JP7760525B2 - 抗ｏｘ４０抗体及びその使用 - Google Patents

Description

本願は、２０２０年４月１７日に出願された中国特許出願第２０２０１０３０４３８１．８号に基づき、及びこれに対する優先権を主張し、及びこの全文は全目的のため参照により本明細書に援用される。

技術分野
本発明は、抗体、詳細には、抗ＯＸ４０抗体及びその抗原結合性フラグメント、並びに前記抗体の調製方法及びＯＸ４０関連疾患又は病態の治療又は予防のためのこれの使用に関する。

ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４及びＡＣＴ３５とも呼ばれる）は、活性ＣＤ４⁺Ｔ細胞、ＣＤ８⁺Ｔ細胞及び調節性Ｔ細胞の面上で、並びにナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の面上でも主に発現される腫瘍壊死因子スーパーファミリーの一員である。活性Ｔ細胞では、ＯＸ４０Ｌ－ＯＸ４０により媒介される共刺激シグナルはヘルパーＴ細胞を刺激して、サイトカインを産出及び分泌し、グランザイム及びパーフォリンを放出するエフェクターＴ細胞を刺激し、並びにエフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞の増殖を引き起こす。同時に、ＯＸ４０Ｌ－ＯＸ４０シグナルは、調節性Ｔ細胞の分化及び活性を阻害し、並びに調節性Ｔ細胞の免疫抑制機能を低下させることにより免疫反応を更に増強することもできる。Ｔ細胞免疫応答におけるＯＸ４０の重要な役割は、ＯＸ４０アゴニストを腫瘍免疫療法の重要な候補とするが、ＯＸ４０阻害薬は、炎症、アレルギー性疾患及び自己免疫疾患における応用価値の可能性を有する。

近年、ＯＸ４０と特異的に結合するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のための製剤技術の広範な応用が明らかになり、２つのカテゴリー、すなわち、ＯＸ４０アゴニスト及びＯＸ４０阻害薬が挙げられる。生理的条件下、ＯＸ４０は、そのリガンドＯＸ４０Ｌとの結合及び三量体化により細胞内の対応するシグナル経路を活性化する。したがって、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体は、架橋を常に必要としアゴニスト抗体として機能する。インビトロ及びインビボ条件下、それぞれ、固体面上の被膜又はＦｃ受容体の何れかにより抗体架橋を行うことができる。Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃフラグメントと特異的に結合するタンパク質受容体のファミリーである。詳細には、Ｆｃγ受容体は、ＩｇＧと特異的に結合し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰなどの機能を発揮することができる。Ｆｃγ受容体としては、主に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、その他が挙げられ、これらは、Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、マスト細胞、血小板、その他を含む様々な血液細胞面上で発現される。生理的条件下、Ｆｃγ受容体は、１つ以上のＩｇＧ分子のＦｃフラグメントと同時に結合することができ、受容体媒介機能を活性化しながらＩｇＧ分子の架橋を行う。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、Ｆｃγ受容体との結合及び架橋によりＯＸ４０分子を活性化することができる。ＯＸ４０アンタゴニスト抗体は、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との結合を遮断し、ＯＸ４０の三量体化を防止することによって、ＯＸ４０活性誘導Ｔ細胞活性化及び関連する炎症反応を阻害することができる。

腫瘍細胞は、免疫回避を行い、体内で生存し及び過剰に増殖する複数の機序により免疫系の認識及び攻撃を回避することができる。腫瘍免疫回避を媒介する重要な機序は、腫瘍微小環境において免疫細胞又は腫瘍細胞内で高度に発現される免疫チェックポイントと名付けられた副刺激分子による。免疫チェックポイントは、その機能に基づいて、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、その他により表される抑制性免疫チェックポイント；並びにＯＸ４０及び４－１ＢＢにより表される活性免疫チェックポイントに分けることができる。抑制性免疫チェックポイントのため、抗体などの薬物を使用してその抑制性機能を遮断することができ、これは、免疫細胞上のブレーキを放出するようなものであり、免疫細胞が腫瘍細胞を殺すのにこれらの役割を果たすことを可能とする。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４により表される腫瘍免疫療法は、非常に重要な治療手段となっており、臨床応用において興奮に満ちた結果を示している。ブレーキ解放後アクセルペダルを踏むのに似てアゴニスト免疫チェックポイントを活性化するためのアゴニストの使用は、免疫細胞の活性を更に増大して、細胞を、腫瘍細胞を殺すのにより効果的にし、及び腫瘍のより広範なスペクトルに対してより効果的な治療効果を最終的に達成する。

最近研究において、様々な腫瘍浸潤性Ｔ細胞はＯＸ４０を発現し、及びＯＸ４０陽性腫瘍患者は比較的長い生存時間を有することが発見され、これはＯＸ４０が腫瘍免疫の役割を果たすことを示唆している。多くの前臨床動物モデルにおいて、ＯＸ４０の活性化は、刺激されたＴ細胞増殖をもたらし、エフェクターＴ細胞、及び調節性Ｔ細胞の機能の阻害を増強した。転移固形腫瘍患者を治療するためのＯＸ４０アゴニスト（９Ｂ１２）を用いた臨床治験では、３０患者のうち１２患者で少なくとも１つの転移病変が退縮したがん患者において免疫機能が改善したこと、及びＯＸ４０抗体が治療された患者において良好な耐容性を示したことが分かった。現在、アゴニスト性ＯＸ４０モノクローナル抗体（例えば、ＭＯＸＲ０９１６、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ ９８６１７８、ＧＳＫ３１７４９９８、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、及びＭＥＤＩ６３８３）は、単剤療法として又は他の免疫抑制薬との組み合わせの何れかでいくつかの臨床治験において評価されている。

自己免疫疾患は、今日人に直面しているもう１つの主要な医療の挑戦であり、ＯＸ４０阻害薬は自己免疫疾患のための可能性のある治療であると期待される。前臨床試験では、ＯＸ４０又はＯＸ４０Ｌ欠損マウスは、アレルギー性喘息のマウスモデルにおいてＴｈ２細胞機能の著しい低下を示すことが分かった。ＯＸ４０阻害薬は、喘息モデルマウスにおいてＴ細胞機能の抑制に関連する症状を緩和することができる。サルインビボ試験において同様な結果が観察された。加えて、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル伝達の遮断後の免疫抑制及び症状緩和は、実験的アレルギー性脳脊髄炎モデル（ＥＡＥ）、関節リウマチモデル（ＲＡ）、並びに大腸炎モデル、移植片対宿主病モデル、Ｉ型糖尿病モデルなどのモデルを含む炎症及び自己免疫疾患の他の伝統的モデルにおいても見られ、ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞は重要な役割を果たす。ＯＸ４０アンタゴニスト抗体に関して、現在の臨床治験は、暫定的結果を得た。ＧＲＢ８３０は、Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．が開発したヒト化ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であり、ＯＸ４０の第二システインリッチドメインと結合し、それによりＯＸ４０Ｌにより引き起こされるＴ細胞活性化を阻害することによりＯＸ４０のＯＸ４０Ｌとの結合を遮断する。ＧＢＲ８３０は、中等症及び重症アトピー性皮膚炎に対する進行中の臨床治験においてポジティブな結果を実証した（Ｐｈａｇｅ ＩＩａ、ＮＣＴ ０２６８３９２８）。加えて、日本の会社協和醗酵が開発したＯＸ４０アンタゴニストモノクローナル抗体ＫＨＫ４０８３は、アトピー性皮膚炎に対するフェーズＩ臨床治験において良好な耐容性及び有効性を示し、中等症及び重症アトピー性皮膚炎に対する薬物（ＮＣＴ ０３７０３１０２）のフェーズＩＩ臨床治験は２０１８年１０月に開始された。

これまでに、いずれものヒト疾病の治療のための明白な有効性を有する抗ＯＸ４０抗体は承認されていない。大きな臨床ニーズを満足するような薬物を更に開発することは大きな意義がある。

本発明は、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメント、その製剤方法、並びにＯＸ４０関連疾患若しくは病態の治療方法を含むこの製剤方法及び使用方法を提供する。

１つの態様では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、重鎖可変領域（ＶＨ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３から選択される１つ～３つを含み、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１、２、３、４若しくは５に記載の通りである、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

１つの態様では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３から選択される１つ～３つを含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６、７、８、９若しくは１０に記載の通りである、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、重鎖可変領域（ＶＨ）、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３ＣＤＲ、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）、すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３ＣＤＲを含み、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１、２、３、４若しくは５に記載の通りであり、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６、７、８、９若しくは１０に記載の通りである、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、重鎖可変領域（ＶＨ）、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３ＣＤＲ、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）、すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３ＣＤＲを含み；ＶＨ及びＶＬは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号７若しくは９に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（４）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ配列番号７若しくは８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ
から選択される、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

１つの態様では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のうちの１つ～３つを含み、ＨＣＤＲ１は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、及びＨＣＤＲ３は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

１つの態様では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のうちの１つ～３つを含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含み、並びにＬＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨは、配列番号１、２、３、４若しくは５に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬは、配列番号６、７、８、９若しくは１０に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号２、３、４、若しくは５に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７、８、９若しくは１０に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号２、３、４、若しくは５に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７、８、９若しくは１０に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、本発明は、完全長抗体、単一ドメイン抗体（ＶＨＨなど）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖなど）、Ｆｖ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）又は二重（多）特異性抗体である、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４のＦｃ領域の配列と同じであるか、又はそのバリアントである。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される抗体のＣＤＲ及びＦｃγＲと結合するＦｃ領域を含む抗ＯＸ４０抗体アゴニストを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体アゴニストのＦｃ領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃ領域のアミノ酸配列と同じである。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される抗体のＣＤＲを含む抗ＯＸ４０抗体アンタゴニストを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体アンタゴニストは、Ｆｃ領域バリアントを含み、このバリアントは、Ｆｃ領域のＦｃγＲとの結合を低減又は排除する。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体アンタゴニストは、Ｆｃ領域バリアントを含み、このバリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａである。

好ましい実施形態では、本発明は、単離された抗ＯＸ４０抗体であって、
（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３であって、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＨＣＤＲ３は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と；
（２）軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３であって、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＬＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と；並びに
（３）ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａである、Ｆｃ領域バリアントと、
を含む、抗体を提供する。好ましくは、Ｆｃ領域バリアントのＦｃγＲとの結合を低減又は排除する。実施形態では、抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、抗体は、完全長抗体である。別の実施形態では、抗体は、１０ｎＭ未満のヒトＯＸ４０に対する結合親和性（Ｋ_D）を有する。別の実施形態では、抗体は、ＯＸ４０抗体アンタゴニストであり、及びＯＸ４０媒介シグナル伝達を遮断するための活性を有する。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される抗体又はそのフラグメントの何れかをコードする単離された核酸であって、好ましくは、核酸は本発明の抗体の重鎖若しくは軽鎖、又は重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする、抗体又はそのフラグメントを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される１つ以上の核酸を含む組換えベクター又は発現ベクターであって、ベクターは本発明により提供される何れかの抗体又はその抗原結合性フラグメントの組換え産生に適している、ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される１つ以上の核酸、又は組換えベクター若しくは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む免疫複合体又は免疫融合体を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合性フラグメント、核酸、ベクター又は宿主細胞を含み、及び必要に応じて、医薬用担体又は医薬用賦形剤などの少なくとも１つの薬学的に許容可能な補助物質を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、ＯＸ４０関連疾患若しくは病態を治療するための薬物の製剤における本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合性フラグメント、核酸、ベクター、宿主細胞、免疫複合体又は免疫融合体の使用も提供する。

別の態様では、本発明は、がん治療のための薬物の製剤における本発明の抗ＯＸ４０抗体アゴニストの使用も提供する。

別の態様では、本発明は、炎症及び／又は自己免疫疾患を治療するための薬物の製剤における本発明の抗ＯＸ４０抗体アンタゴニストの使用も提供する。

別の態様では、本発明は、ＯＸ４０関連疾患若しくは病態の治療方法又は予防方法であって、方法は、本発明により提供される抗体若しくはその抗原結合性フラグメント、又は核酸、ベクター、宿主細胞、免疫複合体若しくは免疫融合体、又はこれを含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連疾患又は病態は、移植片対宿主病などの炎症及び／又は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連疾患又は病態は、メラノーマ、好ましくは転移性メラノーマなどのがんである。

本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを、ＯＸ４０関連疾患若しくは病態を治療又は予防するための他の治療薬又は手順と組み合わせることもできる。

別の態様では、本発明は、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントの使用によりサンプル中のＯＸ４０の検出方法も提供する。方法を使用してＯＸ４０関連疾患又は病態を診断／検出することができる。

本発明は、本明細書に記載されている何れもの実施形態の何れもの組合せも包含する。本明細書に記載されている何れの実施形態も又は何れの組み合わせも、何れか及びすべての抗ＯＸ４０抗体又はフラグメント、本明細書に記載されている本発明の方法及びその使用に適用することができる。

図１は、Ｈｕ３８Ｅ１１－ＩｇＧ２抗体が抗ＣＤ３抗体で活性化されたヒトＴ細胞によりＩＦＮγの分泌を増強することを示す。 図２は、ＥＬＩＳＡにより検出されるとき、抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）がＯＸ４０のＯＸ４０Ｌとの結合を遮断する能力を示す。 図３は、ＥＬＩＳＡにより検出されるとき、ＯＸ４０ＬによるＴ細胞の活性化に対する抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）の遮断効果を示す。 図４は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより側底されるとき、抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）のアンタゴニスト活性及び抗体Ｈｕ３８Ｅ１１のアゴニスト活性を示す。 図５は、ヒトＰＢＭＣ誘導移植片対宿主病に対する抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）の効果を示す。

本発明は、固有のＣＤＲ配列を有し、並びにヒトＯＸ４０との結合に対する高親和性及び特異性を有する抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを、単独又はがん、炎症若しくは自己免疫疾患などの疾病若しくは病態の治療のための他の療法と組み合わせて使用することができる。

定義
特に指定されない限り、本発明を、当技術分野の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、最近生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学における従来技術を用いて実践する。

本発明をより容易に理解するために、いくつかの科学及び技術用語を以下の通り定義する。本明細書中で別の意味に明示的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学及び技術用語は、本発明が属する当業者により通例理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野の定義及び用語のため、専門家によるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を特に参照することができる。アミノ酸残基の略記は、当技術分野で通例使用されている２０Ｌ－アミノ酸の何れか１つについて使用される標準的３文字コード及び／又は１文字コードである。本願及び添付のクレームで使用されている単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別の意味に指定されない限り、複数形を含む。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当業者により決定される特定の値又は整数の許容可能な誤差範囲内の値又は整数を意味し、値又は組成が如何に測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当技術分野における実践毎に１以内又は１より大きい標準偏差を表すことができる。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、５％以下、１０％又は２０％の範囲（すなわち、±５％、±１０％又は±２０％）を表すことができる。

２つ以上の選択項目と関連するために使用される場合、用語「及び／又は」は、選択項目の何れか１つ又は選択項目の何れか２つ以上を意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、言及された要素、整数、又は工程を含むが、他の要素、整数、又は工程を排除しないことを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、特に指定されない限り、言及された要素、整数、又は工程「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を包含する。例えば、特定の配列を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」抗体可変領域を表す場合、特定の配列から成る抗体可変領域を包含することも意図される。

本明細書において、用語「ＯＸ４０」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員である約５０ＫＤのＩ型膜貫通糖タンパク質を表す。ＯＸ４０は、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４又はＴＮＦＲＳＦ４とも呼ぶ。本明細書で使用されるとき、この用語は、特に指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む何れかの脊椎動物源由来の何れかの天然ＯＸ４０を表す。この用語は、細胞内のプロセッシングによる「完全長」、プロセッシングされていないＯＸ４０及びＯＸ４０又はその何れかのフラグメントの何れかの形態を包含する。この用語は、スプライスバリアント又はアレルバリアントなど、ＯＸ４０の天然バリアントも含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、ヒト由来の完全長ＯＸ４０、又はそのフラグメント（単一ペプチドを欠く成熟フラグメントなど）を表す。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０は、受託番号Ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ４３４８９に記載されているアミノ酸配列（リーダーペプチドであるアミノ酸残基１～２８）、又はそのフラグメント（その細胞外ドメインなど）と同じ成熟ＯＸ４０を表す。いくつかの実施形態では、この用語は、ヒトＯＸ４０細胞外ドメイン及びＦｃ領域を含む融合タンパク質など、ＯＸ４０又はそのフラグメント（その細胞外ドメインなど）を含む融合タンパク質も包含する。

本明細書で使用されるとき、用語「ＯＸ４０リガンド」又は「ＯＸ４０Ｌ」は、ｇｐ３４、ＣＤ２５２又はＴＮＦＳＦ４とも呼ばれるＯＸ４０の固有リガンドを表す。ヒトＯＸ４０リガンドは、受託番号ｕｎｉｐｒｏｔ＃Ｐ２３５１０に記載されているアミノ酸配列と同じであるか、又はそのバリアントである。ＯＸ４０Ｌは、細胞面上でホモ三量体を天然に形成し、活性化されたＢ細胞、成熟従来樹状細胞（ＤＣ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、マクロファージ及びランゲルハンス細胞を含む活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で主に発現され、ＮＫ細胞、マスト細胞、活性化Ｔ細胞のサブセット、並びに血管内皮細胞及び平滑筋細胞などの他の細胞型上で発現され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、分子の単一結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の全ての非共有結合性相互作用の総和の強度を表す。特に指定されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する本質的な結合親和性を表す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、総じて、解離錠数（Ｋ_D）により表される。結合親和性の決定方法は、当技術分野において公知であり、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）又は同様な技術（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）が挙げられる。

用語「ＯＸ４０アンタゴニスト」、「ＯＸ４０阻害薬」、「ＯＸ４０アンタゴニスト抗体」、「アンタゴニストＯＸ４０抗体」及び「ＯＸ４０抗体アンタゴニスト」は、本明細書において互換的に使用される。この用語は、ＯＸ４０媒介生物シグナル伝達活性を阻害及び／又は中和することができる抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アンタゴニスト抗体は、ＯＸ４０により引き起こされたシグナル伝達経路を阻害若しくは抑制し、及び／又は、例えば、ＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの結合の遮断若しくはＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの結合の実質的低減によりリンパ球増殖、サイトカイン発現若しくはリンパ球生存などのＯＸ４０媒介細胞性応答を阻害若しくは低減する。

用語「「ＯＸ４０アゴニスト」、「ＯＸ４０アンタゴニスト抗体」、「ＯＸ４０アゴニスト抗体」及び「ＯＸ４０抗体アゴニスト」は、本明細書において互換的に使用される。この用語は、ＯＸ４０媒介生物シグナル伝達活性を促進及び／又は増強することができる抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＯＸ４０により引き起こされたシグナル伝達経路を促進若しくは増強し、及び／又は、例えば、ＯＸ４０との架橋及び結合並びにＯＸ４０媒介生物シグナルの活性化によりリンパ球増殖、サイトカイン発現若しくはリンパ球生存などのＯＸ４０媒介細胞性応答を促進若しくは増強する。

本明細書で使用されるとき、用語「ＯＸ４０関連疾患又は病態」は、ＯＸ４０の発現又は機能若しくは活性、又はＯＸ４０媒介シグナル伝達の活性に関する非生理状態を表し、がん、炎症及び自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、疾病は、ＯＸ４０媒介シグナル伝達の遮断から利益を受けるだろう。いくつかの実施形態では、疾病は、ＯＸ４０媒介シグナル伝達の活性化から利益を受けるだろう。

用語「免疫応答」及び「免疫反応」は本明細書において互換的に使用され、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞及び顆粒球、並びに侵入病原体、病原体に感染された細胞若しくは組織、がん細胞の選択的傷害、破壊若しくは排除をもたらす上記細胞若しくは肝臓により産生された可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）、又は自己免疫若しくは病的炎症の場合、ヒト体由来の正常ヒト細胞若しくは組織などの作用を表す。いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０抗体アンタゴニストは、免疫反応を阻害又は低減、例えば、移植片対宿主病における免疫拒絶を低減する。いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０抗体アゴニストは、抗腫瘍免疫反応を増強する。

本明細書で使用されるとき、用語「シグナル伝達」は、ＯＸ４０Ｌ（リガンド）とＯＸ４０（受容体）との結合などタンパク質－タンパク質相互作用により総じて開始されて、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達をもたらす生化学的因果関係を表す。総じて、伝達は、シグナル伝達を引き起こす一連の反応において１つ以上のタンパク質上の１つ以上のチロシン、セリン、又はスレオニン残基の特異的リン酸化を含む。最後から２番目の過程は、総じて、核イベントを含み、それにより遺伝子発現の変化を引き起こす。

本明細書で使用されるとき、フレーズ「Ｔ細胞機能を増強する」又は「Ｔ細胞アゴニスト活性」は、エフェクター若しくはメモリーＴ細胞の再生の誘導、トリガー若しくは刺激、並びに／又はエフェクター若しくはメモリーＴ細胞の生物機能の維持若しくは増幅及び／若しくは誘導、トリガー若しくは刺激を含む。Ｔ細胞の機能の増強の例としては：介入前のかかるレベルに対して、ＣＤ８⁺エフェクターＴ細胞からのγインターフェロン（ＩＮＦ－γ）の高分泌、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞及び／又はエフェクター細胞からのγインターフェロン（ＩＮＦ－γ）の高分泌、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞及び／又はメモリーＴ細胞からの高増殖、高ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞増殖、並びに高抗原応答性（例えば、クリアランス）が挙げられる。１つの実施形態では、前介入に対して、レベルは、少なくとも５０％、又は６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％以上増加する。この増強の測定方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体のＴ細胞アゴニスト活性を、本発明の抗体の存在下、活性化Ｔ細胞により放出された炎症性因子ＩＦＮγの検出により評価する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞がＩＦＮγを放出するのを促進するＥＣ５０値を、本発明の抗体に対して決定し、より低い値は、抗体がより高いＴ細胞アゴニスト活性を有することを示す。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、参照ＯＸ４０アゴニスト抗体（例えば、ＯＸ４０ｍＡｂ２４）と比較してより高いＴ細胞アゴニスト活性を有する。

本明細書で使用されるとき、フレーズ「Ｔ細胞機能を低減する」又は「Ｔ細胞アンタゴニスト活性」は、エフェクター若しくはメモリーＴ細胞の再生の低減、遮断、若しくは減少、及び／又はエフェクター若しくはメモリーＴ細胞の生物機能の低減、遮断、若しくは減少を含む。Ｔ細胞機能の低減の例としては：介入前のかかるレベルに対して、ＣＤ８⁺エフェクターＴ細胞からのγインターフェロン（ＩＮＦ－γ）の低分泌、ＣＤ４＋メモリー及び／又はエフェクターＴ細胞からのγインターフェロン（ＩＮＦ－γ）の低分泌、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞及び／又はメモリーＴ細胞の低増殖、低ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞増殖、並びに低抗原応答性（例えば、クリアランス）が挙げられる。１つの実施形態では、前介入に対して、レベルは、少なくとも５０％、又は６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％以上低下する。この低減の測定方法は、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０リガンドＯＸ４０Ｌ及び本発明の抗体のＴ細胞アンタゴニスト活性を、本発明の抗体の存在下、活性化Ｔ細胞により放出された炎症性因子ＩＦＮγの検出により評価する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌが媒介したＴ細胞からのＩＦＮγ放出を遮断するＩＣ５０値を、本発明の抗体について決定し、より低い値は、抗体がより高いアンタゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、参照ＯＸ４０アンタゴニスト抗体（例えば、ＧＢＲ８３０）と比較してより高いＴ細胞アンタゴニスト活性を有する。

本明細書で使用されるとき、用語「活性」及び「生物活性」又は用語「生物学的特性」及び「生物学的特徴」は本明細書において互換的に使用され、エピトープ／抗原親和性及び特異性、インビボ又はインビトロでＯＸ４０活性を中和又はアンタゴナイズする能力、インビボ又はインビトロでＯＸ４０を増強又は活性化する能力、Ｔ細胞アゴニスト活性、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合を遮断するＩＣ₅₀、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ媒介Ｔ細胞活性を遮断するＩＣ₅₀、抗体のインビボ安定性及び抗体の免疫原性が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において公知の抗体の他の同定可能な生物学的特性又は特徴としては、例えば、交差反応性（すなわち、総じて標的ペプチドの非ヒトホモログ、又は他のタンパク質若しくは組織との交差反応性）、及び哺乳類細胞内の高レベルの抗体発現を維持する能力が挙げられる。上記特性又は特徴を、当技術分野において周知の技術を用いて観察、決定又は評価することができ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又はＢＩＡＣＯＲＥプラズモン共鳴アッセイ、インビトロ又はインビボ中和アッセイ、サイトカイン又は成長因子の重要帯結合、産生及び／又は分泌、シグナル伝達並びに異なる供給源（ヒト、霊長類、又は他の供給源を含む）からの組織断片の免疫組織化学的検査が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、所望の生物活性を有する抗体のいずれもの形態を表す。したがって、広範な意味で使用され、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体、又はラクダ化単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「全抗体」、「完全長抗体」及び「インタクト抗体」は、本明細書において互換的に使用され、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質を表す。各重鎖は、重鎖可変領域（以後ＶＨと略す）及び重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、３ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以後ＶＬと略す）及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１ドメインＣＬから成る。ＶＨ領域及びＶＬ領域を、より多い保存領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられている）で散在している高頻度可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられている）に更に分けることができる。「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、配列において高頻度可変である抗体可変ドメイン中の領域であり、構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成及び／又は抗原接触残基）「抗原接触部位」）を含む。ＣＤＲは、エピトープとの結合に主に関与している。重鎖及び軽鎖のＣＤＲは、総じて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれており、Ｎ末端から順次番号付けされている。抗体重鎖可変領域に位置するＣＤＲは、それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれている一方で、抗体軽鎖可変領域に位置するＣＤＲは、それぞれ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれている。各ＶＨ又はＶＬは、３ＣＤＲ及び４ＦＲから成り、次の順序アミノ末端からカルボキシル末端へ配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接的に関与していないが、複数のエフェクター機能を示す。

所与のＶＨ又はＶＬアミノ酸配列では、各ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界を、様々な周知のスキームの何れか１つ又はこれらの組み合わせの使用により決定することができ、例えば：Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７））；Ｋａｂａｔスキーム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（バース大学）及びＣｏｎｔａｃｔ（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）；Ｎｏｒｔｈスキーム（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））が挙げられる。本発明における抗ＯＸ４０抗体のＣＤＲの境界を、当技術分野における何れかのスキーム又はこれらの組み合わせ及びマニュアル評価に従って決定することができる。

抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの型（カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ぶ）のうちの１つに割り当てることができる。抗体の重鎖をその重鎖定常領域のアミノ酸配列に従って５つの主要な異なる分類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けることができ、これらの分類のいくつかをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などのサブクラスに更に分けることができる。

「ＩｇＧの形態の抗体」は、抗体の重鎖定常領域がＩｇＧ形態であることを意味する。例えば、ＩｇＧ２の形態の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ２アイソタイプであることを意味する。

本明細書で使用されるとき、用語抗体の「抗原結合性フラグメント」は、抗体のフラグメント又は誘導体を含む。総じて、抗原結合性フラグメントは、抗体の抗原結合性領域又は可変領域の少なくとも１つのフラグメント（１つ以上のＣＤＲなど）を含み、抗体の結合特性の少なくとも一部を維持する。抗原結合性フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦｖフラグメント；ディアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃ－Ｆｖ）；並びにナノボディ及び抗体フラグメントから生成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合活性がモル濃度で発現される場合、結合フラグメント又は誘導体は、総じて、これらが誘導される抗体の抗原結合活性の少なくとも１０％を維持する。好ましくは、結合フラグメント又は誘導体は、これらが誘導される抗体の抗原結合活性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上を維持する。

抗体又はその抗原結合性フラグメントは、その生物活性を有意に変更しない保存置換又は非保存アミノ酸置換を含んでよい（抗体の「保存バリアント」又は「機能的に保存されたバリアント」と呼ぶ）。好ましい態様では、保存置換は、下表Ａに示されている好例の保存置換残基、及び好ましくは、表Ａに示されている好ましい保存アミノ酸置換残基からである。

エピトープは、抗体と結合される抗原の領域である。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置される連続アミノ酸又は非連続アミノ酸から形成され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「単離された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメント」は、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントの精製された状態を表す。例えば、「単離された」は、分子が、核酸、タンパク質、脂質、糖類又は細胞片及び成長培地などの他の物質などの他の生体分子を実質的に含まない。しかしながら、当業者に知られているように、用語「単離された」は、本明細書に記載されている抗体の実験的又は治療応用を実質的に妨げる量で存在しない限り、かかる物質の完全な非存在、又は水、バッファ若しくは塩の非存在を意味することを意図されない。いくつかの実施形態では、単離された抗体又は抗原結合性フラグメントは、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるとき、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超の純度を有する。抗体純度の評価方法の総説については、例えばＦｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７参照。

本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を表し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在するかも知れない可能性のある天然変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一のエピトープに対する。対称的に、従来（ポリクローナル）抗体製剤は、通常、異なるエピトープに対する（又は異なるエピトープに対して特異的な）異なる抗体を含む。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、抗体を産生するためのいずれかの特定の方法を必要とすると解釈すべきでない。

本明細書で使用されるとき、用語「キメラ抗体」は、第１抗体の可変ドメイン及び第２抗体の定常ドメインを有する抗体であって、第１抗体及び第２抗体は異なる種由来である、抗体を表す。総じて、可変ドメインは、げっ歯類などの実験動物の抗体から得られるが、定常ドメイン配列は、得られたキメラ抗体が実験動物由来の抗体よりヒト対象において有害な免疫応答を誘導する可能性がないようにヒト抗体から得られる。

本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、ヒト及び非ヒト（例えば、マウス、ラット）抗体由来の配列を含む抗体形態を表す。総じて、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループと一致し、及び全て又は実質的に全てのフレームワーク（ＦＲ）領域がヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に一致する、少なくとも１つ、及び総じて２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むことができる。場合によっては、当業者に知られているように、アミノ酸変異をヒト化抗体（例えば、可変ドメイン、フレームワーク領域、及び／又は定常領域（存在する場合））に導入して、例えば、抗体の特定の特性を改良することができる；かかる抗体形態は、なお、本発明の「ヒト化抗体」の範囲内にある。

当業者に知られているように、抗体は、抗体を産生するために細胞内で見られる糖鎖を有してよい。例えば、マウス、マウス細胞、又はマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて産生される場合、抗体はマウス糖鎖を含んでよい。あるいは、ラット、ラット細胞、又はラット細胞由来のハイブリドーマにおいて産生される場合、抗体はラット糖鎖を含んでよい。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。天然配列Ｆｃ領域は、様々なＩｇサブタイプ及びそのアロジェネイックなＦｃ領域などの様々な天然免疫グロブリンＦｃ配列を包含する（Ｇｅｓｔｕｒ Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，２０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０）。１つの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリシン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよく、又は存在しなくてもよい。本明細書において特に指定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｃ領域バリアント」及び「バリアントＦｃ領域」は本明細書において互換的に使用され、天然配列Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾を含むＦｃ領域ポリペプチドを表す。本発明のＦｃ領域バリアントは、これらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ２９７Ａは、親ポリペプチドに対してアスパラギンが２９７位においてアラニンにより置換されているＦｃ領域バリアントであり、番号はEUインデックスに従っている。例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａは、置換Ｎ２９７Ａを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を有するＦｃ領域バリアントを表す。修飾は、付加、欠失又は置換であり得る。置換は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含むことができる。バリアントは、非天然アミノ酸を含んでよい。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体Ｆｃ領域と結合する受容体を表現する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＦｃγＲ（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む、これらの受容体のアレルバリアント及び代替スプライシング体も含む。ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）を含み、同様なアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）参照）。ＦｃＲの総説のため、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）参照。将来に同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、母系ＩｇＧを胎児に導入（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））及び免疫グロブリンのホメオスタシスを調節に関与する新生受容体ＦｃＲｎも含む。ＦｃＲｎの結合の測定方法は公知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８（１２）：５９２－５９８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７－６４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６２１６（２００４）；国際公開第２００４／９２２１９号パンフレット（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）参照）。ヒトＦｃＲｎとのインビボ結合及びヒトＦｃＲｎに対する高結合親和性を有するポリペプチドの血清中半減期を、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトヒト細胞株、又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類において決定することができる。国債公開第２０００／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ）は、改良又は低減されたＦｃＲとの結合を有する抗体バリアントを記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）も参照。

用語「薬学的に許容可能な補助物質」は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、医薬用賦形剤、医薬用担体又は安定剤、その他を表し、活性物質と共に投与される。

用語「医薬組成物」は、その中に含まれる有効成分の生物活性が有効であることを可能とする形態で存在し、組成物を投与される対象に対して許容されない毒性を有する更なる成分を含まないような組成物を表す。

本明細書で使用されるとき、用語「免疫複合体」は、これに限定されないが、細胞傷害性薬物又は標識を含む１つ以上の他の物質と結合された抗体である。「免疫融合体」は、１つ以上の他のペプチド又はポリペプチドと共有結合により融合された抗体である。

本明細書に記載されている用語「治療薬」は、がんなどの関連疾患の予防又は治療に有効であるいずれの物質も包含する。

本発明で使用されるとき、用語「細胞傷害性薬物」は、細胞機能を阻害若しくは阻止する及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を表す。

「化学療法薬」としては、がん又は免疫系疾患の治療において有用である化学小分子薬物が挙げられる。

用語「小分子薬物」は、生物過程を調節することができる低分子量を有する化合物を表す。「小分子」は、１０ｋＤより小さい、通常２ｋＤより小さい及び好ましくは１ｋＤより小さい分子量を有する分子と定義される。小分子としては、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体及び抗体模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬として、小分子は、大分子より細胞膜を良く貫通することができ、分解を受けにくく、免疫応答を引き起こす可能性が低い。

本明細書に記載されている用語「免疫調節薬」は、免疫応答を調節（例えば、抑制又は増強）する天然又は合成活性薬剤又は薬物を表す。免疫応答は、体液性応答又は細胞性応答であり得る。ある場合には、免疫調節薬は、免疫応答を阻害する免疫抑制薬、例えば、炎症及び自己免疫疾患において免疫応答を有利に阻害する免疫抑制薬を含む。別の場合では、免疫調節薬は、免疫応答を増強する活性薬剤又は薬物、例えば、がん治療において抗がん免疫応答を有利に増強する活性薬剤又は薬物を含む。

用語「がん性」及び「がん」は、総じて、未制御細胞成長を特徴とする哺乳類における生理障害を表す又は表現する。この定義は、良性及び悪性腫瘍及び休眠腫瘍又は微小転移を含む。「がん」としては、固形腫瘍及び血液がんが挙げられるが、これらに限定されない。様々ながんの例としては、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。

「炎症及び／又は自己免疫疾患」は、いずれもの炎症性病態又は免疫関連病態（例えば、病的炎症及び自己免疫疾患）を広義に含むことを意図される。「自己免疫疾患」は、個体自身の組織若しくは器官が原因及びこれを標的とする疾病若しくは病態、又は同時分離障害若しくはその症状若しくはそれから生じる病態である。自己免疫疾患は、正常体組織及び抗原と反応する抗体を産生するＢ細胞の生成により引き起こされる又はもたらされる病態を表すかも知れない。自己免疫疾患は、更に、自己抗原（例えば、核内抗原）由来のエピトープに対して特異的な自己抗体の分泌を含む疾病であり得る。

本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、形質転換（すなわち、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入）の目的のために使用することができるいずれの組換えポリヌクレオチド構築物も表す。ベクターの１つの型は「プラスミド」、付加的ＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡの導入ループである。ベクターのもう１つの型は、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターである。特定のベクターは、これらを導入する宿主細胞内で自律増殖可能である（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに組み込み、それにより、宿主ゲノムと共に複製する。加えて、いくつかのベクターは、機能的に結合された遺伝子の発現を導く。かかるベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。発現ベクターは、ベクターが宿主細胞に形質転換、トランスフェクト又は形質導入される場合、標的遺伝子を複製及び発現することができる核酸を表す。発現ベクターは、ベクター維持を保証し、必要に応じて宿主内での増幅を提供するための１つ以上の表現型選択可能なマーカー及び複製開始点を含む。

本明細書において用語「対象」又は「患者」又は「個体」は、いずれのヒト又は非ヒト動物も含む。用語「非ヒト動物」は、哺乳類及び非ヒト霊長類などの非哺乳類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類、その他などの全ての脊椎動物を含む。

本明細書において用語「治療有効量」、「治療効果的用量」及び「有効量」は、単独又は他の治療薬との併用で細胞、組織又は対象に与えられる場合、１つ以上の疾病若しくは病態の症状又は疾病若しくは病態の発症を効果的に予防又は改善する本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントの量を表す。治療効果的用量は、関連病状を治療、治癒、予防若しくは改善又はかかる病態の治療、治癒、予防若しくは改善の速度を増加するための量など、症状の改善をもたらすのに充分な抗体又はその抗原結合性フラグメントの量も表す。有効成分単独を個体に投与される場合、治療効果的用量は、成分のみを表す。併用で投与される場合、治療効果的用量は、併用、順々又は同時の投与にかかわらず、治療効果に寄与する有効成分の総量を表す。治療薬の有効量は、少なくとも１０％、通常少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、及び最も好ましくは少なくとも５０％診断基準又はパラメータの改善をもたらすだろう。

本明細書で使用されるとき、「治療する（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、１）診断された病的状態若しくは疾病の症状を治癒、寛解及び緩和する及び／又は診断された病的状態若しくは疾病の進行を止める治療手段、並びに２）病的状態若しくは疾病の発症を予防及び／若しくは遅延する予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）若しくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段を含む。したがって、治療を受けている対象は、疾病を罹患している個体、疾病を罹患する傾向がある個体、及び疾病を予防することを望んでいる個体を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、疾病又は病態の治療に関する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、疾病又は病態の予防に関する。

本発明によるいくつかの実施形態では、疾病又は病態の「治療」は、疾病又は病態の改善を表す（すなわち、疾病又はその臨床症状の少なくとも１つの進行を軽減又は予防又は低減する）。いくつかの他の実施形態では、「治療」は、患者により識別することができない可能性があるこれらの身体的パラメータを含む少なくとも１つの身体パラメータの緩和又は改善を表す。いくつかの他の実施形態では、「治療」は、疾病又は身体的（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的（例えば、身体的パラメータの安定化）状態、又は両方の状態の調節を表す。疾病の治療及び／又は予防の評価方法は、総じて、本明細書に明示的に記載されない限り、当技術分野において公知である。

本発明による更に他の実施形態では、疾病又は病態の「予防」は、疾病若しくは病態の発生若しくは発症又は特定の疾病若しくは病態の症状の阻害を含む。いくつかの実施形態では、がんの家族病歴は、予防レジメンのための候補である。総じて、がんとの関連で、用語「予防」は、特に、がんのリスクを有する対象においてがんの病態又は症状の発症前に対象に薬物を投与することを表す。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によるがんの「治療」後、個体患者は、個体が次のうちの１つ以上を示す場合に首尾よく治療したと見做される：がん細胞数は減少若しくはがん細胞は完全に消滅する；腫瘍サイズは減少する；例えば、軟組織及び骨へのがん細胞の拡散を含む周辺の器官へのがん細胞の浸潤は阻害される若しくは存在しない；腫瘍転移阻害される若しくは存在しない；特定のがんに関連する１つ以上の症状は緩和される；発症率及び死亡率は低下する；生活の質は改善される；腫瘍発生率、頻度若しくは腫瘍形成能は低下する；腫瘍中のがん間細胞の数若しくは頻度は低下する；腫瘍細胞は非腫瘍原性状態に分化する；又はこれらの効果のいくつかの組み合わせ。

「腫瘍増殖の阻害」は、腫瘍細胞増殖を阻害することができるいずれの機序も表す。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞増殖の遅延により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞増殖の停止により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞の殺生により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞アポトーシスの誘導により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞分化の誘導により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞の栄養素欠乏により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞遊走の防止により阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖を、腫瘍細胞浸潤の防止により阻害する。

本明細書で使用されるとき、「配列同一性」は、比較ウィンドウ内での１つずつのヌクレオチド又はアミノ酸の比較に基づいて配列の同一性の程度を表す。「配列同一性（パーセンテージ）」を次のように算出することができる：比較ウィンドウ内で２つの最適に配列された配列を比較し、２つの配列中の同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）を有する位置の数を決定してマッチングする位置の番号を得て、マッチングする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）により除算し、及び結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを得る。配列同一性のパーセンテージを決定する目的のための最適アライメントを、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野において公知の様々な方法で行うことができる。当業者は、配列をアライメントするための最適なパラメータを決定することができ、配列の完全長又は比較される標的配列領域にわたって最大アライメントを行うのに必要ないずれものアルゴリズムが挙げられる。本発明では、抗体配列に関して、アミノ酸配列同一性のパーセンテージを、参照抗体配列と共に、及び好ましい実施形態では、Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従って候補抗体配列の最適アライメントにより決定する。

本明細書で使用されるとき、「ＧＢＲ８３０」は、国際公開第２０１３／００８１７１号パンフレットに開示されているＶＨ６／ＶＬ９重鎖及び軽鎖配列に従って一過性発現により得られるＯＸ４０アンタゴニスト抗体であり；「ＯＸ４０ｍＡｂ２４」は、国際公開第２０１６／０５７６６７号パンフレットに開示されているＯＸ４０ｍＡｂ２４抗体の重鎖及び軽鎖配列に従って一過性発現により得られるＯＸ４０アゴニスト抗体であり；「１１Ｄ４」は、国際公開第２００９／０７９３３５号パンフレットに開示されている１１Ｄ４抗体の重鎖及び軽鎖配列に従って一過性発現により得られるＯＸ４０アゴニスト抗体である。

抗ＯＸ４０抗体及びその産生
本発明の抗体を、抗体を産生するためのいずれかの適切な方法により産生することができる。ＯＸ４０のいずれかの適切な形態を、抗体を産生する免疫原（抗原）として使用することができる。例として及び限定されないが、いずれかのＯＸ４０バリアント又はそのフラグメントを免疫原として使用することができる。いくつかの実施形態では、マウスモノクローナル抗ヒトＯＸ４０抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、当技術分野において周知の方法により産生してよい。これらの方法としては、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、標準プロトコールに従って、マウス脾臓細胞を単離し、及びＰＥＧ又は電気融合によりマウス骨髄腫細胞株と融合する。それから、ＯＸ４０結合活性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を分泌する。本発明のハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン可変領域のＤＮＡ配列を、縮重プライマーＰＣＲに基づいた方法により検出することができる。

げっ歯類（マウスなど）由来の抗体は、インビボで治療薬として使用される場合、望ましくない抗体免疫原性を引き起こし得る。反復使用は、ヒトにおいて治療用抗体に対する免疫応答を引き起こす。この種の免疫応答は、治療有効性の損失を少なくとももたらし、及び重度の症例では、致死的アレルギー反応の可能性をもたらす。げっ歯類抗体の免疫原性を低下させる１つの方法としては、マウス可変領域をヒト定常領域と融合するキメラ抗体の産生が挙げられる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９－４３）。しかしながら、キメラ抗体におけるインタクトなげっ歯類可変領域の保持は、患者の有害な免疫原性をなお引き起こす可能性がある。

げっ歯類可変領域からヒトフレームワークへのＣＤＲの移植（すなわち、ヒト化）を使用してげっ歯類配列を更に最小化した。本発明のヒト化抗体のため、マウスＣＤＲ流域を、当技術分野において公知の方法を用いてヒト生殖系フレームワークに挿入することができる。Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２５，５３９号明細書及びＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書及び米国特許第６，１８０，３７０号明細書参照。

本発明の抗体の可変領域ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界を、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ又はＮｏｒｔｈなどの多くの周知のスキームのうちのいずれか１つを用いることにより決定することができる。なお、異なる定義システムにより得られる同じ抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なるかも知れない。すなわち、異なる割当システムにより定義された同じ抗体の可変領域のＣＤＲ配列は異なる。したがって、本発明で定義される特定のＣＤＲを有する抗体の定義に至る場合、抗体の範囲は、その可変領域配列が特定のＣＤＲを含むが、異なるスキーム（異なる定義システム又はその組み合わせなど）の応用のせいで、指定ＣＤＲ境界が特定のＣＤＲ配列のため本発明で特定されたものと異なる抗体も包含する。

異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかしながら、ＣＤＲは抗体毎に異なるが、ＣＤＲにおいて限定された数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接的に関与する。最小重複領域を、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＮｏｒｔｈスキームのうちの少なくとも２つを用いて決定し、抗原結合のための「最小結合単位」を得ることができる。最小結合単位は、ＣＤＲ残基のサブセットであり得る。当業者に理解されているように、ＣＤＲ配列の残りの残基を、抗体の構造及びタンパク質フォールディングにより決定することができる。したがって、本発明は、本明細書に提示されているＣＤＲのいずれかのバリアントも意図している。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントのバリアントでは、最小結合単位のアミノ酸残基は未変化のままであるが、Ｋａｂａｔ又はＩＭＧＴに従って定義される他のＣＤＲ残基を、保存アミノ酸残基により置換することができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３から選択される１～３つを含む抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、ＨＣＤＲ１は配列番号１１に記載のアミノ酸配列と同じであるか又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列と比較して３以下、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を有するアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と同じであるか又は配列番１２に記載のアミノ酸配列と比較して３以下、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を有するアミノ酸配列を含み、及びＨＣＤＲ３は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と同じであるか又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と比較して３以下、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を有するアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３から選択される１～３つを含む抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、ＬＣＤＲ１は配列番号１４に記載のアミノ酸配列と同じであるか又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列と比較して３以下、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を有するアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１５に記載のアミノ酸配列と同じであるか又は配列番１５に記載のアミノ酸配列と比較して３以下、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を有するアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列と同じであるか又は配列番号１６に記載のアミノ酸配列と比較して３以下、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を有するアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを含み、本明細書に具体的に開示されている３つのＨＣＤＲに対してこの重鎖可変領域の３つのＨＣＤＲは、少なくとも１つ及び５以下、４、３、２又は１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）の全て、並びに／又は本明細書に具体的に開示されている３つのＬＣＤＲに対してこの軽鎖可変領域の３つのＬＣＤＲは、少なくとも１つ及び５以下、４、３、２若しくは１つのアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）の全てを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを含み、本明細書に具体的に開示されている抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域と比較して、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは６以下、５、４、３、２又は１）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存置換）を含み、並びに好ましくはアミノ酸変化はＣＤＲ領域中で起こらない。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨは、配列番号１、２、３、４若しくは５に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬは、配列番号６、７、８、９若しくは１０に記載のアミノ酸配列と同じ又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明の実施形態では、本明細書に記載されているアミノ酸変化は、アミノ酸置換、挿入又は欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載されているアミノ酸変化は、アミノ酸置換、好ましくは保存置換である。

好ましい実施形態では、本発明のアミノ酸変化は、ＣＤＲの外側の領域（例えば、ＦＲ）で起こる。より好ましくは、本発明のアミノ酸変化は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域の外側の領域で起こる。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域で起こる。

いくつかの実施形態では、アミノ酸変化を含む本発明の抗体は、本明細書で開示されている特定の抗体と同じ又は同様な特性を有する。

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、ＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、又は重鎖への翻訳後修飾を含む。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体は、完全長抗体、単一ドメイン抗体（ＶＨＨなど）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖなど）、Ｆｖ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）又は二重（多）特異性抗体である。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の形態の抗体など、いずれかのＩｇＧアイソタイプの形態の抗体である。

いくつかの実施形態では、本発明は、変更されたエフェクター機能を有する抗体も提供する。用語「エフェクター機能」は、抗体分類が変わる抗体のＦｃ領域に起因するこれらの生物活性を表す。５つの主要抗体分類がある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びにこれらのうちのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。抗体のエフェクター機能としては、例えば、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；免疫細胞の動員；並びにＦｃ領域と細胞面上のＦｃＲ受容体との結合により媒介される抗体架橋が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に理解されているように、適切な抗体Ｆｃ領域配列を、標的細胞を殺傷する免疫系を動員、又はＦｃＲとの相互作用による抗体の架橋を遊走することが望まれるかどうかなど、ニーズに応じて選択することができる。例えば、免疫系動員及び標的細胞殺生が対象の抗体の所望の特性である場合、抗体のＦｃ領域を、活性化されたＦｃγＲ受容体との結合の増強及び／又は、例えば、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣエフェクター機能を促進する補体を提供するように選択又は更に修飾することができる。別の例について、免疫系動員が望ましくない場合では、抗体のＦｃ領域を、エフェクター機能を低下させるように選択又は更に修飾することができる。例えば、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブタイプのＦｃ領域を使用することができるか、又はＮ２９７Ａなどの変異を有するＩｇＧ１サブタイプのＦｃ領域を使用することができる。加えて、Ｆｃ領域を、これを含む抗体が１つ以上のＦｃ受容体と選択的に結合するように選択又は変異することができるが、ＡＤＣＣ活性の強度を変更しながら抗体の架橋を増強するなど、抗体エフェクター機能の調整を行うために、更に１つ以上のＦｃＲとの結合を低減又は排除する。例えば、Ｘｉｎｈｕａ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＩｇＧ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ２０１８，９（１）：６３－７３，ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１３２３８－０１７－０４７３－８；Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ＦｃγＲＩ， ＦｃγＲＩＩ，ＦｃγＲＩＩＩ ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＦｃγＲ，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１－６０４．Ｅｐｕｂ ２０００ Ｎｏｖ ２８参照。

本発明は、抗体のインビボ半減期が重要である応用のための抗体バリアント所望の候補を作成するいくつかだが全てではないエフェクター機能を有する抗体バリアントを提供し、及び特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）は不必要又は有害である。インビトロ 及び／又はインビボ細胞毒性アッセイを行い、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（及びしたがってＡＤＣＣ活性又は抗体架橋活性を欠いているかも知れない）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを保証することができる。ＮＫ細胞、ＡＤＣＣを媒介する主要細胞は、ＦｃγＲＩＩＩしか発現しないが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現をＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｔｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に纏めている。ヒトＩｇＧ１のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎと共に結合部位は図示されており、改良された結合を有するバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４，２００１参照）。

いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾を、本発明により提供される抗体のＦｃ領域に導入して、Ｆｃ領域バリアントを産生することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（置換など）を含むヒトＦｃ領域配列（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域など）を含むことができる。例えば、ＦｃγＲとのその結合を増強又は低下及び対応する機能を増強又は低下させるためのヒトＩｇＧ１へのいくつかの修飾を、Ｂｒｕｈｎｓ ａｎｄ Ｊｏｎｓｓｏｎ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１５ Ｎｏｖ；２６８ （１）：２５－５１，４４頁の論文に纏められている。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される抗体は、低下又は欠乏するＦｃγＲ結合活性（抗体架橋活性など）を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、及び特に免疫グロブリン重鎖の位置Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１におけるアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域バリアントは、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｄ及びＰ３３１Ｓから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域バリアントのアミノ酸置換は、Ｎ２９７Ａである。

１つの態様では、本明細書で提供される抗体を修飾して、抗体のグリコシル化度を増加又は減少する。抗体のグリコシル化部位の付加又は欠失を、１つ以上のグリコシル化部位を生成又は除去するためにアミノ酸配列の変更により便利に行うことができる。グリコシル化を変更して、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増大することができる。かかる炭水化物修飾を、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位の変更により行うことができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を行うことができ、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより、この部位におけるグリコシル化を除去する。このグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，４２６，３００号明細書に記載されている。抗体がＦｃ領域を含む場合、これに結合された糖類を変更することができる。いくつかの応用では、望ましくないグリコシル化部位への修飾は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を改良するフルコースモジュールの除去など、有用である。他の応用では、ガラクトシル化修飾を行って、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変することができる。

いくつかの実施形態では、システイン改変抗体、例えば、抗体の１つ以上の残基はシステイン残基により置換される、「チオＭＡｂ」を産生することは望ましいかも知れない。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体を更に修飾して、当技術分野において公知であり、容易に入手可能な付加的非タンパク質部分を含んでよい。抗体誘導体化に適した部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジアルカン、ポリ－１，３，６－トリアルカン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体又はランダム共重合体のいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモ重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、次の特性：
（ｉ）ヒトＯＸ４０、特に、３０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満又は５ｎＭなど、５０ｎＭ未満など、１００ｎＭ未満のＫ_D値を有するなどの高親和性を有する、ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインとの結合であって、好ましくはＫ_D値を、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定することと；
（ｉｉ）４０ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満又は５ｎＭなど、５０ｎＭ未満など、１００ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するなどの高親和性を有する細胞（Ｔ細胞など）の面上で発現されるヒトＯＸ４０との結合であって、好ましくはＥＣ５０値をＦＡＣＳアッセイを用いて測定することと；
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡにより測定されるとき、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％又は９０％の阻害速度、及び好ましくは１０ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満のＩＣ５０値で、ヒトＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌとの結合を遮断することと；
（ｉｖ）表２にリストされているいずれかの抗体と同じ若しくは同様な結合親和性及び／又は特異性を示すことと；
（ｖ）表２にリストされているいずれかの抗体のＯＸ４０結合を阻害（例えば、競合的に阻害）することと；
（ｖｉ）表２にリストされているいずれかの抗体と同じ若しくは重複しているエピトープと結合することと；
（ｖｉｉ）表２にリストされているいずれかの抗体と同じ若しくは同様な生物活性を有することと、
のうちの１つ以上を有する。

いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４ Ｆｃ領域又はそのバリアント、好ましくはヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２ Ｆｃ領域又はそのバリアントなど、ＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ）と結合するＦｃ領域を含むアゴニスト抗体である。バリアントは、好ましくは、親Ｆｃ領域（例えば、天然配列Ｆｃ領域）の結合親和性と同じ又はこれより強力なＦｃγＲに対する結合親和性を有する。好ましくは、抗体は、そのＦｃ領域と細胞面上で発現されるＦｃγＲとの結合により架橋を行う。好ましくは、抗体は、配列番号２１若しくは２２に記載の定常領域配列のＦｃ領域配列と同じヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２ Ｆｃ領域配列を含むか、又は配列番号２１若しくは２２に記載の定常領域配列のＦｃ領域配列と少なくとも９５％、９６％、９７％若しくは９９％の同一性を有するヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２ Ｆｃ領域バリアントを含むか、又は配列番号２１若しくは２２に記載の定常領域配列のＦｃ領域配列に対して１０以下、５若しくは１～３アミノ酸変化を有する。

いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０アゴニスト抗体は、次の特性：
（ｉ）１０ｎＭ未満、より好ましくは５ｎＭ未満のＫ_D値など、高親和性を有するヒトＯＸ４０と結合することであって、好ましくは、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、Ｋ_D値を測定することと；
（ｉｉ）１０ｎＭ未満、より好ましくは５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するなどの高親和性を有する細胞（活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞など）の面上で発現されるヒトＯＸ４０との結合であって、好ましくはＦＡＣＳアッセイを用いて、ＥＣ５０値を測定することと；
（ｉｉｉ）ＯＸ４０媒介シグナル伝達活性を活性化することと；
（ｉｖ）Ｔ細胞アゴニスト活性を有することであって、抗体のＴ細胞アゴニスト活性を、例えば、抗体の存在下活性化Ｔ細胞により放出されたＩＦＮγなどのサイトカインを検出することにより評価することができ、場合によっては、抗体のＥＣ５０値は１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満であることと；
（ｖ）メラノーマ細胞の増殖を阻害することなど、腫瘍増殖を阻害することと、
のうちの１つ以上を有する

いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０抗体は、アンタゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、親Ｆｃ領域（例えば、天然配列Ｆｃ領域）に対して、ＦｃγＲに対するＦｃ領域バリアントの結合親和性を低下又は実質的に排除される、Ｆｃ領域バリアントを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、細胞面上で発言されるＦｃγＲと実質的に結合せず、及びＦｃγＲ媒介抗体架橋は起こらない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域バリアントを含む本発明の抗体は、親Ｆｃ領域（例えば、天然配列Ｆｃ領域）を含む対応する抗体に対してＦｃγＲ媒介エフェクター機能を低下又は排除している。好ましくは、抗体のＦｃ領域は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｄ、Ｐ３３１Ｓ、又はこれらの組み合わせから選択される変異を含む。より好ましくは、抗体のＦｃ領域は、Ｎ２９７Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１に記載の定常領域配列のＦｃ領域配列と同じヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域配列を含むか、又は配列番号２１に記載の定常領域配列のＦｃ領域配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域バリアントを含むか、又は配列番号２１に記載の定常領域配列のＦｃ領域配列に対して１０以下、５若しくは１～３アミノ酸変化を有し、及びＦｃ領域とＦｃγＲとの結合親和性を低下させる変異、好ましくはＮ２９７変異、より好ましくはＮ２９７Ａを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０アンタゴニスト抗体は、次の特性：
（ｉ）１０ｎＭ未満、より好ましくは５ｎＭ未満のＫ_D値など、高親和性を有するヒトＯＸ４０と結合することであって、好ましくは、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、Ｋ_D値を測定することと；
（ｉｉ）１０ｎＭ未満、より好ましくは５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するなどの高親和性を有する細胞（活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞など）の面上で発現されるヒトＯＸ４０との結合であって、好ましくはＦＡＣＳアッセイを用いて、ＥＣ５０値を測定することと；
（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡにより測定されるとき、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、８５％又は９０％の阻害速度、及び好ましくは１０ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満のＩＣ５０値で、ヒトＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌとの結合を遮断することと；
（ｉｖ）ＯＸ４０媒介シグナル伝達活性を遮断することと；
（ｖ）Ｔ細胞アンタゴニスト活性を有することであって、抗体のＴ細胞アゴニスト活性を、例えば、抗体及びＯＸ４０Ｌの存在下活性化Ｔ細胞により放出されたＩＦＮγなどのサイトカインを検出して抗体によるＯＸ４０Ｌ媒介Ｔ細胞活性化の阻害を評価することにより評価することができ、場合によっては、抗体のＩＣ５０値は５ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満であることと；
（ｖｉ）移植片対宿主病において免疫拒絶を低減するなど、抗免疫拒絶活性を示すことと、
のうちの１つ以上を有する。

抗体発現
本発明は、１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞及び本発明のいずれかの抗体又はその抗原結合性フラグメントの産生方法に関し、方法は、宿主細胞の培養、抗体又は抗原結合性フラグメントの精製及び回収を含む。

１つの態様では、本発明は、上記抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントのいずれかをコードする核酸を提供する。例えば、本発明は、本明細書に記載されている重鎖、軽鎖、可変領域又は相補性決定領域を含むセグメントをコードする核酸を提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１７又は１８に記載の核酸配列と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１９又は２０に記載の核酸配列と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

１つの態様では、核酸を含む１つ以上のベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることを意図される宿主細胞に依存する。総じて、発現ベクターは、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸と機能的に連結されたプロモータ及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、抗体定常領域をコードする配列を更に含む。

１つの態様では、本発明は、原核細胞又は真核細胞を含む本発明の組換え抗体を発現するための宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、クローン化及び本発明の核酸を発現するために使用することができる原核宿主細胞である。他の適切な細菌宿主としては、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、並びにサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び様々なシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられる。これらの原核宿主では、発現ベクターを製剤することもでき、総じて、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製開始点）を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類宿主細胞を使用して、本発明の抗ＯＸ４０抗体ポリペプチドを発現及び産生する。例えば、哺乳類宿主細胞は、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は正常ヒト細胞、若しくは不死化動物若しくはヒト細胞を含む外来性発現ベクターを含む哺乳類細胞株であってよい。例えば、インタクト免疫グロブリンを分泌することができる多くの適切な宿主細胞株は開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨＥＫ２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマが挙げられる。

１つの態様では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体の製剤方法であって、方法は、発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入することと、及び充分な時間宿主細胞を培養することにより、抗体が宿主細胞内で発現されることを可能とすること、又はより好ましくは宿主細胞が増殖して抗体を産生する培地に抗体を分泌することを含む、方法を提供する。標準的タンパク質精製方法を使用して、培養培地から抗体を回収することができる。本明細書に記載されている抗体分子を、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、その他などの公知の利用可能な技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、当業者に明白である正味荷電、疎水性、及び親水性などの因子にも依存する。本発明の抗体分子の純度を、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー、その他を含む、様々な周知の分析方法の何れかにより決定することができる。

異なる細胞株により発現される又はトランスジェニック動物内で発現される抗体は、相互に異なるグリコシル化型を有する可能性が高い。しかしながら、本明細書で提供されている核酸によりコードする又は本明細書で提供されているアミノ酸配列を含む全抗体は、抗体のグリコシル化型にかかわらず、本発明の部分である。

アッセイ
本明細書で提供されている抗ＯＸ４０抗体の物理的／化学的特性及び／又は生物活性を、当技術分野において公知の様々なアッセイにより同定、スクリーニング、又は特徴付けすることができる。１つの態様では、本発明の抗体の抗原結合活性を、例えば、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法などの公知の方法により試験する。当技術分野において公知の方法を使用して、ＯＸ４０との結合を決定することができ、好例の方法は本明細書に開示されている。

本発明は、所望の生物活性を有する抗ＯＸ４０抗体を同定するアッセイ方法も提供する。生物活性としては、例えば、ＯＸ４０との結合（例えば、ヒトＯＸ４０との結合）、ＯＸ４０媒介シグナル伝達の増加（例えば、ＮＦγＢ媒介転写の増加）、Ｔエフェクター細胞機能の増強（例えば、エフェクターＴ細胞増殖の増加及び／又はエフェクターＴ細胞によるサイトカイン産生（例えば、γインターフェロン）の増加による）、その他を挙げることができる。インビボ及び／又はインビトロでのかかる生物活性を有する抗体も提供する。

特定の実施形態では、本発明の抗体を、かかる生物活性について試験する。

上記インビトロアッセイ方法のいずれかで使用するための細胞としては、ＯＸ４０を天然で発現するか又は腫瘍細胞株などのＯＸ４０を発現するように改変された細胞株が挙げられる。かかる細胞としては、ＯＸ４０を発現せず、及びＯＸ４０を発現するようにＯＸ４０をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた細胞株も挙げられる。

本発明の免疫複合体又は免疫融合体を、上記アッセイ方法のいずれかを行うために抗ＯＸ４０抗体に代わって、又は付加して使用することができると理解される。

抗ＯＸ４０抗体と別の活性薬との組合せをしようして上記アッセイ方法の何れかを行うことができると理解される。

免疫複合体及び免疫融合体
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明により提供される何れかの抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメント及び別の物質を含む免疫複合体を提供する。１つの実施形態では、別の物質は、例えば、細胞傷害性薬物である。

いくつかの実施形態では、本発明は、何れかの抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む免疫融合体を提供する。

いくつかの実施形態では、免疫複合体及び免疫融合体を、ＯＸ４０関連疾患又は病態を予防又は治療するために使用する。

医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体及び薬学的に許容可能な補助物質を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物を、医薬用キットに含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物を、診断キットなどのキットに含むことができる。

本明細書で使用されるとき、「医薬用担体」は、生理的に適合する何れか及び全ての溶媒、分散媒体、等張剤、吸収遅延剤、その他を含む。本発明に適した医薬用担体は、水及び、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、その他などの石油、動物、植物若しくは合成源のものを含む油類など、滅菌液体であり得る。医薬組成物を静脈投与する場合、水は好ましい担体である。特に注射用液のため、液体担体として生理食塩水、膵性デキストロース及びグリセロール溶液を使用することも可能である。

適切な医薬用賦形剤としては、でんぷん、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、プロピレン、ジオール、水、エタノール、その他が挙げられる。賦形剤の応用及びその使用のため、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ｃ．Ｏｗｅｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈｉｃａｇｏも参照。組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放剤、その他の形態であり得る。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン、その他などの標準的単体を含むことができる。

本発明は、ＯＸ４０若しくはその抗原結合性フラグメントと結合する１つ以上のモノクローナル抗体、又は核酸、ベクター若しくは宿主細胞、又は免疫複合体若しくは免疫融合体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物中の本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体、又はその抗原結合性フラグメント、核酸、ベクター若しくはその宿主細胞、又は免疫複合体、若しくは免疫融合体を、改良された導入、送達、耐容性、その他を提供するために、適切な医薬用担体、賦形剤及び医薬製剤中に使用される適切な別の同時投与される薬剤と共に製剤することができると理解されるべきである。

本明細書に記載されている抗ＯＸ４０抗体を含む医薬製剤を、好ましくは水性液剤又は凍結乾燥製剤の形態で、所望の純度を有する本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを、必要に応じて選択される１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と混合することにより製剤することができる。好例の凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号明細書に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号明細書及び国際公開第２００６／０４４９０８号パンフレットに記載されているものが挙げられ、後者は、ヒスチジン－酢酸緩衝剤を含む製剤を記載している。

本発明の医薬組成物又は製剤は、特定の疾病の治療に必要な１つ以上の他の有効成分、好ましくは、相互に悪影響を与えない補体活性を有するこれらの有効成分を含んでもよい。例えば、他の治療薬も含まれることが望ましい。いくつかの実施形態では、他の治療薬は、化学療法薬、放射線治療薬、サイトカイン、ワクチン、他の抗体、免疫調節薬又は他の生体高分子薬である。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸を含んでもよい。

方法及び使用
本発明は、ＯＸ４０関連疾患又は病態の予防、診断又は治療方法を提供する。方法は、抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合性フラグメント、又は免疫複合体若しくは免疫融合体又はこれを含む医薬組成物、又は本明細書に記載されている核酸、ベクター若しくは宿主細胞の有効量を、これを必要としている患者に投与することを含む。

１つの態様では、本発明は、対象におけるＯＸ４０関連疾患又は病態の予防又は治療のための薬物の製造又は製剤における、抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合性フラグメント、又は免疫複合体若しくは免疫融合体又はこれを含む医薬組成物の使用を提供する。

１つの態様では、本発明により提供される抗ＯＸ４０抗体、及びその抗原結合性フラグメント、並びにこれを含む医薬組成物を、対象におけるＯＸ４０関連疾患又は病態の予防又は治療のための治療薬として使用することができる。標準的方法を用いることにより特定された対象におけるＯＸ４０関連疾患のため、本発明に開示されている抗ＯＸ４０抗体、及びその抗原結合性フラグメント、並びにこれを含む医薬組成物又は免疫複合体若しくは免疫融合体、又は本明細書に記載されている核酸、ベクター若しくは宿主細胞を投与することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法及び使用は、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与すること又は手順を更に含む。いくつかの実施形態では、治療薬は、例えば、化学療法薬、放射線治療薬、サイトカイン、ワクチン、他の抗体、免疫調節薬又は他の生体高分子薬である。いくつかの実施形態では、治療手順は、手術；及び放射線療法、局部照射又は集光照射、その他を含む。

上記併用療法としては、併用投与（２つ以上の治療薬が同じ又は別々の製剤に含まれる）及び個別投与が挙げられ、本発明の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントの投与は、追加の治療薬及び／又はアジュバント及び／又は手順の投与前、投与と同時に、若しくは投与後に起こり得る。

いくつかの実施形態では、本発明のＯＸ４０関連疾患又は病態は、対象における異常なＯＸ４０発現、活性及び／又はシグナル伝達に関連する疾病又は病態を表し、がん、炎症及び自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連疾患又は病態において、ＯＸ４０をコードする核酸（レベル又は含有率）は増加するか、又はＯＸ４０発現は増加するか、又はＯＸ４０のタンパク質レベル若しくは活性は増加するか、又はＯＸ４０により媒介されるシグナル伝達は増加する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連疾患又は病態において、ＯＸ４０をコードする核酸（レベル又は含有率）は減少するか、又はＯＸ４０発現は減少するか、又はＯＸ４０のタンパク質レベル若しくは活性は減少するか、又はＯＸ４０により媒介されるシグナル伝達は減少する。

いくつかの実施形態では、疾病又は病態の治療は、核酸又はタンパク質レベルにおいてＯＸ４０を阻害することから、又はＯＸ４０とそのリガンドとの結合を遮断若しくはＯＸ４０媒介シグナル伝達を阻害することから利益を受けるだろう。

いくつかの他の実施形態では、疾病又は病態の治療は、核酸又はタンパク質レベルにおいてＯＸ４０の増加から、又はＯＸ４０媒介シグナル伝達の増強から利益を受けるだろう。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連疾患又は病態は、がんである。詳細には、がんとしては、固形腫瘍、乳がん、尿路上皮がん、メラノーマ、腎がん、卵巣がん、頭頸部がん、胃がん、肝がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、皮膚がん、中皮腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、前立腺がん、リンパ性白血病及び肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＯＸ４０関連がんを予防、診断又は治療するための抗体は、ＯＸ４０アゴニストである。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連疾患又は病態は、炎症及び／又は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０関連炎症及び／又は自己免疫疾患は、特発性皮膚炎、関節リウマチ、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、ＣＯＰＤ、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、潰瘍性大腸炎、強皮症、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）から選択される。好ましくは、ＯＸ４０関連炎症及び／又は自己免疫疾患を治療又は予防するための抗体は、ＯＸ４０アンタゴニストである。

いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、好ましくはより高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載されている疾病を患っている又は本明細書に記載されている疾病を患うリスクを有する個体）であってよい。１つの実施形態では、対象は、本明細書に記載されている疾病（例えば、がん）を患っている又は患うリスクを有する。特定の実施形態では、対象は、化学療法及び／又は放射線療法など、他の治療を受けている又は受けていた。

本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントを、経口、非経口、肺内及び鼻内投与を含む何れかの適切な方法で投与してよく、局所治療が必要な場合、病巣内投与することができる。非経口点滴としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。投与が短命又は長期であるかどうかに部分的に応じて、何れかの適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により投与を行うことができる。様々な投与レジメンは、本明細書において意図されており、単回又は様々な時点における反復投与、ボーラス投与、及びパルス注入が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、良好な医療行為に相応しい方法で製剤及び投与されるだろう。この場合に考えられる因子としては、治療される特定の疾病、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床症状、疾病の原因、薬物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び開業医に公知の他の因子が挙げられる。必要に応じて、抗体を、疾病の予防又は治療のために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤する。これらの他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、治療しようとする病態、又は治療方法、及び上記他の因子に依存する。

疾病の予防又は治療するため、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメント（単独又は１つ以上の追加の治療薬との併用で使用される場合）は、治療しようとする疾病の種類、抗体の種類、疾病の重症度及び経過、抗体が予防又は治療の目的であるかどうか、前の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応用並びに主治医の判断に応じて適切な投与量で投与されるだろう。抗体を、１回又は一連の治療にわたって患者に適切に投与する。

特定の実施形態では、本明細書で提供されている何れかの抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを使用して、生物サンプル中のＯＸ４０の存在を検出することができる。本明細書で使用されるとき、用語「検出」は、定量的又は定性的検出を含む。特定の実施形態では、生物サンプルは、血液、血清、又は生体起源の他の液体サンプルである。特定の実施形態では、生物サンプルは、細胞又は組織を含む。いくつかの実施形態では、生物サンプルは、過剰増殖又はがん性病変関連病変由来である。

１つの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントを使用して、例えば、本明細書に記載されている疾病の治療又は進行を、並びに個体における診断及び／又はその段階を評価（例えば、モニター）するため、がんなどのＯＸ４０関連疾患又は病態を診断することができる。特定の実施形態では、標識化された抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。標識としては、直接的に検出可能である抄紙機又は部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）、及び、例えば、酵素反応又は分子間相互作用により酵素又はリガンドなどの間接的に検出可能な部分が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書において、ＯＸ４０関連疾患を診断するためのキットを提供し、このキットは、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントを備える。

本明細書で提供されているいくつかの実施形態では、サンプルを、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合性フラグメントを用いた治療前に得る。いくつかの実施形態では、サンプルを、他の治療薬を用いた治療前に得る。いくつかの実施形態では、サンプルを、他の治療薬を用いた治療中又は治療後に得る。

本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態の何れもの組合せも包含する。特定の内容及び実施例は本発明の好ましい実施形態を例証するために記載されているが、単に例証し及び実施例として使用されるだけであると理解されるべきである。本発明は、当業者に明白である本発明の好ましい実施形態に基づいて修正された実施形態を更に包含する。全ての目的のため、引用を含む本明細書で引用されている全ての出版物、特許及び特許出願は、その全文の参照により本明細書に援用される。

実施例１ ハイブリドーマ由来抗体の調製及びスクリーニング
ＯＸ４０抗体を、ハイブリドーマ技術により得た。Ｆｃタグを有するヒトＯＸ４０細胞外ドメインを含む組換えＯＸ４０－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ ３３８８－ＯＸ）を、マウスを免疫化するための抗原として使用した。手短に言えば、Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイント完全又は不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合及び乳化されたＯＸ４０－Ｆｃで免疫化した。マウスを、１回目の免疫化（ロイント完全アジュバント）及び２回目の追加免疫（フロイント不完全アジュバント）に付し、並びに各追加免疫後に採血した。各回の追加免疫後にマウスから採取された血清の結合活性を、組換えヒトＯＸ４０－Ｈｉｓタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ ９９６９－ＯＸ）を用いてＥＬＩＳＡにより検出し、及びヒトＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞との血清の結合活性（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより構築）をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検出した。高血清力価を有するマウスを融合のために選択した。融合４日前、組換えＯＸ４０－Ｆｃタンパク質を、最終追加免疫のためにマウスに腹腔内注射した。融合の日に、マウスを安楽死させてから、マウスから脾臓を採取し、及びホモジナイズして単一細胞懸濁物を得た。マウス脾臓細胞を、電気融合装置を用いてマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣから購入）と融合した。融合細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンデオキシヌクレオチド、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ ２１０６００１７）を含む培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、及び３７℃で７日間培養した。上澄み中のハイブリドーマ細胞により分泌された抗体を、ＯＸ４０関連機能アッセイ（ヒトＯＸ４０に対する結合特異性及びＴ細胞の活性化における活性など）により同定した。陽性ハイブリドーマクローンを、単一又は複数回サブクローニングしてモノクローンを得た。スクリーニング後、３８Ｅ１１を最適ハイブリドーマクローンとして選択した（抗体が分泌され、それにより、３８Ｅ１１と呼ばれる）。

候補ハイブリドーマ細胞３８Ｅ１１を、拡大培養に付し、及び培養７～１０日後、上澄みを集め、遠心分離及びろ過して細胞及びデブリを取り出した。上澄みを、タンパク質Ａ精製カラム（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に通過させて、次いで、カラムを洗浄並びに０．０５Ｍトリス及び１．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含むバッファを用いて平衡化し、並びに次いで、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶離し；並びに溶離液を１Ｍトリス－ＨＣｌ（ｐＨ９）の９分の１体積で直ぐに中和し、並びに次いでＰＢＳバッファに透析した。そして、ハイブリドーマ由来抗体３８Ｅ１１を、更なる特性決定のために得た。

１．１ ＥＬＩＳＡによるＯＸ４０細胞外ドメインタンパク質に対する結合活性の検出
組換えヒトＯＸ４０－Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ ９９６９－ＯＸ）を、９６ウェルプレート上に被覆した。遮断後、段階希釈マウス血清又は抗体を添加及びインキュベートした。０．５％ツイーン２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を、インキュベーションのために添加し、及びプレートをＴＭＤで展開し、及びＯＤ４５０値をマイクロプレートリーダーにより読んだ。

表１に示されているように、得られたハイブリドーマ由来抗体３８Ｅ１１は、０．２７６ｎＭのＥＣ₅₀のヒトＯＸ４０タンパク質との高結合活性を有する。

１．２ ＦＡＣＳによる活性Ｔ細胞上のＯＸ４０との抗体の結合活性の検出
初代ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ １７－１４４０－０２）を用いた密度勾配遠心分離により健康なドナーから得られた全血から単離した。遠心分離後、中間層中の細胞を回収及びＰＢＳで３回洗浄してＰＢＭＣを得た。それから、ヒトＴ細胞を、説明書により推奨されたプロトコールに従って磁気ビーズ単離法によりＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ １３０－０９６－５３５）を用いて単離した。Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン二重抗生物質を含む）培地に再懸濁し、並びにＰＨＡ－Ｌ及びＩＬ－２（又はＣｏｎ－Ａ及びｈＩＬ－２）を２日刺激のために添加してＴ細胞からのＯＸ４０の発現を誘導した。活性化Ｔ細胞を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで１回洗浄し、段階希釈ＯＸ４０抗体を添加し、及び４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ ４０９３０４）（又はＰＥ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ ４０５３０７））及びＡＰＣ－ＣＹ７標識抗体ヒトＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ ３００５１８）を添加した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の面上のＯＸ４０抗体の結合を、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメトリーにより検出した。蛍光強度値のメジアンに対応するように曲線をフィットし、及びＥＣ₅₀を算出した。

表１に示されているように、ハイブリドーマ由来抗体３８Ｅ１１は、０．８ｎＭのＥＣ₅₀のヒト活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０との結合活性を有する。

１．３ 抗体のＴ細胞アゴニスト活性の決定
抗体のＴ細胞アゴニスト活性を、活性Ｔ細胞により放出されたサイトカインＩＦＮγの検出により評価する。手短に言えば、初代ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ １７－１４４０－０２）を用いた密度勾配遠心分離により健康なドナーから得られた全血から単離した。遠心分離後、中間層中の細胞を回収及びＰＢＳで３回洗浄してＰＢＭＣを得た。それから、ヒトＴ細胞を、説明書により推奨されているプロトコールに従って磁気ビーズ単離方法によりＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ １３０－０９６－５３５）を用いて単離した。Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン二重抗生物質を含む）培地に再懸濁した。抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ １６－００３７－８５）と段階希釈ＯＸ４０抗体との混合後、混合物を、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、及びプレートを３７℃で２時間被覆した。未結合抗体を、ＰＢＳで洗浄することにより取り除き、及び単離Ｔ細胞をウェルに添加した。上澄みを、培養３日後に集め、及び上澄み中のＩＦＮγ濃度を、説明書により推奨されている標準的検出方法に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、Ｃｔ ＳＩＦ５０）により検出した。

表１に示されているように、ハイブリドーマ由来抗体３８Ｅ１１は、１．４ｎＭのＥＣ₅₀でＴ細胞によるＩＦＮγ分泌を促進した。

表１は、一時的発現により得られた参照抗ＯＸ４０抗体１１Ｄ４及びＯＸ４０ｍＡｂ２４の機能活性も示す。

実施例２ ハイブリドーマ由来抗体のヒト化
２．１ ハイブリドーマ由来抗体の可変領域配列の決定
ハイブリドーマ配列の決定方法を用いて、ハイブリドーマクローン３８Ｅ１１の細胞を、拡大培養に付し；全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏから購入）で抽出し、及び抗体特異性プライマー（タカラ、ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ １^stＳｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いてＤＮＡに逆転写し；及びマウス免疫グロブリンＶ領域をコードする遺伝子フラグメントを、抗体特異性プライマーを用いて増幅及びクローン化した。可変領域配列を配列解析により得、３８Ｅ１１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１７に記載されている通りであり、及び３８Ｅ１１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１８に記載されている通りである。

２．２ ハイブリドーマ由来抗体のヒト化設計
抗体ヒト化のため、先ず、マウス抗体の可変領域の配列と高度に相同性であるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子を、ＰＤＢ抗体データベースで検索した。３８Ｅ１１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ、ヒト生殖系ＩＧＨＶ１－４６^*０１及びヒト生殖系ＩＧＫＶ４－１^*０１より高い配列相同性を有する。それから、可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列及びその正確な境界を、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより定義する。原則的に、マウス抗体の可変領域と高相同性を有するヒトＩＧＶＨ及びＩＧＶｋを、鋳型として選択し、ＣＤＲグラフティングをヒト化のために使用する。

ヒト化抗体における活性を維持するため、総じて、可変領域及び周囲のフレームワーク領域のアミノ酸配列も、コンピュータシミュレーション技術及び分子ドッキングを用いることにより解析し、及びこれらの空間３Ｄ結合モードを調査する。静電力、ワンデルワールス力、親水性及び疎水性、並びにエントロピーの算出により、ＯＸ４０と相互作用又は空間構造を維持、及び選択されたヒト抗体遺伝子フレームワーク上にグラフトバックし得る個々の候補抗体配列の主要残基を解析する。これに基づいて、確保しなければならないフレームワーク領域のアミノ酸位置をマークし、及び、次いで、ヒト化抗体を合成する。３８Ｅ１１抗体の重鎖可変領域における７部位を、逆変異：Ｖ２０Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｖ７９Ａ及びＴ９１Ｓのために選択した。逆変異の番号及び配置に従って、それぞれ、４つの異なるヒト化重鎖ＶＨ１（配列番号２）、ＶＨ２（配列番号３）、ＶＨ３（配列番号４）、及びＶＨ４（配列番号５）を設計した。３８Ｅ１１抗体の軽鎖可変領域における３部位を、逆変異：Ｍ４Ｌ、Ｖ６２Ｉ及びＬ８２Ｖのために選択し、及び、それぞれ、４つの異なるヒト化軽鎖ＶＬ１（配列番号７）、ＶＬ２（配列番号８）、ＶＬ３（配列番号９）、及びＶＬ４（配列番号１０）を設計した。したがって、ヒト化３８Ｅ１１抗体Ｈｕ３８Ｅ１１及びそのバリアントＨｕ３８Ｅ１１－ｖ１、Ｈｕ３８Ｅ１１－ｖ２、Ｈｕ３８Ｅ１１－ｖ３及びＨｕ３８Ｅ１１－ｖ４を設計及び更に特性決定した。各抗体に含まれるアミノ酸配列を、表２及び３に示す。

２．３ ヒト化抗体の発現
ハイブリドーマ由来抗体３８Ｅ１１、又はそのヒト化配列から誘導された可変領域を増幅及び発現されたプラスミドを得るためにヒトＩｇＧ定常領域を含むベクターにクローン化した。これらの抗体の重鎖定常領域を、ヒトＩｇＧの何れかのサブタイプ（ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号２１に記載されている通りであり、及びヒトＩｇＧ２の重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号２２に記載されている通りであるなど）又はそのバリアントから誘導することができる。しかしながら、特に指定されない限り、Ｈｕ３８Ｅ１１の重鎖定常領域及びそのバリアントは、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域の配列と同一であった。２９３細胞を、重鎖及び軽鎖を含む発現ベクターでコトランスフェクトした。３７℃で４～６日間培養後、上澄みを集め、及び、上記方法に従って、組換え抗体を、抗体の更なる特性決定のためタンパク質Ａアフィニティー精製により得た。

実施例３ ＦＡＣＳによる活性Ｔ細胞上のＯＸ４０とのヒト化抗体の結合活性の検出
前の実施例１．２に記載されている検出方法に従って、ＦＡＣＳを使用して活性Ｔ細胞上のＯＸ４０とのヒト化抗体の結合活性を分析した。

結果：表４に示されているように、ヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１及びそのバリアントは、活性ヒトＴ細胞の面上のＯＸ４０との優れた結合活性を示した。

実施例４ ヒト化抗体のＴ細胞アゴニスト活性の決定
前の実施例１．３に記載されている方法に従って、Ｔ細胞上のヒト化抗体のアゴニスト活性を、抗体の存在下活性化Ｔ細胞により放出された炎症性サイトカインＩＦＮγの検出により評価した。

表５に示されているように、ヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１及びそのバリアントは、活性化Ｔ細胞がＩＦＮγを放出するように効果的に促進する、すなわち、ヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１及びそのバリアントは、Ｔ細胞アゴニスト活性を有する。参照抗体ＯＸ４０ｍＡｂ２４と比較して、ヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１及びそのバリアントは、より低いＥＣ₅₀値（Ｔ細胞がＩＦＮγを放出するように促進する活性に関する尺度）を示し、これは、より有意なアゴニスト活性を示す。

実施例５ ＢｉａｃｏｒｅによるヒトＯＸ４０とのヒト化抗体の結合活性の検出
Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定により結合速度パラメータを決定する。この技術を使用して、抗体と抗原との結合（ｋ_a）及び解離（ｋ_d）の微視的速度定数を検出した。ｋ_a値及びｋ_d値に基づいて、抗原に対する抗体の親和性値を得る。Ｂｉａｃｏｒｅ装置及び試薬の両方をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。詳細には、抗ヒトＦｃ抗体を、ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。発現された抗体を含む上澄み又は精製抗体を移動相バッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ツイーン２０、ｐＨ７．４）に希釈し、及び抗ヒトＦｃ抗体で被覆されたＣＭ５チップを通して流した。それから、段階希釈ヒトＯＸ４０－Ｈｉｓ融合タンパク質は検出チップを通って流れて抗体に対する抗原の結合を測定し、及び、次いで、移動相バッファはチップを通って流れて抗体からの抗原の解離を検出した。抗原及び抗体の結合及び解離シグナルデータを異なる濃度において収集、及び１：１ラングミュアモデルにフィットして抗原と抗体との親和性を算出した。

表６に示されているように、Ｈｕ３８Ｅ１１は、２．３６Ｅ－０９（Ｍ）のＫ_D値の高親和性でヒトＯＸ４０と結合する。

実施例６ Ｔ細胞上のヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１のアゴニスト活性
前の実施例１．３に記載されている方法に従って、Ｔ細胞上のＩｇＧ２の抗体サブタイプを用いたＨｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ２）のアゴニスト活性を、Ｔ細胞により放出された炎症性サイトカインＩＦＮγの検出により評価した。

結果：図１に示されているように、プレートを抗体で被覆した条件下、Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ２）は、参照抗体１１Ｄ４（ＥＣ₅₀＝５．３ｎＭ）より低い１．６ｎＭのＥＣ₅₀のＴ細胞アゴニスト活性も示した。

実施例７ ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合に対するヒト化抗体の遮断効果
この実験では、ＥＬＩＳＡ法を使用して、ＯＸ４０とそのリガンドＯＸ４０Ｌとの結合の遮断において抗体Ｈｕ３８Ｅ１１の活性を決定した。手短に言えば、ＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ ３３８８－ＯＸ）をＰＢＳで希釈し、次いで、９６ウェルプレートに添加し、及びプレートを４℃で一夜被覆した。プレートを、０．５％ツイーン２０を含むＰＢＳで３回洗浄して未結合タンパク質を除去し、次いで、プレートを、室温において１時間２００μｌで１％ＢＳＡを含むＰＢＳの添加により遮断した。０．５％ツイーン２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、段階希釈抗ＯＸ４０抗体を１００μｌで９６ウェルプレートに添加、及び室温で１時間インキュベートした。プレートを、０．５％ツイーン２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。それから、５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＯＸ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ １０５４－ＯＸ）を添加、及び室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄後、ビオチン標識抗ＯＸ４０Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ ＢＡＦ１０５４）を添加、及び室温で１時間インキュベートし、次いで、プレートを洗浄し、及び、次いで、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ ＤＹ９９８）を添加及び室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した。２００μｌ ＴＭＢ発色溶液を、発色のために各ウェルに添加し、及び反応を、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄で停止した。マイクロプレートリーダーにより、Ｏ．Ｄ．値を、４５０ｎｍで検出し、及びバックグラウンドＯ．Ｄ．値を５７０ｎｍで測定した。

図２に示されているように、Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）は、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合を遮断し、９０％の最大阻害速度では、参照抗体ＧＢＲ８３０及びＯＸ４０ｍＡｂ２４の５０％の最大阻害速度より高かった。Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）及びＧＢＲ８３０のＩＣ₅₀値は、おおよそ０．３ｎＭであり、及びＯＸ４０ｍＡｂ２４のＩＣ₅₀値は、約１．２ｎＭであった。

実施例８ ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌ媒介Ｔ細胞活性化に対するヒト化抗体の遮断効果
初代ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ １７－１４４０－０２）を用いた密度勾配遠心分離により健康なドナーの全血から単離した。中間層を回収及びＰＢＳで３回洗浄してＰＢＭＣを得た。それから、初代ヒトＴ細胞を、説明書により推奨されている方法に従って磁気ビーズを用いてＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ １３０－０９６－５３５）により単離した。Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン二重抗生物質を含む）培地に再懸濁した。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ １６－００３７－８５）を、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加、及び３７℃で２時間被覆した。未結合抗体を、ＰＢＳで洗浄することにより除去した。段階希釈ＯＸ４０抗体を、６６４ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＯＸ４０Ｌ（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ １０５４－ＯＸ）と混合した。混合物を被覆された９６ウェルプレートに添加し、及び単離されたＴ細胞をこのウェルに添加及び３日間培養し、及び、次いで、上澄みを集めた。上澄み中のＩＦＮγ濃度を、説明書により推奨されている標準的検出方法に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ ＳＩＦ５０）により検出した。

ＯＸ４０Ｌ－ＯＸ４０相互作用を遮断するＨｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）の機能実験では：プレートを抗ＣＤ３抗体で被覆し、及びＯＸ４０の天然リガンドとしてＯＸ４０Ｌを添加してＴ細胞を刺激し、及び同時に、遊離抗ＯＸ４０抗体を、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との結合により誘導される機能に対する抗体の遮断効果を検出するために、培養系に添加した。プレートを抗ＯＸ４０抗体で被覆しなかったので、抗ＯＸ４０抗体分子はＴ細胞を刺激することができず、架橋の非存在下でＩＦＮγを分泌した。加えて、抗ＯＸ４０抗体は、細胞面上でＯＸ４０と結合及びＯＸ４０ＬとＯＸ４０との結合を遮断し、それにより、Ｔ細胞によるＩＦＮγのＯＸ４０Ｌ誘導分泌を阻害した。

図３に示されている結果に従って、抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）は、より高濃度においてＯＸ４０Ｌにより刺激されたＩＦＮγの分泌を阻害することができ、ＯＸ４０ＬによるＴ細胞活性化時の抗体の遮断効果を示す。ＧＢＲ８３０と比較して、Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）は、ＯＸ４０Ｌ誘導Ｔ細胞活性化のより強い遮断活性を有し、及びより低いＩＣ₅₀値（Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）については０．３ｎＭ、及びＧＢＲ８３０については１．１ｎＭ）を有した。

実施例９ Ｔ細胞アゴニスト活性に対するヒト化抗体のＦｃ領域の効果
異なるＦｃ領域とのＨｕ３８Ｅ１１のＴ細胞アゴニスト活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいてＮＦ－κＢ媒介転写活性化に対する抗体の促進効果の測定により評価することができる。ヒトＯＸ４０を過剰発現し及びＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）を有する組換えジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＯＸ４０－ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ；Ｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒから購入）を構築した。抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ １６－００３７－８５）を、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加、及び４℃で一夜被覆した。未結合抗体を、ＰＢＳで洗浄することにより除去した。それから、Ｊｕｒｋａｔ－ＯＸ４０－ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ細胞及びラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１：１の比で混合し、及び、次いで、被覆された９６ウェルプレートに添加し、及び、次いで、段階希釈Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１）、Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）又はｈＩｇＧ１を添加した。インキュベーション５時間後、ルシフェラーゼの相対量を、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）検出試薬を用いて検出した。

この実験では、Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１）は、ラージ細胞の面上のＦｃγＲ受容体による架橋によりＯＸ４０の下流シグナル伝達を開始した。これは、ＮＦ－κＢの制御下レポーター遺伝子の発現を引き起こした（ＥＣ₅₀＝０．７０ｎＭ）。対称的に、Ｎ２９７Ａ変異が原因で、Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）は、ＦｃγＲ受容体と結合することができず、及び架橋することができず、及び、次いで、ＯＸ４０の下流シグナル伝達をうまく活性化しなかった。加えて、ラージ細胞の面上で発現されたＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合の遮断により、抗体は、ＮＦ－κＢの制御下ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現に対する有意な阻害効果を示した（ＩＣ₅₀＝０．２０ｎＭ）（図４に示されている）。

実施例１０ Ｂ１６Ｆ１０皮下異種移植腫瘍モデルにおけるヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１の抗腫瘍活性
本発明の抗体の抗腫瘍活性を試験するため、Ｂ１６－Ｆ１０皮下腫瘍モデルを、ヒトＯＸ４０を発現するＣ５７ＢＬ／６－Ｔｎｆｒｓｆ４^{em1Clin(hTBFRSF4)}トランスジェニックマウスに確立した。

マウスメラノーマ細胞Ｂ１６－Ｆ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－６４７５（商標））を、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。腫瘍細胞を、ＲＰＭＩ １６４０に懸濁及び雌トランスジェニックマウス（Ｊｉａｎｇｓｕ ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）の右脇腹に１×１０⁵細胞／マウスで皮下移植した。

腫瘍細胞播種の日（１日目）に、マウスを、その体重に応じて３群、第１群に１２マウス（ｈ－ＩｇＧ２）、第２群に１３マウス（１１Ｄ４（ＩｇＧ２））、及び第３群に１３マウス（Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ２））に無作為に分けた。抗体をＤＰＢＳで希釈、及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で単回腹腔内注射により投与した。腫瘍体積（腫瘍体積＝０．５×長径×短径²）、及びマウスの体重を定期的に測定した。投与後１５日目及び１６日目の抗体の腫瘍阻害率を算出した。

腫瘍阻害率の算出式は次の通りである：［（コントロール群における腫瘍体積－治療群における腫瘍体積）／コントロール群における腫瘍体積］×１００％。マウスの相対的体重の算出式は次の通りである：（測定の日のマウスの体重－グルーピング時のマウスの体重）×１００％。

結果：１０ｍｇ／ｋｇの用量において、１１Ｄ４（参照抗体）及びＨｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ２、本発明の抗体）は、それぞれ、３３．２％及び４８．１％の腫瘍増殖の阻害率を示した。加えて、試験の経過中、各群におけるマウスの体重は吸息に増加し、及び異常な挙動は観察されず、抗体は動物により充分に良好な耐容性を示した。

実施例１１ ヒト化抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）の抗免疫拒絶活性
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルを、健康なボランティアから免疫不全ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃ^em26Cd52Ｉｌ２ｒｇ^em26Cd22／Ｎｊｕ（ＮＣＧ）マウスへのヒト初代末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）の移植により確立、及び使用して本発明の抗体の抗免疫拒絶活性を試験した。

初代ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを用いた密度勾配遠心分離により健康なドナーから得られた全血から単離し、及びＰＢＭＣをリン酸バッファ（ＰＢＳ）に懸濁した。

ＰＢＭＣ移植前の日（－１日目）に、マウスを、その体重に応じて７群に無作為に分けた。群を表７に示した。移植の日（０日目）に、全マウスに、１．５Ｇｙ ＴＢＩ（全身照射）の単一線量で１３７Ｃｓγ線を照射し、次いで、ＰＢＳで希釈された抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）及びＧＢＲ８３０を、１ｍｇ／ｋｇの用量及び５ｍＬ／ｋｇの体積で尾から毎週静脈内に与え、及びマウスは、尾静脈内に０．２ｍＬ／マウスで２．５×１０⁷細胞／ｍＬのＰＢＭＣの単回注射を受けた。マウスの生存率を毎日モニターし、及びマウスの体重を定期的に測定した。安楽死のためエンドポイントは、相対的体重損失が２０％以下まで達した場合であり、及び生存時間を記録した。

マウスの相対的体重の算出式は次の通りである：（測定の日のマウスの体重－グルーピング時のマウスの体重）×１００％。

実験結果を図５に示す。この実験では、モデルコントロール群（ｈＰＢＭＣ＋ｈＩｇＧ１群）からの全マウスは４８日目で死に、３２．５日の生存時間メジアンを有し；１ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体Ｈｕ３８Ｅ１１（ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ）で治療された全マウスは実験の６４日目まで生存し、生存時間のメジアンは算出することができず、及びモデルコントロール群（ｈＰＢＭＣ＋ｈＩｇＧ１群）と比較して有意な差があった（^**：ｐ＜０．０１）。１ｍｇ／ｋｇで陽性参照抗体ＧＢＲ８３０で治療されたマウスの生存率は、実験の６４日目で６６．７％であり、生存時間のメジアンは算出することができず、及びモデルコントロール群と比較して統計的差がなかった。

本発明の態様の一部を以下に記載する。
１．単離された抗ＯＸ４０抗体であって、前記抗体は、
（１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３であって、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＨＣＤＲ３は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と；
（２）軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３であって、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＬＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と；並びに
（３）ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａである、Ｆｃ領域バリアントと、
を含む、抗体。
２．重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、項目１記載の抗体。
３．完全長抗体である、項目１又は２記載の抗体。
４．１０ｎＭ未満のヒトＯＸ４０に対する結合親和性（Ｋ_D）を有する、項目１から３の何れかに記載の抗体。
５．ＯＸ４０抗体アンタゴニストであり、及びＯＸ４０媒介シグナル伝達を遮断するための活性を有する、項目１から４の何れかに記載の抗体。
６．前記Ｆｃ領域バリアントとＦｃγＲとの結合を低減又は排除する、項目５記載の抗体。
７．項目１から６の何れかに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
８．項目７記載の１つ以上の核酸を含む、組換えベクター又は発現ベクターであって、項目１から６の何れかに記載の抗体の組換え産生に適している、組換えベクター又は発現ベクター。
９．項目８記載の１つ以上の組換えベクター又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
１０．項目１から６の何れかに記載の抗体を含む、免疫複合体又は免疫融合体。
１１．項目１から６の何れかに記載の抗体、項目７記載の核酸、項目８記載のベクター、項目９記載の宿主細胞、又は項目１０記載の免疫複合体若しくは免疫融合体を含み、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を必要に応じて含む、医薬組成物。
１２．ＯＸ４０関連疾患又は病態を治療又は予防するための医薬品製造における、項目１から６の何れかに記載の抗体、項目７記載の核酸、項目８記載のベクター、項目９記載の宿主細胞、又は項目１０記載の免疫複合体若しくは免疫融合体の使用。
１３．前記ＯＸ４０関連疾患又は病態は、移植片対宿主病などの炎症及び／又は自己免疫疾患である、項目１２記載の使用。
１４．ＯＸ４０関連疾患又は病態の治療方法又は予防方法であって、前記方法は、項目１から６の何れかに記載の抗体、項目７記載の核酸、項目８記載のベクター、項目９記載の宿主細胞、又は項目１０記載の免疫複合体若しくは免疫融合体の有効量を対象に投与することを含む、方法。
１５．前記ＯＸ４０関連疾患又は病態は、移植片対宿主病などの炎症及び／又は自己免疫疾患である、項目１４記載の方法。
１６．サンプル中のＯＸ４０の検出方法であって、前記方法は：
（ａ）前記サンプルを、項目１から６の何れかに記載の抗体又は項目１０記載の免疫複合体若しくは免疫融合体と接触させることと；及び
（ｂ）前記抗体又は免疫複合体若しくは免疫融合体と、ＯＸ４０タンパク質との複合体の生成を検出することと、
を含む、方法。

Claims (17)

1. 単離された抗ＯＸ４０抗体であって、前記抗体は、
   （１）重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３であって、前記ＨＣＤＲ１は配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＨＣＤＲ３は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と；
   （２）軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３であって、前記ＬＣＤＲ１は配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＬＣＤＲ３は配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と；並びに
   （３）ヒトＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａである、Ｆｃ領域バリアントと、
   を含む、抗体。
2. 重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＶＬは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体。
3. 完全長抗体である、請求項１又は２記載の抗体。
4. １０ｎＭ未満のヒトＯＸ４０に対する結合親和性（Ｋ_D）を有する、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
5. ＯＸ４０抗体アンタゴニストであり、及びＯＸ４０媒介シグナル伝達を遮断するための活性を有する、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
6. 前記Ｆｃ領域バリアントとＦｃγＲとの結合を低減又は排除する、請求項５記載の抗体。
7. 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と；
   配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）と；及び
   Ｎ２９７Ａ変異を含む配列番号２１に記載のヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域と、
   を含む全長抗体である、請求項１に記載の抗体。
8. 請求項１から７の何れか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
9. 請求項８記載の１つ以上の核酸を含む、組換えベクター又は発現ベクターであって、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体の組換え産生に適している、組換えベクター又は発現ベクター。
10. 請求項９記載の１つ以上の組換えベクター又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
11. 請求項１から７の何れか一項に記載の抗体を含む、免疫複合体又は免疫融合体。
12. 請求項１から７の何れか一項に記載の抗体、請求項８記載の核酸、請求項９記載のベクター、請求項１０記載の宿主細胞、又は請求項１１記載の免疫複合体若しくは免疫融合体を含み、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を必要に応じて含む、医薬組成物。
13. ＯＸ４０関連疾患又は病態を治療又は予防するための医薬品製造における、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体、請求項８記載の核酸、請求項９記載のベクター、請求項１０記載の宿主細胞、又は請求項１１記載の免疫複合体若しくは免疫融合体の使用。
14. 前記ＯＸ４０関連疾患又は病態は、移植片対宿主病などの炎症及び／又は自己免疫疾患である、請求項１３記載の使用。
15. 請求項１から７の何れか一項に記載の抗体、請求項８記載の核酸、請求項９記載のベクター、請求項１０記載の宿主細胞、又は請求項１１記載の免疫複合体若しくは免疫融合体を含む、ＯＸ４０関連疾患又は病態の治療方法又は予防方法における使用のための組成物。
16. 前記ＯＸ４０関連疾患又は病態は、移植片対宿主病などの炎症及び／又は自己免疫疾患である、請求項１５記載の組成物。
17. サンプル中のＯＸ４０の検出方法であって、前記方法は：
    （ａ）前記サンプルを、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体又は請求項１１記載の免疫複合体若しくは免疫融合体と接触させることと；及び
    （ｂ）前記抗体又は免疫複合体若しくは免疫融合体と、ＯＸ４０タンパク質との複合体の生成を検出することと、
    を含む、方法。