JP7656889B2 - Novel malate dehydrogenase - Google Patents
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Description
本願は新規リンゴ酸脱水素酵素に関する。 This application relates to a novel malate dehydrogenase.
リンゴ酸脱水素酵素(MDH)は、NAD＋またはNADH存在下でリンゴ酸とオキサロ酢酸を可逆的に変換する。NAD＋とNADHはそれぞれ異なる波長のUVに吸収ピークを持つことから、MDHの酵素反応は分光光度計により容易に検出できる。そのため、心臓や肝機能の障害を調べる、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)量の検査薬にはMDHが用いられている。これは検体中に存在するASTにより生成されたオキサロ酢酸がMDHによりリンゴ酸に変換される際のNADHとNAD＋の変換を吸光度変化により検出するものであり、本検出方法はMDH-UV法と呼ばれている。また、AST検査薬に含まれるMDHの活性や安定性は検査薬の品質に関係することから、安定な好熱菌由来MDHや高活性化変異体の研究が行われている（特許文献１、非特許文献１）。 Malate dehydrogenase (MDH) reversibly converts malic acid and oxaloacetate in the presence of NAD + or NADH. Since NAD + and NADH have absorption peaks at different wavelengths in UV, the enzyme reaction of MDH can be easily detected by a spectrophotometer. Therefore, MDH is used in aspartate aminotransferase (AST) test drugs to examine the amount of heart and liver function disorders. This method detects the conversion of NADH and NAD + when oxaloacetate produced by AST present in a sample is converted to malic acid by MDH by the change in absorbance, and this detection method is called the MDH-UV method. In addition, since the activity and stability of MDH contained in AST test drugs are related to the quality of the test drug, research is being conducted on stable thermophilic MDH and highly active mutants (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
MDHは、真核生物ではTCA回路や植物や酵母に存在するグリオキシル酸回路で働くことが知られており、出芽酵母では3種類のアイソザイム(MDH1～3)が報告されている。出芽酵母において、MDH1はミトコンドリアに、MDH2はサイトゾルに、MDH3はグリオキシソームに局在しており、MDH1はTCA回路、MDH2はグリオキシル酸回路で機能している。一方、MDH3は、脂肪酸のβ－酸化において必要なNADHをNAD+に再酸化する役割を担っており、MDH1やMDH2と比較してオキサロ酢酸に対する親和性が低いことが知られている（非特許文献２）。これまでに、サイトゾルやミトコンドリアに局在するMDHでは補酵素や基質との複合体構造が数多く決定され、その反応機構が明らかにされているのに対し（非特許文献３～５）、グリオキシソーム局在のMDHではWatermelon由来MDHのApo型とクエン酸結合型の構造が報告されているだけであった。 MDH is known to function in the TCA cycle in eukaryotes and in the glyoxylate cycle in plants and yeasts, and three isozymes (MDH1-3) have been reported in budding yeast. In budding yeast, MDH1 is localized in mitochondria, MDH2 in cytosol, and MDH3 in glyoxysomes, with MDH1 functioning in the TCA cycle and MDH2 in the glyoxylate cycle. On the other hand, MDH3 plays a role in reoxidizing NADH, which is necessary for the β-oxidation of fatty acids, to NAD + and is known to have a lower affinity for oxaloacetate than MDH1 and MDH2 (Non-Patent Document 2). Many complex structures with coenzymes and substrates have been determined for MDH localized in cytosol or mitochondria, and their reaction mechanisms have been elucidated (Non-Patent Documents 3-5), whereas only the structures of the Apo type and citrate-bound type of MDH from Watermelon have been reported for MDH localized in glyoxysomes.
本願は、リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法により得られるリンゴ酸脱水素酵素を提供することを目的とする。 The present application aims to provide malate dehydrogenase obtained by a method for highly activating malate dehydrogenase.
リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法を見出し、本願発明を完成した。本願にて提供される方法は、特定のリンゴ酸脱水素酵素に限らず、多様なリンゴ酸脱水素酵素の高活性化変異体を作製するために利用することができる。すなわち本願は、リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法により得られるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。 The inventors have discovered a method for highly activating malate dehydrogenase, and have completed the present invention. The method provided in this application can be used to create highly active mutants of various malate dehydrogenases, not limited to a specific malate dehydrogenase. In other words, this application provides malate dehydrogenase obtained by the method for highly activating malate dehydrogenase.
出芽酵母MDH1およびMDH2と比較して、出芽酵母MDH3はオキサロ酢酸に対する親和性が低いことが知られている。本願発明者らは、出芽酵母MDH2およびMDH3のリンゴ酸脱水素酵素活性を測定した結果、MDH3がMDH2と比較して非常に高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有することを明らかにした（参考例１、図２参照）。 Compared to budding yeast MDH1 and MDH2, budding yeast MDH3 is known to have a lower affinity for oxaloacetate. The present inventors measured the malate dehydrogenase activity of budding yeast MDH2 and MDH3 and revealed that MDH3 has a much higher malate dehydrogenase activity than MDH2 (see Reference Example 1, Figure 2).
一般にMDHは、オキサロ酢酸、リンゴ酸、それらに類似したジカルボン酸分子が結合することにより、活性中心ループがオープン状態からクローズ状態となることが報告されている（非特許文献４）。出芽酵母MDH3の活性中心ループはアミノ酸残基Val79-Phe90で構成されており、Arg86-Phe91はαヘリックス構造を形成している。本願発明者らは、出芽酵母MDH3のApo formとNAD＋/OAA結合状態の構造を決定し、両者を比較したが、活性中心の構造変化は確認できなかった。すなわち出芽酵母MDH3においては活性中心ループがオープン状態のままであることが確認された。 It has been reported that in general, the active center loop of MDH changes from an open state to a closed state when oxaloacetate, malic acid, or a dicarboxylic acid molecule similar to them binds (Non-Patent Document 4). The active center loop of budding yeast MDH3 is composed of amino acid residues Val79-Phe90, and Arg86-Phe91 forms an α-helix structure. The present inventors determined the structures of budding yeast MDH3 in the apo form and in the NAD + /OAA bound state and compared the two, but could not confirm any structural change in the active center. In other words, it was confirmed that the active center loop remains in the open state in budding yeast MDH3.
出芽酵母MDH1および2と、出芽酵母MDH3の活性中心ループの配列を比較し、MDH1およびMDH2で保存されているがMDH3においてのみ保存されていない部位として、MDH3のL84（MDH2のM110）を、活性中心ループの構造変化のヒンジに位置し、アミノ酸の相同性が低く、L84と側鎖が近く接触の可能性が予想される部位として、MDH3のM92（MDH2のV118）を同定した。出芽酵母MDH2およびMDH3において、これらの部位を他方の対応するアミノ酸残基に変異させた変異体を作製し、リンゴ酸脱水素酵素活性への影響を検討した。 By comparing the sequences of the active center loop of budding yeast MDH1 and 2 with those of budding yeast MDH3, we identified L84 in MDH3 (M110 in MDH2) as a site that is conserved in MDH1 and MDH2 but not in MDH3, and M92 in MDH3 (V118 in MDH2) as a site located at the hinge of the structural change of the active center loop, with low amino acid homology, a side chain close to L84, and a possible contact site. We created mutants in budding yeast MDH2 and MDH3 in which these sites were mutated to the corresponding amino acid residues of the other, and examined the effect on malate dehydrogenase activity.
出芽酵母MDH3 L84M変異体およびMDH3 L84M/M92V変異体の活性を測定した（参考例２、図３参照）。2種類のMDH3変異体の活性は野生型MDH3よりも低く、野生型MDH2の活性に類似していた。次に、出芽酵母MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体の活性を測定した（実施例１、図４参照）。2種類のMDH2変異体の活性は野生型MDH2よりも高く、野生型MDH3の活性に類似していた。 The activities of the budding yeast MDH3 L84M mutant and the MDH3 L84M/M92V mutant were measured (see Reference Example 2, Figure 3). The activities of the two MDH3 mutants were lower than that of wild-type MDH3 and similar to that of wild-type MDH2. Next, the activities of the budding yeast MDH2 M110L mutant and the MDH2 M110L/V118M mutant were measured (see Example 1, Figure 4). The activities of the two MDH2 mutants were higher than that of wild-type MDH2 and similar to that of wild-type MDH3.
これらの結果から、出芽酵母MDH2およびMDH3において、上記2つの部位を相互に置換することで他方に類似したリンゴ酸脱水素酵素活性を示すことが分かった。MDH2のM110に対応するアミノ酸は、出芽酵母MDH3を除く非常に多くの種でメチオニンに保存されている。したがって、多様なリンゴ酸脱水素酵素において、該メチオニンをロイシンなどの疎水性アミノ酸に置換することにより高活性化MDHを作製できると予想された。 These results indicate that by mutually substituting the above two sites in budding yeast MDH2 and MDH3, one exhibits malate dehydrogenase activity similar to that of the other. The amino acid corresponding to M110 in MDH2 is conserved as methionine in a great many species, except for budding yeast MDH3. Therefore, it was predicted that highly active MDHs could be produced by substituting the methionine in various malate dehydrogenases with a hydrophobic amino acid such as leucine.
出芽酵母MDHにおいて同定された2つの残基の性質が出芽酵母以外の種にも保存されているかを明らかにするため、出芽酵母MDH3とのアミノ酸相同性がそれぞれ約25％、約29％および約25％と低いサーモプラズマ・アシッドフィラム（Thermoplasma acidophilum；TA）のMDH(TA-MDH；aa1-325)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus；GS）のMDH(GS-MDH；aa1-312)およびサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus；TT）のMDH(TT-MDH；aa1-327)を用いた。まず、出芽酵母MDH3のL84およびM92に対応するTA-MDHのM92およびK100に変異を導入したTA-MDH M92L/K100M変異体の活性を測定した（実施例２、図５参照）。その結果、TA-MDH M92L/K100M変異体は野生型TA-MDHと比較して2倍以上も高いリンゴ酸脱水素酵素活性を示した。同様に、出芽酵母MDH3のL84およびM92に対応するGS-MDHのM91およびT99に変異を導入したGS-MDH M91L/T99M変異体の活性を測定した（実施例３、図６参照）。その結果、GS-MDH M91L/T99M変異体は野生型GS-MDHと比較して2倍以上も高いリンゴ酸脱水素酵素活性を示した。さらに、出芽酵母MDH3のL84およびM92に対応するTT-MDHのM96およびV104に変異を導入したTT-MDH M96L/V104M変異体の活性を測定した（実施例４、図７参照）。その結果、TT-MDH M96L/V104M変異体は野生型TT-MDHと比較して2倍以上も高いリンゴ酸脱水素酵素活性を示した。以上から、多様なMDHにおいて保存されているメチオニンをロイシンなどの疎水性アミノ酸に変異することにより高活性化MDHを作製できることが示された。 To clarify whether the properties of the two residues identified in budding yeast MDH are conserved in species other than budding yeast, we used Thermoplasma acidophilum (TA) MDH (TA-MDH; aa1-325), Geobacillus stearothermophilus (GS) MDH (GS-MDH; aa1-312), and Thermus thermophilus (TT) MDH (TT-MDH; aa1-327), which have low amino acid homologies with budding yeast MDH3, respectively, at about 25%, 29%, and 25%. First, we measured the activity of the TA-MDH M92L/K100M mutant, in which mutations were introduced into M92 and K100 of TA-MDH, which correspond to L84 and M92 of budding yeast MDH3 (see Example 2, Figure 5). As a result, the TA-MDH M92L/K100M mutant showed malate dehydrogenase activity more than twice as high as that of wild-type TA-MDH. Similarly, the activity of the GS-MDH M91L/T99M mutant, in which mutations were introduced into M91 and T99 of GS-MDH corresponding to L84 and M92 of budding yeast MDH3, was measured (see Example 3, FIG. 6). As a result, the GS-MDH M91L/T99M mutant showed malate dehydrogenase activity more than twice as high as that of wild-type GS-MDH. Furthermore, the activity of the TT-MDH M96L/V104M mutant, in which mutations were introduced into M96 and V104 of TT-MDH corresponding to L84 and M92 of budding yeast MDH3, was measured (see Example 4, FIG. 7). As a result, the TT-MDH M96L/V104M mutant showed malate dehydrogenase activity more than twice as high as that of wild-type TT-MDH. These results suggest that highly active MDH can be produced by mutating the conserved methionine in various MDHs to a hydrophobic amino acid such as leucine.
すなわち、本願は以下の発明を包含する。
ある態様において、本願は、
活性中心ループにアミノ酸配列X1X2RX3X4GX5X6RX7DLX8（ここで、X1はV、M、L、IまたはA、X2はPまたはA、X3はKまたはR、X4はP、E、DまたはA、X5はメチオニン以外の疎水性アミノ酸、X6はT、E、DまたはS、X7はD、K、SまたはR、X8はF、LまたはVである）を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X5がメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、かつ
配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が90％以下であるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。
That is, the present application includes the following inventions.
In one aspect, the present application provides:
A malate dehydrogenase having an amino acid sequence of X1, X2 , RX3 , X4 , GX5, X6, RX7 , DLX8 in an active center loop (wherein X1 is V, M, L, I or A, X2 is P or A, X3 is K or R, X4 is P, E, D or A, X5 is a hydrophobic amino acid other than methionine, X6 is T, E, D or S, X7 is D, K, S or R, and X8 is F, L or V),
The present invention provides a malate dehydrogenase having a higher malate dehydrogenase activity than a malate dehydrogenase having the same sequence as the malate dehydrogenase except that the hydrophobic amino acid X5 contained in the active center loop is methionine, and having a sequence identity of 90% or less with the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
別の態様において、本願は、
（１）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列、但し配列中Xaaはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である；
（２）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列において、活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されており、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列：または
（３）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、活性中心ループのアミノ酸配列が同一であり、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列のいずれかを含み、
Xaaがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素より高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素を提供する。
In another aspect, the present application provides:
(1) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15, or 16, wherein Xaa is a hydrophobic amino acid other than methionine;
(2) an amino acid sequence having malate dehydrogenase activity, in which 1 to 30 amino acids other than the amino acid sequence of the active center loop in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15 or 16 are deleted, added and/or substituted; or (3) an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15 or 16, the amino acid sequence of the active center loop is the same, and the amino acid sequence has malate dehydrogenase activity,
The present invention provides a malate dehydrogenase having a higher malate dehydrogenase activity than a malate dehydrogenase having the same sequence except that Xaa is methionine.
本願は、リンゴ酸脱水素酵素を高活性化する方法により得られるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。 The present application provides malate dehydrogenase obtained by a method for highly activating malate dehydrogenase.
本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約20」は「18～22」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば「約20～30」は「18～33」を含むものとする。 In this disclosure, when a numerical value is accompanied by the term "about," it is intended to include a range of ±10% of that value. For example, "about 20" is intended to include "18-22." A range of numerical values includes all values between and at the endpoints. "About" in reference to a range applies to both endpoints of the range. Thus, for example, "about 20-30" is intended to include "18-33."
本開示において、アミノ酸残基は以下の略号で表される。
AlaまたはA：アラニン
ArgまたはR：アルギニン
AsnまたはN：アスパラギン
AspまたはD：アスパラギン酸
CysまたはC：システイン
GlnまたはQ：グルタミン
GluまたはE：グルタミン酸
GlyまたはG：グリシン
HisまたはH：ヒスチジン
IleまたはI：イソロイシン
LeuまたはL：ロイシン
LysまたはK：リジン
MetまたはM：メチオニン
PheまたはF：フェニルアラニン
ProまたはP：プロリン
SerまたはS：セリン
ThrまたはT：スレオニン
TrpまたはW：トリプトファン
TyrまたはY：チロシン
ValまたはV：バリン
In this disclosure, amino acid residues are represented by the following abbreviations:
Ala or A: Alanine
Arg or R: Arginine
Asn or N: Asparagine
Asp or D: Aspartic acid
Cys or C: Cysteine
Gln or Q: Glutamine
Glu or E: glutamic acid
Gly or G: glycine
His or H: histidine
Ile or I: Isoleucine
Leu or L: Leucine
Lys or K: Lysine
Met or M: methionine
Phe or F: phenylalanine
Pro or P: Proline
Ser or S: serine
Thr or T: Threonine
Trp or W: Tryptophan
Tyr or Y: Tyrosine
Val or V: Valine
本開示において、あるアミノ酸配列を「含む」とは、そのアミノ酸配列のN末端および／またはC末端に1以上のアミノ酸残基が付加されていてもよいことを意味する。例えば、「配列番号Ｘのアミノ酸配列を含むペプチド」には、配列番号Ｘのアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号Ｘのアミノ酸配列のN末端および／またはC末端に1以上のアミノ酸残基が付加されているペプチドが包含される。 In this disclosure, "comprising" a certain amino acid sequence means that one or more amino acid residues may be added to the N-terminus and/or C-terminus of the amino acid sequence. For example, a "peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:X" includes a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:X and a peptide having one or more amino acid residues added to the N-terminus and/or C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO:X.
リンゴ酸脱水素酵素
本願において、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）は、酵素分類においてEC1.1.1.37に分類され、NAD＋またはNADHの存在下でリンゴ酸とオキサロ酢酸の相互変換を触媒する酸化還元酵素を意味する。出芽酵母MDH3および出芽酵母MDH2のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。サーモプラズマ・アシッドフィラム（Thermoplasma acidophilum；TA）のMDH(TA-MDH；aa1-325)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus；GS）のMDH(GS-MDH；aa1-312)およびサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus；TT）のMDH(TT-MDH；aa1-327)のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３、１１および１２に示す。
Malate dehydrogenase In the present application, malate dehydrogenase (MDH) is classified as EC1.1.1.37 in the enzyme classification, and refers to an oxidoreductase that catalyzes the interconversion of malate and oxaloacetate in the presence of NAD + or NADH. The amino acid sequences of budding yeast MDH3 and budding yeast MDH2 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. The amino acid sequences of Thermoplasma acidophilum (TA) MDH (TA-MDH; aa1-325), Geobacillus stearothermophilus (GS) MDH (GS-MDH; aa1-312), and Thermus thermophilus (TT) MDH (TT-MDH; aa1-327) are shown in SEQ ID NOs: 3, 11, and 12, respectively.
活性中心ループにアミノ酸配列X1X2RX3X4GMX6RX7DLX8（ここで、X1はV、M、L、IまたはA、X2はPまたはA、X3はKまたはR、X4はP、E、DまたはA、X6はT、E、DまたはS、X7はD、K、SまたはR、X8はF、LまたはVである）、あるいはこれと類似する配列を有するMDHは、以下のUniprotの登録番号に記載のものが例示される：P58407、B7VID0、B2SMP6、Q5WU94、P17783、Q1QQR2、Q82WB9、B4F2A1、Q1Q932、Q8ZVB2、A1SRP8、Q0BAF9、B5ZSS0、Q9EYJ6、A1KI28、A3MBR2、Q0S365、A3P7Q9、C1B155、Q2J3G8、B9KNB4、A1W9K7、Q42972、B5R0N2、A4FFX3、B5BGR3、Q0HZ38、Q46YU4、B8CSY7、Q8CQ25、C1CY73、A0A0S3QTC6、A1TP96、B1JMK1、B2IG85、B1Y8A3、Q6ZZC6、Q3AS98、B3PHI3、B0T6C1、Q8TSH7、Q9LKA3、Q5NVR2、Q9SML8、Q92IA0、B4TJT3、B2FQL8、A8GRV2、O67581、Q67LB8、P61891、P10584、A7MWD3、C5BF98、Q5NYA9、Q74D53、Q64P62、Q3SVK5、B3Q761、B7UJW8、Q6F7X1、B3CM44、Q7CWK7、B9JCF5、Q87E35、B4U831、A9VJQ4、Q6MAA3、A4SWW0、Q32BA3、Q5SKV7、Q5HBC0、A8ILC6、Q72ZE5、Q4QL89、A6TEQ3、Q6FYD0、A1WV94、Q11CV9、P80039、B3QPY9、Q8EPE2、A1R2B5、P37226、Q3IZ83、Q11QQ3、A9KFT9、Q9FSF0、B7M0U8、A4WF48、B2K2N5、Q8PC25、Q7VFV4、Q9K849、Q2L068、P61975、Q0I491、Q13DR6、B7NKU9、Q5U907、P61889、Q8YJE7、Q6D9D1、A4WNM7、A5UPY6、B7N0M1、Q7MP97、Q73G44、Q1R6A3、A4SIV0、B2SH29、P25077、A4J5N8、Q9ZP05、A7IBL9、Q5WEG2、Q8A0W0、Q7VW97、Q65G89、A0L113、Q59202、Q5R030、A8FG47、C0RFH2、A0PVV1、B3EEE5、B5REV7、Q07YA5、A8LJK6、Q14IT0、B0TCL9、Q89X59、Q97VN4、B8EB55、A9NDV1、Q8PVJ7、Q47C34、Q9K3J3、Q704B2、B7MBZ7、B7LHU4、P61892、Q0BXA0、B5XSQ7、B0BXA8、Q68WZ8、A5G320、B1XHK9、Q0HEW2、P61890、A5FHP3、A4TRK3、A9R584、Q5KWB7、C6E487、Q7VP41、A8G8Y7、Q47VL0、P11386、Q0AFK6、A1SMP3、Q3J7E7、A3PN14、Q6A6Z5、Q3ZZJ7、Q6G1M0、Q051U6、Q255I4、B9MBP0、Q87SU7、B7NDL4、Q7M9A7、Q5PAV3、Q5H496、Q1CEJ3、A1UQV8、Q57AX1、B8GVT2、Q2T7J2、P19446、B3R570、Q83Q04、B1I3T1、Q5X2T6、B0SN74、Q84FY8、Q9PK18、C3M9U0、Q9PE17、P61973、B1ZG93、A9M8R3、Q3B2R4、B3EP06、P50917、B2HRH5、Q3JKE9、A3NM97、Q169U9、Q8Z3E0、A5FS18、A3QB91、Q3Z9A4、O02640、B0CIT1、B2JQD2、P93819、O88989、A6WXE7、Q7MYW9、Q3IFH4、A0QCI6、B1K394、B3PQ91、A1RS58、B2U705、Q393V1、A9AMD5、A2S105、Q62AG8、A1UZ10、P80536、Q13S42、Q7X3X5、Q6L0C3、Q15YH0、A3MWU9、A0AZ43、O33525、C1AMN4、Q7UNC6、B6IYP5、Q2YAQ4、B2T9P8、Q8XXW5、A5WGM2、Q5LXE1、Q8YP78、Q9CN86、Q6AW21、A1VRQ1、Q126N9、A9MNX5、C0PZQ4、Q83C87、Q1LKG0、B1W3N4、C5BU70、Q30RQ5、B8GPC3、B9KZS7、Q2GCH6、Q21K60、Q07UX5、B2J5F8、A7HT37、Q3A5S0、A7NG29、C6DKH1、A8GWI0、A1S3C4、Q7WS85、Q0T052、A0KG16、A9IZV5、B0B7U5、P40926、P40925、Q6PAB3、Q0K8F5、B1KGG7、Q0TCN0、A0Q6K3、B7HFA6、B2GKC8、Q65T37、Q5YTI1、C3PN92、A0LFF8、Q979N9、C5CSI5、A8A545、Q8DEC2、Q2P736、C0R4Y0、B0TZT2、P0C7R5、Q3BWU8、C1EUT6、A0RJJ0、A9W386、B1LZN1、B2S881、P9WK12、A6Q388、A8GN82、B0TUH8、A8FRU0、Q47TT4、A7NC13、Q0VQ52、Q2GK85、O08349、A1K5Q9、A4YAE8、A7MNR3、B2UKY5、B7LRL0、C3L8X1、B7GGT8、B5EIU8、B9J092、Q54D04、P08249、B9LLP6、Q9HJL5、B5YSW2、Q9X4K8、A4IRP9、A0L5T9、Q60B71、Q0AKT3、A8MAC1、Q7YRU4、B4TWK9、Q2S289、B0VQX5、B1IQP3、B1LGK2、Q5GT41、Q2GGI2、Q0RE66、A4G5Z9、P80458、B3QSH8、Q9Y7R8、P0C890、P48364、Q1BM38、Q4FQU7、B4EFB0、Q2K3E9、Q98EC4、P0A5J7、A3D075、Q31WA4、P17505、A3M928、A3N1U6、B9JTS9、Q25QU7、P44427、B0BC10、Q5ZME2、Q2IK16、Q43744、A1RFX8、B2VGW7、B9KIH0、A7FMU2、A8EUE8、A5G3L2、B0UUR6、Q817F9、Q5L5E3、B8GDA2、B7KVX2、A8EZ58、Q2RV34、C4K2E2、A9L340、B2U1U9、Q5HR46、Q1GQY3、Q9ZF99、A7GTN7、A5IEF4、Q04RS5、A5E935、Q1AWH4、Q82HS2、A9BVK0、Q0ABE6、Q3MDN9、B7JRW5、P49814、Q46BQ2、A9N855、Q6AQI3、O82399、B0BQN0、A1AGC9、B6I1V4、Q8PNP8、Q2A3K7、Q8GNM0、Q39VY0、Q28U77、A9IIS3、Q57JA9、B4SLI5、B9DK67、A8H0U0、Q1IWC9、B7GW58、A1WR02、C4ZSX4、B3H269、Q6HCU0、C1DB66、Q2G946、A9A450、A6L903、Q4FP28、P46488、Q7NZ60、P14152、Q9ZDF3、Q2T4T8、K0J107、A6WSM1、Q3YX11、P82177、Q49VN8、B0V6R7、P61977、B2HZ52、Q9KUT3、B7IJZ0、B7HRN2、Q9Z6N1、O84381、P57106、A5VSQ4、Q8FYF4、Q6AW23、B4SFQ8、B1XV63、B4S9F1、Q5E875、B2I8M1、B0SF41、Q2W064、Q7WD94、A2SHT9、Q2YLR9、B8EM38、P46487、B5FGF5、B0U5Q1、B6EL39、B0RU49、B3E9R5、A7Z7J8、A6SY47、Q633K5、A8AQC8、P83778、Q4R568、Q7W5Q8、B8IJB4、B0UCF0、Q9A2B1、A1T9L9、Q822E9、P61976、Q2IIC2、Q54VM2、Q7XDC8、Q9SN86、A1JIV0、Q5L8Z8、B8F5K4、A4YKC5、Q1RIT9、B5FIT7、B5F7L9、B4T769、Q12R11、A5V5U9、A6UDP3、Q4URH2、Q1CBY7、A5UCQ1、C3PAI1、P9WK13、O67655、A4SFT4、P83373、Q9RXI8、Q55383、A7ZSD0、B7I9D2、Q5FGT9、Q3YS64、Q2J7E7、A4IY35、C5D654、Q6HSF4、B9M1D2、Q7NHJ3、A5UIX3、Q5ZT13、Q8F4A2、A5U1T8、P80040、O24047、Q21XH1、Q21CW7、P37228、P00346、A1BHN9、Q9ZP06、F1C7I4、Q04820、Q43743、Q42686、O48905、Q9FJU0、P11708、P04636、Q6DIY9、P22133、Q08062、B6J7Q0、B6IZN7、Q3T145、A4JKE6、Q9XFW3、A4JM71、Q32LG3、およびQ54GE6。 The amino acid sequence in the active center loop is X 1, X 2, RX 3, X 4 , GMX 6, RX 7 , DLX 8 (wherein X 1 is V, M, L, I, or A, X 2 is P or A, X 3 is K or R, X 4 is P, E, D, or A, X 6 is T, E, D, or S, X 7 is D, K, S, or R, and X 8 is F, L or V), or MDH having a sequence similar thereto, are exemplified by those described in the following Uniprot accession numbers: P58407, B7VID0, B2SMP6, Q5WU94, P17783, Q1QQR2, Q82WB9, B4F2A1, Q1Q932, Q8ZVB2, A1SRP8, Q0BAF9, B5ZSS0, Q9EYJ6, A1KI28, A3MBR2, Q0S365, A3P7Q9, C1B155, Q2J3G8, B9KNB4, A1W9K7, Q42972, B5R0N2, and A4FFX. 3, B5BGR3, Q0HZ38, Q46YU4, B8CSY7, Q8CQ25, C1CY73, A0A0S3QTC6, A1TP96, B1JMK1, B2IG85, B1Y8A3, Q6ZZC6, Q3AS98, B3PHI3, B0T6C1, Q8TSH7, Q9LKA3, Q5NVR2, Q9SML8, Q92IA0, B4TJT3, B2FQL8, A8GRV2, O67581, Q67LB8, P61891, P10584, A7MWD3, C5BF98, Q5NYA9, Q74D53, Q64P62, Q3SVK5, B3Q761, B7UJW8, Q6F7X1, B3CM44, Q7CWK7, B9JCF5, Q87E35, B4U831, A9VJQ4, Q6MAA3, A4SWW0, Q32BA3, Q5SKV7, Q5HBC0, A8ILC6, Q72ZE5, Q4QL89 , A6TEQ3, Q6FYD0, A1WV94, Q11CV9, P80039, B3QPY9, Q8EPE2, A1R2B5, P37226, Q3IZ83, Q11QQ3, A9KFT9, Q9FSF0, B7M0U8, A4WF48, B2K2N5, Q8PC25 , Q7VFV4, Q9K849, Q2L068, P61975, Q0I491, Q13DR6, B7NKU9, Q5U907, P61889, Q8YJE7, Q6D9D1, A4WNM7, A5UPY6, B7N0M1, Q7MP97, Q73G44, Q1R6A 3, A4SIV0, B2SH29, P25077, A4J5N8, Q9ZP05, A7IBL9, Q5WEG2, Q8A0W0, Q7VW97, Q65G89, A0L113, Q59202, Q5R030, A8FG47, C0RFH2, A0PVV1, B3EEE 5, B5REV7, Q07YA5, A8LJK6, Q14IT0, B0TCL9, Q89X59, Q97VN4, B8EB55, A9NDV1, Q8PVJ7, Q47C34, Q9K3J3, Q704B2, B7MBZ7, B7LHU4, P61892, Q0BX A0, B5XSQ7, B0BXA8, Q68WZ8, A5G320, B1XHK9, Q0HEW2, P61890, A5FHP3, A4TRK3, A9R584, Q5KWB7, C6E487, Q7VP41, A8G8Y7, Q47VL0, P11386, Q0AF K6, A1SMP3, Q3J7E7, A3PN14, Q6A6Z5, Q3ZZJ7, Q6G1M0, Q051U6, Q255I4, B9MBP0, Q87SU7, B7NDL4, Q7M9A7, Q5PAV3, Q5H496, Q1CEJ3, A1UQV8, Q57 AX1, B8GVT2, Q2T7J2, P19446, B3R570, Q83Q04, B1I3T1, Q5X2T6, B0SN74, Q84FY8, Q9PK18, C3M9U0, Q9PE17, P61973, B1ZG93, A9M8R3, Q3B2R4, B3E P06, P50917, B2HRH5, Q3JKE9, A3NM97, Q169U9, Q8Z3E0, A5FS18, A3QB91, Q3Z9A4, O02640, B0CIT1, B2JQD2, P93819, O88989, A6WXE7, Q7MYW9, Q3 IFH4, A0QCI6, B1K394, B3PQ91, A1RS58, B2U705, Q393V1, A9AMD5, A2S105, Q62AG8, A1UZ10, P80536, Q13S42, Q7X3X5, Q6L0C3, Q15YH0, A3MWU9, A0 AZ43, O33525, C1AMN4, Q7UNC6, B6IYP5, Q2YAQ4, B2T9P8, Q8XXW5, A5WGM2, Q5LXE1, Q8YP78, Q9CN86, Q6AW21, A1VRQ1, Q126N9, A9MNX5, C0PZQ4, Q8 3C87, Q1LKG0, B1W3N4, C5BU70, Q30RQ5, B8GPC3, B9KZS7, Q2GCH6, Q21K60, Q07UX5, B2J5F8, A7HT37, Q3A5S0, A7NG29, C6DKH1, A8GWI0, A1S3C4, Q7 WS85, Q0T052, A0KG16, A9IZV5, B0B7U5, P40926, P40925, Q6PAB3, Q0K8F5, B1KGG7, Q0TCN0, A0Q6K3, B7HFA6, B2GKC8, Q65T37, Q5YTI1, C3PN92, A 0LFF8, Q979N9, C5CSI5, A8A545, Q8DEC2, Q2P736, C0R4Y0, B0TZT2, P0C7R5, Q3BWU8, C1EUT6, A0RJJ0, A9W386, B1LZN1, B2S881, P9WK12, A6Q388, A 8GN82, B0TUH8, A8FRU0, Q47TT4, A7NC13, Q0VQ52, Q2GK85, O08349, A1K5Q9, A4YAE8, A7MNR3, B2UKY5, B7LRL0, C3L8X1, B7GGT8, B5EIU8, B9J092, Q54D04, P08249, B9LLP6, Q9HJL5, B5YSW2, Q9X4K8, A4IRP9, A0L5T9, Q60B71, Q0AKT3, A8MAC1, Q7YRU4, B4TWK9, Q2S289, B0VQX5, B1IQP3, B1LGK2, Q5GT41, Q2GGI2, Q0RE66, A4G5Z9, P80458, B3QSH8, Q9Y7R8, P0C890, P48364, Q1BM38, Q4FQU7, B4EFB0, Q2K3E9, Q98EC4, P0A5J7, A3D075, Q31WA4 , P17505, A3M928, A3N1U6, B9JTS9, Q25QU7, P44427, B0BC10, Q5ZME2, Q2IK16, Q43744, A1RFX8, B2VGW7, B9KIH0, A7FMU2, A8EUE8, A5G3L2, B0UUR6 , Q817F9, Q5L5E3, B8GDA2, B7KVX2, A8EZ58, Q2RV34, C4K2E2, A9L340, B2U1U9, Q5HR46, Q1GQY3, Q9ZF99, A7GTN7, A5IEF4, Q04RS5, A5E935, Q1AWH4 , Q82HS2, A9BVK0, Q0ABE6, Q3MDN9, B7JRW5, P49814, Q46BQ2, A9N855, Q6AQI3, O82399, B0BQN0, A1AGC9, B6I1V4, Q8PNP8, Q2A3K7, Q8GNM0, Q39VY0 , Q28U77, A9IIS3, Q57JA9, B4SLI5, B9DK67, A8H0U0, Q1IWC9, B7GW58, A1WR02, C4ZSX4, B3H269, Q6HCU0, C1DB66, Q2G946, A9A450, A6L903, Q4FP2 8, P46488, Q7NZ60, P14152, Q9ZDF3, Q2T4T8, K0J107, A6WSM1, Q3YX11, P82177, Q49VN8, B0V6R7, P61977, B2HZ52, Q9KUT3, B7IJZ0, B7HRN2, Q9Z6N 1, O84381, P57106, A5VSQ4, Q8FYF4, Q6AW23, B4SFQ8, B1XV63, B4S9F1, Q5E875, B2I8M1, B0SF41, Q2W064, Q7WD94, A2SHT9, Q2YLR9, B8EM38, P464 87, B5FGF5, B0U5Q1, B6EL39, B0RU49, B3E9R5, A7Z7J8, A6SY47, Q633K5, A8AQC8, P83778, Q4R568, Q7W5Q8, B8IJB4, B0UCF0, Q9A2B1, A1T9L9, Q822 E9, P61976, Q2IIC2, Q54VM2, Q7XDC8, Q9SN86, A1JIV0, Q5L8Z8, B8F5K4, A4YKC5, Q1RIT9, B5FIT7, B5F7L9, B4T769, Q12R11, A5V5U9, A6UDP3, Q4U RH2, Q1CBY7, A5UCQ1, C3PAI1, P9WK13, O67655, A4SFT4, P83373, Q9RXI8, Q55383, A7ZSD0, B7I9D2, Q5FGT9, Q3YS64, Q2J7E7, A4IY35, C5D654, Q6H SF4, B9M1D2, Q7NHJ3, A5UIX3, Q5ZT13, Q8F4A2, A5U1T8, P80040, O24047, Q21XH1, Q21CW7, P37228, P00346, A1BHN9, Q9ZP06, F1C7I4, Q04820, Q43743, Q42686, O48905, Q9FJU0, P11708, P04636, Q6DIY9, P22133, Q08062, B6J7Q0, B6IZN7, Q3T145, A4JKE6, Q9XFW3, A4JM71, Q32LG3, and Q54GE6.
本願のリンゴ酸脱水素酵素
本願は、活性中心ループにアミノ酸配列X1X2RX3X4GX5X6RX7DLX8（ここで、X1はV、M、L、IまたはA、X2はPまたはA、X3はKまたはR、X4はP、E、DまたはA、X5はメチオニン以外の疎水性アミノ酸、X6はT、E、DまたはS、X7はD、K、SまたはR、X8はF、LまたはVである）を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X5がメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、かつ
配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が90％以下であるリンゴ酸脱水素酵素を提供する。
The present application relates to a malate dehydrogenase having an amino acid sequence of X1 , X2, RX3, X4 , GX5, X6, RX7, DLX8 (wherein X1 is V, M, L, I or A, X2 is P or A, X3 is K or R, X4 is P, E, D or A, X5 is a hydrophobic amino acid other than methionine, X6 is T, E, D or S, X7 is D, K, S or R, and X8 is F, L or V) in an active center loop,
The present invention provides a malate dehydrogenase having a higher malate dehydrogenase activity than a malate dehydrogenase having the same sequence as the malate dehydrogenase except that the hydrophobic amino acid X5 contained in the active center loop is methionine, and having a sequence identity of 90% or less with the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
本願のMDHは、活性中心ループにアミノ酸配列X1X2RX3X4GX5X6RX7DLX8を有する。活性中心ループとは、MDHの活性部位に存在するループ構造を意味し、配列番号２の104位～116位に相当するアミノ酸配列である。すなわち、本願のMDHは、配列番号２の104位～116位に相当するアミノ酸配列において、アミノ酸配列X1X2RX3X4GX5X6RX7DLX8を有する。 The MDH of the present application has the amino acid sequence X1, X2, RX, 3, X4 , GX , 5, X6 , RX , 7, DLX8 in the active center loop. The active center loop means a loop structure present in the active site of MDH, and is the amino acid sequence corresponding to positions 104 to 116 of SEQ ID NO: 2. That is, the MDH of the present application has the amino acid sequence X1, X2, RX , 3 , X4 , GX, 5, X6, RX, 7 , DLX8 in the amino acid sequence corresponding to positions 104 to 116 of SEQ ID NO: 2.
本明細書において、あるアミノ酸配列の所定の位置に「相当する位置」とは、あるアミノ酸配列と他のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、あるアミノ酸配列の所定の位置に相当する他のアミノ酸配列の位置を意味する。アラインメントは、例えば公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して実施できる。具体的な遺伝子解析ソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASIS、ゼネティックス製のGENETYX、DDBJが公開しているFASTA、BLAST、ClustalWなどが挙げられる。 In this specification, a "position corresponding to" a given position in an amino acid sequence means a position in an amino acid sequence that corresponds to a given position in the given amino acid sequence in an alignment of the other amino acid sequence. Alignment can be performed, for example, using known genetic analysis software. Specific examples of genetic analysis software include DNASIS made by Hitachi Solutions, GENETYX made by Genetyx, and FASTA, BLAST, and ClustalW published by DDBJ.
アミノ酸配列X1X2RX3X4GX5X6RX7DLX8は、X1がV、M、L、IまたはA、X2がPまたはA、X3がKまたはR、X4がP、E、DまたはA、X5がメチオニン以外の疎水性アミノ酸、X6がT、E、DまたはS、X7がD、K、SまたはR、X8がF、LまたはVである限り、特に限定されない。「疎水性アミノ酸」とは、疎水性側鎖を持つアミノ酸を意味し、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンなどが含まれる。ある実施態様において、メチオニン以外の疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシンまたはイソロイシンであり得、例えばロイシンである。 The amino acid sequence X1 , X2 , Rx3 , X4 , Gx5, X6 , Rx7 , DLx8 is not particularly limited , as long as X1 is V, M, L, I or A, X2 is P or A, X3 is K or R, X4 is P, E, D or A, X5 is a hydrophobic amino acid other than methionine, X6 is T, E, D or S, X7 is D, K, S or R, and X8 is F, L or V. "Hydrophobic amino acid" refers to an amino acid with a hydrophobic side chain, and includes, for example, valine, leucine, isoleucine, and methionine. In some embodiments, the hydrophobic amino acid other than methionine can be valine, leucine or isoleucine, for example leucine.
本願のMDHは、上記のUniprotの登録番号で示されるMDHにおいて、配列番号２の110位に相当するメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸に置換し、必要に応じて他のアミノ酸残基を本願で特定される範囲のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。好ましくは、活性中心ループにアミノ酸配列X1X2RX3X4GMX6RX7DLX8を有するMDHのGとX6の間のメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸に置換したMDHである。より好ましくは、活性中心ループにVPRKPGXTRDDLF（配列番号４）、MPRREGXERKDLL（配列番号５）、MPRRDGXERKDLL（配列番号６）、VARKPGXDRSDLF（配列番号７）、LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）（ここで、各配列のXはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である）を有するMDHであり得、例えばVPRKPGXTRDDLF（配列番号４）、MPRRDGXERKDLL（配列番号６）、LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）を有するMDHである。ここで、配列番号４は、出芽酵母MDH1、出芽酵母MDH2、ヒトMDH2およびブタMDH2の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号５は、ヒトMDH1の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号６は、ブタMDH1の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号７は、大腸菌MDHの活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号８は、好熱菌サーモプラズマ・アシッドフィラムのMDH（TA-MDH）の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号１３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスのMDH（GS-MDH）の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。配列番号１４は、サーマス・サーモフィルスのMDH（TT-MDH）の活性中心ループのうち、メチオニンをメチオニン以外の疎水性アミノ酸（X）に置換した配列を示す。 The MDH of the present application can be obtained by substituting the methionine residue at position 110 of SEQ ID NO: 2 in the MDH represented by the above Uniprot registration number with a hydrophobic amino acid other than methionine, and, if necessary, substituting other amino acid residues with amino acid residues within the range specified in the present application. Preferably , the MDH has the amino acid sequence X1X2RX3X4GMX6RX7DLX8 in the active center loop, and the methionine residue between G and X6 is substituted with a hydrophobic amino acid other than methionine. More preferably, the MDH may have VPRKPGXTRDDLF (SEQ ID NO: 4), MPRREGXERKDLL (SEQ ID NO: 5), MPRRDGXERKDLL (SEQ ID NO: 6), VARKPGXDRSDLF (SEQ ID NO: 7), LARKPGXSRDDLF (SEQ ID NO: 8), IARKPGXSRDDLV (SEQ ID NO: 13), or APRKAGXERRDLL (SEQ ID NO: 14) (wherein X in each sequence is a hydrophobic amino acid other than methionine) in the active center loop, for example, MDH having VPRKPGXTRDDLF (SEQ ID NO: 4), MPRRDGXERKDLL (SEQ ID NO: 6), LARKPGXSRDDLF (SEQ ID NO: 8), IARKPGXSRDDLV (SEQ ID NO: 13), or APRKAGXERRDLL (SEQ ID NO: 14). Here, SEQ ID NO: 4 shows the sequence in which methionine is replaced with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine in the active center loops of budding yeast MDH1, budding yeast MDH2, human MDH2, and porcine MDH2. SEQ ID NO: 5 shows a sequence in which methionine is replaced with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine in the active center loop of human MDH1. SEQ ID NO: 6 shows a sequence in which methionine is replaced with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine in the active center loop of porcine MDH1. SEQ ID NO: 7 shows a sequence in which methionine is replaced with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine in the active center loop of Escherichia coli MDH. SEQ ID NO: 8 shows a sequence in which methionine is replaced with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine in the active center loop of thermophilic bacterium Thermoplasma acidophilum MDH (TA-MDH). SEQ ID NO: 13 shows a sequence in which methionine is replaced with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine in the active center loop of Geobacillus stearothermophilus MDH (GS-MDH). SEQ ID NO: 14 shows a sequence in which methionine in the active center loop of Thermus thermophilus MDH (TT-MDH) is substituted with a hydrophobic amino acid (X) other than methionine.
ある実施態様において、本願のMDHは、配列番号２のアミノ酸配列の118位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンであってもよい。 In one embodiment, the MDH of the present application may have an amino acid at a position corresponding to position 118 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 as methionine.
また、本願のMDHは、活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X5またはXがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する。リンゴ酸脱水素酵素活性は、例えばオキサロ酢酸（OAA）またはリンゴ酸が酵素1mg、1分間あたり何μmol生産または消費されるかを示す比活性(unit/mg)(unit=μmol/min)により定義される。例えば、本願のMDHは、活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X5またはXがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して、約1.2倍以上、約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、または約4倍以上高いリンゴ酸脱水素酵素の比活性を有する。リンゴ酸脱水素酵素活性はまた、例えば定められた条件下で毎分基質1μmolの変化を触媒する酵素量を1単位とするunitにより定義される。例えば、本願のMDHは、活性中心ループに含まれる疎水性アミノ酸X5またはXがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して、約1.2倍以上、約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、または約4倍以上高いリンゴ酸脱水素酵素のunitを有する。 Moreover, the MDH of the present application has a higher malate dehydrogenase activity than MDH having the same sequence except that the hydrophobic amino acid X5 or X contained in the active center loop is methionine. The malate dehydrogenase activity is defined, for example, by the specific activity (unit/mg) (unit=μmol/min) indicating how many μmoles of oxaloacetate (OAA) or malic acid are produced or consumed per minute per 1 mg of enzyme. For example, the MDH of the present application has a specific malate dehydrogenase activity that is about 1.2 times or more, about 1.5 times or more, about 2 times or more, about 3 times or more, or about 4 times or more higher than that of MDH having the same sequence except that the hydrophobic amino acid X5 or X contained in the active center loop is methionine. The malate dehydrogenase activity is also defined, for example, by the unit, where the amount of enzyme that catalyzes the conversion of 1 μmol of substrate per minute under a specified condition is one unit. For example, the MDH of the present application has about 1.2 times or more, about 1.5 times or more, about 2 times or more, about 3 times or more, or about 4 times or more more units of malate dehydrogenase than an MDH having the same sequence except that the hydrophobic amino acid X5 or X contained in the active center loop is methionine.
リンゴ酸脱水素酵素活性を測定する方法としては、公知の方法が使用できる。例えば、MDHおよび基質であるオキサロ酢酸を含む溶液にNADHを添加し、NADHの減少速度を測定することにより酵素活性を測定してもよい。NADHの減少速度は、例えばNADHの吸収波長である340nmの吸光度を分光光度計などを用いてモニターすることにより測定できる。また、NADHの減少速度は、NADHとNAD＋の蛍光の差に基づき蛍光法（例えば励起波長340nm、蛍光波長460nm）により測定することもできる。 Known methods can be used to measure malate dehydrogenase activity. For example, NADH may be added to a solution containing MDH and the substrate oxaloacetate, and the enzyme activity may be measured by measuring the rate of decrease of NADH. The rate of decrease of NADH can be measured, for example, by monitoring the absorbance at 340 nm, which is the absorption wavelength of NADH, using a spectrophotometer or the like. The rate of decrease of NADH can also be measured by a fluorometric method (e.g., excitation wavelength 340 nm, fluorescence wavelength 460 nm) based on the difference in fluorescence between NADH and NAD + .
さらに、本願のMDHは、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性が98％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、または55％以下であり得、例えば90％以下である。 Furthermore, the MDH of the present application may have a sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 of 98% or less, 95% or less, 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, or 55% or less, for example, 90% or less.
本明細書における、核酸配列またはアミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態に（一致が最大となる状態に）アラインメントされた2つの配列間で一致する塩基またはアミノ酸残基の割合を意味する。ここで、比較対象の配列は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。配列同一性は、公共のデータベース（例えば、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp））で提供されるFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて算出することができる。あるいは、市販の配列解析ソフトウェア（例えば、Vector NTI（登録商標）ソフトウェア、GENETYX（登録商標） ver. 12）を用いて求めることもできる。 As used herein, "sequence identity" in relation to nucleic acid sequences or amino acid sequences refers to the percentage of matching bases or amino acid residues between two sequences aligned optimally (maximally identical) across the entire region of the sequences being compared. The sequences being compared may have additions or deletions (e.g., gaps, etc.) in the optimal alignment of the two sequences. Sequence identity can be calculated using programs such as FASTA, BLAST, and CLUSTAL W provided in public databases (e.g., DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp)). Alternatively, it can be determined using commercially available sequence analysis software (e.g., Vector NTI (registered trademark) software, GENETYX (registered trademark) ver. 12).
具体的なリンゴ酸脱水素酵素の例として本願は、
（１）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列、但し配列中Xaaはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である；
（２）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列において、活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されており、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列：または
（３）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、活性中心ループのアミノ酸配列が同一であり、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列のいずれかを含み、
Xaaがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素より高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素を提供する。
As a specific example of malate dehydrogenase, the present application
(1) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15, or 16, wherein Xaa is a hydrophobic amino acid other than methionine;
(2) an amino acid sequence having malate dehydrogenase activity, in which 1 to 30 amino acids other than the amino acid sequence of the active center loop in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15 or 16 are deleted, added and/or substituted; or (3) an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15 or 16, the amino acid sequence of the active center loop is the same, and the amino acid sequence has malate dehydrogenase activity,
The present invention provides a malate dehydrogenase having a higher malate dehydrogenase activity than a malate dehydrogenase having the same sequence except that Xaa is methionine.
配列番号９は、出芽酵母MDH2のアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。配列番号１０はTA-MDHのアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。配列番号１５はGS-MDHのアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。配列番号１６はTT-MDHのアミノ酸配列のうち活性中心ループのメチオニン残基をメチオニン以外の疎水性アミノ酸（Xaa）に置換したアミノ酸配列を示す。 SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of the budding yeast MDH2 in which the methionine residue in the active center loop has been replaced with a hydrophobic amino acid (Xaa) other than methionine. SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of the TA-MDH in which the methionine residue in the active center loop has been replaced with a hydrophobic amino acid (Xaa) other than methionine. SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of the GS-MDH in which the methionine residue in the active center loop has been replaced with a hydrophobic amino acid (Xaa) other than methionine. SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence of the TT-MDH in which the methionine residue in the active center loop has been replaced with a hydrophobic amino acid (Xaa) other than methionine.
ある態様において、本願のMDHは、（１）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列（但し配列中Xaaはメチオニン以外の疎水性アミノ酸である）を含み得る。 In one embodiment, the MDH of the present application may include (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15, or 16 (wherein Xaa is a hydrophobic amino acid other than methionine).
別の態様において、本願のMDHは、（２）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列において、活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～10個、1～15個、1～20個、1～25個、1～30個、1～40個または1～50個、例えば1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されており、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を含み得る。 In another embodiment, the MDH of the present application may include an amino acid sequence having malate dehydrogenase activity, in which (2) 1 to 10, 1 to 15, 1 to 20, 1 to 25, 1 to 30, 1 to 40 or 1 to 50, for example 1 to 30, amino acids other than the amino acid sequence of the active center loop are deleted, added and/or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15 or 16.
さらに別の態様において、本願のMDHは、（３）配列番号９、１０、１５または１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％、例えば少なくとも90％の配列同一性を有し、活性中心ループのアミノ酸配列が同一であり、リンゴ酸脱水素酵素活性を有するアミノ酸配列を含み得る。 In yet another embodiment, the MDH of the present application may include an amino acid sequence that has (3) at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, e.g., at least 90%, sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 15, or 16, has the same amino acid sequence of the active center loop, and has malate dehydrogenase activity.
これらの態様のMDHは、配列番号９の110位に相当するアミノ酸（Xaa）がメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHより高いリンゴ酸脱水素活性を有する。例えば、Xaaがメチオニンである以外は同一の配列を有するMDHと比較して、約1.2倍以上、約1.5倍以上、約2倍以上、約3倍以上、または約4倍以上高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する。リンゴ酸脱水素酵素活性を測定する方法は上述の通りである。 These embodiments of MDH have higher malate dehydrogenase activity than MDH having the same sequence except that the amino acid (Xaa) corresponding to position 110 of SEQ ID NO:9 is methionine. For example, compared to MDH having the same sequence except that Xaa is methionine, the malate dehydrogenase activity is about 1.2 times or more, about 1.5 times or more, about 2 times or more, about 3 times or more, or about 4 times or more higher. The method for measuring malate dehydrogenase activity is as described above.
本願のリンゴ酸脱水素酵素の作製方法
本願のMDHは、例えば本願のMDHのアミノ酸配列をコードするDNAを調製し、これを発現ベクターに連結し、発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、異種あるいは同種タンパク質として生産し、単離および精製することで製造できる。
Method for Producing Malate Dehydrogenase of the Present Application The MDH of the present application can be produced, for example, by preparing DNA encoding the amino acid sequence of the MDH of the present application, ligating it to an expression vector, transforming a host with the expression vector, producing it as a heterologous or homologous protein, and isolating and purifying it.
本願のMDHをコードするDNAの調製方法としては、従来公知の手法を用いることができる。例えば、遺伝子合成により目的のアミノ酸配列をコードするDNAを全合成する方法、上述の多様な種由来の野生型MDHをコードするDNAに対して、部位特異的変異導入法により所定の部位に変異を導入する方法等が挙げられる。部位特異的変異導入法としては、従来公知の手法を用いることができ、例えばインバースPCR法が使用できる。インバースPCR法を使用する場合、市販のキットを用いてもよく、例えばKOD-Plus-Mutagenesis Kit、Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England BioLabs)およびQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent)などが使用できる。 The DNA encoding the MDH of the present application can be prepared by a conventional method. For example, a method of totally synthesizing a DNA encoding a target amino acid sequence by gene synthesis, a method of introducing a mutation into a specific site by site-directed mutagenesis into DNA encoding wild-type MDH derived from the various species described above, and the like can be mentioned. As the site-directed mutagenesis method, a conventional method can be used, for example, inverse PCR. When using inverse PCR, a commercially available kit can be used, for example, KOD-Plus-Mutagenesis Kit, Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England BioLabs), and QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) can be used.
本願のMDHをコードするDNAを、制限酵素およびDNAリガーゼを用いて、適切な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより、該DNAを含む発現ベクターを製造できる。 An expression vector containing the DNA encoding the MDH of the present application can be produced by linking the DNA downstream of a promoter in an appropriate expression vector using a restriction enzyme and DNA ligase.
発現ベクターとしては、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ファージDNA（ラムダファージなど）、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV40の誘導体などが挙げられるが、宿主細胞において複製および生存可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。例えば、宿主が大腸菌である場合、pET、pCold、pUC、pBADなどを例示することができる。 Expression vectors include bacterial plasmids, yeast plasmids, phage DNA (such as lambda phage), viral DNA such as retrovirus, baculovirus, vaccinia virus, and adenovirus, and derivatives of SV40, but any other vector can be used as long as it is replicable and viable in the host cell. For example, when the host is E. coli, examples include pET, pCold, pUC, and pBAD.
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合、lacプロモーター、T7プロモーター、Trpプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどが挙げられる。 The promoter may be any promoter appropriate for the host used to express the gene. For example, when the host is Escherichia coli, examples of the promoter include the lac promoter, T7 promoter, Trp promoter, PL promoter, and PR promoter.
本明細書において、宿主は、上記発現ベクターを導入することにより目的のMDHを発現できる限り、特に限定されない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母などの真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。 In the present specification, the host is not particularly limited as long as it is capable of expressing the desired MDH by introducing the expression vector. Examples of the host include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, fungi such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells.
細菌を宿主とする場合、宿主は例えば大腸菌である。大腸菌としては、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるBL21株、JM109株、XL1-Blue株などを挙げることができる。これら菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ATCC）などから容易に入手可能である。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。 When a bacterium is used as the host, the host is, for example, Escherichia coli. Examples of Escherichia coli include E. coli K12 strain and E. coli B strain, as well as BL21 strain, JM109 strain, and XL1-Blue strain, which are derived from wild-type strains. These strains are readily available, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC). There is no particular limitation on the method of introducing a recombinant vector into bacteria, as long as it is a method that introduces DNA into bacteria. Examples include a method using calcium ions and electroporation.
酵母を宿主とする場合は、用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属、トルロプシス属、またはピキア属等が使用できる。例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。 When yeast is used as a host, the type of yeast used is not particularly limited, but the genera Saccharomyces, Debaryomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Yarrowia, Rhodotorula, Lipomyces, Kluyveromyces, Rhodosporidium, Trichoderma, Torulopsis, and Pichia can be used. Examples include Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, and Schizosaccharomyces pombe. The method of introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples include electroporation, spheroplast, and lithium acetate methods.
目的とするリンゴ酸脱水素酵素が細胞外に排出される場合には培地から直接に、また細胞内に存在する場合には、超音波破砕や機械的破砕などの物理的手段もしくは細胞溶解剤などの化学的手段によって細胞を破壊した後にリンゴ酸脱水素酵素を精製する。具体的には、リンゴ酸脱水素酵素は、組換え細胞の培地から、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール(PEG)もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動などの技術を組み合わせて、部分的にまたは完全に精製することができる。 When the target malate dehydrogenase is secreted outside the cells, it is purified directly from the medium, and when it is present inside the cells, it is purified after disrupting the cells by physical means such as ultrasonic disruption or mechanical disruption, or by chemical means such as cell lysing agents. Specifically, malate dehydrogenase can be partially or completely purified from the medium of recombinant cells by a combination of techniques such as ammonium sulfate, polyethylene glycol (PEG) or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, reversed-phase high performance liquid chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and electrophoresis.
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定用組成物
本願はまた、本願のリンゴ酸脱水素酵素を含むアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）測定用組成物を提供する。
Composition for Measuring Aspartate Aminotransferase The present application also provides a composition for measuring aspartate aminotransferase (AST), which contains the malate dehydrogenase of the present application.
ASTはα－ケトグルタール酸のα－ケト基とL－アスパラギン酸のアミノ基の転移反応を触媒して、オキサロ酢酸とグルタミン酸を生成する。この反応に共役して、MDHは生成したオキサロ酢酸の存在下でNADHをNADに変換する。この時のNADHの減少速度を測定することにより、AST活性値を算出することができる。NADHの減少速度を測定する方法は上述の通りである。 AST catalyzes the transfer reaction between the α-keto group of α-ketoglutaric acid and the amino group of L-aspartic acid to produce oxaloacetic acid and glutamic acid. In conjunction with this reaction, MDH converts NADH to NAD in the presence of the produced oxaloacetic acid. AST activity can be calculated by measuring the rate at which NADH decreases. The method for measuring the rate at which NADH decreases is as described above.
本願のAST測定用組成物は、本願のMDHを含み、測定試料中のASTの量を測定するために使用される組成物である。測定試料はASTを含む限り特に限定されないが、例えば血漿または血清などの生体試料である。 The composition for measuring AST of the present application is a composition that contains the MDH of the present application and is used to measure the amount of AST in a measurement sample. The measurement sample is not particularly limited as long as it contains AST, and is, for example, a biological sample such as plasma or serum.
本願のAST測定用組成物において、本願のMDHの濃度はASTを測定できる限り特に限定されないが、例えば測定時において0.1U/mL～100U/mL、1U/mL～10U/mL、または1U/mL～5U/mLである。 In the composition for measuring AST of the present application, the concentration of the MDH of the present application is not particularly limited as long as it allows measurement of AST, but is, for example, 0.1 U/mL to 100 U/mL, 1 U/mL to 10 U/mL, or 1 U/mL to 5 U/mL at the time of measurement.
本願のAST測定用組成物は、本願のMDHに加えて反応の基質としてα－ケトグルタール酸、アスパラギン酸およびNADHを含んでいてもよい。各基質の濃度はASTを測定できる限り特に限定されない。 The composition for measuring AST of the present application may contain, in addition to the MDH of the present application, α-ketoglutaric acid, aspartic acid, and NADH as reaction substrates. The concentration of each substrate is not particularly limited as long as AST can be measured.
本願のAST測定用組成物はさらに、緩衝剤、保存剤、pH調整剤および／または抗酸化剤などを含んでいてもよい。緩衝剤としては公知の緩衝剤が使用できるが、例えば、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。 The composition for measuring AST of the present application may further contain a buffering agent, a preservative, a pH adjusting agent, and/or an antioxidant. Known buffering agents can be used as the buffering agent, and examples of such buffering agents include carbonate buffer, Tris buffer, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol buffer, phosphate buffer, borate buffer, glycine buffer, and diethanolamine buffer.
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。 The following examples are provided for further explanation, but the present invention is not limited to these examples.
［材料と方法］
野生型MDH3およびMDH3変異体の作製
His-SUMO1-MDH3 cDNA、His-SUMO1-MDH3 L84M cDNAまたはHis-SUMO1-MDH3 L84M/M92V cDNAをpColdベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。37℃で培養を行い、600nmでの吸光度（OD600）が0.5～0.6に達した際にisopropyl β-d-1 thiogalactopyranoside（IPTG）を終濃度0.1mMとなるように添加し、MDH3遺伝子の発現を誘導した。その後、16℃でさらに24時間インキュベートした。
Materials and Methods
Generation of wild-type MDH3 and MDH3 mutants
His-SUMO1-MDH3 cDNA, His-SUMO1-MDH3 L84M cDNA, or His-SUMO1-MDH3 L84M/M92V cDNA was cloned into pCold vector to prepare recombinant vectors. E. coli was transformed with the recombinant vectors. The cells were cultured at 37°C, and when the optical density at 600 nm (OD600) reached 0.5-0.6, isopropyl β-d-1 thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.1 mM to induce expression of the MDH3 gene. The cells were then incubated at 16°C for a further 24 hours.
5053gで15分間遠心分離することにより細胞を回収し、溶解用緩衝液（20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl）に再懸濁し、超音波破砕により溶解させた。細胞溶解液をNi2+ Sepharoseカラム（GE Healthcare）に添加し、結合したタンパク質を溶出用緩衝液（300mM imidazole、500mM NaCl、20mM Tris-HCl pH7.5）を用いてカラムから溶出した。ユビキチン様特異的プロテアーゼ（Ulp1）を添加して4℃で一晩インキュベートすることにより、タグを切断した。ゲル濾過用緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、150mM NaCl）を満たしたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。 Cells were harvested by centrifugation at 5053 g for 15 min, resuspended in lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) and lysed by sonication. The cell lysate was applied to a Ni 2+ Sepharose column (GE Healthcare) and bound proteins were eluted from the column using elution buffer (300 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5). The tag was cleaved by adding ubiquitin-like specific protease (Ulp1) and incubating overnight at 4°C. Further purification was performed using a HiLoad Superdex 75 column (GE Healthcare) filled with gel filtration buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol, 150 mM NaCl).
野生型MDH2の作製
GST-MDH2 cDNAをpet28aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った。
Generation of wild-type MDH2
GST-MDH2 cDNA was cloned into the pet28a vector to prepare a recombinant vector. E. coli was transformed with the recombinant vector. Culture, centrifugation, and cell disruption were performed in the same manner as for the purification of MDH3.
細胞溶解液をGlutathione Sepharose 4Bカラム（GE Healthcare）に添加し、結合したタンパク質を溶出用緩衝液（20mM glutathione、50mM Tris-HCl pH7.5）を用いてカラムから溶出した。3C proteaseを添加して4℃で一晩インキュベートすることにより、GSTタグを切断した。試料を再度Glutathione Sepharoseカラムに吸着させ、非吸着画分を回収することにより試料をさらに精製した。 The cell lysate was applied to a Glutathione Sepharose 4B column (GE Healthcare), and bound proteins were eluted from the column using elution buffer (20 mM glutathione, 50 mM Tris-HCl pH 7.5). The GST tag was cleaved by adding 3C protease and incubating overnight at 4°C. The sample was further purified by adsorbing it again to the Glutathione Sepharose column and collecting the non-adsorbed fraction.
MDH2変異体の作製
His-SUMO1-MDH2 M110L cDNAまたはHis-SUMO1-MDH2 M110L/V1184M cDNAをpColdベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、HiLoad Superdex 75カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーまでを行い、MDH2変異体を精製した。
Generation of MDH2 mutants
His-SUMO1-MDH2 M110L cDNA or His-SUMO1-MDH2 M110L/V1184M cDNA was cloned into pCold vector to prepare recombinant vector. E. coli was transformed with the recombinant vector. After culturing, centrifugation, and cell disruption in the same manner as for MDH3 purification, gel filtration chromatography using a HiLoad Superdex 75 column was performed to purify the MDH2 mutant.
その後、HiTrap QHP(GE Healthcare)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料をさらに精製した。緩衝液A（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol）および緩衝液B（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、2M NaCl）を用いた直線濃度勾配条件で溶出を行った。 The sample was then further purified by anion exchange chromatography using a HiTrap QHP (GE Healthcare). Elution was performed under linear gradient conditions using buffer A (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol) and buffer B (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol, 2 M NaCl).
野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の作製
His-SUMO1-TA-MDH cDNAまたはHis-SUMO1-TA-MDH M92L/K100M cDNAをpet28aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、Ni2+ Sepharoseカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーまでを行った。ユビキチン様特異的プロテアーゼ（Ulp1）を添加して4℃で一晩インキュベートすることにより、タグを切断した。その後、HiTrap QHP(GE Healthcare)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより試料をさらに精製した。緩衝液A（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol）および緩衝液B（20mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、2M NaCl）を用いた直線濃度勾配条件で溶出を行った。
Generation of wild-type TA-MDH and TA-MDH mutants
His-SUMO1-TA-MDH cDNA or His-SUMO1-TA-MDH M92L/K100M cDNA was cloned into the pet28a vector to prepare recombinant vectors. E. coli was transformed with the recombinant vectors. The same procedures as for the purification of MDH3 were used for culturing, centrifugation, and cell disruption, followed by affinity chromatography using a Ni 2+ Sepharose column. The tag was cleaved by adding ubiquitin-like specific protease (Ulp1) and incubating overnight at 4°C. The samples were then further purified by anion exchange chromatography using a HiTrap QHP (GE Healthcare). Elution was performed using a linear gradient of buffer A (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol) and buffer B (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol, 2 M NaCl).
野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の作製
GS-MDH cDNAまたはGS-MDH M91L/T99M cDNAをpet21aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、70℃で約10分熱処理を行った。その後、ゲル濾過用緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、150mM NaCl）を満たしたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。
Generation of wild-type GS-MDH and GS-MDH mutants
GS-MDH cDNA or GS-MDH M91L/T99M cDNA was cloned into the pet21a vector to prepare a recombinant vector. E. coli was transformed with the recombinant vector. After culturing, centrifugation, and cell disruption in the same manner as for MDH3 purification, the cells were heat-treated at 70°C for approximately 10 minutes. The cells were then further purified using a HiLoad Superdex 75 column (GE Healthcare) filled with gel filtration buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol, 150 mM NaCl).
野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の作製
TT-MDH cDNAまたはTT-MDH M96L/V104M cDNAをpet21aベクターにクローニングし、組換えベクターを作製した。組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換した。MDH3の精製と同様の手順で培養、遠心分離および細胞破砕を行った後、70℃で約10分熱処理を行った。その後、ゲル濾過用緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.5、10mM β-mercaptoethanol、150mM NaCl）を満たしたHiLoad Superdex 75カラム(GE Healthcare)を用いてさらに精製した。
Generation of wild-type TT-MDH and TT-MDH mutants
TT-MDH cDNA or TT-MDH M96L/V104M cDNA was cloned into the pet21a vector to prepare a recombinant vector. E. coli was transformed with the recombinant vector. After culturing, centrifugation, and cell disruption in the same manner as for the purification of MDH3, the cells were heat-treated at 70°C for approximately 10 minutes. The cells were then further purified using a HiLoad Superdex 75 column (GE Healthcare) filled with gel filtration buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM β-mercaptoethanol, 150 mM NaCl).
活性測定Activity measurement
試料（45mM カリウムリン酸緩衝液（KPB）、オキサロ酢酸（OAA）、各MDH）にNADHを加え、NADHの吸収波長である340nmの吸光度を分光光度計（Smart Spec Plus、Bio-Rad）で測定することによりΔO.D./minを得た。MDH2、MDH3およびTA-MDHの活性測定では、OAAの濃度範囲を0.01～4mMとし、各MDHの濃度を0.02μg/mlとした。GS-MDHおよびTT-MDHの活性測定では、OAAの濃度範囲を0.002～0.3ｍMとし、各MDHの濃度を0.002μg/mlとした。各濃度のOAAについて、それぞれΔO.D./minを得た。各条件につき3回ずつ測定を行った。 NADH was added to the sample (45 mM potassium phosphate buffer (KPB), oxaloacetic acid (OAA), each MDH), and ΔO.D./min was obtained by measuring the absorbance at 340 nm, the absorption wavelength of NADH, using a spectrophotometer (Smart Spec Plus, Bio-Rad). For activity measurements of MDH2, MDH3, and TA-MDH, the OAA concentration range was 0.01-4 mM, and the concentration of each MDH was 0.02 μg/ml. For activity measurements of GS-MDH and TT-MDH, the OAA concentration range was 0.002-0.3 mM, and the concentration of each MDH was 0.002 μg/ml. ΔO.D./min was obtained for each concentration of OAA. Measurements were performed three times for each condition.
各濃度のOAAにおけるΔO.D./minに基づき、Excelのアドインプログラムのソルバを用いてミカエリス＝メンテン式の誤差が最小になるようにMDHとOAAの解離定数Km(mM)値および反応速度の最大値Vmax(μM/min)を算出した。340nmにおけるNADHのモル分子吸光係数を6.3×103l/(mol・cm)とした。これらの値から、定められた条件下で毎分基質1μmolの変化を触媒する酵素量を1単位とするunit(μmol/min)、酵素蛋白質1mgあたりの酵素活性である比活性(unit/mg)、各活性部位が単位時間ごとに触媒する反応過程の回転(回転数)を表すKcat、異なる酵素の触媒効率を比較する際のパラメータであるKcat/Kmを算出した。 Based on the ΔO.D./min at each concentration of OAA, the dissociation constant K m (mM) of MDH and OAA and the maximum reaction rate V max (μM/min) were calculated using the Excel add-in program Solver so that the error of the Michaelis-Menten equation was minimized. The molar extinction coefficient of NADH at 340 nm was set to 6.3×10 3 l/(mol·cm). From these values, we calculated unit (μmol/min), which is the amount of enzyme that catalyzes the change of 1 μmol of substrate per minute under the specified conditions, specific activity (unit/mg), which is the enzyme activity per mg of enzyme protein, K cat , which represents the turnover (turnover number) of the reaction process catalyzed by each active site per unit time, and K cat /K m , which is a parameter for comparing the catalytic efficiency of different enzymes.
［結果］
参考例１：出芽酵母の野生型MDH2および野生型MDH3の活性測定
出芽酵母の野生型MDH2および野生型MDH3の活性測定の結果を図２に示す。図２のグラフからミカエリス＝メンテン式の誤差が最小になるようにKm(mM)値およびVmax(μM/min)を算出した。これらの値から、unit(μmol/min)、比活性(unit/mg)、Kcat、Kcat/Kmを算出した（表１）。
表１．出芽酵母の野生型MDH2および野生型MDH3の各種パラメータ
Reference Example 1: Measurement of activity of wild-type MDH2 and wild-type MDH3 in budding yeast
The results of activity measurements of wild-type MDH2 and wild-type MDH3 from budding yeast are shown in Figure 2. The K m (mM) value and V max (μM/min) were calculated from the graph in Figure 2 so as to minimize the error of the Michaelis-Menten equation. From these values, unit (μmol/min), specific activity (unit/mg), K cat , and K cat /K m were calculated (Table 1).
Table 1. Various parameters of wild-type MDH2 and wild-type MDH3 in budding yeast
測定の結果、MDH3の比活性は639unit/mgであり、MDH2の比活性（151unit/mg）に比べて4倍以上も高い値であった。また、MDH3のOAAに対するKm値は0.138mMであり、MDH2のKm値（0.040mM）に比べて3倍以上も高い値であった。さらに、MDH3のVmaxは0.080(ΔO.D./min)であり、MDH2のVmax（0.019ΔO.D./min）に比べて4倍以上も高い値であった。以上から、MDH3はMDH2に比べ非常に高い活性を持つ酵素であることが明らかになった。 As a result of the measurement, the specific activity of MDH3 was 639 units/mg, which was more than four times higher than that of MDH2 (151 units/mg). In addition, the Km value of MDH3 for OAA was 0.138 mM, which was more than three times higher than that of MDH2 (0.040 mM ). Furthermore, the Vmax of MDH3 was 0.080 (ΔO.D./min), which was more than four times higher than that of MDH2 (0.019ΔO.D./min). From the above, it was revealed that MDH3 is an enzyme with much higher activity than MDH2.
参考例２：出芽酵母のMDH3変異体の活性測定
出芽酵母のMDH3変異体の活性測定の結果を図３に示す。野生型MDH2およびMDH3の活性測定と同様に、各種パラメータを算出した（表２）。
表２．出芽酵母のMDH3変異体の各種パラメータ
Table 2. Various parameters of MDH3 mutants of budding yeast
MDH3 L84M変異体およびL84M/M92V変異体の比活性はそれぞれ284unit/mgおよび193unit/mgであり、野生型MDH3の比活性(639unit/mg)に比べ非常に低い値であり、MDH2の比活性(151unit/mg)に近い値であった。また、MDH3 L84M変異体およびL84M/M92V変異体のKm値はそれぞれ0.026mMおよび0.023mMであり、野生型MDH3のKm値(0.138mM)に比べ非常に低い値であり、MDH2のKm値(0.04mM)に近い値であった。さらに、MDH3 L84M変異体およびL84M/M92V変異体のVmaxはそれぞれ0.035(ΔO.D./min)、0.024(ΔO.D./min)であり、野生型MDH3のVmax(0.080ΔO.D./min)に比べて低く、MDH2のVmax(0.019ΔO.D./min)に近い値であった。 The specific activities of the MDH3 L84M and L84M/M92V mutants were 284 and 193 units/mg, respectively, which were much lower than that of wild-type MDH3 (639 units/mg) and close to that of MDH2 (151 units/mg). The Km values of the MDH3 L84M and L84M/M92V mutants were 0.026 mM and 0.023 mM, respectively, which were much lower than that of wild-type MDH3 (0.138 mM) and close to that of MDH2 (0.04 mM). Furthermore, the V max of the MDH3 L84M mutant and L84M/M92V mutant were 0.035 (ΔO.D./min) and 0.024 (ΔO.D./min), respectively, which were lower than the V max of wild-type MDH3 (0.080ΔO.D./min) and close to the V max of MDH2 (0.019ΔO.D./min).
実施例１：出芽酵母のMDH2変異体の活性測定
出芽酵母のMDH2変異体の活性測定の結果を図４に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表３）。
表３．出芽酵母のMDH2変異体の各種パラメータ
Table 3. Various parameters of MDH2 mutants of budding yeast
MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体の比活性はそれぞれ664unit/mg、653unit/mgであり、野生型MDH2の比活性(151unit/mg)に比べ高く、MDH3の比活性(639unit/mg)に近い値であった。また、MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体のOAAに対するKm値はそれぞれ0.156mM、0.329mMであり、野生型MDH2のKm値(0.040mM)に比べ高く、MDH3のKm値(0.138mM)に近い値であった。さらに、MDH2 M110L変異体およびMDH2 M110L/V118M変異体のVmaxはそれぞれ0.083(ΔO.D./min)および0.081(ΔO.D./min)であり、野生型MDH2のVmax(0.019ΔO.D./min)に比べて高く、MDH3のVmax(0.080ΔO.D./min)に近い値であった。 The specific activities of the MDH2 M110L mutant and the MDH2 M110L/V118M mutant were 664 and 653 units/mg, respectively, which were higher than that of wild-type MDH2 (151 units/mg) and close to that of MDH3 (639 units/mg). The Km values of the MDH2 M110L mutant and the MDH2 M110L/V118M mutant for OAA were 0.156 mM and 0.329 mM, respectively, which were higher than that of wild-type MDH2 (0.040 mM) and close to that of MDH3 (0.138 mM). Furthermore, the V max of the MDH2 M110L mutant and the MDH2 M110L/V118M mutant were 0.083 (ΔO.D./min) and 0.081 (ΔO.D./min), respectively, which were higher than the V max of wild-type MDH2 (0.019ΔO.D./min) and close to the V max of MDH3 (0.080ΔO.D./min).
実施例２：野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の活性測定
野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の活性測定の結果を図５に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表４）。
表４．野生型TA-MDHおよびTA-MDH変異体の各種パラメータ
Table 4. Various parameters of wild-type TA-MDH and TA-MDH mutants
野生型TA-MDHとTA-MDH M92L/K100M変異体の比活性はそれぞれ152unit/mg、339unit/mgであり、変異体は野生型よりも2倍以上高い比活性を示した。また、野生型TA-MDHとTA-MDH M92L/K100M変異体のKm値はそれぞれ0.007mM、0.018mMであり、変異体は野生型よりも2倍以上高いKmを示した。さらに、Vmaxはそれぞれ0.019(ΔO.D./min)、0.042(ΔO.D./min)であり、変異体は野生型よりも2倍以上高い活性を示した。 The specific activities of wild-type TA-MDH and the TA-MDH M92L/K100M mutant were 152 and 339 units/mg, respectively, and the mutant showed more than two-fold higher specific activity than the wild-type. The K m values of wild-type TA-MDH and the TA-MDH M92L/K100M mutant were 0.007 mM and 0.018 mM, respectively, and the mutant showed more than two-fold higher K m than the wild-type. Furthermore, the V max was 0.019 (ΔO.D./min) and 0.042 (ΔO.D./min), respectively, and the mutant showed more than two-fold higher activity than the wild-type.
実施例３：野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の活性測定
野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の活性測定の結果を図６に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表５）。
表５．野生型GS-MDHおよびGS-MDH変異体の各種パラメータ
Table 5. Various parameters of wild-type GS-MDH and GS-MDH mutants
野生型GS-MDHとGS-MDH M91L/T99M変異体の比活性はそれぞれ863unit/mg、3516unit/mgであり、変異体は野生型よりも4倍以上高い比活性を示した。また、野生型GS-MDHとGS-MDH M91L/T99M変異体のKm値はそれぞれ0.001mM、0.017mMであり、変異体は野生型よりも15倍以上高いKmを示した。さらに、Vmaxはそれぞれ0.011(ΔO.D./min)、0.044(ΔO.D./min)であり、変異体は野生型よりも4倍も高い活性を示した。 The specific activities of wild-type GS-MDH and the GS-MDH M91L/T99M mutant were 863 and 3516 units/mg, respectively, and the mutant showed more than four times higher specific activity than the wild-type. The K m values of wild-type GS-MDH and the GS-MDH M91L/T99M mutant were 0.001 mM and 0.017 mM, respectively, and the mutant showed more than 15 times higher K m than the wild-type. Furthermore, the V max was 0.011 (ΔO.D./min) and 0.044 (ΔO.D./min), respectively, and the mutant showed four times higher activity than the wild-type.
実施例４：野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の活性測定
野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の活性測定の結果を図７に示す。上記と同様に、各種パラメータを算出した（表６）。
表６．野生型TT-MDHおよびTT-MDH変異体の各種パラメータ
Table 6. Various parameters of wild-type TT-MDH and TT-MDH mutants
野生型TT-MDHとTT-MDH M96L/V104M変異体の比活性はそれぞれ519unit/mg、2441unit/mgであり、変異体は野生型よりも4倍以上高い比活性を示した。また、野生型TT-MDHとTT-MDH M96L/V104M変異体のKm値はそれぞれ0.003mM、0.016mMであり、変異体は野生型よりも5倍以上高いKmを示した。さらに、Vmaxはそれぞれ0.034(ΔO.D./min)、0.158(ΔO.D./min)であり、変異体は野生型よりも4倍以上高い活性を示した。 The specific activities of wild-type TT-MDH and the TT-MDH M96L/V104M mutant were 519 unit/mg and 2441 unit/mg, respectively, and the mutant showed a specific activity more than four times higher than that of the wild-type. The K m values of wild-type TT-MDH and the TT-MDH M96L/V104M mutant were 0.003 mM and 0.016 mM, respectively, and the mutant showed a K m more than five times higher than that of the wild-type. Furthermore, the V max was 0.034 (ΔO.D./min) and 0.158 (ΔO.D./min), respectively, and the mutant showed an activity more than four times higher than that of the wild-type.
Claims (7)
（１）配列番号１０、１５または１６のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶ、ＬまたはＩである）；
（２）配列番号１０、１５または１６のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶ、ＬまたはＩである）、においてアミノ酸配列LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）、またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）（ここでＸはＶ、ＫまたはＩである)である活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されている；
（３）配列番号１０、１５または１６のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶ、ＬまたはＩである）に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつアミノ酸配列LARKPGXSRDDLF（配列番号８）、IARKPGXSRDDLV（配列番号１３）、またはAPRKAGXERRDLL（配列番号１４）（ここでＸはＶ、ＫまたはＩである)である活性中心ループを有する、
を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
Ｘａａがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素。 The sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 is 90% or less, and the sequence is any one of the following amino acid sequences (1) to (3) :
(1) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 15, or 16, wherein Xaa is V, L, or I;
(2) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 15 or 16 (wherein Xaa is V, L or I), 1 to 30 amino acids other than the amino acid sequence of the active center loop, which is the amino acid sequence LARKPGXSRDDLF (SEQ ID NO: 8), IARKPGXSRDDLV (SEQ ID NO: 13), or APRKAGXERRDLL (SEQ ID NO: 14) (wherein X is V, K or I), are deleted, added and/or substituted;
(3) having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 15 or 16 (wherein Xaa is V, L or I), and having an active center loop of the amino acid sequence LARKPGXSRDDLF (SEQ ID NO: 8), IARKPGXSRDDLV (SEQ ID NO: 13), or APRKAGXERRDLL (SEQ ID NO: 14) (wherein X is V, K or I);
A malate dehydrogenase having the formula :
A malate dehydrogenase having a higher malate dehydrogenase activity than a malate dehydrogenase having the same sequence except that Xaa is methionine.
（１）配列番号９のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶまたはＬである）；
（２）配列番号９のアミノ酸配列（ここで配列中ＸａａはＶまたはＬである）、において、アミノ酸配列VPRKPGXTRDDLF（配列番号４）（ここでＸはＶまたはＬである）である活性中心ループのアミノ酸配列以外の1～30個のアミノ酸が欠損、付加および／または置換されている；
（３）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつアミノ酸配列VPRKPGXTRDDLF（配列番号４）（ここでＸはＶまたはＬである）の活性中心ループを有する、
を有するリンゴ酸脱水素酵素であって、
Ｘａａがメチオニンである以外は同一の配列を有するリンゴ酸脱水素酵素と比較して高いリンゴ酸脱水素酵素活性を有する、リンゴ酸脱水素酵素。 The sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 is 90% or less, and the sequence is any one of the following amino acid sequences (1) to (3) :
(1) an amino acid sequence of SEQ ID NO:9, wherein Xaa is V or L;
(2) In the amino acid sequence of SEQ ID NO:9 (wherein Xaa is V or L), 1 to 30 amino acids other than the amino acid sequence of the active center loop, which is the amino acid sequence VPRKPGXTRDDLF (SEQ ID NO:4) (wherein X is V or L), are deleted, added and/or substituted;
(3) having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:9 and having an active center loop of the amino acid sequence VPRKPGXTRDDLF (SEQ ID NO:4) (wherein X is V or L);
A malate dehydrogenase having the formula :
A malate dehydrogenase having a higher malate dehydrogenase activity than a malate dehydrogenase having the same sequence except that Xaa is methionine.
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