JP7688150B2 - 抗ＯＸ４０Ｌ抗体、抗ＯＸ４０Ｌ及び抗ＴＮＦαの二重特異性抗体、並びにこれらの用途 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 公開日：２０１９年１２月９日 Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１９ 公開日：２０２０年５月１８日 ＢＩＯ ＫＯＲＥＡ ２０２０

本発明は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する新規な抗体、及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体に関するものであって、具体的には、ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＯＸ４０とＯＸ４０受容体との結合を効果的に阻害する抗体又は二重特異性抗体、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む形質転換体、前記抗体の作製方法、前記抗体を含む自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物、前記抗体を含む自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断用組成物、前記抗体を用いた自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断方法、前記抗体を用いて自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断するための情報の提供方法及びそのためのキットに関する。

自己免疫疾患又は炎症性疾患は、ヒトの免疫が異常に活性化することで起こる。自己免疫疾患の代表的なものである関節リウマチは、その治療薬としてＴＮＦα阻害剤が治療薬市場の６８％を占めている。

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、単球及びマクロファージを含む多様な細胞によって産生されるサイトカインであり、これは、本来特定のマウス腫瘍の壊死を誘導する能力により同定された［参照文献：Ｏｌｄ，Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：６３０－６３２］。その後、悪液質に関連するカケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）と名付けられた因子がＴＮＦαと同一の分子であることが明らかになった。ＴＮＦαは、ショックの媒介に関与する［参照文献：Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５－５１８；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ
Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６２５－６５５］。さらに、ＴＮＦαは、敗血症、感染症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、及び移植片対宿主病を含む様々なヒト疾患及び障害の病理生理学に関連している［参照文献：Ｖａｓｉｌｉ，Ｐ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４１１－４５２；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１－５０３］。

様々な疾患におけるヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）の有害な役割のために、治療戦略は、ｈＴＮＦα活性を阻害又は相殺するように計画されている。特に、ｈＴＮＦαに結合してそれを中和する抗体は、ｈＴＮＦα活性を阻害する手段として用いられた。ｈＴＮＦα中和抗体には、ｈＴＮＦαで免疫したマウスのリンパ球から得られたハイブリドーマによって分泌されたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）［参照文献：Ｈａｈｎ Ｔ；ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：３８１４－３８１８；Ｌｉａｎｇ，Ｃ－Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３７：８４７－８５４；Ｈｉｒａｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９６：５７－６２；Ｆｅｎｄｌｙ，Ｂ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ６：３５９－３７０；Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ ａｌＬ．（１９９０）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ２：１６２－１６９；米国特許第５，２３１，０２４号（Ｍｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ）；欧州特許公報第１８６８３３Ｂ１号（Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．）；欧州特許出願第２１８８６８Ａｌ号（Ｏｌｄ ｅｔ ａｌ．）；欧州特許公報第２６０ ６１０Ｂ１号（Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ．）］又はキメラ抗体［参照文献：Ｋｎｉｇｈｔ，Ｄ．Ｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１４４３－１４５３；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／１６５５３（Ｄａｄｄｏｎａ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．）］又はヒト化モノクローナル抗体［参考文献
：ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／１１３８３（Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．）］又はヒトモノクローナル抗体［参考文献：米国１０－１１４２８２５］などがある。これらの抗ｈＴＮＦα抗体は、ｈＴＮＦαに対して高親和性（例：Ｋｄ≦１０^－９Ｍ）を示し、ｈＴＮＦα活性を中和することができる。このような抗ｈＴＮＦα抗体は、様々な自己免疫疾患、感染症、移植拒絶反応、及び移植片対宿主病などにおいて治療薬として用いられている。

しかしながら、これら抗ｈＴＮＦα抗体のＴＮＦα阻害剤に対して不応の患者群が約５０％に達している（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１１，２７６－２８９（２０１５）。しかも、近年開発されている自己免疫疾患の標的は、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＣＤ２０などであり、これより派生した医薬品は、ＴＮＦα阻害剤ほどの効能を発揮できていない（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１１，２７６－２８９（２０１５））。

特に、関節リウマチなどの自己免疫疾患は、単に一種類の免疫細胞の異常ではなく、免疫系全般の問題によって起こるため、一つの標的のみを阻害する従来の治療薬開発方法では治療薬の有効性を向上させるのに限界がある。したがって、この有効性の限界を克服するために、異なる作用機序を有する２つ以上の標的を一度に制御する二重又は多重特異性抗体が開発されている。しかし、従来の二重特異性抗体は、先天性（ｉｎｎａｔｅ）免疫系又は後天性（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫系のうち特定の細胞にのみ限定して作用するため、免疫系全般の恒常性を改善することはできない。

本発明の目的は、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）に特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片を提供することである。

本発明の目的は、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で示されるＯＸ４０Ｌタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で示される９３番～１００番、及び配列番号４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で示される１４１番～１５１番のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌの立体構造的エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識する、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体を提供することである。

本発明の目的は、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）に特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片；及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片；を含む、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を提供することである。

本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その結合断片又は前記二重特異性抗体をコードする核酸、前記核酸が導入された発現ベクター又は前記発現ベクターが導入された宿主細胞を提供することである。

本発明の目的は、前記宿主細胞を用いた抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は二重特異性抗体を産生する方法を提供することである。
本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は前記二重特異性抗体を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は前記二重特異性抗体を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断用組成物を提供することである。

本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は二重特異性抗体を含み、前記ＯＸＯ４０Ｌ及びＴＮＦαのうち少なくとも一方を検出するための組成物を提供することである。

本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は二重特異性抗体を用いて自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断するための情報の提供方法を提供することである。

本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は二重特異性抗体を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断するための情報を提供するキットを提供することである。

本発明の目的は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その抗原結合断片又は二重特異性抗体の薬学的に有効な量を投与することを含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供することである。

本発明の目的は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造における、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は二重特異性抗体の用途を提供することである。

本発明の目的は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は二重特異性抗体の用途を提供することである。

本発明に開示される各説明及び実施形態は、それぞれ他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本発明に開示される様々な要素の全ての組み合わせが本発明の範囲に属する。

また、下記具体的な説明によって本発明の範囲が限定されるとは言えない。

本発明は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合しながらＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との相互作用を阻害する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又は結合断片を提供する。

本明細書において、用語「抗体」は、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体として働くタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全（Ｗｈｏｌｅ）抗体、及び結合断片を全て含む。また、前記用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）又は二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディを含んでもよい。

典型的には、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域（前記部位は、ドメインとしても知られている）を含むことができる。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３つの超可変領域及び４つのフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含むことがで
きる。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と名付けられ、さらに特定のＣＤＲが位置する鎖によって識別されることができる。

全抗体は、２つの全長軽鎖及び２つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＧを含むことができ、ＩｇＧは、亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、及びＩｇＧ_４を含むことができる。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、及びエプシロン（ε）タイプを有することができ、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）を有することができる。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有することができる。

本明細書において、用語「断片」、「抗体断片」、「抗原結合断片」、及び「結合断片」は、抗原結合機能を有する本発明の抗体の任意の断片を意味するものとして互換的に用いられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖなどを含んでもよい。

前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と、「軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１ドメイン）」とを有する構造であって、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成することで産生され得る。Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有する最小の抗体断片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。これらの結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、例えば、遺伝子組換え技術によって作製することができる。

本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同一な抗体集団から得られた単分子組成の抗体分子を指し、このようなモノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単結合特異性及び親和性を示す。本発明の一実施形態において、本発明のＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体、又はＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体は、単分子抗体であってもよい。具体的には、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、ＯＸ４０Ｌの特定のエピトープに特異的に結合する単分子組成の抗体を意味し、前記二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαの特定のエピトープに同時に特異的に結合する単分子組成の二重特異性抗体を意味し得る。

本発明の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体、及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であってもよいが、特にこれに限定されない。

本発明において、用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域を組換えた抗体であって、マウス抗体に比べて免疫反応が大きく改善された抗体である。

本発明において、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体のタンパク質配列を、ヒトにおいて自然に産生される抗体変異体に類似するように修飾した抗体を意味する。例えば、前記ヒト化抗体は、マウス由来のＣＤＲをヒト抗体由来のＦＲと組換えてヒト化可変領域を作製し、これを所望のヒト抗体の定常領域と組換えてヒト化抗体を作製することができる。ただし、単にＣＤＲグラフトのみを行う場合、ヒト化抗体の親和性が低下するため、ＣＤ
Ｒの３次元構造に影響を与えることと思われるいくつかの重要なＦＲアミノ酸残基をマウス抗体のものに親和させることにより、元のマウス抗体の親和性と同じレベルまで上げることができる。

本明細書において、用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であって、相補性結晶領域、フレームワーク領域を含む、抗体を構成する全てのアミノ酸配列がヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列から構成されているものを意味する。ヒト抗体は、通常ヒトの疾患を治療するのに用いられ、これは、３つ以上の潜在的な利点を有し得る。まず、これは、ヒト免疫系とより良好に相互作用し、例えば、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）により標的細胞をより効率的に破壊することができる。第二に、ヒト免疫系が前記抗体を外来のものとして認識しないという利点がある。第三に、より少ない量、より低い頻度で薬物を投与しても、ヒト循環系における半減期が天然の抗体と類似しているという利点がある。本発明の実施形態において、本発明のＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体、及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体は、ヒト抗体であってもよい。したがって、本発明のヒト抗ＯＸ４０Ｌ抗体、及び本発明のヒト二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌに対して強い親和性を示し、ＯＸ４０Ｌを発現している細胞（例：単核球）がＯＸ４０受容体に結合することを効果的に阻害するだけでなく、重鎖及び軽鎖ドメインの何れもヒト由来であるため、低い免疫原性を示し、自己免疫疾患や炎症性疾患などの治療に有用に用いられる。

本明細書において、用語「ＯＸ４０Ｌ」は、ＯＸ４０タンパク質を受容体とするリガンドであり、具体的には、ＯＸ４０受容体に結合するタンパク質を意味する。ＯＸ４０Ｌに関する情報は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなど、公知のデータベースから得ることができ、その例として、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒがＧｅｎｅ ＩＤ：５４５６７、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ_００３３２６．５（
ＴＮＦＳＦ４ ｖｅｒ１）、ＮＭ_００１２９７５６２．２（ＴＮＦＳＦ４ ｖｅｒ２）
である配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌの情報が挙げられる。

ＯＸ４０Ｌは、抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）に過剰発現しており、いくつかの免疫細胞を活性化させることが知られている。具体的には、ＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦαやＩＮＦγと同様に、自己免疫疾患患者において過剰産生されることが観察されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．３０：２８１５－２８２３）。全身に分布するＴＮＦαとは異なり、ＯＸ４０Ｌは、活性化された免疫細胞でのみ産生され、主に病変位置に分布する。ＯＸ４０Ｌは、先天性免疫系の抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）と後天性免疫系のヘルパーＴ細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）に同時に関与して免疫系の恒常性を取り戻すことができる多重免疫調節タンパク質である（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１２，７４－７６（２０１６），（Ｃｌｉｎｉｃ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６）。

本発明において、用語「ＯＸ４０」は、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を媒介するタンパク質を意味する。前記ＯＸ４０は、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を媒介するタンパク質であれば制限なく含まれてもよい。

本発明において、用語「ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用を阻害する」又は「ＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との相互作用を阻害する」は、本発明のＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片がＯＸ４０Ｌに結合し、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０と
の相互作用を抑制又は阻害することを意味する。抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片がＯＸ４０Ｌに結合すると、ＯＸ４０Ｌの生物学的機能を抑制又は阻害することにより、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０の結合が抑制又は阻害され、ＯＸ４０のシグナル伝達をもたらすことができなくなる。すなわち、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片のＯＸ４０Ｌへの結合により、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用が抑制又は阻害され、結果としてＯＸ４０のシグナル伝達が抑制又は阻害される。

本発明において、「ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体」は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合してＯＸ４０Ｌの生物学的活性を抑制又は阻害する抗体を意味する。前記抗体は、ＯＸ４０Ｌの生物学的活性を抑制又は阻害し、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との相互作用を抑制又は阻害することができる。本明細書において、「ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体」は、「ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体」又は「抗ＯＸ４０Ｌ抗体」と互換的に用いることができる。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体の形態は、前述したように全抗体と結合断片を何れも含むことができる。本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合しながらＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との相互作用を阻害し、自己免疫疾患や炎症疾患などを治療するのに有用に用いられ、自己免疫疾患又は炎症疾患で過剰発現するヒトＯＸ４０Ｌに特異的に結合することで、副作用を最小限に抑えながら治療効果を最大化することができる。

本発明の実施形態において、前記ＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との相互作用を阻害する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０Ｌに３×１０^－９Ｍ以下で結合することができる。具体的には、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、１．５×１０^－９Ｍ、１．３×１０^－９Ｍ、特に、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合することができる。

本発明において、用語「結合定数（Ｋ_ｏｎ）」は、特定の抗体抗原相互作用の結合比率を意味し、用語「解離定数（Ｋ_ｏｆｆ）」は、特定の抗体抗原相互作用の解離比率を意味する。また、本発明において、用語「抗原に対する親和性（Ｋ_Ｄ）」は、Ｋ_ｏｆｆ：Ｋ_ｏｎの割合（すなわち、Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎ）をモル濃度（Ｍ）で表したものである。抗体に対するＫ_Ｄ値は、当業界で広く確立された方法を用いて測定することができる。例えば、抗体のＫ_Ｄ値を測定する方法として、バイオコア_ＴＭシステムを用いた表面プラズモン共鳴分析が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０Ｌに対して高い結合力を示し、低濃度でもＯＸ４０Ｌに対する活性を抑制又は阻害でき、自己免疫疾患又は炎症疾患に対して優れた治療効果を示すことができる。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０Ｌの立体構造的エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識することができる。例えば、本発明の前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１で示されるヒトＯＸ４０Ｌタンパク質のアミノ酸配列において、９３番～１００番及び１４１番～１５１番のアミノ酸配列に３×１０^－９Ｍ以下で結合することができる。具体的には、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１で示されるヒトＯＸ４０Ｌタンパク質のアミノ酸配列において、９３番～１００番及び１４１番～１５１番のアミノ酸配列に１．５×１０^－９Ｍ、１．３×１０^－９Ｍ、特に、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合することができる。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３又は配列番号４で示されるヒトＯＸ４０Ｌタンパク質のアミノ酸配列に高い結合力で結
合することができ、具体的には、３×１０^－９Ｍ以下で結合することができる。具体的には、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、１．５×１０^－９Ｍ、１．３×１０^－９Ｍ、特に、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合することができる。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片のヒトＯＸ４０Ｌに対するＫ_Ｄは、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；Ｂｉａｃｏｒｅ）分析によって測定されたものであってもよい。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、具体的には、以下に挙げる配列を含んでもよいが、これに限定されない。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１２、１３及び１４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５、１６、１７及び１８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１９、２０、２１及び２２からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２３及び２４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５及び２６からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域を含んでいてもよい。

本発明において、用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て含んでいてもよい。

また、本発明において、用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１２で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で示される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１９で示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２３で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２７で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体であってもよいが、これに限定されない。本発明の実施形態では、前記抗体を０２Ｃ０９と名付けた。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１３で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６で示される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０で示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２８で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体であってもよいが、これに限定されない。本発明の実施形態では、前記抗体をｈｕ３Ｆ０７、Ｉ３Ｆ０７と名付けた。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１３で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１７で示される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２１で示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２９で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体であってもよいが、これに限定されない。本発明の実施形態では、前記抗体を１０Ｈ０７と名付けた。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１４で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１８で示される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２２で示される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３０で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体であってもよいが、これに限定されない。本発明の実施形態では、前記抗体を２１Ｇ０７と名付けた。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号３７、４１、４５、４９及び５３からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖可変領域、及び
配列番号３８、４２、４６、５０及び５４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖可変領域を含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号３７に記載の重鎖可変領域及び配列番号３８に記載の軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号４１に記載の重鎖可変領域及び配列番号４２に記載の軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号４５に記載の重鎖可変領域及び配列番号４６に記載の軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号４９に記載の重鎖可変領域及び配列番号５０に記載の軽鎖可変領域；又は
（ｅ）配列番号５３に記載の重鎖可変領域及び配列番号５４に記載の軽鎖可変領域を含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号５、６、７、及び８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖定常領域；及び
配列番号１０のアミノ酸配列に記載の軽鎖定常領域を含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片は、
前記（ａ）配列番号３７に記載の重鎖可変領域及び配列番号３８に記載の軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号４１に記載の重鎖可変領域及び配列番号４２に記載の軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号４５に記載の重鎖可変領域及び配列番号４６に記載の軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号４９に記載の重鎖可変領域及び配列番号５０に記載の軽鎖可変領域；又は（ｅ）配列番号５３に記載の重鎖可変領域及び配列番号５４に記載の軽鎖可変領域、及び
前記配列番号５、６、７、及び８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖定常領域及び配列番号１０のアミノ酸配列に記載の軽鎖定常領域
を含む抗体又はその結合断片であってもよい。

ここで、前記（ａ）及び（ｂ）の可変領域を含む抗体は、ヒト化抗体であり、前記（ｃ）～（ｄ）の可変領域を含む抗体は、キメラ抗体である。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、人体において十分な効果を示す物理化学的特性を有し、優れた熱安定性を有する。例えば、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、５０℃を超える温度、具体的には、５９℃以上の温度で溶融し、人体内で約２週間以上の半減期を有することができる。

本発明の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体が定常領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来又はこれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又はこれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）による定常領域を含むことができる。

本明細書において、用語「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、二量体又は多量体を形成するときに、同種由来の単鎖免疫グロブリン定常領域をコードするポリペプチドが異なる種由来の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの定常領域からなる群から選択される２つ以上の定常領域から二量体又は多量体を形成することができる。

本明細書において、用語「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」は、単鎖免疫グロブリン重鎖定常領域内に、２つ以上の異なる種由来の免疫グロブリン重鎖定常領域に該当する配列が存在することを意味し、その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、並びにＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ～４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能である。

一方、ＩｇＧの亜型であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４重鎖定常領域の組み合わせ又はハイブリダイゼーションも可能である。前記組み合わせ及びハイブリダイゼーションについては、前述の説明と同様である。

本発明の実施形態において、前記ＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号５に記載のＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ１ Ｎ２９７Ａ重鎖定常領域は、配列番号６に記載の重鎖定常領域、ＩｇＧ４重鎖定常領域は、配列番号７に記載のＩｇＧ４重鎖定常領域、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ重鎖定常領域は、配列番号８に記載のＩｇＧ４重鎖定常領域であってもよいが、これに限定されない。

また、本発明の前記ＯＸ４０Ｌに特異的な抗ＯＸ４０Ｌ抗体が軽鎖定常領域を含む場合、前記軽鎖定常領域は、ラムダ（λ）又はカッパ（κ）軽鎖由来であってもよい。前記抗体の軽鎖定常領域がカッパ軽鎖由来である場合、配列番号１０に記載のカッパ軽鎖定常領域であってもよいが、これに限定されない。

本発明において、前記抗体は、マウスから産生されたマウス抗体及びこれより抗体の親和性、免疫性などを改善するために、親抗体のアミノ酸配列の一部を置換、付加及び／又は欠失させた変異体を全て含んでもよい。前記変異体は、これに限定されないが、その例として、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性最適化抗体などを含んでもよい。本発明において、「親和性最適化抗体」とは、特定の抗体のＣＤＲ配列の一部が置換、付加、欠失した変異体であって、前記特定の抗体と同一の抗原エピトープに結合しつつも抗原に対する結合親和性が向上した抗体のことをいう。

本発明において、前記変異体は、親抗体と同一のＣＤＲを含むか、又は同一のエピトープを標的とすることを条件に、親抗体ＣＤＲアミノ酸配列の一部が変異（置換、付加又は欠失）した抗体を包括的に指す。このような変異体は、同一のエピトープに対する結合能が保持される範囲内で、抗体の親和性及び免疫性などを改善するために当業者によって適宜調節されてもよい。

本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０Ｌを特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含んでいてもよい。例えば、抗体の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性をさらに改善するために、抗体のアミノ酸配列にさらなる変化を与えてもよい。これらの修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。これらのアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて行われる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類を分析することにより、アルギニン、リジン、及びヒスチジンは、何れも正電荷を帯びる残基であり；アラニン、グリシン、及びセリンは、同様の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン
、及びチロシンは、同様の形状を有するということが分かる。したがって、これらを踏まえると、アルギニン、リジン、及びヒスチジン；アラニン、グリシン、及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、生物学的に機能的均等物といえる。例えば、本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、本明細書の配列番号に記載のアミノ酸配列の１つ以上の残基に保存的アミノ酸変化を含んでいてもよく、保存的アミノ酸の変化は、下記表１の置換を含んでいてもよい。

本発明の実施形態によれば、ＯＸ４０Ｌを標的とする新規な抗体を作製した。ヒトＯＸ４０Ｌ（ｈＯＸ４０Ｌ）で免疫したマウスで作製したライブラリー、そしてヒトライブラリーからＯＸ４０Ｌに特異的な抗体０２Ｃ０９、ｈｕ３Ｆ０７、１０Ｈ０７、２１Ｇ０７を作製した。前記抗体は、ＯＸ４０Ｌに対する親和性が０．２～０．７ｎＭレベルであり、高い親和性でＯＸ４０Ｌに特異的に結合し（表３２、図４）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＸ４０Ｌ阻害能は０．２～０．９ｎＭで、対照抗体より著しく優れていることを確認した（図５）。また、Ｔ細胞において、ＯＸ４０Ｌによる免疫活性を遮断する結果を示した（図６）。これらの結果は、本発明のＯＸ４０Ｌに特異的な抗ＯＸ４０Ｌ抗体が、ＯＸ４０受容体との結合を効率的に遮断し、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を抑制し、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療に著しく優れた効果を示すことができ、副作用を最小限に抑えることができ、免疫系の恒常性を保持しつつも自己免疫疾患及び炎症性疾患を選択的に治療できることを意味する。

本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、前記ＯＸ４０Ｌの機能を阻害し、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療に有効に用いられる。

ヒトの免疫系は、先天性（ｉｎｎａｔｅ）免疫系と後天性（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫系の２つからなっており、自己免疫疾患は、先天性（ｉｎｎａｔｅ）免疫系と後天性（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫系が異常に活性化されたときに起こり得る。

ＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体が結合すると、先天性免疫系及び後天性免疫系に関わる免疫細胞が過剰に活性化して様々な疾患を引き起こすことが知られている。

前記ＯＸ４０Ｌは、先天性免疫系の抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ、ＡＰＣ）と後天性免疫系のヘルパーＴ細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）に同時に関与し、免疫系の恒常性に関与することができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１２，７４～７６（２０１６）、（Ｃｌｉｎｉｃ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１６）。また、前記ＯＸ４０Ｌは、全身に分布するサイトカインとは異なり、病変位置に集中的に分布するため、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片は、病変周辺のＯＸ４０Ｌに結合する可能性が高い。

したがって、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、病変周辺に集中的に分布するＯＸ４０Ｌに結合し、自己免疫疾患及び炎症性疾患に対する治療効果を最大化することができ、副作用を減少して安全性を向上することができる。

また、後天性免疫系は、先天性免疫系より反応速度は遅いが持続性が高く、免疫系の過剰な活性により起こる自己免疫疾患の主な要因であり得る。本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片のＯＸ４０Ｌの抑制又は阻害は、先天性免疫細胞だけでなく、従来の自己免疫疾患治療薬が影響を及ぼさなかった後天性免疫細胞を調節できるという点で大きな利点がある。

すなわち、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用を効果的に抑制及び阻害する本発明は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片を自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療に有効に用いることができる。

本発明は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）、前記核酸を含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。

本明細書で使用される用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包括的に含み、前記核酸分子の基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が修飾されたアナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（１９９０）９０：５４３－５８４）。

本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸分子の配列は、修飾されてもよく、前記修飾は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換もしくは保存的置換を含む。

本発明の核酸は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。本発明において、実質的な同一性は、前記本発明のヌクレオチド配列と、任意の他の配列とを最大限対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析したときに、少なくとも８０％の相同性、具体的には、少なくとも９０％の相同性、より具体的には、少なくとも９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味し得る。

本明細書で使用される用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、宿主細胞において目的の遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含み、具体的には、プラスミ
ドベクターであってもよいが、これに限定されない。

本発明のベクターにおいて、軽鎖可変領域をコードする核酸分子及び重鎖可変領域をコードする核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）されたものであってもよい。

本発明において、用語「作動可能に連結された」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子の結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的結合を意味し、これによって前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を調節する。

本発明の組換えベクターシステムは、当業界で公知の様々な方法によって構築することができる。例えば、その具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明において、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む発現ベクターは、特に限定されないが、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核細胞又は原核細胞において、前記核酸を複製及び／又は発現することのできるベクターであってもよい。具体的には、宿主細胞において前記核酸が発現するように適切なプロモーターに作動可能に結合され、少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターであってもよく、より具体的には、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルス、レトロウイルスベクターなどに前記核酸が導入された形態であってもよい。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む発現ベクターは、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸をそれぞれ含む発現ベクター、又は重鎖もしくは軽鎖をコードする核酸を何れも含む発現ベクターてあってもよい。

本発明において、前記発現ベクターが導入された形質転換体は、特に限定されないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラチフィムリウムなどの細菌細胞；酵母細胞；ピキアパストリスなどの菌類細胞；ドロゾフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウメラノマ細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞、ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胎児腎細胞、ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；又は植物細胞であってもよい。本発明の実施形態では、ＨＥＫ細胞などを宿主細胞として用いた。

本明細書において、用語「導入」は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含むベクターを宿主細胞に送達する方法を意味する。この導入は、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介トランスフェクション法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当技術分野で公知の様々な方法によって行うことができる。また、形質導入は、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を手段とし、ウイルス粒子を用いて目的物を細胞内に送達することを意味する。ちなみに、遺伝子ボンバード
メントなどによりベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明において、導入は、形質転換と混用されることがある。

本発明は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片を作製する方法を提供する。

本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、公知のモノクローナル抗体作製技術によって容易に作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の作製は、免疫した動物から得られたＢリンパ球を用いてハイブリドーマを作製することによって行うか（Ｋｏｅｈｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５）、又はファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いて行うことができるが、これに限定されるものではない。

ファージディスプレイ技術を用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを作製せずに、Ｂリンパ球から直接抗体遺伝子を得てファージ（ｐｈａｇｅ）表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いれば、Ｂ細胞不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）によってモノクローナル抗体の産生に関連する従来の多くの困難を克服することができる。一般に、ファージディスプレイ技術は、１）ファージの外被タンパク質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｐＩＩＩ（又はｐＩＶ）Ｎ末端に該当する遺伝子部位にランダム配列オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を挿入するステップ；２）天然型の外被タンパク質の一部と前記ランダム配列オリゴヌクレオチドとによってコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させるステップ；３）前記オリゴヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと結合できる受容体物質を処理するステップ；４）受容体に結合したペプチドファージ粒子を低ｐＨ分子又は結合競争力のある分子を用いて溶出させるステップ；５）パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）によって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させるステップ；６）所望の量を得るために前記方法を繰り返すステップ；及び７）パンニングによって選別されたファージクローンのＤＮＡ配列から活性のあるペプチド配列を決定するステップからなる。

本発明の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片の作製方法は、ファージディスプレイ技術を用いて行うことができる。当業者は、公知のファージディスプレイ技術、例えば、Ｂａｒｂａｓら（ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２：１１９，１９９１及びＪ．Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；７５（１４）：６６９２－９）及びＷｉｎｔｅｒら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３，１９９４）の論文に公知の方法を参考して、前記本発明の作製方法における各ステップを容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために用いられるファージは、例えば、繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）として、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１又はＰｆ３ファージが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、前記繊維状ファージの表面上で異種遺伝子を発現させるために用いられるベクターとしては、例えば、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ－ＣＡＴ１又はｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクター、又はｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８又はｐＳＥＸなどのファージミドベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、増幅のための組換えファージの再感染に必要な野生型の外被タンパク質を提供するために用いられるヘルパーファージとしては、例えば、Ｍ１３Ｋ０７又はＶＳＣＭ１３などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明のファージディスプレイクローンをコードするポリヌクレオチドは、通常の方法によって容易に単離及び配列分析することができる。その例として、ハイブリドーマ又はファージ鋳型ＤＮＡから当該重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。一旦前記ポリヌクレオチドが単
離されると、これを発現ベクター内に取り入れることができ、その後前記発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して、形質転換された宿主細胞（すなわち、形質転換体）から所望のモノクローナル抗体を産生することができる。したがって、本発明の前記ヒトモノクローナル抗体の作製方法は、ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを増幅させるステップを含む、ヒトモノクローナル抗体の作製方法であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、前記公知の組換え手段又は生化学的方法により作製することができ、抗体は、適切な宿主細胞に抗体をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体の培養液から回収することができる。

本発明の実施形態において、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片の作製（産生）方法は、
（ａ）前記形質転換体を培養し、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片を産生するステップ；及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で産生された抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片を回収するステップを含む、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片の作製方法であってもよい。

本発明の実施形態において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、公知の単離方法により単離することができ、その例として、プロテインＡセファロース、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなど、通常の免疫グロブリン精製方法によって培養培地から適切に単離することができるが、これに限定されるものではない。

本発明は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片；及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を提供する。

本明細書において、用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる種類の抗原（標的タンパク質）に結合できる抗体を意味する。具体的には、天然には存在せず、遺伝子工学又は任意の方法によって作製された形態であってもよい。

本発明の前記二重特異性抗体は、２つの異なる標的に結合できる抗体であり、前記二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに結合することができる。

本発明の「二重特異性抗体」は、「二重標的タンパク質」、「二重抗体」又は「二重抗体タンパク質」と混用されることがある。

本発明の二重特異性抗体の構成要素であるＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその結合断片は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合してＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０Ｌシグナル経路を遮断することのできる抗体又はその結合断片を含む。本発明の実施形態において、本発明の二重特異性抗体の構成要素であるＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその結合断片は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片について前述した内容と互いに矛盾しない限り、実質的に同様の本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片であってもよい。また、本発明の実施形態において、本発明の二重特異性抗体の構成要素であるＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその結合断片は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合してＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０Ｌシグナル経路を遮断できる抗体であって、ＷＯ２０１８０８３２４８、ＷＯ２００９１４１２３９、ＵＳ２０１７２６０２７９、ＷＯ２００６０２９８７９、又はＷＯ２０１１０７３１８０に記載の抗体又はその結合断片であってもよい。

本発明の二重特異性抗体の構成要素であるＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその結合断片は、免疫細胞で過剰発現されるＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、本発明の二重特異性抗体を、ＴＮＦαを発現する免疫細胞に集中させることができるだけでなく、ＴＮＦαと結合してそれ自体でも免疫細胞活性を減らす能力を有し得る。

また、ＯＸ４０Ｌは、ＡＰＣで過剰発現し、Ｔ細胞に発現するＯＸ４０受容体と相互作用して免疫細胞の増殖／分化／活性化を誘導し、様々な炎症性サイトカインを分泌するように誘導する、先天性免疫と後天性免疫を同時に活性化させる上流シグナルの一つである。抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナルを阻害し、自己免疫疾患及び炎症性疾患患者において過度に活性化されている免疫反応を減少させることができる。

さらに、抗ＴＮＦα抗体又はその結合断片は、炎症反応の下流シグナルであるＴＮＦαに対する治療に抵抗性を示す自己免疫疾患及び炎症性疾患患者に対しても効果を示すことができる。

本明細書において、用語「ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体」は、ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαによる２つのシグナル伝達経路を同時に阻害できる二重特異性タンパク質であれば、制限なく含んでもよい。前記二重特異性抗体を構成するＴＮＦαに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及びＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片で説明した全長抗体及び抗体断片の形態を何れも含んでいてもよい。

本発明において、用語「ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用を阻害する」とは、本発明のＯＸ４０Ｌに特異的に結合する二重特異性抗体がＯＸ４０Ｌに結合し、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用を阻害することを意味し、二重特異性抗体の結合によってＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用が阻害され、ＯＸ４０ＬのＯＸ４０結合によるＯＸ４０の構造的変化をもたらさないため、加水分解できず、ＯＸ４０のシグナル伝達を不可能とする。

本明細書において、用語「ＴＮＦαに特異的に結合する抗体」は、体内で広範囲にＴＮＦαを抗原として特異的に結合する抗体であれば、その全てが含まれる。本発明の一実施形態において、前記ＴＮＦαに特異的に結合する抗体は、ＴＮＦαを標的とする治療用抗体であって、ＷＯ１９９７０２９１３１、ＷＯ２００３０４５４００、ＷＯ２００４０５０６８３、ＷＯ１９９８０１１９１７、ＥＰ１０９７９４５、ＷＯ２００１０３７８７４、ＵＳ２００６０２４３１０、ＷＯ２００６１２５２２９、ＷＯ２００７０５６５４０、ＷＯ１９９４００６４７６、ＷＯ２００００５９５３０、又はＷＯ２００１０００２２９に記載の抗体又はその結合断片であってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の一実施形態において、前記ＴＮＦαに特異的に結合する抗体は、米国ＦＤＡ及び欧州ＥＭＡなどから承認され、安定して使用することのできる治療用抗体であるａｄａｌｉｍｕｍａｂ（商品名Ｈｕｍｉｒａ、ａｂｂｖｉｅ）であってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。このようなＴＮＦαに特異的に結合する抗体は、前述した全長抗体又は抗体断片の形態を何れも含み、ＩｇＧ抗体の形態であってもよいが、これに限定されない。

ＴＮＦαは、免疫細胞を調節するサイトカインであり、体内の発熱源として作用して熱を出させて細胞の死滅を誘導し、炎症性サイトカインを産生して自己免疫疾患及び炎症性疾患を引き起こす。ＴＮＦαは、主に活性化したマクロファージから分泌されるが、その他の様々な免疫細胞である神経細胞からも分泌される。ＴＮＦαの最も重要な役割は、免疫細胞の調節である。過剰発現したＴＮＦαを阻害すれば、自己免疫疾患及び炎症性疾患
を抑制することができる。

前記二重特異性抗体は、ＴＮＦαと結合し、ヒトＴＮＦαとＴＮＦα受容体（ＴＮＦα
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＮＦα Ｒｃ）との相互作用を抑制又は阻害し、具体的には、前記二重特異性抗体の構成要素であるＴＮＦαに特異的な二重特異性抗体がＴＮＦαに結合して、ＴＮＦαとＴＮＦα受容体との相互作用を抑制又は阻害することを意味し得るが、これに限定されない。

本発明の目的上、前記ＴＮＦα受容体は、哺乳動物のＴＮＦαに結合するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよいが、具体的には、ヒトＴＮＦαに結合するタンパク質を意味し得る。

本発明のＴＮＦαに特異的な二重特異性抗体又はその結合断片によるＴＮＦαとＴＮＦα受容体との相互作用の阻害により、ＴＮＦαとＴＮＦα受容体の結合によるＴＮＦα／ＴＮＦα受容体シグナル伝達を抑制することになる。免疫系でＴＮＦαとＴＮＦα受容体が結合すると、免疫細胞でＴＮＦα／ＴＮＦα受容体シグナル伝達が活性化され、これは、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０シグナル伝達経路の作用機序とは異なる機序で免疫細胞分化などを調節し、様々な自己免疫疾患の治療薬として用いられている。

したがって、本発明の前記ＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的な二重特異性抗体は、互いに異なる機序で過剰に活性化された免疫細胞に対して抑制能を示し、より優れた自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療効果を有する治療薬として用いられる。

したがって、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０シグナル伝達及びＴＮＦα／ＴＮＦα受容体シグナル伝達を効果的に阻害する本発明の前記ＯＸ４０及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、自己免疫疾患及び炎症性疾患を効果的に治療することができ、副作用を最小限に抑えながら治療効果を最大化することができる。

本発明の実施形態において、前記ＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号８９に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号９０に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９１に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号９２に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９３に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９４に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、前記ＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５のアミノ酸配列に記載の重鎖可変領域及び配列番号３６のアミノ酸配列に記載の軽鎖可変領域を含んでいてもよく、具体的には、前記Ｈｕｍｉｒａの可変領域を含んでいてもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体の形態は、特に限定されないが、ＩｇＧ形態の抗体に結合断片がリンカーで連結されている二重特異性抗体を提供する。具体的には、本発明の前記二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片がリンカーで連結されているものであってもよい。

本発明の実施形態において、前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２の配列に記載のペプチド又は非ペプチドであってもよい。

本明細書において、用語「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」は、基本的に２つの異なる融合
パートナー（例えば、生体高分子など）を水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス力、ジスルフィド結合、塩橋、疎水性相互作用、共有結合などを用いて連結することのできる連結体を意味し、具体的には、生理学的条件又は他の標準ペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存条件）下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与できる少なくとも１つのシステインを有していてもよく、単にそれぞれの融合パートナーを連結する役割に加えて、融合パートナー間に一定の間隔を付与する役割、又は融合体に柔軟性や剛直性を提供するヒンジ（ｈｉｎｇｅ）としての役割を果たすことができる。前記リンカーは、非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーであってもよく、ペプチド結合、ジスルフィド結合などによって直接連結されるものを何れも含んでいてもよい。

本発明において、前記リンカーは、特に限定されないが、具体的には、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体とＴＮＦαに特異的に結合する抗体とを連結できるポリペプチドであってもよく、より具体的には、前記ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体のＦｃ領域のＣ末端又は軽鎖領域のＣ末端とＴＮＦαに特異的に結合する抗体とを連結できるペプチドリンカーであってもよく、さらに具体的には、ＧＧＧＧＳモチーフが繰り返される形態のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。前記ＧＧＧＧＳモチーフは、１～１０回繰り返されてもよく、最も具体的には、前記ＧＧＧＧＳモチーフが３回繰り返される配列番号３１のアミノ酸配列又は前記ＧＧＧＧＳモチーフが４回繰り返される配列番号３２のアミノ酸配列からなってもよいが、これに限定されるものではなく、当業界で通常の知識を有する者が容易に導き出すことのできる範囲内で様々なリンカーが用いられてもよい。

本発明において、用語「非ペプチドリンカー」は、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性リンカーを意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく任意の共有結合によって互いに連結されてもよい。

本発明の非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテルなどの生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸又はこれらの組み合わせであってもよい。具体的には、ポリエチレングリコール単独重合体であってもよく、当技術分野で既知のこれらの誘導体及び当該技術分野で容易に作製できる誘導体も本発明の範囲に含まれてもよい。

より具体的には、分子量１～５ｋＤａのポリエチレングリコール単独重合体であってもよく、最も具体的には、３．４ｋＤａ程度の両末端に二機能性アルデヒド（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ）の形態でＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体とＴＮＦαに特異的に結合する抗体とを連結できるリンカーであってもよい。特に、両末端にアルデヒド反応性基を有する場合、非特異的反応を最小化するのに有効である。

前記リンカーを介して直接又は間接的に連結される部位は、特に限定されないが、Ｆｃ部分、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖなどであってもよい。前記二重特異性抗体は、特に限定されないが、前記ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体の全部又は一部（断片）、及びＴＮＦαに特異的に結合する抗体の全部又は一部（断片）が連結されている形態であってもよい。

また、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するタンパク質の全部又は一部、及びＴＮＦαに特異的に結合する抗体の重鎖の全部又は一部がペプチドリンカーで連結されている形態；ＯＸ４０Ｌに特異的に結合するタンパク質の全部又は一部、及びＴＮＦαに特異的に結合する抗体の軽鎖の全部又は一部がペプチドリンカーで連結されている形態；又はこれらの組み
合わせであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、免疫グロブリン（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ、ＩｇＧ）形態のＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体、及びＴＮＦαに特異的に結合する全長抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ又はｓｃＦｖ型の抗体がリンカーで連結されている形態であってもよい。

本発明の実施形態において、免疫グロブリン（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ、ＩｇＧ）形態のＴＮＦαに特異的に結合する抗体、及びＯＸ４０Ｌに特異的に結合する全長抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ又はｓｃＦｖ型の抗体がリンカーで連結されている形態であってもよいが、これに限定されない。

本発明において、用語「結合断片」は、抗原結合能力を有する断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖを含む、抗体の抗原結合形態を含む。特に、前記用語は、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｖｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含み、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）又はダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（Ｔｒｉａｂｏｄｙ）、及びテトラボディ（Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）を含む。

本発明において、用語「ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｖｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を有する最小抗体断片を意味し、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、前記ドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在してもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方の末端に、ＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片が連結されているものであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片が連結されているものであってもよい。具体的には、前記二重特異性抗体は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片がリンカーを介して連結されていてもよい。例えば、前記二重特異性抗体は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片が配列番号３１又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するリンカーを介して連結されていてもよいが、特にこれに限定されるものではない。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、抗ＴＮＦα抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方の末端に、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が連結されているものであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、前記抗ＴＮＦα抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が連結されているものであってもよい。具体的には、前記二重特異性抗体は、前記抗ＴＮＦα抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片がリンカーで連結されているものであってもよい。例えば、前記抗ＴＮＦα抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するリンカーを介して連結されていてもよいが、特にこれに限定されるものではない。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体の結合断片と抗ＴＮＦα抗体の結合断片とがリンカーを介して連結されているものであってもよい。前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するリンカーであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、
ａ）配列番号１２、１３及び１４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５、１６、１７及び１８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１９、２０、２１及び２２からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３及び２４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５及び２６からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域を含む、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片と、
ｂ）配列番号８９に記載のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１；配列番号９０に記載のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９１に記載のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域、及び配列番号９２に記載のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９３に記載のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９４に記載のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域を含む、ＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその結合断片とが、
リンカーを介して連結されているものであってもよい。

前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するリンカーであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は：
ａ）（ｉ）配列番号１２に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２７に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片；
（ｉｉ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１７に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片；又は
（ｉｖ）配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１８に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２２に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片と、
ｂ）配列番号８９に記載のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１；配列番号９０に記載のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９１に記載のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３；を含む
重鎖可変領域、及び配列番号９２に記載のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９３に記載のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９４に記載のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域を含む、ＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその結合断片とが、
リンカーを介して連結されているものであってもよい。

前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するリンカーであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は：
ａ）配列番号３３、３７、４１、４５、４９及び５３からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖可変領域；及び配列番号３４、３８、４２、４６、５０及び５４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖可変領域；を含む抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片と、
ｂ）配列番号３５に記載の重鎖可変領域及び配列番号３６に記載の軽鎖可変領域を含む抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片とが、
リンカーを介して連結されているものであってもよい。

前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するリンカーであってもよい。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は：
ａ）（ａ）配列番号３７に記載の重鎖可変領域及び配列番号３８に記載の軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号４１に記載の重鎖可変領域及び配列番号４２に記載の軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号４５に記載の重鎖可変領域及び配列番号４６に記載の軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号４９に記載の重鎖可変領域及び配列番号５０に記載の軽鎖可変領域；（ｅ）配列番号５３に記載の重鎖可変領域及び配列番号５４に記載の軽鎖可変領域；又は（ｆ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を含む抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片と、
ｂ）配列番号３５に記載の重鎖可変領域及び配列番号３６に記載の軽鎖可変領域を含む抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片とが、
リンカーを介して連結されているものであってもよい。

前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するリンカーであってもよい。

例えば、前記二重特異性抗体の構造は、図１に示すような形態の構造を有していてもよい。

他の例として、前記二重特異性抗体は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体の抗原結合断片と抗ＴＮＦα抗体の抗原結合断片とが連結されている構造を有していてもよい。

本発明の二重特異性抗体が定常領域を含む場合、前記二重特異性抗体は、具体的には、配列番号５、６、７及び８からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖定常領域；及び配列番号１０のアミノ酸配列に記載の軽鎖定常領域の全部又はその一部を含むものであってもよいが、これに限定されない。前記二重特異性抗体が定常領域を含む場合は、前記二重特異性抗体を構成するＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその結合断片、又はＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその結合断片が定常領域の全部又は一部を含む場合を意味する。

本発明の二重特異性抗体は、人体において十分な効果を示すことのできる物理化学的特性を有し、優れた熱安定性を有する。例えば、前記二重特異性抗体は、５０℃を超える温度、具体的には、５９℃以上の温度で溶融し、その結合を長期間保持することができ、人体内で約２週間以上の半減期を有することができる。

すなわち、本発明によるＴＮＦαに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及びＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性抗体は、ヒト由来ＴＮＦαとＯＸ４０Ｌに対して強い親和性を示し、ＯＸ４０Ｌを発現している細胞（例：免疫細胞）がＯＸ４０に結合することを効果的に阻害するだけでなく、ＴＮＦαがＴＮＦ受容体に結合して炎症性反応を抑制し、自己免疫疾患などの治療においてより著しい治療効果を示すことができる。

本発明の二重特異性抗体において、ＴＮＦαに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、及びＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、それぞれの特異的結合を保持し、特に、それぞれの標的に対する親和性を低下させることなく２つの標的（抗原）を同時に阻害することができるため、同時に２つのシグナルを阻害するが、これは、１つの標的と結合して阻害することよりもさらに効果的であり得る。

本発明の実施例では、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）をベクターに挿入し、これを動物細胞に導入してＯＸ４０Ｌ－ＴＮＦα結合二重特異性抗体を発現及び単離し、ＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的に結合するＯＸ４０Ｌ－ＴＮＦα二重特異性抗体を作製した。

前記二重特異性抗体分子は、ＯＸ４０Ｌ ＩｇＧ抗体分子とＴＮＦα結合ｓｃＦｖとをリンカーで連結した構造、又はＴＮＦα ＩｇＧ抗体分子とＯＸ４０Ｌ結合ｓｃＦｖとをリンカーで連結した構造を有している（図１）。前記動物細胞に導入及び発現したＯＸ４０Ｌ－ＴＮＦα結合二重特異性抗体を単離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により発現及び純度を確認した（図２）。

また、ＯＸ４０ＬとＴＮＦαに対する二重特異性抗体のＯＸ４０ＬとＴＮＦαに対する結合能アッセイ（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）により分析した結果、ＯＸ４０Ｌ－ＴＮＦα結合二重特異性抗体が二重特異性抗体の標的であるＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合することを確認した（表３２）。

本発明の実施形態において、前記二重特異性抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌに３×１０^－９Ｍ以下で結合することができる。具体的には、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、１．５×１０^－９Ｍ、１．３×１０^－９Ｍ、又は１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合し、ヒトＴＮＦαに対しては、１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合することができる。具体的には、二重特異性抗体の抗原であるＯＸ４０ＬとＴＮＦαに対する平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋ_Ｄ）値をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析法により測定した結果、前記二重特異性抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌに対しては０．４～０．５ｎＭのＫ_Ｄ値を、ヒトＴＮＦαに対しては０．２～０．５ｎＭのＫ_Ｄ値を示すことを確認した（表３２、図４）。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＯＸ４０Ｌ阻害能が０．２～１．３ｎＭで、対照抗体より著しく優れており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＮＦα阻害能も０．０５～０．０７ｎＭで、優れていることを確認した（表３５、図５）。また、Ｔ細胞において免疫活性を遮断する結果を示した（図６）。

したがって、本発明の二重特異性抗体は、各抗原に対する結合力を保持しつつもＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合し、前記標的に関連する疾患を効果的に治療することができる。

また、本発明の二重特異性抗体は、ＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合できるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｓｓａｙ実験により、免疫細胞のＯＸ４０ＬとヒトＯＸ４０との結合及びＴＮＦαとＴＮＦα受容体との結合によるそれぞれのシグナル伝達経路
が、二重特異性抗体処理によって効果的に阻害されることを確認した（表３５及び図５）。これらの結果より、本発明のＯＸ４０ＬとＴＮＦαに特異的な二重特異性抗体が、それぞれの受容体であるＯＸ４０とＴＮＦα受容体との結合を効率的に遮断し、過剰に活性化した免疫系を鎮める効果を示し、ＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合して前記標的に関連する疾患を効果的に治療できることが分かる。

本発明は、前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）、前記核酸（ポリヌクレオチド）を含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。

本発明において、前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体に関連する核酸（ポリヌクレオチド）、発現ベクター、形質転換体、導入については矛盾しない限り、前述の説明と同様である。

本発明は、ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を作製する方法を提供する。

具体的には、前記作製方法は、（ａ）前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む発現ベクターが導入された形質転換体を培養して二重特異性抗体を産生するステップ；及び（ｂ）前記ステップ（ａ）で産生された二重特異性抗体を回収するステップを含む、ＯＸ４０ＬとＴＮＦαに二重特異的に結合する抗体を含んでいてもよい。

本発明の前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体の作製方法は、矛盾しない限り、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片に記載の作製方法を実質的に同様に適用してもよい。

本発明は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいてもよい。

本発明において、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤をいう。液状溶液として製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであり、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒、又は錠剤に製剤化してもよい。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌに結合してＯＸ４０受容体との結合を阻害することにより過剰に活性化された免疫細胞の阻害に関与することができる。前記ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０受容体については、前述の説明と同様である。

さらに、前記二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌに加えてＴＮＦαに結合し、ＴＮＦαとＴＮＦα受容体との相互作用を阻害するが、これにより、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０シグナル伝
達経路の作用機序とは異なる機序で免疫細胞の分化などを調節し、様々な自己免疫疾患の抑制に関与することができる。

したがって、本発明の前記薬学的組成物は、自己免疫疾患又は炎症性疾患を著しく効果的に予防又は治療でき、副作用を最小限に抑え、安全性を高めることができる。

本発明において、自己免疫疾患又は炎症性疾患は、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を含んでもよい。関節リウマチは、炎症性疾患であるとともに自己免疫疾患として分類される疾患であって、本発明において、用語「自己免疫疾患」、「炎症性疾患」又は「自己免疫疾患及び炎症性疾患」は、関節リウマチを含む。

本明細書において、用語「予防」は、疾患の発病を抑制又は遅延させることを意味し、疾患が治療された対象において前記疾患が再発することを抑制又は遅延させることを意味する。

本発明において、用語「治療」は、組成物の投与によって自己免疫疾患の症状を改善又は良好に変化させるあらゆる行為を意味し得る。

本発明は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

本発明は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含む薬学的組成物を用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

前記自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を個体に投与するステップを含む。

前記自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又はＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む。

前記個体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患が発病している、もしくは発病が疑われる個体であってもよく、具体的には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ヒトなどを含む哺乳動物や鳥類などを含んでもよいが、特にこれに限定されない。

前記薬学的組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製する。さらに、単なる賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられるが、よく用いられる単純希釈剤の水、リキッドパラフィン以外にも様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレ
ングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択される何れかの剤形を有していてもよい。

前記本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体又は前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与される。本発明において、用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、癌の種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野で周知の要素に応じて決めることができる。本発明の組成物は、個別の治療薬として投与するか、又は他の治療薬と併用して投与してもよく、従来の治療薬と順次又は同時に投与してもよい。そして、単回又は複数回投与してもよい。前記要素を全て考慮し、副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって決められてもよい。

ここで、前記組成物は、薬学的に有効な量で単回又は複数回投与してもよい。この場合、組成物は、液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶皮錠剤もしくはカプセル剤、又は坐剤の形態で投与してもよい。投与経路には、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが含まれるが、これに限定されるものではない。しかし、経口投与の場合、ペプチドが消化されるため、経口組成物は、活性薬剤をコーティングするか、又は胃での分解から保護されるように製剤化されるべきである。さらに、薬学的組成物は、活性物質が標的細胞へ移動可能な任意の装置によって投与されてもよい。

また、本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造における前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は二重特異性抗体の用途を提供する。

本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造における前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は二重特異性抗体を含む薬学的組成物の用途を提供する。

本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は二重特異性抗体の用途を提供する。

本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療のための前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は二重特異性抗体を含む薬学的組成物の用途を提供する。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体、薬学的組成物、自己免疫疾患、炎症性疾患、予防、又は治療については、矛盾しない限り、前述の説明と同様である。

本発明は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含み、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の単離された生物学的試料のＯＸ４０Ｌタンパク質を抗原抗体反応によって検出する、
診断用組成物を提供する。

本発明の実施形態において、前記診断用組成物は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の発病有無を診断することができる。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体、自己免疫疾患及び炎症性疾患は、矛盾しない限り、前述の説明と同様である。

本発明において、用語「診断」は、病理状態の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の発病有無を確認することである。

本発明において、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片又は前記診断用組成物は、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の単離された試料のＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを測定し、測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを健常人及び／又は患者対照群の試料と比較して自己免疫疾患又は炎症性疾患を判断するのに用いてもよい。

そのためのタンパク質のレベルを測定する方法としては、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、放射免疫測定（ｏｔＡ：ｂａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｂａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定アッセイ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。前記のような分析方法を用いて、健常人対照群と自己免疫疾患の疑いのある個体におけるＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを比較することができ、これにより、疾患が疑われる患者における自己免疫疾患の発病有無を診断できるようになる。

本発明の自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断用組成物は、本発明の抗体に加えて、前記タンパク質のレベルを測定する方法を実施するために必要なものとして当業界で公知のものを制限なくさらに含んでもよい。

本発明の診断用組成物が、前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含む場合、前記診断用組成物は、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の単離された生物学的試料のＴＮＦαタンパク質を抗原抗体反応によって検出する組成物であってもよい。具体的には、前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含む場合、前記診断用組成物は、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の単離された生物学的試料のＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つを抗原抗体反応によって検出する組成物であってもよい。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体又は前記診断用組成物は、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の単離された試料のＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つのレベルを測定して、自己免疫疾患又は炎症性疾患と判断するために用いてもよい。

前記タンパク質のレベルを測定する方法は、矛盾しない限り、前述の説明と同様である。

本発明は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体、又はそれらを含む診断用組成物を用いることによる自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断方法又は診断のための情報の提供方法を提供する。具体的には、本発明は、（ａ）前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患が疑われる個体の単離された試料のＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを測定するステップ；及び（ｂ）前記ステップ（ａ）で測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患を判断するステップを含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断方法、又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断するための情報の提供方法を提供する。

例えば、測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患を判断するステップは、前記測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質のレベルを一般的な健常人及び／又は患者のタンパク質のレベルと比較することによって実施してもよい。

本発明は、（ａ）前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を用いて、自己免疫疾患が疑われる個体の単離された試料のＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つのレベルを測定するステップ；及び（ｂ）前記ステップ（ａ）で測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つのタンパク質のレベルを用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患を判断するステップを含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の診断方法、又は自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断するための情報の提供方法を提供する。

例えば、測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つのタンパク質のレベルを用いて、自己免疫疾患又は炎症性疾患を判断するステップは、前記測定されたＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つのタンパク質のレベルを一般的な健常人及び／又は患者のＯＸ４０Ｌタンパク質及びＴＮＦαタンパク質のうち少なくとも１つのタンパク質のレベルと比較することによって実施してもよい。

本発明は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断するための情報を提供するキットを提供する。

前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片、又は前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体、自己免疫疾患、炎症性疾患、個体、診断及びタンパク質のレベルを測定するステップ（方法）については、矛盾しない限り、前述の説明と同様である。

本発明において、用語「試料」は、自己免疫疾患患者においてＯＸ４０Ｌの発現レベルが異なる全血、血清、血液、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、脳脊髄液及び細胞間液などの試料を含むが、これに限定されない。

本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合して受容体間の結合を効果的に阻害するだけでなく、免疫抑制能に優れており、自己免疫疾患、炎症性疾患の治療及び診断分野において著しく優れた効果を示すことができる。

さらに、前記ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαに特異的に結合する二重特異性抗体は、ＯＸ４０ＬだけでなくＴＮＦαにも強い親和性を示し、人体で長期間結合を保持するため免疫抑制能に優れており、自己免疫疾患、炎症性疾患の治療及び診断分野において著しく優れた効果を示すことができる。

図１は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合できる二重特異性抗体の構造を例示的に示したものである。図１において、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３は、重鎖の定常領域、ＣＬは、軽鎖の定常領域を意味し、縞模様（又は斜線）で示される部分は、各鎖の可変領域（ＣＤＲ領域（白）及びフレームワーク領域（有色））を示す。 図２は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合できる二重特異性抗体を産生した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果を示したものである。 図３は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体に対するＯＸ４０Ｌ抗原のｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ結果をＨＤＸ－ＭＳにより分析して示したものである。 図４は、二重特異性抗体が、抗原であるＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合できるかをビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析法により測定した結果を示したものである。図４のグラフの横軸は、Ｔｉｍｅ（０＝ｃａｐｔｕｒｅ_ｌｅｖｅｌ）であり、縦軸は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（０＝ｃａｐｔｕｒｅ_ｌｅｖｅｌ）である。 図５は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合できる二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｓｓａｙ結果を示したものである。 図６は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαに同時に結合できる二重特異性抗体のＴ ｃｅｌｌのＩＬ－２分泌に関する影響を確認した結果を示したものである。

以下、実施例により本発明を詳しく説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明が下記実施例により限定されるものではない。

実施例１：ＯＸ４０Ｌ特異的抗体クローンの選別

実施例１－１：ＯＸ４０Ｌ抗原の準備

ヒトＯＸ４０Ｌの抗原は、細胞外ドメインを活用してＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００３３１７のヒトＯＸ４０Ｌアミノ酸配列（配列番号１）の５１番目～１８３番目の
アミノ酸配列（Ｑ５１～Ｌ１８３）のＮ末端にヒスチジンタグを融合させて作製された、アクロバイオシステムズ社から提供されたヒトＯＸ４０Ｌタンパク質（Ｃａｔ＃ ＯＸＬ－Ｈ５２Ｑ８）を入手して用いた。

前記アクロバイオシステムズ社のヒトＯＸ０４Ｌタンパク質（抗原）のアミノ酸配列は、配列番号２に明示した。前記提供された抗原は、ＨＥＫ２９３細胞で産生され、１６．９ｋＤａの大きさを有する。

実施例１－２：ヒトライブラリーファージの作製

多様性を有するヒト由来ｓｃＦｖライブラリー細胞７．５×１０^１０個を、２×ＹＴ－ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｍｇｃｌ２－ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（ＣＭ）培地に３７℃で培養液の吸光度がＯＤ_６００＝０．５～０．７になるまで培養した。

前記細胞にヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を感染させ、３７℃で約１時間培養した。培養した細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した後、２×ＹＴ－ＩＰＴＧ－Ｍｇｃｌ_２－ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ（ＫＭ）－ＣＭ培地を入れて細胞を再混合し、３０℃の振盪培養器で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、上清液に４％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ、８１２５３）、３％ＮａＣｌ（Ｊｕｎｓｅｉ、１９０５－０３５０）を加えてよく溶かした後、氷で約１時間反応させた。再び遠心分離（７５００ｒｐｍ、４℃、３０分）し、ペレットにＤＰＢＳ（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ、ＬＢ００１－０２）を加えて溶かした後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分）してライブラリーファージを含む上清液を得、新しいチューブに入れて５±３℃で保管した。

実施例１－３：免疫ライブラリーファージの作製

実施例１－１のヒトＯＸ４０Ｌ抗原（配列番号２）で、Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｏｕｓｅとＳＤ ＲＡＴを用いて免疫ライブラリーファージを作製した。

７週齢のＢａｌｂ／Ｃマウス１０匹と８週齢の雄ＳＤ ＲＡＴ４匹を純化した後、０日目、２１日目、４２日目、６３日目にヒトＯＸ４０Ｌ抗原で免疫を行い、８４日目に脾臓を摘出してＲＮＡを溶出した。溶出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、重鎖可変部と軽鎖可変部を増幅した。重鎖可変部と軽鎖可変部を混合し、ｓｃＦｖ型に増幅されたＤＮＡをファージベクター（ｐＹＧ１００）に挿入して、ＲＡＴ由来の免疫ｓｃＦｖライブラ
リー細胞を作製した。作製した細胞を２×ＹＴ－ｇｌｕｃｏｓｅ－Ｍｇｃｌ２－ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（ＣＭ）培地に３７℃で培養液の吸光度がＯＤ_６００＝０．５～０．７になるまで培養した。

前記培養した細胞にヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を感染させ、３７℃で約１時間培養した。培養した細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した後、２×ＹＴ－ＩＰＴＧ－Ｍｇｃｌ_２－ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ（ＫＭ）－ＣＭ培地を入れて細胞を再混合し、３０℃の振盪培養器で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、上清液に４％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ、８１２５３）、３％ＮａＣｌ（Ｊｕｎｓｅｉ、１９０５－０３５０）を加えてよく溶かした後、氷で約１時間反応させた。再び遠心分離（７５００ｒｐｍ、４℃、３０分）し、ペレットにＤＰＢＳ（Ｗｅｌｌｇｅｎｅ、ＬＢ００１－０２）を加えて溶かした後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分）してライブラリーファージを含む上清液を得、新しいチューブに入れて５±３℃で保管した。

実施例１－４：ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）

ヒトＯＸ４０Ｌに結合するＯＸ４０Ｌ抗体を選別するために、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に実施例１－１のヒトＯＸ４０Ｌタンパク質を含む溶液を１～１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、５±３℃で一晩免疫試験管の表面にＯＸ４０Ｌタンパク質を吸着させた後、ウシ血清アルブミン１％溶液を試験管に添加して、ＯＸ４０Ｌが吸着していない表面を保護した。試験管を空にした後、１％ウシ血清アルブミン溶液に分散した１０^１２ＣＦＵのヒト抗体ファージライブラリー（実施例１－２）又は免疫ファージライブラリー（実施例１－３）を試験管に入れて抗原と結合させた。非特異的に結合したファージをＰＢＳ－Ｔ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で５～２０回洗浄し、ＤＰＢＳで１～５回さらに洗浄した後、残っている抗原特異的ファージ抗体を０．１Ｍ ＴＡＥ溶液を用いて回収した。

前記回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．５）で中和した後、ＸＬ１Ｂｌｕｅ大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をＳＯＢＣＧプレートにガラスビーズを用いて塗抹し、３７℃の培養器で約１６時間培養した。翌日、培養した大腸菌を４ｍｌのＳＢ（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）カルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して一部は－８０℃に保管し、残りのうち５０μｌを２０ｍｌのＳＢカルベニシリン培養液に２％ブドウ糖溶液（ｇｌｕｃｏｓｅ）を添加して３７℃で培養した。培養液の吸光度が６００ｎｍで０．６になったら遠心分離して培養液を除去し、これを再び２０ｍｌのＳＢカルベニシリン培養液に懸濁した後、１０^１２ＰＦＵのＭ１３ヘルパーファージを入れてゆっくり撹拌しながら３７℃で培養した。翌日、培養液を遠心分離して培養液のみを取り、ポリエチレングリコールと塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を加えて４℃で３０分間沈殿させた後、遠心分離した。上清液を除去し、沈殿したファージをＰＢＳ １ｍｌに懸濁させ、これをライブラリーとして用いて前記パンニング工程を３～５回繰り返すことによって、抗原特異的クローンを増幅／濃縮した。

実施例１－５：ファージパンニング後の特異的クローンの選別

ヒトＯＸ４０Ｌタンパク質と結合する抗体（ｓｃＦｖ）を選別するために、以下の２つの方法のうち１つを用いて抗原特異的クローンを選別した。

第１に、パンニングを行った後、寒天培地に塗抹培養して単一コロニーを得、これを１～１．５ｍＬの培養液に接種、培養した後、ＩＰＴＧに誘導し、ｓｃＦｖ型のタンパク質
を大腸菌で発現した。大腸菌培養物を遠心分離して上清液を得、これをＥＬＩＳＡ法によって組換えヒトＯＸ４０Ｌ抗原とｓｃＦｖとの結合を確認するために用いた（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ．Ｒａｄｅｒ ａｎｄ ＢａｒｂａｓＩＩＩ．２０００．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．１ｓｔｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．ＮＹ．ＵＳＡ．ｐｐ．１１．９－１１．１２）。結合したｓｃＦｖは、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）－ａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体とテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて検出した。

第２に、パンニングを行った後、ＳＯＢＣＧプレートから単一のファージを得、これを１ｍＬずつ培地を分注したｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接種し、１６時間３７℃で振盪培養した。増幅された細胞を１０倍希釈してｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに再び接種し、ＯＤ_６００で０．５になるまで３７℃の振盪培養器で培養した。ＯＤ_６００で０．５に達したら、Ｍ１３ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅを１０^９ＣＦＵレベルで入れ、３７℃の静置培養器で３０分間、３７℃の振盪培養器で３０分間感染させた。感染が終わったら遠心分離して細胞を沈殿させて上清液を得、ＥＬＩＳＡ法によってヒトＯＸ４０Ｌ抗原と結合するｓｃＦｖを確認した。結合したｓｃＦｖは、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）－ａｎｔｉ－Ｍ１３抗体とテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて検出した。
これらより確認された抗原特異的抗体（ｓｃＦｖ）クローンは、塩基配列分析法により分析した。

実施例２：抗ＯＸ４０Ｌ抗体の作製

前記実施例１－５で得られた抗体可変領域（ｓｃＦｖ）に対する配列に基づいて、重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列番号８）と連結し、軽鎖可変領域は軽鎖定常領域（配列番号１０）と連結して作製した。前記抗体を０２Ｃ０９、Ｈｕ３Ｆ０７、１０Ｈ０７、２１Ｇ０７、Ｉ３Ｆ０７と名付けた。

（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９

０２Ｃ０９抗体は、配列番号１２で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で示される重鎖ＣＤＲ２；配列番号１９で示される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２３で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５で示される軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２７で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む。

抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９は、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。

遺伝子の細胞内送達効率を高めるポリマーであるＰＥＩを用いて、抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９をコードする遺伝子を含む発現ベクターを形質導入した浮遊ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ動物細胞を５００ｍＬ培養用三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で瓶１本当たり２００ｍＬで培養し、必要に応じて大量培養した。

形質導入されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ細胞は、３７℃、８％ＣＯ_２条件下で浮遊培養し、培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＡＧＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＧ１０００Ｄ９Ｐ１）を用いて培養した。過剰発現させる場合は、培養培地５ｍＬ中にＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６－２）５００μｇと過剰発現させようとするＤＮＡを１２５μｇ混合して行った。ＤＮＡ－ＰＥＩを入れてから約２４時間後に１０％ｓｏｙｔｏｎｅ（ＢＤ、２１２４８８）を１０ｍＬ入れ、約５日間さらに培養した後、上清液のみを得て抗体の精製に用いた。

抗体を精製するために、一次的に組換えプロテイン－Ａセファロースカラムを用いて抗体を培養液から精製した。純度の向上が必要なときは、一次精製生成物を用いて二次精製を行った。その際には、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製し
た。

（２）抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｈｕ３Ｆ０７

Ｈｕ３Ｆ０７抗体は、配列番号１３で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６で示される重鎖ＣＤＲ２；配列番号２０で示される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２８で示される軽鎖ＣＤＲ３を含
む。

抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｈｕ３Ｆ０７は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（３）抗ＯＸ４０Ｌ抗体１０Ｈ０７

１０Ｈ０７抗体は、配列番号１３で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１７で示される重鎖ＣＤＲ２；配列番号２１で示される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２９で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む。

抗ＯＸ４０Ｌ抗体１０Ｈ０７は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株
を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（４）抗ＯＸ４０Ｌ抗体２１Ｇ０７

２１Ｇ０７抗体は、配列番号１４で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１８で示される重鎖ＣＤＲ２；配列番号２２で示される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３０で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む
。

抗ＯＸ４０Ｌ抗体２１Ｇ０７は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（５）抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７

Ｉ３Ｆ０７抗体は、配列番号１３で示される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６で示される重鎖ＣＤＲ２；配列番号２０で示される重鎖ＣＤＲ３；配列番号２４で示される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６で示される軽鎖ＣＤＲ２；配列番号２８で示される軽鎖ＣＤＲ３を含む。

抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７は、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株
を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

実施例３：ＯＸ４０ＬとＴＮＦαを標的とする二重特異性抗体の作製

前記実施例２で作製されたヒトＯＸ４０Ｌと結合する抗体（０２Ｃ０９、Ｈｕ３Ｆ０７、Ｉ３ＦＯ７）又はその断片（ｓｃＦｖ）を、リンカーを用いて抗ＴＮＦα抗体（ＴＮＦαｉ抗体（Ｈｕｍｉｒａ））又はその断片（ｓｃＦｖ）と連結し、ヒトＴＮＦαにも結合できる二重特異性抗体を作製した（図１参照）。

具体的には、前記二重特異性抗体は、（ｉ）抗ＯＸ４０Ｌ抗体の重鎖定常領域Ｃ末端に抗ＴＮＦα抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで連結した形態と；（ｉｉ）
抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖定常領域Ｃ末端に抗ＴＮＦα抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで連結した形態と；（ｉｉｉ）抗ＴＮＦα抗体の重鎖定常領域Ｃ末端に抗ＯＸ４０Ｌ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで連結した形態と；（ｉｖ）抗ＴＮＦα抗体の軽鎖定常領域Ｃ末端に抗ＯＸ４０Ｌ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで連結した形態で作製し、それぞれＩｇＧ－ｓｃＦｖ－結合位置の順に０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＨＣ、０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＬＣ、ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣ、ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣ、ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＨＣ、ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＬＣ、ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＨＣ、ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＬＣ、Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣ、Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣ、ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＨＣ、ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＬＣと名付けた。

前記リンカーは、配列番号３１で示されるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを用いた。

前記ＴＮＦαｉ抗体は、前記実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体の産生（作製）方法と実質的に同様の方法であり、前記ＴＮＦα抗体の重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列番号８）と連結し、軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域（配列番号１０）と連結して作製した。

（１）二重特異性抗体０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＨＣ

前記二重特異性抗体０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＨＣは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の重鎖定常領域Ｃ末端に、ＴＮＦαｉ抗体（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖可変領域（配列番号３５）とＴＮＦαｉ抗体（Ｈｕｍｉｒａ）の軽鎖可変領域（配列番号３６）とがリンカー（配列番号３２）で連結されているＴＮＦαｉ抗体の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＨＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（２）二重特異性抗体０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＬＣ

０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＬＣは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の軽鎖定常領域Ｃ末端に、Ｈｕｍｉｒａ重鎖可変領域（配列番号３５）とＨｕｍｉｒａ軽鎖可変領域（配列番号３６）とがリンカー（配列番号３２）で連結されているＴＮＦαｉ抗体の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＬＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（３）二重特異性抗体Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣ
Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の重鎖定常領域Ｃ末端に、ＴＮＦαｉ抗体の重鎖可変領域（配列番号３５）とＴＮＦαｉ抗体の軽鎖可変領域（配列番号３６）とがリンカー（配列番号３２）で連結されているＴＮＦαｉ抗体の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（４）二重特異性抗体Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣ

Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の軽鎖定常領域Ｃ末端に、ＴＮＦαｉ抗体の重鎖可変領域（配列番号３５）とＴＮＦαｉ抗体の軽鎖可変領域（配列番号３６）とがリンカー（配列番号３２）で連結されているＴＮＦαｉ抗体の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（５）二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＨＣ

ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＨＣは、ＴＮＦαｉ抗体（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖定常領域Ｃ末端に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の重鎖可変領域（配列番号３７）と抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の軽鎖可変領域（配列番号３８）とがリンカー（配列番号３２）で連結されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＨＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（６）二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＬＣ

ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＬＣは、ＴＮＦαｉ抗体の軽鎖定常領域Ｃ末端に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の重鎖可変領域（配列番号３７）と抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の軽鎖可変領域（配列番号３８）とがリンカー（配列番号３２）で連結されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＬＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（７）二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＨＣ

ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＨＣは、ＴＮＦαｉ抗体の重鎖定常領域Ｃ末端に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の重鎖可変領域（配列番号４１）と抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の軽鎖可変領域（配列番号４２）とがリンカー（配列番号３２）で連結されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＨＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（８）二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＬＣ

ＴＮＦαｉ－ｈｕ３Ｆ０７ ＬＣは、ＴＮＦαｉ抗体の軽鎖定常領域Ｃ末端に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の重鎖可変領域（配列番号４１）と抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の軽鎖可変領域（配列番号４２）とがリンカー（配列番号３２）で連結されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体ｈｕ３Ｆ０７の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＬＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（９）二重特異性抗体Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣ

前記二重特異性抗体Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の重鎖定常領域Ｃ末端に、ＴＮＦαｉ抗体（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖可変領域（配列番号３５）とＴＮＦαｉ抗体（Ｈｕｍｉｒａ）の軽鎖可変領域（配列番号３６）とがリンカー（配列番号３２）で連結されているＴＮＦαｉ抗体の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（１０）二重特異性抗体Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣ

Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の軽鎖定常領域Ｃ末端に、Ｈｕｍｉｒａの重鎖可変領域（配列番号３５）とＨｕｍｉｒａの軽鎖可変領域（配列番号３６）とがリンカー（配列番号３２）で連結されているＴＮＦαｉ抗体の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＬＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（１１）二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＨＣ

ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＨＣは、ＴＮＦαｉ抗体の重鎖定常領域Ｃ末端に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の重鎖可変領域（配列番号５３）と抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の軽鎖可変領域（配列番号５４）とがリンカー（配列番号３２）で連結されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＨＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

（１２）二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＬＣ

ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＬＣは、ＴＮＦαｉ抗体の軽鎖定常領域Ｃ末端に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の重鎖可変領域（配列番号５３）と抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の軽鎖可変領域（配列番号５４）とがリンカー（配列番号３２）で連結されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体Ｉ３Ｆ０７の結合断片（ＳｃＦｖ）が、リンカー（配列番号３１）で連結されている。

二重特異性抗体ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＬＣは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３－Ｆの動物細胞株を用いて作製した。具体的な培養条件、培養方法、及び精製方法は、前記（１）抗ＯＸ４０Ｌ抗体０２Ｃ０９で説明したものと実質的に同様にして行った。

また、前記実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体の産生（作製）方法と実質的に同様の方法で、抗ＯＸ４０Ｌ抗体であるｏｘｅｌｕｍａｂのＶＨとＶＬのｓｅｑｕｅｎｃｅ（配列番号３３及び３４）を用いてｒｅｆｅｒｅｎｃｅ抗体である抗ＯＸ４０Ｌ抗体（以下、Ｒｅｆ．Ａｂ又はＯ４Ｌ）を作製し、抗ＴＮＦα抗体であるＨｕｍｉｒａのＶＨとＶＬ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（配列番号３５及び３６）を用いてｒｅｆｅｒｅｎｃｅ抗体である抗ＴＮＦα抗体（以下、Ｒｅｆ．ＴＮＦαｉ又はＨｕｍｉｒａ）を作製した。

前記作製した抗体Ｏ４Ｌ及び前記Ｒｅｆ．ＴＮＦαｉを用いて、前記実施例３の二重特異性抗体の産生（製造）方法と実質的に同様の方法で、抗ＯＸ４０Ｌ－ＴＮＦαｉ ＨＣ及びＬＣ抗体（以下、それぞれＯ４Ｌ－ＴＮＦαｉ ＨＣ及びＯ４Ｌ－ＴＮＦαｉ ＬＣ）を作製した。

実験例１：抗体の分析

実施例２で得られた抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び実施例３で得られた二重特異性抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析し、その結果を図２に示した。

実験例２：抗ＯＸ４０Ｌ抗体に対するＯＸ４０Ｌ抗原のｅｐｉｔｏｐｅ

抗ＯＸ４０Ｌ抗体に対するＯＸ４０Ｌ抗原のｅｐｉｔｏｐｅを、ＨＤＸ－ＭＳにより分析を行った。０．１２～２．００Ｍ Ｕｒｅａ、０．１２～１．００Ｍ ＴＣＥＰ（ｐＨ２．６）ｑｕｅｎｃｈ ｂｕｆｆｅｒとｐｅｐｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎを用い、５つのｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓに対してＤ_２Ｏベースの緩衝溶液でｌａｂｅｌｉｎｇして分析した。データは、ＰＬＧＳとＤｙｎａｍＸを用いて処理し、図３のような結果を得た。

実験例３：抗体の特性

実験例３－１．抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び二重特異性抗体の抗原に対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）分析

前記実施例２及び３で単離、精製された抗ＯＸ４０Ｌ抗体及びＯＸ４０ＬとＴＮＦαを同時に制御する二重特異性抗体の抗原に対する親和性を以下のように分析した。

前記抗体のうち抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号２）との結合力を確認し、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦα二重特異性抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号２）とヒトＴＮＦα（アクロバイオシステムズ社のＴＮＦ－Ｈ５２２８）に対してそれぞれ結合力を確認した（表３２）。

ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析は、Ｂｉｃｏｒｅ Ｔ２００を用い、ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒは、ＨＢＳ－ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５％ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉ
ｔ（ａｎｔｉ－ｈＦｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いてａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ法によりＣＭ５チップの表面に固定した。ヒトＯＸ４０Ｌ又はヒトＴＮＦαをｒｕｎｎｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒで１０ｎＭに希釈した後、１／２連続希釈して５濃度区間で分析した。抗体の濃度は、抗体を０．２μｍフィルターで滅菌濾過し、吸光度（Ａ２８０）を測定して確認した。分析試料は、最小希釈倍数１００以上となるように高純度／高濃度で用意し、緩衝液の変化による影響（Ｂｕｆｆｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）を最小化した。全ての分析の間には再活性化ステップ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）を設けて実験のベースラインが一定に保てるようにした。Ｂｉａｃｏｒｅ分析結果は、表３２及び図４の通りである。

図４において、Ａｇ１は、ヒトＯＸ４０Ｌを示し、Ａｇ２は、ヒトＴＮＦαを示す。

前記表３２から確認できるように、実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、ＯＸ４０Ｌに、実施例３の二重特異性抗体は、ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦαの両方に強く結合することが確認できた。具体的には、抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び二重特異性抗体の何れもＯＸ４０Ｌとの結合力はｎＭレベルであり、特に、二重特異性抗体は、ＴＮＦαとの結合力もｎＭレベルであることを確認した。前記結果は、二重特異性抗体がそれぞれの抗原に対して結合能を妨げられることなく高いレベルを保持することを示唆している。

実験例３－２．抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び二重特異性抗体の熱安定性試験

実施例３の二重特異性抗体及び実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体の熱安定性に関する特性を確認するために試験を行った（表３３）。

抗体をＤＰＢＳに希釈して３μＭ／４５μＬを作製した後、２００×ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ ｄｙｅ（＃Ｓ６６５０、Ｔｈｅｒｍｏ）５μＬと混合し、ｑＰＣＲ Ｔｕｂｅ（＃Ｂ７７００９、Ｂ５７６５１、ｂｉｏｐｌａｓｔｉｃｓ）に５０μＬずつ分注した。
Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ９６ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器を用いてｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲの条件は、２５℃で３０秒間反応させた後、９９℃まで１℃ずつ昇温しながら各温度で１分間反応させ、最後に２５℃で１０秒間反応させた後終了した。抗体の構造が解ける速度定数としては、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、溶融温度）を用い、その結果は、下記表３３の通りである。

前記表から確認できるように、抗ＯＸ４０Ｌ抗体と二重特異性抗体の融解温度は、５９～６５℃の間であり、前記結果は、二重特異性抗体も抗ＯＸ４０Ｌ抗体と同様の熱安定性を有することを示す。

実験例３－３．抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び二重特異性抗体のＰＫ（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）

実施例３の二重特異性抗体及び実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体を投与したときの薬物動態を確認するために分析を行った（表３４）。

薬物反応が一定していて安定した供給システムを備えているため、薬物動態試験に広く用いられるＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系の雄Ｒａｔを用いた。試験は、絶食せずに行い、７週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ｒａｔを３匹ずつ用い、５ｍｐｋ（２．５～２．４ｍｇ／ｍｌ）で単回静脈投与（ＩＶ ｂｏｌｕｓ）した。投与後、３ｍｉｎ、３、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８－ｈｒで合計１０回頸
静脈で約１５０ｕｌ／ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ採血し、抗凝固剤としてＳｏｄｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎを用いて単離し、試料は、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）により約７０μｌの血漿を得、その直後に超低温冷凍庫に保管した。実験中は１日１回以上一般症状を観察した。最後の採血後、実験動物は、ＣＯ_２吸入により安楽死させた。

ＰＫ試験により得られたＰｌａｓｍａは、分析装置のＧｙｒｏｌａｂ ｘＰｌｏｒｅ（登録商標）（Ｃａｔ．＃Ｐ００２０３００、ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ）とＧｙｒｏｌａｂ ＰＫ ｋｉｔ（Ｃａｔ．＃Ｐ００２０４９９、ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ）により分析した。Ｇｙｒｏｌａｂからの結果値をＢＡ Ｃａｌｃ ２００７ １．０．０又はＰＫ Ｓｏｌｖｅｒ ２．０プログラムを用いてＡＵＣ（ｌａｓｔ）、ＡＵＣ（ｉｎｆ）、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｈａｌｆ ｌｉｆｅなどのｐａｒａｍｅｔｅｒ値を得た。その結
果は、表３４の通りである。

実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体の半減期は、それぞれ３．６ｄａｙ、４．０ｄａｙであり、実施例３の二重特異性抗体は、３．６～６．０ｄａｙで観察された。
したがって、ヒトにおいても約２週間以上の半減期を示すことができると推測できる。

実験例４：抗体の効能

実験例４－１．抗体のシグナル抑制能の評価（１）

実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体と実施例３の二重特異性抗体（Ｈｕ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ
ＨＣ、０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＨＣ、Ｏ４Ｌ－ＴＮＦαｉ ＨＣ）の活性評価実験は、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１９７７０６）とＴＮＦα／ＴＮＦα Ｒｃ遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１７７５０３）を用いて行った（表３５、図５）。

（１）ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０遮断バイオアッセイキットを用いて、実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び実施例３の二重特異性抗体の活性を評価した。

ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌをＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培養液に浸し、３７℃、５％ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで一晩静置培養した。
翌日、細胞に反応させる抗原と抗体を準備した。ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）培養液においてＯＸ４０Ｌ抗原を細胞に取り入れたときの最終濃度が１５ｎｇ／ｍＬとなるように準備した。抗ＯＸ４０Ｌ抗体と二重特異性抗体及び対照抗体は、細胞に取り入れたときに開始濃度の最終濃度が３３μｇ／ｍＬとなるように希釈した後、１／３ずつ階段希釈して９段階で準備した。１０番目の濃度は０で培養液に置き換えて合計１０段階の濃度勾配となるように準備した。準備した抗原希釈液と抗体希釈液をそれぞれ２５μＬずつ細胞に分注した。各試料が３反復となるように分注した。分注後、細胞と抗原希釈液、抗体希
釈液が合計１００μＬとなるようにした。ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで約５時間反応さ
せた。

Ｂｉｏ－Ｇｌｏを７５μＬずつ分注して約１０分間反応させ、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒによりｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅで試料を分析した後、４－ｐａｒａｍｅｔｅｒ（Ｘ軸ｌｏｇ（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））で分析した。

抗体の濃度単位であるμｇ／ｍＬでＩＣ_５０分析結果をｎＭに換算して最終ＩＣ_５０を求めた。これは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体は１５０ｋＤａであり、二重特異性抗体は２００ｋＤａであるため、同一条件で見るためであった。

（２）ＴＮＦα／ＴＮＦα Ｒｃ遮断バイオアッセイキットを用いて二重特異性抗体の活性を評価した。

ＮＦκＢ－ＲＥ ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌ ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培養液に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで静置培養した。細胞に反応させる抗原と抗体
を準備した。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培養液にＴＮＦα抗原を希釈して細胞に反応させるとき、最終濃度は３ｎｇ／ｍＬとなるようにした。二重特異性抗体と対照抗体であるＨｕｍｉｒａ（Ｒｅｆ．ＴＮＦαｉ）の開始濃度を１０ｎＭの濃度でＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培養液に希釈した後、１／２ずつ階段希釈して８段階で準備した。細胞に反応させるとき、最終濃度は、開始濃度が０．８ｎＭとなるようにした。

準備した抗原希釈液と抗体希釈液を３：２で混合し、２０μＬずつ細胞に分注した。各試料が２反復となるように分注した。分注後、ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒで約４時間反
応させた。

Ｂｉｏ－Ｇｌｏを１００μＬずつ分注して反応させ、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒによりｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅで試料を分析した後、４－ｐａｒａｍｅｔｅｒ（Ｘ軸ｌｏｇ（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））で分析してＩＣ_５０を求めた。

前記ＩＣ_５０値は、下記表３５及び図５の通りである。

前記表３５及び図５から分かるように、実施例２及び３による二重特異性抗体及び抗ＯＸ４０Ｌ抗体のＯＸ４０Ｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ能力は、１．３×１０^－９Ｍ（ｎＭ）以下のレベルであり、特に、抗ＯＸ４０Ｌ抗体のＯＸ４０Ｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ能力は、０．９×１０^－９Ｍ（ｎＭ）以下のレベルであり、二重特異性抗体は、ＴＮＦαのｂｌｏｃｋｉｎｇ能力も１×１０^－９Ｍ（ｎＭ）以下のレベルで、著しく優れたｂｌｏｃｋｉｎｇ能力を示すことが分かった。すなわち、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、優れたＯＸ４０Ｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ能力を示し、前記抗体を用いて作製した二重特異性抗体は、ＯＸ４０ＬだけでなくＴＮＦαに対しても優れたｂｌｏｃｋｉｎｇ能力を示すことが分かる。

実験例４－２．抗体のシグナル抑制能の評価（２）

実施例３の二重特異性抗体（０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＬＣ、ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９
ＨＣ、ＴＮＦαｉ ０２Ｃ０９ ＬＣ）の活性をＴＮＦα／ＴＮＦα Ｒｃ遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１７７５０３６）を用いて評価した（表３６）。具体的な評価条件及び方法は、前記実験例４－１．抗体のシグナル抑制能の評価（１）で説明したものと実質的に同様である。

前記表３６から分かるように、実施例３の二重特異性抗体０２Ｃ０９－ＴＮＦαｉ ＬＣ、ＴＮＦαｉ－０２Ｃ０９ ＨＣ、ＴＮＦαｉ ０２Ｃ０９ ＬＣのＴＮＦα ｂｌｏｃｋｉｎｇ能力は、１×１０^－９Ｍ（ｎＭ）以下のレベルであり、優れたｂｌｏｃｋｉｎｇ能力を示すことが分かった。

実験例４－３．抗体のシグナル抑制能の評価（３）

実施例３の二重特異性抗体（Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ ＨＣ、Ｉ３Ｆ０７－ＴＮＦαｉ
ＬＣ、ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＨＣ、ＴＮＦαｉ－Ｉ３Ｆ０７ ＬＣ）の活性をＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１９７７０６）とＴＮＦα／ＴＮＦα Ｒｃ遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ：Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１７７５０３）を用いて評価した（表３７）。具体的な評価条件及び方法は、前記実験例４－１．抗体のシグナル抑制能の評価（１）で説明したものと実質的に同様である。

前記表３７から分かるように、実施例３の二重特異性抗体のＯＸ４０Ｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ能力は、１×１０^－９Ｍ（ｎＭ）以下のレベルであり、ＴＮＦαのｂｌｏｃｋｉｎｇ能力も１×１０^－９Ｍ（ｎＭ）以下のレベルで、優れたｂｌｏｃｋｉｎｇ能力を示すことが分かった。

実験例４－４．抗体の免疫細胞活性阻害能の評価

実施例２の抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び実施例３の二重特異性抗体の効能を評価するために、健常人のＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅ
ｌｌ）及び関節リウマチ（ＲＡ）患者のＰＢＭＣを用いて免疫細胞の活性阻害能を確認した（図６）。

前記方法により健常人のＰＢＭＣ及びＲＡ患者のＰＢＭＣからそれぞれＴ細胞を単離し、Ｔ細胞が活性化したときに分泌されるサイトカインであるＩＬ－２の分泌減少レベルを分析した。

健常人及び患者のＰＢＭＣからそれぞれＴ細胞を分画するために、ａｎｔｉ ＣＤ３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１００）を１００ｎｇ／ｗｅｌｌに希釈し、９６ｗｅｌｌに約１６時間５±３で付着させた。付着液を除去した後、ＰＢＳで洗浄した。ＬＧＭ－３（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）にＤＮａｓｅ Ｉを２０Ｕ／ｍＬとなるように希釈した後、健常人のＰＢＭＣを入れて混合液を製造し、遠心分離（２００ｇ、１５分）して上清液を除去し、ＬＧＭ－３（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）を用いて健常人のＰＢＭＣが１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように希釈した後分注した。ヒトＯＸ４０Ｌ（ＡＣＲＯＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社、ＯＸＬ－Ｈ５２Ｑ８）とヒトＴＮＦα（ＳＩＮＯ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ、１０６０２－ＨＮＡ）をＬＧＭ－３（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）に希釈して分注した健常人のＰＢＭＣに５０μＬずつ添加した。抗ＯＸ４０Ｌ抗体及び二重特異性抗体をＬＧＭ－３（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）に８００ｎｇ／ｍＬで作製した後、１ｎＭとなるように希釈した。ＰＢＭＣから単離したＴ細胞とヒトＯＸ４０Ｌ、ヒトＴＮＦαを入れたｐｌａｔｅに５０μＬずつ分注して混ぜた。約２４～７２時間後に上清液のみを回収してＩＬ－２を測定し、その結果を図６に示した。

図６において、Ａは、健常人のＰＢＭＣ由来のＴ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ結果を示し、
Ｂは、患者のＰＢＭＣ由来のＴ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ結果を示す。

図６から確認できるように、本発明の二重特異性抗体を投与するとＩＬ－２が減少する傾向を示すことが確認できる。特に、ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来のＴ ｃｅｌｌ結果を見ると、本発明の二重特異性抗体は、Ｈｕｍｉｒａ（Ｒｅｆ．ＴＮＦαｉ）に対し、ＲＡ患者のＰＢＭＣ由来のＴ ｃｅｌｌにおいてＩＬ－２発現を著しく減少させたことが確認できる。これは、本発明の二重特異性抗体がＲＡに有効な治療用抗体として作用可能であって、特に、Ｈｕｍｉｒａに不応性のＲＡ患者においても有効に作用できることを意味する。

したがって、本発明の抗ＯＸ４０Ｌ抗体と二重特異性抗体は、過剰に活性化された免疫系を鎮めることができ、自己免疫疾患に優れた治療効果を示すことが分かる。

Claims (31)

1. ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）に特異的に結合し、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との相互作用を阻害する、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片であって、
   前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が：
   （ｉ）配列番号１２に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２７に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片；
   （ｉｉ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片；
   （ｉｉｉ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１７に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
   （ｉｖ）配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１８に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２２に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片である、
   抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
2. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３及び４からなる群から選択されるアミノ酸配列に記載の１つ以上のエピトープに結合するものである、請求項１に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
3. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＯＸ４０Ｌに１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合し、ここで、前記Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析によって測定されたものである、請求項１又は２に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
4. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
   配列番号１３のアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６のアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０のアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域を含むものである、請求項１～３の何れか一項に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
5. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
   配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～３の何れか一項に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
6. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
   配列番号３７、４１、４５、４９及び５３からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の重鎖可変領域；及び
   配列番号３８、４２、４６、５０及び５４からなる群から選択される１つのアミノ酸配列に記載の軽鎖可変領域を含むものである、請求項１又は２に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
7. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
   （ａ）配列番号３７に記載の重鎖可変領域及び配列番号３８に記載の軽鎖可変領域；
   （ｂ）配列番号４１に記載の重鎖可変領域及び配列番号４２に記載の軽鎖可変領域；
   （ｃ）配列番号４５に記載の重鎖可変領域及び配列番号４６に記載の軽鎖可変領域；
   （ｄ）配列番号４９に記載の重鎖可変領域及び配列番号５０に記載の軽鎖可変領域；又は
   （ｅ）配列番号５３に記載の重鎖可変領域及び配列番号５４に記載の軽鎖可変領域；
   を含むものである、請求項１又は２に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
8. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
   配列番号５、６、７及び８からなる群から選択される一つのアミノ酸配列に記載の重鎖定常領域；及び
   配列番号１０のアミノ酸配列に記載の軽鎖定常領域を含むものである、請求項７に記載の抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片。
9. ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片；及びＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体であって、
   前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が：
   （ｉ）配列番号１２に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５に記載の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１９に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２３に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２７に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片；
   （ｉｉ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６に記載の重鎖ＣＤＲ２；及
   び配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片；
   （ｉｉｉ）配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１７に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２１に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
   （ｉｖ）配列番号１４に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１８に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２２に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片である、
   二重特異性抗体。
10. 前記二重特異性抗体は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片と抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片とが連結されているものである、請求項９に記載の二重特異性抗体。
11. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３及び４からなる群から選択されるアミノ酸配列に記載の１つ以上のエピトープに結合するものである、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
12. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
    配列番号１３のアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６のアミノ酸配列に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域を含むものである、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
13. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
    配列番号１３に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号１６に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０に記載の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片である、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
14. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
    配列番号３３、３７、４１、４５、４９及び５３からなる群から選択される一つのアミノ酸配列に記載の重鎖可変領域；及び
    配列番号３４、３８、４２、４６、５０及び５４からなる群から選択される一つのアミノ酸配列に記載の軽鎖可変領域；を含むものである、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
15. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片は：
    （ａ）配列番号３７に記載の重鎖可変領域及び配列番号３８に記載の軽鎖可変領域；
    （ｂ）配列番号４１に記載の重鎖可変領域及び配列番号４２に記載の軽鎖可変領域；
    （ｃ）配列番号４５に記載の重鎖可変領域及び配列番号４６に記載の軽鎖可変領域；
    （ｄ）配列番号４９に記載の重鎖可変領域及び配列番号５０に記載の軽鎖可変領域；
    （ｅ）配列番号５３に記載の重鎖可変領域及び配列番号５４に記載の軽鎖可変領域；又は
    （ｆ）配列番号３３に記載の重鎖可変領域及び配列番号３４に記載の軽鎖可変領域；
    を含むものである、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
16. 前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は：
    配列番号８９に記載の重鎖ＣＤＲ１；配列番号９０に記載の重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９１に記載の重鎖ＣＤＲ３；を含む重鎖可変領域、及び
    配列番号９２に記載の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９３に記載の軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号９４に記載の軽鎖ＣＤＲ３；を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項１０～１５の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
17. 前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５に記載の重鎖可変領域及び配列番号３６に記載の軽鎖可変領域を含むものである、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
18. 前記二重特異性抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌに１．５×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合し、ヒトＴＮＦαに対しては１×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄで結合し、ここで、前記Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；Ｂｉａｃｏｒｅ）分析によって測定されたものである、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
19. 前記二重特異性抗体は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方の末端に、ＴＮＦαに特異的に結合する抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片が連結されているものである、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
20. 前記二重特異性抗体は、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片が連結されているものである、請求項１９に記載の二重特異性抗体。
21. 前記二重特異性抗体は、抗ＴＮＦα抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方の末端に、ＯＸ４０Ｌに特異的に結合する抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が連結されているものである、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
22. 前記抗ＴＮＦα抗体の軽鎖及び重鎖の少なくとも一方のＣ末端に、前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片が連結されているものである、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
23. 前記抗ＯＸ４０Ｌ抗体又はその抗原結合断片及び前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片は、リンカーで連結されているものである、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
24. 前記リンカーは、配列番号３１又は配列番号３２の配列に記載のものである、請求項２３に記載の二重特異性抗体。
25. 請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項９～２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
26. 請求項２５に記載の核酸を含む発現ベクター。
27. 請求項２６に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
28. 請求項２７に記載の形質転換体を用いた抗体又はその抗原結合断片、又は二重特異性抗体を産生する方法。
29. 請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項９～２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体、並びに薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、薬学的組成物。
30. 自己免疫疾患又は炎症性疾患を予防又は治療するための、請求項２９に記載の薬学的組成物。
31. 自己免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造における、請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項９～２４の何れか一項に記載の二重特異性抗体、又は請求項２９に記載の薬学的組成物の使用。