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JP7734075B2 - 疑似ｆａｂベースの多重特異性結合タンパク質 - Google Patents

疑似ｆａｂベースの多重特異性結合タンパク質

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JP7734075B2 JP2021536777A JP2021536777A JP7734075B2 JP 7734075 B2 JP7734075 B2 JP 7734075B2 JP 2021536777 A JP2021536777 A JP 2021536777A JP 2021536777 A JP2021536777 A JP 2021536777A JP 7734075 B2 JP7734075 B2 JP 7734075B2
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Description

関連出願
本出願は、２０１８年１２月２４日に出願された欧州出願第１８３０６８４０．２号、および２０１９年６月２１日に出願されたＥＰ出願第１９３０５８１３．８号に対する優先権を主張し、それらの内容は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
天然の抗体構造における非対称性の生成は、２つの（例えば、二重特異性抗体）またはより多くの結合特異性を有する多重特異性結合タンパク質の生成のための前提条件である。例えば、異なる非対称結合アームまたはＦａｂ上で１つまたはそれ以上のＦｖを分離することによって、２つの異なる抗原またはエピトープを同時に結合する柔軟性を有する二重特異性抗体を作製することができる。しかしながら、これらの利点にもかかわらず、多種多様な多重特異性抗体技術は、種々の非対称な重鎖および軽鎖の誤対合のために、プロセスおよび製造上の問題に悩まされている。例えば、これらの技術の多くは、いわゆる「軽鎖問題」に悩まされ、２つの異なる軽鎖と重鎖とのランダムな対合は、所望の組合せ以外の種々の組合せの鎖対合を生成する。場合によっては、軽鎖の問題は、両方の抗原またはエピトープへの結合を可能にする共通の軽鎖の使用によって回避できることがある。しかしながら、このフォーマットは、トランスジェニックマウスにおけるデノボ抗体の生成を必要とするため、多くの抗体で不可能なことがあり得る。さらに、ヒト患者由来の広く中和する抗ＨＩＶ抗体のような稀な抗体は、このようなフォーマットに適合させることができない。したがって、誤対合問題に対する代替的で創造的な解決策が依然として必要である。
本開示は、「疑似Ｆａｂ」を形成するために使用される「安定化ノックアウトドメイン」と呼ばれる新規なヘテロ二量体化ドメインの発見に基づく。本明細書に開示されているように、疑似Ｆａｂは、多重特異性結合特性を付与するために、多種多様な結合タンパク質および結合フォーマットに組み込むことができる。ある種の態様では、疑似Ｆａｂ部分は、従来の多重特異性結合タンパク質フォーマットで一般的に生成される望ましくない鎖の誤対合を最小化または排除しながら、所望の多重特異性結合タンパク質の優先的な生成、合成または精製を促進することができる。一態様では、本開示は、結合タンパク質であって、
（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するために第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、（３）標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（４）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記結合タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、結合タンパク質であって、
（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分
を含み、
安定化ノックアウトドメインは、（３）野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（４）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換されることを除いて、疑似Ｆａｂ分子と同一である、前記結合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、
標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した少なくとも第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）
をさらに含む多重特異性結合タンパク質である。
一態様では、本開示は、多重特異性結合タンパク質であって、
ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分
ｂ）（３）標的抗原Ｂと結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）と、（４）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメインとを含む第１のＦａｂ部分
を含む多重特異性結合タンパク質であって、
安定化ノックアウトドメインは、（５）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（６）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは安定化ノックアウトドメインは、（５）野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（６）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換されることを除いて、擬Ｆａｂ分子と同一である、前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
別の態様において、本開示は、多重特異性結合タンパク質であって、
ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）を含む第１の疑似Ｆａｂ部分と、（２）安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含み、ただし、ＣＬドメインと対合したＣＨ１ドメインを含まない、第１の疑似Ｆａｂ部分であって、
安定化ノックアウトドメインは、（３）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（４）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは安定化ノックアウトドメインは、（３）野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（４）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインと置換される以外は、疑似Ｆａｂ分子と同一である、第１の疑似Ｆａｂ部分；
ｂ）（５）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）と、（６）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメインとを含む第１のＦａｂ部分；ならびに
ｃ）第１のＦａｂ部分および第１の疑似Ｆａｂ部分を作動可能に連結するリンカー部分
を含む前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、多重特異性結合タンパク質であって、
ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）を含む第１の疑似Ｆａｂ部分と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分；
ｂ）（３）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）と、（４）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメインとを含む第１のＦａｂ部分であって、
安定化ノックアウトドメインは、（５）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（６）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは安定化ノックアウトドメインは、（５）野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（６）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換される以外は、擬Ｆａｂ分子に同一である第１のＦａｂ部分；
ｃ）第１のＦａｂ部分および第１の疑似Ｆａｂ部分を作動可能に連結するリンカー部分
を含む前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、リンカー部分は１つまたはそれ以上の重鎖上にある。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、標的抗原Ｃに結合する第３の機能的抗原結合部位を形成するための第３のＶＨドメイン（ＶＨｃ）と対合した第３のＶＬドメイン（ＶＬｃ）をさらに含む。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、独立して１つまたは２つの疑似Ｆａｂ部分および１つまたは２つのＦａｂ部分を含む。
一部の実施形態では、リンカー部分はペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは１～１０である）のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。
一部の実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは全長ＩｇＧ抗体を含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、全長ＩｇＧ抗体のＦｃドメインまたはその機能性断片を含む。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、以下の群：
（ａ）ＶＨａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨｂ－Ｌ２－ＶＨＸおよびＶＬａ－ＣＬおよびＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬＸ；
（ｂ）ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨｂ－ＣＨ１およびＶＬａ－Ｌ３－ＶＬＸおよびＶＬｂ－ＣＬ；
（ｃ）ＶＨａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨａ－ＣＨ１およびＶＨｂ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－Ｌ４－ＶＨＸ、ならびに２つの鎖ＶＬｂ－Ｌ５－ＶＬＸ
（ａ）および（ｂ）の鎖は、１回または２回存在することがおよび２つの鎖ＶＬａ－ＣＬ
のうちの１つから選択される別々のタンパク質鎖を含み；
でき、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、独立して同一であるかまたは異なるリンカーである。
本開示は、多重特異性抗体であって、
ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）；
（２）第１のジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）；
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の疑似Ｆａｂ部分であって、
第１のｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含むか、あるいは（ｉ）野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換される以外は、疑似Ｆａｂ分子と同一である第１の疑似Ｆａｂ部分；
ｂ）（１）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）；
（２）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメイン；および
（３）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第１のＦａｂ部分
を含む前記多重特異性抗体を提供する。
一部の実施形態では、第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）は、疑似Ｆａｂ部分のＶＨＸドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）は、第１のＦａｂ部分の第１のＣＨ１ドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、第１および第２のヘテロ二量体化ドメインは、第１および第２のＦｃドメインを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、一般的な構造ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、１つまたはそれ以上のノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）突然変異を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインの１つは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含む第１のＣＨ３ドメインを含み、他方のＦｃドメインは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異の一方または両方を含む第２のＣＨ３ドメインを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｈ４３５Ｒおよび／またはＹ４３６Ｆ突然変異を含む。
一部の実施形態では、第１の疑似Ｆａｂ部分は、式：
（Ｉａ）Ｎ－ＶＨａ－Ｌ１－ＶＨＸ－Ｃ
で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
（ＩＩａ）Ｎ－ＶＬａ－Ｌ２－ＶＬＸ－Ｃ
で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、
式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す。
一部の実施形態では、第１の疑似Ｆａｂ部分は、式：
（Ｉｂ）Ｎ－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨａ－Ｃ
で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
（ＩＩｂ）Ｎ－ＶＬＸ－Ｌ２－ＶＬａ－Ｃ
で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、
式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す。
一部の実施形態では、第１の疑似Ｆａｂ部分は、式：
（Ｉｃ）Ｎ－ＶＬａ－Ｌ１－ＶＨＸ－Ｃ
で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
（ＩＩｃ）Ｎ－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＬＸ－Ｃ
で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、
式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す。
一部の実施形態では、第１の疑似Ｆａｂ部分は、式：
（Ｉｄ）Ｎ－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＬａ－Ｃ
で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、式：
（ＩＩｄ）Ｎ－ＶＬＸ－Ｌ２－ＶＨａ－Ｃ
で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
を含み、
式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す。
一部の実施形態では、標的抗原Ａ、標的抗原Ｂおよび標的抗原Ｃのうちの少なくとも２つは、異なる標的抗原である。
一部の実施形態では、標的抗原のうちの少なくとも１つは細胞表面受容体のリガンドであり、標的抗原のうちの少なくとも１つは細胞表面受容体である。
一部の実施形態では、抗原結合部位は異なる抗体に由来する。
一部の実施形態では、標的抗原Ａ、標的抗原Ｂおよび標的抗原Ｃは同じ標的抗原である。
一部の実施形態では、抗原結合部位は同じ標的抗原上の異なるエピトープに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合部位は同じ標的抗原上の同じエピトープに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合部位は同じ抗体に由来する。
一部の実施形態では、疑似Ｆａｂ部分の融点（Ｔｍ）は、参照Ｆａｂ分子よりも少なくとも４℃高い。
一部の実施形態では、操作された鎖間ジスルフィド結合はＶＨ４４Ｃ－ＶＬ１００Ｃである。
一部の実施形態では、操作された鎖間ジスルフィド結合はＶＨ１０５Ｃ－ＶＬ４３Ｃである。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、疑似Ｆａｂ部分のＶＨＸドメインに存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ３に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ２に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ１に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、疑似Ｆａｂ部分のＶＬＸドメインに存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ３に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ２に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ１に存在する。
一部の実施形態では、疑似Ｆａｂ部分のＶＨＸドメインは、配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＬＸ／ＶＨＸ対は、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
（ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
からなる群から選択される。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、結合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されている１つまたはそれ以上のさらなる結合ドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の追加の結合ドメインは、第１または第２の疑似Ｆａｂ部分のＮ末端に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の追加の結合ドメインは、第１または第２のＦａｂ部分のＮ末端に作動可能に連結されている。
別の態様において、本開示は、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む多重特異性結合タンパク質であって、
（ａ）第１のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第２のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第３のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第４のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１およびＬ２は、独立して同一であるかまたは異なるアミノ酸リンカーである。
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記多重特異性結合タンパク質を提供する。
別の態様において、本開示は、４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
（ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第５のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ１［Ｖ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第６のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＶＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
（ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第５のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［Ｖ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第６のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ２［ＶＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
（ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第５のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ４－ＶＨＸ－ＦＣ１［Ｖ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第６のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ５－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＶＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し、
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様において、本開示は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
（ａ）ポリペプチドは、次の式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第２のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第３のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬｃ－Ｌ４－ＣＬ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第４のポリペプチドは、式：
ＶＨｃ－Ｌ５－ＶＨｂ－Ｌ６－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｃは第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｃは第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＶＬＸは第１の安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは第１の安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）第３のＶＬドメイン（ＶＬｃ）は第３のＶＨドメイン（ＶＨｃ）と対合して、標的抗原Ｃに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（４）式ＩＩＩのポリペプチドおよび式ＩＶのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対（ＣＯＤＶ）を形成し；
（５）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合した、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様において、本開示は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
（ａ）ポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第２のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第３のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬｃ－Ｌ４－ＣＬ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第４のポリペプチドは、式：
ＶＨｃ－Ｌ５－ＶＨｂ－Ｌ６－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｃは第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｃは第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＶＬＸは第１の安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは第１の安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）第３のＶＬドメイン（ＶＬｃ）は第３のＶＨドメイン（ＶＨｃ）と対合して、標的抗原Ｃに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（４）式ＩＩＩのポリペプチドおよび式ＩＶのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対（ＣＯＤＶ）を形成し；
（５）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）参照Ｆａｂ分子の標的抗原に対するその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む、前記抗原結合タンパク質を提供する。
他の態様では、一部の実施形態は、本明細書に記載されるすべての結合タンパク質に関連し、ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）野生型ドメインに対する標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換されることを除いて、疑似Ｆａｂ分子と同一である。これらの実施形態では、標的抗原への結合は、当該技術分野において公知である方法、例えば、限定されないが、表面プラズモン共鳴よって測定され、熱安定性は、当該技術分野において公知である方法、例えば、限定されないが、示差走査熱量測定によって測定される。
一部の実施形態では、ＦＣ１およびＦＣ２ドメインは、１つまたはそれ以上のノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）突然変異を含み、突然変異は、ポリペプチドのＦｃドメインヘテロ二量体化を促進する。
一部の実施形態では、ＦＣ１またはＦＣ２の一方は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含む第１のＣＨ３ドメインを含み、ＦＣ１またはＦＣ２の他方は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異の一方または両方を含む第２のＣＨ３ドメインを含み、突然変異はＦｃドメインヘテロ二量体化を促進する。
一部の実施形態では、ＦＣ１またはＦＣ２ドメインは、Ｈ４３５Ｒおよび／またはＹ４３６Ｆ突然変異を含む。
一部の実施形態では、標的抗原Ａ、標的抗原Ｂおよび標的抗原Ｃのうちの少なくとも２つは、異なる標的抗原である。
一部の実施形態では、標的抗原の少なくとも１つは細胞表面受容体のリガンドであり、標的抗原の少なくとも１つは細胞表面受容体である。
一部の実施形態では、抗原結合部位は異なる抗体に由来する。
一部の実施形態では、標的抗原Ａ、標的抗原Ｂおよび標的抗原Ｃは同じ標的抗原である。
一部の実施形態では、抗原結合部位は同じ標的抗原上の異なるエピトープに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合部位は同じ標的抗原上の同じエピトープに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合部位は同じ抗体に由来する。
一部の実施形態では、疑似Ｆａｂ部分の融点（Ｔｍ）は、参照Ｆａｂ分子よりも少なくとも４℃高い。
一部の実施形態では、操作された鎖間ジスルフィド結合はＶＨ４４Ｃ－ＶＬ１００Ｃである。
一部の実施形態では、操作された鎖間ジスルフィド結合はＶＨ１０５Ｃ－ＶＬ４３Ｃである。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、疑似Ｆａｂ部分のＶＨＸドメインに存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ３に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ２に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ１に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、疑似Ｆａｂ部分のＶＬＸドメインに存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ３に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ２に存在する。
一部の実施形態では、標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異のうちの少なくとも１つは、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ１に存在する。
一部の実施形態では、疑似Ｆａｂ部分のＶＨＸドメインは、配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＬＸ／ＶＨＸ対は、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
（ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
からなる群から選択される。
別の態様において、本開示は、多重特異性結合タンパク質における重鎖－軽鎖の誤対合を低減させるための安定化ノックアウトドメインの使用であって、安定化ノックアウトドメインは、（３）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異を含むＶＨＸおよびＶＬＸドメインと、（４）参照Ｆａｂ分子に対する疑似Ｆａｂの増大した熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換されることを除いて、疑似Ｆａｂ分子と同一である、前記使用を提供する。
一部の実施形態では、操作された鎖間ジスルフィド結合はＶＨ４４Ｃ－ＶＬ１００Ｃである。
一部の実施形態では、操作された鎖間ジスルフィド結合はＶＨ１０５Ｃ－ＶＬ４３Ｃである。
一部の実施形態では、疑似Ｆａｂ部分のＶＨＸドメインは、配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＬＸ／ＶＨＸ対は、
（ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
（ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、
配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
からなる群から選択される。
一部の実施形態では、疑似Ｆａｂは、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを欠いている。
一部の実施形態では、結合タンパク質の１つまたはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。一部の実施形態では、結合タンパク質の１つまたはそれ以上をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子のキットが提供される。
一部の実施形態では、核酸分子を含む発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、核酸分子のキットを含む発現ベクターのキットが提供される。
一部の実施形態では、核酸分子または発現ベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、核酸分子のキットまたは発現ベクターのキットを含む単離された宿主細胞が提供される。
一部の実施形態では、結合タンパク質を生成する方法であって、宿主細胞を結合タンパク質が発現されるような条件下で培養すること；および宿主細胞から結合タンパク質を精製することを含む前記方法が提供される。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体および治療有効量の多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、薬剤として使用するための多重特異性結合タンパク質が提供される。
一部の実施形態では、抗原活性が有害である障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の多重特異性結合タンパク質を投与することを含む前記方法が提供される。
上記される本発明の概要は、非限定的であり、開示された組成物および方法の他の特徴および利点は、本発明の以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
配列の簡単な説明
配列番号１：トラスツズマブの可変軽鎖配列。
配列番号２：トラスツズマブの可変重鎖配列。
配列番号３：トラスツズマブｋｏ変異体１の可変重鎖配列。
配列番号４：トラスツズマブｋｏ変異体２の可変重鎖配列。
配列番号５：トラスツズマブｋｏ変異体３の可変重鎖配列。
配列番号６：抗ＩＬ１３－－ＶＬ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号７：抗－ＩＬ１３－－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－抗－Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号８：抗ＩＬ１３－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号９：抗ＩＬ１３－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号１０：抗ＩＬ１３－ＶＬ３－ＩＧＫ。
配列番号１１：抗ＩＬ１３－ＶＨ２－ＩＧＨＧ１。
配列番号１２：抗ＴＮＦアルファ－ＶＬ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号１３：抗ＴＮＦアルファ－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号１４：抗ＴＮＦアルファ－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号１５：抗ＴＮＦアルファ－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号１６：抗ＴＮＦａ－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号１７：抗ＴＮＦａ－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号１８：抗ＩＬ６Ｒ－ＶＬ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号１９：抗ＩＬ６Ｒ－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号２０：抗ＩＬ６Ｒ－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ
配列番号２１：抗ＩＬ６Ｒ－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号２２：抗ＩＬ６Ｒ－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号２３：抗ＩＬ６Ｒ－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号２４：抗ＣＴＬＡ４－ＶＬ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号２５：抗ＣＴＬＡ４－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号２６：抗ＣＴＬＡ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号２７：抗ＣＴＬＡ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号２８：抗ＣＴＬＡ４－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号２９：抗ＣＴＬＡ４－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号３０：抗ＰＤ１－ＶＬ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号３１：抗ＰＤ１－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号３２：抗ＰＤ１－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ
配列番号３３：抗ＰＤ１－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号３４：抗ｈｕＰＤ－１－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号３５：抗ｈｕＰＤ－１－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号３６：抗ＩＬ４－ＶＬ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号３７：抗ＩＬ４－ＶＨ－Ｇ４Ｓ－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号３８：抗ＩＬ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号３９：抗ＩＬ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号４０：抗ＩＬ４－ＶＬ１－ＩＧＫＣ。
配列番号４１：抗ＩＬ４－ＶＨ１－ＩｇＧ１。
配列番号４２：抗ＰＤ１－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号４３：抗ＰＤ１－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号４４：抗ＣＴＬＡ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号４５：抗ＣＴＬＡ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号４６：抗ＩＬ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号４７：抗ＩＬ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号４８：抗ＩＬ１３－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号４９：抗ＩＬ１３－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－ＤＫＴＨＴ－Ｈｉｓ６。
配列番号５０：抗ＩＬ１３－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号５１：抗ＩＬ１３－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－ＶＨ＿Ｖａｒ１－Ｇ４４Ｃ）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１。
配列番号５２：抗ＩＬ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号５３：抗ＩＬ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１（ノブ）。
配列番号５４：抗ＰＤ１－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号５５：抗ＰＤ１－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１（ホール－ＲＦ）。
配列番号５６：抗ＩＬ１３－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号５７：抗ＩＬ１３－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１（ノブ）。
配列番号５８：抗ＰＤ１－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号５９：抗ＰＤ１－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１（ホール－ＲＦ）。
配列番号６０：抗ＰＤ１－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号６１：抗ＰＤ１－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１（ノブ）。
配列番号６２：抗ＩＬ１３－ＶＬ ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号６３：抗ＩＬ１３－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１（ホール－ＲＦ）。
配列番号６４：抗ＣＴＬＡ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号６５：抗ＣＴＬＡ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１（ノブ）。
配列番号６６：抗ＰＤ１－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号６７：抗ＰＤ１－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１（ホール－ＲＦ）。
配列番号６８：抗ＩＬ４－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号６９：抗ＩＬ４－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１（ノブ）。
配列番号７０：抗ＩＬ１３－ＶＬ ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号７１：抗ＩＬ１３－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１（ホール－ＲＦ）。
配列番号７２：抗ＰＤ１－ＶＬ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｑ１００Ｃ）－ＶＬ。
配列番号７３：抗ＰＤ１－ＶＨ－（Ｇ４Ｓ）２－抗Ｈｅｒ２－（トラスツズマブ－Ｇ４４Ｃ－Ｖａｒ２）－ＶＨ－Ｆｃ－ｈｕＩｇＧ１（ノブ）。
配列番号７４：抗ＰＤ１－ＶＬ－ｈｕＩＧＫＣ。
配列番号７５：抗ＰＤ１－ＶＨ－ｈｕＩｇＧ１（ホール－ＲＦ）。
配列番号７６：ｄｓ ｋｏトラスツズマブの可変軽鎖配列。
配列番号７７：ｄｓ ｋｏトラスツズマブ変異体１の可変重鎖配列。
配列番号７８：ｄｓ ｋｏトラスツズマブ変異体２の可変重鎖配列。
配列番号７９：ｄｓ ｋｏトラスツズマブ変異体３の可変重鎖配列。
配列番号８０：抗ＴＣＲα／β×抗ＣＤ１２３野生型
配列番号８１：抗ＴＣＲα／β×抗ＣＤ１２３－ｄｓＴｒａｓＫＯ２
配列番号８２：抗ＴＣＲα／β－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＣＤ１２３
配列番号８３：抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３野生型
配列番号８４：抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３－ｄｓＴｒａｓＫＯ２
配列番号８５：抗ＣＤ３ε－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＣＤ１２３
配列番号８６：抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３野生型
配列番号８７：抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３－ｄｓＴｒａｓＫＯ２
配列番号８８：抗ＣＤ３ε－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＣＤ１２３
配列番号８９：抗ＴＣＲα／β×抗ＴＮＰ陰性対照－野生型
配列番号９０：抗ＴＣＲα／β×抗ＴＮＰ－ｄｓＴｒａｓＫＯ２陰性対照
配列番号９１：抗ＴＣＲα／β－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＴＮＰ陰性対照
配列番号９２：抗ＴＮＰ×抗ＣＤ１２３陰性対照－野生型
配列番号９３：抗ＴＮＰ×抗ＣＤ１２３－ｄｓＴｒａｓＫＯ２陰性対照
配列番号９４：抗ＴＮＰ－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＣＤ１２３陰性対照
配列番号９５：抗ＣＤ３ε×抗ＴＮＰ陰性対照－野生型
配列番号９６：抗ＣＤ３ε×抗ＴＮＰ－ｄｓＴｒａｓＫＯ２陰性対照
配列番号９７：抗ＣＤ３ε－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＴＮＰ陰性対照
配列番号９８：抗ＣＤ３ε×抗ＴＮＰ陰性対照－野生型
配列番号９９：抗ＣＤ３ε×抗ＴＮＰ－ｄｓＴｒａｓＫＯ２陰性対照
配列番号１００：抗ＣＤ３ε－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×ｘ抗ＴＮＰ陰性対照
本発明の上述および他の特徴ならびに利点は、添付の図面と関連して取られる例示的な実施形態の以下の詳細な説明からより十分に理解される。特許または出願ファイルは、色を付して作成された少なくとも１つの図面を含む。この特許または特許出願公開の写しおよび色図面（複数可）は、請求および必要な手数料の納付があったとき、特許庁によって提供される。
図１Ａ～図１Ｂは、ＣＨ１／ＣＬ対をジスルフィド安定化ノックアウトドメイン（ｄｓＫＯ）で置換した疑似Ｆａｂ断片を含む二量体二重特異性タンデム分子を図式的に示す図である。タンデム－（Ｆｖ－Ｆａｂ×Ｆｖ－疑似Ｆａｂ）分子を図１Ａに示し、タンデム－（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ×Ｆｖ－Ｆａｂ）分子を図１Ｂに示す。 例示的な二量体二重特異性ＩｇＧ分子（（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ）×（Ｆｖ－Ｆａｂ）－Ｆｃ））を図式的に示す図である。ジスルフィド安定化ノックアウトドメイン（ｄｓＫＯ）は、ＩｇＧ分子の１つのＦａｂアームのＣＨ／ＣＬドメインに置換する。ペプチドリンカー（例えば、Ｇ４Ｓまたは（Ｇ４Ｓ）２）は、第１の抗原結合部位（Ｆｖ）をｄｓＫＯドメインに結合させて、抗原標的Ａに結合する疑似Ｆａｂ部分を形成する。ノブ－イントゥ－ホール（ＫＩＨ）またはＲＦ突然変異を有するＦｃヘテロ二量体化ドメインは、疑似Ｆａｂ部分を抗原標的Ｂに結合する第２のＦａｂ結合アームに連結する。 図３Ａ～図３Ｃは、ＣＨ１／ＣＬのジスルフィド安定化トラスツズマブノック（「ｄｓＴｒａｓｔＫＯ」）ＶＨ／ＶＬ置換を含む抗体構築物（図３Ｂ）と比較したＣＨ１／ＣＬのトラスツズマブＷＴ ＶＨ／ＶＬ置換を含む抗体構築物（図３Ａ）のモノマー画分、ならびに両方の構築物の熱安定性（図３Ｃ）を図式的に示す図である。 ＨＥＲ２に結合するトラスツズマブのＰＤＢ構造１Ｎ８Ｚを図式的に示す図である。ＨＥＲ２（Ｒ５０、Ｒ５９、Ｙ３３およびＹ１０３）への結合を消失させる４つの不活性化突然変異の位置が示される。 図５Ａ～図５Ｂは、ｄｓＴｒａｓｔｕＫＯ変異体１～３がもはやＨＥＲ２に結合しないことを示す結合実験の結果をグラフで示す図である。 図６Ａ～図６Ｂは、実験においてある種の対照として使用される疑似ＩｇＧおよび疑似Ｆａｂ構築物を示す図である。 図７Ａ～図７Ｄは、ある種の例示的な実施形態による代表的な二重特異性フォーマットおよび精製結果を示す図である。図７Ａは、ＩｇＧ足場内の個々のドメインの配置を示す。Ｆｖ１（抗ＩＬ４）は、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介してｄｓＴｒａｓＫＯ２のＶＬ／ＶＨに融合される。Ｆｖ２（抗ＩＬ１３）は野生型立体配置を保持する。図７Ｂは、４～１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ ＭＯＰＳドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて、抗体の還元型（１つの軽鎖および１つの重鎖）および酸化型を示す。分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いた生成物の純度を図７Ｃに示す。Ｊｅｔ ＳｔｒｅａｍデュアルＥＳＩインターフェースおよびＡｇｉｌｅｎｔ １２９０／１２６０インフィニティＬＣシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５４０超高精細度（ＵＨＤ）Ｑ－ＴＯＦを用いたインタクト質量分析により、分子の完全性を検証した（図７Ｄ）。 分析用疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の結果を示す図であり、ｄｓＴｒａｓＫＯ２－二重特異性構築物が正しく対合し、予想外の種を含まなかったことを示す。 図６Ａの超微細構造を有する疑似Ｆａｂ ＩＬ１３－ｄｓＴｒａｓＫＯ２構築物の結晶構造を図式的に示す図である。この構造を３．７５Åで解析した。構造は、ＴｒａｓＫＯ２－ＩＬ１３疑似Ｆａｂ（薄灰色）およびＦａｂ抗ＩＬ１３（濃灰色）のＩＬ１３－ＶＨ／ＶＬドメインの重ね合わせを示す。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＣＨ１／ＣＬ対をジスルフィド安定化ノックアウトドメイン（ｄｓＫＯ）で置換した疑似Ｆａｂ断片を含む二量体二重特異性タンデム分子を図式的に示す図である。タンデム－（Ｆｖ－Ｆａｂ×Ｆｖ－疑似Ｆａｂ）－ＩｇＧ分子を図１０Ａに示し、タンデム－（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ×Ｆｖ－Ｆａｂ）－ＩｇＧ分子を図１０Ｂに示す。 図１１Ａ～１１Ｂは、ＣＨ１／ＣＬ対をジスルフィド安定化ノックアウトドメイン（ｄｓＫＯ）で置換した疑似Ｆａｂ断片を含む二量体二重特異性タンデム分子を図式的に示す図である。（（（（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ）［ＨＣ］－（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ））×（（Ｆｖ－Ｆａｂ）［ＨＣ］－（Ｆｖ－Ｆａｂ）））－Ｆｃ分子は、ノブ－イントゥ－ホール（ＫＩＨ）およびＲＦ突然変異を有するＦｃヘテロ二量体化ドメインを有するものを図１１Ａに示され、ＲＦ突然変異のみを有するものを図１１Ｂに示される。 図１２Ａ～図１２Ｄは、従来のＩｇＧ抗体（ポガリズマブ）の各Ｆｖ２ドメイン（第２の標的抗原Ｂ、すなわちＯｘ４０に対する結合特異性を有する）に、Ｆｖ１ドメイン（第１の標的抗原Ａ、すなわちＧＩＴＲに対する結合特異性を有する）およびｄｓＴｒａｓＫＯドメインを含む第１の疑似Ｆａｂが付加された、代表的な二重特異性タンデムＩｇＧ設計を示す図である。図１２Ａは、ＩｇＧ足場内の個々のドメインの配置を示す。Ｆｖ１（抗ＧＩＴＲ）は、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介してｄｓＴｒａｓＫＯ２のＶＬ／ＶＨに融合される。Ｆｖ２（抗Ｏｘ４０）は野生型立体配置を保持する。Ｆｖ１－ｄｓＴｒａｓＫＯ２は、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介してＦｖ２－Ｃｋ／ＣＨ１に融合される。図１２Ｂは、４～１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ ＭＯＰＳドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて、還元型（２つの軽鎖および１つの重鎖）および酸化型の抗体を示す。分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いた生成物の純度を図１２Ｃに示す。Ｊｅｔ ＳｔｒｅａｍデュアルＥＳＩインターフェースおよびＡｇｉｌｅｎｔ １２９０／１２６０インフィニティＬＣシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５４０超高精細度（ＵＨＤ）Ｑ－ＴＯＦを用いたインタクト質量分析により、分子の完全性を検証した（図１２Ｄ）。 図１３Ａ～図１３Ｄは、代表的な三重特異性ＣＯＤＶ ＩｇＧ設計を示す図であり、Ｆｖ３ドメイン（第１の標的抗原Ａ、すなわちＣＤ１３７に対する結合特異性を有する）およびｄｓＴｒａｓＫＯドメインを含む第１の疑似Ｆａｂは、ＣＯＤＶアーム（第２の標的抗原Ｂ、すなわちＯｘ４０に対する結合特異性（Ｆｖ１）および第３の標的抗原Ｃ、すなわちＰＤ１に対する結合特異性（Ｆｖ２）を有する）と対合する。図１３Ａは、ＣＯＤＶ ＩｇＧ足場内の個々のドメインの配置を示す。ＣＯＤＶアーム上のＦｖ１（抗Ｏｘ４０）およびＦｖ２（抗ＰＤ１）を野生型ラムダおよびＣＨ１ドメインに融合させる。Ｆａｂアーム上のＦｖ３（抗ＣＤ１３７）を（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介してｄｓＴｒａｓＫＯ２のＶＬ／ＶＨに融合させる。図１３Ｂは、４～１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ ＭＯＰＳドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いたＣＯＤＶ抗体の還元型（２つの軽鎖および２つの重鎖）および酸化型を示す。分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いた生成物の純度を図１３Ｃに示す。Ｊｅｔ ＳｔｒｅａｍデュアルＥＳＩインターフェースおよびＡｇｉｌｅｎｔ １２９０／１２６０インフィニティＬＣシステムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５４０超高精細度（ＵＨＤ）Ｑ－ＴＯＦを用いたインタクト質量分析により、分子の完全性を検証した（図１３Ｄ）。 ｄｓＴｒａｓＫＯ２ノックアウト二重特異性分子との正しい軽鎖対合を確実にするために使用される２段階精製プロセスの概略図を示す。 図１５Ａ～図１５Ｂは、二重特異性抗体抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３と共インキュベートされたＴＨＰ－１標的細胞に対するヒト汎Ｔ細胞の細胞毒性アッセイを示す図である。図１５Ａは、ＩＤ番号３３、３４および３５を有する二重特異性抗体に対応し、陰性対照は４５および４６である。図１５Ｂは、ＩＤ番号３６、３７および３８を有する二重特異性抗体に対応し、陰性対照は４７および４８である。Ｔエフェクター細胞およびＣＦＳＥ標識されたＴＨＰ－１標的細胞を１０：１のエフェクター対標的比で播種し、それぞれの二重特異性分子（１０ｎＭ～０ｎＭ）の連続希釈液とともに２０時間、３７℃で同時インキュベートした。死細胞を７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより測定した。細胞毒性活性は、死ＴＨＰ－１標的細胞のパーセンテージ（７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ二重陽性）に基づいて計算した。データは、２つの代表的な健康なドナーの平均として、二重特異性分子の濃度［ｐＭ］に対する死標的細胞［％］を示す。
Ｉ．定義
開示をより容易に理解できるように、選択された用語を以下に定義する。
本明細書で使用される場合、２０個の慣用的なアミノ酸およびそれらの略語は慣用的な用法に従う。２０個の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）；非天然アミノ酸、例えば、α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸および他の非慣用的アミノ酸はまた、本発明の結合タンパク質のポリペプチド鎖に適した成分であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４－ヒドロキシプロリン、ｙ－カルボキシグルタミン酸、ｃ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ｃ－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、ｕ－Ｎ－メチルアルギニン、ならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記において、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシル末端方向であり、標準的な用法および慣例に従う。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる（表１を参照されたい）。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを同じクラスのうちの別のメンバーとの交換を伴うことができる。保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を包含することができ、典型的には、生体系における合成によるのではなく、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド模倣物、およびアミノ酸残基の他の復帰または反転の形態が含まれる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのうちのメンバーと交換することを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「突然変異」または「突然変異型」とは、１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換によるアミノ酸配列の変化を指す。突然変異は、所定の配列、例えば、エピトープ１を特異的に認識するＶＬ１および／またはＶＨ１対のアミノ酸配列に対して導入される。用語「非突然変異」は、機能的特性を示す任意のアミノ酸配列、例えば、依然として結合特性を示す任意の配列を指す。これは、以下の通り示される。ＶＨ１／ＶＬ１は、ＶＨ１／ＶＬ１がエピトープに特異的に結合しないように突然変異される。このＶＨ１／ＶＬ１の非変異型は、依然としてエピトープ１に特異的に結合する。したがって、任意のエピトープに結合する抗体のすべてのＶＨ／ＶＬドメインは、本発明の足場タンパク質として役立つように突然変異されるのに適している。
本明細書で使用される場合、用語「変異体」とは、それが由来する、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を指す。２つの配列間の同一性パーセントの決定は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻、５８７３～５８７７頁、１９９３年の数学的アルゴリズムを用いて達成される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３～４１０頁のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻、３３８９～３４０２頁に記載されているように使用する。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが使用される。あるいは、変異体はまた、最大２０、１５、１０、５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、特に保存的アミノ酸置換を有するものとして定義することができる。保存的置換は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。アミノ酸の物理的および化学的特性の概要を上記の表１に示す。特定の実施形態では、保存的置換は、共通の（すなわち、カラム１および／または２の）表１に従う少なくとも１つの特性を有するアミノ酸で行われる置換である。用語「変異体」はまた、断片を含む。断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端欠失が、合計で最大２０、１５、１０、５、４、３、２または１個のアミノ酸（複数可）を有する。さらにまたは代替的に、変異体は、例えば、合計で最大５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１個のアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸付加によって修飾される。
本明細書で使用される場合、用語「結合タンパク質」または「結合ポリペプチド」とは、対象の標的抗原（例えば、ヒト抗原）への選択的結合に関与する少なくとも１つの結合部位を含むポリペプチド（例えば、抗体またはその断片）を指す。結合部位の例としては、限定されないが、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、またはリガンドの受容体結合部位が挙げられる。ある種の態様では、結合ポリペプチドは、複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の）結合部位を含む。ある種の態様では、結合タンパク質は治療用酵素ではない。
本明細書で使用される場合、用語「Ｈｅｒ２」または「ＨＥＲ２」とは、上皮細胞増殖因子受容体ファミリーのメンバーであるヒト上皮細胞増殖因子受容体２を指す。
本明細書で使用される場合、用語「結合タンパク質」とは、少なくとも１つの抗原に特異的に結合することができる天然に存在しないかまたは組換えもしくは操作された分子を指す。特定の実施形態では、結合タンパク質は、抗原に特異的に結合する少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対を含む。
単一宿主細胞における２つの軽鎖および２つの重鎖の共発現による二重特異性結合タンパク質の生成は、所望の二重特異性結合タンパク質の収率が低く、密接に関連した誤対合結合タンパク質汚染物質を除去することが困難であるため、非常に困難であり得る（Ｓｕｒｅｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３巻、７９８９～７９９３頁１９８６年）。これは、重鎖がホモ二量体、ならびに所望のヘテロ二量体を形成するためであり、本明細書では「重鎖対合問題」と称する。さらに、軽鎖は、本明細書では「軽鎖対合問題」と称する、非同族重鎖と誤対合し得るため、２つの抗体の共発現は、所望の二重特異性結合タンパク質に加えて、最大９つの望ましくない種を生じさせ得る。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体化ドメイン」とは、それぞれの軽鎖または重鎖の誤対合を防止しながら、所望のタンパク質をもたらすように軽鎖およびそれらの同族重鎖の正しいアセンブリを容易にし、指向しまたは強制する二重または多重特異性結合タンパク質のサブユニットを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ二量体化Ｆｃ」または「ヘテロ二量体化Ｆｃの機能的断片」とは、定常ドメインの突然変異体形態、例えば、ＣＨ２－ＣＨ３またはＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４の突然変異体形態を指し、それはもはやホモ二量体を形成しないが、対応する突然変異型Ｆｃ部分を有するヘテロ二量体を形成するという点で、天然に存在するＦｃ部分に関して突然変異型である。したがって、この用語は、ヘテロ二量体を形成する２つの鎖のうちの１つの部分を指す。このような部位のいくつかは、当該技術分野で公知であり、例えば、ノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）変異体またはＥＶ－ＲＷＴ変異体を含む。
Ｒｉｄｇｅｗａｙおよび共同研究者は、一方のＣＨ３界面上の小さな側鎖をより大きな側鎖に置換してノブを作り、他方のＣＨ３ドメイン上の大きな側鎖をより小さな側鎖に置き換えて孔を生成することにより、ヘテロ二量体アセンブリに有利なＣＨ３界面を生成した。このような突然変異体の試験は、選択的ヘテロ二量体化を示した。この元のノブ－イントゥ－ホール突然変異をさらに拡張して、ジスルフィド結合形成を可能にするさらなる置換を試験する二重特異性ＩｇＧ抗体を生成するために使用されたファージディスプレイによりさらに適切な組合せを同定した。ノブ－イン－ホール変異体は、本明細書に参考により組み入れられる米国特許第５，７３２，１６８号および米国特許第８，２１６，８０５号にさらに記載される。したがって、ある実施形態では、１つのＦＣドメインまたはヘテロ二量体化ドメインのＣＨ３ドメインは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、別のＦＣドメインまたはヘテロ二量体化ドメインのＣＨ３ドメインは、突然変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含む（アミノ酸位置はＩｇＧ１配列を参照することによって示される）。
本明細書で使用される場合、用語「ホモ二量体化ドメイン」とは、２つの同様のドメイン、例えば２つの重鎖のホモ二量体化を媒介するドメインを指す。重鎖対合は、定常領域の最後のドメイン、すなわち、ＩｇＧ分子中のＣＨ３によって媒介され、高親和性ホモ二量体複合体（約１０ｐＭのＫＤ）を形成する。重鎖のアセンブリ後に形成される２本の重鎖の共有結合に関与するヒンジ領域には、さらなる相互作用が存在する。ＣＨ３ホモ二量体における相互作用は、ヒトγ１のＣＨ３に関して示されるように、ＣＨ３界面で約１６残基が関与し、６残基（Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｆ４０５、Ｙ４０７およびＫ４０９）が界面の中心に形成されたパッチが安定性に強く寄与している。ホモ二量体化ドメインは、限定されないが、Ｆｃ領域およびそのエフェクター修飾された変異体またはいずれかの断片、ならびにＣＨ２ドメインまたはその断片、ＣＨ３ドメインまたはその断片、ＣＨ４ドメインまたは断片などを含む。
天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含む。このような四量体は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対は、１つの全長「軽鎖」（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重鎖」（典型的には約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。用語「重鎖」および「軽鎖」とは、本明細書で使用される場合、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に関与する約１００～１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与する定常ドメインを規定する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖ＩｇＧ免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインはカルボキシル末端にある。
ヒト軽鎖は、典型的にはカッパおよびラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡも同様に、限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに細分される。完全長の軽鎖および重鎖内では、可変ドメインおよび定常ドメインは、典型的には、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、すべての目的で全体として参照により組み入れられる基本免疫学（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９年）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって接続された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープへの結合を可能にし得る。アミノ末端からカルボキシル末端まで、軽鎖と重鎖可変ドメインの両方は、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」とは、抗原に結合することができる単一の可変領域内に存在する３つのＣＤＲのグループを指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムによって異なるように定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７年）および（１９９１年））によって記載されたシステムは、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基番号を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと呼ばれる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．Ａｆｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１～１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７７～８３頁）は、アミノ酸配列レベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤ内のある種のサブ部分が、ほぼ同一のペプチド骨格構造を採用することを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と命名され、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を示す。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする境界を有するＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ばれる。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ、１９９５年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９巻：１３３～３９頁；ＭａｃＣａｌｌｕｍ、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２巻（５号）：７３２～４５頁；Ｌｅｆｒａｎｃ、２００３年、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７巻：５５～７７頁によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書のシステムの１つに厳密に従うことはできないが、それにもかかわらず、特定の残基もしくは残基のグループ、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響しないという予測または実験的知見に照らして、それらは短縮または延長されるが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができるが、ある種の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を用いた予測ＣＤＲの同定は、当該分野において、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２巻、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．、Ｄｉｋｅｌ Ｓ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、３３～５１頁（２０１０年）において周知である。重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列もまた検査して、他の慣用的方法、例えば、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の公知のアミノ酸配列と比較して、配列超可変性の領域を決定することによりＣＤＲの配列を同定することができる。番号付けされた配列は、目視によって、またはＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻：４６７３～８０頁に記載されるように、アラインメントプログラム、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムスイートのうちの１つを用いることによって整列されることができる。分子モデルは、慣用的には、フレームワークおよびＣＤＲ領域を正確に描写し、したがって、配列ベースの割り当てを修正するために使用される。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、２７巻（１号）：５５～７７頁；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定され得る。
用語「Ｆｃ」とは、本明細書で使用される場合、抗体の消化から生じるか、または他の手段によって産生される非抗原結合断片の配列を含む分子を指し、単量体形態であるか多量体形態であるかを問わず、ヒンジ領域を含むことができる。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、典型的にはヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれかであり得るが、例示的な実施形態ではＩｇＧ１およびＩｇＧ２が使用される。Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体または多量体の形態に連結することができる単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に依存して１～４の範囲である。Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって生じるジスルフィド結合二量体である。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書で使用される場合、単量体、二量体および多量体形態であることが一般的である。
Ｆ（ａｂ）断片は、典型的には、１つの軽鎖、ならびに１つの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、Ｆ（ａｂ）断片のＶＨ－ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用される場合、Ｆ（ａｂ）断片はまた、アミノ酸リンカーによって分離された２つの可変ドメインを含む１つの軽鎖、およびアミノ酸リンカーおよびＣＨ１ドメインによって分離された２つの可変ドメインを含む１つの重鎖を含むことができる。
Ｆ（ａｂ’）断片は、典型的には、１つの軽鎖、および（ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の）より多くの定常領域を含む１つの重鎖の一部を含み、それにより、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔｍ」とは、結合タンパク質、抗原結合タンパク質、抗体の融解温度を指し、抗原結合タンパク質の熱安定性に対して重要なパラメータである。Ｔｍとは、一般的に、Ｆｖ断片、すなわち可変領域重鎖および軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）の熱安定性を指す。Ｔｍは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定することができる。
本開示の一実施形態は、１～３個の標的抗原に対する生物学的および免疫学的特異性を有する結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、このような結合タンパク質を発現する（すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む）宿主細胞を提供する。
用語「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」とは、本明細書で使用される場合、結合タンパク質によって結合することができ、さらに、動物において使用して、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成することができる分子または分子の一部（例えば、エピトープ）を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有することができる。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識する無傷の抗体と競合することができる。
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」または「標的エピトープ」または「エピトープ標的」とは、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意の決定基、例えば、ポリペプチド決定基を指す。例えば、決して限定されないが、標的エピトープＡは抗原の第１のエピトープであり得、標的エピトープＢは抗原の第２のエピトープであり得る。あるいは、標的エピトープＢは、第２の抗原上の第２のエピトープであり得る。ある種の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基（surface grouping）、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基を含み、ある種の実施形態では、特定の三次元構造特性および／または特定の荷電特性を有することができる。エピトープは、抗体によってまたは抗体の抗原結合断片によってまたは結合タンパク質によって結合される抗原の領域である。ある種の実施形態では、結合タンパク質は、それがタンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、平衡解離定数が１０－８Ｍ未満である場合、平衡解離定数が１０－９Ｍ未満である場合、または解離定数が１０－１０Ｍ未満である場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、０～１００個の連続したアミノ酸残基を指す。リンカーは、存在するかまたは存在せず、および同一であるかまたは異なる。リンカーは、すべて同じアミノ酸配列を有することができるか、またはすべて異なるアミノ酸配列を有することができる。
一部の実施形態では、用語「リンカー」とは、１～１５個の連続するアミノ酸残基を指す。典型的には、リンカーは、２つのアミノ酸間または２つのポリペプチドドメイン間の柔軟性および空間的分離を提供する。リンカーをＶＨ、ＶＬ、ＣＨおよび／またはＣＬドメインの間に挿入して、分子のフォーマットに応じて、例えば、二重可変領域免疫グロブリンに折り畳まれるように、軽鎖および重鎖のドメインに対して十分な柔軟性および可動性を提供することができる。リンカーは、典型的には、アミノ配列レベルで、それぞれ、可変ドメイン間、可変ドメインとノックアウトドメイン間、または可変ドメインと定常ドメイン間の遷移で挿入される。ドメイン間の遷移は、免疫グロブリンドメインの大きさが十分に理解されているため、同定することができる。ドメイン遷移の正確な位置は、実験データによって示されるように、またはモデリングもしくは二次構造予測の技術によって決定されるように、二次構造エレメント、例えばベータ－シートまたはアルファ－ヘリックスを形成しないペプチドストレッチを配置することによって決定することができる。ある種の例示的な実施形態では、リンカーは、Ｆａｂドメイン間に挿入され、タンデムＦａｂ抗体を作製することができる。特定の実施形態では、リンカーは、第１のＦａｂのＶＨドメインのＮ末端と第２のＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端の間に挿入される。
リンカー中のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカー中で達成するのに必要な二次構造エレメント（複数可）のタイプに依存して変化し得る。例えば、グリシン、セリンおよびアラニンは、最大の柔軟性を有するリンカーに適している。グリシン、プロリン、スレオニンおよびセリンのある種の組合せは、より剛性であり、伸長されたリンカーが望まれる場合に有用である。任意のアミノ酸残基は、所望の特性に応じて必要とされる場合、より大きなペプチドリンカーを構築するために、他のアミノ酸残基と組み合わせたリンカーとみなすことができる。
一部の実施形態では、リンカーは、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基；ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；トリペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；４つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；５つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；６つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；７つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；および８つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒのような小さなアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ、またはＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳもしくはＧＧＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）およびペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、単一のＳｅｒ残基；単一のＶａｌ残基；Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｇｌｎ－Ｐｒｏ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ｔｈｒ－ＬｙｓおよびＳｅｒ－Ｌｅｕから選択されるジペプチド；Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ、（配列番号ｘ）、Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）；Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、Ｈｉｓ－Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（配列番号ｘ）およびＡｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、２つのタンデムＦａｂは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２リンカーを介して連結される。一部の実施形態では、安定化ノックアウトドメインとＶＨ／ＶＬ対の間のリンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２リンカーである。
Ｌ１およびＬ２が軽鎖上にあり、Ｌ３およびＬ４が重鎖上にあるＣＯＤＶ－Ｆａｂ部分を有する一部の実施形態では、Ｌ１は３～１２個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は３～１４個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は１～８個のアミノ酸残基長であり、Ｌ４は１～３個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１は５～１０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は５～８個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は１～５個のアミノ酸残基長であり、Ｌ４は１～２個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１は７個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は５個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は１個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は２個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１は１０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は１０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ４は０個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、各々、０～１５個のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）から独立に選択される長さを有し、リンカーの少なくとも２つは１～１５個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号ｘ）である。一部の実施形態では、リンカーは、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は、配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は、配列Ｓｅｒを含み、Ｌ４は、配列Ａｒｇ－Ｔｈｒを含む。一部の実施形態では、Ｌ３は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列Ｓｅｒを含み、Ｌ２は、配列Ａｒｇ－Ｔｈｒを含み、Ｌ３は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ４は、配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、各々、独立して、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（ｎは０～５の整数である；配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｓｅｒ、Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、およびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は配列Ｓｅｒを含み、Ｌ４は配列Ａｒｇ－Ｔｈｒを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は０個のアミノ酸長であり、Ｌ４は０個のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は０個のアミノ酸長であり、Ｌ４は０個のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は０個のアミノ酸長であり、Ｌ３は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ４は０個のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、０個のアミノ酸長であり、Ｌ３およびＬ４は、各々、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号ｘ）（ｎは０～５の整数である；配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｓｅｒ、Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、およびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）から独立して選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ３およびＬ４は、０個のアミノ酸長であり、Ｌ１およびＬ２は、各々、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（ｎは０～５の整数である；配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｓｅｒ、Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、およびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）から独立して選択される配列を含む。
一部の実施形態では、リンカー（複数可）は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとの間の接合部において天然に存在する配列から誘導される配列を含む（例えば、国際公開第２０１２／１３５３４５号に記載されているもの）。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、内因性ＶＨとＣＨ１ドメインの間、または内因性ＶＬとＣＬドメイン（例えばκまたはλ）の間の遷移で見出される配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、内因性ヒトＶＨとＣＨ１ドメインの間、または内因性ヒトＶＬとＣＬドメイン（例えば、ヒトκまたはλ）の間の遷移で見出される配列を含む。
上記で列挙された例は、いかなる方法でも開示の範囲を限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシンおよびプロリンからなる群から選択されるランダムに選択されたアミノ酸を含むリンカーは、本明細書に記載の結合タンパク質における使用に適している。リンカー配列のさらなる記載については、例えば、参照により組み入れられる国際公開第２０１２１３５３４５号、国際公開第２０１７／１８０９１３号を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「原子価」とは、結合タンパク質、エピトープ、抗原結合タンパク質または抗体の結合部位の数を指す。例えば、用語「一価結合タンパク質」とは、１つの抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。用語「二価結合タンパク質」とは、２つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。用語「三価結合タンパク質」とは、３つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。用語「四価結合タンパク質」とは、４つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、二価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、二価結合タンパク質は、２つの異なる抗原標的に結合することができる。特定の実施形態では、三価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができ、すなわち、単一特異的である。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、２つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、二重特異性である。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、３つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、三重特異性である。特定の実施形態では、四価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができ、すなわち、単一特異的である。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、２つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、二重特異性である。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、３つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、三重特異性である。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、４つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、四重特異性である。
本明細書で使用される場合、用語「特異性」とは、結合タンパク質、エピトープ、抗原結合タンパク質または抗体の結合特異性の数を指す。例えば、用語「単一特異的結合タンパク質」とは、１つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。用語「二重特異性結合タンパク質」とは、２つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。用語「三重特異性結合タンパク質」とは、３つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。用語「四重特異性結合タンパク質」とは、４つの異なる抗原標的などに特異的に結合する結合タンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「選択的認識部位」とは、選択的認識部位に結合する親和性試薬によって選択的に認識されることを可能にする結合タンパク質における修飾を指す。選択的認識部位の例は、免疫グロブリンのＦｃ部分におけるプロテインＡの結合部位を含む。
本明細書で使用される場合、用語「親和性試薬」とは、マトリックス上に固定化され、分子、例えばアミノ酸または糖側鎖の表面グループ化に特異的に結合し、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な荷電特性を有するリガンドを含む試薬を指す。親和性試薬はアフィニティークロマトグラフィーのツールであり、リガンドと生成物の間の特異的相互作用によって精製が可能になる。「プロテインＬ」とは、親和性試薬の例であり、マトリックス上に固定化され、免疫グロブリンカッパ軽鎖の可変ドメインのサブセットに対して親和性を有するリガンドを形成する組換えタンパク質Ｌを指す。このようなマトリックスはレジンであり得る。親和性試薬の別の例は、「ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ」であり、これは、マトリックス上に固定化され、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖の定常ドメインに対して親和性を有するリガンドを形成する組換え１３ｋＤａのラクダ科由来の一本鎖抗体を指す。親和性試薬の別の例はプロテインＡである。プロテインＡは、細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁にもともと見出される４２ｋＤａの表面タンパク質である。タンパク質Ａの主要な結合部位は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間のＦｃ領域上にあることが、結晶学的精密化によって示されている。さらに、プロテインＡは、ヒトＶＨ３遺伝子ファミリー由来のＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を含むヒトＩｇＧ分子と結合することが示されている。プロテインＡは、ある種の免疫グロブリンのＦｃ部分に強い親和性で結合することができる。
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）の間のリアルタイム結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリックス上の結合タンパク質）を固定化し、リガンド（標的抗原）を提示することによって行うことができる。用語「ＫＤ」とは、本明細書で使用される場合、特定の結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」とは、結合タンパク質またはその抗原結合断片が、少なくとも約１×１０－６Ｍ、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍまたはそれ以上のＫｄでエピトープを含む抗原に結合する能力、および／または非特異的抗原に対するその親和性より少なくとも２倍高い親和性でエピトープに結合する能力を指す。結合タンパク質または抗体に対する抗原の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行うことができる。
本明細書で使用される場合、用語「参照Ｆａｂ分子」とは、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換されることを除いて、疑似Ｆａｂ分子と同一である分子を指す。「参照Ｆａｂ分子」とは、可変ドメインが疑似Ｆａｂの可変ドメインと同一であり、ＣＨ１およびＣＬドメインを有する分子を指す。疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインは、ＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換される。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、すべての公知の生命形態に不可欠である、高分子もしくはオリゴマー高分子または大きな生体分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含む核酸はヌクレオチドとして公知である単量体からできている。ほとんどの天然に存在するＤＮＡ分子は、互いに巻きついた２つの相補的な生体高分子鎖からなり、二重らせんを形成する。ＤＮＡ鎖はまた、ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドとして公知である。各ヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基、ならびにデオキシリボースまたはリボースと呼ばれる単糖およびリン酸基で構成される。天然に存在する核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの糖と次のヌクレオチドのリン酸の間の共有結合によって、鎖中で互いに接続され、その結果、糖－リン酸骨格が交互に変わる。糖がデオキシリボースの場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースの場合、ポリマーはＲＮＡである。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合を介して形成される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを指す。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドであり得るか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得ることが理解される。このような修飾には、塩基修飾、例えばブロムリジン、リボース修飾、例えばアラビノシドおよび２’，３’－ジデオキシリボース、ならびにヌクレオチド間結合修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデートおよびホスホロアミデートが含まれる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組合せであり、（１）単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と結合せず；（２）天然に連結されないポリヌクレオチドに結合され；または（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
「単離されたポリペプチド」とは、（１）それが通常見出される少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、（２）同じ供給源、例えば、同一種からの他のポリペプチドを実質的に含まない、（３）異種からの細胞により発現される、（４）それが天然において結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）「単離されたポリペプチド」が天然において結合しているポリペプチドの一部と（共有結合または非共有結合によって）結合していない、（６）それが天然において結合していないポリペプチドと操作可能に（共有結合または非共有結合によって）結合している、または（７）天然に存在しないものである。このような単離されたポリペプチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せによってコードされる。例示的な実施形態では、単離されたポリペプチドは、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨げるその天然環境中に見出されるポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」とはまた、発現構築物とも呼ばれ、通常、細胞におけるタンパク質発現のために設計されたプラスミドまたはウイルスを指す。用語「ベクター」とは、細胞にタンパク質および／またはベクターに含まれる核酸を導入することができるかまたは導入するものであるタンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはその混合物を指す。ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が挙げられる。特に、ベクターは、目的の遺伝子産物、例えば、外来性または異種性ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために使用される。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含み得る。外来ＤＮＡは、宿主細胞において天然に見出されないＤＮＡであって、例えば、ベクター分子を複製し、選択マーカーもしくはスクリーニング可能マーカーをコードし、または導入遺伝子をコードする異種ＤＮＡとして定義される。一度宿主細胞内に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立にまたはそれと同時的に複製することができ、ベクターおよびその挿入されたＤＮＡの数コピーを作製することができる。さらに、ベクターはまた、挿入されたＤＮＡをｍＲＮＡ分子に転写することを可能にするか、またはそうでなければ挿入されたＤＮＡをＲＮＡの複数のコピーに複製させる、必要なエレメントを含むことができる。ベクターはさらに、目的の遺伝子の発現を調節する「発現制御配列」を包含することができる。典型的には、発現制御配列は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えば、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターまたはリプレッサーである。１つまたはそれ以上の目的の遺伝子産物をコードする１を超えるポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は、一緒にまたは１つもしくはそれ以上の発現制御配列によって別々に制御される。より具体的には、ベクター上に含まれる各ポリヌクレオチドは、別個の発現制御配列によって制御されるか、またはベクター上に含まれるすべてのポリヌクレオチドは、単一の発現制御配列によって制御される。単一の発現制御配列によって制御される単一ベクター上に含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成し得る。いくつかの発現ベクターは、発現されたｍＲＮＡの半減期を増加させ、および／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入されたＤＮＡに隣接する配列エレメントをさらに含む。したがって、挿入されたＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多くの分子が迅速に合成される。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことが意図される。ある種の修飾は突然変異または環境の影響のいずれかにより次世代に起こる可能性があるため、このような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合もあるが、このような細胞は本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物の発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む、広範な宿主細胞発現系を使用して、結合タンパク質を発現させることができる。適切な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ１９である。結合タンパク質を組換え的に発現させるために、宿主細胞は、結合タンパク質のポリペプチド鎖が宿主細胞内で発現されるように、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、例示的な実施形態では、宿主細胞が培養される培地中に分泌させ、そこから結合タンパク質を回収することができる。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」とは、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。
用語「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、結合タンパク質の送達を達成または増強するのに適した１つまたはそれ以上の製剤材料を指す。
用語「有効量」および「治療有効量」とは、１つまたはそれ以上の結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を含む医薬組成物に関して使用される場合、所望の治療結果をもたらすのに十分な量または投薬量を指す。より具体的には、治療有効量は、ある期間、治療される状態に関連付けられた臨床的に定義された病理学的プロセスの１つまたはそれ以上を阻害するのに十分な量の結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）である。有効量は、使用されている特異的抗体様結合タンパク質に依存して変化することができ、また、治療される患者および障害の重症度に関連する種々の因子および状態に依存する。例えば、結合タンパク質または多重特異性結合タンパク質をインビボで投与する場合、因子、例えば患者の年齢、体重および健康、ならびに前臨床動物研究で得られた用量反応曲線および毒性データは、これらの因子の中で考慮される。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
本明細書で使用される場合、用語「結合タンパク質を生成する方法」とは、当該技術分野において周知である技術を使用するタンパク質発現の組換え方法を指す。
ＩＩ．疑似ＦＡＢ部分
ある種の実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、少なくとも１つの疑似Ｆａｂ部分を含む。本明細書で使用される場合、「疑似Ｆａｂ」部分は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと可変重鎖（ＶＨ）の対合によって形成される機能性抗原結合部分を含むという点で、従来の抗体のＦａｂ部分と類似している。しかしながら、従来のＦａｂのＶＬおよびＶＨドメインは、それぞれ定常軽鎖（ＣＬ）ドメインおよび定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインと直接融合または連結されるが、疑似Ｆａｂ部分はＣＨ１およびＣＬドメインを欠いている。代わりに、疑似ＦａｂのＶＬおよびＶＨドメインは、標的抗原（例えば、任意の標的抗原）に特異的に結合することができない不活性または非機能的結合部分（本明細書では「安定化ノックアウト」部分またはドメイン）を形成する、第２の対の安定化ノックアウトＶＬおよびＶＨドメイン（本明細書ではＶＬＸおよびＶＨＸと称する）に作動可能に連結されている。ある種の実施形態では、疑似Ｆａｂ部分は、それが由来する対応するＦａｂ部分の標的抗原に結合することができない。疑似Ｆａｂ部分はＣＨおよびＣＬドメインを欠いている。
標的抗原に選択的に結合することはできないが、疑似ＦａｂのＶＬＸおよびＶＨＸドメインは、それにもかかわらず、互いに優先的に会合して安定な鎖対合を形成する。したがって、異なる特異性を有する１つまたはそれ以上の追加の結合ドメインに疑似Ｆａｂを付加することによって、疑似ＦａｂのＶＬＸ／ＶＨＸ鎖対合の固有の安定性は、所望の多重特異性結合分子の鎖のヘテロ二量体化を駆動することができる。
したがって、本開示の疑似Ｆａｂは、式：
（Ｉ）ＶＨａ－Ｌ１－ＶＨＸ；または
（ＩＩ）ＶＨｂ－Ｌ１－ＶＨＸ
で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
（ＩＩＩ）ＶＬａ－Ｌ２－ＶＬＸ；または
（ＩＶ）ＶＬｂ－Ｌ２－ＶＬＸ
で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
を含むかまたはそれからなり、
式中、
ＶＨＸはＶＬＸと会合してノックアウトドメインを形成し、
ＶＨはＶＬと会合して第１の機能的抗原結合ドメインを形成し、
Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、存在するかまたは存在しない。
ある種の実施形態では、疑似Ｆａｂの第１のポリペプチド鎖は構造ＶＨ－Ｌ１－ＶＨＸを有し、疑似Ｆａｂの第２のポリペプチド鎖は構造ＶＬ－Ｌ２－ＶＬＸを有する。
他の実施形態では、疑似Ｆａｂの第１のポリペプチドは構造ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨを有し、第２のポリペプチド鎖は構造ＶＬＸ－Ｌ２－ＶＬを有する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、以下の群：
（ａ）ＶＨａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨｂ－Ｌ２－ＶＨＸおよびＶＬａ－ＣＬおよびＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬＸ；
（ｂ）ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨｂ－ＣＨ１およびＶＬａ－Ｌ３－ＶＬＸおよびＶＬｂ－ＣＬ；
（ｃ）ＶＨａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨａ－ＣＨ１およびＶＨｂ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－Ｌ４－ＶＨＸならびに２つの鎖ＶＬｂ－Ｌ５－ＶＬＸおよび２つの鎖ＶＬａ－ＣＬ
のうちの１つから選択される別個のタンパク質鎖を含み、
（ａ）および（ｂ）の鎖は、１回または２回存在することができ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、独立して同一であるかまたは異なるリンカーである。
（ａ）ノックアウトドメイン
疑似Ｆａｂの「ノックアウト」ドメインは、正常に機能する抗原結合部位の結合親和性または特異性の抑制または減少をもたらす任意の手段によって生成することができる。ある種の実施形態では、疑似Ｆａｂのノックアウトドメインは、ノックアウトドメインのＶＬＸおよびＶＨＸドメインの１つまたは両方における１つまたは複数の突然変異によって不活性または非機能性にされている。一実施形態では、ノックアウト修飾は、アミノ酸置換である。他の実施形態では、ノックアウト修飾は、アミノ酸の挿入または欠失である。別の実施形態では、ノックアウト修飾は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入およびアミノ酸欠失の組合せである。さらに他の実施形態では、ノックアウトドメインは、例えば、標的抗原に結合する可変ドメインの能力を妨げる部分を用いた共有結合修飾によって非機能性にされる。
ある種の実施形態では、ノックアウト修飾は、安定化抗原結合タンパク質複合体の反発または破壊を作り出すことによって結合を消失させる。ある種の実施形態では、ノックアウト修飾は、標的抗原と通常接触する残基を、標的抗原と電荷－電荷反発を生じるアミノ酸で置換することを含み得る。さらにまたはあるいは、π－π相互作用の複合体を不安定化する突然変異を導入することができる。
ある種の実施形態では、ノックアウト修飾は、荷電アミノ酸を非荷電アミノ酸で置換することである。他の実施形態では、ノックアウト修飾は、非荷電アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することである。他の実施形態では、ノックアウト修飾は、極性アミノ酸を非極性アミノ酸で置換することである。他の実施形態では、ノックアウト修飾は、荷電アミノ酸を極性および非荷電アミノ酸で置換し、極性非荷電アミノ酸を非極性疎水性アミノ酸で置換することである。
ある種の実施形態では、ノックアウト修飾は、抗原との結合相互作用を形成するアミノ酸位置で導入される。例えば、ノックアウト修飾は、抗原－抗体相互作用が通常起こるタンパク質表面上に位置し得る。ある種の例示的な実施形態では、修飾は、１つまたは両方のＶＬＸまたはＶＨＸドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）に導入することができる。
ある種の実施形態では、ノックアウト修飾は、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ１中の残基の置換である。別の実施形態では、ノックアウト修飾は、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ２中の残基の置換である。別の実施形態では、ノックアウト修飾は、ＶＨＸドメインのＣＤＲＨ３中の残基の置換である。
ある種の実施形態では、ノックアウト修飾は、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ１中の残基の置換である。別の実施形態では、ノックアウト修飾は、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ２中の残基の置換である。別の実施形態では、ノックアウト修飾は、ＶＬＸドメインのＣＤＲＬ３中の残基の置換である。
ある種の例示的な実施形態では、ＶＨＸまたはＶＬＸドメインのＣＤＲ中のアルギニンは、グルタミン酸に突然変異される。他の実施形態では、ＶＨＸまたはＶＬＸドメインのＣＤＲ中の１つまたはそれ以上のチロシンは、アラニンに突然変異される。
ある種の実施形態では、修飾は、それが由来する機能的な非ノックアウト（すなわち、野生型）対応物の標的抗原結合活性を完全に欠いたノックアウトドメインをもたらす。あるいは、ノックアウトドメインの結合機能性は、その機能的な非ノックアウト対応物と比較して実質的に低減させることができるが、それにもかかわらず、あるレベルの検出可能な結合を保持することができる。
ノックアウトドメインを生成するための足場は、例えば、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から得ることができる。ＰＤＢは、大きな生体分子、例えば、タンパク質および核酸の三次元構造データの結晶学的データベースである。ノックアウトドメインは、抗原結合ドメインおよびその同族標的抗原のコンピューターベースのモデリングによって抗原結合に関与することが予測されるアミノ酸を特異的に突然変異させることによって生成することができる。その後の結合研究は、当該技術分野において公知である方法、例えば、表面プラズモン共鳴を用いて行うことができ、結合機能が消失し、結合ドメインとその標的の間の相互作用が破壊されるかどうかを高精度で明らかにすることができる。
（ｂ）安定化ノックアウトドメイン
ある種の実施形態では、ノックアウトドメインは、その野生型対応物と比較して、熱安定性が増加した安定化ノックアウトドメインである。例えば、ある種の例示的な実施形態では、ノックアウトドメインの融解温度（Ｔｍ）は、それが由来する野生型対応物と比較して、少なくとも０．２５℃、少なくとも０．５℃、少なくとも０．７５℃、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、または少なくとも１０℃内である。他の例示的な実施形態では、ノックアウトドメインのＴｍは、その野生型対応物に関して増加した。例えば、Ｔｍは、それが由来する野生型対応物と比較して、少なくとも０．２５℃、少なくとも０．５℃、少なくとも０．７５℃、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、または少なくとも１０℃増加し得る。熱安定性は、当業者が日常的に使用する示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）または他の生物分析法によって測定することができる。
ある種の実施形態では、疑似Ｆａｂは、増大した安定性を付与する疑似ＦａｂのノックアウトドメインのＶＨＸまたはＶＬＸドメイン間の操作された鎖内ジスルフィド結合を含む。典型的には、この修飾は、ＶＨＸドメインの少なくとも１つのアミノ酸をシステイン（Ｃｙｓ）残基で置換し、ＶＬＸドメインの少なくとも１つのアミノ酸をＣｙｓ残基で置換することである。Ｃｙｓ残基は、二量体形成後にジスルフィド結合の形成を可能にするＶＨＸおよびＶＬＸドメインの位置に導入することができる。ある種の実施形態では、ＶＨ／ＶＬ界面間の安定性を改善するために、ＶＨおよびＶＬ界面に突然変異を作製することができる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインにおける特異的な一連のアミノ酸突然変異は、ジスルフィド架橋を形成する非天然システイン残基の導入を介して安定性を改善し得る。
ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸残基に対して、第１のセットのジスルフィド安定化突然変異を作製することができる。例示的な実施形態では、ジスルフィド結合は、ＶＨＸドメインの４４位におけるＣｙｓおよびＶＬＸドメインの１００位におけるＣｙｓによって形成される。このセットのジスルフィド安定化突然変異は、代替的に「ＶＨ４４Ｃ／ＶＬ１００Ｃ」突然変異セットと呼ばれる。第１のセットのジスルフィド安定化突然変異は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられるＲｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４巻、１２３９～１２４５頁、１９９６年においてさらに詳細に記載される。
ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸残基に対して、第２のセットのジスルフィド安定化突然変異を作製することができる。例示的な実施形態では、ジスルフィド結合は、ＶＨＸドメインの１０５位のＣｙｓおよびＶＬＸドメインの４３位のＣｙｓによって形成される。第２のセットのジスルフィド安定化突然変異は、代替的に「ＶＨ１０５Ｃ／ＶＬ４３Ｃ」突然変異セットと呼ばれる。他方のジスルフィド安定化突然変異は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられる米国特許第９，５２７，９２７号においてさらに詳細に記載される。
ある種の実施形態では、疑似ＦａｂのＶＬＸドメインは、少なくとも１つのノックアウト修飾を有する配列番号１の変異体を含む。例えば、ＶＬＸドメインは、ノックアウト修飾を別にして、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
ある種の実施形態では、疑似ＦａｂのＶＨＸドメインは、少なくとも１つのノックアウト修飾を有する配列番号２の変異体を含む。例えば、ＶＨＸドメインは、ノックアウト修飾を別にして、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態では、疑似ＦａｂのＶＬＸドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、疑似ＦａｂのＶＨＸドメインは、配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９の群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＩＩ．多重特異性疑似Ｆａｂ含有結合ポリペプチド
他の態様では、本明細書に記載される疑似Ｆａｂ部分を含む多重特異性結合タンパク質が提供される。疑似Ｆａｂ部分の高度にモジュラー性は、多種多様な多重特異性構造を形成することを可能にする。
ある種の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、多価疑似Ｆａｂ含有結合タンパク質を形成するために、疑似Ｆａｂ部分の一方または両方の鎖のＮ末端および／またはＣ末端に付加されたさらなる結合特異性を含む。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、
ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）；
（２）第１のジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）；
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の疑似Ｆａｂ部分であって、
第１のｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分；
ｂ）（１）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）；
（２）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメイン；および
（３）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第１のＦａｂ部分
を含む。
一部の実施形態では、結合タンパク質の第１および第２のヘテロ二量体化ドメインは、第１および第２のＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、一般構造ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインを含む。
（ａ）Ｆｃ－ヘテロ二量体化ドメイン
ある種の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃ－ヘテロ二量体化Ｃ１またはＣ２ドメインをさらに含み得る。一部の実施形態では、Ｆｃ二量体化ドメインは、ヘテロ二量体化Ｆｃまたはその断片、特にＦｃ部分のノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）変異体およびそのエフェクター修飾変異体、またはヘテロ二量体化Ｆｃもしくはその断片、特にＦｃのＥＶ－ＲＷＴ変異体およびそのエフェクター修飾変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｆｃは、１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異を含む。１つの可能性は、例えば、Ｈ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆからなる群から選択される突然変異によって、第１の親和性試薬に対する選択的認識部位を除去し、第２の親和性試薬の選択的認識部位を導入することである。あるいは、第２の親和性試薬に対する選択的認識部位のみを導入することができる。
ｂ）ホモ二量体化ドメイン
ある種の実施形態では、本開示の多重特異性結合タンパク質は、ホモ二量体化ドメインをさらに含むことができる。一部の実施形態では、ホモ二量体化ドメインは、Ｆｃ領域およびそのエフェクター修飾変異体；１つまたはそれ以上のＣＨ２ドメイン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭの１つまたはそれ以上のＣＨ２ドメイン；１つまたはそれ以上のＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤの１つまたはそれ以上のＣＨ３ドメイン；ならびに１つまたはそれ以上のＣＨ４ドメイン、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＭの１つまたはそれ以上のＣＨ４ドメインからなる群から選択される。
ＩＩＩ．多量体疑似ＦＡＢ含有結合タンパク質
（ａ）対称的な四価構築体
別の実施形態では、結合ポリペプチドは、追加の結合ドメインを形成するための疑似Ｆａｂのポリペプチド鎖と会合する追加のポリペプチド鎖を含む疑似Ｆａｂ含有結合タンパク質を含む。これらの疑似Ｆａｂ含有結合ポリペプチドをさらにＦｃヘテロ二量体化ドメインに融合させて、従来のＹ字型抗体の半分を形成する。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第５のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ１［Ｖ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第６のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＶＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合した、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
これらの分子は、「タンデム－（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ×Ｆｖ－Ｆａｂ）」とも呼ばれる（図１０Ｂを参照されたい）。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第５のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［Ｖ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第６のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ２［ＶＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
これらの分子は、「タンデム－（Ｆｖ－Ｆａｂ×Ｆｖ－疑似Ｆａｂ－ＩｇＧ）」とも呼ばれる（図１０Ａを参照されたい）。
（ｂ）非対称四重特異性分子
結合ポリペプチドの二量体化であって、１つのみが疑似Ｆａｂを含むものは、さらなる特異性を有する非対称構築物をもたらす。これらの疑似Ｆａｂ含有結合ポリペプチドをさらにＦｃヘテロ二量体化ドメインに融合させて、従来の全長Ｙ字型ＩｇＧ抗体の半分を形成する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第２のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第３のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第４のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１およびＬ２は、独立して同一であるかまたは異なるアミノ酸リンカーである。
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）を第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合させて、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
これらの分子は、二量体二重特異性ＩｇＧ分子（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ）×（Ｆｖ－Ｆａｂ）－Ｆｃとも呼ばれる（図２および７を参照されたい）。
別の実施形態では、結合ポリペプチドは、追加の結合ドメインを形成するための疑似Ｆａｂのポリペプチド鎖と会合する追加のポリペプチド鎖を含む疑似Ｆａｂ含有結合タンパク質を含む。これらの疑似Ｆａｂ含有結合ポリペプチドをさらにＦｃヘテロ二量体化ドメインに融合させて、従来のＹ字型抗体の半分を形成する。このような分子の二量体化は、さらなる特異性を有する構築物をもたらす。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第５のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ４－ＶＨＸ－ＦＣ１［Ｖ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第６のポリペプチドは、式：
ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ５－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＶＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
Ｃ末端ヘテロ二量体化ドメインは、従来のＦｃ－ノブ－ホールヘテロ二量体化ドメイン、従来のＦｃ－ＲＦヘテロ二量体化ドメイン、またはそれらの組合せであり得る。これらの分子は、「Ｆｖ－疑似Ｆａｂ（［ＨＣ］－（Ｆｖ－疑似Ｆａｂ））×（（（Ｆｖ－Ｆａｂ）［ＨＣ］－（Ｆｖ－Ｆａｂ）））－Ｆｃ」とも呼ばれる（図１１を参照されたい）。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第２のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第３のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬｃ－Ｌ４－ＣＬ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第４のポリペプチドは、式：
ＶＨｃ－Ｌ５－ＶＨｂ－Ｌ６－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｃは第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｃは第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）第３のＶＬドメイン（ＶＬｃ）は第３のＶＨドメイン（ＶＨｃ）と対合して、標的抗原Ｃに結合する第３の機能的抗原結合部位を形成し；
（４）式ＩＩＩのポリペプチドおよび式ＩＶのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対（ＣＯＤＶ）を形成し；
（５）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ２）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）標的抗原へのその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１のポリペプチドは、式：
ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
で表される構造を含み、
（ｂ）第２のポリペプチドは、式：
ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｃ）第３のポリペプチドは、式：
ＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬｃ－Ｌ４－ＣＬ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
（ｄ）第４のポリペプチドは、式：
ＶＨｃ－Ｌ５－ＶＨｂ－Ｌ６－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬｃは第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨｃは第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はアミノ酸リンカーであり、
（１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
（２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
（３）第３のＶＬドメイン（ＶＬｃ）は第３のＶＨドメイン（ＶＨｃ）と対合して、標的抗原Ｃに結合する第３の機能的抗原結合部位を形成し；
（４）式ＩＩＩのポリペプチドおよび式ＩＶのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対（ＣＯＤＶ）を形成し；
（５）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ２）ドメインを形成し；
ｄｓＫＯドメインは、（ｉ）参照Ｆａｂ分子の標的抗原に対するその結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含む。
これらの分子は、「（ＣＯＤＶ－Ｆａｂ）×（疑似Ｆａｂ）－Ｆｃ」とも呼ばれる（図１３を参照されたい）。
本発明の第１および第２の態様の特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号６および７；配列番号８および９；配列番号１０および１１；配列番号１２および１３；配列番号１４および１５；配列番号１６および１７；配列番号１８および１９；配列番号２０および２１；配列番号２２および２３；配列番号２４および２５；配列番号２６および２７；配列番号２８および２９；配列番号３０および３１；配列番号３２および３３；配列番号３４および３５；配列番号３６および３７；配列番号３８および３９；配列番号４０および４１；配列番号４２および４３；配列番号４４および４５；配列番号４６および４７および配列番号４８および４９；配列番号５０および５１；配列番号５２および５３および配列番号５４および５５；配列番号５６および５７および配列番号５８および５９；配列番号６０および６１および配列番号６２および６３；配列番号６４および６５および配列番号６６および６７；配列番号６８および６９および配列番号７０および７１；配列番号７２および７３；ならびに配列番号７４および７５からなる群から選択される軽鎖と重鎖対を含む。
一部の実施形態では、第１および第２のＣＬは、定常領域軽鎖カッパ（ＣＬκ）および定常領域軽鎖ラムダ（ＣＬλ）からなる群から独立して選択される。
一部の実施形態では、ＨＤ１およびＨＤ２は、各々、Ｆｃ領域およびそのエフェクター修飾変異体；ヘテロ二量体化Ｆｃ部分、特にＦｃ部分およびそのエフェクター修飾変異体のノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）変異体；１つまたはそれ以上のＣＨ２ドメイン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭのもの、１つまたはそれ以上のＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤのもの、または１つまたはそれ以上のＣＨ４ドメイン、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＭのものを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインの１つは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含む第１のＣＨ３ドメインを含み、他方のＦｃドメインは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異の一方または両方を含む第２のＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、ＨＤ１またはＨＤ２のＦｃ領域は、第２の親和性試薬に対して選択的認識部位の除去をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異、例えば、Ｈ４３５ＲまたはＹ４３６Ｆからなる群から選択されるアミノ酸突然変異、または第３の親和性試薬に対する選択的認識部位の導入をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異を含む。
（ｅ）核酸
第５の態様では、本発明は、結合タンパク質の一方または両方を含む疑似Ｆａｂをコードするヌクレオチド配列と、本発明の第１、第２または第３の態様のいずれかの多重特異性結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、単離された核酸分子に関する。
本発明の一態様は、本発明の第１から第３の態様のいずれか１つの結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
標準組換えＤＮＡ方法論は、結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞にこのようなベクターを導入するために使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第３版）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるかまたは本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行うことができる。特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および医薬化学に関連して、ならびのその実験手順および技術において利用される命名法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。同様に、従来の技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、送達、および患者の治療のために使用される。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。本発明の第５の態様の一部の実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかをコードする核酸と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含む。
本開示のある種の態様は、ポリヌクレオチドのキットに関する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドはベクター（例えば、発現ベクター）である。キットは、特に、本明細書に記載された結合タンパク質、例えば、本開示のヘテロ二量体化ドメイン、二価、三価、四価または多価結合タンパク質のうちの１つまたはそれ以上の生成における使用を見出すことができる。
一部の実施形態では、単離された核酸は、結合タンパク質をコードする核酸配列の転写を指向するために、異種プロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、核酸の転写を指向する核酸制御配列を指すことができる。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合に、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは結合タンパク質のコード配列に作動可能に連結されている。プロモーターの例としては、限定されないが、ウイルス（ポリオーマウイルス、家禽痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られるプロモーター、異種真核生物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなど）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ １０８巻（２号）：１９３～９頁、１９９１年）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３巻：ｅ４３、２００５年）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母アルファ接合因子のプロモーターが含まれ得る。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または本明細書に記載されている他の適切なプロモーター、または当業者によって容易に認識される他の適切なプロモーターの制御下にあり得る。
一部の実施形態では、単離された核酸はベクターに組み込まれる。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結されている１つまたはそれ以上の調節配列を含み得る。用語「調節配列」は、本明細書で使用される場合、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。適切なエンハンサーの例としては、限定されないが、哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、インスリンなど）からのエンハンサー配列、および真核細胞ウイルス（例えば、複製起点の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなど）からのエンハンサー配列が挙げられる。適切なベクターの例としては、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルスベクターなど）が挙げられる。発現ベクターを用いて、宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができる。宿主内で発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該技術分野において公知であり、目的の任意の細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様の核酸分子を含む発現ベクターに関する。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかの第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターなどのベクター系に関する。本発明の第６の態様の一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖をコードする第２のベクター、結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖をコードする第３のベクター、および結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖をコードする第４のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第３および第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第３のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第２および第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第２および第３のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターを含む。ベクター系の１つまたはそれ以上のベクターは、本明細書に記載されるベクターのいずれかであり得る。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のベクターは発現ベクターである。
（ｆ）単離された宿主細胞
第７の態様では、本発明は、本発明の第５の態様の核酸分子、または本発明の第６の態様の発現ベクターを含む単離された宿主細胞に関する。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドキット、ベクター、および／またはベクター系を含む単離された宿主細胞に関する。本発明の第７の態様の一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌ＤＨ５α細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、出芽酵母（S. cerevisiae）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例としては、例えば、ショウジョウバエ細胞（例えば、Ｓ２細胞）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）細胞（例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞）、およびツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞（例えば、Ｓｆ２１またはＳｆ９細胞）が挙げられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例としては、例えば、ヒト胚性腎細胞（例えば、懸濁培養中の増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ細胞、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝細胞腫株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞）などが挙げられる。
ＩＶ．調製方法
１．発現方法
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかを生成する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、
ａ）宿主細胞が結合タンパク質を発現するような条件下で、単離された核酸、ベクター、および／またはベクター系（例えば、本明細書に記載される単離された核酸、ベクター、および／またはベクター系のいずれか）を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞のいずれか）を培養する工程；ならびに
ｂ）宿主細胞から結合タンパク質を単離する工程
を含む。タンパク質を発現する条件下で宿主細胞を培養する方法は、当業者に周知である。培養宿主細胞からタンパク質を単離する方法は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続くサイズ排除クロマトグラフィーを含む２段階アフィニティークロマトグラフィー）によるなど、当業者に周知である。
２．精製方法
第４の態様において、本発明は、
（ｉ）多重特異性結合タンパク質を含む溶液を、第１、第２または第３のアフィニティー試薬について多重特異性結合タンパク質の認識部位に特異的に結合する第１、第２、または第３のアフィニティー試薬に適用する工程；
（ｉｉ）第１、第２もしくは第３のアフィニティー試薬に結合しない多重特異性結合タンパク質、または第１もしくは第３のアフィニティー試薬に結合する多重特異性結合タンパク質のいずれかを回収する工程
を含む、本発明の第３の態様の多重特異性結合タンパク質を精製する方法に関し、第１、第２および第３のアフィニティー試薬の各々は、多重特異性結合タンパク質の異なる認識部位に結合する。
一部の実施形態では、方法は、工程（ｉｉ）で回収された多重特異性結合タンパク質を含む溶液を第１、第２または第３のアフィニティー試薬に適用する工程であって、アフィニティー試薬は、工程（ｉ）で使用されたアフィニティー試薬とは異なる工程、第１、第２もしくは第３のアフィニティー試薬に結合しない多重特異性結合タンパク質、または第１もしくは第３のアフィニティー試薬に結合する多重特異性結合タンパク質のいずれかを回収するさらなる工程を含む。
一部の実施形態では、第１の親和性試薬はＣカッパに結合しており；第２の親和性試薬はプロテインＡであり；および／または第３の親和性試薬はプロテインＧである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、カッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってカッパセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および場合によりラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってラムダＦａｂセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってラムダＦａｂセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および場合によりカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってカッパセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、２つのＦｃ領域を含み、各々はＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ３ドメインのうちの１つのみが、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置４３５および４３６に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換はＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、次にカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってカッパセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、次に場合によりラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってラムダＦａｂセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって順番に精製される。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、次にラムダ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってラムダＦａｂセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、次に場合によりカッパ軽鎖アフィニティークロマトグラフィー（例えば、製造業者の指示に従ってカッパセレクトレジンを使用する；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって順番に精製される。例えば、一部の実施形態では、結合タンパク質をプロテインＡと接触させ、アミノ酸置換Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを含む０または２つのＣＨ３ドメインのいずれかを含む結合タンパク質から結合タンパク質を単離させるのに適した条件下でプロテインＡから溶出し、カッパ軽鎖親和性媒体と接触させ（例えば、カッパセレクトレジンで使用される；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ）、およびラムダＣＬドメインのみを含む結合タンパク質から単離させるのに適した条件下で（例えば、製造業者の指示に従って）カッパ軽鎖親和性媒体から溶出させる。
プロテインＡ溶出に適した条件は、限定されないが、ｐＨ４．５～２．８からの段階的溶出勾配を含み、当該技術分野において公知である。一部の実施形態では、タンパク質精製に有用なプロテインＡまたはプロテインＡ変異体が採用される。一部の実施形態では、プロテインＡは、例えば、クロマトグラフィー媒体の一部として、基質またはレジンに結合される。一部の実施形態では、カッパ軽鎖親和性媒体からの溶出後、結合タンパク質をラムダ軽鎖親和性媒体（例えば、ラムダＦａｂセレクトレジン；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅで使用されるようなもの）と接触させ、結合タンパク質をカッパＣＬドメインのみを含む結合タンパク質から単離するのに適した条件下で（例えば、製造業者の指示に従って）ラムダ軽鎖親和性媒体から溶出させる。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＨＩＣクロマトグラフィーを用いて検出される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ラムダＣＬドメインを含む第１のポリペプチド鎖；ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３５４および３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含む第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインであって、アミノ酸置換はＳ３５４ＣおよびＴ３６６ＷであるＣＨ３ドメイン；ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３４９、３６６、３６８、４０７、４３５および４３６に対応する位置にアミノ酸置換を含む第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインであって、アミノ酸置換はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６ＦであるＣＨ３ドメイン；ならびにカッパＣＬドメインを含む第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は宿主細胞によって生成される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞培地または宿主細胞抽出物から精製される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、（例えば、プロテインＡと接触させる前に）宿主細胞によって分泌されるか、または宿主細胞から生成および抽出される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、プロテインＡと接触させた場合に、細胞培地または宿主細胞抽出物中に存在する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、他の結合タンパク質、ポリペプチド、および／または他の細胞成分から精製される。
一部の実施形態では、安定化ノックアウトドメインは、所望の多重特異性結合タンパク質の優先的合成または精製を促進するために使用され、安定化ノックアウトドメインは、（１）標的抗原への結合を消失させる１つまたはそれ以上の不活性化突然変異と、（２）参照Ｆａｂ分子に対して増強された熱安定性（Ｔｍ）を付与する１つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合とを含み、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換されることを除いて、疑似Ｆａｂ分子と同一である。
Ｖ．製剤／医薬組成物
第８の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明の第１から第３の態様のいずれか１つの治療有効量のタンパク質とを含む医薬組成物に関する。
結合タンパク質を含む治療用組成物または医薬組成物は、本開示の範囲内である。本発明の第８の態様の一部の態様は、本明細書に記載される治療有効量の結合タンパク質のいずれか１つ、または結合タンパク質－薬物コンジュゲートを、投与様式に適合するように選択された薬学的または生理学的に許容される製剤と混合して含む医薬組成物を含む。
許容される製剤材料は、典型的には、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。
一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透性を修飾、維持、または防ぐための製剤材料を含み得る。適切な製剤材料には、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン）、充填剤、単糖、二糖および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニクス；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０；Ｔｒｉｔｏｎ；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、等張化増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬補助剤が挙げられる（例えば、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０年）。およびその後続の版を参照されたい）。
一部の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図された投与経路、送達フォーマットおよび所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。このような組成物は、結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響を与え得る。
一部の実施形態では、医薬組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、天然において水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のための適切なビヒクルまたは担体は、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得、場合によっては、非経口投与のための組成物中に一般的な他の物質を補足することができる。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらに例示的なビヒクルである。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、これはさらにソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本開示の１つの実施形態では、結合タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤と混合することによって、保存のために調製することができる。さらに、結合タンパク質は、適切な賦形剤、例えばショ糖を用いて凍結乾燥剤として製剤化することができる。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、非経口送達または皮下のために選択することができる。あるいは、組成物は、吸入させるために、または消化管を通じて、例えば経口的に送達させるために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。
一部の実施形態では、製剤成分は、投与部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
非経口投与が意図される場合、使用するための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の結合タンパク質を含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、無菌蒸留水であり、結合タンパク質が、適切に保存された無菌の等張溶液として製剤化される。さらに別の調製物は、薬剤、例えば、注射用ミクロスフェア、生物浸食性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームを用いた所望の分子の製剤化を含むことができ、次に、デポ注射を介して送達される生成物の制御されたまたは持続的な放出を提供する。ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは循環中の持続時間を促進する効果を有することができる。所望の分子を導入するための他の適切な手段は、埋込み可能な薬物送達デバイスを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。例えば、結合タンパク質は、吸入のための乾燥粉末として製剤化することができる。結合タンパク質吸入溶液はまた、エアロゾル送達用の噴射剤とともに製剤化することができる。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧することができる。
また、ある種の製剤を経口投与し得ることが企図される。本開示の一実施形態では、この様式で投与される多重特異性結合タンパク質は、固形投薬形態、例えば、錠剤およびカプセルの配合において慣用的に使用される担体を伴ってまたは伴わずに製剤化することができる。例えば、カプセルは、生物学的利用能が最大化され、全身前の分解が最小化される場合、胃腸管内の点で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。結合タンパク質の吸収を促進にするために、さらなる物質を含めることができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用することができる。
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物中の有効量の多重特異性結合タンパク質を伴うことができる。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、溶液を単位投薬形態で調製することができる。適切な賦形剤としては、限定されないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトースもしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンもしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクが挙げられる。
本開示のさらなる医薬組成物は、当業者には明らかであり、持続性または制御された送達製剤中に結合タンパク質を伴う製剤が含まれる。種々の他の持続性または制御された送達手段、例えば、リポソーム担体、生物侵食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ注射を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。持続放出調製物のさらなる例には、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、エチレンビニルアセテート、またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸の共重合体が含み得る。持続放出組成物はまた、リポソームを含むことができ、当該技術分野において公知であるいくつかの方法のいずれかによって調製することができる。
一部の実施形態では、医薬組成物は、インビボでの投与のために使用されるべきであり、典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通して濾過することによって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに、この方法を用いた滅菌を行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。
医薬組成物が製剤化されていると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存することができる。このような製剤は、直ぐに使える形態、または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。
本開示はまた、単回投薬単位を生成するためのキットを包含する。キットは、各々、乾燥された多重特異性結合タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。また、本開示の範囲には、単一および複数チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含むキットが含まれる。
治療的に使用される有効量の結合タンパク質の医薬組成物は、例えば、治療的背景および目的に依存する。したがって、治療のための適切な用量レベルは、送達された分子、結合タンパク質が使用されている適応、投与経路、および患者のサイズ（体重、体表面または臓器サイズ）および状態（年齢および全身健康）に部分的に依存して変化することを当業者は理解する。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し、投与経路を修飾することができる。
投薬頻度は、使用される製剤中の結合タンパク質の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投薬として、２回またはそれ以上の投薬（所望の分子と同量を含有し得るか、または含有し得ない）として、経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として投与することができる。適切な投薬量のさらなる精密化は、当業者によって日常的になされ、当業者よって日常的に行われるタスクの範囲内にある。適切な投薬量は、適切な用量－反応データを使用することによって確認することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法、例えば、経口；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内もしくは病変内経路による注射；持続放出システムによる；または移植デバイスによるものに従う。所望であれば、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、または移植デバイスによって投与することができる。
一部の実施形態では、組成物はまた、所望の分子が吸収またはカプセル化されているメンブレン、スポンジまたは他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の適切な組織または臓器に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与を介して行うことができる。
ＶＩ．治療・使用方法
第９の態様において、本発明は、抗原活性が有害である障害を治療する方法に関し、本発明の第１から第３の態様のいずれか１つの結合タンパク質の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。一部の実施形態では、薬剤として使用するための多重特異性結合タンパク質が提供される。
結合タンパク質は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに１つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量のための免疫沈降アッセイにおいて使用することができる。結合タンパク質は、使用されるアッセイ方法に適した親和性で１つまたはそれ以上の標的抗原に結合する。
診断用途のために、一部の実施形態では、結合タンパク質は、検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成することができる任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎもしくは６７Ｇａ；蛍光性または化学発光性化合物、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン；または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。
結合タンパク質はまた、インビボでのイメージングに有用である。検出可能な部分で標識された結合タンパク質は、動物に、例えば、血流中に投与することができ、宿主中の標識抗体の存在および位置がアッセイされる。結合タンパク質は、核磁気共鳴、放射線学、または当該技術分野において公知である他の検出手段による否かにかかわらず、動物において検出可能な任意の部分で標識することができる。
臨床または研究用途のために、一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞毒性剤にコンジュゲートされる。細胞毒性剤（すなわち、抗体－薬物コンジュゲート）に結合された種々の抗体が、特定の腫瘍細胞に細胞毒性ペイロードを標的化するために使用されている。細胞毒性剤、および薬剤を抗体にコンジュゲートするリンカーは、当該技術分野において公知である；例えば、Ｐａｒｓｌｏｗ，Ａ．Ｃ．ら、（２０１６年）Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ４巻：１４頁、およびＫａｌｉｍ，Ｍ．ら、（２０１７年）Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．１１巻：２２６５～２２７６頁を参照されたい。
本開示はまた、生物学的試料中の標的抗原レベルを検出するのに有用な結合タンパク質および他の試薬を含むキットを指す。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照試料、ならびに検出試薬を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される任意の結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、ベクターシステム、および／または宿主細胞を含む組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、容器と、容器上または容器と関連するラベルまたはパッケージ挿入物とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成される。容器は、それ自体で、または状態を治療、予防および／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有するバイアルであり得る）。一部の実施形態では、ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が、選択される状態を予防、診断および／または治療するために使用されることを示す。あるいはまたはさらに、製造物品またはキットは、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含むことができる。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、癌を治療または予防するために、それを必要とする患者に投与される。一部の実施形態では、本開示は、増殖性疾患または障害（例えば、癌）を予防および／または治療する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される結合タンパク質またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも１つの治療有効量を患者に投与することを含む。一部の実施形態では、患者はヒトである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法（例えば、当該技術分野において公知である任意の抗癌療法化学療法剤または療法）と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法の前に投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法と同時に投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗レトロウイルス療法の後に投与される。
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、これらが変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施態様では、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．およびＫｏｌｂ，Ｈ．編集、（１９９５年）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるように定義される。本明細書に別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。いずれかの潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に提供される定義は、任意の辞書または外来的定義よりも優先される。文脈上別段の要求がない限り、単数語は複数を含み、複数語は単数語を含むものとする。「または」の使用は、特に断らない限り、「および／または」を意味する。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定するものではない。本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、単数形は、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数の参照を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
さらに、本明細書に記載された実験は、特に断らない限り、当業者の範囲内で従来の分子および細胞生物学的ならびに免疫学的技術を使用する。このような技術は、熟練作業者に周知であり、文献で十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７～２００８年）、補遺含む、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）、ＭＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１４章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０１３年、第２版）を参照されたい。
本明細書の本文中には、いくつかの文献が引用されている。本明細書に引用される各文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、上述のものであれ下記のものであれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明によりこのような開示に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。
以下において、本発明のエレメントを説明する。これらのエレメントは、特定の実施形態で記載されるが、しかしながら、追加の実施形態を作製するために、任意の方法および任意の数で組み合わせることができることを理解するべきである。様々に説明された実施例および好ましい／特定の実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施形態を任意の数の開示されたおよび／または好ましいエレメントと組み合わせる実施形態を支持し、包含するものと理解されるべきである。さらに、文脈上別段の指示がない限り、本出願に記載されたすべてのエレメントの置換および組合せは、本出願の明細書によって開示されたものとみなされるべきである。
一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本明細書に提供される方法および技術は、一般的に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、ならびに他に指示されない限り、本明細書全体を通じて引用されおよび検討される、種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように行われる。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるかまたは本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および医薬化学と関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤、および送達、患者の治療には標準的な技術が用いられる。
実施例１：適切な置換足場の同定
本明細書に開示される結合タンパク質は、種々の抗体フォーマットにおけるノックアウトＶＨ／ＶＬドメインによる１つのＣＨ１／ＣＬ対の置換を含む（図１、２、７、および１０～１３を参照されたい）。ＣＨ１／ＣＬ二量体を置換するための適切な置換足場を同定するために、ある種のＶＨ／ＶＬ対へのジスルフィド架橋の導入を調べた。さらに、発現性および別のＶＨ／ＶＬ対への融合を調べた。
トラスツズマブは、正しい軽鎖対合の問題を解決するために、ＣＨ１／ＣＬ二量体を置換するための適切な置換足場であることが決定された。
実施例２：ＣＨ１／ＣＬを置換するためのトラスツズマブ変数ドメインの使用
ＶＨ４４およびＶＬ１００位でのシステイン残基は、トラスツズマブのＶＨ／ＶＬ間のジスルフィド結合（本明細書ではｄｓ－トラスツズマブと呼ばれる）を生成し、それによってヘテロ二量体を安定化させるのに適合していることが決定された。その熱安定性を決定するために、ｄｓ－トラスツズマブドメインをＤ－ＰＢＳ緩衝液（ＧＩＢＣＯ）中１ｍｇ／ｍＬの濃度で１４日間４０℃でインキュベートした。同じ濃度の対照試料を－８０℃および４℃に保持した。ストレス試験の完了後、試料をその凝集含量について分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。分析用ＳＥＣは、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）およびＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ ＨＰＬＣガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて２５℃でＢｉｏＳＥＣｃｕｒｉｔｙ装置（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて行った。２５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ６．７を用いて０．２５ｍｌ／分の流速で分析物を泳動し、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍで検出した。静的光散乱を４３６ｎｍで検出した。５μｌのタンパク質試料（１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに適用した。データ評価をＷｉｎＧＰＣソフトウェアｖ８．１（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて行った。分子量を推定するために、ＳＥＣカラムを６．５～６７０ｋＤａの分子量範囲のタンパク質標準で較正した。
ｄｓ－トラスツズマブ足場（ＶＨ４４／ＶＬ１００システイン修飾を伴う）は、４℃までに熱安定性を増大させることが見出された（図３Ａ～Ｃを参照されたい）。
実施例３：疑似ＩｇＧ設計におけるＶＨ／ＶＬへの接続の調査
ＣＨ１／ＣＬの置換足場としてジスルフィド結合安定化トラスツズマブ骨格を含む疑似ＩｇＧ１構築物を作製した。ｄｓ－トラスツズマブ足場をＧ４Ｓまたは（Ｇ４Ｓ）２リンカーで目的のＶＨ／ＶＬ対に融合させた（図６を参照されたい）。
融点の決定（Ｔｍ）
融点（Ｔｍ）を示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）を用いて測定した。試料をＤ－ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で希釈して、白色セミスカート９６ウェルプレート（ＢＩＯＲＡＤ）のＤ－ＰＢＳ中にＳＹＰＲＯ－オレンジ色素の４倍濃縮溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＭＳＯ中の５０００×ストック）を含む最終濃度０．２μｇ／μｌとした。すべての測定は、ＭｙｉＱ２リアルタイムＰＣＲ装置（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて二重に行った。融解曲線の負の一次微分曲線（－ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ）をｉＱ５ソフトウェアｖ２．１（ＢＩＯＲＡＤ）で生成した。次に、データをＥｘｃｅｌにエクスポートして、Ｔｍ決定およびデータのグラフィック表示を行った。
６つの抗体配列をｄｓ－トラスツズマブと融合させて発現させ、各融合タンパク質のプロテインＡ精製および融解温度に続いてモノマー％、ならびにｄｓ－トラスツズマブドメインを伴わない疑似ＩｇＧ抗体を下記の表４に記載する。発現レベルはＷＴ－ＩｇＧと比較してわずかに低く、モノマー含量はＷＴ－ＩｇＧと比較してわずかに低かった。
実施例４：ｄｓ－Ｔｒａｓノックアウト（ｄｓＴｒａｓＫＯ）変異体の作製
トラスツズマブの結合活性は、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２（ＨＥＲ２）に対する抗体の結合能力に影響を与えるために、トラスツズマブ抗体のパラトピック領域に４つの重要なアミノ酸残基突然変異を導入することによってノックアウトされた。トラスツズマブは、ＰＤＢ公開データベースにおいて入手可能であるＰＤＢ構造１Ｎ８Ｚに基づいてモデル化された。重鎖上の４つの位置は、ｄｓ－トラスツズマブとその抗原の相互作用を潜在的に破壊することが同定された。これらの位置には、ＨＥＲ２上のグルタミン酸とアスパラギン酸を結合するアルギニンＲ５９とＲ５０の両方が含まれる。アルギニン残基をグルタミン酸残基に突然変異させることによる電荷の反転は、ＨＥＲ２の反発をもたすべきである。科学的理論に拘束されることを意図せずに、他の２つの位置チロシンＹ３３およびＹ１０５は、フェニルアラニンとのπ－π相互作用によって複合体を安定化するようであった。科学的理論にとらわれることを意図せずに、アラニンの突然変異はこの相互作用を妨げるべきである。１Ｎ８Ｚファイルの結晶学的データをＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏスイートで分析した。抗体（トラスツズマブｆａｂ）とその標的（ＨＥＲ２タンパク質ドメイン）の間の既存の界面領域に特に注意を払った（図４を参照されたい）。
１Ｎ８Ｚ共結晶界面領域の分析
抗体および標的界面領域分析の間、すべての非共有相互作用は、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ非結合相互作用モニターを用いて適格化された。得られた表の抽出物を表５に示す。表５は、各相互作用について、相互作用する原子間の距離、相互作用のタイプの性質、および相互作用する原子の特徴を示す。
トラスツズマブｆａｂとＨＥＲ２タンパク質の間に生じる非共有相互作用の表に基づいて、結合相互作用を破壊するためにある種の相互作用を消失させるように選択した。
結合相互作用を妨げる突然変異の推奨される組合せ
以下の４つのアミノ酸残基突然変異は、元のトラスツズマブ配列を維持するために、非結合相互作用データに基づいて選択された。
トラスツズマブ重鎖アルギニン５０残基の場合：
抗体のこのアルギニン残基は、ＨＥＲ２残基のグルタミン酸５５８およびアスパラギン酸５６０と塩架橋相互作用を起こす。ＨＥＲ２残基のグルタミン酸５５８およびアスパラギン酸５６０の反発を生じさせるために、アルギニン５０をグルタミン酸残基に突然変異させた。
トラスツズマブ重鎖アルギニン５９残基の場合：
抗体のこのアルギニン残基は、ＨＥＲ２残基のグルタミン酸５５８およびアスパラギン酸５６０と塩架橋相互作用を起こす。ＨＥＲ２残基のグルタミン酸５５８およびアスパラギン酸５６０の反発を生じさせるために、アルギニン５９をグルタミン酸残基に突然変異させた。
チロシン重鎖アルギニン３３残基の場合：
抗体のこのチロシン３３残基は、ＨＥＲ２残基のフェニルアラニン５７３とπ相互作用を起こす。抗体とその標的の間で生じるこれらのπ相互作用を破壊させるために、チロシン３３をアラニン残基に突然変異させた。
チロシン重鎖アルギニン１０５残基の場合：
抗体のこのチロシン１０５残基は、ＨＥＲ２残基のフェニルアラニン５７３とπ相互作用を起こす。抗体とその標的の間で生じるこれらのπ相互作用を破壊するために、チロシン１０５をアラニン残基に突然変異させた。
突然変異が推奨されているアミノ酸残基の特定の組合せを表６に示す。これらの組合せは、トラスツズマブ抗体の２つの変異体をもたらす。
変異型１ Ｆａｂは全４つの点突然変異を含む。２つの正に荷電した残基を負に荷電した残基に戻した変異型２ Ｆａｂは、ＨＥＲ２タンパク質に対する反発領域を元のトラスツズマブＨＥＲ２結合領域に有する。ＨＥＲ２フェニルアラニン５７３とのπ相互作用の破壊を伴う変異型３ Ｆａｂは、トラスツズマブ－ＨＥＲ２複合体の不安定化を誘導する。全３つのｄｓＴｒａｓＫＯ変異体は、ＨＥＲ２への結合を消失させることが見出された（図５Ａ～図５Ｂを参照されたい）。変異体２（ｄｓＴｒａｓＫＯ２）が最良の生産者であることが同定された。
実施例５：ＣＨ１／ＣＬの置換足場としてのｄｓＴｒａｓＫＯ２の評価
ｄｓＴｒａｓＫＯ変異体を疑似ＩｇＧ（単一特異性）フォーマット（図６Ａ参照）および疑似Ｆａｂ（図６Ｂ参照）において評価した。試験した疑似ＩｇＧおよび疑似Ｆａｂフォーマットは、親抗体の発現および精製特徴と類似していた（表７を参照されたい）。
実施例６：ＣＨ１／ＣＬの置換足場としてｄｓＴｒａｓＫＯ２を用いる天然構造を有する二重特異性抗体の評価
ｄｓＴｒａｓＫＯ２ドメインは、天然ＩｇＧ構造を有する二重特異性抗体における置換足場として評価された。特に、ＦｃにおけるＲＦ突然変異を有する抗ＩＬ４－ｄｓＴｒａｓＫＯ（Ｖａｒ２）×抗ＩＬ１３－ｈｕＩｇＧ１二重特異性設計を合成した（図７を参照されたい）。
ｉ．ｄｓＴｒａｓＫＯ２二重特異性分子の発現
対応する構築物の両重鎖（ｄｓＴｒａｓＫＯ２ノブおよびＷＴ－ホール）および両軽鎖（ｄｓＴｒａｓＫＯおよびＷＴ－カッパ／ラムダ）をコードする発現プラスミドを大腸菌（ＤＨ５α）中で増殖させた。トランスフェクションに使用されるプラスミドをＱｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキットを用いて大腸菌から調製した。
Ｆ１７無血清懸濁培養（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖するＨＥＫ２９３－ＦＳ細胞をポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いて、指示された軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）プラスミドでトランスフェクトした。３７℃で７日間培養した後、遠心分離により細胞を除去し、上清を０．２２μｍフィルター上に通過させて粒子を除去した。
精製のために、抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（カタログ番号：１１－００３４－９３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（カタログ番号：１７－０５０８７－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて直接脱塩した。可能なホモ二量体ｄｓＴｒａｓＫＯ２単一特異性分子は、追加のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ捕捉工程（０．１ＭグリシンｐＨ２．７溶出緩衝液）を用いることによって選別される（図１４を参照されたい）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（ＧＥ）および最終限外濾過濃度工程を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、上記実施例２に記載されるように行った）によりタンパク質を最終精製（polish）した後、タンパク質をさらなる特徴付けのために使用した。ｄｓＴｒａｓＫＯ２二重特異性構築物の精製結果については表８を参照されたい。代表的な二重特異性設計および精製の結果については図７Ａ～図７Ｄを参照されたい。
ＣＨ１／ＣＬ対のｄｓＴｒａｓＫＯ２置換を含む二重特異性抗体の抗原結合の評価
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、抗体への抗原の結合を評価した。抗体構築物への抗原の結合は、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定された。ヒトＩＬ４（ＩＬ００４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびヒトＩＬ１３（ＩＬ０１２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヒトＨＥＲ２（１１２９２－ＥＲ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＴＮＦａ（Ｈ８９１６、ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヒトＣＴＬＡ４（ＣＴ４－Ｈ５２２９、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＰＤ－１（８９８６－ＰＤ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびヒトＩＬ６Ｒａ（２２７－ＳＲ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を抗原として使用した。抗ヒトＦｃ捕捉抗体（ヒト抗体捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準手順を用いて、研究グレードＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の第１級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して固定化した。リガンドを１０μｌ／分の流速で捕捉し、調整されたＲＵ値を用いて、分析物結合の最大値を３０ＲＵとした。ＨＥＲ２との結合試験は、抗原を抗ヒトＦｃ抗体で捕捉することによって行われた。試験した抗体構築物を分析物として使用し、３０μＬ／分の流速にて１００ｎＭ濃度で２４０秒間注入し、解離時間は３００秒であった。結合動力学測定は、捕捉された抗体を用いて、３ｎＭ～１００ｎＭの分析物の２倍系列希釈液を注入して行った。ヒトＩＬ４およびＩＬ１３について、それぞれ０．１ｎＭ～３ｎＭおよび０．８ｎＭ～２５ｎＭの希釈系列を使用した。チップ表面を捕捉キットとともに提供される再生緩衝液を２分間注入することにより再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰ緩衝液ブランクで二重参照した。データ分析は、ＢＩＡ評価ソフトウェアｖ４．１を用いて行われた。ｍＡｂ、疑似ＩｇＧおよび二重特異体（bispecifics）の結合特性を下記の表９に示す。
ＳＰＲの結果は、ｄｓＴｒａｓＫＯ２に融合した種々のＶＨ／ＶＬが二重特異性抗体などの親抗原結合親和性を保持することを示した。
タンパク質完全性の分析
ヘテロ二量体構築物のタンパク質完全性および潜在的な誤対合をＬＣ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分析した。タンパク質試料を、３７℃で１５時間、０．５μｌのＰＮＧａｓｅＦ（グリセロール不含、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理されたＤ－ＰＢＳ緩衝液中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した１２．５μｇのタンパク質を用いて脱グリコシル化した。ＬＣ－ＭＳ分析は、６５４０ＵＨＤ精密質量Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行われた。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーは、１８０μＬ／分でガードカラムＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ８、５μｍ、２．１×１２．５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を有するポロシェル３００ＳＢ－Ｃ８、５μｍ、７５×０．５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行われた。溶出液は、ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ａ）および９０％アセトニトリル、１０％ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ｂ）であった。２μｇのタンパク質をカラムに注入し、０％から１００％Ｂの直線勾配を用いて１３分間で溶出した。データ分析はＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアＢ．０６（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行われた。分子量は、ＧＰＭＡＷソフトウェアバージョン９．１３ａ２（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅデータ）を用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された。ｄｓＴｒａｓＫＯ２－抗体融合タンパク質は、ほとんど無傷であり、正しいヘテロ二量体対合を示すことが示された（下記の表１０を参照されたい）。
ＬＣ－ＭＳ分析に加えて、二重特異性試料はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分析され、潜在的な誤対合または予想外の種を検出した。分析用ＨＩＣは、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ １０μｍ、２×７５ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＬＣ１０ ＨＰＬＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて２５℃でを行われた。分析を０．１ｍｌ／分の流速で行い、検出波長は２８０ｎｍであった。５μｇの未希釈タンパク質試料をカラムに適用した。勾配溶出は０～３０分間（０～１００％Ｂ）であり、続いて１０分間の１００％Ｂおよび１５分間の再平衡化であった。緩衝液Ａは、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成された。緩衝液Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成された。データ評価はＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアｖ５．８５（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて行われた。データは、ｄｓＴｒａｓＫＯ２－二重特異性試料が、予期せぬ種が存在しないことを示す、均一なＨＩＣプロファイルを有し、二重特異性試料が正しい対合を有することを示した（図８を参照されたい）。
熱安定性：疑似ＩｇＧと二重特異体の比較
ｄｓＴｒａｓＫＯ２疑似ＩｇＧおよび二重特異性試料の熱安定性は、上記実施例２に記載されるように評価された。融点（Ｔｍ）は、実施例３に記載されるように、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）を用いて決定された。ｄｓＴｒａｓＫＯ２ベースの構築物は、親モノクローナルＩｇＧと比較して融解温度の低下を示し、２週間の熱安定性アッセイ（４０℃、４℃および－８０℃）において安定性の障害は検出されなかった（下記表１１を参照されたい）。
実施例７：疑似Ｆａｂ ＩＬ－１３の結晶構造
ｄｓＴｒａｓＫＯ２－ＩＬ１３－疑似Ｆａｂの結晶化を構造研究のために行った。結晶化試験は、１：１のタンパク質：リザーバー比を用いた標準的な２滴、９６ウェルＭＲＣプレートにおける座滴実験として設定し、２０℃でインキュベートした。ＴｒａｓＫＯ２－ＣＨ１／ＣＬと抗ＩＬ１３－ＴｒａｓＫＯ２の両方は、市販されている種々の疎マトリックススクリーンに対する結晶化ヒットについてスクリーニングされた。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．１Ｍ塩化ナトリウム中のＴｒａｓＫＯ２－ＣＨ１／ＣＬ（１５ｍｇ／ｍｌのストック）および抗ＩＬ１３－ＴｒａｓＫＯ２（１５．６ｍｇ／ｍｌのストック）用のスクリーニング液滴は、１００ｎｌのタンパク質溶液を１００ｎｌのリザーバー溶液と混合することによって調製され、８０μｌのリザーバーに対する座滴蒸気拡散実験において平衡化された。データ回収および構造溶液に適したＴｒａｓＫＯ２－ＣＨ１／ＣＬの最終結晶は、０．１Ｍリン酸クエン酸ナトリウムｐＨ４．２、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００および０．２Ｍ塩化ナトリウムからなるリザーバー溶液を用いて２０℃で成長させた。回折品質抗ＩＬ１３－ＴｒａｓＫＯ２結晶は、０．１ＭのＣＨＥＳ ｐＨ９．５および２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００からなるリザーバー溶液で成長させた。すべての結晶は、２５％（ｗ／ｖ）エチレングリコール（最終濃度）の添加により液体窒素中でのフラッシュ冷却の前に凍結保護された。
データ回収および構造決定
回折データをＳｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＳＬＳ）、Ｖｉｌｌｉｎｇｅｎ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのビームラインＰＳＩＩで収集した。回折データは、ＣＣＰ４プログラムスイート（Ｗｉｎｎら、２０１１年）のＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ、２０１０年）およびＡＩＭＬＥＳＳ（Ｅｖａｎｓ ＆ Ｍｕｓｈｕｄｏｖ、２０１３年）の組合せを用いて処理された。ＴｒａｓＫＯ２－ＣＨ１／ＣＬは、空間群Ｉ２３中で結晶化され、セルパラメータは１５３．２３Å、１５３．２３Å、１５３．２３Å、９０．００°、９０．００°、９０．００°であり、データは３．７０Åの解像度に拡張された。抗ＩＬ１３－ＴｒａｓＫＯ２の結晶は、空間群Ｐ３２２１に属し、セルパラメータは１４５．３７ １４５．３７ ５２．０６ ９０．００ ９０．００ １２０．００であり、１．８５Åに回折した。
ＰｈａｓｅｒのＣＣＰ４実施を用いた分子置換によって構造を解明した（ＭｃＣｏｙら、２００７年）。ＴｒａｓＫＯ２－ＣＨ１／ＣＬについて、トラスツズマブ－ＶＨ－ＶＬドメインの修飾バージョン、およびｐｄｂ－エントリー１ｎ８ｚのＣＨ１／ＣＬドメインを検索モデルとして使用した。抗ＩＬ１３－ＴｒａｓＫＯ２上の分子置換は、Ｆａｂ抗ＩＬ１３のＳａｎｏｆｉ内部構造の抗ＩＬ１３ ＶＨ／ＶＬドメイン、および位相モデルとしての１ｎ８ｚ ＶＨ／ＶＬドメインの改変バージョンを用いて行われた。原子モデルは、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙら、２０１０年）およびＲｅｆｉｎｅ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ、２０１７年）を用いた手動モデル構築および改良の反復ラウンドによって構築された。最終モデルのＲ因子およびＲフリー因子は、ＴｒａｓＫＯ２－ＣＨ１／ＣＬについては１９．２／２３．２であり、抗ＩＬ１３－ＴｒａｓＫＯ２については２１．０／３１．２である（結晶構造については図９を参照されたい）。
実施例８：置換足場ＣＨ１／ＣＬとしてｄｓＴｒａｓＫＯ２を用いるタンデム構造を有する二重特異性抗体の評価
ｄｓＴｒａｓＫＯ２ドメインが、二重特異性タンデムＩｇＧ設計における置換足場として評価された。特に、抗ＧＩＴＲ－ｄｓＴｒａｓＫＯ２×抗ＯＸ４０－カッパ］－ｈｕＩｇＧ１タンデムＩｇＧ設計を合成し、試験した（図１０～１２を参照されたい）。
ｄｓＴｒａｓＫＯ２二重特異性タンデム分子の発現
対応する構築物の重鎖および両軽鎖（ｄｓＴｒａｓＫＯおよびＷＴ－カッパ／ラムダ）をコードする発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ中で増殖させた。トランスフェクションに使用されるプラスミドをＱｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキットを用いて大腸菌から調製した。Ｆ１７無血清懸濁培養（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖するＨＥＫ２９３－ＦＳ細胞をポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いて、指示されたＬＣおよびＨＣプラスミドでトランスフェクトした。３７℃で７日間培養した後、遠心分離により細胞を除去し、上清を０．２２μｍフィルター上に通過させて粒子を除去した。精製のために、抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（カタログ番号：１１－００３４－９３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（カタログ番号：１７－０５０８７－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて直接脱塩した。可能なホモ二量体ｄｓＴｒａｓＫＯ２単一特異性分子は、追加のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ捕捉工程（０．１ＭグリシンｐＨ２．７溶出緩衝液）を用いることによって選別される（図１４を参照されたい）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（ＧＥ）および最終限外濾過濃度工程を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりタンパク質を最終精製した後、タンパク質をさらなる特徴付けのために使用した。代表的な二重特異性設計および精製の結果については図１２Ａ～１２Ｄを参照されたい。
実施例９：ＣＨ１／ＣＬの置換足場としてｄｓＴｒａｓＫＯ２を用いたＣＯＤＶ構造を有する三重特異性抗体の評価
ｄｓＴｒａｓＫＯ２ドメインは、三重特異性クロスオーバー変異体ドメイン（ＣＯＤＶ）設計における置換足場として評価された。特に、ＣＯＤＶ－抗Ｏｘ４０×抗ＰＤ１］×抗ＣＤ１３７－ｄｓＴｒａｓＫＯ２－ｈｕｌｇＨｕＧ１－ＬＡＬＡ－ＫＩＨ－ＲＦ構築物を合成し、試験した（図１３を参照されたい）。
ｄｓＴｒａｓＫＯ２三重特異性ＣＯＤＶ分子の発現
重鎖および両軽鎖（ｄｓＴｒａｓＫＯおよびＷＴ）をコードする発現プラスミド、ならびに対応する構築物の両重鎖（ＣＯＤＶ－ノブおよびｄｓＴｒａｓＫＯ２－ホール）および両軽鎖（ＣＯＤＶおよびｄｓＴｒａｓＫＯ）をコードする発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ中で増殖させた。トランスフェクションに使用されるプラスミドをＱｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキットを用いて大腸菌から調製した。Ｆ１７無血清懸濁培養（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖するＨＥＫ２９３－ＦＳ細胞をポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いて、指示されたＬＣおよびＨＣプラスミドでトランスフェクトした。３７℃で７日間培養した後、遠心分離により細胞を除去し、上清を０．２２μｍフィルター上に通過させて粒子を除去した。精製のために、抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（カタログ番号：１１－００３４－９３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（カタログ番号：１７－０５０８７－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて直接脱塩した。試料をさらに、ＭｏｎｏＳ陽イオン交換カラム（カタログ番号：１７－５１６９－０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、０．０１ＭのＬ－ヒスチジンｐＨ６．０緩衝液中の０～１ＭのＮａＣｌ塩勾配）で精製した。限外濾過濃縮工程の後、タンパク質をさらに特徴付けるために使用した。代表的な三重特異性設計および精製結果については図１３Ａ～図１３Ｄを参照されたい。
実施例１０：ＣＨ１／ＣＬの置換足場としてｄｓＴｒａｓＫＯ２を用いる二重特異性Ｔ細胞誘導抗体の評価
一般的方法
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析ＳＥＣは、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ３００カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）およびＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ３００ガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えたＢｉｏＳＥＣｃｕｒｉｔｙ装置（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて２５℃で行われた。２×濃縮したＤ－ＰＢＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて０．５ｍｌ／分の流速で分析を行い、２８０ｎｍで検出した。１０μｌのタンパク質試料（１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに適用した。データ評価はＷｉｎＧＰＣソフトウェアｖ８．１（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて行った。分子量を推定するために、ＳＥＣカラムをタンパク質較正標準ミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で較正した。
分析用疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
分析用ＨＩＣは、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６×３５ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＬＣ１０ ＨＰＬＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）またはＶａｎｑｕｉｓｈ ＨＰＬＣ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２５℃で行われた。流速１ｍｌ／分で分析を行い、２８０ｎｍで検出した。５μｇの未希釈タンパク質試料をカラムに適用した。勾配溶出は、１５％Ｂから８５％Ｂまで７分間、続いて１００％Ｂまで１分間、次に１５％Ｂまで１分間とし、次に１５％Ｂで３分間平衡化した。緩衝液Ａは、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成される。緩衝液Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成された。データ評価は、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェア ｖ５．８５（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）またはＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを用いて行われた。
ｎａｎｏＤＳＦ
タンパク質変性の開始温度（Ｔ開始）および融点（Ｔｍ）をナノ示差走査蛍光測定（ｎａｎｏＤＳＦ）を用いて測定した。試料を製剤緩衝液中で０．５μｇ／μｌの最終濃度に希釈し、ナノＤＳＦキャピラリー（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に二重に装填した。すべての測定は、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．ｐｌｅｘナノＤＳＦデバイス（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。加熱速度は２０℃～９５℃で１℃／分であった。データは、ＰＲ．ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．３．１（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて記録され、ＰＲ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．０．３（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
抗体構築物への抗原の結合をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ）を用いたＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定した。結合動力学および親和性決定のために、ヒトＣＤ３εδ－Ｆｃ－ＨｉｓおよびヒトＣＤ１２３－Ｆｃ－Ｈｉｓ融合タンパク質（両方とも内部源由来）を抗原として使用した。抗Ｈｉｓ捕捉抗体（Ｈｉｓ捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を標準手順を用いて、研究グレードＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上の第１級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して固定化した。抗原は、１０～３０ＲＵの間の抗体結合レベルに到達させるために、１０μＬ／分の流速で９０秒間、抗Ｈｉｓ捕捉チップ表面によって捕捉された。ＣＤ１２３親和性を決定するために１００ｎＭ～３．１ｎＭの２倍希釈系列において、およびＣＤ３結合親和性を決定するために４００ｎＭ～３．１ｎＭまたは１００ｎＭ～３．１ｎＭの２倍希釈系列において、抗体を２４０秒間、３０μＬ／分で注入した。解離は、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を１２００秒間注入することにより３０μＬ／分で測定された。再生緩衝液（Ｈｉｓ捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を注入することにより、チップ表面を再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液ブランクで二重参照した。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ１．１１．７４４２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、動力学ならびに親和性定数ｋａ、ｋｄおよびＫＤを決定するための１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。
ＣＤ３およびＣＤ１２３に対する抗体の相対的結合レベル（Ｒｍａｘ％）を評価するために、抗体をセンサーチップへの抗Ｆｃ親和性捕捉によって捕捉した。このアッセイでは、ヒトＣＤ３εδ－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ（＃ＣＴ０３８－Ｈ２５０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびヒトＣＤ１２３（＃３０１－Ｒ３／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を用いた。抗ヒトＦｃ捕捉抗体（ヒト抗体捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を標準手順を用いて、研究グレードＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の第１級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して固定化した。抗体を流速１０μｌ／分で捕捉し、調整されたＲＵ値を用いて、１０～３０ＲＵの最大分析物結合をもたらした。抗原を分析物として使用し、ＣＤ３εδ－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓについては４００ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のいずれかで、ＣＤ１２３については１００ｎＭ濃度で注入した。抗原を３０μＬ／分の流速で２４０秒間注入し、解離時間は３００秒であった。チップ表面を捕捉キットとともに提供される再生緩衝液を２分間注入することにより再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰ緩衝液ブランクで二重参照した。データ分析および結合レベルの決定をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ１．１１．７４４２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。Ｒｍａｘ％値は、理論的Ｒｍａｘ値で割った最大結合レベルを用いて計算された。理論的Ｒｍａｘ値は、捕捉レベルＲ捕捉、結合化学量論測定Ｎ、およびＲｍａｘ＝Ｒｃａｐｔｕｒｅ×Ｎ×（Ｍｗ（Ａｇ）／Ｍｗ（Ａｂ））を有する抗体Ｍｗ（Ａｂ）および抗原Ｍｗ（Ａｇ）の分子量から計算された。
質量分析
ヘテロ二量体構築物のタンパク質完全性および潜在的な誤対合をＬＣ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分析した。タンパク質試料をＬＣ－ＭＳグレード水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で０．１７ｍｇ／ｍＬに希釈した１２．５μｇのタンパク質を用いて脱グリコシル化し、０．５μＬのＰＮＧａｓｅＦ（グリセロール不含、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で３７℃にて１６時間処理した。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析装置を用いて行われた。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーは、ＭａｂＰａｃ ＲＰ ＨＰＬＣカラム、分析用粒子サイズ４μｍ、２．１×１００ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３００μＬ／分で行われた。溶出液は、ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ａ）および９０％アセトニトリル、１０％ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ｂ）であった。２μｇのタンパク質溶液をカラムに注入し、０％から９５％Ｂの直線勾配を用いて１２分間で溶出した。データ分析はＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔソフトウェア１３．０．３（Ｇｅｎｅｄａｔａ）を用いて行われた。分子量は、ＧＰＭＡＷソフトウェアバージョン１０．３２ｂ１（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅデータ）を用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された。
二重特異性ＴｒａｓＫＯ２分子による細胞毒性アッセイ
二重特異性ＴｒａｓＫＯ２分子は、初代ヒトＴ細胞を用いた細胞毒性アッセイにおいて分析された。健康なドナーの血液からのヒト末梢単核細胞を１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃１０７７１）および１０分間、１０００×ｇでの遠心分離を用いてＬｅｕｃｏｓｅｐ－Ｔｕｂｅｓ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、＃２２７２９０）中で単離した。単離されたＰＢＭＣを５％ＭＡＣＳ ＢＳＡストック溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９１－３７０）が補足されたａｕｔｏＭＡＣＳリンシング緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９１－２２２）中で２回洗浄した。一次ヒトＴ細胞をＭＡＣＳｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９６－５３５）を用いて、製造業者のプロトコルを用いてヒトＰＢＭＣから単離した。単離されたヒトＴ細胞を１０％ＦＣＳ ＨＩ（Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）が補足されたＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃７２４００）に５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞毒性アッセイに先立って、ＴＨＰ－１標的細胞（ＡＤＣＣ ＴＩＢ－２０２）を１μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｃ１１５７）で１５分間、３７℃にて染色した。細胞をＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ培地中で２回洗浄し、４００×ｇで５分間遠心分離した。ＴＨＰ－１標的細胞を１０％ＦＣＳ ＨＩが補足されたＲＰＭＩ培地に５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。ＣＦＳＥ標識されたＴＨＰ－１細胞およびヒトパンＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的比で混合し、９６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ、＃６５０１８５）中で１００μｌ／ウェルの全体積で播種した。５μＬ／ウェルの体積で１０ｎＭ～０ｎＭ（１：６希釈）から開始した１１希釈系列において二重特異性ＴｒａｓＫＯ２分子を細胞に添加し、２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を５μｇ／ｍＬの７－ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１３１０）で３０分間、４℃にて染色した。細胞毒性を決定するために、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）上でＣＦＳＥ／７－ＡＡＤ二重陽性ＴＨＰ－１細胞をゲートすることにより死細胞を測定し、ＥＣ５０値をＸｌｆｉｔソフトウェアを用いて決定した。
ｄｓＴｒａｓＫＯ２ドメインは、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体設計における置換足場として評価された。抗ＴＣＲα／βまたは２つの異なる抗ＣＤ３εのうちの１つをエフェクターアームとして、および抗ＣＤ１２３を標的アームとして用いることにより、二重特異性Ｔ細胞誘導剤を作製した。ＴＮＰ抗体配列（トリニトロフェノール抗体）を用いて両アームの陰性対照を作製した。二重特異性タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅで精製し、続いてＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＳＥＣで精製した。二重特異性抗体は、野生型二重特異性ＩｇＧ（天然に存在する誤対合の検出）またはＦａｂアーム（両方とも可能な再操作されたＦａｂアームが生成された）の１つの上のＴｒａｓＫＯ２置換のいずれかで発現させた。二重特異性抗体の生物物理学的特徴付けを下記の表１２に記載する。
上記の生物物理学的特徴付けに加えて、二重特異性ＴｒａｓＫＯ２分子を細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて分析した。図１５Ａに示されるように、全３つの抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３二重特異性抗体は同等であり、強力な活性を示した。抗体ＩＤ番号３４および３５におけるｄｓＴｒａｓＫＯ２ドメインの存在は、鎖の誤対合を低減させながら、活性に負の影響を及ぼさなかった。ＴＮＰ抗体配列を含む陰性対照抗体ＩＤ番号４５および４６を用いた。図１５Ｂに示されるように、全３つの抗ＣＤ３ε×抗ＣＤ１２３二重特異性抗体は、代替抗ＣＤ３ε結合ドメインを有し、同様に同等であり、強力な活性を示した。抗体ＩＤ番号３７および３８におけるｄｓＴｒａｓＫＯ２ドメインの存在は、鎖の誤対合を低減させながら、活性に負の影響を及ぼさなかった。陰性対照として、ＴＮＰ抗体配列を含む抗体ＩＤ番号４７および４８を用いた。

Claims (34)

  1. 結合タンパク質であって、
    （１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む少なくとも１つの疑似Ｆａｂ部分
    を含み、ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記結合タンパク質。
  2. 結合タンパク質が、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した少なくとも第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）をさらに含む多重特異性結合タンパク質である、請求項１に記載の結合タンパク質。
  3. 多重特異性結合タンパク質であって、
    ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分；
    ｂ）（３）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）と、（４）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメインとを含む第１のＦａｂ部分
    を含み、
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記多重特異性結合タンパク質。
  4. 多重特異性結合タンパク質であって、
    ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）と、（２）第１の安定化ノックアウトドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）と対合した第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）とを含む第１の疑似Ｆａｂ部分；
    ｂ）（３）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）と、（４）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメインとを含む第１のＦａｂ部分；および
    ｃ）第１のＦａｂ部分および第１の疑似Ｆａｂ部分を操作可能に連結するリンカー部分を含み、
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記多重特異性結合タンパク質。
  5. リンカー部分がペプチドリンカーである、請求項１～４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  6. ペプチドリンカーが、式（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）n（ｎは１～１０である）のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、請求項５に記載の結合タンパク質。
  7. リンカー部分がヘテロ二量体化ドメインである、請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  8. 独立して１つまたは２つの第１の疑似Ｆａｂ部分および１つまたは２つの第１のＦａｂ部分を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  9. 以下の群：
    （ａ）ＶＨａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨｂ－Ｌ２－ＶＨＸおよびＶＬａ－ＣＬおよびＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬＸ；
    （ｂ）ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨｂ－ＣＨ１およびＶＬａ－Ｌ３－ＶＬＸおよびＶＬｂ－ＣＬ；
    （ｃ）ＶＨａ－ＣＨ１－Ｌ１－ＶＨａ－ＣＨ１およびＶＨｂ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－Ｌ４－ＶＨＸ、ならびに２つの鎖ＶＬｂ－Ｌ５－ＶＬＸおよび２つの鎖ＶＬａ－ＣＬ
    のうちの１つから選択される別々のタンパク質鎖を含み、
    （ａ）および（ｂ）の鎖は１回または２回存在することができ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、独立して同一であるかまたは異なるリンカーである、請求項１～８のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  10. 第１の疑似Ｆａｂ部分が、式：
    （Ｉａ）Ｎ－ＶＨａ－Ｌ１－ＶＨＸ－Ｃ
    で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
    （ＩＩａ）Ｎ－ＶＬａ－Ｌ２－ＶＬＸ－Ｃ
    で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
    を含み、
    式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す、請求項１～９のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  11. 第１の疑似Ｆａｂ部分が、式：
    （Ｉｂ）Ｎ－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＨａ－Ｃ
    で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
    （ＩＩｂ）Ｎ－ＶＬＸ－Ｌ２－ＶＬａ－Ｃ
    で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
    を含み、
    式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す、請求項１～１０のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  12. 第１の疑似Ｆａｂ部分が、式：
    （Ｉｃ）Ｎ－ＶＬａ－Ｌ１－ＶＨＸ－Ｃ
    で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
    （ＩＩｃ）Ｎ－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＬＸ－Ｃ
    で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
    を含み、
    式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す、請求項１～１１のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  13. 第１の疑似Ｆａｂ部分が、式：
    （Ｉｄ）Ｎ－ＶＨＸ－Ｌ１－ＶＬａ－Ｃ
    で表される構造を有する第１のポリペプチド鎖、および式：
    （ＩＩｄ）Ｎ－ＶＬＸ－Ｌ２－ＶＨａ－Ｃ
    で表される構造を有する第２のポリペプチド鎖
    を含み、
    式中、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、これらは独立して存在するかまたは存在せず、ＮおよびＣはそれぞれＮ末端およびＣ末端を表す、請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  14. 結合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されている１つまたはそれ以上のさらなる結合ドメインをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  15. １つまたはそれ以上のさらなる結合ドメインが、第１または第２の疑似Ｆａｂ部分のＮ末端に作動可能に連結されている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の結合タンパク
    質。
  16. 多重特異性結合タンパク質であって、
    ａ）（１）標的抗原Ａに結合する第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合した第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）；
    （２）第１のジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成するための第１の安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合した第１に安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）；
    （３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
    を含む第１の疑似Ｆａｂ部分；
    ここで、ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される；
    ｂ）（１）標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成するための第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合した第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）；
    （２）第１のＣＬドメインと対合した第１のＣＨ１ドメイン；および
    （３）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
    を含む第１のＦａｂ部分
    を含む前記多重特異性結合タンパク質。
  17. 第１および第２のヘテロ二量体化ドメインが第１および第２のＦｃドメインを含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
  18. Ｆｃドメインが一般構造ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインを含む、請求項１６または１７に記載の結合タンパク質。
  19. 少なくとも２つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む多重特異性結合タンパク質であって、
    （ａ）第１のポリペプチドは、式：
    ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
    で表される構造を含み、
    （ｂ）第２のポリペプチドは、式：
    ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｃ）第３のポリペプチドは、式：
    ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｄ）第４のポリペプチドは、式：
    ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
    で表される構造を含み、
    式中、
    ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むＦｃドメインであり；ならびに
    Ｌ１およびＬ２は、独立して同一であるかまたは異なるアミノ酸リンカーであり、
    （１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
    （２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
    （３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記多重特異性結合タンパク質。
  20. ４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
    （ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
    ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
    ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
    で表される構造を含み、
    （ｃ）第５のポリペプチドは、式：
    ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ１［Ｖ］
    で表される構造を含み、
    （ｄ）第６のポリペプチドは、式：
    ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＶＩ］
    で表される構造を含み、
    式中、
    ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むＦｃドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、
    （１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標
    的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
    （２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
    （３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記抗原結合タンパク質。
  21. ４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
    （ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
    ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
    ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
    で表される構造を含み、
    （ｃ）第５のポリペプチドは、式：
    ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［Ｖ］
    で表される構造を含み、
    （ｄ）第６のポリペプチドは、式：
    ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ２［ＶＩ］
    で表される構造を含み、
    式中：
    ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むＦｃドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２およびＬ３はアミノ酸リンカーであり、
    式中、
    （１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
    （２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
    （３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記抗原結合タンパク質。
  22. ４つの抗原結合部位を形成する６つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
    （ａ）第１および第２のポリペプチドは、式：
    ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］および［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｂ）第３および第４のポリペプチドは、式：
    ＶＬｂ－ＣＬ［ＩＩＩ］および［ＩＶ］
    で表される構造を含み、
    （ｃ）第５のポリペプチドは、式：
    ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－Ｌ３－ＶＨａ－Ｌ４－ＶＨＸ－ＦＣ１［Ｖ］
    で表される構造を含み、
    （ｄ）第６のポリペプチドは、式：
    ＶＨｂ－ＣＨ１－Ｌ５－ＶＨｂ－ＣＨ１－ＦＣ２［ＶＩ］
    で表される構造を含み、
    式中、
    ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
    ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むＦｃドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５はアミノ酸リンカーであり、
    （１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
    （２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
    （３）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ）ドメインを形成し；
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記抗原結合タンパク質。
  23. ３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質であって、
    （ａ）第１のポリペプチドは、式：
    ＶＬａ－Ｌ１－ＶＬＸ［Ｉ］
    で表される構造を含み、
    （ｂ）第２のポリペプチドは、式：
    ＶＨａ－Ｌ２－ＶＨＸ－ＦＣ１［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｃ）第３のポリペプチドは、式：
    ＶＬｂ－Ｌ３－ＶＬｃ－Ｌ４－ＣＬ［ＩＩＩ］
    で表される構造を含み、
    （ｄ）第４のポリペプチドは、式：
    ＶＨｃ－Ｌ５－ＶＨｂ－Ｌ６－ＣＨ１－ＦＣ２［ＩＶ］
    で表される構造を含み、
    式中、
    ＶＬａは第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬｂは第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬｃは第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨａは第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨｂは第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインである；
    ＶＨｃは第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＶＬＸは安定化ノックアウト軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨＸは安定化ノックアウト重鎖可変ドメインであり；
    ＦＣ１およびＦＣ２は、免疫グロブリンヒンジ領域と、ＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含むＦｃドメインであり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はアミノ酸リンカーであり、
    （１）第１のＶＬドメイン（ＶＬａ）は第１のＶＨドメイン（ＶＨａ）と対合して、標的抗原Ａに結合する第１の機能的抗原結合部位を形成し；
    （２）第２のＶＬドメイン（ＶＬｂ）は第２のＶＨドメイン（ＶＨｂ）と対合して、標的抗原Ｂに結合する第２の機能的抗原結合部位を形成し；
    （３）第３のＶＬドメイン（ＶＬｃ）は第３のＶＨドメイン（ＶＨｃ）と対合して、標的抗原Ｃに結合する第３の機能的抗原結合部位を形成し；
    （４）式ＩＩＩのポリペプチドおよび式ＩＶのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対（ＣＯＤＶ）を形成し；
    （５）安定化ノックアウトＶＬドメイン（ＶＬＸ）は安定化ノックアウトＶＨドメイン（ＶＨＸ）と対合して、ジスルフィド安定化ノックアウト（ｄｓＫＯ２）ドメインを形成し；
    ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択される、前記抗原結合タンパク質。
  24. Ｆｃドメインが１つまたはそれ以上のノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）突然変異を含む、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  25. 疑似Ｆａｂ部分の融点（Ｔm）が、参照Ｆａｂ分子よりも少なくとも４℃高い、請求項１～２４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  26. １つまたはそれ以上の操作された鎖間ジスルフィド結合のうちの少なくとも１つがＶＨ４４Ｃ－ＶＬ１００Ｃである、請求項１～２５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  27. 標的抗原Ａおよび標的抗原Ｂが同一抗原の異なるエピトープである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
  28. 多重特異性結合タンパク質における重鎖－軽鎖の誤対合を低減させるための安定化ノックアウトドメインの使用であって、安定化ノックアウトドメインは、ＶＨＫおよびＶＬＸドメインを含み、ＶＬＸ／ＶＨＸ対が、
    （ｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７７のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；
    （ｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７８のアミノ酸配列を含むＶＨＸ；ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＶＬＸ、および
    配列番号７９のアミノ酸配列を含むＶＨＸ
    からなる群から選択され、参照Ｆａｂ分子は、疑似Ｆａｂ参照分子において、参照Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメインがＶＨＸおよびＶＬＸドメインで置換される以外は、疑似Ｆａｂ分子と同一である、前記使用。
  29. 請求項１～２７のうちのいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  30. 請求項２９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  31. 請求項２９に記載の核酸分子または請求項３０に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
  32. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の結合タンパク質を生成する方法であって、請求項３１に記載の宿主細胞を該結合タンパク質が発現されるような条件下で培養する工程；および該宿主細胞から該結合タンパク質を精製する工程を含む前記方法。
  33. 薬学的に許容される担体と、治療有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の多重特異性結合タンパク質とを含む医薬組成物。
  34. 抗原活性が有害である障害の治療に使用するための医薬組成物であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の多重特異性結合タンパク質を投与する工程を含む前記医薬組成物。
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