし、遠心洗浄（１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。

継代培養した第２世代の肺がん細胞の一部について、更に継代培養を行った。図２に第３世代の写真、図３に第４世代の写真を示す。なお、第２世代から第４世代までの継代培養の成功率は、約９０％であった。

＜比較例３＞
実施例４のキレート剤に代え、酵素（０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ、１ｍＬ）を添加した以外は、実施例４と同様の手順で継代培養を行った。結果は、多くのがん細胞が死んでしまい、５０％～７０％の頻度で継代できなかった。

［他のＲＯＣＫ阻害剤を用いた初代培養、継代培養の実施］
＜実施例５＞
実施例２のＹ－２７６３２に代え、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ－２７６３２ ２ＨＣｌ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）の４薬剤を使用した以外は、実施例２と同様の手順で初代培養を行った。初代培養の成功率は、以下のとおりであった。なお、接着培養および浮遊培養の両方で初代培養は成功したが、実施例２と異なり、成功率が高かった培養方法の結果のみを示す。
・Ｙ－２７６３２ ２ＨＣＬ：３例中２例で成功。成功率６７％。
・Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：４例中３例で成功。成功率７５％。
・Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ （ＨＡ－１１００） ＨＣＬ：４例中３例で成功。成功率７５％。
・ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣＬ：３例中２例で成功。成功率６７％。

また、実施例５の４種類のＲＯＣＫ阻害剤を用いて第２世代まで培養した肺がん、膵臓がん、胃がん細胞から、肺がん（３例）、膵臓がん（２例）、胃がん（３例）を選択して更に継代培養したところ、全て第４世代まで継代することができた。継代による細胞の増殖数は、Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌを基準（１とする）とした場合、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅは０．９９、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌは１．１３、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌは１．０３となり、同様に増殖していた。

以上の結果から、本出願で開示する培地を用いることで、がん細胞の種類を問わず、高い成功率で初代培養および継代培養できることを確認した。

［保存用培地］
＜実施例６、比較例４＞
生体から採取した肺がん細胞を長期保存用培地に浸漬し、常温（実施例６）と冷蔵庫（比較例４）で３日間保存し、その後に実施例２と同様の手順で初代培養（ただし、接着培養のみ。）を行った。図４に常温で保存した肺がん細胞の初代培養７日目の写真を示す。図５に冷蔵庫で保存した肺がん細胞の初代培養７日目の写真を示す。図４の写真から明らかなように、長期保存用培地にて生体から採取したがん細胞を常温で保存しても、がん細胞は増殖することを確認した。一方、図５の写真から明らかなように、生体から採取したがん細胞を冷蔵庫で保存した場合は、がん細胞の増殖は常温保存と比較して劣っていた。一般的に、生体から採取したがん細胞を直ぐに培養しない場合は、冷蔵庫で保存される。本出願で開示する培地を用いることで、採取したがん細胞を常温保存できることから、採取した細胞の取り扱いの利便性が向上する。

＜比較例５＞
実施例２で用いた培地からＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを除いた培地、つまり、従来から一般的に用いられる培地を用いた以外は実施例６と同様の手順で実験を行った。なお、比較例５では、肺がん細胞に加え、卵巣がんでも実験を行った。結果は以下のとおりであった。
・肺がん：３例中成功は０。成功率は０％。
・卵巣がん：２例中成功は０。成功率０％。

以上の結果から、本出願で開示する培地は、初代培養、継代培養、保存用の何れの用途にも使用できることを確認した。更に、がん細胞を保存する際には、常温保存の方が好ましいことを確認した。

［ＤＮＡ品質につて］
＜実施例７＞
次に、初代培養で得られたがん細胞のＤＮＡ品質を調べる実験を行った。実験手順を以下に示す。

＜サンプルの調整＞
（１）ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のＤＮＡ
４人の患者（結果を示す図４では、それぞれ、Ｓａｍｐｌｅ１、２、３、４と表記する。）から手術の際に採取した肺がん組織を、一般的な手順と処理時間でホルマリン固定し、その後、組織の切り出しを行い、一般的な工程にて病理診断用パラフィンブロックを作製（ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ：ＦＦＰＥ）した。このブロックからミクロトームを用いて一般的な手法で作製されたパラフィン切片から、市販のＤＮＡ抽出キットにてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。

（２）Ｒａｐｉｄ－ＦＦＰＥのＤＮＡ
上記３人の患者（Ｓａｍｐｌｅ３は無し。）から手術の際に採取した肺がん組織を、直ちに５～１０ｍｍ程度のサイズに切り出しを行い、一般的な方法にてホルマリン固定パラフィンブロックを作製した。その後は、上記のＦＦＰＥと同様にパラフィン切片を作製し、ｇＤＮＡ抽出を行った。

（３）Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｅｌｌのＤＮＡ
上記４人の患者から手術の際に採取した肺がん組織を、短期保存用培地に入れて細胞培養室まで搬送した。その後、実施例２の手順にしたがって初代培養を行った。培養によって増殖したがん細胞からｇＤＮＡを抽出した。

＜電気泳動＞
ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、上記＜サンプルの調整＞で抽出したｇＤＮＡの品質を確認した。図６に結果を示す。図６のゲル電気泳動の結果に示すように、ＦＦＰＥではほとんどバンドは見えなかった。一方、Ｒａｐｉｄ－ＦＦＰＥでは、バンドは見えたがブロードであった。これは、組織固定に使用されるホルマリンにより、タンパク質とＤＮＡが架橋したり、ＤＮＡの分解が起きたためと考えられる。一方、初代培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ）では、ＤＮＡは分解されずにきれいなバンドが確認された。各サンプルのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の相対的な品質の決定におけるＤＮＡＩｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＤＩＮ）の値は、図６から明らかなようにＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｌｌが最も高かった。なお、ＤＩＮの評価範囲は１～１０であり、ＤＩＮ値が高いほどｇＤＮＡが分解されていないことを示している。

以上の結果から、初代培養したがん細胞からは高い品質のｇＤＮＡが得られることから、患者毎の遺伝子解析等にも用いることができる。

本出願で開示する培地を用いることで、高い成功率でがん細胞の初代培養ができる。したがって、医療産業にとって有用である。

Claims (11)

1. がん細胞の培養用および／または保存用の培地であって、該培地は、
   ＲＯＣＫ阻害剤およびモノチオグリセロールを少なくとも含み、
   前記培地中のＲＯＣＫ阻害剤の最終濃度が、０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上、１００μｍｏｌ／Ｌ以下であり、
   前記培地中のモノチオグリセロールの最終濃度が、１０μｍｏｌ／Ｌ以上、５０００μｍｏｌ／Ｌ以下である
   培地。
2. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、
   Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌ、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１０７７）ＨＣｌ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、Ａｚａｉｎｄｏｌｅ １（ＴＣ－Ｓ ７００１）、Ｙ－３９９８３ ＨＣｌ、Ｎｅｔａｒｓｕｄｉｌ（ＡＲ－１３３２４）２ＨＣｌ、Ｂｅｌｕｍｏｓｕｄｉｌ（ＫＤ０２５）およびＡＴ１３１４８からなる群から選択した少なくとも一種である
   請求項１に記載の培地。
3. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２ ２ＨＣｌ、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１１００）ＨＣｌおよびＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌからなる群から選択した少なくとも一種である
   請求項２に記載の培地。
4. 前記培地中のモノチオグリセロールの最終濃度が、１０μｍｏｌ／Ｌ以上（ただし、１０μｍｏｌ／Ｌは除く。）、５０００μｍｏｌ／Ｌ以下である
   請求項１に記載の培地。
5. 抗生物質および／または抗真菌剤を更に含む
   請求項１に記載の培地。
6. がんが、肺がんである
   請求項１に記載の培地。
7. 前記培地が、がん細胞の保存用の培地であり、
   がん細胞が常温で保存される
   請求項１～６のいずれか一項に記載の培地。
8. がん細胞の初代培養方法であって、該初代培養方法は、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の培地を用いて、生体から採取したがん細胞を培養する培養工程を含む
   初代培養方法。
9. がん細胞の継代培養方法であって、該継代培養方法は、
   請求項８に記載の初代培養方法で培養したがん細胞を、継代時に、２価の金属イオンと結合するキレート剤を用いることで、がん細胞が培養容器の壁面に接着することを低下させた状態でがん細胞を培養容器から取り出し、新しい培地を含む培養容器に移し替える継代工程を含む
   継代培養方法。
10. がん細胞の保存方法であって、該保存方法は、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の培地に、生体から採取したがん細胞を浸漬し、常温で保存する保存工程を含む
    保存方法。
11. 培地がウシ胎児血清を含む
    請求項１０に記載の保存方法。