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JP7740025B2 - 細胞の高密度培養方法 - Google Patents

細胞の高密度培養方法

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JP7740025B2 JP2021571195A JP2021571195A JP7740025B2 JP 7740025 B2 JP7740025 B2 JP 7740025B2 JP 2021571195 A JP2021571195 A JP 2021571195A JP 2021571195 A JP2021571195 A JP 2021571195A JP 7740025 B2 JP7740025 B2 JP 7740025B2
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Description

本発明は、細胞の高密度培養法に関し、詳細には、コリンの添加による、細胞の高密度培養法に関する。
細胞を用いた再生医療技術は、これまでに治療することが困難であった様々な疾病や損傷を治療し得る手段の一つとして、近年、非常に注目されている。再生医療には大量の細胞を必要とするため、細胞を効率良く培養する方法の開発が意欲的に進められている。例えば、特許文献１には、培地中で幹細胞をＲＯＣＫ阻害剤で処理することを含む、幹細胞の培養方法が報告されている。また、本発明者らも２０１８年にグルコースおよび／または特定のアミノ酸を培地に添加することによる、動物細胞の高密度培養法等を報告している（特許文献２）。
特開２００８－０９９６６２号公報 特願２０１８－１８４３５２号
特許文献２に記載の方法は、高密度培養法としては非常に優れた方法の一つであるが、今回、本発明者らは当該方法を再検討し、さらに好ましい高密度培養法の開発を試みた。
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、細胞の高密度培養時に、様々な培地成分のなかでもコリンを追加添加するだけで極めて容易に細胞増殖を促進できる事実を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］コリンを０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで培地に添加することを含む、細胞の培養方法。
［２］細胞培養が浮遊培養である、［１］記載の方法。
［３］高密度培養用である、［１］または［２］記載の方法。
［４］培養される細胞の培地中の細胞密度が６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、［３］記載の方法。
［５］細胞が多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、［１］～［４］のいずれか記載の方法。
［６］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、［５］記載の方法。
［７］細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、［１］～［４］のいずれか記載の方法。
［８］コリンを１５ｍｇ／Ｌ以上含む、細胞培養培地組成物。
［９］浮遊培養用である、［８］記載の培地組成物。
［１０］高密度培養用である、［８］または［９］記載の培地組成物。
［１１］浮遊培養される細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、［１０］記載の培地組成物。
［１２］細胞が、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、［８］～［１１］のいずれか記載の培地組成物。
［１３］多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、［１２］記載の培地組成物。
［１４］細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、［８］～［１３］のいずれか記載の培地組成物。
本発明によれば、高密度培養下において、容易に細胞増殖を促進することができる。
図１は、ｉＰＳ細胞の増殖に対するコリン濃度の影響（ｎ＝１）を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
定義
本明細書において、「浮遊培養」とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態で行われる細胞培養方法をいう。本発明において、浮遊培養は、液体培地に対する外部からの圧力や振動、または、当該液体培地中での振とうや回転操作を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。
本明細書において、「高密度培養」とは、一般的な細胞培養において想定される細胞密度と比較して高い細胞密度での培養をいう。高密度の基準は、培養方法（接触培養／浮遊培養等）や多能性幹細胞の種類等によっても異なり得るが、例えば、ｉＰＳ細胞を浮遊培養する場合、本明細書においては６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の密度での培養を高密度培養と定義する。
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書において、「成体幹細胞（体性幹細胞とも称される）」とは、特定の組織（器官）を構成する細胞に分化し得る能力を有する細胞を意味する。成体幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、表皮幹細胞、間葉系幹細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書において、「前駆細胞」とは、前述した多能性幹細胞や成体幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞を意味する。
１．細胞の培養方法
本発明は、コリンを０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで培地に添加することを含む、細胞の培養方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
本発明の方法に用いられるコリンは細胞培養に用いられるグレードのものであれば特に限定されず、市販品を用いればよい。好適なコリンとしては、塩化コリン、重酒石酸コリン、重炭酸コリン、コリンリン酸塩、クエン酸二水素コリン等が挙げられるが、好ましくは塩化コリンである。
本発明の方法において、培地に添加されるコリンの量（遊離体に換算した含有量）は、通常０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは０．１～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ（例えば、
［１］１～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、８０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、９０～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［２］１～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、８０～９０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［３］１～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、７０～８０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［４］１～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、６０～７０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［５］１～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、５０～６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［６］１～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、４０～５０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［７］１～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、３０～４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［８］１～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、２０～３０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ；
［９］１～２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、１０～２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）
とすることができる。
本発明の方法において用いられる培地は特に限定されず、培養する細胞種に適したものを使用することができる。かかる培地は自体公知の方法により調製することもできるし、市販品を用いてもよい。
市販の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、α改変型イーグル最小必須培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（αＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ）、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。
また、特に幹細胞培養用の培地としては、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨＥＳｃＧＲＯ（商標） Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳ ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（商標） Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標） ｈＥＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｓｒａｅｌ Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標） ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、ＡＦ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標） ｈＥＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｓｒａｅｌ Ｂｅｉｔ－Ｈａｅｍｅｋ社）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標） ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ－ＦＸ培地、ＣＤＭ培地、ＤＥＦ－ＣＳ ５００ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ ３Ｄ Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。
また、これらの培地に、さらに細胞増殖に好ましい成分を添加することもできる。かかる成分としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖；アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等のアミノ酸；アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質；グリシルグリシルグリシン、大豆ペプチド等のペプチド；血清；コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ群（チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド等）、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン；オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸等の脂肪酸；コレステロール等の脂質；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩；亜鉛、銅、セレン等の微量元素；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＥＳ））、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ））、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ－［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ））等の緩衝剤；アンホテリシンＢ、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質；Ｔｙｐｅ Ｉ コラーゲン、Ｔｙｐｅ ＩＩ コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン等の細胞接着因子および細胞外マトリックス成分；インターロイキン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－α、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アクチビンＡ等のサイトカインおよび増殖因子；デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、インスリン等のホルモン等が挙げられ、培養する細胞の種類に応じて適切な成分を選択して用いることができる。
好ましい一態様において、Ｄ－グルコースおよび５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（またはシスチン）、メチオニン、アルギニン）を追加で培地に添加してもよい。
グルコース（またはその塩）は、グルコースの濃度に換算して通常０．１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～９００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～２００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ～２０ｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように本発明の培地に添加することができる。
また、５種のアミノ酸（トリプトファン、セリン、システイン（シスチン）、メチオニンおよびアルギニン）は、培地に対し、トリプトファンの濃度（遊離体のトリプトファンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、セリンの濃度（遊離体のセリンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～４２５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、システインもしくはシスチンの濃度（遊離体のシステインに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２８００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、メチオニンの濃度（遊離体のメチオニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～５５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、アルギニンの濃度（遊離体のアルギニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～１５００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ～２００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように本発明の培地に添加することができる。
本発明の方法を適用し得る細胞種は特に限定されない。かかる細胞種としては、例えば、精子や卵子等の生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
一態様において、細胞は、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞であり得るが、これらに限定されない。
一態様において、細胞は多能性幹細胞であり得る。この場合、ｂＦＧＦを追加で培地に添加することも好ましい。
一態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはｉＰＳ細胞であり、好ましくはｉＰＳ細胞であり得る。また、成体幹細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、表皮幹細胞、または間葉系幹細胞であり得るが、これらに限定されない。尚、多能性幹細胞、成体幹細胞、および前駆細胞の由来も特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。
一態様において、細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であり得る。ｉＰＳ細胞由来の細胞とは、ｉＰＳ細胞を、自体公知の方法を用いて、分化させる途中の段階にある細胞、または、分化させた細胞を意味する。
本発明の方法において、培養条件は特に限定されず、細胞種、細胞密度、培養方法（接着培養／浮遊培養等）等に応じて自体公知の方法を選択すればよい。例えば、培養温度は、通常２５℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃であり得る。二酸化炭素濃度としては、通常４体積％～１０体積％、好ましくは４体積％～６体積％であり得る。酸素濃度としては、通常１体積％～２５体積％、好ましくは４体積％～２０体積％であり得る。
２．細胞培養培地組成物
本発明は、コリンを１５ｍｇ／Ｌ以上含む、細胞培養用培地組成物（以下、「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。
本発明の培地組成物は、一般的な細胞用の基礎培地に高濃度のコリンを添加することに特徴がある。
本願出願日時点において、細胞を培養するための培地に含有されるコリン量は、多くても１４ｍｇ／Ｌ程度である。コリンをこれ以上の濃度で添加しても、細胞の増殖に対する作用が一定であると考えられているためである。しかし、本発明の培地組成物が含有するコリンの濃度の下限は、通常１５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１７ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１８ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２０ｍｇ／Ｌであり得、これ以上であってもよい。また、上限は特に限定されないが、コスト等の観点から、通常１００００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは５０ｍｇ／Ｌであり得る。一態様において、本発明の培地組成物のコリンの濃度は、通常１５ｍｇ／Ｌ～１００００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１６ｍｇ／Ｌ～１０００００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１７ｍｇ／Ｌ～１００００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１８ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２０ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌであり得る。
本発明の培地組成物を調製するうえで用いられる細胞用の培地は、培養する細胞に即して、自体公知の方法により調製したものであってもよく、また、市販品であってもよい。
本発明の培地組成物の製造に用い得る培地、さらに本発明の培地組成物に、さらに添加し得る成分、本発明の培地組成物を適用し得る細胞種は、「１．細胞の培養方法」において説明したものと同様である。
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例
以下の実施例では、コリンによる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の増殖効果を評価した。ｉＰＳ細胞として、ｉＰＳアカデミアジャパン社より購入した１２１０Ｂ２株を用いた。また、ｉＰＳ細胞用培地として、市販のＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ（味の素社）を用いた。
［実施例１］浮遊培養系を用いたｃｈｏｌｉｎｅ強化によるｉＰＳ細胞の増殖促進効果
ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ： ＢＷＶ－Ｓ０３Ａ）を用いて、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ＋１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ： ０３４－２４０２４）にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ＣＯ２濃度＝５％、攪拌速度＝１２０ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。播種２日目に７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎで交換した。播種３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３ＮまたはＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ＋１０ｍｇ／Ｌ Ｃｈｏｌｉｎｅ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ （富士フイルム和光純薬社）に再懸濁し、マイクロバイオリアクターのａｍｂｒ１５（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ：００１－０８８１）に移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続けた。７割の培地をＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３ＮまたはＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３Ｎ＋１０ｍｇ／Ｌ Ｃｈｏｌｉｎｅ Ｃｈｌｏｒｉｄｅで１日１回交換し、さらに両群に４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ Ｔｒｐ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ Ｓｅｒ（味の素社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ Ｃｙｓ塩酸塩（日本プロテイン社）、４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ Ｍｅｔ（味の素社）、１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ Ａｒｇ（味の素社）、４ｇ／Ｌ／ｄａｙ Ｄ－グルコース（ナカライテスク社：１６８０６－２５）を添加した。培養８日目に生細胞数を生死細胞オートアナライザーのＶｉ－ＣＥＬＬＴＭ ＸＲ（ベックマン・コールター社）を用いて測定した。
ｉＰＳ細胞の増殖に対するコリンの影響を１連にて検証した結果を図１に示す。コリンの添加により、細胞増殖促進効果を示す結果が得られた。
本発明によれば、非常に簡便且つ安価な方法により、極めて効率の良い高密度培養を行うことができる。
本出願は、日本で出願された特願２０２０－００３９５９（出願日：２０２０年１月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. コリンを０．０１～１００００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙで培地に添加して細胞を高密度培養することを含む、細胞の培養方法であって、該細胞が多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、方法。
  2. 細胞培養が浮遊培養である、請求項１記載の方法。
  3. 培養される細胞の培地中の細胞密度が６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  6. コリンを１５ｍｇ／Ｌ以上含む、高密度培養用の細胞培養培地組成物であって、細胞が、多能性幹細胞、成体幹細胞、または前駆細胞である、培地組成物。
  7. 浮遊培養用である、請求項６記載の培地組成物。
  8. 浮遊培養される細胞の細胞密度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項７記載の培地組成物。
  9. 細胞がｉＰＳ細胞である、請求項６～８のいずれか一項記載の培地組成物。
  10. 細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項６～８のいずれか一項記載の培地組成物。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119955716B (zh) * 2025-04-10 2025-07-25 深圳泰华赛尔生物科技有限公司 一种脂肪来源极小类胚胎样干细胞的培养基与培养方法、应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524826A (ja) 2010-04-26 2013-06-20 ノバルティス アーゲー 改良型細胞培養培地
JP2016026490A (ja) 2014-06-27 2016-02-18 国立大学法人 千葉大学 多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990003430A1 (en) * 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB2251249B (en) * 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2015042356A1 (en) * 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
CN114807010B (zh) * 2015-04-01 2024-11-29 勃林格殷格翰国际公司 细胞培养基
CN104962516A (zh) * 2015-07-20 2015-10-07 龚伟 一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基
GB201700504D0 (en) * 2017-01-11 2017-02-22 Francis Crick Inst Ltd Composition
JP2018184352A (ja) 2017-04-24 2018-11-22 アサマ化成株式会社 抗体を有効成分とするｔｎｆ産生抑制作用組成物
JP7139719B2 (ja) 2018-06-26 2022-09-21 富士通株式会社 情報処理装置、演算処理装置及び情報処理装置の制御方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524826A (ja) 2010-04-26 2013-06-20 ノバルティス アーゲー 改良型細胞培養培地
JP2016026490A (ja) 2014-06-27 2016-02-18 国立大学法人 千葉大学 多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法

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