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JP7778571B2 - 免疫細胞機能をモジュレートするための変異体インターロイキン－２ポリペプチドと抗原結合分子の融合体 - Google Patents

免疫細胞機能をモジュレートするための変異体インターロイキン－２ポリペプチドと抗原結合分子の融合体

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JP7778571B2
JP7778571B2 JP2021572298A JP2021572298A JP7778571B2 JP 7778571 B2 JP7778571 B2 JP 7778571B2 JP 2021572298 A JP2021572298 A JP 2021572298A JP 2021572298 A JP2021572298 A JP 2021572298A JP 7778571 B2 JP7778571 B2 JP 7778571B2
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アッシャー バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド
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Description

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年６月５日に出願した米国仮出願第６２／８５７，７２６号の優先権を主張するものである。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１８２８４２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年６月５日、サイズ：１０５ＫＢ）。
本開示は、変異体インターロイキン－２ポリペプチド、および変異体インターロイキン－２ポリペプチドと抗原結合分子とを含む融合ポリペプチドを開示する。本開示は、免疫細胞を本開示の融合ポリペプチドと接触させることにより免疫細胞機能をモジュレートする方法を提供する。加えて、本開示は、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。本開示は、融合タンパク質を産生するための方法、融合タンパク質を含む医薬組成物、およびそれらの使用をさらに提供する。
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、アルファベータＣＤ４＋およびＣＤ８ Ｔ＋細胞を含む多くのリンパ球サブセット、ならびに様々な生得および生得様リンパ球、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（Ｔγδ）細胞、および生得リンパ系細胞（ＩＬＣ１、ＩＬＣ２およびＩＬＣ３細胞）を調節するサイトカインである。ＩＬ－２のその受容体への結合は、リンパ球における多くの遺伝子の転写を調節するＳＴＡＴ５転写因子（ｐＳＴＡＴ５）のリン酸化を促進する受容体関連ヤヌスキナーゼ、ＪＡＫ３およびＪＡＫ１、のリン酸化を誘導する。ＩＬ－２のその受容体への結合は、ＳＴＡＴ５に加えて、ＥＲＫ、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔキナーゼなどの、他のシグナル伝達経路も活性化する。リンパ球におけるＩＬ－２シグナル伝達は、細胞生存、増殖、ならびに炎症誘発性サイトカイン分泌および細胞傷害機能を含むエフェクター機能向上、ならびに一部の場合には、活性化誘導性細胞死を促進する（Ross & Cantrell, Annu Rev Immunol.2018 Apr 26;36:411-433において概説されている）。
ＩＬ－２は、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγサブユニットからなる受容体複合体（ＩＬ－２Ｒβγ、中親和性受容体）に中等度の親和性で結合することによりシグナルを伝達することができ、これらのサブユニットの両方が、免疫細胞における下流のシグナル伝達の誘発に必要とされ、その誘発に十分なものである。加えて、ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγサブユニットからなる受容体複合体（ＩＬ－２Ｒαβγ、高親和性受容体）に高度な親和性で結合する（Stauber et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Feb 21;103(8):2788-93）。ＩＬ－２Ｒα発現は、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞、活性化Ｔリンパ球、ならびにＩＬＣ２およびＩＬＣ３細胞に限られており、このことが、これらのサブセットをＩＬ－２シグナル伝達に対する感受性が最も高いものにする。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγサブユニットは、別の関連サイトカインＩＬ－１５と共有され、そしてＩＬ－２Ｒγサブユニットは、他の一般的なガンマ鎖サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９およびＩＬ－２１）間で共有される。ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、Ｔγδ細胞ならびにＩＬＣ１、ＩＬＣ２およびＩＬＣ３細胞をはじめとする多くの生得および生得様リンパ球は、高レベルのＩＬ－２Ｒβを発現し（ImmGen consortium；Heng TS et al, Immunological Genome Project Consortium. Nat Immunol.2008 Oct;9(10):1091-4）、このこともまた、そのようなリンパ球を、ＩＬ－２サイトカインとＩＬ－１５サイトカインの両方に対して感受性の高いものにする。
リンパ球に対するその強力な活性と一致して、高用量のＩＬ－２の全身投与は、多くの前臨床がんモデルにおいて抗腫瘍免疫応答の活性化および有効性をもたらした。全身投与高用量ＩＬ－２は、患者においても試験されており、高用量のＩＬ－２が転移性黒色腫および腎細胞癌（ＲＣＣ）の処置に認可されている。投与レジメンは、高親和性ＩＬ－２受容体を刺激するために必要な濃度に血清レベルを維持するためにＩＬ－２のｉｎ ｖｉｖｏ半減期に基づいて確立された、８時間おきの６００，０００ＩＵ／ｋｇの静脈内注射からなった。ＲＣＣでの全奏効率は２０％であり、完全奏功率は９％であった一方で、黒色腫での全奏効率は１６％であり、完全奏功率は６％であった（Rosenberg, J Immunol.2014 Jun 15;192(12):5451-8において概説されている）。がんにおける高用量ＩＬ－２の有効性は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を、これらの機能を維持しつつ強力に拡大増殖させる（expand）、その能力によるものと考えられる。しかし、ＩＬ－２はまた、Ｔｒｅｇ細胞を拡大増殖し、それらの適切な抑制機能を促進する（Chinen et al, Nat Immunol.2016 Nov;17(11):1322-1333）。実際、ＩＬ－２に対するＴｒｅｇの感受性に起因して、病原性免疫応答を抑制するために、低用量ＩＬ－２治療レジメンが、自己免疫を有する患者において試験されている（Collison, Nat Rev Rheumatol.2019 Jan;15(1):2）。
免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞に対するその望ましくない効果に加えて、患者におけるＩＬ－２の恩恵は、発熱、悪寒、倦怠感、関節痛、低血圧、異常肝機能、腎不全、ならびに毛細血管漏出症候群および体液貯留を含む、重大な毒性を伴った。ＩＬ－２により誘導される毒性は、患者が摂取できるだろう投薬回数に制限を課すため、ＩＬ－２処置は、厳格な患者適格性基準、および経験を積んだ医師による投与を必要とする（Schwartz et al, Oncology (Williston Park).2002 Nov;16(11 Suppl 13):11-20）。ＩＬ－２の毒性には免疫細胞と血管内皮との相互作用の複雑なセットが関与する：ＩＬ－２活性化細胞は、内皮細胞に強く結合し、その結果、それらの溶解をもたらし、ＩＬ－２は、内皮細胞上の機能性ＩＬ－２受容体とのその相互作用によって肺水腫を誘導する（Milling et al, Adv Drug Deliv Rev. 2017 May 15; 114: 79-101において概説されている）。ＩＬ－２ＲαとのＩＬ－２の相互作用の遮断は、動物モデルにおいて肺水腫を消失させた（Krieg et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jun 29;107(26):11906-11）。加えて、同研究は、ＩＬ－２Ｒαの遮断がまた、ＩＬ－２Ｒβγ＋エフェクター免疫細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞について、ならびに比較的程度は低いがＴｒｅｇについても、活発な活性化をもたらし、その結果、安全性と抗腫瘍有効性の両方を組換えＩＬ－２と比較して大幅に向上させることを示した。
最近、ＮＫ細胞は、マウスにおいて、ＩＬ－２がＩＦＮ－αと一緒に投与された場合にＮＫ細胞の過剰活性化および複数の炎症性サイトカインの分泌によってＩＬ－２の毒性を生じさせることが示された（Rothschilds et al, Oncoimmunology.2019 Feb 19;8(5):e1558678）。加えて、ＮＫ細胞は、同じくＩＬ－２Ｒβγによってシグナル伝達するサイトカインＩＬ－１５の毒性を生じさせることも示された（Guo et al, J Immunol.2015 Sep 1;195(5):2353-64）。ＩＬ－２Ｒβγシグナル伝達に応答してのこのＮＫ細胞過剰活性化は、活性化に応答してＮＫ細胞がＩＬ－２Ｒβを高度に発現することおよび炎症性サイトカインを迅速に分泌することができることに起因する可能性が高い。加えて、高レベルのＩＬ－２Ｒβも発現する他の生得リンパ球も、ＩＬ－２の毒性の誘導へのそれらの役割は研究されてはいないものの、ＩＬ－２の全身投与で観察される全身毒性の一因になる可能性がある。
その一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、多くの前臨床がんモデルにおいて、ＩＬ－２含む免疫治療剤の有効性を媒介することが示されており（Caudana et al, Cancer Immunol Res.2019 Mar;7(3):443-457）、それらは、患者において免疫療法に対する応答との相関も認められた（Sade-Feldman et al, Cell.2018 Nov 1;175(4):998-1013）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ（ＣＤ８α、ＣＤ８ａ）ホモ二量体およびＣＤ８アルファ－ＣＤ８ベータ（ＣＤ８β、ＣＤ８ｂ）ヘテロ二量体として細胞表面に見出されるＩ型膜貫通糖タンパク質であるＣＤ８を発現する。ＣＤ８二量体は、標的細胞上の主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ分子と相互作用し、この相互作用によってＴＣＲはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化中にＭＨＣと密接に係合した状態に保たれる。ＣＤ８αの細胞質テールは、Ｔ細胞活性化中にＴＣＲの下流でシグナル伝達を開始させるＴ細胞キナーゼ（Ｌｃｋ）のための結合部位を含有し、その一方で、ＣＤ８βの役割は、ＭＨＣクラスＩへのＣＤ８の結合の結合活性を増大させることおよびＣＤ８／ＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用の特異性に影響を与えることにあると考えられている（Bosselut et al, Immunity. 2000 Apr;12(4):409-18）。
腫瘍内Ｔ細胞は、複数のヒトがんにおいてＰＤ１を発現することが最近示された（Gros et al, J Clin Invest. 2014 May;124(5):2246-59；Egelston etl al, Nat Commun. 2018 Oct 16;9(1):4297；Thommen et al, Nat Med. 2018 Jul;24(7):994-1004）。ＰＤ１は、細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞質テールとを含有するＩ型膜貫通タンパク質である。細胞質テールは、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２などの細胞内ホスファターゼを動員することができる免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）の一部であるリン酸化部位を含有する。ＰＤ１は、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合することにより、ＴＣＲシグナル伝達を負に調節する。ＰＤ１とそのリガンドとのこの相互作用は、がん処置としてのいくつかの承認されている抗ＰＤ１および抗ＰＤ－Ｌ１抗体により遮断される（Ribas & Wolchok, Science.2018 Mar 23;359(6382):1350-1355）。
腫瘍内Ｔ細胞上でのＰＤ１の高度な発現は、腫瘍抗原に対する特異性に関連しており、腫瘍におけるこれらのＰＤ１＋Ｔ細胞の出現頻度が抗ＰＤ１抗体に対する応答と関連付けられた（Thommen et al, Nat Med.2018 Jul;24(7):994-1004）。ＰＤ１は、末梢血ＣＤ８＋およびＣＤ４＋メモリーおよびエフェクターＴ細胞上にも発現され、腫瘍抗原特異的腫瘍内Ｔ細胞上より低レベルでだが、ＰＤ１は、健康な組織内に存在するＴ細胞上にも発現され得る。加えて、他の細胞型、例えば、Ｔｒｅｇ、Ｔγδ、ＮＫ ＴおよびＩＬＣ２細胞も、ＰＤ１を発現し得る。
ＲｉｂａｓおよびＷｏｌｃｈｏｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）３５９（６３８２）：１３５０～１３５５ Ｔｈｏｍｍｅｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１８）２４（７）：９９４～１００４
目標は、前臨床がんモデルおよびがん患者における有効性と関連付けられている、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＰＤ１＋Ｔ細胞に対するＩＬ－２の活性を増強すること、ならびにＩＬ－２の毒性および望ましくない効果と関連付けられている、Ｔｒｅｇおよび生得リンパ系細胞をはじめとする他の細胞に対するＩＬ－２の活性を低減させることにより、ＩＬ－２の毒性を低減させ、その有効性を向上させることである。
本開示は、とりわけ、例えば図１Ａ（配列番号１）および図２に描示されているような、野生型成熟ＩＬ－２アミノ酸配列に対する１つ、２つもしくはそれより多くの、または３つもしくはそれより多くのアミノ酸置換（すなわち、変異）を有する変異体ＩＬ－２ポリペプチドを記載する。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｂ（配列番号２）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の低減を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｂ（配列番号２）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の低減を示し、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｃ（配列番号３）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対する結合親和性の低減を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｂ（配列番号２）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の低減を示し、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｄ（配列番号４）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の低減を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｂ（配列番号２）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の低減を示し、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｃ（配列番号３）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対する結合親和性の低下を示し、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｄ（配列番号４）に描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の低減を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して生物物理学的特性の向上を示す。
本明細書で開示される変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒ複合体に対するそれらの結合親和性の減少に起因して、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｔｒｅｇなどの、有効性に対するＩＬ－２の望ましくない効果に関連する免疫細胞、もしくはＮＫ細胞を含む、生得リンパ系細胞などの、ＩＬ－２の毒性に関連する免疫細胞と結合する能力および／またはそのような細胞を刺激する能力が低下している。しかし、本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドはまた、野生型ＩＬ－２と比較して、前臨床がんモデルにおける有効性および患者における免疫療法に対する応答と関連付けられている、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの、望ましいＩＬ－２Ｒ発現免疫細胞に結合する能力および／またはそのような免疫細胞を活性化する能力が低下している。本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを、がんおよび他の免疫関連疾患、例えばある特定の感染性疾患の処置に対する安全性と有効性の両方がより高いものであり得る治療薬にするために、本発明者らは、本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＣＤ８およびＰＤ１などの、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在する抗原に対する抗体などの抗原結合分子とを含む融合タンパク質を設計した。変異体ＩＬ－２ポリペプチドと特異的抗原に結合する抗体とを含むそのような融合タンパク質は、融合体の抗原結合分子により認識される抗原に結合するので、「標的化された」融合タンパク質とも呼ばれる。このような融合タンパク質は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドといずれの特定の抗原にも結合しない対照抗体とを含む「標的化されていない」融合タンパク質（すなわち、ＩＬ－２ポリペプチドとのＦｃ融合体または対照抗体融合体；Zhu et al, Cancer Cell.2015 Apr 13;27(4):489-501）と区別される。
理論に拘束されることを望まないが、図３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の抗原に結合する抗原結合分子が、変異体ＩＬ－２ポリペプチドによるＣＤ８＋Ｔ細胞への結合および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に対する刺激を増加させるために、どのように働くかの一般的な機序を、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含有する本開示の標的化された融合タンパク質の文脈で描示する。ある特定の抗原結合分子は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに融合された場合、融合体の抗原結合分子に対する抗原を発現する細胞に対してのみ変異体ＩＬ－２ポリペプチドの結合を大幅に増加させるおよび／または活性を大幅に増大させる能力があり、その結果、抗原発現細胞を抗原非発現細胞よりも優先的に活性化する（図３）。標的化された融合タンパク質とは異なり、同じ変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含有する標的化されていない融合タンパク質は、抗原発現細胞に優先的に結合せず、および／または抗原発現細胞を優先的に活性化しない（図３）。
理論に拘束することを望まないが、標的化された融合タンパク質による抗原発現細胞の活性化と抗原非発現細胞の活性化の差異、および標的化された融合タンパク質による抗原発現細胞の活性化と標的化されていない融合タンパク質による抗原発現細胞の活性化の差異は、治療剤としての標的化された融合タンパク質の有効性にとって重要であり、これらの差異を実験に基づいて測定することができると考えられる。有効性に対する毒性または望ましくない効果と関連がある他の細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞などの有効性と関連がある細胞に対する選択性が高い融合タンパク質ほど、融合タンパク質が治療剤として使用されたときにその治療指数が高い可能性がある。
本開示のある特定の態様は、２つの部分を含む融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、第１の部分は、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＶＨは、可変重鎖であり、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬ（ここで、ＶＬは、可変軽鎖であり、ＣＬは、定常軽鎖である）、および変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端は、ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されており；第２の部分は、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体および抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬを含み；第１の部分と第２の部分の両方が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端は、ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；第２の部分は、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；第２の部分は、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１の部分は、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端は、ＦｃドメインのＮ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；第２の部分は、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；第２の部分は、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１の部分は、ヒトＣＤ８αまたはヒトＣＤ８βに結合する、抗原結合ドメインを含み；第２の部分は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み；第２の部分は、第１の部分にリンカーを介して連結されている（例えば、第２の部分は、第１の部分に融合されている）。
一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減、および配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減、および配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号４のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減、および配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減、および配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号４のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す。
一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性は、野生型ＩＬ－２によるＴｒｅｇ細胞の活性化と比較して、本開示の融合タンパク質（例えば、本開示の抗ＣＤ８抗原結合ドメインと変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む）によるＴｒｅｇ細胞の活性化を比較することにより、および野生型ＩＬ－２、またはＩＬ－２Ｒａへの結合を伴わずＩＬ－２ＲｂおよびＩＬ２Ｒｇへの野生型様の結合を伴うＩＬ－２ポリペプチドによるＮＫ細胞の活性化と比較して、本開示の融合タンパク質（例えば、本開示の抗ＣＤ８抗原結合ドメインと変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む）によるＮＫ細胞（ＩＬ－２Ｒｂｇを発現する）の活性化を比較することにより、測定される。
一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性が低減したまたはそのような結合親和性がない変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγに対する結合親和性は、野生型ＩＬ－２、またはＩＬ－２Ｒａへの結合を伴わずＩＬ－２ＲｂおよびＩＬ２Ｒｇへの野生型様の結合を伴うＩＬ－２ポリペプチドによる、ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγを発現する細胞の活性化と比較して、本開示の融合タンパク質（例えば、本開示の抗ＣＤ８抗原結合ドメインと変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む）による、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγを発現する細胞の活性化を比較することにより、測定される。例えば、ＩＬ－２Ｒαへの結合が低減されたまたはそのような結合がない変異体ＩＬ－２ポリペプチド（またはそれを含む融合タンパク質）を、必要に応じてさらに変異させ、ＩＬ－２Ｒα／β／γを発現する細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞またはＩＬ－２ｂｇ、すなわちＮＫ細胞の活性化について試験することができる。変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒαに結合していないので、ＩＬ－２Ｒα／β／γを発現する細胞を活性化する能力またはそのような細胞の活性化の効力を、ＩＬ－２Ｒβ／γへの変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合タンパク質の結合についてのアッセイとして使用することができる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＮＫ細胞の活性化と比較して、１０倍もしくはそれより大きい効力、または５０倍もしくはそれより大きい効力で、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に対する１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くのアミノ酸置換を有する、配列番号１の配列を含み、これらの置換は、Ｑ１１、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９およびＳ１３０からなる群より選択される配列番号１の位置に存在する。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に対するＦ４２ＡまたはＦ４２Ｋアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に対するＲ３８Ａ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６８Ａ、Ｅ６８Ｑ、Ｅ６８ＫまたはＥ６８Ｒアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に対するＨ１６Ｅ、Ｈ１６Ｄ、Ｄ２０Ｎ、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｒ、Ｍ２３Ｋ、Ｓ８７Ｋ、Ｓ８７Ａ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｖ、Ｄ８４Ｈ、Ｄ８４Ｙ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｋ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９１Ｔ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９２Ａ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ａ、Ｅ９５Ｒ、Ｔ１２３Ａ、Ｔ１２３Ｅ、Ｔ１２３Ｋ、Ｔ１２３Ｑ、Ｑ１２６Ａ、Ｑ１２６Ｓ、Ｑ１２６Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ１２７Ｅ、Ｓ１２７ＫまたはＳ１２７Ｑアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１８～８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ、およびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ、およびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、本明細書に記載の、ＩＬ－２ｍ１、ＩＬ－２ｍ２、ＩＬ－２ｍ３、ＩＬ－２ｍ４、ＩＬ－２ｍ４．９、ＩＬ－２ｍ４．１０、ＩＬ－２ｍ４．１１、ＩＬ－２ｍ４．１２、ＩＬ－２ｍ４．１３、ＩＬ－２ｍ４．１４、ＩＬ－２ｍ４．１５、ＩＬ－２ｍ４．１６、ＩＬ－２ｍ４．１７、ＩＬ－２ｍ４．２、ＩＬ－２ｍ４．１、ＩＬ－２ｍ４．６、ＩＬ－２ｍ４．１８、ＩＬ－２ｍ４．４、ＩＬ－２ｍ４．１９、ＩＬ－２ｍ４．５、ＩＬ－２ｍ４．２０、ＩＬ－２ｍ４．３、ＩＬ－２ｍ４．２１、ＩＬ－２ｍ４．２２、ＩＬ－２ｍ４．２３、ＩＬ－２ｍ４．２４、ＩＬ－２ｍ５、ＩＬ－２ｍ６、ＩＬ－２ｍ７、ＩＬ－２ｍ８、ＩＬ－２ｍ９、ＩＬ－２ｍ１０、ＩＬ－２ｍ１０．１、ＩＬ－２ｍ１０．２、ＩＬ－２ｍ１０．３、ＩＬ－２ｍ１０．４、ＩＬ－２ｍ１０．５、ＩＬ－２ｍ１０．６、ＩＬ－２ｍ１０．７、ＩＬ－２ｍ１０．８、ＩＬ－２ｍ１０．９、ＩＬ－２ｍ１０．１０、ＩＬ－２ｍ１０．１１のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＣＤ８に結合し、この融合タンパク質のＣＤ８への結合は、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない。一部の実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１と比較してアミノ酸変異Ｃ１２５Ａをさらに含む。一部の実施形態では、前記第１および第２のＦｃドメインは、ＥＵ番号付けに従って、次のＦｃ変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＫ３２２Ａ。一部の実施形態では、前記第１のＦｃドメインは、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃドメインは、ＥＵ番号付けに従って、次のアミノ酸置換：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むか；または前記第２のＦｃドメインは、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第１のＦｃドメインは、ＥＵ番号付けに従って、次のアミノ酸置換：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質が、ヒトＣＤ８に結合し、この融合タンパク質のＣＤ８への結合が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しないという特性；および融合タンパク質が、ＮＫ細胞の活性化と比較して１０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するという特性のうちの１つまたは複数を有するかまたは示す。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化の効力は、細胞増殖（例えば、Ｋｉ６７アッセイ）により評価される細胞活性化のＥＣ５０により測定される。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化の効力は、ＳＴＡＴ５活性（例えば、ｐＳＴＡＴ５アッセイ）により評価される細胞活性化のＥＣ５０により測定される。
本開示の他の態様は、上記実施形態のいずれか１つによる変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド（例えば、１つまたは複数）に関する。本開示の他の態様は、上記実施形態のいずれか１つによる変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合タンパク質または単離されたポリヌクレオチドをコードする、ベクター（例えば、１つまたは複数）に関する。一部の実施形態では、ベクター（例えば、１つまたは複数）は、発現ベクターである。本開示の他の態様は、上記実施形態のいずれか１つによるポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む、宿主細胞（例えば、単離されたおよび／または組換え宿主細胞）に関する。本開示の他の態様は、上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。本開示の他の態様は、上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物の医薬としての使用に関する。本開示の他の態様は、医薬の製造における上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物の使用に関する。本開示の他の態様は、がんまたは慢性感染症を処置する方法における上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物の使用であって、前記方法が、それを必要とする患者に有効量の融合タンパク質または医薬組成物を投与するステップを含む使用に関する。本開示の他の態様は、がんを処置する方法における上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物の使用であって、前記方法が、それを必要とする患者に、有効量の融合タンパク質または医薬組成物を、Ｔ細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と組み合わせて投与するステップを含む使用に関する。本開示の他の態様は、がんまたは慢性感染症を処置するための医薬の製造における上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物の使用に関する。本開示の他の態様は、がんまたは慢性感染症を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量の上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。本開示の他の態様は、がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の上記実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質または医薬組成物を、Ｔ細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と組み合わせて投与するステップを含む方法に関する。本明細書に記載される実施形態のいずれかによる一部の実施形態では、ＩＣＩは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質を含有する本開示の標的化されたＩＬ－２融合タンパク質は、抗原発現ＩＬ－２Ｒβ＋細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原非発現ＩＬ－２Ｒβ＋細胞、例えばＮＫ細胞の少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、または少なくとも２００倍活性化する。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、抗原発現ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、例えば、前記ＩＬ－２変異体ポリペプチドと前記細胞上に発現されたいずれの抗原にも結合しない対照抗体とを含む融合タンパク質と比較して、５０倍を超えて、１００倍、または少なくとも２００倍、活性化する。ＩＬ－２融合タンパク質による前記細胞活性化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、前記ＩＬ－２融合タンパク質での処理後の前記細胞におけるｐＳＴＡＴ５または細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することにより決定される。
まとめると、本開示は、ＩＬ－２の効果を、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの、目的のある特定の免疫細胞サブセットまで低減することにより、ＩＬ－２Ｒ複合体を発現するあらゆる免疫細胞に対するＩＬ－２の多面的効果の、効果のサブセットへの低減を果たす。このような絞り込みは、治療薬として投与されたときに、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞またはウイルス抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞サブセットにＩＬ－２ポリペプチドの作用を方向付け、したがって、１）有効性に寄与しない可能性があるＴ細胞；または２）ＩＬ－２の受容体を発現し、全身に分布し、毒性に寄与し得る生得リンパ球；３）ＩＬ－２のシンクとして作用するかまたは有効性に負に寄与し得る他の免疫細胞を温存すること（sparring）により、ＩＬ－２ポリペプチドの毒性を低減させることを目的とする。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体であって、ここで、ＶＨは、可変重鎖であり、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬであって、ここで、ＶＬは、可変軽鎖であり、ＣＬは、定常軽鎖である、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬ、および変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、前記ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されており；
ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体および抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬを含み；
前記第１の部分と前記第２の部分の両方が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する、
融合タンパク質。
（項目２）
２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体であって、ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、前記ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
前記第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する、
融合タンパク質。
（項目３）
２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体であって、ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端が、前記ＦｃドメインのＮ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
前記第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する、
融合タンパク質。
（項目４）
２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、ヒトＣＤ８αまたはヒトＣＤ８βに結合する抗原結合ドメインを含み；
ｉｉ）第２の部分が、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み；
前記第２の部分が、前記第１の部分にリンカーを介して連結されている、
融合タンパク質。
（項目５）
前記第１の部分が、（ａ）１つもしくは２つの重鎖ポリペプチドと１つもしくは２つの軽鎖ポリペプチドとを含む抗体もしくはその抗原結合性断片；（ｂ）単鎖抗体もしくは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；または（ｃ）ＶＨＨ抗体を含む、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目６）
ＮＫ細胞の活性化と比較して、１０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、項目１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目７）
ＮＫ細胞の活性化と比較して、５０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、項目６に記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、項目１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、項目８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号４のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、項目８または項目９に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１に対する１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くのアミノ酸置換を有する、配列番号１の配列を含み、前記１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くの置換が、Ｑ１１、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９およびＳ１３０からなる群より選択される配列番号１の位置における置換を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くの置換が、配列番号１に対するＦ４２ＡまたはＦ４２Ｋアミノ酸置換を含む、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くの置換が、配列番号１に対するＲ３８Ａ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６８Ａ、Ｅ６８Ｑ、Ｅ６８ＫまたはＥ６８Ｒアミノ酸置換をさらに含む、項目１１または項目１２に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くの置換が、配列番号１に対するＨ１６Ｅ、Ｈ１６Ｄ、Ｄ２０Ｎ、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｒ、Ｍ２３Ｋ、Ｓ８７Ｋ、Ｓ８７Ａ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｖ、Ｄ８４Ｈ、Ｄ８４Ｙ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｋ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９１Ｔ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９２Ａ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ａ、Ｅ９５Ｒ、Ｔ１２３Ａ、Ｔ１２３Ｅ、Ｔ１２３Ｋ、Ｔ１２３Ｑ、Ｑ１２６Ａ、Ｑ１２６Ｓ、Ｑ１２６Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ１２７Ｅ、Ｓ１２７ＫまたはＳ１２７Ｑアミノ酸置換をさらに含む、項目１１から１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くの置換が、配列番号１と比較してアミノ酸変異Ｃ１２５Ａをさらに含む、項目１１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１８～８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、およびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記融合タンパク質が、ヒトＣＤ８に結合し、前記融合タンパク質のＣＤ８への結合が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない、項目１から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
第１および第２のＦｃドメインが、ＥＵ番号付けに従って、次のＦｃ変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＫ３２２Ａを含む、項目１から１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２０）
（ａ）ＥＵ番号付けに従って、前記第１のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むか；または
（ｂ）ＥＵ番号付けに従って、前記第２のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第１のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む、
項目１から１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２１）
（ａ）前記融合タンパク質が、ヒトＣＤ８に結合し、前記融合タンパク質のＣＤ８への結合が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない特性；および
（ｂ）ＮＫ細胞の活性化と比較して、１０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する特性、
のうちの１つまたは複数を有する、項目１から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２２）
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化の効力が、細胞増殖により評価される細胞活性化のＥＣ５０により測定される、項目６、７および２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２３）
項目１から２２のいずれか一項に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
（項目２４）
項目２３に記載のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
（項目２５）
項目２３に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
（項目２６）
項目１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目２７）
医薬としての使用のための、項目１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
がんまたは慢性感染症を処置する方法であって、有効量の項目１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または項目２６に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
（項目２９）
がんを処置する方法であって、有効量の項目１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または項目２６に記載の組成物をＴ細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と組み合わせて患者に投与するステップを含む方法。
（項目３０）
前記ＩＣＩが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である、項目２９に記載の方法。
図１Ａ～１Ｄは、成熟ＩＬ－２（図１Ａ；配列番号１）、ＩＬ－２Ｒα（図１Ｂ；配列番号２）、ＩＬ－２Ｒβ（図１Ｃ；配列番号３）およびＩＬ－２Ｒγ（図１Ｄ；配列番号４）ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図２は、野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチド（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。「Ｘ」は、本開示の成熟ＩＬ－２ポリペプチドを生成するために別のアミノ酸に置換される、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの配列中のアミノ酸を示す。
図３は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ８またはＰＤ１抗原結合分子の標的化された融合体、および変異体ＩＬ－２ポリペプチドとの標的化されていない融合体が、どのようにＣＤ８またはＰＤ１抗原を発現するまたは発現しない細胞を刺激するように働くかの一般的な機序を示す。
図４は、一部の実施形態による３つの異なる融合タンパク質フォーマット（フォーマットＡ、ＢおよびＣ）を描示する。
図５は、治療用ヒトＩＬ－２（左側）で刺激された、ならびにＩＬ－２Ｒαへの結合を有さず、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγへの野生型結合を有するＩＬ－２バリアント（右側）で刺激された、異なるマウス脾臓細胞のサブセットにおけるＳＴＡＴ５の活性化を示す。脾臓サブセットにおけるＳＴＡＴ５活性化を、フローサイトメトリーにより測定した。ＩＬ－２で刺激された脾臓細胞サブセットにおけるＳＴＡＴ５の活性化が、左側に示されている。ＩＬ－２Ｒａに結合しない以前に公開されたＩＬ－２バリアント（ＩＬ－２ｖ； Klein et al, Oncoimmunol. 2017; 6(3); e1277306を参照されたい）と対照抗体（ｘＨＡ）との融合体であるｘＨＡ－ＩＬ－２ｖで刺激された脾臓細胞サブセットにおけるＳＴＡＴ５の活性化が、右側に示されている。ＮＫ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞よりも、ＣＤ２５／ＩＬ２Ｒαへの結合が低減されたＩＬ－２およびＩＬ－２バリアントに対する感受性が高いことが判明した。
図６Ａおよび６Ｂは、マウスにおける、ＣＤ２５への結合が低減されたＩＬ－２バリアントのＮＫ細胞誘導毒性を示す。８～１０週齢のＢ６マウスに、示されている化合物の単一用量を皮下注射し、それらのマウスの体重を毎日記録した。図６Ａは、２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１（ｘＰＤ１）と併用投与されるｘＨＡ－ＩＬ－２ｖで処置されたマウスについての体重の記録を示す。図６Ｂは、腫瘍において発現される抗原（腫瘍抗原／ＴＡｇ）を標的とする抗体に融合された同じＩＬ－２ｖであるＴＡｇ－ＩＬ－２ｖで処置されたマウスについての体重の記録を示す。ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖを単独で５ｍｇ／ｋｇで投与した。ＮＫ細胞を、２００ｍｇ／マウス ｉ．ｐ．の抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６クローン）で枯渇させた。枯渇用抗体を、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖ投与の２日前および投与の１日後に注射して、枯渇を維持した。ＮＫ細胞は、毒性を誘導し、この毒性は、ＣＤ２５／ＩＬ２Ｒａへの結合が低減されたＩＬ－２バリアントで処置されたマウスにおいて体重減少として現れた。
図７は、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗マウスＣＤ８抗体の結合の決定を示す。新鮮な脾細胞を、示されている抗体とともに２時間、４℃でインキュベートした。次いで、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に対する抗体および抗ｈＦｃで染色した。抗ｈＦｃを使用して、ｈＦｃを含有するＣＤ８－ＩＬ２融合体の結合を測定した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。抗ｈＦｃでの染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、結合を示すために使用されている。ｘｍＣＤ８ａｂ２（公開されているクローンＹＴＳ１５６．７．７）は、ｘｍＣＤ８ａｂ１（公開されているクローン２．４３）より高い親和性を有した。ｘＣＤ８ａｂ２．１は、ｘＣＤ８ａｂ２内に２つの変異を誘導することにより生成された、ｘＣＤ８ａｂ２のより親和性の低いバリアントである。
図８は、抗マウスＣＤ８抗体についてのＭＨＣ遮断ステータスを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウス由来の脾細胞から精製し、２４時間、ＥＬ－４－ＯＶＡ発現系統（Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ、ＣＲＬ－２１１３；ＡＴＣＣ）とともに、各々１００，０００細胞で共培養した。細胞を、ＣＤ２５およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節について、細胞表面染色およびフローサイトメトリーにより分析した。ｘＣＤ８ａｂ１とｘＣＤ８ａｂ２との両方が、ＣＤ２５を発現する細胞の％により測定されるようにＴ細胞活性化を遮断した。ｘＣＤ８ａｂ２は、ＣＤ８に対するそのより高い結合親和性と相関して、より強力にＴ細胞の活性化を遮断した。
図９は、ＣＤ８抗体に融合されたヒトＩＬ－２変異タンパク質による、ＩＬ－２Ｒを発現する他の免疫細胞よりも選択的な、ＣＤ８ Ｔ細胞の標的化を示す。ＩＬ－２変異タンパク質を、フォーマットＢで、以前に公開された抗マウスＣＤ８抗体であるｘｍＣＤ８ａｂ１（２．４３クローン）に融合した（左側に略図で示されている）。マウス脾細胞におけるＳＴＡＴ５活性化を、フローサイトメトリーにより測定した。ＣＤ８抗体に融合されたＩＬ－２変異タンパク質バリアントは、ＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋（上方右側）として特定されるＮＫ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞（下方左側）およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞（下方右側）などの、ＩＬ－２Ｒを発現する他の免疫細胞よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞（上方左側のグラフ）を選択的に標的とした。
図１０は、Ｂ１６冷たい腫瘍モデル（cold tumor model）における抗ＰＤ１との組合せでのＴＡｇ－ＩＬ－２ｖの単一用量に対するＣＤ８－ＩＬ－２の単一用量の有効性を示す。Ｃ５７ＢＬ６マウスの後肢の後部上方に培養Ｂ１６．Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－６４７５）の５×１０５個の細胞（１００μＬ）を皮下移植した。腫瘍体積が、移植後おおよそ８日目に６０～１２０ｍｍ３に達するまで、腫瘍体積を測定した（ＴＶ＝幅×幅×長さ×０．５）。各マウスを秤量し、示されている化合物（マウス１０匹／群）：ＰＢＳ（上方左側）、１ｍｇ／ｋｇでｘｍＣＤ８ａｂ１－ＩＬ２ｍ１０（上方中央）、１ｍｇ／ｋｇでｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ１０（上方右側）、５ｍｇ／ｋｇでｘＰＤ１（下方左側）、１ｍｇ／ｋｇでＴＡｇ－ＩＬ－２ｖ（下方中央）、または３ｍｇ／ｋｇでＴＡｇ－ＩＬ－２ｖ（下方右側）を首筋の下に皮下投与した。腫瘍体積および体重を、研究の終了（初回投与の３０～４０日後）まで、または最大腫瘍体積（２０００ｍｍ３）に達するまで、３～４日ごとに測定した。腫瘍の完全退縮（ＣＲ）および投与後１４日目までの＜１００ｍｍ３により定義される腫瘍の部分退縮またはより遅い成長（ＰＲ）が、当てはまる場合には示されている。ＰＢＳおよびｘＰＤ１群のマウスを除くすべてのマウスに、抗ＰＤ１を併用投与した。ｘｍＣＤ８－ＩＬ２ｍ１０は、Ｂ１６冷たい腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ１との組合せでのＴＡｇ－ＩＬ－２ｖよりも良好な性能を示した。
図１１Ａおよび１１Ｂは、単一用量ＣＤ８－ＩＬ－２で処置したＢ１６腫瘍を有するマウスの血液中および腫瘍内へのＣＤ８ Ｔ細胞蓄積の誘導を示す。Ｂ６マウスにＢ１６腫瘍細胞を注射し、腫瘍を２００～２５０ｍｍ３に成長させた後、１ｍｇ／ｋｇで示されているＩＬ－２融合体を５ｍｇ／ｋｇのｘＰＤ１と一緒にマウスに投与した。腫瘍および血液から細胞を採取し、フローサイトメトリーによりプロファイリングして、示されているように、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）を検出した。図１１Ａは、血液中の免疫細胞計数値を示し、図１１Ｂは、腫瘍中の免疫細胞計数値を示す。ｘＨＡ－ＩＬ－２ｖよりもｘｍＣＤ８－ＩＬ２ｍ１０でのほうが、より多くのＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍内で観察された。
図１２Ａ～１２Ｃは、ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＣＤ８－ＩＬ－２の単一用量およびＴＡｇ－ＩＬ－２ｖの単一用量の性能を示す。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの後肢の後部上方に培養ＣＴ２６．ｗｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２６３８）の２×１０５個の細胞（１００μＬ）を皮下移植した。腫瘍体積が、移植後おおよそ８日目に６０～１２０ｍｍ３に達するまで、腫瘍体積を測定した（ＴＶ＝幅×幅×長さ×０．５）。次いで、各マウスを秤量し、示されている化合物：ＰＢＳ（図１２Ａ）、２ｍｇ／ｋｇでＴＡｇ－ＩＬ－２ｖ（図１２Ｂ）、または０．３ｍｇ／ｋｇでｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４（図１２Ｃ）を、皮下投与した（１群当りマウス９匹）。腫瘍体積および体重を、研究の終了（初回投与の３０日後）まで、または最大腫瘍体積（２０００ｍｍ３）に達するまで、３～４日ごとに測定した。当てはまる場合には、腫瘍の完全退縮（ＣＲ）が示されている。ｘｍＣＤ８－ＩＬ２ｍ４は、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてＴＡｇ－ＩＬ－２ｖよりも良好な性能を示した。
図１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの融合体の効力に対するＣＤ８抗体親和性の影響を示す。フォーマットＣでの、ｘｍＣＤ８ａｂ２またはそのより親和性のより低いバリアントｘｍＣＤ８ａｂ２．１に融合されたＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｍ４で、細胞を処置した。ＣＤ８＋Ｔ細胞（左側）およびＮＫ細胞（右側）におけるＳＴＡＴ５活性化を、フローサイトメトリーにより測定した。ｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４は、ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ－２ｍ４と比較して、ＮＫ細胞よりもＣＤ８ Ｔ細胞に対するより低い効力およびより低い選択性を有した。
図１４は、ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４およびｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの拡大増殖を示す。ナイーブＢ６マウスを、１ｍｇ／ｋｇで示されている化合物で処置し、投与後５日目に採血した。細胞を系統マーカーで染色して、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を同定し、フローサイトメトリーによりプロファイリングした。ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４とｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４との両方が、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８ Ｔ細胞を拡大増殖した。両方の融合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８ Ｔ細胞のＮＫ細胞よりも高度な拡大増殖を誘導した。
図１５Ａおよび１５Ｂは、高親和性ＣＤ８抗体に融合された、ＩＬ－２Ｒαへの結合を有さないおよび１つの追加の変異を有する、ｘｍＣＤ８－ＩＬ－２変異タンパク質についての、ＳＴＡＴ５アッセイでの特徴付けを示す。示されているタンパク質とインキュベートされ、次いで、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ）についておよび細胞内ホスホ－ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）について染色された、Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。データは、示されている細胞サブセットにおけるＳＴＡＴ５についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１５Ａは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化を示し、その一方で図１５Ｂは、ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化（ＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋として定義される）を示す。ある特定のＩＬ－２変異は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する、ＣＤ８を発現しない他のＩＬ２Ｒβ／γ発現細胞よりも高度な効力を維持しつつ、抗ＣＤ８抗体に融合されたＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ２Ｒβ／γ発現細胞への結合を低下させた。
図１６Ａおよび１６Ｂは、低親和性ＣＤ８抗体バリアントに融合された、ＩＬ－２Ｒαへの結合を有さないおよび１つの追加の変異を有する、ｘｍＣＤ８－ＩＬ－２変異タンパク質の、ＳＴＡＴ５アッセイでの特徴付けを示す。示されているタンパク質とインキュベートされ、次いで、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ）についておよび細胞内ＳＴＡＴ５について染色された、Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。データは、示されている細胞サブセットにおけるＳＴＡＴ５についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図１６Ａは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化を示し、その一方で図１６Ｂは、ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化を示す。ある特定のＩＬ－２変異は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する、ＣＤ８を発現しない他のＩＬ２Ｒβ／γ発現細胞よりも高度な効力を維持しつつ、低親和性抗ＣＤ８抗体に融合されたＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ２Ｒβ／γ発現細胞への結合を低下させた。
図１７Ａおよび１７Ｂは、高親和性ＣＤ８抗体に融合された、ＩＬ－２Ｒαへの結合を有さないおよび１つの追加の変異を有する、ｘｍＣＤ８－ＩＬ－２変異タンパク質についての、細胞増殖マーカー（Ｋｉ６７）の発現を検出するアッセイでの特徴付けを示す。示されているタンパク質とインキュベートされ、次いで、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ）についてならびに増殖の細胞内マーカー、Ｋｉ６７、ＩＬ２Ｒβ／γおよびＳＴＡＴ５からの下流シグナル伝達事象について染色された、Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞。データは、増殖マーカーＫｉ６７について陽性の示されている細胞サブセット中の細胞の％を示す。図１７Ａは、Ｋｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示し、その一方で図１７Ｂは、Ｋｉ６７陽性ＮＫ細胞のパーセントを示す。
図１８Ａおよび１８Ｂは、低親和性ＣＤ８抗体に融合された、ＩＬ－２Ｒαへの結合を有さないおよび１つの追加の変異を有する、ｘｍＣＤ８－ＩＬ－２変異タンパク質についての、Ｋｉ６７アッセイでの特徴付けを示す。示されているタンパク質とインキュベートされ、次いで、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ）についておよびＫｉ６７について染色された、Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞。データは、増殖マーカーＫｉ６７について陽性の示されている細胞サブセット中の細胞の％を示す。図１８Ａは、Ｋｉ６７陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示し、その一方で図１８Ｂは、Ｋｉ６７陽性ＮＫ細胞のパーセントを示す。
図１９は、代表的な分子についてのＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する効力ならびにＮＫ細胞より高いＣＤ８ Ｔ細胞に対するそれらの選択性について概要を描示する。各々の分子についてのＣＤ８およびＮＫ細胞活性化が、同じグラフに示されている。ＣＤ８細胞対ＮＫ細胞の効力の差が両方向矢印で示されている。グラフは、ＮＫ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対する様々な選択性を有する、生成されたＣＤ８－ＩＬ２融合体について特徴付けデータの概要を示す。ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４（上部左側）およびｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４．２（上部右側）は、最も高い選択性（＞１０００倍）を有し、これにｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４（約５０～１００倍、下部左側）が続き、ｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４．１（約１０倍；下部右側）が最も低い選択性を有した。
図２０は、最も高い有効性を有するＣＤ８－ＩＬ－２融合体の特性を描示する。ＮＫ細胞よりもＣＤ８ Ｔ細胞に対する様々な程度の選択性を有する４つの代表的なＣＤ８－ＩＬ２融合体（示されている通り）を、Ｂ１６腫瘍モデルにおいて試験した。全マウスのうちの完全退縮（ＣＲ）を有したマウスの数が、各パネルに示されている。すべてのマウスに、１ｍｇ／ｋｇの示した融合体を５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１と一緒に投与した。１ｍｇ／ｋｇを上回る投与は、ＮＫ細胞上のＩＬ－２ＲβγへのＩＬ－２変異タンパク質の結合に起因して、ＮＫ細胞活性化を誘導し得、それによって、体重減少および毒性が誘導される。ＣＤ８－ＩＬ－２は、より低い用量でＴＡｇ－ＩＬ－２ｖよりも良好な性能を示した。ＣＤ８ Ｔ細胞に対して最も低い選択性を有するＣＤ８－ＩＬ２融合体は、マウス１０匹のうちの１匹しか完全腫瘍退縮を示さない、図１０でＴＡｇ－ＩＬ－２ｖについて観察されたものに迫る、最も小さい有効性をＢ１６モデルにおいて有した。最も高い有効性、治療指数、および＞４０％無腫瘍マウスには、＞１０倍の選択性が必要であった。
図２１は、ＣＤ８－ＩＬ－２での処置による、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および全ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の拡大増殖を示す。Ｂ６マウスにＢ１６腫瘍細胞を注射し、腫瘍を２００～２５０ｍｍ３に成長させた後、１ｍｇ／ｋｇで示されているＩＬ－２融合体を５ｍｇ／ｋｇのｘＰＤ１と一緒にマウスに投与した。腫瘍を投与後５日目に除去し、単一細胞に消化し、フローサイトメトリーによりプロファイリングしてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）を検出した。細胞をまた、製造業者のプロトコールに従ってｐ１５Ｅテトラマー（ＴＢ－Ｍ５０７－２、ＭＢＬ）で染色して、ｐ１５Ｅ腫瘍抗原を認識するＴ細胞を検出した。データは、各腫瘍から単離された１０６細胞当りの細胞計数値として表されている。ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４．２とｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４との両方が、全腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の約１５倍の拡大増殖、およびｐ１５Ｅ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞において５～１７倍の拡大増殖を誘導した。
図２２は、二価低親和性ＣＤ８抗体ＩＬ－２融合体および一価高親和性ＣＤ８抗体ＩＬ－２融合体の効力を示す。Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞を、示されているタンパク質とともに３０分間、ＲＰＭＩ培地中でインキュベートし、その後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ）についておよび細胞内ホスホ－ＳＴＡＴ５について染色した。二価低親和性融合体は、ｐＳＴＡＴ５について陽性の細胞のパーセンテージにより測定して、高親和性一価融合体のものと同様の効力を有した。高親和性ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体（フォーマットＣでの）に、または二価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体（フォーマットＡでの）に融合されたＩＬ－２ｍ４．２融合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して同様の効力を有し、一価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ－２ｍ４（フォーマットＣ）融合体よりもはるか大きい効力を有した。
図２３は、Ｂ１６腫瘍モデルにおける二価Ｃ末端フォーマット（フォーマットＡ）融合体の効力を示す。マウスに、対照としてのＰＢＳを投与したか、または１ｍｇ／ｋｇの示されている融合体を５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１と一緒に投与した（１群当りマウス９匹）。二価Ｃ末端フォーマット（フォーマットＡ）も非常に効果的であった。フォーマットＣでの高親和性ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合されたＩＬ－２ｍ４．２融合体（図２０）またはフォーマットＡでの二価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体に融合されたＩＬ－２ｍ４．２融合体（図２３）は、同様のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有した。
図２４は、ＣＤ８抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞活性化の遮断を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウス由来の脾細胞から精製し、２４時間、ＥＬ－４－ＯＶＡ系統（ＡＴＣＣ）とともに、各々１００，０００細胞で共培養した。細胞を、ＣＤ２５およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節について、細胞表面染色およびフローサイトメトリーにより分析した。ある特定のＣＤ８抗体は、ＣＤ８ Ｔ細胞活性化を遮断しなかった。ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体（配列番号１６の配列を含むＶＨドメインと、配列番号１７の配列を含むＶＬドメインとを含む）は、濃度２００ｎＭであってもＣＤ８ Ｔ細胞活性化を遮断しなかった。ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体は、二価フォーマットのものであった。
図２５は、示されている通りのｘｍＣＤ８ａｂ２およびｘｍＣＤ８ａｂ３融合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力の比較を示す。Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞を、示されているタンパク質とともに３０分間、ＲＰＭＩ培地中でインキュベートし、その後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂ）についておよび細胞内ｐＳＴＡＴ５について染色した。ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４．２とｘｍＣＤ８ａｂ３－ＩＬ２ｍ４．２との両方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ８＋Ｔ細胞に対して同様の活性とＴＡｇ－ＩＬ－２ｖよりも大きい効力を示した。
図２６Ａおよび２６Ｂは、Ｂ１６腫瘍モデルにおけるＩＬ－２変異タンパク質に融合されたＭＨＣ非遮断抗ＣＤ８抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を示す。マウスに、ＰＢＳまたは０．３ｍｇ／ｋｇ（図２６Ａ）もしくは１ｍｇ／ｋｇ（図２６Ｂ）の示されている融合体を５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１と一緒に投与した。フォーマットＣでのＭＨＣ非遮断ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体に融合されたＩＬ－２ｍ４．２融合体（図２６Ｂ）は、フォーマットＣでのＭＨＣ遮断ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合されたＩＬ－２ｍ４．２融合体（図２６Ａ）よりもはるかに効果的であった。
図２７は、ＰＤ１－Ｔ細胞よりもＰＤ１＋Ｔ細胞を優先的に標的とする、ＩＬ－２変異タンパク質の融合体を示す。サイズ３００～６００ｍｍ３のＢ１６腫瘍をマウスから除去し、単一細胞に消化した。ＣＤ４５＋細胞を精製し（ＭｉｌｔｅｎｙｉのＬＳカラム、製造業者のプロトコールに従って）、示されている融合タンパク質で３０分間、刺激した。細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂおよびＰＤ１）について、および細胞内ホスホ－ＳＴＡＴ５について、染色した。ＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ２ｍ１０と抗ＰＤ１抗体の融合体は、ＰＤ１－Ｔ細胞よりもＰＤ１＋Ｔ細胞を優先的に標的としたが、ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＰＤ１＋Ｔｒｅｇ細胞との両方を標的とした。
定義
「免疫細胞」は、本明細書で使用される場合、宿主の免疫系にとって異質とみなされる生物または他の実体に対して反応する、免疫系の細胞である。それらは、外来病原体、生物および疾患から宿主を保護する。免疫細胞は、白血球とも呼ばれ、病原体と闘うための生得免疫応答と適応免疫応答の両方に関与する。生得免疫応答は、病原体への曝露時にさらなる抗原刺激または学習過程なしに直ちに起こる。適応免疫応答は、最初の抗原刺激を必要とし、その後、記憶形成を行ない、その結果として、同じ病原体とのその後の遭遇中の応答性の強化をもたらす。生得免疫細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞、生得リンパ系細胞（ＩＬＣ）、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など、好中球、巨核球、好酸球および好塩基球を含むが、これらに限定されない。適応免疫細胞は、ＢおよびＴリンパ球／細胞を含む。Ｔ細胞サブセットは、アルファベータＣＤ４＋Ｔ（ナイーブＣＤ４＋、メモリーＣＤ４＋、エフェクターメモリーＣＤ４＋、エフェクターＣＤ４＋、調節性ＣＤ４＋）、およびアルファベータＣＤ８＋Ｔ（ナイーブＣＤ８＋、メモリーＣＤ８＋、エフェクターメモリーＣＤ８＋、エフェクターＣＤ８＋）を含むが、これらに限定されない。Ｂ細胞サブセットは、ナイーブＢ、メモリーＢ、および形質細胞を含むが、これらに限定されない。ＮＫ ＴおよびＴガンマデルタ（Ｔγδ）細胞は、生得リンパ球と適応リンパ球の両方の特性を示す。
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、健康および疾患の際の免疫応答の編成に重要な役割を果たす免疫細胞である。特有の機能および特性を有する２つの主要なＴ細胞サブセットが存在する：ＣＤ８抗原を発現するＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、グランザイムおよびパーフォリンなどの細胞傷害性タンパク質を使用して標的細胞を溶解することができる細胞傷害性またはキラーＴ細胞であり、ＣＤ４抗原を発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージなどの機能を含む、多くの他の免疫細胞型の機能を調節することができるヘルパーＴ細胞である。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫応答を抑制することができる調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ならびにサイトカインなどの免疫調節性タンパク質を分泌することにより異なるタイプの免疫応答を調節するヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）、ヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）およびヘルパーＴ細胞１７（Ｔｈ１７）などの、いくつかのサブセットにさらに細分される。Ｔ細胞は、特有の抗原特異的モチーフに結合するアルファベータＴ細胞受容体によってそれらの標的を認識し、この認識機序は、一般に、それらの細胞傷害機能およびサイトカイン分泌機能を誘発するために必要とされる。「生得リンパ球」は、細胞傷害活性またはＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７サイトカインの分泌などの、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の特性も示し得る。これらの生得リンパ球サブセットの一部は、ＮＫ細胞ならびにＩＬＣ１、ＩＬＣ２およびＩＬＣ３細胞；および生得様Ｔ細胞、例えばＴγδ細胞；およびＮＫ Ｔ細胞を含む。典型的に、これらの細胞は、免疫調節性サイトカインなどの、感染または傷害組織からの炎症刺激に迅速に応答することができるが、アルファベータＴ細胞とは異なり、それらは、抗原特異的パターンを認識する必要なく応答することができる。
「サイトカイン」は、始原／初代細胞と標的／エフェクター細胞との間のクロストークを媒介する免疫調節性ポリペプチドの一形態である。サイトカインは、可溶性形態としてまたは細胞表面と会合して標的免疫細胞上の「サイトカイン受容体」に結合してシグナル伝達を活性化するように機能することができる。「サイトカイン受容体」は、本明細書で使用される場合、細胞の細胞外表面のサイトカインへの結合時に細胞内シグナル伝達を活性化する、細胞表面のポリペプチドである。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子を含むが、これらに限定されない。サイトカインは、免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞および間質細胞をはじめとする広範な細胞により産生される。所与のサイトカインが１つより多くの細胞型により産生されることもある。サイトカインは、多面的である；受容体が複数の免疫細胞サブセット上に発現されるため、１つのサイトカインが複数の細胞内のシグナル伝達経路を活性化することができる。しかし、細胞型に依存して、サイトカインのシグナル伝達事象は、異なる下流細胞事象、例えば、活性化、増殖、生存、アポトーシス、他の免疫調節性タンパク質のエフェクター機能および分泌をもたらすことができる。
「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸を指す。
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、単量体（アミノ酸）がペプチド結合（アミド結合としても公知）により互いに直鎖状に連結されている、分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２アミノ酸またはそれより多いアミノ酸の任意の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２アミノ酸もしくはそれより多いアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはいずれかと同義的に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、天然生物源に由来し得るか、または組換え技術により産生され得る、ポリペプチドの産物を指すように意図されているが、必ずしも指定核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成による様式を含む任意の様式で生成され得る。ポリペプチドは、規定の三次元構造を通常は有し得るが、必ずしもそのような構造を有する必要はない。本開示のポリペプチドは、アミノ酸約３個もしくはそれを超える、５個もしくはそれを超える、１０個もしくはそれを超える、２０個もしくはそれを超える、２５個もしくはそれを超える、５０個もしくはそれを超える、７５個もしくはそれを超える、１００個もしくはそれを超える、２００個もしくはそれを超える、５００個もしくはそれを超える、１，０００個もしくはそれを超える、または２，０００個もしくはそれを超えるサイズのものであり得る。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、フォールディングされていると言及され、規定の三次元構造を有さず、むしろ多数の異なるコンフォメーションをとるポリペプチドは、フォールディングされていないと言及される。ポリペプチドは、二量体、三量体およびより高級のオリゴマーなどの、すなわち、１つより多くのポリペプチド分子からなる、多量体をさらに形成することもある。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であることもあり、または同一でないこともある。それ故、そのような多量体の対応するより高次の構造は、ホモもしくはヘテロ二量体、ホモもしくはヘテロ三量体などと呼ばれる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、改変ポリペプチド／タンパク質も指し、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含むがこれらに限定されない、発現後の改変が、影響を受ける。
「残基」とは、本明細書で使用される場合、タンパク質内の位置およびその関連アミノ酸の正体を意味する。例えば、Ｌｅｕ ２３４（Ｌｅｕ２３４またはＬ２３４とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１内の２３４位の残基である。
「野生型」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見られるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を本明細書では意味する。野生型タンパク質は、意図的に改変されていない、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
「置換」または「変異」は、ポリペプチドの野生型配列内に天然に存在するアミノ酸が、前記ポリペプチド内の同じ位置に天然に存在しない別のアミノ酸に置換される、ポリペプチド骨格に対する変化を指す。好ましくは、変異（単数または複数）は、ポリペプチドのその受容体に対する親和性を改変することによって、ポリペプチドが野生型同族ポリペプチドの親和性および活性とは異なる親和性および活性になるようにポリペプチドの活性を変更するために、導入される。変異は、ポリペプチドの生物物理学的特性を向上させることもできる。アミノ酸変異は、当技術分野において周知の遺伝学的または化学的方法を使用して生じさせることができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成およびこれらに類するものを含み得る。遺伝子操作以外の方法によりアミノ酸の側鎖基を変更する方法、例えば、化学的改変も、有用であり得ると考えられる。
「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、任意の天然ヒトＩＬ－２を指す。「ＩＬ－２」は、プロセシングされていないＩＬ－２はもちろん、細胞内でのプロセシングの結果として生じるＩＬ－２の一形態である「成熟ＩＬ－２」も包含する。「成熟ＩＬ－２」の配列は、図１Ａに描示されている。プロセシングされていないヒトＩＬ－２の１つの例示的形態は、成熟ＩＬ－２に結合された追加のＮ末端アミノ酸シグナルペプチドから構成される。「ＩＬ－２」は、ＩＬ－２の天然に存在するバリアント、例えば、対立遺伝子またはスプライスバリアント（単数または複数）を含むが、これらに限定されない。例示的なヒトＩＬ－２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６０５６８（ＩＬ２＿ＨＵＭＡＮ）のもとに記載されている。
「親和性」または「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原との）間の１：１相互作用を反映する、固有結合親和性を指す。親和性は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）との比である解離定数（ＫＤ）によって、一般に表すことができる。したがって、同等の親和性は、速度定数の比が同じままであるならば、異なる速度定数を含み得る。親和性は、当技術分野において公知の一般的な方法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）法（例えば、Ｏｃｔｅｔ）および他の旧来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）によって、測定することができる。
「結合」または「特異的結合」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたは抗原結合分子がそのポリペプチドまたは標的抗原の受容体とそれぞれ選択的に相互作用する能力を指し、この特異的相互作用は、標的化されていないまたは望ましくないもしくは非特異的相互作用と区別され得る。特異的結合の例としては、ＩＬ－２サイトカインのその特異的受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγ）への結合、および抗原結合分子の特異的抗原（例えば、ＣＤ８またはＰＤ－１）への結合が挙げられるが、これらに限定されない。
「変異体ＩＬ－２ポリペプチド」は、その受容体への親和性が低減したＩＬ－２ポリペプチドを指し、そのような親和性の減少は、変異体の生物活性の低減をもたらすことになる。親和性の低減およびそれによる活性の低減を、少数のアミノ酸変異または置換を導入することにより、達成することができる。変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβγへの親和性低減などの、所望の特性を有する最終構築物を生成するために、ペプチド骨格への他の改変を有することもあり、そのような改変としては、ポリペプチドのアミノ酸欠失、並べ替え、環化、ジスルフィド結合または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくは炭水化物変更）、ポリペプチドに対する化学的もしくは酵素的改変（例えば、ポリペプチド骨格へのＰＥＧの結合）、ペプチドタグもしくは標識の付加、またはタンパク質もしくはタンパク質ドメインへの融合を含むが、これらに限定されない。所望の活性としては、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して生物物理学的特性の向上も挙げることができる。複数の改変を組み合わせて、親和性の低減、または生物物理学的特性の向上などの、所望の活性改変を達成してもよい。非限定的な例として、コンセンサスＮ連結型グリコシル化のためのアミノ酸配列をポリペプチドに組み込んでグリコシル化を可能にすることができる。別の非限定的な例は、リシンをポリペプチド上に組み込んでＰＥＧ化を可能にすることができることである。好ましくは、変異（単数または複数）が、ポリペプチドに、その活性を改変するために導入される。
「標的化部分」および「抗原結合分子」は、本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。標的化部分または抗原結合分子は、タンパク質、炭水化物、脂質または他の化合物であり得る。標的化部分または抗原結合分子は、抗体、抗体断片（Chames et al, 2009；Chan & Carter, 2010；Leavy, 2010；Holliger & Hudson, 2005）、足場抗原結合タンパク質（Gebauer and Skerra, 2009；Stumpp et al, 2008）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（Tramontano et al, 1994）、重鎖抗体の可変ドメイン（ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ＶＨＨ）、新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）（Blake et al, 2006）、コラーゲン結合ドメイン（Knight et al, 2000）、レクチン結合タンパク質（テトラネクチン）、コラーゲン結合タンパク質、アドネクチン／フィブロネクチン（Lipovsek, 2011）、血清トランスフェリン（トランスボディ（ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｙ））、エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ））（Nygren et al, 2008）、Ａドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）（ＷＯ２０１００６６７４０）、アビマー／マキシボディ、設計されたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎ）（Stumpp et al, 2008）、アンチカリン（Skerra et al, 2008）、ヒトガンマクリスタリンまたはユビキチン（アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）分子）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）（Kolmar et al, 2008）、半減期を延長するための融合を伴うまたは伴わない直鎖状または拘束ペプチド、例えば、（Ｆｃ融合体－ペプチボディ（Ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ））（Rentero Rebollo & Heinis, 2013；ＥＰ１１４４４５４Ｂ２；Shimamoto et al, 2012；ＵＳ７２０５２７５Ｂ２）、拘束二環式ペプチド（ＵＳ２０１８／０２００３７８Ａ１）、アプタマー、操作されたＣＨ２ドメイン（ナノボディ；Dimitrov, 2009）および操作されたＣＨ３ドメイン「Ｆｃａｂ」ドメイン（Wozniak-Knopp et al, 2010）を含むが、これらに限定されない。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、同義的に使用され、本明細書では最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、そのような抗体構造には、モノクローナル抗体（例えば、完全長または無傷モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片および単一ドメイン抗体（本明細書でより詳細に説明される通りの）が、これらが所望の抗原結合活性を示す限り含まれるが、これらに限定されない。
抗体（免疫グロブリン）は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するタンパク質を指す。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ＩｇＧクラスの天然免疫グロブリンは、ジスルフィド結合されている２本の軽鎖と２本の重鎖から構成されている、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知であり、例えば、Abbas et al., 2000, Cellular and Mol、およびKindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)に、一般に記載されている。抗体（免疫グロブリン）は、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラス：α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）があり、これらの一部は、サブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの一方に割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結されている、２つのＦａｂ分子およびＦｃドメインから本質的になる。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、本明細書で使用される場合、定常領域の少なくとも一部分を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を指す。この用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ２およびＣＨ３）、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびに必要に応じて、これらのドメインのＮ末端側の可撓性ヒンジのすべてまたは一部分とを指すことができる。ＩｇＡおよびＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２およびＩｇＧ ＣＨ３ドメインを、一部の場合にはヒンジを含めて、含む。本明細書中で別段の定めがない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ番号付けシステムによるものである。「ヒンジ」領域は、通常は、約２１６位のアミノ酸残基から約２３０位のアミノ酸残基に及ぶ。ヒンジ領域は、本明細書では、天然ヒンジドメインであることもあり、またはバリアントヒンジドメインであることもある。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常は、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、本明細書では、天然配列ＣＨ２ドメインであることもあり、またはバリアントＣＨ２ドメインであることもある。「ＣＨ３ドメイン」は、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基までの、Ｆｃ領域内のＣＨ２ドメインのＣ末端側の残基のストレッチを含む。ＣＨ３領域は、本明細書では、天然配列ＣＨ３ドメインであることもあり、またはバリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖内に「突出部」（「ノブ」）が導入されており、その他方の鎖に対応する「空洞」（「ホール」）が導入されている、ＣＨ３ドメイン；本明細書に参照により明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照されたい）であることもある。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義は、両方のアミノ酸２３１～４４７（ＣＨ２－ＣＨ３）もしくは２１６～４４７（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、またはこれらの断片を含む。この文脈での「Ｆｃ断片」は、Ｎ末端およびＣ末端のどちらかまたは両方からのより少数のアミノ酸を含有することがあるが、一般にサイズに基づく、標準的な方法（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して検出され得るように、別のＦｃドメインまたはＦｃ断片と二量体を形成する能力をなお保持する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインは、本開示において特に有用なものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４からのＦｃドメインであり得る。
「バリアントＦｃドメイン」または「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」は、親Ｆｃドメインと比較してアミノ酸改変（例えば、置換、付加および欠失）を有する。この用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子バリアントも含む。一般に、バリアントＦｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインに対して（下記で論じられる同一性アルゴリズムを使用して、当技術分野において公知であるようなＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用する一実施形態を用いて、デフォルトパラメーターを使用して）少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの同一性を有する。あるいは、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変を有し得る。例えば、生物学的機能を大幅に失うことなく、１個または複数のアミノ酸を免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。加えて、本明細書中で論じられるように、本明細書でのバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの、本明細書に記載の公知の技法を使用して測定されるように、別のＦｃドメインと二量体を形成する能力をなお保持する。
「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃガンマＲ」とは、本明細書で使用される場合、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によりコードされる、タンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトの場合、このファミリーは、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含む、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１およびＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含む、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含む、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（全体が参照により組み込まれる、Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）；および任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプを含むが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれらに限定されない、任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプを含むが、これらに限定されない。
「エフェクター機能」とは、本明細書で使用される場合、抗体アイソタイプによって変わり得る、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用の結果として生じる、生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、およびＢ細胞活性化を含むが、これらに限定されない。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合している抗体を認識し、その後、その標的細胞の溶解を引き起こす、細胞により媒介される反応を指す。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関しており、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、ＡＤＣＣ活性の増大につながる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているものなどの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行なうことができる。「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシスとは、本明細書で使用される場合、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合している抗体を認識し、その後、その標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす、細胞により媒介される反応を意味する。
「Ｆｃヌル」および「Ｆｃヌルバリアント」は、同義的に使用され、本明細書では、エフェクター機能の低減または消失を有する改変Ｆｃを記述するために使用される。そのようなＦｃヌルまたはＦｃヌルバリアントは、ＦｃγＲおよび／または補体受容体へと低減または消失されている。好ましくは、そのようなＦｃヌルまたはＦｃヌルバリアントは、エフェクター機能の消失を有する。この改変のための例示的な方法は、化学的変更、アミノ酸残基置換、挿入および欠失を含むが、これらに限定されない。結果として生じるバリアントのエフェクター機能を低減させるために１つまたは複数の改変が、位置：ｉ）ＩｇＧ１：Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｓ２３９ Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｎ２９７、Ｌ３２８、Ｐ３３１、Ｋ３２２、Ａ３２７およびＰ３２９、ｉｉ）ＩｇＧ２：Ｖ２３４、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｈ２６８、Ｎ２９７、Ｖ３０９、Ａ３３０、Ａ３３１、Ｋ３２２、ならびにｉｉｉ）ＩｇＧ４：Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５およびＥ３１８に導入された、Ｆｃ分子上の例示的なアミノ酸位置（ＥＵ番号付けスキームに基づく番号付け）。エフェクター機能の低下を有する例示的なＦｃ分子としては、以下の置換のうちの１つまたは複数を有するものが挙げられる：ｉ）ＩｇＧ１：Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｑ、Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７欠失；ｉｉ）ＩｇＧ２：Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ、およびＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ；ｉｉｉ）ＩｇＧ４：Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｄ２６５ＡおよびＬ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｅ３１８Ａ。
「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域に特異的に結合することができる決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）であり、通常は、特異的構造特性はもちろん、特異的電荷特性も有する。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有することもある。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、抗原結合ペプチドにより有効に遮断されているアミノ酸残基（言い換えると、アミノ酸残基は、抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）とを含み得る。エピトープは、コンフォメーションエピトープまたは直鎖状エピトープのどちらかであり得る。エピトープは、典型的には、少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８個～１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体の、別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を明らかにする、単純なイムノアッセイ、例えば「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」、で検証することができる。
「リンカー」は、本明細書で使用される場合、２本のポリペプチド鎖を接続する分子を指す。リンカーは、ポリペプチドリンカーであることもあり、または合成の化学的リンカーであることもある（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996において開示されているものを参照されたい）。ポリペプチドリンカーの長さおよび配列は、特に限定されず、当業者により目的に従って選択され得る。ポリペプチドリンカーは、１個または複数のアミノ酸を含む。好ましくは、ポリペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さを有する、好ましくは、５～１００、さらに好ましくは１０～５０アミノ酸の長さを有する、ペプチドである。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは、Ｇ、Ｓ、ＧＳ、ＳＧ、ＳＧＧ、ＧＧＳおよびＧＳＧ（Ｇ＝グリシンおよびＳ＝セリン）である。別の実施形態では、前記ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｘＧｎ（配列番号５）または（ＧＧＧＧＳ）ｘＧｎ（配列番号６）または（ＧＧＧＧＧＳ）ｘＧｎ（配列番号７）（ｘ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２、およびｎ＝０、１、２または３）である。好ましくは、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｘＧｎ（ｘ＝２、３または４、およびｎ＝０）（配列番号８）であり、より好ましくは、前記リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｘＧｎ（ｘ＝３、およびｎ＝０）（配列番号９）である。合成の化学的リンカーは、ペプチドを架橋するために日常的に使用される架橋剤、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、スベリン酸ビス（スクシンイミジル）（ＢＳ３）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（コハク酸スクシンイミジル）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）（スルホ－ＥＧＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ－ＤＳＴ）、ビス［２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、およびビス［２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ－ＢＳＯＣＯＥＳ）を含む。
用語「ポリヌクレオチド」は、本開示のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合を含むこともあり、または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるものなどの、アミド結合）を含むこともある。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。一部の態様では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（特に、発現ベクター）が、提供される。一態様では、本開示のポリペプチドを作製するための方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養するステップ、およびポリペプチドを宿主細胞から回収するステップを含む方法が提供される。「組換え（の）」は、外来性宿主細胞において組換え核酸技法を使用して生成されるタンパク質を意味する。宿主細胞において発現された、組換えにより産生されたタンパク質は、本開示では単離されたと考えられ、任意の好適な技法によって分離された、分画された、または部分的にもしくは実質的に精製された天然または組換えタンパク質も、単離されたと考えられる。
「単離された」は、本明細書で開示される様々なポリペプチドを記述するために使用される場合、そのポリペプチドが発現された細胞または細胞培養物から同定および分離および／または回収された、ポリペプチドを意味する。典型的に、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップにより精製されることになる。精製レベルの要求はなく、「精製」または「精製された」は、出発材料と比較して、組成物中の夾雑物の濃度に対する標的タンパク質濃度の上昇を指す。「単離されたタンパク質」は、本明細書で使用される場合、異なる結合特異性を有する他のタンパク質が実質的にない標的タンパク質を指す。
用語「がん」は、身体の他の部分に浸潤または拡散する可能性がある制御されないかつ異常な細胞成長を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理的状態を指す。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより詳細な例としては、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん（bronchioloalviolar cell lung cancer）、扁平上皮がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、頭頸部がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚および眼内黒色腫、甲状腺がん、子宮がん、消化管がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮内膜癌、子宮がん、卵管癌、頸部癌、膣癌、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、膀胱がん、肝臓がん、ヘパトーマ、肝細胞がん、子宮頸がん、唾液腺癌、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、脊髄軸腫瘍（spinal axis tumor）、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞種、神経鞘腫（schwanoma）、上衣腫（ependymona）、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫が、上記のがんのいずれかの難治性バージョン、または上記のがんのうちの１つもしくは複数の組合せを含めて、挙げられるが、これらに限定されない。
変異体ＩＬ－２ポリペプチド
本開示は、とりわけ、ＩＬ－２Ｒα（例えば、配列番号２のまたは図１Ｂに示されているようなアミノ酸配列を含む）に対して５０％未満の結合親和性を示す、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドはまた、ＩＬ－２Ｒβ（例えば、配列番号３のまたは図１Ｃに示されているようなアミノ酸配列を含む）に対して５０％未満の結合親和性を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、配列番号１のまたは図１Ａに示されているようなアミノ酸配列を含む）と比較して、ＩＬ－２Ｒαに対して５０％未満の結合親和性、およびＩＬ－２Ｒβ（例えば、配列番号３のまたは図１Ｃに示されているようなアミノ酸配列を含む）に対して５０％未満の結合親和性を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、配列番号１のまたは図１Ａに示されているようなアミノ酸配列を含む）と比較して、ＩＬ－２Ｒαに対して５０％未満の結合親和性、およびＩＬ－２Ｒγ（例えば、配列番号４のまたは図１Ｄに示されているようなアミノ酸配列を含む）に対して５０％未満の結合親和性を示す。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２Ｒαに対して５０％未満の結合親和性、ＩＬ－２Ｒβに対して５０％未満の結合親和性およびＩＬ－２Ｒγに対して５０％未満の結合親和性を示す。ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβに対する野生型および本開示の変異体ポリペプチドの結合親和性の差異は、例えば、当業者によく知られているタンパク質間相互作用の親和性を測定する標準的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで、測定することができる。ＩＬ－２Ｒγに対する野生型および本開示の変異体ポリペプチドの結合親和性の差異は、ＩＬ－２Ｒγに対する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの親和性が非常に低いので、ＳＰＲアッセイによって信頼性をもって測定することができない。その代わりに、ＩＬ－２Ｒγに対するそれらの低減した親和性を、ｐＳＴＡＴ５を測定し、ＩＬ－２Ｒγに対する親和性を低減させる置換があるまたはないＩＬ－２ポリペプチドのＩＬ－２Ｒ発現細胞に対する活性を比較する、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行なうことにより、推定することができる。
本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、図１Ａ（配列番号１）に描示されているようなアミノ酸配列を有する野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドに対する１つもしくは複数、２つもしくはそれより多くの、または３つもしくはそれより多くの、親和性を低減させるアミノ酸置換を有し、１つもしくは複数、２つもしくはそれより多くの、または３つもしくはそれより多くの置換残基は、次の群から選択される：Ｑ１１、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｑ２２、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９およびＳ１３０。野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドの配列内の可能なアミノ酸置換の位置は、例えば図２に描示されている。ＩＬ－２Ｒαに対する親和性の減少は、野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドの配列内の次の残基のうちの１つまたは複数を置換することにより達成することができる：Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９およびＬ７２。ＩＬ－２Ｒβに対する親和性の減少は、次の残基のうちの１つまたは複数を置換することにより達成することができる：Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１およびＩ９２。ＩＬ－２Ｒγに対する親和性の減少は、野生型成熟ＩＬ－２ポリペプチドの配列内の次の残基のうちの１つまたは複数を置換することにより達成することができる：Ｑ１１、Ｌ１８、Ｑ２２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９およびＳ１３０。
一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、例えば図１Ａ（配列番号１）に描示されているような野生型成熟ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＦ４２ＡまたはＦ４２Ｋアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、例えば図１Ａ（配列番号１）に描示されているような野生型成熟ＩＬ－２アミノ酸配列に対する、Ｆ４２ＡまたはＦ４２Ｋアミノ酸置換およびＲ３８Ａ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｅ６２Ｑ、Ｅ６８Ａ、Ｅ６８Ｑ、Ｅ６８ＫまたはＥ６８Ｒアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、例えば図１Ａ（配列番号１）に描示されているような野生型成熟ＩＬ－２アミノ酸配列に対する、Ｆ４２Ａ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ｑ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ｋ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ｒ；またはＲ３８ＡおよびＦ４２Ｋアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８ＥおよびＦ４２Ａアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８ＤおよびＦ４２Ａアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＦ４２ＡおよびＥ６２Ｑアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８ＡおよびＦ４２Ｋアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８ＤおよびＦ４２Ａアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８ＡおよびＦ４２Ｋアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＦ４２ＡおよびＥ６２Ｑアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＨ１６Ｅ、Ｈ１６Ｄ、Ｄ２０Ｎ、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｒ、Ｍ２３Ｋ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｖ、Ｄ８４Ｈ、Ｄ８４Ｙ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｋ、Ｓ８７Ｋ、Ｓ８７Ａ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９１Ｔ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９２Ａ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ａ、Ｅ９５Ｒ、Ｔ１２３Ａ、Ｔ１２３Ｅ、Ｔ１２３Ｋ、Ｔ１２３Ｑ、Ｑ１２６Ａ、Ｑ１２６Ｓ、Ｑ１２６Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ１２７Ｅ、Ｓ１２７ＫまたはＳ１２７Ｑアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、図１Ａに描示されている野生型成熟ＩＬ－２アミノ酸配列に対してＦ４２Ａ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ｑ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ｋ；Ｆ４２ＡおよびＥ６８Ｒ；またはＲ３８ＡおよびＦ４２Ｋアミノ酸置換、ならびに図１Ａ（配列番号１）に描示されている野生型成熟ＩＬ－２アミノ酸配列に対してＨ１６Ｅ、Ｈ１６Ｄ、Ｄ２０Ｎ、Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｒ、Ｍ２３Ｋ、Ｄ８４Ｌ、Ｄ８４Ｎ、Ｄ８４Ｖ、Ｄ８４Ｈ、Ｄ８４Ｙ、Ｄ８４Ｒ、Ｄ８４Ｋ、Ｓ８７Ｋ、Ｓ８７Ａ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９１Ｔ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９２Ａ、Ｅ９５Ｓ、Ｅ９５Ａ、Ｅ９５Ｒ、Ｔ１２３Ａ、Ｔ１２３Ｅ、Ｔ１２３Ｋ、Ｔ１２３Ｑ、Ｑ１２６Ａ、Ｑ１２６Ｓ、Ｑ１２６Ｔ、Ｑ１２６Ｅ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ１２７Ｅ、Ｓ１２７ＫまたはＳ１２７Ｑアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＨ１６Ｅアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＨ１６Ｄアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対するＲ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬ




ＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴ




ＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＥＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＤＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＡＭＬＴＫＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７９）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＱＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＳＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８２）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＡＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＥＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭ




ＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＨＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＤＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＥＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＡＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＳＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号８８）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、生物物理学的特性の向上などの追加の利点を提供する、変異および欠失を含むがこれらに限定されない他の改変も含有する。生物物理学的特性の向上は、熱安定性、凝集特性、酸可逆性、粘度、および哺乳動物または細菌または酵母細胞における産生の向上を含むが、これらに限定されない。例えば、残基Ｃ１２５を、中性アミノ酸、例えば、セリン、アラニン、トレオニンまたはバリンで置き換えることができ、Ｎ末端Ａ１残基を欠失させることができる可能性があり、これらの両方が、米国特許第４，５１８，５８４号に記載されている。変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、米国特許第５，２０６，３４４号に記載されているような、残基Ｍ１０４の変異、例えば、Ｍ１０４Ａを含むこともある。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む。他の実施形態では、１つ、２つまたは３つのＮ末端残基が欠失されている。
融合タンパク質
本開示は、本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、次の抗原：ＣＤ８α、ＣＤ８βおよびＰＤ１のうちの１つに結合する抗原結合分子とを含む融合タンパク質であって、融合体の抗原結合分子に対する抗原を発現する免疫細胞を、前記抗原を発現しない免疫細胞よりも優先的に活性化する、融合タンパク質を提供する。
抗原発現細胞に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む標的化されたＩＬ－２融合タンパク質の優先的活性は、ＩＬ－２ＲβγまたはＩＬ－２Ｒαβγも発現する抗原発現および抗原非発現細胞を含むアッセイで実証される。１つのそのようなアッセイは、ＩＬ－２ポリペプチドへの曝露時のヒト末梢血および／または腫瘍浸潤免疫細胞などのヒト免疫細胞における増殖マーカーＫｉ－６７のＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）リン酸化および／または発現を測定する、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイである。アッセイの一形式では、標的化されたＩＬ－２融合タンパク質の活性は、抗原発現細胞に対する選択性を実証するために、抗原発現細胞および抗原非発現細胞に対して測定される。アッセイの別の形式では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む標的化されたＩＬ－２融合タンパク質の抗原発現細胞に対する活性は、抗原結合分子に融合されたときの変異体ＩＬ－２ポリペプチドのシグナル伝達におけるレスキューの大きさを実証するために、同じ変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む標的化されていないＩＬ－２融合タンパク質、および抗原発現細胞上のいずれの抗原も認識しない対照抗体の活性と比較される。
一部の実施形態では、ＣＤ８α抗原結合分子を含有する本開示の融合タンパク質は、ＣＤ８α＋ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、ＣＤ８α－ＩＬ－２Ｒβ＋細胞の少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍活性化する。一部の実施形態では、前記融合タンパク質は、ＣＤ８α＋ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、前記ＩＬ－２変異体ポリペプチドと前記細胞上に発現されるいずれの抗原にも結合しない対照抗体とを含む融合分子と比較して、５０倍、１００倍または２００倍を超えて活性化する。ＩＬ－２融合タンパク質による前記細胞活性化は、前記ＩＬ－２融合タンパク質での処置後に前記細胞におけるｐＳＴＡＴ５または細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することにより決定される。
一部の実施形態では、ＣＤ８β抗原結合分子を含有する本開示の融合タンパク質は、ＣＤ８β＋ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、ＣＤ８β－ＩＬ－２Ｒβ＋細胞の少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍活性化する。一部の実施形態では、前記融合タンパク質は、ＣＤ８β＋ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、前記ＩＬ－２変異体ポリペプチドと前記細胞上に発現されるいずれの抗原にも結合しない対照抗体とを含む融合分子と比較して、５０倍、１００倍または２００倍を超えて活性化する。ＩＬ－２融合タンパク質による前記細胞活性化は、前記ＩＬ－２融合タンパク質での処置後に前記細胞におけるｐＳＴＡＴ５または細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することにより決定される。
一部の実施形態では、ＰＤ１抗原結合分子を含有する本開示の融合タンパク質は、ＰＤ１＋ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、ＰＤ１－ＩＬ－２Ｒβ＋細胞の少なくとも１０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍活性化する。一部の実施形態では、前記融合タンパク質は、ＰＤ１＋ＩＬ－２Ｒβ＋細胞を、前記ＩＬ－２変異体ポリペプチドと前記細胞上に発現されるいずれの抗原にも結合しない対照抗体とを含む融合タンパク質と比較して、５０倍、１００倍または２００倍を超えて活性化する。ＩＬ－２融合タンパク質による前記細胞活性化は、前記ＩＬ－２融合タンパク質での処置後に前記細胞におけるｐＳＴＡＴ５または細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を測定することにより決定される。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、次のうちの１つまたは複数を提示する：ヒトＣＤ８と結合し、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない；およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、例えばＮＫ細胞の活性化と比較して、少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍または１０００倍大きい効力で活性化する。一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断するかどうかを、例えば、抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質の存在または非存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞の（例えば、抗原刺激による）活性化ステータスをアッセイすることにより、アッセイすることができる。例示的なアッセイおよび条件については、例えば、実施例３を参照されたい。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の活性化を、例えば、増殖（例えば、Ｋｉ６７）、ＩＬ－２Ｒβ／γ下流シグナル伝達、および／またはＳＴＡＴ５下流シグナル伝達の１つまたは複数のマーカー（例えば、１つまたは複数のマーカーを発現する処置された細胞の比率）をアッセイすることにより、測定することができる。例示的なアッセイおよび条件については、例えば、実施例５を参照されたい。
これらの知見の拡張により、本開示の融合タンパク質は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドの配列に少数の変異を導入すること以外の方法によりＩＬ２Ｒαに対する結合親和性の低減が果たされたＩＬ－２Ｒαβγに結合するポリペプチドを含有することができる。したがって、本発明の融合タンパク質は、Lopes et al, J Immunother Cancer. 2020; 8(1): e000673に記載されているようなＩＬ－２Ｒαに融合されたＩＬ－２ポリペプチド；またはＩＬ－２Ｒβγに結合するがＩＬ－２Ｒαに結合しないようにコンピュータによって設計された合成ポリペプチド模倣物、例えば、Silva et al, Nature. 2019 Jan;565(7738):186-191に記載されているもの；またはＩＬ－２Ｒβγのアゴニストである抗原結合ドメインポリペプチドを使用することによるものを含むことができる。そのようなポリペプチドをＣＤ８抗体に融合して、融合体を構築することができ、その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するそれらの融合体の選択的効力は、ＮＫ細胞と比較して１０倍またはそれより大きくなる。
融合タンパク質フォーマット
前記融合タンパク質は、図４に描示されているような異なるフォーマットを有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、図４Ａに描示されているような２つの部分を含む：ｉ）第１の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＶＨは、可変重鎖であり、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬ（ここで、ＶＬは、可変軽鎖であり、ＣＬは、定常軽鎖である）と、変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；第１の部分と第２の部分との両方が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、図４Ｂに描示されているような２つの部分を含む：ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、図４Ｃに描示されているような２つの部分を含む：ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端が、ＦｃドメインのＮ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する。
一部の実施形態では、融合タンパク質の前記第１および第２のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、ＥＵ番号付けに従って、次のＦｃ変異を含有する：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＫ３２２Ａ。一部の実施形態では、融合タンパク質の前記第１および第２のＦｃドメインは、エフェクター機能を低下させるために、ＥＵ番号付けに従って、次のＦｃ変異を含有する：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＫ３２２Ａ。一部の実施形態では、融合タンパク質の前記第１および第２のＦｃドメインは、ヘテロ二量体の形成を促進するために、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｗ（ノブ）ならびにＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（ホール）を含有する。
一部の実施形態では、本明細書で開示される組換え二重特異性抗体および／または融合タンパク質は、ごく大まかに、２つのカテゴリー、すなわち、ｉ）可変領域のみの組合せの結果として得られるフォーマット、およびｉｉ）可変領域とＦｃドメインを併せ持つフォーマットに分類され得る。第１のカテゴリーの代表は、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｂ）、ＤＡＲＴ、短鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、Ｆａｂ－Ｆｃ、タンデムＦａｂ、二重可変領域ＦａｂおよびタンデムｄＡｂ／ＶＨＨである。２つの可変領域は、共有結合によって一緒に連結されていることもあるか、または非共有結合性相互作用によって一緒に連結されていることもある。
一部の実施形態では、二重特異性抗体／融合タンパク質は、各対が明確に異なる結合特異性を有する２対の重鎖と軽鎖の組合せを含有する天然免疫グロブリン構造で生成される。ＩｇＧ内の２本の重鎖のホモ二量体化は、ＣＨ３相互作用により媒介される。ヘテロ二量体の形成を促進するために、遺伝子改変が２つのそれぞれのＣＨ３領域に導入される。そこでのヘテロ二量体化変異は、多くの場合、立体反発、電荷誘導相互作用、または鎖間ジスルフィド結合形成を伴う。ヘテロ二量体化を促進するための例示的なＦｃ改変としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：
一部の実施形態では、二重特異性抗体を、半抗体からの産生後組み立てにより生成することができ、それによって重鎖と軽鎖の誤対合の問題が解決される。これらの抗体は、多くの場合、半抗体のヘテロ二量体化に有利に働く改変を含有する。例示的な系としては、表Ａに収載されている、ノブ－イントゥ－ホール、ＩｇＧ１（ＥＥＥ－ＲＲＲ）、ＩｇＧ２（ＥＥＥ－ＲＲＲＲ）（Strop et al. J Mol Biol (2012)）およびＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆ４０５Ｌ－Ｋ４０９Ｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような場合、半抗体は、別々の細胞系で個々に産生され、精製される。次いで、精製抗体を軽度の還元に付して半抗体を得、次いで、これらの半抗体を二重特異性抗体に組み立てた。次いで、従来の精製方法を使用して混合物からヘテロ二量体二重特異性抗体を精製した。
一部の実施形態では、鎖の選択的対合に頼らない二重特異性抗体生成を用いる戦略も用いることができる。これらの戦略は、典型的には、ヘテロ二量体がホモ二量体とは明確に異なる生化学的または生物物理学的特性を有することになるように、抗体に対して遺伝子改変を導入することを含み、したがって、組み立てまたは発現後のヘテロ二量体をホモ二量体から選択的に精製することができる。一例は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン内にＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを導入して、プロテインＡ樹脂へのＦｃの結合を消失させ、次いで、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆバリアントと野生型Ｆｃを共発現させることである。２コピーのＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含有する、得られたホモ二量体抗体は、プロテインＡカラムに結合することができず、その一方で、１コピーのＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ変異を含むヘテロ二量体抗体は、ホモ二量体野生型抗体からの強い相互作用と比較して、プロテインＡに対する親和性の低下を有することになる（Tustian et al Mabs 2016）。他の例は、カッパ／ラムダ抗体（Fischer et al., Nature Communication 2015）、およびそれぞれの鎖への異なる電荷（Ｅ３５７Ｑ、Ｓ２６７ＫまたはＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）の導入（ＵＳ２０１８／０１４２０４０Ａ１；Strop et al. J Mol Biol (2012)）を含む。
一部の実施形態では、追加の結合部位を免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のどちらかに融合することによって、二重特異性抗体を生成することができる。追加の結合部位の例としては、可変領域、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨおよびペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ヘテロ二量体変異および／またはＦｃガンマ受容体結合を改変するための変異は、Ｆｃ安定性の低減をもたらした。したがって、追加の変異をＦｃ領域に加えてその安定性を増大させた。例えば、１つまたは複数のジスルフィド結合対、例えば、Ａ２８７ＣとＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９ＣとＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２ＣとＶ３０２Ｃ、およびＶ３２３ＣとＩ３３２Ｃとが、Ｆｃ領域に導入される。別の例は、ヒンジジスルフィドを安定させるための、ＩｇＧ４に基づく二重特異性抗体へのＳ２２８Ｐの導入である。追加の例としては、Ｆｃ安定性および凝集耐性を増強するためのＫ３３８Ｉ、Ａ３３９ＫおよびＫ３４０Ｓ変異の導入（Gao et al, 2019 Mol Pharm. 2019;16:3647）が挙げられる。
抗原結合分子
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＣＤ８に結合し、融合タンパク質のＣＤ８への結合は、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない。一部の実施形態では、本開示の抗原結合分子は、ＣＤ８α上のエピトープに結合し、この抗原結合分子のＣＤ８αへの結合は、ＣＤ８ααまたはＣＤ８αβと標的細胞または抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を遮断しない。一部の実施形態では、本開示の抗原結合分子は、ＣＤ８β上のエピトープに結合し、この抗原結合分子のＣＤ８βへの結合は、ＣＤ８αβと標的細胞または抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を遮断しない。一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断するかどうかを、例えば、抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質の存在または非存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞の（例えば、抗原刺激による）活性化ステータスをアッセイすることにより、アッセイすることができる。例示的なアッセイおよび条件については、例えば、実施例３を参照されたい。
一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＴＫＧＬＥＷＶＡＹＩＮＴＧＧＧＴＴＹＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＡＫＳＴＬＹＬＱＭＤＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＴＴＡＩＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ（配列番号１０）の配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＧＥＴＶＳＩＥＣＬＡＳＥＤＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＱＶＬＩＹＡＡＮＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＳＧＭＱＰＥＤＥＧＤＹＦＣＬＱＧＳＫＦＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１１）の配列を含むＶＬドメインとを含む。一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質は、ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＳＬＶＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＳＧＦＳＬＩＳＤＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＧＩＷＡＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＲＤＴＳＫＳＱＧＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＦＣＴＳＮＲＥＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１２）の配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＧＤＫＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＩＤＫＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＲＱＬＩＨＹＴＳＴＬＶＳＧＴＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＳＦＳＩＳＳＶＥＳＥＤＩＡＳＹＹＣＬＱＹＤＴＬＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１３）の配列を含むＶＬドメインとを含む。一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質は、ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＳＬＶＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＶＳＧＦＳＬＩＳＤＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＭＧＧＩＷＡＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＲＤＴＳＫＳＱＧＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＦＣＴＳＡＲＥＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１４）の配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＧＤＫＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＩＤＫＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＲＱＬＩＨＹＴＳＴＬＶＳＧＴＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＳＦＳＩＳＳＶＥＳＥＤＩＡＳＹＹＣＬＱＹＡＴＬＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１５）の配列を含むＶＬドメインとを含む。一部の実施形態では、本開示の抗ＣＤ８抗体または融合タンパク質は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＡＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＳＤＣＹＭＡＷＶＲＱＴＰＴＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＤＧＧＳＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＭＡＴＹＹＣＡＣＡＴＤＬＳＳＹＷＳＦＤＦＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１６）の配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＰＶＳＬＧＥＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＧＩＳＮＮＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＩＫＰＬＩＹＨＴＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＭＹＹＣＱＱＤＡＴＦＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１７）の配列を含むＶＬドメインとを含む。
一部の実施形態では、本開示の抗原結合分子は、ＰＤ１上のエピトープに結合し、この抗原結合分子のＰＤ１への結合は、ＰＤ１と標的細胞または他の免疫細胞上に発現されるＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断しない。そのような融合タンパク質は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびセミプリマブを含むがこれらに限定されない、抗ＰＤ１治療用抗体と組み合わせて、そのような融合タンパク質を治療薬として投与することができるので、特に有用である。
一部の実施形態では、本開示の抗原結合分子は、ＰＤ１上のエピトープに結合し、この抗原結合分子のＰＤ１への結合は、ＰＤ１と標的細胞または他の免疫細胞上のＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断する。そのような融合タンパク質は、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブを含むがこれらに限定されない、抗ＰＤＬ１治療用抗体と組み合わせて、そのような融合タンパク質を治療薬として投与することができるので、特に有用である。
本開示のある特定の態様は、がんまたは慢性感染症を処置する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、有効量の融合タンパク質または融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を患者に投与するステップを含む。一部の実施形態では、前記処置を必要とする患者は、がんと診断されている。
一部の実施形態では、融合タンパク質または組成物は、Ｔ細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、化学療法剤は、キナーゼ阻害剤、代謝拮抗薬、細胞毒素もしくは細胞増殖抑制剤、抗ホルモン剤、白金系化学療法剤、メチルトランスフェラーゼ阻害剤、抗体、または抗がんペプチドである。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＥＡＣＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、Ａ２ＡＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬＳ、アデノシン、ＴＧＦＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＩＤＯ、ＣＳＦ１Ｒ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＩＤＯ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＬＩＬＲＢ４、ＳＩＧＬＥＣ－１５、またはアルギナーゼを標的とし、ＰＤ－１の阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）、ＰＤ－Ｌ１の阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、またはＣＴＬＡ－４の阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）を含むが、これらに限定されない。Ｔ細胞療法の例としては、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞ベースの治療法、養子Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ベースのＴ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）ベースの治療法、自家Ｔ細胞療法、および同種異系Ｔ細胞療法が挙げられるが、これらに限定されない。例示的ながんワクチンとしては、樹状細胞ワクチン、１つまたは複数のがん抗原をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むワクチン、および１つまたは複数のがん抗原ペプチドを含むワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質と１つまたは複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の一部である。本明細書に記載の医薬組成物および製剤を、所望の純度を有する活性成分（例えば、融合タンパク質）と、１つまたは複数の必要に応じた薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）とを混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存薬；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリンなど；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、凍結乾燥される。
列挙された実施形態
以下の列挙された実施形態は、本発明の一部の態様の代表である。
１．２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＶＨは、可変重鎖であり、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬ（ここで、ＶＬは、可変軽鎖であり、ＣＬは、定常軽鎖である）と、変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
第１の部分と第２の部分の両方が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する融合タンパク質。
２．２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、前記ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する
融合タンパク質。
３．２つの部分を含む融合タンパク質であって、
ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体（ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端が、ＦｃドメインのＮ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、ヒトＣＤ８βおよびヒトＰＤ１から選択される１つの抗原上のエピトープに結合する
融合タンパク質。
４．前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、図１Ａに描示されているアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｂに描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減、および図１Ａに描示されているアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｃに描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、実施形態１～３のいずれか１つの融合タンパク質。
５．前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、図１Ａに描示されているアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、図１Ｄに描示されているアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減をさらに示す、実施形態４の融合タンパク質。
６．前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、図２に描示されているような、かつＱ１１、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９、Ｓ１３０の群から選択される、野生型ＩＬ－２アミノ酸配列に対する２つまたはそれより多くのアミノ酸置換を有する、実施形態４または５の融合タンパク質。
７．前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、野生型ＩＬ－２と比較してその生物物理学的特性を向上させるためのアミノ酸変異Ｃ１２５Ａをさらに含む、実施形態６の融合タンパク質。
８．前記第１および第２のＦｃドメインが、エフェクター機能を低下させるために、ＥＵ番号付けに従って、次のＦｃ変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＫ３２２Ａを含有する、実施形態６または７の融合タンパク質。
９．前記第１および第２のＦｃドメインが、ヘテロ二量体の形成を促進するために、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｗ（ノブ）ならびにＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（ホール）を含有する、実施形態６または７の融合タンパク質。
１０．実施形態１～９のいずれか１つの変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
１１．実施形態１０のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
１２．実施形態１０のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
１３．実施形態１～９のいずれか１つによる融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
１４．医薬としての使用のための実施形態１～９のいずれか１つの融合タンパク質。
１５．がんまたは慢性感染症を処置する方法であって、実施形態１～９および１３のいずれかによる組成物を患者に投与するステップを含む方法。
１６．がんを処置する方法であって、実施形態１～９および１３のいずれかによる組成物を、Ｔ細胞療法またはがんワクチンと組み合わせて患者に投与するステップを含む方法。
（実施例１）
組換えＤＮＡ技法
組換えＤＮＡ操作を伴う技法は、以前に、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載された。すべての試薬は、製造業者の指示に従って使用した。ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングにより決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用してＰＣＲにより生成したか、または合成オリゴヌクレオチドからＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）、ＡＴＵＭ（Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）、もしくはＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で合成されたものであった。設計した制限エンドヌクレアーゼ切断部位と隣接している遺伝子セグメントを消化し、その後、それらのそれぞれの発現ベクターにクローニングした。ＤＮＡを形質転換された細菌から精製し、濃度をＵＶ可視分光法により決定した。ＤＮＡシークエンシングを使用して、サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を確認した。
抗体遺伝子の単離
ＣＤ８またはＰＤ１抗原に結合する抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ系またはｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のどちらかを使用して生成した。ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ法のために、非免疫ヒト抗体ファージライブラリーを、５～６ラウンド、パニングして、標的抗原に対する抗体を単離した。パニング後、ＥＬＩＳＡで標的抗原への、非特異的抗原より特異的な結合を示した個々のファージクローンを同定した。その後、特異的バインダーの重鎖および軽鎖ＶドメインのＤＮＡ断片をクローニングし、シークエンシングした。その一方で、組換え形態の抗原でのマウスおよびラマの免疫化から抗体も生成した。マウス免疫化からは、ハイブリドーマ法を使用して抗体を単離した。手短に述べると、免疫化後、脾臓および／またはリンパ節からのＢ細胞を骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマ細胞を生成した。次いで、ハイブリドーマクローンを、ＥＬＩＳＡを使用して個々にスクリーニングして、抗原に特異的な抗体を発現するクローンを同定した。最後に、抗体の重鎖および軽鎖ＶドメインのＤＮＡ断片を特異的ハイブリドーマからクローニングし、その後、シークエンシングした。ラマ免疫化については、抗体遺伝子を末梢Ｂ細胞からクローニングし、ファージミドベクターにライゲーションしてファージディスプレイ抗体ライブラリーを生成した。次いで、ファージライブラリーを目的の抗原に対してパニングすることによって抗体を単離した。パニング後、標的抗原への非特異的抗原より特異的な結合を示した個々のファージクローンを、ＥＬＩＳＡを使用して同定した。その後、特異的バインダーの重鎖および軽鎖ＶドメインのＤＮＡ断片をクローニングし、シークエンシングした。次いで、非ヒト（マウスおよびラマ）由来の抗体をヒト化して、非ヒトフレームワークおよび相補性決定領域変異を除去した。
融合構築物のクローニング
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Lefranc et al. IMGT（登録商標）, the international ImMunoGeneTics information system（登録商標） 25 years on. Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43からのＩＭＧＴ（登録商標）（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））で得られる。重鎖および軽鎖Ｖドメインの増幅ＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１含有哺乳動物発現ベクターにインフレームで挿入した。構築物のＩＬ－２部分を、ＩｇＧ重鎖のＣ末端とＩＬ－２のＮ末端との間に、（Ｇ４Ｓ）３ １５－ｍｅｒリンカーを使用して重鎖とインフレームでクローニングした。ＩＬ－２部分を融合した後、ＩｇＧ重鎖のＣ末端リシン残基を除去した。単一ＩＬ－２遺伝子が完全ＩｇＧに融合された構築物を生成するには、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインにおけるノブ－イントゥ－ホール改変により促進されるヘテロ二量体化のために２つの重鎖プラスミドを構築してトランスフェクトする必要があった。ＩＬ－２部分に接続された「ホール」重鎖は、ＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を保有した一方で、融合されていない「ノブ」重鎖は、ＣＨ３ドメインにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を保有した（ＥＵ番号付け）。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を消失させ、ＦｃＲ共活性化を防止するために、ＩｇＧ重鎖の各々のＣＨ２ドメインに次の変異を導入した：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＥＵ番号付け）。抗体－ＩＬ－２融合構築物の発現をＣＭＶプロモーターにより駆動し、コード配列の下流に位置する合成ポリＡシグナル配列により転写を終結させた。
ＩＬ－２ポリペプチドを有する融合タンパク質の調製
実施例で使用する場合のＩＬ－２ポリペプチドを有する融合タンパク質をコードする構築物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用する指数増殖しているＥｘｐｉ２９３細胞と哺乳動物発現ベクターの共トランスフェクションにより産生した。手短に述べると、ＩＬ－２融合構築物を、先ず、プロテインＡマトリックスを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。プロテインＡカラムをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で平衡させ、洗浄した。融合構築物を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ３．６で溶出した。溶出画分をプールし、１０ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ６に透析した。ホモ二量体よりもヘテロ二量体を精製するためにイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ－Ｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してタンパク質をさらに精製した。タンパク質をロードした後、カラムを１０ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ６で洗浄する。次いで、タンパク質を１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６緩衝液中２５ｍＭから５００ｍＭまでの漸増勾配の塩化ナトリウムで溶出した。ヘテロ二量体に相当する主溶離液ピークを回収し、濃縮した。次いで、精製タンパク質をＰＢＳ中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により洗練した。
アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することにより、精製ＩＬ－２融合構築物のタンパク質濃度を決定した。融合構築物の純度、完全性および単量体状態を、還元剤（５ｍＭ １，４－ジチオトレイトール）の存在および非存在下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブルー（ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用した（４～２０％ Ｔｒｉｓ－グリシンゲルまたは３～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、イムノコンジュゲート試料の凝集物の含有量を分析した。
抗原発現血液免疫細胞の選択的活性化を測定するためのｐＳＴＡＴ５およびＫｉ－６７アッセイ
ＩＬ－２融合タンパク質の活性を、ＳＴＡＴ５のリン酸化を測定するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのアッセイで決定した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して健康なドナーの血液からＰＢＭＣを単離し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を製造業者の指示に従って使用して赤血球を溶解した。典型的には、ＰＢＭＣを無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁させ、９６ウェルＵ底プレートに分取した（ウェル当り５０μｌ）。ＩＬ－２融合タンパク質および対照タンパク質、例えば、組換えヒトＩＬ－２および対照（ＨＡに標的化される）融合タンパク質を希釈して所望の濃度にし、ウェルに添加した（２×刺激として５０μｌを添加した）。インキュベーションを典型的には３０分、３７℃で行ない、その後、１００μｌの予温しておいた４％ＰＦＡ（最終２％）を用いて１０分間、３７℃でそれを停止させた。次いで、細胞を次の表面マーカーに対する抗体で染色した：ＣＤ４５（クローンＨＩ３０）、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８α（ＳＫ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ＲＰＡ－Ｔ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＣＤ２５（Ｍ－Ａ２５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、４％ＰＦＡで１０分間、室温で固定した。固定後、予冷しておいたＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者のプロトコールに従って用いて、細胞を透過処理した。透過処理後、細胞を、細胞内マーカー（ｐＳＴＡＴ５［ｐＹ６９４］、クローン４７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、および／またはパーフォリン、クローンδＧ９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。データを、ｐＳＴＡＴ５陽性パーセントとして、一部の場合にはｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートして各構築物についてのＥＣ５０値を決定した。
増殖などの、ｐＳＴＡＴ５からさらに下流のＩＬ－２融合タンパク質により誘導される細胞の変化を測定するために、フローサイトメトリーアッセイを使用して、細胞内増殖マーカーＫｉ－６７の発現を検出した。手短に述べると、ＰＢＭＣを上記で説明したように単離し、ＩＬ－２融合タンパク質および対照の存在下、血清を補充したＲＰＭＩ１６４０（１０％ ＦＢＳ）中で４～６日間、または無血清ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）中でインキュベートした。Ｋｉ－６７（クローンＫｉ－６７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）についての染色は、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者のプロトコールに従って用いて行なった。データをＫｉ－６７陽性パーセントとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートして、可能な場合には各構築物についてのＥＣ５０値を決定した。
マウス免疫細胞の活性化を測定するためのｐＳＴＡＴ５およびＫｉ６７アッセイ
脾臓を７０ｍＭストレーナー上に配置し、プランジャーを使用してストレーナーを通してＰＢＳで細胞を洗浄することにより、Ｂ６マウスの脾臓から脾細胞を単離した。赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、細胞をＲＰＭＩ培地１ｍｌ当り２０×１０６個で再懸濁させた。細胞をＵ底プレートに１ウェル当り５０ｍｌで播種した。ＩＬ－２融合タンパク質および対照タンパク質を細胞に添加した（２×刺激として５０μｌ）。ＣＤ４９ｂ抗体（５ｍｌ、ＤＸ５クローン）を各ウェルに添加した後、３７℃で３０分間、細胞をインキュベートした。細胞を８％ＰＦＡ（最終４％）で固定した。細胞をＰＢＳ－２％ＦＢＳで２回洗浄し、７５ｍｌのＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ緩衝液に再懸濁させ、１時間、４℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳ－２％ＦＢＳで３回洗浄し、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３－６．７）、ＣＤ８ｂ（ＹＴＳ１５６．７．７）、ＣＤ２５（７Ｄ４）、およびｐＳＴＡＴ５（クローン４７）に対する抗体を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で染色した。試料を２回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。Ｋｉ６７アッセイのために、１×１０５個の脾細胞を、９６ウェルＵ底プレート内１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地に播種し、３７℃で５日間培養した後、Ｋｉ－６７について染色した。手短に述べると、ＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．４）、ＣＤ８（５３－６．７）、ＣＤ２５（ＰＣ６１）およびＮＫ１．１（ＰＫ１３６）に対する抗体で細胞の表面を染色し、次いで、固定し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者のプロトコールに従って使用して透過処理した。Ｋｉ６７抗体（クローン１６Ａ８）を４５分間、４℃で添加し、その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβについての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合親和性の決定
ヒトとカニクイザルＣＤ８α、ＣＤ８βおよびＰＤ１抗原に対する、ならびにヒトＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβに対するＩＬ－２融合タンパク質の動態速度定数（kinetic rate constant）（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（１０ｍＭホスフェート、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ７．４、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を使用して３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。手短に述べると、親和性を決定するために、ＩＬ－２融合タンパク質をそれらのＦｃを介してＣＭ４センサーチップ上に、共有結合で固定化された抗ヒトＦｃ捕捉抗体によって０．７５μｇ／ｍＬでおよび１０μＬ／分の流量で３０秒間、捕捉した。参照表面として役立つようにフローセル１上には抗体を捕捉しなかった。様々な濃度の抗原（１ｍＭから１．４ｎＭまで３倍希釈）またはＩＬ－２受容体（３ｍＭから１２ｎＭまで３倍希釈）を、捕捉されたＩＬ－２融合タンパク質上に被検物質として注入した。結合相を１２０秒間記録し、解離相を６００秒間記録した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、センサーグラムを二重参照し、物質移動モデルで１：１ラングミュアにグローバルフィッティングして会合速度（ｋｏｎ）、解離速度（ｋｏｆｆ）および平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を決定した。
代替の形式のアッセイでは、抗原を先ずチップ上に捕捉し、次いで、ＩＬ－２融合タンパク質を被検物質として注入した。この場合、社内で生成したまたは商業的に購入したヒスチジンタグ付きＩＬ－２受容体を泳動用緩衝液で０．１２５μｇ／ｍＬに希釈し、抗ＨＩＳ抗体とアミンカップリングしたＣＭ４センサーチップ上に１分間、１０μＬ／分で捕捉した。参照表面として役立つようにフローセル１上にはＩＬ－２受容体を捕捉しなかった。１０００ｎＭ～４．１ｎＭ（３倍希釈系列）のＩＬ－２融合タンパク質をフローセル１および２に２分間注入し、１分間、解離させた。分析サイクル間に１０ｍＭグリシン ｐＨ１．７の２回の３０秒注入によって表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、センサーグラムを二重参照し、１：１ラングミュアにグローバルフィッティングしてｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫＤを決定した。
（実施例２：脾臓細胞サブセットを活性化するＩＬ－２およびＩＬ－２バリアントの能力）
本実施例は、ＩＬ－２融合体化合物のマウスＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性化能およびマウスにおけるＮＫ媒介毒性の誘導能を試験するための実験を説明する。
ＩＬ－２およびＣＤ２５／ＩＬ２Ｒαへの結合が低減されたＩＬ－２バリアントの、脾臓細胞サブセットを活性化する能力を、ＳＴＡＴ５アッセイで試験した。ＩＬ－２と、対照抗体（ｘＨＡ）に融合した以前に公開されたＩＬ－２バリアント（ＩＬ－２ｖ）であるｘＨＡ－ＩＬ－２ｖとを使用して、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含有するマウス脾細胞を刺激した。異なる脾臓サブセットにおけるＳＴＡＴ５活性化を、実施例１に記載したようにフローサイトメトリーにより測定した。ＣＤ８ Ｔ細胞をＣＤ３＋ＣＤ４－ゲート／サブセットで同定し、Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋として同定し、ＮＫ細胞をＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋として同定した。
図５は、この実験の結果を示す。ＮＫ細胞は、ＩＬ－２刺激に対する感受性がＣＤ８＋Ｔ細胞の約１０倍であったが、Ｔｒｅｇ細胞が、最も感受性が高かった（図５の左側）。ＩＬ－２ｖの場合、ＣＤ２５へのその結合の低下に起因して、ＮＫ細胞は、ＩＬ－２ｖ刺激に対する感受性がＣＤ８ Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞との両方の約１０倍であった（図５の右側）。
ＮＫ細胞誘導毒性を試験するために、ＣＤ２５／ＩＬ２Ｒａへの結合が低減されたＩＬ－２バリアントで処置したマウスにおける体重減少を測定した。ＩＬ－２バリアントでの処置によるＮＫ細胞誘導毒性は、体重減少として現れ得る。この実験のために、８～１０週齢のＢ６マウスに、示した化合物の単一用量を皮下注射し、それらのマウスの体重を毎日記録した。ｘＨＡ－ＩＬ－２ｖは、２．５ｍｇ／ｋｇで抗ＰＤ１（ｘＰＤ１）と一緒に１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで投与したが、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖは、単独で５ｍｇ／ｋｇで投与した。ＮＫ細胞を２００ｍｇ／マウス ｉ．ｐ．で抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６クローン）で枯渇させた。枯渇用抗体を、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖ投与の２日前および投与の１日後に注射して、枯渇を維持した。
図６Ａおよび６Ｂは、これらの実験の結果を示す。ＩＬ－２バリアント（ＩＬ－２ｖ）を対照ｘＨＡ抗体に融合したもの（ｘＨＡ－ＩＬ－２ｖ）またはＦＡＰ抗体に融合したもの（ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖ）は、マウスにおける体重減少を誘導した（図６Ａ）。この体重減少は、ＮＫ細胞をＮＫ１．１抗体で枯渇させたマウスにおいて明らかなように、ＮＫ細胞により媒介された（図６Ｂ）。ＮＫ細胞により媒介されるこのような毒性は、ヒトではＩＬ－２ベースの治療薬の最大耐用量を制限し得る。マウスにおける対照抗体標的化ＩＬ２ｖまたは腫瘍抗原標的化ＩＬ２ｖについての最大耐用量は、５ｍｇ／ｋｇをはるかに下回っていた。
（実施例３：抗マウスＣＤ８抗体の特徴付け）
本実施例は、抗マウスＣＤ８抗体の特徴付けを記載する。
結果
抗マウスＣＤ８抗体の結合親和性をフローサイトメトリー分析によって決定した。新鮮な脾細胞を、ｘＣＤ８ａｂ１（クローン２．４３）、ｘＣＤ８ａｂ２（クローンＹＴＳ１５６．７．７）またはｘＣＤ８ａｂ２．１のいずれかとともに２時間、４℃でインキュベートした。ｘＣＤ８ａｂ１（クローン２．４３）およびｘＣＤ８ａｂ２（クローンＹＴＳ１５６．７．７）配列は、以前に公開されている。ｘＣＤ８ａｂ２．１クローンは、変異Ｎ９５Ａ（ＶＨ）およびＤ９２Ａ（ＶＫ）の導入によりｘＣＤ８ａｂ２から誘導した。抗マウスＣＤ８抗体とのインキュベーション後に、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に対する抗体および抗ｈＦｃ（ＨＰ６０１７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、これらのうちの最後の抗ｈＦｃは、ｈＦｃを含有するＣＤ８－ＩＬ２融合体の結合を測定するために使用した。染色された細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより分析し、抗ｈＦｃでの染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して結合を表示した。図７に示されているように、ｘＣＤ８ａｂ２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してｘＣＤ８ａｂ１より高い親和性を有した。ｘＣＤ８ａｂ２．１は、ｘＣＤ８ａｂ２に２つの変異（Ｎ９５Ａ（ＶＨ）およびＤ９２Ａ（ＶＫ））を導入することにより生成した、ｘＣＤ８ａｂ２のより親和性の低いバリアントである。
抗マウスＣＤ８抗体についてのＭＨＣ遮断ステータスも試験した。ある特定のＣＤ８抗体の結合は、Ｔ細胞上のＣＤ８分子と抗原提示細胞または腫瘍細胞上のＭＨＣ分子との相互作用に干渉することによって、Ｔ細胞活性化を阻害することができる。この実験のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ－Ｉトランスジェニックマウス由来の脾細胞から精製し、２４時間、ＥＬ－４－ＯＶＡがん系統（ＡＴＣＣ）とともに、各々１００，０００細胞で共培養した。細胞を、ＣＤ２５およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節について、細胞表面染色およびフローサイトメトリーにより分析した。図８に示されているように、ｘＣＤ８ａｂ１とｘＣＤ８ａｂ２との両方がＴ細胞活性化を遮断した。このことは、これらの抗体が、ＣＤ８とＭＨＣの相互作用に干渉し、その相互作用を遮断したことを示唆している。ｘＣＤ８ａｂ２は、ＣＤ８に対するそのより高い結合親和性と相関して、より強力にＴ細胞の活性化を遮断した。
（実施例４：抗ＣＤ８抗体に融合したＩＬ－２変異タンパク質の特徴付け）
本実施例は、ＣＤ８抗体に融合したＩＬ－２変異タンパク質の特徴付けを記載する。
方法
Ｂ１６マウス腫瘍モデル
８～１０週齢のＣ５７ＢＬ６雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を．動物飼養施設で飼育し、環境に順化させた。培養Ｂ１６．Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－６４７５）を採取し、移植のために無血清培地（１×ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ｄ６４２９）に５×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁させた。マウスを剪毛し、５×１０５個の細胞（１００μＬ）を後肢の後部上方に皮下移植した。移植後おおよそ８日目に６０～１２０ｍｍ３の腫瘍体積に達するまで腫瘍を測定した（ＴＶ＝幅×幅×長さ×０．５）。次いで、腫瘍体積によりマウスを群に無作為に割り当てた。各マウスを秤量し、首筋の下に皮下投与した。腫瘍体積および体重を、研究の終了（初回投与の３０～４０日後）まで、または最大腫瘍体積（２０００ｍｍ３）に達するまで、３～４日ごとに測定した。研究の終了時にＣＯ２と適切な二次安楽死薬によりマウスを安楽死させた。
ＣＴ２６マウス腫瘍モデル
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを剪毛し、培養ＣＴ２６ ｗｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２６３８）の２×１０５個の細胞（１００μＬ）を後肢の後部上方に皮下移植した。腫瘍体積が、移植後おおよそ８日目に６０～１２０ｍｍ３に達するまで、腫瘍体積を測定した（ＴＶ＝幅×幅×長さ×０．５）。次いで、各マウスを秤量し、示した化合物を皮下投与した（１群当りマウス９匹）。
Ｂ１６腫瘍を有するマウスの血液および腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞の分析
Ｂ６マウスにＢ１６腫瘍細胞を注射し、腫瘍を２００～２５０ｍｍ３に成長させた後、１ｍｇ／ｋｇで示したＩＬ－２融合体をマウスに投与した。腫瘍を投与後５日目に除去し、単一細胞に消化し、フローサイトメトリーによりプロファイリングしてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）を検出した。手短に述べると、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ Ｃチューブの中でＭｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－７３０）を製造業者のプロトコールに従って使用して、腫瘍を消化した。単離された細胞を計数し、１０×１０６個の細胞をＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５およびＣＤ４９ｂに対する抗体で染色した。血液もマウスから採取し（５０μｌ）、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、系統マーカーで染色してＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を同定した。細胞をフローサイトメーターで分析した。
結果
ＣＤ８抗体に融合したＩＬ－２変異タンパク質バリアントを、ＩＬ－２Ｒを発現する他の免疫細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的標的化について試験した。ＩＬ－２変異タンパク質を、フォーマットＢで、以前に公開された抗マウスＣＤ８抗体であるｘｍＣＤ８ａｂ１（２．４３クローン）に融合した。マウス脾細胞を、実施例１に記載したように、ＩＬ－２変異タンパク質融合体で処理してＳＴＡＴ５アッセイを行なった。表１および図９は、この実験の結果をまとめる。
フォーマットＢでのＣＤ８抗体に融合したＩＬ－２変異タンパク質は、ＮＫ細胞を含む、ＩＬ－２Ｒを発現する他の細胞より、ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に標的とした。ＴｒｅｇはＣＤ２５を発現するが他の細胞はしないので、Ｔｒｅｇに対する活性をＩＬ－２Ｒα／ＣＤ２５結合の代替物として使用した。他の配列もＣＤ８ Ｔ細胞をＮＫ細胞より優先的に標的としたが、より高度なＣＤ２５結合の結果としてＴｒｅｇに対する活性が増大した。このアッセイでのＩＬ－２の活性が＜０．００１ｎＭであったこと（図５のパネルＡ）から、表１に含めた配列のすべては、ＩＬ２Ｒα／ＣＤ２５への結合の少なくとも５０％低減を示した。さらに、Ｔｒｅｇに対して最低の活性を有したいくつかの配列（表１に示されているようなｍ３、ｍ４、ｍ５、ｍ１０）を同定した。
抗ＰＤ１との組合せでのＣＤ８－ＩＬ－２およびＴＡｇ－ＩＬ－２ｖの有効性を、Ｂ１６腫瘍モデルにおいて試験した。フォーマットＣでの、ｘｍＣＤ８ａｂ１（２．４３クローン）およびｘｍＣＤ８ａｂ２（ＹＴＳ１５６７．７）という２つの異なるＣＤ８抗体の一方に融合したＩＬ－２ｍ１０変異タンパク質を、Ｂ１６腫瘍を移植したマウスにおいて示した通りに投与した。図１０に示されているように、抗ＰＤ１抗体は、このモデルで中程度の効果しか示さず、腫瘍成長を遅延させたが完全奏効マウスも治癒したマウスもいなかった。ＣＤ８－ＩＬ２変異タンパク質は、抗ＰＤ１と併用投与した場合、単一用量レジメンでのＴＡｇ－ＩＬ－２ｖより多くの完全腫瘍退縮を誘導した。ＣＤ８ａｂ２融合体は、ＣＤ８ａｂ１融合体より多くの完全腫瘍退縮を誘導した。
ＣＤ８－ＩＬ－２融合体での処置による血液中および腫瘍内へのＣＤ８＋Ｔ細胞蓄積に対する効果を、Ｂ１６腫瘍モデルを使用して試験した。Ｂ１６腫瘍細胞を移植したマウスに、１ｍｇ／ｋｇでＩＬ－２融合体を、５ｍｇ／ｋｇのｘＰＤ１と一緒に投与した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを、腫瘍および血液試料の両方においてフローサイトメトリーにより測定した。図１１Ａおよび１１Ｂに示されているように、血液中（図１１Ａ）ではＣＤ８－ＩＬ２がＴＡｇ－ＩＬ－２ｖより多くのＣＤ８ Ｔ細胞拡大増殖を誘導した一方で、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖは、より多くのＮＫ細胞拡大増殖を誘導した。同様に、ＣＤ８－ＩＬ２を投与したマウスにおける腫瘍内（図１１Ｂ）ではＣＤ８＋Ｔ細胞の大幅な拡大増殖が観察された（約１７倍）一方で、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖの存在下では約３倍のＣＤ８＋Ｔ細胞拡大増殖しか観察されなかった。
ＣＤ８－ＩＬ－２およびＴＡｇ－ＩＬ－２ｖの性能を比較するために、ＣＴ２６腫瘍細胞を移植し、単独でのＣＤ８－ＩＬ－２または単独でのＴＡｇ－ＩＬ－２ｖのどちらかで処置したマウスにおいて、腫瘍退縮を評価した。図１２Ａ～１２Ｃに示されているように、フォーマットＣでのｘｍＣＤ８ａｂ２に融合したＩＬ－２ｍ４変異タンパク質は、両方の薬物を単剤で投与した場合ＣＴ２６結腸腫瘍モデルにおいて、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖよりも、多くの完全および部分腫瘍退縮を誘導した。
効力に対するＣＤ８抗体親和性の影響を、ＩＬ－２ｍ４との融合体について試験した。この実験のために、ＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｍ４をフォーマットＣでｘｍＣＤ８ａｂ２またはｘｍＣＤ８ａｂ２．１のどちらかに融合した。ｘｍＣＤ８ａｂ２．１は、ｘｍＣＤ８ａｂ２のより親和性の低いバージョンである。マウス脾細胞でのＳＴＡＴ５アッセイを、実施例１で説明したように行った。図１３に示されているように、ｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ－２ｍ４融合体は、ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ－２ｍ４と比較して、ＮＫ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に対する低い効力および低い選択性を有した。
ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４およびｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４を、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大増殖するそれらの能力についても試験した。１ｍｇ／ｋｇで示した化合物で処置したナイーブＢ６マウスから血液を採取した。ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルをフローサイトメトリーにより決定した。図１４に示されているように、両方の融合体は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８ Ｔ細胞の、ＮＫ細胞より高度な拡大増殖を誘導した。
（実施例５：ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγへ結合が減少した抗ＣＤ８：ＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質の特徴付け）
本実施例は、ＩＬ－２Ｒβ／γへの結合が減少したｘｍＣＤ８－ＩＬ－２変異タンパク質の特徴付けを記載する。
方法
ＳＴＡＴ５アッセイ
Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞を、示したタンパク質とともに、抗ＣＤ４９ｂ染色抗体と一緒にＲＰＭＩ培地中で３０分間、インキュベートし、その後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５）についておよび細胞内ＳＴＡＴ５について、実施例１におけるプロトコールに従って染色した。示した細胞サブセットにおけるＳＴＡＴ５についてのデータを平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表す。
Ｋｉ６７アッセイ
Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞を、示したタンパク質とともに５日間、完全ＲＰＭＩ培地中でインキュベートし、その後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＮＫ１．１）について、ならびに増殖の細胞内マーカー、Ｋｉ６７、ＩＬ－２Ｒβ／γおよびＳＴＡＴ５からの下流シグナル伝達事象について、実施例１におけるプロトコールに従って染色した。
結果
ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４の活性用量が、検出可能なＮＫ細胞拡大増殖を誘導したことを考慮すると、ＮＫ細胞を含む、ＩＬ２Ｒ＋細胞に対するその活性をさらに減少させるためにＩＬ２ｍ４に追加の変異を導入した。ＩＬ－２Ｒβ／γのＩＬ－２との相互作用表面における（ＩＬ－２Ｒｂｇへの結合を低減させると予測された）変異を選択した。ＩＬ－２Ｒへの結合を妨げる、選択した変異を有するＩＬ－２変異タンパク質を、フォーマットＣでｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合し、マウス脾細胞を用いてＳＴＡＴ５アッセイで試験した。表２ならびに図１５Ａおよび１５Ｂは、これらの実験の結果を示す。表２は、変異のリストを示す。
フォーマットＣでの、選択した変異を有するＩＬ－２変異タンパク質とｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体との間の融合体も作製し、マウス脾細胞を用いてＳＴＡＴ５アッセイで試験した。表３ならびに図１６Ａおよび１６Ｂは、この実験の結果を示す。
選択した変異を有するＩＬ－２変異タンパク質を、フォーマットＣでｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合し、マウス脾細胞を用いてＫｉ６７アッセイで試験した。Ｋｉ６７は、増殖の細胞内マーカーであり、ＩＬ－２Ｒβ／γおよびＳＴＡＴ５の下流シグナル伝達事象を表す。表４ならびに図１７Ａおよび１７Ｂは、これらの実験の結果をまとめる。フォーマットＢでのＴＡｇ－２ｖ融合体を参照として含めた。
下記の表に収載する選択した変異を有するＩＬ－２変異タンパク質を、フォーマットＣでｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体に融合し、マウス脾細胞を用いてＫｉ６７アッセイで試験した。表５ならびに図１８Ａおよび１８Ｂは、これらの実験の結果を示す。
代表的な分子についてのＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する効力を図１９にまとめる。生成したＣＤ８－ＩＬ２融合体には、ＮＫ細胞より高いＣＤ８ Ｔ細胞に対する様々な選択性があり、ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４およびｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４．２が最も高く（＞１０００倍）、これにｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４（約５０～１００倍）が続き、ｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４．２が最も低い（約１０倍）。ｍ４変異タンパク質融合体は、ＩＬ－２Ｒαへの低下した結合を有したが、ｍ４．１およびｍ４．２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγへの結合を低下させる追加の変異を含んでいた。
（実施例６：Ｂ１６腫瘍モデルにおける抗ＰＤ－１との組合せでのＣＤ８：ＩＬ２融合タンパク質の効果についての試験）
結果
ＮＫ細胞と比較して、ＣＤ８ Ｔ細胞に対する様々な程度の選択性を有する４つの代表的なＣＤ８－ＩＬ２融合体を、Ｂ１６腫瘍モデルにおいて実施例４に記載したように試験した。すべてのマウスに、１ｍｇ／ｋｇの示した融合体を５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１と一緒に投与した。図２０に示されているように、ＣＤ８－ＩＬ－２は、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖよりも良好な性能（図１０を参照されたい）をより低い用量で示した。ＣＤ８ Ｔ細胞に対して最も低い選択性を有するＣＤ８－ＩＬ２融合体は、Ｂ１６モデルにおいて、ＴＡｇ－ＩＬ－２ｖについて観察されたもの（図１０）に迫る、最も小さい有効性を有した。最も高い有効性および＞４０％無腫瘍マウスには、＞１０倍の選択性が必要であった。
ＣＤ８－ＩＬ－２の性能を、処置時の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の拡大増殖を分析することにより、さらに試験した。Ｂ６マウスにＢ１６腫瘍細胞を注射し、腫瘍を２００～２５０ｍｍ３に成長させた後、１ｍｇ／ｋｇで示したＩＬ－２融合体を５ｍｇ／ｋｇのｘＰＤ１と一緒にそれらのマウスに投与した。腫瘍を投与後５日目に除去し、単一細胞に消化し、フローサイトメトリーによりプロファイリングしてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋ＣＤ３－）を検出した。細胞をまた、ｐ１５Ｅテトラマー（ＴＢ－Ｍ５０７－２、ＭＢＬ）を製造業者のプロトコールに従って用いて染色して、ｐ１５Ｅ腫瘍抗原を認識するＴ細胞を検出した。図２１に示されているように、ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４．２とｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４との両方が、全腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の＞１５倍の拡大増殖、およびｐ１５Ｅ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞において５～１７倍の拡大増殖を誘導し、ＮＫ細胞は、拡大増殖が低い～拡大増殖がなかった。
ＳＴＡＴ５アッセイを行なって、二価低親和性融合体および高親和性一価融合体の効力を比較した。Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞を、融合タンパク質とともに３０分間、ＲＰＭＩ培地中でインキュベートし、その後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５）についておよび細胞内ＳＴＡＴ５について、実施例１におけるプロトコールに従って染色した。図２２に示されているように、二価低親和性融合体は、高親和性一価誘導体と同様の効力を有した。高親和性ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合した（フォーマットＣでの）または二価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体に融合した（フォーマットＡでの）ＩＬ－２ｍ４．２融合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して同様の効力を有し、一価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１－ＩＬ２ｍ４（フォーマットＣ）融合体よりもはるか大きい効力を有した。
二価Ｃ末端フォーマット（フォーマットＡ）の親和性をさらに試験するために、二価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体（フォーマットＡでの）をＢ１６腫瘍モデルにおいて実施例４で説明したように試験した。マウスに、対照としてのＰＢＳを投与したか、または１ｍｇ／ｋｇの示した融合体を５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１と一緒に投与した（１群当りマウス９匹）。図２３に示されているように、高親和性ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合した（フォーマットＣでの）または二価ｘｍＣＤ８ａｂ２．１抗体に融合した（フォーマットＡでの）ＩＬ－２ｍ４．２融合体は、高親和性ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合した（フォーマットＣでの）ＩＬ－２ｍ４．２融合体とｉｎ ｖｉｖｏで同様の有効性を有した（図２０を参照されたい）。したがって、二価Ｃ末端フォーマット（フォーマットＡ）も非常に効果的である。
ＣＤ８抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞活性化の遮断も試験した。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウス由来の脾細胞から精製し、２４時間、ＥＬ－４－ＯＶＡ系統（ＡＴＣＣ）とともに、各々１００，０００細胞で共培養した。細胞を、ＣＤ２５およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節について、実施例３に記載したように細胞表面染色およびフローサイトメトリーにより分析した。図２４に示されているように、ある特定のＣＤ８抗体は、ＣＤ８ Ｔ細胞活性化を遮断しなかった。ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体は、濃度２００ｎＭであってもＣＤ８ Ｔ細胞活性化を遮断しなかった。ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体は、二価であった。
ＣＤ８抗体によるＣＤ８ Ｔ細胞活性化の遮断も試験した。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ－Ｉマウス由来の脾細胞から精製し、２４時間、ＥＬ－４－ＯＶＡ系統（ＡＴＣＣ）とともに、各々１００，０００細胞で共培養した。細胞を、ＣＤ２５およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節について、実施例３に記載したように細胞表面染色およびフローサイトメトリーにより分析した。図２４に示されているように、ある特定のＣＤ８抗体は、ＣＤ８ Ｔ細胞活性化を遮断しなかった。ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体は、濃度２００ｎＭであってもＣＤ８ Ｔ細胞活性化を遮断しなかった。ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体は、二価であった。
ｘｍＣＤ８ａｂ２融合体とｘｍＣＤ８ａｂ３融合体とのｉｎ ｖｉｖｏでの効力を比較するために、Ｂ１６腫瘍を担持しているＢ６マウスからの脾細胞を、示したタンパク質とともに３０分間、ＲＰＭＩ培地中でインキュベートし、その後、細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＮＫ１．１）についておよび細胞内ＳＴＡＴ５について、実施例１におけるプロトコールに従って染色した。図２５に示されているように、ｘｍＣＤ８ａｂ２－ＩＬ２ｍ４．２およびｘｍＣＤ８ａｂ３－ＩＬ２ｍ４．２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ８＋Ｔ細胞に対して同様の活性を示した。
ＭＨＣ非遮断抗体に融合したＩＬ－２ｍ４．２も、Ｂ１６腫瘍モデルにおいて実施例４に記載したように試験した。マウスに、ＰＢＳ、０．３ｍｇ／ｋｇ（図２６Ａ）もしくは１ｍｇ／ｋｇ（図２６Ｂ）の示した融合体を５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１と一緒に投与した（１群当りマウス９匹）。図２６Ａおよび２６Ｂに示されているように、ＭＨＣ非遮断抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、より最適であった。ＭＨＣ非遮断ｘｍＣＤ８ａｂ３抗体に融合した（フォーマットＣでの）ＩＬ－２ｍ４．２融合体は、ＭＨＣ遮断ｘｍＣＤ８ａｂ２抗体に融合した（フォーマットＣでの）ＩＬ－２ｍ４．２融合体よりもはるかに効果的であった。
ＩＬ－２変異タンパク質の融合体によるＰＤ１＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋とＴｒｅｇとの両方に対する標的化について優先的標的化も試験した。サイズ３００～６００ｍｍ３のＢ１６腫瘍をマウスから除去し、単一細胞に消化した。ＣＤ４５＋細胞を精製し（ＭｉｌｔｅｎｙｉのＬＳカラム、製造業者のプロトコールに従って）、示した融合タンパク質で３０分間、刺激した。細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４９ｂおよびＰＤ１）について、および細胞内ホスホ－ＳＴＡＴ５について、染色した。図２７に示されているように、ＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ２ｍ１０と抗ＰＤ１抗体の融合体は、ＰＤ１－Ｔ細胞よりもＰＤ１＋Ｔ細胞を優先的に標的としたが、ＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＰＤ１＋Ｔｒｅｇ細胞との両方を標的とした。
（実施例７：ｈＰＢＭＣにおけるＣＤ８－ＩＬ－２融合体の活性および選択性に対するＩＬ－２変異の影響）
本実施例は、ｈＰＢＭＣにおけるＣＤ８－ＩＬ－２融合体の活性および選択性に対するＩＬ－２変異の影響を記載する。
結果
ｈＰＢＭＣにおけるＣＤ８－ＩＬ－２融合体の活性に対するＩＬ－２変異の影響を特徴付けるために、示したＩＬ－２変異タンパク質をｘｍＣＤ８ａｂ１抗体に融合し、ｈＰＢＭＣを用いてＳＴＡＴ５アッセイで試験した。ｘｍＣＤ８ａｂ１抗体は、ヒトＣＤ８を認識しなかった。得られたデータを使用して、各々の変異をＳＴＡＴ５活性に対するその効果に従ってランク付けした。表６、７および８は、この実験の結果をまとめる。Ｔｒｅｇを、ＩＬ－２Ｒβγを発現する細胞の代表例として示す。
表６は、すべてフォーマットＢでの、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｍ１～ＩＬ－２ｍ１０の、対照ｘＨＡ抗体に融合したＩＬ－２ｖに匹敵するような、ヒトＴｒｅｇに対する活性を描示する。表６は、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｍ１～ＩＬ－２ｍ１０はすべて、野生型ＩＬ－２と比較してＴｒｅｇに対する活性が大幅に低減したことによって、ＩＬ－２Ｒａへの結合が大幅に低減し、ＩＬ－２Ｒａへの結合を有さないＩＬ－２ｖと同等になったことを示す（Klein et al, Oncoimmunol. 2017; 6(3); e1277306）。
表７は、すべてフォーマットＢでの、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｍ１０．１～ＩＬ－２ｍ１０．１１のヒトＴｒｅｇに対する活性を、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２ｍ１０と比較して、描示する。表７は、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２ｍ１０．１～ＩＬ－２ｍ１０．１１はすべて、ＩＬ－２ｍ１０と比較してＴｒｅｇに対する活性が大幅に低減したことを示す。ＩＬ－２ｍ１０は、ＩＬ２Ｒａに対する活性が低減している、乃至は活性がないため、ＩＬ－２ｍ１０．１～ＩＬ－２ｍ１０．１１に存在する追加の変異がＩＬ－２Ｒβγへの結合を減少させることにより分子の活性を低減させた。
表８は、すべてフォーマットＢでの、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２ｍ４．１～ＩＬ－２ｍ４．６およびＩＬ－２ｍ４．９～ＩＬ－２ｍ４．２４のヒトＴｒｅｇに対する活性を、ｘｍＣＤ８ａｂ１に融合したＩＬ－２ｍ４と比較して、描示する。ＩＬ－２ｍ４は、ＩＬ２Ｒαに対する活性が低減している、乃至は活性がないため、表８に示すＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質に存在する追加の変異がＩＬ－２Ｒβγへの結合を減少させることにより分子の活性を低減させた。Ｔｒｅｇに対する活性の減少、したがって、ＩＬ－２Ｒｂｇへの結合の減少が、ＩＬ－２ｍ４．９、ＩＬ－２ｍ４．１０、ＩＬ－２ｍ４．１２およびＩＬ－２ｍ４．１６を除く、ＩＬ－２変異タンパク質融合体の全てについて観察された。
ＣＤ８－ＩＬ－２変異タンパク質融合体によるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的刺激も試験した。示したＩＬ－２変異タンパク質を、フォーマットＣで、以前に公開された抗ヒトＣＤ８抗体クローンＯＫＴ８（ｘｈＣＤ８ａｂ）に融合し、ｈＰＢＭＣを用いてＳＴＡＴ５アッセイで試験した。表９および１０は、この実験の結果をまとめる。ＣＤ８－ＩＬ２変異タンパク質融合体は、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞を選択的かつ強力に刺激した。ＩＬ－２ｍ４は、ＩＬ２Ｒａに対する活性が低減している、乃至は活性がないため、表９に示すＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質に存在する追加の変異がＩＬ－２Ｒｂｇへの結合を減少させることにより分子の活性を低減させた。Ｔｒｅｇに対する活性の減少、したがって、ＩＬ－２Ｒｂｇへの結合の減少が、ＩＬ－２ｍ４．２６、ＩＬ－２ｍ４．２７、ＩＬ－２ｍ４．２８およびＩＬ－２ｍ４．２９を除く、ＩＬ－２変異タンパク質融合体の全てについて観察された。
ある特定の変異は、非常に弱いＣＤ８ Ｔ細胞活性化を生じさせる結果となったので、有用でなかった（すなわち、Ｎ８８Ｅ変異を含有するＩＬ－２変異タンパク質は、ｘｈＣＤ８ａｂとの融合体の文脈においてＣＤ８ Ｔ細胞をごく弱くしか活性化しなかったが、Ｎ８８Ａ／Ｓ／Ｔは、ＣＤ８ Ｔ細胞に対して強力な活性を有するＣＤ８－ＩＬ２分子を生じさせた）。
表１１および表１２は、対照抗体（ｘＨＡ）またはｘｈＣＤ８ａｂ抗体のどちらかへの融合体の文脈においてＱ１２６Ａ変異を有するＩＬ－２ｍ１０．１２変異タンパク質の活性を描示する。ＣＤ８－ＩＬ２融合体の文脈におけるこの変異は、ヒトＴｒｅｇに対するＣＤ８－ＩＬ２融合体の活性を、ＩＬ－２ｍ１０変異タンパク質を含有するもの（表６および７）と比較して減少させたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な選択的活性化を可能にした。

Claims (23)

  1. ２つの部分を含む融合タンパク質であって、
    ｉ）第１の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体であって、ここで、ＶＨは、可変重鎖であり、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬであって、ここで、ＶＬは、可変軽鎖であり、ＣＬは、定常軽鎖である、抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬ、および変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、前記ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されており；
    ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体および抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬを含み；
    前記第１の部分と前記第２の部分の両方が、次の群：ヒトＣＤ８α、およびヒトＣＤ８βから選択される１つの抗原上のエピトープに結合し；
    前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む、
    融合タンパク質。
  2. ２つの部分を含む融合タンパク質であって、
    ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体であって、ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端が、前記ＦｃドメインのＣ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
    ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
    前記第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、およびヒトＣＤ８βから選択される１つの抗原上のエピトープに結合し；
    前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む、
    融合タンパク質。
  3. ２つの部分を含む融合タンパク質であって、
    ｉ）第１の部分が、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体であって、ここで、ＣＨ２－ＣＨ３は、Ｆｃドメインである、抗体ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含むポリペプチドであって、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドのＣ末端が、前記ＦｃドメインのＮ末端にリンカーを介して融合されているポリペプチドであり；
    ｉｉ）第２の部分が、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３単量体と抗体軽鎖ＶＬ－ＣＬとを含むポリペプチドであり；
    前記第２の部分が、次の群：ヒトＣＤ８α、およびヒトＣＤ８βから選択される１つの抗原上のエピトープに結合し；
    前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む、
    融合タンパク質。
  4. ２つの部分を含む融合タンパク質であって、
    ｉ）第１の部分が、ヒトＣＤ８αまたはヒトＣＤ８βに結合する抗原結合ドメインを含み；
    ｉｉ）第２の部分が、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含み；
    前記第２の部分が、前記第１の部分にリンカーを介して連結され、
    前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、以下のセットのアミノ酸置換（配列番号１の配列に対する）：Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＥおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＤおよびＦ４２Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＮ８８Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＶ９１Ｅ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＮ８８Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＶ９１Ｅ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４Ｈ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２Ｑ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ｄ、Ｆ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ａ；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＤ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＥ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２ＱおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ｑ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＳおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｎ８８ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｖ９１ＥおよびＣ１２５Ａ；Ｆ４２Ａ、Ｄ８４ＨおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｄ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；Ｈ１６Ｅ、Ｆ４２ＡおよびＣ１２５Ａ；ならびにＦ４２Ａ、Ｃ１２５ＡおよびＱ１２６Ｓのうちの１つを有する、配列番号１のアミノ酸配列を含む、
    融合タンパク質。
  5. 前記第１の部分が、（ａ）１つもしくは２つの重鎖ポリペプチドと１つもしくは２つの軽鎖ポリペプチドとを含む抗体もしくはその抗原結合性断片；（ｂ）単鎖抗体もしくは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；または（ｃ）ＶＨＨ抗体を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. ＮＫ細胞の活性化と比較して、１０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. ＮＫ細胞の活性化と比較して、５０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号３のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＩＬ－２ポリペプチドの結合親和性と比較して、配列番号４のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒγポリペプチドに対する結合親和性の５０％またはそれを超える低減を示す、請求項８または請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記融合タンパク質が、ヒトＣＤ８に結合し、前記融合タンパク質のＣＤ８への結合が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  12. 前記第１の部分のＣＨ２－ＣＨ３のＦｃドメインおよび前記第２の部分のＣＨ２－ＣＨ３のＦｃドメインが、ＥＵ番号付けに従って、次のＦｃ変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＫ３２２Ａを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. （ａ）ＥＵ番号付けに従って、前記第１の部分のＣＨ２－ＣＨ３のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第２の部分のＣＨ２－ＣＨ３のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含むか；または
    （ｂ）ＥＵ番号付けに従って、前記第２の部分のＣＨ２－ＣＨ３のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第１の部分のＣＨ２－ＣＨ３のＦｃドメインが、次のアミノ酸置換：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む、
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. （ａ）前記融合タンパク質が、ヒトＣＤ８に結合し、前記融合タンパク質のＣＤ８への結合が、ＣＤ８とＭＨＣクラスＩの相互作用を遮断しない特性；および
    （ｂ）ＮＫ細胞の活性化と比較して、１０倍またはそれより大きい効力でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する特性、
    のうちの１つまたは複数を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  15. ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化の効力が、細胞増殖により評価される細胞活性化のＥＣ５０により測定される、請求項６、７および１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
  17. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
  18. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  19. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  20. 医薬としての使用のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物または請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. がんまたは慢性感染症を処置するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物または請求項１９に記載の医薬組成物。
  22. がんを処置するための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物または請求項１９に記載の医薬組成物であって、前記組成物が、Ｔ細胞療法、がんワクチン、化学療法剤、または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と組み合わせて患者に投与されることを特徴とする、組成物または医薬組成物。
  23. 前記ＩＣＩが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤である、請求項２２に記載の組成物または医薬組成物。
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