JP7731555B2 - 多能性幹細胞の分化抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、多能性幹細胞を浮遊培養によって製造する製造方法に関し、また、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を製造する製造方法に関する。

ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化は、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性がある。例えば、多能性幹細胞から、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞等の多種多様な体細胞に試験管内で分化誘導する技術が既に開発されている。

一方で、多能性幹細胞を用いた再生医療は、実用化に向けて課題が残されており、その課題の一つは、多能性幹細胞の生産性である。例えば、肝臓の再生には約２×１０^１１個の細胞が必要と言われている。多能性幹細胞の培養方法は、平坦な基板上に細胞接着させて培養する接着培養と、液体培地中に細胞を浮遊させて培養する浮遊培養に大別される。接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０^６ｃｍ^２以上の基板が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。このように、基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するため、スケールアップに膨大な面積が必要となり、再生医療に必要な量の細胞を供給することは困難である。浮遊培養では液体培地中で細胞を浮遊させながら培養するため、得られる細胞数は培地体積に依存する。そのため、浮遊培養はスケールアップが容易であり、細胞の大量生産に適している。例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、液体培地を撹拌しながら多能性幹細胞を浮遊培養する方法が開示されている。

また、前記再生医療の実用化に向けた別の課題としては、目的体細胞の生産性が挙げられる。目的体細胞を効率的に生産するための取り組みとして、分化誘導効率を向上させる取り組みが挙げられ、その方法は種々報告されている。例えば、非特許文献２には、多能性幹細胞の接着培養において、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤を培地中に添加することで、多能性幹細胞の自発的分化を抑制する方法が開示されている。また、非特許文献３には、多能性幹細胞の接着培養において、タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤を培地中に添加することで、多能性幹細胞の自発的分化を抑制する方法が開示されている。

上述したように、多能性幹細胞から目的体細胞を効率的に生産するための方法は各種開発されている。しかしながら、非特許文献２及び３の方法は、接着培養に関する記載のみであり、浮遊培養での自発的分化抑制効果は記載されておらず、ＰＫＣ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤を組み合わせることによる効果は記載も示唆もない。

Ｏｌｍｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ Ｃ，Ｖｏｌｕｍｅ １８（１０）：７７２－７８４（２０１２） Ｍ．Ｋｉｎｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（１）：ｅ５４１２２ Ｔ．Ｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（５）：ｅ６３３７８

本発明は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制し、多能性幹細胞の未分化状態を維持する技術を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞の浮遊培養において、ＰＫＣβ阻害剤と、ＴＮＫＳ阻害剤とを共存させることで、三胚葉全ての方向への自発的分化を抑制して、多能性幹細胞の未分化状態を維持できることに成功した。本発明は、これらの研究結果に基づいて完成に至ったものであり、以下を包含する。

（１）ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞集団の製造方法。
（２）前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤含有濃度が、２５ｎＭ以上１５μＭ以下である（１）記載の方法。
（３）前記液体培地中のＴＮＫＳ阻害剤含有濃度が、９０ｎＭ以上４０μＭ以下である（１）記載の方法。
（４）前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率が１６７：１以上１：１６００以下の範囲である（１）記載の方法。
（５）前記液体培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを含有する（１）記載の方法。
（６）前記液体培地が、ＦＧＦ２及び/又はＴＧＦ－β１を含む（１）記載の方法。
（７）前記液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する（１）記載の方法。
（８）前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である（７）記載の方法。
（９）前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む（１）記載の方法。
（１０）前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む（１）記載の方法。
（１１）前記多能性幹細胞集団は、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である（１）記載の方法。
（１２）前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及び/又は人工多能性幹細胞である（１）記載の方法。
（１３）上記液体培地中の乳酸濃度が５～１５ｍＭになるまで上記浮遊培養する（１）記載の方法。
（１４）上記浮遊培養は、翼先端速度を０．０５ｍ／ｓ以上１．３７ｍ／ｓ以下とした攪拌培養である（１）記載の方法。
（１５）前記（１）～（１４）の何れかに記載の方法により製造される多能性幹細胞集団。
（１６）ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む、多能性幹細胞分化抑制剤。
（１７）前記ＰＫＣβ阻害剤含有濃度が、５０ｎＭ以上２００ｍＭ以下である（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
（１８）前記ＴＮＫＳ阻害剤含有濃度が、１８０ｎＭ以上１１３ｍＭ以下である（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
（１９）前記分化抑制剤中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率が、１６７：１以上１：１６００以下の範囲である（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
（２０）前記（１６）～（１９）の何れかに記載の多能性幹細胞分化抑制剤を含む多能性幹細胞分化抑制キット。

（２１）前記ＰＫＣβ阻害剤は、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＬＹ－３３３５３１、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ、Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｏ６９７６、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂａｉｃａｌｅｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ ＩＩ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ Ｃ、Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌ－ｔｈｒｅｏ Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ及びＭｅｌｉｔｔｉｎからなる群から選ばれる少なくとも１つである（１）記載の方法及び（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
（２２）前記ＴＮＫＳ阻害剤は、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ及びＷＩＫＩ４からなる群から選ばれる少なくとも１つである（１）記載の方法及び（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
（２３）前記多能性幹細胞がプライム型多能性幹細胞である（１）記載の方法及び（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。
（２４）前記液体培地がＬＩＦを含まない（１）記載の方法。
（２５）ＬＩＦを含まない液体培地組成物を含む（２０）記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
（２６）前記液体培地がＧＳＫ３阻害剤を含まない（１）記載の方法。
（２７）ＧＳＫ３阻害剤を含まない液体培地組成物を含む（２０）記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
（２８）前記液体培地がＧＳＫ３阻害剤とＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない（１）記載の方法。
（２９）ＧＳＫ３阻害剤とＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない液体培地組成物を含む（２０）記載の多能性幹細胞分化抑制キット。
（３０）ＰＫＣβ阻害剤は下記構造式[式Ｉ]を有する化合物である（１）記載の方法及び（１６）記載の多能性幹細胞分化抑制剤。

で表される化合物又はその塩。
式Ｉにおいて、
Ｒ_１は水素原子または炭素数１～３のアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）であり、
Ｒ_２は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基（好ましくはメチル基）、又は、－Ｎ（Ｒ_Ａ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
Ｒ_Ａは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）であり、
Ｒ_３は、
、
、
又は
で表される基であり、
Ｒ_Ｂは、水素原子、－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２）により置換された炭素数２～４のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２））、又は

で表される基であり、
或いは、Ｒ_２とＲ_Ｂとが一体となって下記の二価基
を形成していてもよく、ここで、＃はＲ_２の結合位置への結合を指し、＃＃はＲ_Ｂの結合位置への結合を指し、
前記二価基に含まれる不斉炭素の立体配置は特に限定されないが、好ましくは、
であり、
Ｒ_Ｃは、－Ｎ（Ｒ_Ｄ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
Ｒ_Ｄは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）である。
式Ｉで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２０－０２１８４３号の開示内容を包含する。

本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法によれば、浮遊培養により未分化状態を維持した多能性幹細胞集団を製造することができる。
本発明の多能性幹細胞分化抑制剤によれば、浮遊培養中の多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。

比較例１～３及び実施例１にて撮像した細胞凝集塊の位相差画像である。 実施例２で行った定量的リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示す特性図である。 比較例４、５－１～５－４及び実施例３－１～３－３にて撮像した細胞凝集塊の位相差画像である。 参考例２、比較例４、５－１～５－４及び実施例３－１～３－３にて培養した多能性幹細胞における、ＰＡＸ６の相対遺伝子発現量を示す特性図である。 参考例３、比較例６、７－１～７－４及び実施例５－１～５－２にて培養した多能性幹細胞における、未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧの陽性率を示す特性図である。 参考例４、比較例８、９及び実施例７にて培養した多能性幹細胞における、Ｔの相対遺伝子発現量を示す特性図である。 参考例４、比較例８、９及び実施例７にて培養した多能性幹細胞における、ＳＯＸ１７の相対遺伝子発現量を示す特性図である。 比較例１０及び実施例９にて撮像した細胞凝集塊の位相差画像である。 参考例５、比較例１０及び実施例９にて培養した多能性幹細胞における、Ｔの相対遺伝子発現量を示す特性図である。 参考例５、比較例１０及び実施例９にて培養した多能性幹細胞における、ＳＯＸ１７の相対遺伝子発現量を示す特性図である。 参考例５、比較例１０及び実施例９にて培養した多能性幹細胞における、ＰＡＸ６の相対遺伝子発現量を示す特性図である。 比較例１１で接着培養した多能性幹細胞（ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加条件と無添加条件）を撮像した位相差画像である。 実施例１１で浮遊培養した多能性幹細胞（ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加条件と無添加条件）を撮像した位相差画像である。 比較例１１及び実施例１１で培養した多能性幹細胞における増幅率を示す特性図である。 比較例１２にて浮遊培養した多能性幹細胞を撮像した位相差画像である。撮像した細胞凝集塊の位相差画像である。 実施例１２にて浮遊培養した多能性幹細胞を撮像した位相差画像である。撮像した細胞凝集塊の位相差画像である。 比較例１２及び実施例１２で培養した多能性幹細胞におけるＯＣＴ４及びＳＯＸ２の相対遺伝子発現量を示す特性図である。 比較例１２及び実施例１２で培養した多能性幹細胞におけるＯＣＴ４の陽性率を示す特性図である。 比較例１２及び実施例１２で培養した多能性幹細胞における到達生細胞密度を示す特性図である。 実施例１２で培養した多能性幹細胞の培地に含まれる乳酸濃度を示す特性図である。 実施例１３及び参考例６で培養した多能性幹細胞におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、Ｔ、ＳＯＸ１７及びＰＡＸ６の相対遺伝子発現量を示す特性図である。 実施例１３で培養した多能性幹細胞についてＧ－Ｂａｎｄ解析した結果を示す特性図である。 実施例１３及び参考例６（未分化維持）並びに実施例１４及び参考例７（分化誘導）で培養した多能性幹細胞におけるＣＤＸ２、ＰＤＧＦＲａ、ＳＯＸ１７及びＰＡＸ６について相対遺伝子発現量を測定した結果を示す特性図である。

１．多能性幹細胞分化抑制剤
１－１．概要
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤を含有することに特徴がある。また、本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤からなる組成物とすることができる。本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤により、浮遊培養中の細胞における未分化状態を維持し、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を容易に製造することができる。

１－２．用語の定義
本明細書で使用する以下の用語について定義する。
≪細胞≫
本明細書において発明の対象となる「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有し、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。より具体的に、多能性とは、個体を構成する胚葉（脊椎動物では外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉）に分化できる能力を意味する。このような細胞は例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、生殖系幹細胞（ＧＳ細胞：Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、そして人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）等が挙げられる。「ＥＳ細胞」とは、初期胚より調製された多能性幹細胞である。「ＥＧ細胞」とは、胎児の始原生殖細胞より調製された多能性幹細胞である（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９５：１３７２６－１３７３１）。「ＧＳ細胞」とは、細胞精巣より調製された多能性幹細胞である（Ｃｏｎｒａｄ Ｓ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ,４５６：３４４－３４９）。また、「ｉＰＳ細胞」とは、分化済みの体細胞に少数の初期化因子をコードする遺伝子を導入することによって体細胞を未分化状態にするリプログラミングが可能となった多能性幹細胞をいう。

本明細書における多能性幹細胞は、多細胞生物に由来する細胞であればよい。好ましくは動物由来細胞、より好ましくは哺乳動物由来細胞である。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物、そしてヒト、アカゲザル、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。特に好ましくは、ヒト由来細胞である。

本明細書で使用する多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞及びプライム型多能性幹細胞を含む。ナイーブ型多能性幹細胞は着床前の内部細胞塊でみられる多能性に近い状態であり、プライム型多能性幹細胞は着床後のエピブラスト内でみられる多能性に近い状態と定義される。プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞と比較して、個体発生への寄与が低頻度であり、Ｘ染色体の転写活性が一本のみであり、転写抑制ヒストン修飾が高レベルであるといった特徴がある。また、プライム型多能性幹細胞におけるマーカー遺伝子はＯＴＸ２であり、プライム型多能性幹細胞のマーカー遺伝子はＲＥＸ１、ＫＬＦファミリーである。さらに、プライム型多能性幹細胞のコロニー形成は扁平であり、ナイーブ型多能性幹細胞のコロニー形成はドーム状である。本明細書で使用する多能性幹細胞は、特にプライム型多能性幹細胞を用いることが好ましい。

本明細書で使用する多能性幹細胞は、市販の細胞又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製した細胞を用いてもよい。なお、限定はしないが、本明細書の各発明に用いる場合、多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞が好ましい。

本明細書で使用するｉＰＳ細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２、ＷＴＣ－１１株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、１２１０Ｂ２株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｂ２株等を使用することができる。

また、本明細書で使用するｉＰＳ細胞が新たに作製された細胞の場合、導入される初期化因子の遺伝子の組み合わせは、限定はしないが、例えばＯＣＴ３／４遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子の組み合わせ（Ｙｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ,３１８：１９１７－２０．）、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子及びＮａｎｏｇ遺伝子の組み合わせ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ.２００７，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１‐７２．）を使用することができる。これらの遺伝子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入であってもよいしタンパク質として導入してもよい。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。さらに、新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞を用いてもよい。

本明細書で使用するＥＳ細胞が市販品の場合、限定はしないが、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥｓ－２株、ＫｈＥｓ－３株、ＫｈＥｓ－４株、ＫｈＥｓ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＳＥＥＳ－４株、ＳＥＥｓ－５株、ＳＥＥｓ－６株、ＳＥＥｓ－７株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。

≪細胞凝集塊≫
本明細書において「細胞凝集塊」とは、浮遊培養において細胞凝集によって形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊は、通常、略球状を呈する。細胞凝集塊を構成する細胞は、１種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。

多能性幹細胞マーカーは、多能性幹細胞で特異的に又は過剰に発現している遺伝子マーカーで、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。

多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞である場合、多能性幹細胞マーカーの陽性率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％以下とすることができる。多能性幹細胞マーカーを発現する及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合が前記範囲内である細胞凝集塊は、未分化性が高く、より均質な細胞集団である。

≪培養及び培地≫
「浮遊培養」とは、細胞培養方法の一つで、培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。本明細書において「浮遊状態」とは、培養容器等の外部マトリクスに対して細胞が非接着の状態をいう。「浮遊培養法」は、細胞を浮遊培養する方法であって、この方法での細胞は、培養液中で凝集した細胞塊で存在する。浮遊培養法に対する他の培養方法として、接着培養法がある。「接着培養法」は、細胞を接着培養する方法である。「接着培養」とは、細胞を培養容器等の外部マトリクス等に接着させて、原則単層で増殖させることをいう。なお、前述の接着性細胞は、通常、接着培養のみならず、浮遊培養での培養も可能である。

本明細書において「培地」とは、細胞を培養するために調製された液状又は固形状の物質をいう。原則として、細胞の増殖及び／又は維持に不可欠の成分を必要最小限以上含有する。本明細書の培地は、特に断りがない限り、動物由来細胞の培養に使用する動物細胞用の液体培地が該当する。

本明細書において「基礎培地」とは、様々な動物細胞用培地の基礎となる培地をいう。単体でも培養は可能であり、また様々な培養添加物を加えて、目的に応じた各種細胞に特異的な培地に調製することもできる。本明細書で使用する基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’Ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒe F－１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地の重量比を好ましくは６０／４０以上４０／６０以下の範囲、例えば５８／４２、５５／４５、５２／４８、５０／５０、４８／５２、４５／５５、又は４２／５８等で混合した培地を用いる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。
本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。

本明細書において「培養添加物」とは、培養目的で培地に添加される血清以外の物質である。培養添加物の具体例として、限定はしないが、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、増殖因子、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及びサイトカインは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。また、増殖因子は、限定するものではないが、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ及びＩＧＦＢＰ－７を使用することができる。抗生剤は、限定するものではないが、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。本発明で用いる培地の培養添加物として、特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ－β１である。

また、培地には、ＲＯＣＫ阻害剤を含有することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤を培地に含有することで、多能性幹細胞の浮遊培養における細胞死を大幅に抑制することができる。

さらに、培地としては、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、ＬＩＦを含まない組成とすることが好ましい。さらに、プライム型多能性幹細胞を培養対象とする場合、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のいずれか一方、好ましくは両方を含まない培地組成とすることが好ましい。これらＬＩＦ、ＧＳＫ３阻害剤、及びＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤を含まない培地であれば、プライム型多能性幹細胞をナイーブ化することなく、且つ未分化状態を維持して培養することができる。

本発明で用いる培地は、前記培養添加物を１種以上含むことができる。前記培養添加物を添加する培地としては、限定はしないが、前記基礎培地が一般的である。

培養添加物は、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ－アスコルビン酸は、２－リン酸アスコルビン酸マグネシウム等の誘導体の形態で培地に添加してもよく、セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウム等）の形態で培地に添加してもよい。また、インスリン、トランスフェリン、及びセレンに関しては、ＩＴＳ試薬（インスリン-トランスフェリン-セレン）の形態で培地に添加することもできる。また、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つが添加された市販の培地を使用することもできる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ II（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦ Ｄｒｙ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ^ＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８^ＴＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、及びＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等が挙げられる。

なお、本発明で用いる培地として最も好ましいものは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子を含む無血清培地である。特に好ましくは、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

≪ＰＫＣβ阻害剤≫
本明細書において「プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤」とは、ＰＫＣβの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。プロテインキナーゼは、Ｃ末端側の触媒領域及びＮ末端側の調節領域を有している。触媒領域は、基質タンパク質上のリン酸化残基を認識する配列と、ＡＴＰ／Ｍｇ^２＋結合する配列とから構成される。調節領域はＣ１とＣ２ドメインから構成される。

ＰＫＣには、在来型（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ及びＰＫＣγがある。なお、ＰＫＣには、新型（Ｎｏｖｅｌ）アイソザイムとしてＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηがあり、非典型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）アイソザイムとしてＰＫＣζ、ＰＫＣλ及びＰＫＣμがある。

本明細書において、ＰＫＣβという場合、これらＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの両者を含む意味若しくはＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩのうち一方を意味する。また、本明細書においてＰＫＣβ阻害剤という場合、これら従来型、新型及び非典型アイソザイムのうち、少なくともＰＫＣβＩ及び/又はＰＫＣβＩＩを阻害する物質を意味する。すなわち、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、ＰＫＣβＩＩの活性のみを阻害又は抑制する物質、及びＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

なお、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβの活性のみを特異的に阻害又は抑制する物質でもよいが、ＰＫＣβＩ又はＰＫＣβＩＩ以外に他のアイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質であってもよい。例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩを含む、前述した全ての従来型、新型及び非典型アイソザイムの活性を阻害又は抑制する物質でもよい。また、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に従来型アイソザイムであるＰＫＣα及びＰＫＣγの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。さらに、ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβＩ及びＰＫＣβＩＩの他に新型アイソザイムであるＰＫＣδ、ＰＫＣε、ＰＫＣθ及びＰＫＣηの活性を阻害又は抑制する物質であっても良い。

ＰＫＣβ阻害剤は、ＰＫＣβに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＰＫＣβをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

一例として、ＰＫＣβ阻害剤は、下記構造式［式Ｉ］を有する化合物を挙げることができる。

で表される化合物又はその塩。
式Ｉにおいて、
Ｒ_１は水素原子または炭素数１～３のアルコキシ基（好ましくはメトキシ基）であり、 Ｒ_２は、水素原子、炭素数１～３のアルキル基（好ましくはメチル基）、又は、－Ｎ（Ｒ_Ａ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
Ｒ_Aは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）であり、
Ｒ_３は、
、
、
又は
で表される基であり、
Ｒ_Ｂは、水素原子、－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２）により置換された炭素数２～４のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）_３－Ｓ－Ｃ（＝ＮＨ）（－ＮＨ_２））、又は
で表される基であり、
或いは、Ｒ_２とＲ_Ｂとが一体となって下記の二価基
を形成していてもよく、ここで、＃はＲ_２の結合位置への結合を指し、＃＃はＲ_Ｂの結合位置への結合を指し、
前記二価基に含まれる不斉炭素の立体配置は特に限定されないが、好ましくは、
であり、
Ｒ_Ｃは、－Ｎ（Ｒ_Ｄ）_２により置換された炭素数１～３のアルキル基（好ましくは－（ＣＨ_２）－Ｎ（ＣＨ_３）_２）であり、
Ｒ_Ｄは独立にエチル基又はメチル基（好ましくはメチル基）である。

式Ｉで表される化合物の塩としては塩酸塩又は硫酸塩が例示できる。
上記構造式［式Ｉ］を有するＰＫＣβ阻害剤としては、具体的に、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＬＹ－３３３５３１、Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ、Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ、Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｏ６９７６、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂａｉｃａｌｅｉｎ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、Ｌｕｔｅｏｌｉｎ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ ＩＩ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ Ｃ、Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌ－ｔｈｒｅｏ Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ及びＭｅｌｉｔｔｉｎからなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、上記構造式を有するＰＫＣβ阻害剤の中でも、Ｇｏ６９８３、ＧＦ１０９２０３Ｘ及びＬＹ－３３３５３１からなる群から選ばれる化合物を使用することが好ましい。

Ｇｏ６９８３（３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

ＧＦ１０９２０３Ｘ（２－［１－（３－ジメチルアミノプロピル）インドール－３－イル］－３－（インドール－３－イル）マレイミド）の構造式を下記に示す。

ＬＹ－３３３５３１（（９Ｓ）－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，１０，１１－テトラヒドロ－９Ｈ，１８Ｈ－５，２１：１２，１７－ジメテノジベンゾ ［ｅ，ｋ］ピロロ［３，４－ｈ］［１，４，１３］オキサジアザシクロヘキサデシン－１８，２０（１９Ｈ）－ジオン、モノヒドロキシクロライド）の構造式を下記に示す。

Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１－メチルインドール－３－イル）－４－［１－［１－（ピリジン－２－イルメチル）ピペリジン－４－イル］インドール－３－イル］ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

Ｓｏｔｒａｓｔａｕｒｉｎ（３－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）キナゾリン－４－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）の構造式を下記に示す。

Ｒｏ－３１－８２２０－ｍｅｓｙｌａｔｅ（３－［３－［２，５－ジヒドロ－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－２，５－ジオキソ－１Ｈ－ピロール－３－ｙｌ］－１Ｈ－インドール－１－イル］プロピルカルバムイミドチオ酸エステルメシラート）の構造式を下記に示す。

Ｒｏ－３２－０４３２－ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（３－［（８Ｓ）－８－［（ジメチルアミノ）メチル］－６，７，８，９－テトラヒドロピリド ［１，２－ａ］インドール－１０－イル］－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン 塩酸塩）の構造式を下記に示す。

≪ＴＮＫＳ阻害剤≫
本明細書において「タンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤」とは、タンキレースの活性を阻害又は抑制する物質を意味する。タンキレース（タンキラーゼと称する場合もある）は、標的タンパク質をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化するポリ（ＡＤＰ－リボシル）化酵素（ＰＡＲＰ）ファミリーに属し、タンキレース１（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－１／ＰＡＲＰ－５ａ）及びタンキレース２（ｔａｎｋｙｒａｓｅ－２／ＰＡＲＰ－５ｂ）が知られている。タンキレースについては、テロメア蛋白質ＴＲＦ１をポリ（ＡＤＰ－リボシル）化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する機能が知られている。

本明細書において、ＴＮＫＳという場合、これらタンキレース１及びタンキレース２の両者を含む意味若しくはタンキレース１及びタンキレース２のうち一方を意味する。また、本明細書においてＴＮＫＳ阻害剤という場合、タンキレース１及び/又はタンキレース２を阻害する物質を意味する。すなわち、ＴＮＫＳ阻害剤は、タンキレース１の活性のみを阻害又は抑制する物質、タンキレース２の活性のみを阻害又は抑制する物質及びタンキレース１並びにタンキレース２の活性を阻害又は抑制する物質を含む意味である。

ＴＮＫＳ阻害剤は、ＴＮＫＳに対して直接又は間接的に作用する化合物、ＴＮＫＳをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。

一例として、ＴＮＫＳ阻害剤としては、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＭＳＣ２５０４８７７及びＷＩＫＩ４からなる群から選ばれる化合物を挙げることができる。特に、ＴＮＫＳ阻害剤の中でも、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ及び/又はＸＡＶ９３９を使用することが好ましい。

ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）の構造式を下記に示す。

ＸＡＶ９３９（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

Ｇ００７－ＬＫ（４－［５－［（１Ｅ）－２－［４－（２－クロロフェニル）－５－［５－（メチルスルフォニル）－２－ピリジニル］－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］エテニル］－１，３，４－オキサジアゾ－ル－２－イル］－ベンゾニトリル）の構造式を下記に示す。

Ｇ２４４－ＬＭ（３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－［２－（メチルスルフォニル）フェニル］－１－ピペラジニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン）の構造式を下記に示す。

ＷＩＫＩ４（２－［３－［［４－（４－メトキシフェニル）－５－（４－ピリジニル）－４Ｈ－１，２，４－チアゾル－３－イル］チオ］プロピル］－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－１，３（２Ｈ）－ジオン）の構造式を下記に示す。

１－３．構成
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤は、上記１－２．で定義したＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を有効成分として含む。

ここで、多能性幹細胞分化抑制剤においてＰＫＣβ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。

ＰＫＣβ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲に応じて決定することができる。

例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として２５ｎＭ以上とすることができ、３０ｎＭ以上とすることができ、５０ｎＭ以上とすることができ、８０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、３μＭ以上とすることができ、５μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができる。

ＰＫＣβ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲やＰＫＣβ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。

例えば、ＰＫＣβ阻害剤は、液体培地中の終濃度として１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができ、７００ｎＭ以下とすることができ、５００ｎＭ以下とすることができ、２００ｎＭ以下とすることができ、１５０ｎＭ以下とすることができ、１００ｎＭ以下とすることができ、８０ｎＭ以下とすることができ、５０ｎＭ以下とすることができ、３０ｎＭ以下とすることができる。

なお、多能性幹細胞分化抑制剤が組成物の場合、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに上記範囲となるように決めることができる。例えば、当該組成物を２倍希釈して使用する場合、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の下限は、５０ｎＭ以上とすることができ、６０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１６０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、１．４μＭ以上とすることができ、２μＭ以上とすることができ、６μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができ、２０μＭ以上とすることができる。

なお、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の上限は、特に限定されず、ＰＫＣβ阻害剤の溶解度とすることができる。具体的には、当該組成物中のＰＫＣβ阻害剤の上限を２００ｍＭとすることができる。

一方、多能性幹細胞分化抑制剤においてＴＮＫＳ阻害剤は、１種、又は異なる２種以上の組み合わせであってもよい。

ＴＮＫＳ阻害剤の濃度の下限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲に応じて決定することができる。

例えば、ＴＮＫＳ阻害剤は、液体培地中の終濃度として９０ｎＭ以上とすることができ、１００ｎＭ以上とすることができ、１５０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、５００ｎＭ以上とすることができ、６００ｎＭ以上とすることができ、７００ｎＭ以上とすることができ、８００ｎＭ以上とすることができ、９００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、１．５μＭ以上とすることができ、３μＭ以上とすることができ、５μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができ、１５μＭ以上とすることができ、３０μＭ以上とすることができ、３５μＭ以上とすることができる。

ＴＮＫＳ阻害剤の濃度の上限は、特に限定されず、多能性幹細胞に対する分化抑制作用を有する範囲やＴＮＫＳ阻害剤の溶解度等に応じて決定することができる。

例えば、ＴＮＫＳ阻害剤は、液体培地中の終濃度として４０μＭ以下とすることができ、３５μＭ以下とすることができ、３０μＭ以下とすることができ、１５μＭ以下とすることができ、１０μＭ以下とすることができ、５μＭ以下とすることができ、３μＭ以下とすることができ、１．５μＭ以下とすることができ、１μＭ以下とすることができ、９００ｎＭ以下とすることができ、８００ｎＭ以下とすることができ、７００ｎＭ以下とすることができ、６００ｎＭ以下とすることができ、５００ｎＭ以下とすることができ、４００ｎＭ以下とすることができ、３００ｎＭ以下とすることができ、２００ｎＭ以下とすることができ、１５０ｎＭ以下とすることができ、１００ｎＭ以下とすることができる。

なお、多能性幹細胞分化抑制剤が組成物の場合、当該組成物中のＴＮＫＳ阻害剤の濃度は、培地に添加されたときに上記範囲となるように決めることができる。例えば、当該組成物を２倍希釈して使用する場合、当該組成物中のＴＮＫＳ阻害剤の下限は、１８０ｎＭ以上とすることができ、２００ｎＭ以上とすることができ、３００ｎＭ以上とすることができ、４００ｎＭ以上とすることができ、６００ｎＭ以上とすることができ、８００ｎＭ以上とすることができ、１μＭ以上とすることができ、１．２μＭ以上とすることができ、１．４μＭ以上とすることができ、１．６μＭ以上とすることができ、１．８μＭ以上とすることができ、２μＭ以上とすることができ、３μＭ以上とすることができ、６μＭ以上とすることができ、１０μＭ以上とすることができ、２０μＭ以上とすることができ、３０μＭ以上とすることができ、６０μＭ以上とすることができ、７０μＭ以上とすることができる。

なお、当該組成物中のＴＮＫＳ阻害剤の上限は、特に限定されず、ＴＮＫＳ阻害剤の溶解度とすることができる。具体的には、当該組成物中のＴＮＫＳ阻害剤の上限を１１３ｍＭとすることができる。

また、液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率の下限は、特に限定されないが、例えば１６７：１以上、１１１：１以上、５６：１以上、３３：１以上、１１：１以上、７．８：１以上、５．６：１以上、２．２：１以上、１．７：１以上、又は１．１：１以上とすることができる。液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率の上限は、特に限定されないが、例えば、１：１６００以下、１：１４００以下、１：１２００以下、１：６００以下、１：４００以下、１：２００以下、１：１２０以下、１：６０以下、１：４０以下、１：３６以下、１：３２以下、１：２８以下、１：２４以下、１：２０以下、１：１６以下、１：１２以下、１：８以下、１：６以下、又は１：４以下とすることができる。液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率は、特に限定されないが、例えば１６７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。また、液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率は、１１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、３３：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、７．８：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、５．６：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、２．２：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１．７：１以上１：１６００以下の範囲とすることができ、１．１：１以上１：１６００以下の範囲とすることができる。さらに液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率は、１６７：１以上１：１４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２００以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：３２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２４以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：２０以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：１２以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：８以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：６以下の範囲とすることができ、１６７：１以上１：４以下の範囲とすることができる。

一方、多能性幹細胞分化抑制剤が組成物の場合、有効成分であるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤と組み合わされる他の成分として、担体が挙げられる。担体には、溶媒及び／又は賦形剤が含まれる。

溶媒としては、例えば、水、バッファ（ＰＢＳを含む）、生食、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、キシレン、低級アルコール）等が挙げられる。

賦形剤としては、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等を挙げることができる。抗生剤は、特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、ｄｌ－カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、２－ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、ｌ－メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ－ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ及びその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ及びその誘導体、αリポ酸及びその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、及びこれらの混合物などが挙げられる。

また、多能性幹細胞分化抑制剤は、１種以上の増殖因子を含有してもよい。増殖因子には、例えば、ＦＧＦ２及びＴＧＦ－β１が挙げられる。

多能性幹細胞分化抑制剤の形態は、液剤、又は固形剤（顆粒剤、散剤、粉剤を含む）のいずれであってもよい。多能性幹細胞分化抑制剤の適用形態は特に限定されない。例えば、浮遊培養に用いる培地の形態であってもよいし、浮遊培養用の培地の調製時に配合される添加物の形態であってもよい。

１－４．効果
本発明の多能性幹細胞分化抑制剤によれば、浮遊培養系において多能性幹細胞の未分化状態を維持し、細胞凝集塊を形成させることができる。それによって、大量の多能性幹細胞を効率的に生産することが可能となる。
２．多能性幹細胞集団の製造方法

２－１．概要
本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法は、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む。本発明に係る多能性幹細胞集団の製造方法によれば、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤が存在することで、多能性幹細胞における未分化状態を維持し、浮遊培養によって多能性幹細胞集団を容易に製造することができる。

２－２．方法
本態様の方法は、浮遊培養工程を必須の工程として、また、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。

２－２－１．維持培養工程
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化状態を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、当該分野で既知の動物細胞培養法を利用することができる。例えば、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよい。

以下、限定はしないが、本工程をはじめ、後述する浮遊培養工程で用いる動物細胞培養法について例示し、説明をする。

（細胞）
本工程で使用する細胞は、浮遊培養において細胞凝集が可能な細胞である。前述の「１－２．用語の定義」における「培養及び培地」の項で記載したように、動物細胞が好ましく、ヒト細胞はより好ましい。また、細胞の種類は、多能性幹細胞であり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。

（培養容器）
培養に用いる培養容器は、容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、Ｎｕｎｃｌｏｎ^ＴＭ Ｓｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できる。

培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。

使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限が、０．３２ｃｍ^２以上、０．６５ｃｍ^２以上、１．９ｃｍ^２以上、３．０ｃｍ^２以上、３．５ｃｍ^２以上、９．０ｃｍ^２以上、又は９．６ｃｍ^２以上で、上限が、１０００ｃｍ^２以下、５００ｃｍ^２以下、３００ｃｍ^２以下、１５０ｃｍ^２以下、７５ｃｍ^２以下、５５ｃｍ^２以下、２５ｃｍ^２以下、２１ｃｍ^２以下、９．６ｃｍ^２以下、又は３．５ｃｍ^２以下であることが好ましい。

（培地）
培地や培養液の量は、使用する培養容器によって適宜調整すればよい。例えば１２ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり３．５ｃｍ^２）を使用する場合は、１ウェルあたりの量を０．５ｍＬ以上、１．５ｍＬ以下、好ましくは約１．３ｍＬとすることができる。また、６ウェルプレート（平面視でのウェル底面の面積が１ウェルあたり９．６ｃｍ^２）を使用する場合には、１ウェルあたりの量を下限は１．５ｍＬ以上、２ｍＬ以上、又は３ｍＬ以上とすることができ、また上限は６．０ｍＬ以下、５ｍＬ以下、４ｍＬ以下とすることができる。さらに、１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、容器当たりの量を下限は１０ｍＬ以上、１５ｍＬ以上、２０ｍＬ以上、２５ｍＬ以上、又は３０ｍＬ以上とすることができ、また上限は５０ｍＬ以下、４５ｍＬ以下、又は４０ｍＬ以下とすることができる。また、容量が５００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、１０５ｍＬ以上、１１０ｍＬ以上、１１５ｍＬ以上、又は１２０ｍＬ以上とすることができ、また上限は１５０ｍＬ以下、１４５ｍＬ以下、１４０ｍＬ以下、１３５ｍＬ以下、１３０ｍＬ以下、又は１２５ｍＬ以下とすることができる。さらに、容量が１０００ｍＬの三角フラスコを使用する場合は、容器当たりの量を下限は２５０ｍＬ以上、２６０ｍＬ以上、２７０ｍＬ以上、２８０ｍＬ以上、又は２９０ｍＬ以上とすることができ、また上限は３５０ｍＬ以下、３４０ｍＬ以下、３３０ｍＬ以下、３２０ｍＬ以下、又は３１０ｍＬ以下とすることができる。さらに、例えば容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は１００ｍＬ以上、２００ｍＬ以上、３００ｍＬ以上、４００ｍＬ以上、５００ｍＬ以上、６００ｍＬ以上、７００ｍＬ以上、８００ｍＬ以上、９００ｍＬ以上、又は１０００ｍＬ以上とすることができ、上限は２０００ｍＬ以下、１９００ｍＬ以下、１８００ｍＬ以下、１７００ｍＬ以下、１６００ｍＬ以下、１５００ｍＬ以下、１４００ｍＬ以下、１３００ｍＬ以下、１２００ｍＬ以下、又は１１００ｍＬ以下とすることができる。また、容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグを使用する場合は、１バッグ当たりの量を下限は５００ｍＬ以上、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、又は５Ｌ以上とすることができ、上限は１０Ｌ以下、９Ｌ以下、８Ｌ以下、７Ｌ以下、又は６Ｌ以下とすることができる。

（播種密度）
浮遊培養に際して、新たな培地に播種する細胞の密度（播種密度）は、培養時間や培養後の細胞状態、培養後に必要な細胞数を勘案して適宜調整することができる。限定はしないが、通常、下限は０．０１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、０．１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、そして、上限は２０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、又は１０×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲にあればよい。

（培養条件）
培養温度、時間、ＣＯ_２濃度等の培養条件は特に限定しない。当該分野における常法の範囲で行えばよい。例えば培養温度は下限が２０℃以上、又は３５℃以上、そして上限が４５℃以下、又は４０℃以下であればよいが、好ましくは３７℃である。また、培養時間は下限が０．５時間以上又は６時間以上、そして上限が７日間以下、１２０時間以下、９６時間以下、７２時間以下、又は４８時間以下の範囲にあればよい。培養時のＣＯ_２濃度は、下限が４％以上、又は４．５％以上、そして上限が１０％以下、又は５．５％以下であればよいが、好ましくは５％である。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、１日に１回以上、又は１日に２回以上で行えばよいがそれらに限定されない。培地交換は、回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。

また、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングは、例えば、培地中の乳酸濃度に基づいて決定することもできる。乳酸は、培養中に細胞により産生され、培地中に蓄積される。細胞が産生した乳酸或いは元から培地中に含まれていた乳酸は、細胞にダメージを与え、その結果、多能性幹細胞の未分化性維持を阻害し、増殖、特に継代後の細胞増殖能を低下させるなどの悪影響を与えることが知られている。そこで、培地中の乳酸濃度に基づいて培養終了のタイミング及び／又は培地交換のタイミングを決定することで、乳酸による未分化性維持の阻害作用、乳酸による細胞増殖能の低下作用を回避することができる。

特に、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、乳酸による上記作用を低減することができる。換言すると、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、通常の細胞培養よりも高濃度の乳酸であっても未分化性を維持できるか、細胞増殖能を維持することができる。具体的には、培地中の乳酸濃度が５ｍＭ以上に達しても、好適に培養を行うことができる。また培地中の乳酸濃度が７ｍＭ以上に達しても、９ｍＭ以上に達しても、１０ｍＭ以上に達しても、１１ｍＭ以上に達しても、１２ｍＭ以上に達しても、好適に培養を行うことができる。

一方、培地中の乳酸濃度は１５ｍＭ以下までとすることが好ましい。特に、培地中の乳酸濃度は、１４ｍＭ以下、１３ｍＭ以下、１２ｍＭ以下、１０ｍＭ以下とすることが好ましい。培地中の乳酸濃度がこの範囲であれば、培地ｐＨの著しい低下を抑制でき、細胞に対する上記作用を回避することができる。

以上のように、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングを、培地中の乳酸濃度が例えば１５ｍＭに達するまで、１４ｍＭ以下に達するまで、１３ｍＭ以下に達するまで、１２ｍＭ以下に達するまで、１０ｍＭ以下に達するまでとすることができる。なお、他の実施形態としては、培養終了のタイミング及び培地交換のタイミングを、培地中の乳酸濃度がこの範囲よりも低い時点とすることもできる。

（培養方法）
培養中の培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよいが、好ましくは流動培養である。

「静置培養」とは、培養容器内で培地を静置した状態で培養することをいう。接着培養では、通常、この静置培養が採用される。

「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の場合、細胞の凝集を促進するように培地を流動させる方法が好ましい。そのような培養方法として、例えば、旋回培養法、揺動培養法、撹拌培養、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

「旋回培養法」（振盪培養法を含む）とは、旋回流による応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。

旋回速度は特に限定されないが、下限は１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、８３ｒｐｍ以上、８５ｒｐｍ以上、又は９０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は２００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下とすることができる。旋回培養に使用するシェーカーの振幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、又は２５ｍｍ以上とすることができる。一方、上限は、例えば２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、又は２５ｍｍ以下とすることができる。旋回培養の際の回転半径も特に限定されないが、好ましくは振幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ以上又は１０ｍｍ以上であり、上限は例えば１００ｍｍ以下又は５０ｍｍ以下とすることができる。特に、後述する細胞凝集塊の製造方法等では、旋回条件を前記範囲にすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。

「揺動培養法」とは、揺動（ロッキング）撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１往復を１回とした場合、下限は１分間に２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上、一方、上限は１分間に１５回以下、２０回以下、２５回以下、又は５０回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち誘導角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は０．１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、又は８°以上、一方、上限は２０°以下、１８°以下、１５°以下、１２°以下又は１０°以下とすることができる。後述する細胞凝集塊の製造方法等では、揺動条件を前記範囲とすることで、適切なサイズの細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。

さらに、上記旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。

「撹拌培養法」とは、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌手段を用いて容器内の培地を撹拌する条件で培養する方法をいう。例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで撹拌培養を達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。撹拌手段による撹拌速度は特に限定されないが、下限は１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、又は７０ｒｐｍ以上、９０ｒｐｍ以上、１１０ｒｐｍ以上、１３０ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は２００ｒｐｍ以下、又は１５０ｒｐｍ以下とすることができる。

また、「撹拌培養法」においては、培養中の細胞にかかる剪断応力を制御することが好ましい。多能性幹細胞を含む動物細胞は、一般的に、他の細胞と比較して物理的ストレスに弱い場合が多い。そのため、攪拌培養に際して細胞に負荷される剪断応力が大きすぎると、細胞が物理的なダメージを受け、増殖能が低下したり、多能性幹細胞であれば未分化性を維持できなくなったりする場合がある。

攪拌培養において細胞に負荷される剪断応力は、限定されないが、例えば翼先端速度に依存する。翼先端速度とは、攪拌翼先端部の周速であり、翼径［ｍ］×円周率×回転数［ｒｐｓ］＝翼先端速度［ｍ／ｓ］として求めることができる。なお、翼径が、攪拌翼の先端形状により複数求められる場合には、最も大きな距離とすることができる。

特に、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、負荷される剪断応力に上記作用を低減することができる。換言すると、プロテインキナーゼＣβ（ＰＫＣβ）阻害剤及びタンキレース（ＴＮＫＳ）阻害剤の存在下に多能性幹細胞を浮遊培養する場合、通常の細胞培養よりも高い剪断応力が負荷される条件であっても未分化性を維持できるか、細胞増殖能を維持することができる。具体的には、翼先端速度が０．２３ｍ／ｓ以上といった非常に大きな値であっても、多能性幹細胞の未分化性を維持しながら攪拌培養することができる。

また、翼先端速度は、０．０５ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．０８ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１０ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１３ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．１７ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２０ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２３ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．２５ｍ／ｓ以上とすることが好ましく、０．３０ｍ／ｓ以上とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、多能性幹細胞の未分化を維持しながら、細胞同士の過凝集を抑制することができる。

さらに、翼先端速度は、１．３７ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、１．００ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．８４ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．５０ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．４２ｍ／ｓ以下とすることが好ましく、０．３４ｍ／ｓ以下とすることが好ましく０．３０ｍ／ｓ以下とすることが好ましい。翼先端速度をこの範囲とすることで、多能性幹細胞の未分化を維持しながら、培養系内の培地流動状態を安定化することができる。

本工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。

本態様の浮遊培養方法により製造される個々の細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上であればよい。一方、その上限は１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、又は３００μｍ以下であればよい。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

本態様の浮遊培養方法により製造される細胞凝集塊の集団のうち、重量基準で下限が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。

本態様の浮遊培養方法により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。

（工程後処理）
本工程後は、常法により培養液と細胞を分離し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。

２－２－２．浮遊培養工程
「浮遊培養工程」は、上述した多能性幹細胞分化抑制剤又はその有効成分であるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程である。

本工程での細胞培養方法は、基本的に前述の「２－２－１．維持培養工程」に記載の培養方法に準ずる。したがって、ここでは維持培養工程に既述の方法と共通する説明については省略し、本工程に特徴的な点についてのみ詳述する。

（細胞）
本工程で使用する細胞は、限定はしないが、維持培養工程後に調製された細胞が好ましい。細胞の種類も、維持培養工程に記載のように、多能性幹細胞であり、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性幹細胞は特に好ましい。また培地に播種する際の細胞の状態は、単一細胞の状態であることが好ましい。 また、本工程で使用する多能性幹細胞は、一つの細胞でも良いし、複数細胞からなる細胞集団（多能性幹細胞集団）でもよい。前記多能性幹細胞が多能性幹細胞集団の場合、前記集団において多能性幹細胞マーカー(例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ)を発現する及び／または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合（比率）は、例えば９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以下である。

（培地）
本工程は、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地で培養することに特徴があり、この点において、維持培養工程で使用する培地と相違する。培地の種類は、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含み、かつ細胞を増殖及び／又は維持できる培地であれば、限定はしない。

本工程で培地中に含まれるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の濃度は、上記１－３．構成の欄に記載した通りとする。本工程開始時における培地中のＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の濃度が前記範囲内にあればＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の添加方法については特に限定はしない。例えば、培地に１種以上のＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を総量で前記濃度範囲となるように直接投与して調製してもよい。

（培養方法）
本工程では、浮遊培養を行う。したがって、培養方法は、培地を流動する流動培養が好ましい。ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地で多能性幹細胞を浮遊培養することによって、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。

本工程では、培養途中の多能性幹細胞の一部を取り出し、未分化状態を維持しているか確認することができる。例えば、培養中に取り出した多能性幹細胞に発現する多能性幹細胞マーカーの発現を測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。多能性幹細胞マーカーとしては、上述したように、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ－１－６０、ｃ－Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－１等が例示できる。これら多能性幹細胞マーカーの検出方法も、上述したように、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。

培養中に取り出した多能性幹細胞のなかで多能性幹細胞マーカーの陽性率が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。

また、本工程において、培養途中で取り出した多能性幹細胞における三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現を測定することで、未分化状態を維持しているか確認することができる。すなわち、これら内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカーの陽性率がいずれも、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、より好ましくは７％以下、より好ましくは６％以下、より好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、より好ましくは検出限界以下の場合、未分化を維持していると判断することができる。

内胚葉系細胞マーカーとは、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する。

中胚葉系細胞マーカーとは、中胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、Ｔ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。なお中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。

外胚葉系細胞マーカーとは、外胚葉系細胞に特異的な遺伝子であり、例えば、ＦＧＦ５、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６等を挙げることができる。なお外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体、末梢神経系などを形成する。また、外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。

これら三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現は、当該技術分野において任意の検出方法により測定することができる。三胚葉マーカー（内胚葉系細胞マーカー、中胚葉系細胞マーカー及び外胚葉系細胞マーカー）の発現を測定する方法としては、限定はしないが、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法、ノーザンハイブリダイゼーション又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等が挙げられる。定量的リアルタイムＰＣＲ解析においては、測定対象のマーカー遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量に対する相対発現量に換算し、当該相対発現量に基づいてマーカー遺伝子の発現量を評価できる。内部標準遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子やβ－アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子を挙げることができる。

２－２－３．回収工程
「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。

本明細書において「（細胞の）回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。

浮遊培養の工程の後、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、濾過フィルターや中空糸分離膜等を用いて回収することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない遠心加速度と処理時間で行えばよい。例えば、遠心加速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば１００×ｇ以上、３００×ｇ以上、８００×ｇ以上、又は１０００×ｇ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００×ｇ以下、１５００×ｇ以下、又は１６００×ｇ以下であればよい。また処理時間の下限は、上記遠心加速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上であればよい。また、上限は、上記遠心加速度により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば１０分以下、８分以下、６分以下、又は３０秒以下であればよい。フィルトレーションで液体成分を除去する場合、例えば、不織布やメッシュフィルターに培養液を通して濾液を除去し、残った細胞凝集塊を回収すればよい。また、中空糸分離膜で液体成分を除去する場合、例えば、細胞濃縮洗浄システム（カネカ社）のような中空糸分離膜を備えた装置を用いて培養液と細胞を分離し、回収すればよい。

回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば前述の維持培養工程における「工程後処理」に記載の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。

（単一細胞化）
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。

単一細胞化は、剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。例えば、単一細胞化にトリプシンを使用する場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５体積％以上、０．１８体積％以上、０．２０体積％以上、又は０．２４体積％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、０．３０体積％以下、０．２８体積％以下、又は０．２５体積％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば５分以上、８分以上、１０分以上、１２分以上、又は１５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば３０分以下、２８分以下、２５分以下、２２分以下、２０分以下、又は１８分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。

単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記と同様に行えばよい。

３．細胞凝集塊製造方法及びその方法で得られる細胞凝集塊
３－１．概要
上述した「２．多能性幹細胞集団の製造方法」を適用することで、生産物として細胞凝集塊を得ることができる。本製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。

３－２．細胞凝集塊製造方法
本態様の細胞凝集塊製造方法における基本工程は、上述した「２．多能性幹細胞集団の製造方法」に準ずる。すなわち、必須の工程として浮遊培養工程を、また選択工程として維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、前述の通りである。

３－３．細胞凝集塊
本態様の細胞凝集塊製造方法により、未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。

本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される個々の細胞凝集塊のサイズは、特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最大幅のサイズの下限が３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上であればよい。一方、その上限は１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、又は２００μｍ以下であればよい。因みにヒトｉＰＳ細胞１個が約１０μｍの寸法である。この範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される細胞凝集塊の集団のうち、重量基準で下限が１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％が上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊であることが好ましい。上記のサイズ範囲内の細胞凝集塊を２０％以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。

本態様の細胞凝集塊製造方法により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。

細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞の場合、多能性幹細胞マーカーを発現している及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合で細胞凝集塊を構成する多能性幹細胞の未分化性を判断してもよい。例えば、多能性幹細胞マーカーの陽性率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％以下とすることができる。多能性幹細胞マーカーが前記陽性率の範囲内にある細胞凝集塊は、未分化状態を維持した多能性幹細胞集団から構成されており、より均質な細胞集団であるといえる。

なお、多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。細胞マーカーを検出する方法としては、限定はしないが、例えばフローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーにおいて、検出試薬として蛍光標識抗体を用いる場合、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出されたときに、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、「陽性率」と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において、細胞凝集塊を構成する細胞は、単一種、又は２種以上の細胞で構成されていてもよい。例えば、ｉＰＳ細胞のみで構成される細胞凝集塊であってもよいし、ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞で構成された細胞凝集塊であってもよい。

３－４．効果
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。

４．多能性幹細胞塊の製造方法
４－１．概要
上述した「２．多能性幹細胞集団の製造方法」を用いて、多能性幹細胞凝集塊を製造することができる。本製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。

４－２．多能性幹細胞塊の製造方法
本態様の多能性幹細胞塊の製造方法における基本工程は、上述した「２．多能性幹細胞集団の製造方法」に準ずる。すなわち、必須の工程として、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む培地で浮遊培養する工程（第一工程）を含み、また選択工程として、維持培養工程、及び回収工程を含む。各工程の説明は、原則として上述した「２．多能性幹細胞集団の製造方法」に記載の通りである。

前述の第一工程の培養時間は、好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１２時間以上、好ましくは７日間以下、６日間以下、５日間以下、４日間以下、より好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下、最も好ましくは２４時間以下である。また、前述の維持培養工程の培養時間は、好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、好ましくは７日間以下、６日間以下、５日間以下、より好ましくは４日間以下、最も好ましくは７２時間以下である。

第一工程中に、第一工程と維持培養工程の間に、及び／又は維持培養工程中に、適当な頻度で培地交換を行うことができる。特に、第一工程と維持培養工程との間において、培地交換を行う。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に1回以上、３日に1回以上、２日に１回以上、１日に1回以上、1日に２回以上で行えばよいがそれらに限定されない。なお、培地交換の頻度や方法等については、上記の頻度や方法には限定されず、適宜最適な方法を採用すればよい。

４－３．多能性幹細胞凝集塊
本態様の多能性幹細胞塊の製造方法によれば、適切なサイズの多能性幹細胞凝集塊を、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ製造することができる。例えば、本態様の多能性幹細胞集団培養方法により得られた多能性幹細胞集団において、多能性幹細胞マーカー(例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ)を発現する及び／または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合（比率）は、例えば９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以下である。

４－４．効果
本態様の細胞凝集塊製造方法によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持した細胞凝集塊を製造することができる。

５．浮遊培養用培地
５－１．概要
本態様は、細胞の浮遊培養用培地である。本態様の浮遊培養用培地を使用すれば、培地中で多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。

５－２．構成
本態様の細胞の浮遊培養用培地は、上述した「１．多能性幹細胞分化抑制剤」に記載の分化抑制剤、又はその有効成分であるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を少なくとも含み、浮遊培養における多能性幹細胞の未分化状態を維持するための細胞増殖用培地で構成される。

本態様の浮遊培養用培地の組成は、上述した「１．多能性幹細胞分化抑制剤」の「１－２．用語の定義」における「培養及び培地」の項に詳述している。

分化抑制剤、その有効成分であるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の構成、並びに分化抑制剤中の含有濃度については、上述した「１．多能性幹細胞分化抑制剤」の「１－３．構成」において詳述している。

浮遊培養用培地は、少なくとも細胞培養時は液体培地として使用されるが、保存用としては、例えば、粉末化され、調合された固体状態であってもよい。この場合、培地として使用する前に滅菌水等に溶解し、適当な濃度に希釈した後、使用すればよい。

また、浮遊培養用培地は、使用前まで凍結して保存し、使用時に解凍して使用することができる。

５－３．効果
本態様の浮遊培養用培地を用いて細胞を浮遊培養すれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持することができる。

６．多能性幹細胞分化抑制キット
６－１．概要
本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤を含むキットは、ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤からなる多能性幹細胞分化抑制剤を含む、多能性幹細胞の培養に使用されるキットである。本多能性幹細胞分化抑制キットを用いることで、多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら浮遊培養により多能性幹細胞を増殖することができる。

６－２．構成
多能性幹細胞分化抑制キットは、必須の構成要素としてＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤からなる多能性幹細胞分化抑制剤を、また選択的構成要素として培地、及び／又はプロトコルを包含する。

プロトコルには、本多能性幹細胞分化抑制キットの使用方法が記載されている。具体的には、多能性幹細胞分化抑制キットに含まれるＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤の培地への添加量や、その他の成分に関する添加量、未分化を維持する好適な浮遊培養方法等が記載されている。

以下、実施例により、本発明に係る多能性幹細胞分化抑制剤、多能性幹細胞集団の製造方法を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

＜参考例１：ヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株の接着培養＞
ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ Ｓｉｌｋ（ニッピ社）を０．２５μｇ／ｃｍ^２でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株（コリエルインスティチュート社）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で接着培養を行った。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２（富士フィルム和光純薬社））を最終濃度が１０μＭとなるように培地に添加した。

＜比較例１：ヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株の浮遊培養＞
参考例１の手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（ナカライテスク社）で洗浄後、０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（ナカライテスク社）で５分間処理した。ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎを吸引した後、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地をディッシュに加え、セルスクレイパーによって細胞を剥離させた後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬社）を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり１×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー（オプティマ社）上で９０ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで浮遊培養を行った。培養２、４、７、９日目に培地交換を行った。培地交換の方法としては、ウェルから培養上清だけを３ ｍＬ吸引除去した後、Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地３ｍＬをウェルに添加した。培養５日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ で洗浄後、細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり１×１０^５個の細胞を含むように調製し、培養０日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図１に示した。図1より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。

＜比較例２：ヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株の浮遊培養へのＴＮＫＳ阻害剤添加＞
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をＴＮＫＳ阻害剤であるＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（富士フィルム和光純薬社）を最終濃度１０μＭで含むように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜比較例３：ヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株の浮遊培養へのＰＫＣβ阻害剤添加＞
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をＰＫＣβ阻害剤であるＧｏ６９８３（富士フィルム和光純薬社）を最終濃度１０μＭで含むように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例１：ヒトｉＰＳ細胞ＷＴＣ－１１株の浮遊培養へのＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地をＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ及びＧｏ６９８３をそれぞれ最終濃度１０μＭで含むように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例２：定量的リアルタイムＰＣＲ解析＞
以下に示す手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。参考例１の培養５日目の細胞、及び比較例１、２、実施例１の培養１０日目の細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳで洗浄し、Ｍｏｎａｒｃｈ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。精製方法はキット付属の使用マニュアルに従った。微量分光光度計で１０００ｎｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡを分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）（東洋紡社）１μＬ、５ｘ ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社）４μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡社）２μＬ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０ｕｎｉｔｓ／μＬ）（東洋紡社）１μＬ、Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（２５ｐｍｏｌ／μＬ）（東洋紡社）１μＬ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ_２Ｏを添加して２０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３０℃で１０分反応後、４２℃で６０分反応、９９℃で５分反応を連続して行い、４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を滅菌水で５倍に希釈した。希釈したｃＤＮＡ溶液を０．５μＬ／ｗｅｌｌ、滅菌水を３．９８μＬ／ｗｅｌｌ、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）を５μＬ／ｗｅｌｌ、Ｔａｑｍａｎ（商標登録） ｐｒｏｂｅを０．５μＬ／ｗｅｌｌ、５０Ｘ ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ（東洋紡社）を０．０２μＬ／ｗｅｌｌをとなるように反応プレートに添加して混合した。ＴａｑｍａｎプローブはＧＡＰＤＨ、ＯＣＴ４、Ｔ、ＳＯＸ１７、ＰＡＸ６を用いた。ＴａｑＭａｎ（商標登録） ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表１に示す。

定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したＴａｑｍａｎ（商標登録） ｐｒｏｂｅのＡｓｓａｙ ＩＤを以下に示した。
ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１
ＯＣＴ４：Ｈｓ０１０８８１１４＿ｍ１
Ｔ：Ｈｓ００６１００８０＿ｍ１
ＳＯＸ１７：Ｈｓ００７５１７５２＿ｓ１
ＰＡＸ６：Ｈｓ０４２６０３６７＿ｇＨ
遺伝子発現を測定した結果を表２及び図２に示した。

表２及び図２に示すように、接着培養を行った参考例１では、Ｔ（中胚葉マーカー遺伝子）、ＳＯＸ１７（内胚葉マーカー遺伝子）、及びＰＡＸ６（外胚葉マーカー遺伝子）の発現量が低く、多能性幹細胞の未分化状態が維持されていた。

一方、浮遊培養を行った比較例１では、Ｔ、ＳＯＸ１７、及びＰＡＸ６の発現量が参考例１と比較して増加した。このことから、浮遊培養においては、中胚葉、内胚葉及び外胚葉への自発的分化が起きており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていないことが示された。また、ＴＮＫＳ阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例２では、Ｔ及びＳＯＸ１７の発現量については、参考例１と同程度まで抑制できたものの、ＰＡＸ６発現量は参考例１よりも高かった。また、ＰＫＣβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例３では、ＰＡＸ６発現量については、参考例１と同程度まで抑制できたものの、Ｔ及びＳＯＸ１７の発現量は比較例１よりも高くなった。ＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤を両方添加した実施例１では、Ｔ、ＳＯＸ１７及びＰＡＸ６のいずれの発現量も参考例１と同程度であった。

上記結果から、ＴＮＫＳ阻害剤は、中胚葉及び内胚葉への自発的分化を効果的に抑制できるが、外胚葉分化に対する抑制効果は弱いことが示された。また、ＰＫＣβ阻害剤は、外胚葉への自発的分化は抑制できるものの、中胚葉及び内胚葉分化を促進してしまうことが示された。一方、ＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤の両方を添加して浮遊培養を行うと中胚葉、内胚葉及び外胚葉全てに対する自発的分化を抑制できることが明らかになった。

つまり、多能性幹細胞の中胚葉、内胚葉及び外胚葉への自発的分化を効果的に抑制し、多能性幹細胞の未分化状態を維持するためには、ＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤のいずれか片方を添加するだけでは不十分であり、ＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤の両方を添加することで初めて、中胚葉、内胚葉及び外胚葉の全てに対する自発的分化を抑制し、多能性幹細胞の未分化状態を維持できることが明らかになった。

＜参考例２：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の接着培養＞
Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を０．５μｇ／ｃｍ^２でコーティングした細胞培養用ディッシュに、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で接着培養を行った。培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）を使用し、毎日培地交換を行った。細胞播種時のみＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が１０μＭとなるように培地に添加した。

＜比較例４：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養＞
参考例２と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養４日目に継代を行い、培養８日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養１日目及び５日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２日目及び６日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養４日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製し、培養０日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養８日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図３に示した。図３より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。

＜比較例５：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養へのＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣ阻害剤添加＞
ＰＫＣβ以外のＰＫＣアイソザイムを阻害するＰＫＣ阻害剤に分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、表３に示す組み合わせでＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣ阻害剤（ＰＫＣβ以外のＰＫＣアイソザイムの活性を阻害する）を添加した点を除いて、比較例４と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例３：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養へのＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
実施例１で使用したＧｏ６９８３以外のＰＫＣβ阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、表４に示す組み合わせでＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤を添加した点を除いて、比較例４と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例４：定量的リアルタイムPCR解析＞
以下に示す手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。参考例２の培養４日目の細胞、及び比較例４、５、実施例３の培養８日目の細胞をＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて溶解させた。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させた溶液からｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離及び精製した。精製したＲＮＡをＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ（島津製作所社）を用いて濃度測定し、５００ｎｇ分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡社）を２μＬとＲｎａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ_２Ｏを添加して１０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３７℃で１５分反応後、５０℃で５分反応、９８℃で５分反応を連続して行い、４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０（ナカライテスク社）で１００倍に希釈し、３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に５μＬ／ｗｅｌｌで添加した。ＫＯＤ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）、５０μＭに調製したＦｏｒｗａｒｄプライマー、５０μＭに調製したＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社）を１００：１：１：４８の割合で混合し、この混合液を１５μＬ／ｗｅｌｌで前記３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートに添加して混合した。プライマーはＧＡＰＤＨ、ＯＣＴ４、Ｔ、ＳＯＸ１７、ＰＡＸ６を用いた。３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表５に示す。

定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示した。
ＡＣＴＢ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＯＣＴ４（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号３）
ＯＣＴ４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ－３’（配列番号４）
ＳＯＸ２（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号５）
ＳＯＸ２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＣ－３’（配列番号６）
ＮＡＮＯＧ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
ＮＡＮＯＧ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）
Ｔ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号９）
Ｔ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１０）
ＳＯＸ１７（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
ＳＯＸ１７（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
ＰＡＸ６（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１３）
ＰＡＸ６（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号１４）
遺伝子発現を測定した結果を表６及び図４に示した。

表６及び図４に示したように、浮遊培養を行った比較例４では、接着培養（参考例２）と比較してＰＡＸ６の発現量が増加しており、外胚葉への自発的分化が起きていることが示された。ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣ阻害剤（ＰＫＣβ以外のＰＫＣアイソザイムの活性を阻害する）を添加した比較例５－１から５－４は、ＰＡＸ６発現量が比較例４と同程度であった。ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加した実施例３－１から３－３は、ＰＡＸ６の発現量が比較例４よりも低く、参考例２と同程度であった。

比較例５－１から５－４で添加した４種類のＰＫＣ阻害剤は、いずれもＰＫＣβの阻害効果はない。一方、実施例３で添加したＬＹ－３３３５３１はＰＫＣβの選択的阻害剤であり、Ｇｏ６９８３及びＧＦ１０９２０３ＸはＰＫＣβを含む複数のＰＫＣアイソザイムの活性を阻害する広域阻害剤である。これらのことから、外胚葉への自発的分化抑制にはＰＫＣβの阻害が効果的であり、ＰＫＣβ阻害剤は、多能性幹細胞の外胚葉への分化抑制剤として有用であることが明らかとなった。

＜参考例３：フローサイトメトリー解析用細胞の調製＞
接着培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、参考例２と同じ手順で４日間培養を行い、細胞を調製した。

＜比較例６：フローサイトメトリー解析用細胞の調製＞
浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、比較例４と同じ手順で８日間培養を行い、細胞を調製した。

＜比較例７：フローサイトメトリー解析用細胞の調製＞
ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣ阻害剤（ＰＫＣβ以外のＰＫＣアイソザイムの活性を阻害する）を添加して浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、比較例５と同じ手順で８日間培養を行い、細胞を調製した。使用したＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣ阻害剤（ＰＫＣβ以外のＰＫＣアイソザイムの活性を阻害する）の組み合わせを表７に示す。

＜実施例５：フローサイトメトリー解析用細胞の調製＞
ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加して浮遊培養した細胞集団の未分化性をフローサイトメトリー解析するため、実施例３－２及び３－３と同じ手順で８日間培養を行い、細胞を調製した。使用したＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤の組み合わせを表８に示す。

＜実施例６：フローサイトメトリー解析＞
以下に示す手順でフローサイトメトリー解析を行った。参考例３、比較例６、比較例７、及び実施例５で得た細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで処理し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。その後、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより－２０℃で一晩透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。その後、細胞のサンプルを２つに分けてそれぞれ５０μＬずつに再懸濁した。一方に蛍光標識済抗ＯＣＴ４、抗ＳＯＸ２、及び抗ＮＡＮＯＧ抗体をそれぞれ加えて混合し、もう一方に蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体を加えて混合し、４℃、遮光状態で１時間染色した。使用した抗体とその添加量を表９に示した。

そして、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（ルミックス社）にて解析した。アイソタイプコントロール抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、より蛍光強度が強い細胞集団が１．０％以下となるすべての領域を選択した。抗ＯＣＴ４、抗ＳＯＸ２、及び抗ＮＡＮＯＧ抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、前記領域内に含まれる細胞の割合を算出し、これをＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧが陽性を呈する細胞の比率とした。その結果を表１０及び図５に示した。

表１０及び図５に示すように、接着培養を行った参考例３は未分化マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧについて、陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、未分化状態を維持した多能性幹細胞集団が得られた。一方、浮遊培養を行った比較例６及び、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣ阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例７ではＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が低下したことから、自発的に分化した細胞集団が出現しており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていなかった。ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った実施例５は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧについて、陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、自発的分化を抑制して未分化状態を維持した細胞集団が得られたと考えられた。これらの結果からも、ＴＮＫＳ阻害剤とＰＫＣβ阻害剤を使用した浮遊培養により、自発的分化を抑制し、未分化状態を維持した多能性幹細胞集団を取得可能であることが明らかになった。

＜参考例４：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の接着培養＞
参考例２と同じ手順で接着培養を実施した。

＜比較例８：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養＞
参考例２と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株をＡｃｃｕｔａｓｅで５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり１ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で９８ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養１日目及び６日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２日目及び７日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養５日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製し、培養０日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。

＜比較例９：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養へのＰＯＲＣＮ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
実施例１で使用したＴＮＫＳ阻害剤はＷＮＴシグナルの阻害剤効果を持つことが知られている。そこで、ＴＮＫＳ阻害剤以外にＷＮＴシグナルの阻害効果を持つＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、ＰＯＲＣＮ阻害剤としてＩＷＰ－２（富士フィルム和光純薬社）又はＷＮＴ－Ｃ５９（ケイマンケミカル社）を添加し、ＰＫＣβ阻害剤としてＧＦ１０９２０３Ｘ又はＬＹ－３３３５３１を添加した点を除いて、比較例８と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例７：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養へのＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
実施例１で使用したＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＴＮＫＳ阻害剤を使用した場合にも、分化抑制効果があるかどうかを確認するために、以下の方法で浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、ＴＮＫＳ阻害剤としてＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ又はＸＡＶ９３９（富士フィルム和光純薬社）を添加し、ＰＫＣβ阻害剤としてＧＦ１０９２０３Ｘ又はＬＹ－３３３５３１を添加した点を除いて、比較例８と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例８：定量的リアルタイムＰＣＲ解析＞
参考例４の培養４日目の細胞、並びに比較例８、比較例９、及び実施例７の培養１０日目の細胞に対し、実施例４と同じ手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。遺伝子発現を測定した結果を表１１及び１２並びに図６及び７に示した。

表１１及び１２並びに図６及び７に示したように、接着培養を行った参考例４では、Ｔ、ＳＯＸ１７、及びＰＡＸ６の発現量が低く、多能性幹細胞の未分化状態が維持されていた。一方、浮遊培養を行った比較例８では、Ｔ及びＳＯＸ１７の発現量が増加したことから、中胚葉及び内胚葉への自発的分化が起きており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていなかった。ＰＯＲＣＮ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った比較例９では、比較例８よりもＴ及びＳＯＸ１７の発現量が低かったことから、ＰＯＲＣＮ阻害剤は中胚葉及び内胚葉への自発的分化を抑制することが示された。また、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った実施例７は、比較例９と比較してＴ及びＳＯＸ１７の発現量がさらに低かったことから、ＰＯＲＣＮ阻害剤よりもＴＮＫＳ阻害剤の方がより強力に中胚葉及び内胚葉への自発的分化を抑制できることが示された。ＰＯＲＣＮ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤のいずれもＷＮＴシグナルの阻害効果を持つが、ＰＫＣβ阻害剤との組み合わせにおける中胚葉及び内胚葉への自発的分化抑制においてはＴＮＫＳ阻害剤の方が効果的であることが明らかになった。

＜参考例５：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の接着培養＞
参考例２と同じ手順で接着培養を実施した。

＜比較例１０：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養＞
比較例８と同じ手順で浮遊培養を実施した。培養８日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図８に示した。図８より、細胞凝集塊を形成したことが確認できた。

＜実施例９：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養におけるＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤の濃度検討＞
浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、ＴＮＫＳ阻害剤としてＩＷＲ－１－ｅｎｄｏを最終濃度３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭのうちいずれかの濃度で添加し、ＰＫＣβ阻害剤としてＧｏ６９８３又はＬＹ－３３３５３１を最終濃度１０μＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭのいずれかの濃度で添加した点を除いて、比較例８と同じ手順で浮遊培養を実施した。

＜実施例１０：定量的リアルタイムＰＣＲ解析＞
参考例５の培養４日目の細胞、並びに比較例１０及び実施例９の培養１０日目の細胞に対し、実施例４と同じ手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。遺伝子発現を測定した結果を表１３及び１４並びに図９から１１に示した。

表１３及び１４並びに図９から１１に示すように、接着培養を行った参考例５では、Ｔ、ＳＯＸ１７、及びＰＡＸ６の発現量が低く、多能性幹細胞の未分化状態が維持されていた。一方、浮遊培養を行った比較例１０では、Ｔ、ＳＯＸ１７、及びＰＡＸ６の発現量が増加したことから、中胚葉、内胚葉、及び外胚葉への自発的分化が起きており、多能性幹細胞の未分化状態を維持できていなかった。ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加して浮遊培養を行った実施例９において、ＴＮＫＳ阻害剤を最終濃度３０μＭ以下、１００ｎＭ以上の濃度範囲で添加すると、Ｔ及びＳＯＸ１７の発現量は比較例１０と比較して低く、中胚葉及び内胚葉への自発的分化を抑制した。また、実施例９において、ＰＫＣβ阻害剤を最終濃度１０μＭ以下、３０ｎＭ以上の濃度範囲で添加すると、ＰＡＸ６の発現量は比較例１０と比較して低く、外胚葉への自発的分化を抑制した。

＜比較例１１：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の接着培養におけるＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
参考例２において、接着培養の播種培地及び培地交換培地に対し、ＸＡＶ９３９を最終濃度１０μＭとＧＦ１０９２０３Ｘを最終濃度５μＭで添加する条件と、添加しない条件の２通りで接着培養を実施した。培養４日目の細胞の位相差画像を図１２に示した。図１２より、ＸＡＶ９３９とＧＦ１０９２０３Ｘを添加した条件では、大半の細胞が死滅したことが確認できた。培養４日目に細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。播種生細胞数に対する培養４日目の生細胞数を増幅率と定義すると、ＸＡＶ９３９とＧＦ１０９２０３Ｘを添加した条件の増幅率は２．１１×１０^－２であった。このことから、接着培養において、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を添加すると、多能性幹細胞の生存及び増殖に悪影響を及ぼすことが示された。

＜実施例１１：ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の浮遊培養におけるＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
比較例４において、浮遊培養の播種培地及び培地交換培地に対し、ＸＡＶ９３９を最終濃度１０μＭとＧＦ１０９２０３Ｘを最終濃度５μＭで添加する条件と、添加しない条件の２通りで浮遊培養を実施した。培養４日目の細胞の位相差画像を図１３に示した。図１３より、ＸＡＶ９３９とＧＦ１０９２０３Ｘを添加した条件は、無添加条件と同様に細胞凝集塊を形成し、同じ形態を示した。培養４日目に細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで１０分間処理して剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。比較例９と同様に増幅率を算出すると、ＸＡＶ９３９とＧＦ１０９２０３Ｘを添加した条件の増幅率は２．６８であった。比較例１１と実施例１１の増幅率比較を図１４に示した。これらのことから、実施例１１のＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を浮遊培養で添加した場合では、比較例１１の接着培養で確認された生存及び増殖への悪影響が顕著に改善されることが明らかになった。

＜比較例１２：ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株の長期浮遊培養＞
参考例２と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で９０ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で浮遊培養を行った。
細胞を播種した日を培養０日目とし、培養４、８、１６及び２０日目に継代を行い、培養２４日目まで浮遊培養を行った。培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、先ず、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻すことで培地交換した。培地交換時に、培養１、５、９、１３，１７，２１日目は、培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２、６、１０，１４，１８，２２日目は、培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養４、８、１２、１６、２０日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して３７℃で１０分間処理した後、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製し、培養０日目と同様に細胞を播種して浮遊培養を継続した。培養８，１６、２４日目に位相差顕微鏡を用いて細胞凝集塊の位相差画像を取得した。細胞凝集塊の位相差画像を図１５に示した。図１５より、細胞凝集塊を形成したことが確認できたが、その形状は歪であった。

＜実施例１２：ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株の長期浮遊培養におけるＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤添加＞
浮遊培養の培地にＴＮＫＳ阻害剤としてＩＷＲ－１－ｅｎｄｏを２０μＭ、ＰＫＣβ阻害剤添加としてＬＹ－３３３５３１を１μＭ添加し、培地交換及び継代の直前に培養上清のサンプリングを行い、王子計測機器社製多機能バイオセンサＢＦ－７Ｄを用いて、乳酸濃度の測定を行った以外は、比較例１２と同様に培養を行った。
細胞凝集塊の位相差画像を図１６に示した。図１６より、球状の綺麗な細胞凝集塊を形成したことを確認できた。また、図１７に比較例１２と実施例１２で行った定量的リアルタイムＰＣＲ解析の結果（使用したプライマー及び解析条件は実施例４参照）の推移を示した。図１７に示した通り、実施例１２では未分化マーカーであるＯＣＴ４の相対遺伝子発現量が長期培養においても高く維持されていることが分かった。また、実施例１２においては、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７の相対遺伝子発現量が長期培養においても低く維持されていることが分かる。一方、図１８に比較例１２と実施例１２における未分化マーカーであるＯＣＴ４の陽性率の推移を示す。図１８から、実施例１２においては、未分化マーカーであるＯＣＴ４の陽性率が長期培養においても高く維持されていることが分かる。

図１５～１８に示した比較例１２と実施例１２の結果から、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を含む培地を使用することで、多能性幹細胞を長期間にわたり浮遊培養を行っても、未分化性を維持できることが明らかとなった。さらに、図１９に比較例１２と実施例１２における到達生細胞密度の推移を示した。図１９から、実施例１２においては、多能性幹細胞を長期間にわたり浮遊培養を行っても、増殖性を維持できていることが分かった。さらにまた、図２０に実施例１２の培地交換及び継代直前における培地中の乳酸濃度を測定した結果を示した。図２０から、実施例１２においては、継代直前における培地中の乳酸濃度が１０ｍＭを超えて１２ｍＭ程度まで高くなっていることが分かった。以上の図１７～２０に示した結果から、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を含む培地を使用することで、培地中の乳酸濃度が比較的高くなっても、多能性幹細胞の未分化性と増殖能を維持できることが分かった。

＜実施例１３：攪拌型リアクターによる長期浮遊培養＞
浮遊培養用の培養容器をＡＢＬＥ社製のｉＰＳ細胞培養用シングルユースバイオリアクター（３０ｍＬ）を用い、３０ｍＬの細胞懸濁液を播種し、１３５ｒｐｍ、すなわち０．２３ｍ／ｓの翼先端速度で攪拌し、培養３、６、９、１２日目に継代を行い、培養１５日目まで浮遊培養を行った。本例では、培地交換時に、培養１、４、７、１０、１３日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度６．９μＭとなるように添加し、培養２、５、８、１１、１４日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度３．７１μＭとなるように添加した以外は、実施例１２と同様に培養を行った。

＜参考例６：ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株の長期接着培養＞
参考例２と同じ手順で接着培養したヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で５分間処理して培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。その後、実施例１３と同じ培養日数と継代数とした以外は、参考例２と同じ手順での培養と継代を繰り返し行った。
図２１に実施例１３と参考例６で行った定量的リアルタイムＰＣＲ解析の結果（使用したプライマー及び解析条件は実施例４参照）の推移を示した。なお、図２１においてデータが欠損しているポイントは、検出限界値以下であったことを意味している。図２１に示したように、実施例１３では浮遊培養でありながら、未分化マーカーの相対遺伝子発現量が長期培養においても、参考例６の接着培養と同等に高く維持されていることが分かる。また、実施例１３においては、代表的な三胚葉マーカーの相対遺伝子発現量が長期培養においても、参考例６の接着培養と同様に低く維持されていることが分かる。また、図２２に実施例１３で得られた細胞についてＧ－Ｂａｎｄ解析した結果を示した（株式会社日本遺伝子研究所に委託）。図２２に示す通り、実施例１３における浮遊培養によっても、継代３世代及び継代５世代ともに新たな核型異常が発生することは無いことが分かった。
以上の図２１及び２２に示した結果から、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を含む培地を使用することで、多能性幹細胞に対して高い剪断応力を負荷する攪拌培養条件であっても、核型異常を生じることなく、多能性幹細胞の未分化性を維持することができることが分かった。

＜実施例１４：長期浮遊培養後のｉＰＳ細胞の分化能評価＞
凍結保存した実施例１３の細胞を解凍し、最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２、２０μＭのＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、１μＭのＬＹ－３３３５３１を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり２×１０^５個の細胞を含むように調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で９０ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で４日間の浮遊培養を行った。
培地交換は毎日行った。培地交換の方法としては、先ず、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻すことで培地交換を行った。ただし、培地交換時に、培養開始から１日後は培地中のＹ－２７６３２の最終濃度を６．９μＭに減らし、培養２日後は培地中のＹ－２７６３２の最終濃度を３．７１μＭに減らし、培養３日後は培地中のＹ－２７６３２の最終濃度を２．５３μＭに減らした。
次いで、培地及び培地中の添加剤を表１５に示すように変化させながら、三胚葉それぞれへの分化誘導を行った。

本実施例では、中胚葉マーカーとしてＣＤＸ２、心原性中胚葉マーカーとしてＰＤＧＦＲａ、内胚葉マーカーとしてＳＯＸ１７、外胚葉マーカーとしてＰＡＸ６について定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーや解析条件は実施例４と同様である。なお心原性中胚葉マーカーであるＰＤＧＦＲａについては以下のプライマーセットを使用した。
ＰＤＧＦＲａ（Ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣ－３’（配列番号１５）
ＰＤＧＦＲａ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧ－３’（配列番号１６）

＜参考例７：接着培養されたｉＰＳ細胞の分化能評価＞
凍結保存した参考例６の細胞を解凍し、参考例２と同様に接着培養を行った。ただし、内径６ｃｍの培養皿、培地量は４．２ｍＬ、播種密度は１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とし、４日間の培養とした。接着培養後、ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジー社）で５分間処理して細胞を培養面から剥離し、ピペッティングによって単一細胞まで分散させた。その後、実施例１４と同様に三胚葉への分化誘導をそれぞれ実施した。
図２３に定量的リアルタイムＰＣＲ解析によって三胚葉マーカーの相対遺伝子発現量を測定した結果を示した。図２３に示したように、実施例１４において長期浮遊培養されたｉＰＳ細胞は三胚葉それぞれへの分化誘導能を有していることが明らかとなった。

＜実施例１２～１４について＞
以上に示したように、ＴＮＫＳ阻害剤及びＰＫＣβ阻害剤を含む培地を使用することで多能性幹細胞の大量調製法として期待される浮遊培養を、その増殖性、未分化性、分化誘導能を維持しながら長期にわたって培養できることが示された。実施例１２～１４にて使用した多能性幹細胞には、フィーダーフリーで樹立される等、臨床用多能性幹細胞と同等の製法で提供されるものが含まれている。したがって、臨床用多能性幹細胞についてもまた、実施例１２～１４によって示されたように増殖性、未分化性、分化誘導能を維持しながら大量に調整できることが期待できる。

Claims (12)

1. ＰＫＣβ阻害剤及びＴＮＫＳ阻害剤を含む液体培地中で、多能性幹細胞を浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞集団の製造方法であって、
   前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤含有濃度が、２５ｎＭ以上１５μＭ以下であり、
   前記液体培地中のＴＮＫＳ阻害剤含有濃度が、９０ｎＭ以上４０μＭ以下であり、そして
   前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を形成する工程を含む
   前記製造方法。
2. 前記ＰＫＣβ阻害剤が、ＬＹ３３３５３１である請求項１記載の方法。
3. 前記液体培地中のＰＫＣβ阻害剤とＴＮＫＳ阻害剤の含有濃度の比率が１６７：１以上１：１６００以下の範囲である請求項１記載の方法。
4. 前記液体培地が、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１つを含有する請求項１記載の方法。
5. 前記液体培地が、ＦＧＦ２及び/又はＴＧＦ－β１を含む請求項１記載の方法。
6. 前記液体培地が、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する請求項１記載の方法。
7. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である請求項６記載の方法。
8. 前記浮遊培養する工程が、細胞凝集塊を回収する工程を含む請求項１記載の方法。
9. 前記多能性幹細胞集団は、ＯＣＴ４が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、ＳＯＸ２が陽性を呈する細胞の比率が９０％以上であり、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率が９０％以上である請求項１記載の方法。
10. 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及び/又は人工多能性幹細胞である請求項１記載の方法。
11. 上記液体培地中の乳酸濃度が５～１５ｍＭになるまで上記浮遊培養する請求項１記載の方法。
12. 上記浮遊培養は、翼先端速度を０．０５ｍ／ｓ以上１．３７ｍ／ｓ以下とした攪拌培養である請求項１記載の方法。