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JP7650085B2 - 間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力の査定の方法、ならびに間葉系幹細胞の選択および間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料としての組織の同定の関連する方法 - Google Patents

間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力の査定の方法、ならびに間葉系幹細胞の選択および間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料としての組織の同定の関連する方法 Download PDF

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JP7650085B2 JP2022521087A JP2022521087A JP7650085B2 JP 7650085 B2 JP7650085 B2 JP 7650085B2 JP 2022521087 A JP2022521087 A JP 2022521087A JP 2022521087 A JP2022521087 A JP 2022521087A JP 7650085 B2 JP7650085 B2 JP 7650085B2
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Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年10月8日に出願された米国仮出願第62/912,374号に基づく優先権の恩典を主張するものであり、その内容は事実上その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本願は、参照により本明細書に組み入れられる、コンピュータで読み取り可能な形態の配列表を含有する。
発明の分野
本発明は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定する方法に関する。さらに、本発明は、cGMP条件下で幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択する方法、および後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択する方法に関する。さらに、本発明は、マスター細胞バンクを生成するための間葉系幹細胞集団を選択する方法、および薬学的に使用するための間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定する方法に関する。本発明は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定するための、少なくとも1種のタンパク質の使用にも関する。本発明は、cGMP条件下で幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択するための、少なくとも1種のタンパク質の使用にも関する。さらに、本発明は、後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択するための間葉系幹細胞集団を選択するための、少なくとも1種のタンパク質の使用に関する。本発明は、マスター細胞バンクを生成するための間葉系幹細胞集団を選択するための間葉系幹細胞集団を選択するための、少なくとも1種のタンパク質の使用、および薬学的に使用するための間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定するための間葉系幹細胞集団を選択するための間葉系幹細胞集団を選択するための、少なくとも1種のタンパク質の使用にも関する。さらに、本発明は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定する方法に関する。
発明の背景
間葉系幹細胞（MSC）は、自己再生および多系統分化の能力を有する。従って、これらの細胞は、再生医学のための魅力的かつ有望なツールである。MSCは、様々な組織、例えば、骨髄間質、脂肪組織、真皮、胎盤、臍帯血、または種々の臍帯組織、例えば、ワルトン膠様質、臍帯静脈の内皮下層、もしくは臍帯の羊膜組織から単離され得る（Mitchell,K.E.et al.(2003)Stem Cells 21,50-60；米国特許第5,919,702号；米国特許出願第2004/0136967号；Romanov,Y.A.et al.(2003)Stem Cells 21,105-110；Covas,D.T.et al.(2003)Braz.J.Med.Biol.Res.36,1179-1183；US2006/0078993）。臍帯の羊膜から単離された間葉系幹細胞は、（登録された米国特許第9,085,755号、第9,737,568号、および第9,844,571号に至る）米国特許出願第2006/0078993号、ならびに対応する国際特許出願WO2006/019357において最初に報告された。さらに、臍帯の羊膜に由来するそのような間葉系幹細胞の集団は、米国出願第20181/27721号または対応する国際出願WO 2018/067071において最近記載された。
米国出願第20181/27721号または対応する国際出願WO 2018/067071において記載された間葉系幹細胞集団は、この集団の幹細胞の99％以上が、3種のMSCマーカー、CD73、CD90を発現する一方で、CD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠くという利点を有する。従って、この極めて均一で、よく定義された細胞集団は、例えば、Dominici et al,Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement",Cytotherapy(2006)Vol.8,No.4,315-317; Sensebe et al.,"Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices:a,review",Stem Cells Research & Therapy 2013,4:66); Vonk et al.,Stem Cells Research & Therapy(2015)6:94; またはKundrotas Acta Medica Lituanica.2012.Vol.19 No.2.P.75-79によって定義される、ヒトMSCを細胞治療に使用するための一般的に認められている基準を、例えば、完全に満たすため、臨床試験および細胞ベースの治療のための理想的な候補である。国際出願WO 2018/067071において記載されるように、この間葉系幹細胞集団は、例えば、創傷治癒のため、例えば、熱傷または慢性糖尿病性創傷の処置のため、未分化状態で使用され得る。あるいは、この間葉系幹細胞集団を、例えば、インスリン産生β島細胞へ分化させ、次いで、インスリン欠損、例えば、糖尿病に罹患している患者へ、例えば、移植によって、それを投与することができる（これに関しては、国際出願WO2007/046775も参照すること）。
国際出願WO 2018/067071にも記載されている、この間葉系幹細胞集団を作製するプロセスは、そのような同種細胞ベースの治療のために必要とされる、適正製造基準（Good Manufacturing Practice）（GMP）条件下での実施のために適当である。しかしながら、GMP準拠の作製は、薬物生成物が有機低分子であるか、生物学的分子であるか、または国際出願WO 2018/067071の間葉系幹細胞集団の場合のように細胞集団であるか、に関わらず、製造された薬物生成物の品質管理を必要とする。従って、国際出願WO 2018/067071の間葉系幹細胞集団のGMP準拠の作製のための品質管理アッセイを利用可能にすることは、望ましいであろう。
これに関して、間葉系幹細胞は、他の任意の生物学的材料と同様に、固有の可変性を有することが公知である。例えば、間葉系幹細胞の細胞生物学の研究は、それらの寿命および増大能に影響を与える多様な因子を同定した。ドナー組織の起源、ドナーの年齢、環境的背景、および単離方法などの問題が、間葉系幹細胞の全体的な品質に影響を与えることが記載されている（Paladino,et al."Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells,"Cell and Tissue Banking,vol.17,no.1,pp.123-136,(2016),https://doi.org/10.1007/s10561-015-9525-6を参照すること）。さらに、Paladino,et al.（前記）2016は、細胞の生存率、培養中の寿命、増大可能性、および分化能に関して利点があるか否かを同定するため、細胞バンク化のための臍帯からのMSCの3種の異なる単離方法を比較することによって、間葉系幹細胞における個々の可変性を解明した。3種の研究されたプロトコルのうちの少なくとも2種によって、高度に管理された実験条件の下で、同一の試料が処理されたため、結果は、倍加時間および寿命の読み取りを含む、観察された可変性の一部が、明白に各ドナーに固有であることを明らかにしていると、著者らは報告している。さらなる研究において、Paladino et al.(2017)"Intrinsic Variability Present in Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells and T Cell Responses May Impact Cell Therapy".Hindawi,Stem Cells International Volume 2017,Article ID 8492797,12 pages,https://doi.org/10.1155/2017/8492797は、免疫調整分子の遺伝子発現が、ワルトン膠様質間葉系幹細胞（WJ-MSC）の試料間で変動し、特別なパターンが存在しないことを示した。共培養において、全てのWJ-MSCが、マイトジェンによって活性化されるCD3+T細胞の増殖を阻害することができたが、その程度は異なっており、各PBMCは、異なる阻害レベルで応答した。著者らは、各WJ-MSCが、独特の挙動を示し、サイトカインmRNA発現のパターンおよび免疫調整能に関して異なっていることを示唆した。著者らは、試料間の可変性が、治療的に利用されるWJ-MSCの有効性において役割を果たし得ることも想定した。
これらの結果を考慮すると、臍帯の羊膜に由来するMSCも、特定の分子の産生に関して固有の可変性を有する可能性が高く、次に、それは、治療的適用、例えば、創傷治癒または糖尿病のための適合性に影響を与え得る。従って、例えば、創傷治癒目的のために使用するために適当なMSC集団またはMSC含有ドナー組織を同定する方法を、利用可能にすることは、有利であろう。そのような方法は、（細胞治療薬物生成物を作製するために必要な）マスター細胞バンクを生成するためにも、または後に薬学的に投与するための幹細胞集団をcGMP条件下で作製するためにも、理想的に有用であろう。
従って、例えば、MSC含有組織のドナー、またはその後の治療的適用、例えば、創傷治癒のために適当であるMSC集団のドナーを同定するために使用され得る方法を提供することが、本発明の目的である。
この目的は、独立請求項の特徴を有する方法および使用によって達成される。
第1の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定する方法を提供する。
第2の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、cGMP条件下で幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択する方法を提供する。
第3の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択する方法を提供する。
第4の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、マスター細胞バンクを生成するための間葉系幹細胞集団を選択する方法を提供する。
第5の局面において、本発明は、組織または組織から単離された細胞の試料によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを決定する工程を含む、薬学的に使用するための間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定する方法を提供する。
第6の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用を提供する。
第7の局面において、本発明は、cGMP条件下で幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用を提供する。
第8の局面において、本発明は、後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用を提供する。
第9の局面において、本発明は、マスター細胞バンクを生成するための間葉系幹細胞集団を選択するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用を提供する。
第10の局面において、本発明は、薬学的に使用するための間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用を提供する。
第11の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定する方法を提供する。
第12の局面において、本発明は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用を提供する。
本発明は、非限定的な例および図面と共に考慮された時に、詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
適当な創傷治癒効力を有するMSC集団を含有する治療用組成物を作製する方法の例示的な例の実験工程を模式的に表す流れ図を示す。この方法は、MSC集団を作製するための出発材料として適当な組織の同定、MSC集団の創傷治癒効力の査定、マスター細胞バンクを作製するためのMSC集団の選択、および薬学的に投与するためのMSC集団の選択を含む。この例において使用される幹細胞は、臍帯の羊膜から単離され、臍帯最外層（lining）幹細胞（CLSC）とも呼ばれる。この例は、MSC培養のための出発材料として使用され得る、臍帯組織を含む組織バンクを準備することから始まる。この目的のため、組織提供についてのドナーの同意を得ることができる（ステージ1）。さらに、母体および新生児の血液試料を、感染性疾患についてスクリーニングし、臍帯を、微生物混入について試験する。例えば、100個までの臍帯試料を、そのような組織バンクに収集することができる。混入またはドナーの感染性疾患に関して問題がないことが見出された組織を、純粋なMSC株を作製するために使用される発達培養のために使用する（ステージ2）。この目的のため、臍帯の、約10個の個々の羊膜からのアウトグロース（outgrowths）を、増殖のため、0～2代にわたり培養する。2代目（P2）からのMSCを、フローサイトメトリーによって、MSCマーカーについて査定し、上清をサイトカイン産生について査定する。ステージ2におけるMSCについての中間合格（in-process release）基準は、95％超がCD73、CD90、CD105について陽性であること、ならびに5％未満がCD34、CD45、およびHLA-DRについて陽性であること、アンジオポエチン-1およびTGFβのインビトロ産生が500pg/mlを超えること、ならびにVEGFおよびHGFが100pg/mlを超えること、ならびに無菌試験が陰性であることが含まれる。次いで、ステージ2中間合格基準を満たす細胞株を、製造プロセスのステージ3のため、Terumo Quantumバイオリアクターにおいてさらに増殖させる。ステージ3におけるMSCについての中間合格基準は、95％超がCD73、CD90、CD105について陽性であること、ならびに5％未満がCD34、CD45、およびHLA-DRについて陽性であること、無菌性、内毒素、マイコプラズマ、ヒト病原体ウイルス、および外来性ウイルスについて試験されることを含む。試験を通過した間葉系細胞株（集団）を、マスター細胞バンクとしてバンク化する（ステージ3）。マスター細胞バンクが解凍され、培養液に播種され、合格基準は、無菌性、マイコプラズマ、および内毒素であり、最終的に、試験を通過した1×、3×、および5×106個のMSCが、担体培地、例えば、1mlのHypothermosol（登録商標）中でビン詰めされ、薬学的に投与する前には、2～8℃で保存される（ステージ4）。 ステージ2後の、図1に記載されたように培養された、10個の異なる臍帯ドナーから得られた10個の個々のMSC集団におけるAng-1、VEGF、HGF、およびTGFβ（ここでは、TGFβ1）の分泌レベル分析の結果を示す。図2Aは、個々のMSC集団、8049356、8049358、8049359、8049364、8049365、8049369、8049370、8049372、8049373、および8049384についてのトランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）の分泌レベルを示す。10個全ての集団の分泌レベルが、赤線によって示された、約500pg/mlであるTGFβについての閾値を超えている。図2Bは、個々のMSC集団、8049356、8049358、8049359、8049364、8049365、8049369、8049370、8049372、8049373、および8049384についての肝細胞増殖因子（HGF）の分泌レベルを示す。8049365、8049369、8049372、8049373、および8049384の分泌レベルは、赤線によって示された、約100pg/mlであるHGFについての閾値を超えている。図2Cは、個々のMSC集団、8049356、8049358、8049359、8049364、8049365、8049369、8049370、8049372、8049373、および8049384についてのアンジオポエチン1（Ang-1）の分泌レベルを示す。10個全ての集団の分泌レベルが、赤線によって示された、約500pg/mlであるAng-1についての閾値を超えている。図2Dは、個々のMSC集団、8049356、8049358、8049359、8049364、8049365、8049369、8049370、8049372、8049373、および8049384についての血管内皮増殖因子（VEGF）の分泌レベルを示す。8049358、8049359、および8049370を除く全ての集団の分泌レベルが、赤線によって示された、約100pg/mlであるVEGFについての閾値を超えている。 MSC集団（8049372）におけるサイトカイン分泌安定性の査定を示す。この目的のため、TGFβ、HGF、Ang-1、およびVEGFの分泌レベルを各々決定し、ステージ4後の同一集団の2個の別々の試料において比較する。図3Aは、2個の別々の試料におけるTGFβの分泌レベルを示し、ステージ4後のそれぞれ約2230pg/mlおよび2419pg/mlという安定的なタンパク質分泌を示している。図3Bは、2個の別々の試料におけるHGFの分泌レベルを示し、ステージ4後のそれぞれ約933pg/mlおよび985pg/mlという安定的なタンパク質分泌を示している。図3Cは、2個の別々の試料におけるAng-1の分泌レベルを示し、ステージ4後のそれぞれ約1800pg/mlおよび1854pg/mlという安定的なタンパク質分泌を示している。図3Dは、2個の別々の試料におけるVEGFの分泌レベルを示し、ステージ4後のそれぞれ約210pg/mlおよび219pg/mlという安定的なタンパク質分泌を示している。 図4は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定するためのアッセイの結果を示す。胎盤から得られたMSC、ワルトン膠様質から得られたMSC（WJ MSC）、および臍帯最外層MSC（CL-MSC）とも呼ばれる臍帯の羊膜から得られたMSCを、MSCを培養するために適当な異なる培地（PTT4、PTT6、およびDMEM/F12）において培養した。タンパク質検出をMSC上清において実施し、分析をLuminex 200およびXponentソフトウェアを使用して実施した。図4Aは、Ang-1の測定を要約したものである。S1は、アッセイにおいて使用された最高標準を示す。それを上回る試料は、外挿して考慮される（濃度が高過ぎる）。グラフは、CL-MSC、WJ-MSC、および胎盤MSCの全てが、PTT6において成長した時に、MSCがPTT4またはDMEM/F12において成長した時と比較して、はるかに高いレベルのAng-1を産生することを示している。図4Bは、PTT6、PTT4、またはDMEM/F12において培養されたCL-MSC、WJ-MSC、および胎盤MSCの分析された上清におけるVEGFの測定を要約したものである。S1は、アッセイにおいて使用された最高標準を示す。それを上回る試料は、外挿して考慮される（濃度が高過ぎる）。グラフから分かるように、CL-MSC、WJ-MSC、および胎盤MSCの全てが、PTT6において成長した時に、MSCがPTT4またはDMEM/F12において成長した時と比較して、はるかに高いレベルのVEGFを産生する。図4Cは、HGFの測定を要約したものである。グラフは、CL-MSC、WJ-MSC、および胎盤MSCの全てが、PTT6において成長した時に、MSCがPTT4またはDMEM/F12において成長した時と比較して、はるかに高いレベルのAng-1を産生することを示している。図4Dは、TGFβ1のシングルプレックス測定を示す。グラフから分かるように、CL-MSC、WJ-MSC、および胎盤MSCの全てが、PTT6において成長した時に、DMEM/F12において成長した時より多くのTGFβ1を産生する。 4Aの説明を参照のこと。 4Aの説明を参照のこと。 4Aの説明を参照のこと。
発明の詳細な説明
本発明は、治療的に使用するための間葉系幹細胞集団のGMP準拠の製造プロセスの様々なステージのためのバリデーションのため、かつ/または品質管理として、全て、適当である、いくつかの方法に関する。これらの方法は、全て、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を使用する。
従って、MSC集団の培地においてAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌レベルを決定する工程が、MSC集団のGMP準拠の製造プロセスのいくつかの局面について、適当な基準であることが、驚くべきことに見出された。MSC集団が培養されるまたは保管される培地におけるAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌レベルの決定は、MSC集団の創傷治癒効力を査定するため、適当な創傷治癒効力を有するMSC集団を作製するための出発材料として適当な（ドナー）組織を同定するため、cGMP準拠の作製のためのMSC集団を選択するため、または後に薬学的に投与するための、もしくはマスター細胞バンクを生成するためのMSC集団を選択するため、使用され得る。さらに、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌レベルの決定は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定するため、使用され得る。
ここで、創傷治癒過程におけるAng-1、TGFβ1、VEGF、およびHGFの関与は、当業者に公知であることに注意すること。創傷治癒におけるAng-1（SEQ ID NO:1）の関与については、例えば、Li et al.Stem Cells Research & Therapy 2013,4:113"Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 gene promote wound healing"またはBitto et al,"Angiopoietin-1 gene transfer improves the impaired wound healing of the genetically diabetic mice without increasing VEGF expression",Clinical Science May 14,2008,114(12)707-718を参照すること。Liらの研究においては、Ang-1遺伝子が骨髄間葉系幹細胞に挿入され、その結果は、「Ang1-MSCが、MSC、Ad-Ang1、または偽処置と比較して、創傷治癒を有意に促進し、上皮および真皮の再生を増加させ、血管新生を増強する」ことを示した。注目すべきことに、Liらの著者は、MSCが単独では十分なAng-1を産生しないと述べており、この理由のため、著者らは、遺伝学的に修飾された細胞を得るため、Ang-1遺伝子をMSCへ挿入した。
創傷治癒、具体的には、慢性/非治癒性創傷の治癒における、トランスフォーミング増殖因子β、例えば、TGFβ1（SEQ ID NO:2）、TGFβ2、およびTGFβ3の関与については、例えば、Ramirez et al."The Role of TGFb Signaling in Wound Epithelialization"Advances In Wound Care,Volume 3,Number 7,2013,482-491またはPakyari et al.,Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing,Advances In Wound Care,Volume 2,Number 5,2012,215-224を参照すること。
創傷治癒、具体的には、慢性/非治癒性創傷の治癒におけるVEGF（SEQ ID NO:3）の関与については、例えば、Froget et al.,Eur.Cytokine Netw.,Vol.14,March 2003,60-64またはBao et al.,"The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Healing"J Surg Res.2009 May 15;153(2):347-358を参照すること。
創傷治癒、具体的には、慢性/非治癒性創傷の治癒におけるHGF（SEQ ID NO:4）については、例えば、Yoshida et al.,"Neutralization of Hepatocyte Growth Factor Leads to Retarded Cutaneous Wound Healing Associated with Decreased Neovascularization and Granulation Tissue Formation"J.Invest.Dermatol.120:335-343,2003、Li,Jin-Feng et al."HGF Accelerates Wound Healing by Promoting the Dedifferentiation of Epidermal Cells through β1-Integrin/ILK Pathway."BioMed Research International 2013(2013):470418、またはConway et al,"Hepatocyte growth factor regulation:An integral part of why wounds become chronic".Wound Rep Reg(2007)15 683-692を参照すること。
創傷治癒効力とは、創傷治癒を容易にするまたは加速する可能性、能力、コンピテンス、または有効性を意味し得る。本発明において、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFのうちの1種、2種、3種、または4種全ての、（濃度とも呼ばれる）分泌レベルが、本明細書において定義される、これらのタンパク質の各々に特異的な閾値と等しいまたはそれより高い場合、MSC集団が、例えば、十分な創傷治癒効力を有すると見なされる、または組織が、薬学的に適当なMSC集団を作製するための出発材料として適当であると見なされる（実施例2も参照すること）。従って、創傷治癒の査定は、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌レベルの決定、ならびに特定の閾値に到達しているかまたはそれを超えているか否かのその後の決定を含む。MSC集団の創傷治癒効力の査定は、MSC培養の異なるステージにおいて実施され得る。創傷治癒効力を有し、従って、後に薬学的に使用するために適当であり得るMSC集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定するため、MSC培養前の組織において直接、創傷治癒効力を査定することができる。薬学的適用のために適当であるためには、MSC集団は、現行適正製造基準（cGMP）条件下で作製されなければならないかもしれない。従って、MSC集団を作製する前に、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌レベルを決定することは、cGMP条件下でMSC集団を作製するためのMSC集団を選択するために適当であり得る。さらに、後に薬学的に投与するためのMSC集団が、本明細書に記載される方法を使用して選択され得る。
本発明に従って選択されたMSC集団は、マスター細胞バンクを生成するためにも使用され得る。これに関して、選択されたMSC集団は、凍結保存前に、さらに特徴決定され、完全性、ならびに混入物質、例えば、細菌、真菌、マイコプラズマ、およびウイルスについて試験され得る。準備された後、MSCマスター細胞バンクは、必要な時にいつでも、さらなる研究または作製のプロセスのための培養物の形成のため、特定のMSC集団を増幅することを可能にし得る。例えば、創傷治癒特性を有するMSCを含むMSCマスター細胞バンクは、創傷治癒のために理想的である量のAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFを分泌する特定のMSC集団の増幅を可能にし得る。
Ang-1、TGFβ、VEGF、および/またはHGFの分泌レベルは、本明細書に記載される方法において選択基準として使用される。閾値と等しいまたは閾値を超える分泌レベルは、例えば、（i）MSC集団の創傷治癒の効力、または（ii）MSC集団を作製するための出発材料として適当である組織もしくは単離された細胞集団を示し得る。本発明において、Ang-1についての閾値は、約100pg/ml、約200pg/ml、約300pg/ml、約400pg/ml、約500pg/ml、約600pg/ml、約700pg/ml、約800pg/ml、約900pg/ml、または約1000pg/mlであり得る。好ましくは、Ang-1についての閾値は、約500pg/mlである。TGFβについての閾値は、約100pg/ml、約200pg/ml、約300pg/ml、約400pg/ml、約500pg/ml、約600pg/ml、約700pg/ml、約800pg/ml、約900pg/ml、または約1000pg/mlであり得る。好ましくは、TGFβについての閾値は、約500pg/mlである。VEGFに関して、閾値は、約80pg/ml、約100pg/ml、約120pg/ml、約140pg/ml、約160pg/ml、約180pg/ml、または約200pg/mlであり得、VEGFについての閾値は、好ましくは、約100pg/mlである。HGFについて、閾値は、約80pg/ml、約100pg/ml、約120pg/ml、約140pg/ml、約160pg/ml、約180pg/ml、または約200pg/mlであり得る。好ましくは、HGFについての閾値は、約100pg/mlである。
本発明の1つの例において、以下の閾値レベル（閾値）が使用される：
－ アンジオポエチン1（Ang-1）について、約400pg/mlの閾値、
－ トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、約400pg/mlの閾値、
－ 血管内皮増殖因子（VEGF）について、約80pg/mlの閾値、
－ 肝細胞増殖因子（HGF）について、約80pg/mlの閾値。
本発明の別の例において、以下の閾値レベル（閾値）が使用される：
－ アンジオポエチン1（Ang-1）について、約500pg/mlの閾値、
－ トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、約500pg/mlの閾値、
－ 血管内皮増殖因子（VEGF）について、約100pg/mlの閾値、
－ 肝細胞増殖因子（HGF）について、約100pg/mlの閾値。
これらの2つの例において、例えば、MSC集団を、適当な創傷治癒特性を有すると見なすためには、または組織を、薬学的に適当なMSC集団を作製するための適当な出発材料であると見なすためには、4種全てのタンパク質の分泌レベルが、分泌レベル/濃度のそれぞれの閾値（実施例2を参照すること）と等しいまたはそれを超えている。ここで、本発明において決定された濃度、従って、閾値レベルは、好ましくは、絶対濃度であることに注意すること。
任意の薬学的に適当なMSC集団が、本発明において使用され得る。従って、MSC集団は、MSCを含有することが公知の任意の哺乳動物組織またはコンパートメント/身体部分に由来し得る。例示的な例において、MSC集団は、臍帯のMSC集団、胎盤MSC集団、臍帯胎盤付着部のMSC集団、臍帯血のMSC集団、骨髄のMSC、または脂肪組織由来のMSC集団であり得る。臍帯のMSC集団は、MSCを含有する臍帯組織の任意のコンパートメントに由来してよく、例えば、羊膜、血管周囲MSC集団、ワルトン膠様質のMSC集団、臍帯の羊膜のMSC集団であってもよいし、臍帯の混合MSC集団、即ち、これらのコンパートメントのうちの2種以上の幹細胞を含むMSCの集団であってもよい。これらのコンパートメントのMSC、およびそれらの単離は、当業者に公知であり、例えば、Subramanian et al"Comparative Characterization of Cells from the Various Compartments of the Human Umbilical Cord Shows that the Wharton's Jelly Compartment Provides the Best Source of Clinically Utilizable Mesenchymal Stem Cells",PLoS ONE 10(6):e0127992,2015、およびその中で引用された参照、Van Pham et al."Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications",Cell Tissue Bank(2016)17:289-302,2016に記載されている。臍帯の混合MSC集団は、例えば、臍帯組織から動脈および静脈を除去し、残りの組織およびワルトン膠様質を細断し、本発明の培養培地において（組織外植片によって）臍帯組織を培養することによって得ることができる。臍帯の混合MSC集団は、Schugar et al."High harvest yield,high expansion,and phenotype stability of CD146 mesenchycal stromal cells from whole primitive human umbilical cord tissue.Journal of biomedicine & biotechnology.2009:2009:789526"によって記載されたような条件（10％ウシ胎仔血清、10％ウマ血清、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む血清補足DMEMにおける培養）で、完全な臍血管を有する臍帯組織全体を、組織外植片として培養することによっても得ることができる。これに関して、臍帯胎盤付着部のMSC集団は、Beeravolu et al."Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta."J Vis Exp.2017;(122):55224によって記載されたように単離され得ることに注意すること。本発明の例において、MSC集団は、臍帯、または臍帯の羊膜に由来する（実施例1～4を参照すること）。臍帯の羊膜のMSC集団は、高度に定義されており、均一である。従って、本発明の1つの態様において、国際出願WO 2018/067071に記載される間葉系幹細胞集団が使用される。従って、方法の典型的な例において、MSCの少なくとも約90％以上、約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上が、以下のマーカーを発現する：CD73（SEQ ID NO.5）、CD90（SEQ ID NO.6）、およびCD105（SEQ ID NO.7）。さらに、これらの例において、MSCの少なくとも約90％以上、約91％以上、MSCの約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上が、以下のマーカーの発現を欠き得る：CD34（SEQ ID NO.8）、CD45（SEQ ID NO.9）、およびHLA-DR（SEQ ID NO.10）。具体的な例において、MSC集団の約97％以上、約98％以上、または約99％以上が、CD73、CD90、およびCD105を発現する一方で、CD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠く。好ましい例において、MSC集団の少なくとも約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上の細胞が、CD73、CD90、およびCD105の各々を発現する一方で、MSCの少なくとも約90％以上、約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上が、CD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠き得る。具体的な例において、MSC集団の約97％以上、約98％以上、または約99％以上が、CD73、CD90、およびCD105を発現する一方で、CD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠く。
本発明において、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFのレベルは、典型的には、MSC集団が保管されるか、輸送されるか、または培養される培地の上清において決定される。MSC集団は、長期間または短期間、保管され得る。長期保存培地の例には、約-80℃での保存を可能にするグリセロールおよびトレハロース、または約-195℃での保存を可能にする凍結保護物質、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。短期保存は、投与場所（例えば、診療所もしくは病院）への輸送、および/またはMSC集団が対象へ投与されるまでの期間の保存を含み得る。賦形剤HypoThermosol（登録商標）は、短期保存培地の例示的な例である。この保存培地は、輸送のために適当であり、約2～8℃でのMSC保存を可能にする。輸送のために適当な培地の別の例は、Plasmalyteである。MSC培養のために適当な培地の例には、市販の培地、例えば、CTS StemPro MSC SFM、MesenPRO RS培地、StemPro MSC SFM XenoFreeが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。本発明の1つの例において、MSC細胞培養培地は、国際出願WO 2018/067071に記載されている培養培地PTT6であり得る。従って、国際出願WO 2018/067071の開示によると、MSC細胞培養培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、ハムF12培地（F12）、無血清基本培地、例えばM171、およびウシ胎仔血清（FBS）を含み得る。従って、1つの例において、培地は、約55～65％(v/v)の最終濃度のDMEM、約5～15％(v/v)の最終濃度のF12、約15～30％(v/v)の最終濃度のM171、および約1～8％(v/v)の最終濃度のFBSを含み得る。「％(v/v)」の値は、本明細書において使用されるように、培地の最終体積に対する個々の成分の体積をさす。これは、例えば、DMEMが約55～65％(v/v)の最終濃度で培地中に存在する場合、1リットルの培地が、約550～650mlのDMEMを含有することを意味する。他の例において、培地は、約57.5～62.5％(v/v)の最終濃度のDMEM、約7.5～12.5％(v/v)の最終濃度のF12、約17.5～25.0％(v/v)の最終濃度のM171、および約1.75～3.5％(v/v)の最終濃度のFBSを含み得る。さらなる例において、培地は、約61.8％(v/v)の最終濃度のDMEM、約11.8％(v/v)の最終濃度のF12、約23.6％(v/v)の最終濃度のM171、および約2.5％(v/v)の最終濃度のFBSを含み得る。前記の成分に加えて、培地は、MSC培養のために有利である補助剤を含み得る。本発明において、MSC培養培地は、例えば、上皮増殖因子（EGF）を含み得る。存在する場合、EGFは、約1ng/ml～約20ng/mlの最終濃度で培養培地中に存在し得る。これらの例のいくつかにおいて、培養培地は、約10ng/mlの最終濃度のEGFを含み得る。本発明の培養培地は、インスリンも含み得る。存在する場合、インスリンは、約1μg/ml～10μg/mlの最終濃度で存在し得る。これらの例のいくつかにおいて、培養培地は、約5μg/mlの最終濃度のインスリンを含み得る。培養培地は、以下の補助剤のうちの少なくとも1種をさらに含み得る：アデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）。そのような例において、培養培地は、アデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）のうちの3種全てを含み得る。これらの例において、培養培地は、約0.05～約0.1μg/mlアデニンの、最終濃度のアデニン、約1～約10μg/mlヒドロコルチゾンの、最終濃度のヒドロコルチゾン、および/または約0.5～約5ng/mlの、最終濃度の3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）を含み得る。これに関して、本明細書に記載された培地においてMSC集団を培養することによって、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の発現および/または分泌が増加し得ることに注意すること。
本発明の方法において、典型的には、適当な期間の後に、MSCを含有する培地においてAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの濃度を決定するため、培地を遠心分離に供することが必要とされ得る。これに関して、適当な期間は、MSC集団が検出可能な量のタンパク質を分泌するために適当な任意のインキュベーション期間（細胞集団が、例えば、保存培地もしくは輸送培地、例えば、Hypothermosolにおいて保存されるかもしくは輸送される場合）または培養期間（細胞集団が培養培地において培養される場合）であり得る。例示的な例において、適当な期間は、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、約46時間、約48時間、約50時間、または約54時間のインキュベーション期間または培養期間であり得る。遠心分離後、遠心分離された培地の上清は、分泌されたタンパク質のレベル/濃度を決定するため、イムノアッセイに供され得る。培地中に分泌された1種または複数種のタンパク質を検出するために適当な任意のイムノアッセイが、本発明において適用され得る。培地中のタンパク質を検出するための適当なイムノアッセイの例示的な例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）またはシングルプレックスアッセイである。（例えば、商品名Q-PlexでBioVendor（Brno,Czech Republic）より市販されている、またはR&D Systems Inc（Minneapolis,USA）より市販されている）シングルプレックスアッセイは、96穴ELISAプレートの各ウェルの底に、明確な配置で、キャプチャー抗体からなる2個のスポットを置くことによって実施され得る（アッセイスポットに加えて、第2のスポットは、適切なアッセイ手順を保証するための陽性対照スポットである）。培地中の複数のタンパク質を検出する適当なアッセイの例は、マルチプレックスアッセイである。そのようなマルチプレックスアッセイにおいては、複数の分析物が、分析物を空間的に分離する固体表面、例えば、ELISAプレートに固定化され得る。あるいは、マルチプレックスアッセイは、ビーズ上または粒子上に固定化された分析物を使用して実施されてもよい。そのようなケースにおいて、各分析物についてのアッセイは、異なるビーズ/粒子を利用する。例示的な例において、ビーズベースのマルチプレックスアッセイが、培地中に分泌されたAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFを検出するために使用され得る（実施例1および実施例4を参照すること）。複雑な試料、例えば、細胞培養培地において複数の標的分析物を同時に検出し、定量化するためのそのようなマルチプレックスアッセイ系は、例えば、Luminex（登録商標）アッセイおよびLuminex（登録商標）High Performanceアッセイとして、R&D Systems Inc（Minneapolis,USA）より市販されている。
本発明は、MSC集団の創傷治癒効力を査定するための、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用にも関する。さらに、本発明は、cGMP条件下で幹細胞集団を作製するためのMSC集団を選択するための、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用に関する。従って、本発明は、後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するためのMSC集団を選択するための、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用に関する。本発明は、マスター細胞バンクを生成するためのMSC集団を選択するための、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用にさらに関する。
さらに、本発明は、薬学的に使用するためのMSC集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定するためのMSC集団を選択するための、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用に関する。本発明において、そのような組織は、MSCを含有することが公知の任意の哺乳動物組織またはコンパートメント/身体部分であり得る。そのような組織の例には、ほんの少数の公知のMSC起源組織を挙げると、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、臍帯胎盤付着部の組織、臍帯組織、例えば、ワルトン膠様質、臍帯の羊膜が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一例において、組織は、臍帯または臍帯の羊膜であり、それらから作製されたMSC集団は、臍帯の羊膜のMSC集団であり得る。
例えば、特定のドナーに由来する組織が、薬学的に使用するためのMSC集団を作製するための出発材料として適当であるか否かを決定するため、組織を、例えば、組織外植片として直接培養することができる。そのような組織外植片について、それぞれの組織（例えば、ワルトン膠様質、胎盤羊膜、または臍帯の羊膜）の試料を、組織培養皿に置き、本明細書に記載される適当な培養/成長培地において培養することができる（これに関しては、米国特許第9,085,755号または第9,737,568号も参照すること）。次いで、適当な培養期間の後に、組織からの細胞アウトグロース（組織から培養皿の表面へのMSCの移動）が起こり、次いで、培養培地を、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌について分析することができる。あるいは、まず、公知の単離方法を使用して、選択された組織からMSC集団を単離することができ、次いで、単離されたMSC集団を、適当な培地において培養し、Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌についてチェックすることができる。組織とは無関係に、本明細書に記載される方法のためのAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの使用は、MSC集団によって、または組織試料によって、または組織試料から単離された細胞によって培地中に分泌された前記タンパク質のうちの少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、または4種全てを培地において決定する工程を含み得る。
本発明は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定する方法にさらに関する。この方法も、MSC集団によって細胞培養培地中に分泌されたAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを決定する工程を含む。従って、本発明は、間葉系幹細胞の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定するための、少なくとも1種のタンパク質の使用にも関する。この使用は、間葉系幹細胞集団によって細胞培養培地中に分泌されたAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFからなる群より選択される少なくとも2種、少なくとも3種、または4種全てのタンパク質のレベルを細胞培養培地において決定する工程を含み得る。
以下の非限定的な実験例によって、本発明をさらに例示する。
本明細書に開示されたポリペプチドの配列は、表1に示される。
Figure 0007650085000001
Figure 0007650085000002
Figure 0007650085000003
実験実施例
実施例1：MSCを含有する適当な臍帯の同定、創傷治癒のために適当な薬学的組成物を生成するための、臍帯から得られたMSC集団の査定および選択
MSCは、University of Colorado Hospitalにおいて収集された新鮮な臍帯組織に由来した。
ステージ1：組織バンク
最初の工程において、一般的には、施設内倫理審査委員会（Institutional Review Board）（IRB）同意が組織ドナーから得られた後に、臍帯を収集する。新鮮な収集された臍帯を1～2mm3の切片に切断し、4～5セグメントを含有するバイアルにおいて速度制御型凍結を行い、-196℃の液体窒素（LN2）気相において隔離して保存する（図1を参照すること）。出産7日以内に収集された母体血試料を、感染性疾患についてスクリーニングし、組織を、微生物混入について試験する。ステージ1についての中間合格基準は、CMVを除く全ての感染性疾患についての試験が陰性であること、無菌試験が陰性であること、および母親の質問票が受理可能であることを含む。臍帯には出産中に膣内細菌叢が自然に混入するが、抗生物質使用中の収集は、その一部を無菌にする。100個までの臍帯試料を、そのような組織バンクに収集することができる。無菌組織を、ステージ2において使用する。
ステージ2：発達培養
発達培養は、純粋なMSC株を作製するために使用される臍組織からのアウトグロースである。10個の組織セグメントを6穴プレートに個々に置き、0代目（P0）細胞を生成するため、およそ10～20日間増殖させる。P0細胞を175cm2フラスコに播種し、1代目（P1）細胞を得るため、培養する。P1細胞を、1～3×106細胞/バイアルで、CryoStor 5において凍結させるか、または培養のため、播種する。1代目細胞を2～3×105細胞/175cm2フラスコに播種する。増殖中、細胞の形態を記録する。2代目（P2）由来の細胞を、MSCマーカーについて、フローサイトメトリーによって査定し、上清をサイトカイン産生について査定する。より詳細には、P2細胞を、以下の分析物、Ang-1、VEGF、HGFについてのマルチプレックス分析（R&D Systems/Bio techneカタログ番号LXSAHM）に供し、TGFβについては、シングルプレックスアッセイを実施した。アッセイは、以下のように実施された。
マルチプレックスアッセイ：
（i）総体積を1000μlにするために適切な体積の完全PTT6培地を既に含有している1個の微量遠心管に、100μlの各標準物質を合わせることによって、標準物質を調製した。標準物質S1は、1個のバイアルに合わせられた全てのマルチプレックス標準物質を含有した。S1の3倍段階希釈を行うため、S2～S6とラベリングされた5本の1.5mlポリプロピレンチューブの各々に、200μlの完全PTT6培地をピペットで移した。次いで、S1からS2へ100μlを移した。ボルテックス後、S2からS3へ100μlを移した。その手順をS6まで続けた。PTT6完全培地をブランクとして用いた。
（ii）再懸濁させるためにバイアルを静かにボルテックスすることによって、ビーズを調製した。バイアルを反転させないように注意することが重要であった。プレート全体を使用する場合には、500μlのビーズを5.0mlの希釈液RD2-1と合わせた。より少数のウェルを使用する場合には、相応じて体積を調整した。バイアルまたはウェルは遮光されていた。
（iii）必要な場合：試料調製。試料濃度が最高標準値（S1）を超えない限り、全ての試料を未希釈で使用した。超える場合には、適切に希釈された試料によってアッセイを繰り返した。希釈には、PTT6を使用した。全ての試料をトリプリケートで測定した。
（iv）ビーズを静かにボルテックスした後、マルチチャンネルピペットおよびリザーバーを使用して、50μlを各ウェルに添加した。
（v）1ウェル当たり50μlの標準物質または試料を添加した。次いで、プレートをプレートシーラーで覆い、800rpmのオービタルシェーカーにおいて、室温（RT）で、2時間、遮光しながらインキュベートした。
（vi）試料インキュベーション中に、再懸濁させるためにバイアルを静かにボルテックスすることによって、ビオチン抗体カクテルを調製した。バイアルを反転させないように注意することが重要であった。次いで、500μlのビオチン抗体カクテルを5.0mlの希釈液RD2-1と合わせた。溶液を徹底的に混合した。
（vii）（バイアルを反転させないように注意して）再懸濁させるためにバイアルを静かにボルテックスすることによって、ストレプトアビジンフィコエリトリン（PE）を調製した。次いで、200μlのストレプトアビジン-PE濃縮物を、5.35mlの洗浄緩衝液と合わせた。溶液を徹底的に混合し、遮光した。
（Viii）プレートを以下のように洗浄した：プレートを磁石に付着させ、少なくとも1分間放置した。プレートを磁石に付着させたまま、シンクにプレートをデカントするため、プレートを素早く反転させた後、比較的力強く下方に動かし（1～2回）、ウェルを空にした。反転による液体の完全な除去が必須であったが、プレートの吸い取りはしなかった。磁石を離し、マルチチャンネルピペットを使用して、100μlの洗浄緩衝液をウェルに充填した。その後、磁石を再び付着させ、1分間放置した後、前記と同様にデカントを実施した。この洗浄を全部で3回繰り返した。
（ix）50μlの希釈されたビオチン抗体を、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに添加した。プレートを覆い、800rpmに設定されたシェーカーにおいて、RTで、1時間、インキュベートした。その後、プレートを前記と同様に3回洗浄した。
（x）50μlの希釈されたストレプトアビジン-PEを各ウェルに添加した。プレートを覆い、前記と同様に、シェーカーにおいて、RTで、30分間インキュベートした。その後、プレートを前記と同様に3回洗浄した。
（xi）100μlの洗浄緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを、前記と同様に、シェーカーにおいて、RTで、2分間インキュベートした。次いで、ウェルの内容物を、120μlに設定されたマルチチャンネルピペットを使用して、Costar 6509 96穴4プレートに直ちに移した。次いで、プレートをLuminex 3Dスキャナーのフィッティングモールドに置いた。
（xii）プレートを読み取り、Luminex 3DおよびXponentソフトウェアを使用して分析した。
TGFβ1シングルプレックス:
（i）希釈を行うため、1.5mlポリプロピレンチューブを使用することによって、標準物質を調製した。この目的のため、500μlの標準物質S1をS1チューブにピペットで移した。チューブS2～S6に、200μlの完全PTT6培地を添加した。S1からS7まで連続的に100μlを移し、確実に徹底的に混合することによって、標準物質を1:3希釈した。
（ii）再懸濁させるためにバイアルを静かにボルテックスすることによって、ビーズを調製した。バイアルを反転させないよう注意することが重要であった。プレート全体を使用する場合には、50μlのビーズを5.0mlの微粒子希釈液RD2-1と合わせた。より少数のウェルを使用する場合には、相応じて体積を調整した。バイアルまたはウェルは遮光されていた。
（iii）TGFβ1を免疫反応性にするため（標準物質については行わず、試料のみ）、30μlの活性化試薬を150μlの上清に添加した。溶液を徹底的に混合し、RTで10分間インキュベートした。試料濃度が最高標準値（S1）を超えない限り、全ての試料を未希釈で使用した。超える場合には、適切に希釈された試料によってアッセイを繰り返した。希釈には、PTT6を使用した。全ての試料をトリプリケートで測定した。
（iv）ビーズを静かにボルテックスした後、マルチチャンネルピペットおよびリザーバーを使用して、50μlを各ウェルに添加した。
（v）1ウェル当たり50μlの標準物質または試料を添加した。次いで、プレートをプレートシーラーで覆い、800rpmのオービタルシェーカーにおいて、RTで、2時間、遮光しながらインキュベートした。
（vi）試料インキュベーション中に、再懸濁させるためにバイアルを静かにボルテックスすることによって、ビオチン抗体カクテルを調製した。バイアルを反転させないように注意することが重要であった。次いで、50μlのビオチン抗体濃縮物を、5.0mlのビオチン抗体希釈液と合わせた。溶液を徹底的に混合した。
（vii）（バイアルを反転させないように注意して）再懸濁させるためにバイアルを静かにボルテックスすることによって、ストレプトアビジンフィコエリトリン（PE）を調製した。次いで、55μlの100×ストレプトアビジン-PE濃縮物を、5.35mlの洗浄緩衝液と合わせた。溶液を徹底的に混合し、遮光した。
（Viii）プレートを以下のように洗浄した：プレートを磁石に付着させ、少なくとも1分間放置した。プレートを磁石に付着させたまま、シンクにプレートをデカントするため、プレートを素早く反転させた後、比較的力強く下方に動かし（1～2回）、ウェルを空にした。反転による液体の完全な除去が必須であったが、プレートの吸い取りはしなかった。磁石を離し、マルチチャンネルピペットを使用して、100μlの洗浄緩衝液をウェルに充填した。その後、磁石を再び付着させ、1分間放置した後、前記と同様にデカントを実施した。この洗浄を全部で3回繰り返した。
（ix）50μlの希釈されたビオチン抗体を、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに添加した。プレートを覆い、800rpmに設定されたシェーカーにおいて、RTで、1時間、インキュベートした。その後、プレートを前記と同様に3回洗浄した。
（x）50μlの希釈されたストレプトアビジン-PEを各ウェルに添加した。プレートを覆い、前記と同様に、シェーカーにおいて、RTで、30分間インキュベートした。その後、プレートを前記と同様に3回洗浄した。
（xi）100μlの洗浄緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを、前記と同様に、シェーカーにおいて、RTで、2分間インキュベートした。次いで、ウェルの内容物を、120μlに設定されたマルチチャンネルピペットを使用して、Costar 6509 96穴4プレートに直ちに移した。次いで、プレートをLuminex 3Dスキャナーのフィッティングモールドに置いた。
（xii）プレートを読み取り、Luminex 3DおよびXponentソフトウェアを使用して分析した。
ステージ3：マスター細胞バンク
次いで、ステージ2中間合格基準を満たす3つの細胞株を、20～40×106生細胞で、Terumo Quantumバイオリアクターに播種し、およそ7～14日間増殖させる。Quantum後、無菌性、内毒素、マイコプラズマ、ヒト病原体ウイルス、および外来性ウイルスの試験について、細胞を試験する。細胞を9～10×106細胞/バイアル（1バッチ当たり50～70バイアル）で凍結保存する。MSCを、フラスコ中で、Terumo Quantumにおいて、1000mlの場合は以下のように配合された培養培地PTT6（500mlのPTT6基本培地、236mlのM171、236mlのDMEM F12、25mlのウシ胎仔血清、0.1mlの0.1mg/ml上皮増殖因子［最終濃度 10ng/ml］）、0.35mlのインスリン（最終濃度 5μg/ml）において増殖させ、5％CO2で37℃でインキュベートする。
ステージ4：治療用培養物
Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFについての試験が陽性であった1×、3×、および5×106個のMSCを、Hypothermosol（登録商標）中でビン詰めし、薬学的に投与する前には、2～8℃で保存した。
実施例2：適当なドナー臍帯を同定するためのタンパク質分泌レベル分析
分析のため、異なるドナーから10個の臍帯を収集した。臍帯の羊膜に由来する10個の個々のMSC集団を作製するため、これらの臍帯を使用した。
実験の目標は、個々のMSC集団の分泌プロファイルの可変性についての結論を退け、Ang-1、VEGF、HGF、およびTGFβ1の十分な分泌を有するMSC集団を同定するため、Ang-1、VEGF、HGF、およびTGFβ1の分泌レベルを決定することであった。
従って、個々のMSC集団を本発明に従って培養し、ステージ2後に、Ang-1、VEGF、HGF、およびTGFβ（ここでは、TGFβ1）の分泌レベルを、実施例1に記載されたように、各MSC集団について決定した。分泌レベル分析の結果は、タンパク質に特異的な閾値（Ang-1およびTGFβについて、それぞれ500pg/ml、VEGFおよびHGFについて、それぞれ100pg/ml）が水平の黒線によって示されている、図2に示される。
結果から分かるように、TGFβ1の分泌レベルは、10個の個々のMSC集団の全てにおいて、閾値の2倍より高い。従って、全ての個々のMSC集団について、TGFβ1についての500pg/mlという閾値を超えていた。HGFのプロットされた分泌レベルは、10個の試料のうちの5個、即ち、約600pg/mlの分泌レベルを示すMSC集団8049365、約300pg/mlの分泌レベルを示すMSC集団8049369、約1450pg/mlの分泌レベルを示すMSC集団8049372、約380pg/mlの分泌レベルを示すMSC集団8049373、および約190pg/mlの分泌レベルを示すMSC集団8049384が、100pg/mlという閾値を超えていることを示している。Ang-1のプロットされた分泌レベルは、個々のMSC集団が、全て、500pg/mlという閾値を超えていたことを示している。VEGFの分泌レベルは、8049358、8049359、および8049370を除く全ての試料について、100pg/mlという閾値を超えていたことを示している。これに関して、8049359の分泌レベルは、わずか約50pg/mlであり、8049358および8049359のレベルは、ゼロに近かった。
結果は、異なる個々のMSC集団のタンパク質分泌レベルが変動することを示しており、MSCが個々の分泌プロファイルを有することが確認された。Ang-1、VEGF、HGF、およびTGFβ1の十分な分泌を有するMSC集団を同定するため、これらのタンパク質の分泌レベルを分析した。
これに関して、MSCがAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの十分な分泌を示すのは、これらのタンパク質のレベルが、それぞれの閾値を超える場合である。従って、（各々、異なるドナー臍帯から得られた）MSC集団、8049365、8049369、8049372、8049373、および8049384のみが、4種の選択されたタンパク質の各々について与えられた閾値を超えるMSC集団であるため、これらは、十分なAng-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの分泌を示す。後の実験（マスター細胞バンクの準備、および薬学的目的のための細胞の作製）のため、MSC集団8049372を本明細書において選択した。
実施例3：分泌レベル安定性の分析
実施例2においてタンパク質Ang-1、TGFβ、VEGF、およびHGFの十分な分泌を示したMSC集団8049372を、タンパク質分泌レベルの安定性を分析するために使用した。従って、細胞が4回継代されるまで、MSC集団をさらに培養した。次いで、ステージ4後のMSC集団の2個の試料（ウェル1のMSCおよびウェル2のMSC）を、実施例1に記載されたように、Ang-1、VEGF、HGF、およびTGFβ（ここでは、TGFβ1）の分泌レベルに関して分析した。次いで、この実験（ステージ4後）において決定されたMSC集団8049372のタンパク質分泌レベルを、実施例2（ステージ2後）において決定されたMSC集団8049372の分泌レベルと比較する。このようにして、異なる時点における分泌レベルの変化を明らかにすることができる。それにより、タンパク質分泌レベルの安定性について、従って、経時的にタンパク質分泌が十分であるかについて、結論を得ることができる。結果は図3に示される。
ステージ2後、MSC集団8049372は、TGFβ1について、約2200pg/mlの分泌レベルを示した。細胞をさらに2回継代した後、ステージ4後のMSC集団8049372は、平均して、約2345pg/ml TGFβ1を示す。従って、MSC集団8049372の分泌レベルは、細胞をさらに2回継代した後、約7％増加した。HGFの分泌レベルは、細胞をさらに2回継代した後、ステージ2後の約1450pg/mlから、ステージ4後の平均の約959pg/mlまで、約33％減少した。ステージ4後のMSC集団8049372は、平均して、約1827pg/ml Ang-1を示し、これは、ステージ2後の2000pg/ml Ang-1に対する約9％の減少である。VEGFの分泌レベルは、細胞をさらに2回継代した後、ステージ2後の約150pg/mlから、ステージ4後の平均の約215pg/mlまで、約43％増加した。
結果は、タンパク質Ang-1、VEGF、HGF、およびTGFβ（ここでは、TGFβ1）の分泌レベルが、細胞をさらに2回継代した後にも変動することを示している。しかしながら、本明細書において選択されたそれぞれの閾値は、細胞をさらに2回継代した後にも、分析されたタンパク質の全てについて依然として超えている。従って、この実験の結果は、MSC集団8049372が、相対的なタンパク質分泌安定性を維持し、従って、創傷治癒効力を維持していたことを示している。従って、この結果は、MSC集団の創傷治癒効力が、ある程度の期間、安定的であり得ることを示している。この結果に基づき、MSC集団8049372は、マスター細胞バンクを生成するための、または後に対象へ投与するための薬学的組成物を作製するための、出発材料として、適当な候補である。
実施例4：間葉系幹細胞の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地の同定
この実験のため、臍帯の羊膜の様々な単離されたMSC集団を、国際出願WO 2018/067071に記載されたように、PTT4、PTT6、またはDMEM/F12において培養し、その後、比較のため、創傷治癒マーカータンパク質の分泌に関して分析した。
単離されたMSCの培養のための培養プロトコル
・5百万個のMSCを100mm組織培養皿に蒔き、DMEM/F12/10％FCS中で24時間おいた。
・培地を捨て、PTT4、PTT6 / DMEM/F12を、培養物に添加し24時間おいた。
・培地を捨て、細胞をPBSで洗浄した。
・10ml DMEMを、培養物に添加し24時間おいた。
・培地を捨て、5ml DMEMを培養物に添加した。
・24時間の培養後、条件培地を採集し、細胞片を除去するために遠心分離し、上清を、-80℃での保存、およびその後のサイトカインアッセイによるマーカータンパク質分泌の分析のため、チューブに分配した。
PTT4培地、PTT6培地、およびDMEM/F12培地の上清における分泌レベル分析
分泌レベル分析をMSC上清において実施した。測定および分析は、Luminex 200およびXponentソフトウェアを使用して実施された。
胎盤の上清の試料を除き、各試料をトリプリケートで試験した。この実験の目標は、PTT4またはPTT6のいずれかにおいて培養されたMSCのサイトカインプロファイルを生成し、異なる起源組織に由来するMSC（臍帯最外層、ワルトン膠様質、胎盤のMSC）のプロファイルを比較することであった。サイトカイン測定は下記のように実施された。プロファイルは、どの培地で成長したどの幹細胞集団が、関心対象のサイトカインをより多く分泌するか、即ち、どの培地が、MSCの創傷治癒特性を誘導するまたは促進するために適当であるかを明らかにする。
マルチプレックス分析
マルチプレックスに関する情報：
R&D Systems/Bio-techneカタログ番号LXSAHM。このキットは、ロット番号L123680、使用期限08/28/18であり、以下の分析対象に関する：
・Ang-1、アンジオポエチン
・VEGF、血管内皮増殖因子
・HGF、肝細胞増殖因子
TGFβ1シングルプレックスに関する情報：R&D Systems/Bio-techne：
・ベースキット、カタログ番号LTGM00、ロット番号P156217、受領02/27/18、使用期限08/30/18
・TGFβ1成分、カタログ番号LTGM100、ロット番号P161760、受領02/27/18、使用期限11/27/19
マルチプレックスに関する情報:
R&D Systems/Bio-techneカタログ番号LXSAHM。このキットは、ロット番号L123999、使用期限09/25/18であり、以下の分析対象に関する：
・Ang-1、アンジオポエチン
・VEGF、血管内皮増殖因子
・HGF、肝細胞増殖因子
データ入力
生データ出力は、PDFおよびExcelフォーマットでなされる。Excelフォーマットでのデータが、データを処理するために使用される。
手順
MSC上清におけるタンパク質検出は、詳細なプロトコル情報に従って実施された。この実験の一部分として、プロトコルは、マルチプレックスキットのStd.8を使用しないという修正を１つを有する。Std.8を中止する理由は、R&D Systemsのプロトコル自体が標準物質1～6のみを使用するためである。さらに、Std.8は、マルチプレックスを構成する6種の分析物のうちの2種についてしかバリデートされていなかった：HGF。HGFの場合、その分析物は、標準曲線の中央領域に入る。標準物質は成長培地を使用して再構成されるため、PTT4およびPTT6の両方によって標準曲線を構築した。PTT4またはPTT6のいずれかにおいて成長した試験試料を、それぞれの標準曲線から外挿した。結果は、Luminexソフトウェアによって生成された、分析物に特異的な標準曲線から、同ソフトウェアによって外挿された：分析アルゴリズムは、重み付けのために1/y2を使用する重み付き分析によるLogistic 5P Weightedに設定された。
試料
1. （MSCに曝されない）DMEM/F12培地およびPTT6培地およびPTT4培地
2. 試験されるMSCの上清
3. 任意選択：異なるドナー；CR001A、C、D、およびGに由来する上清
Ang-1についての結果は、図4Aに示され、臍帯の羊膜のMSCが、DMEM/F12またはPTT4において成長した時より、PTT6において成長した時に、より多くのAng-1を産生することを示している。VEGFについての結果は、図4Bに示され、臍帯の羊膜のMSCが、DMEM/F12またはPTT4において成長した時より、PTT6において成長した時に、より多くのVEGFを産生することを示している。HGFについての結果は、図4Cに示され、臍帯の羊膜のMSCが、DMEM/F12またはPTT4において成長した時より、PTT6において成長した時に、より多くのHGFを産生することを示している。最後に、TGFβ1についての結果は、図4Dに示され、臍帯の羊膜のMSCが、DMEM/F12またはPTT4において成長した時より、PTT6において成長した時に、より多くのTGFβ1を産生することを示している。
前記の実験から、以下のことを結論付けることができる。MSCがPTT6培地において培養された時に、MSC集団によるAng-1、TGFβ1、VEGF、およびHGFの分泌が、PTT4または市販の培養培地、例えば、DMEM/F12における分泌レベルと比較して、有意に増加する。PTT6培地は、MSC集団における（本明細書に記述されたように、創傷治癒における関与が公知である）Ang-1、TGFβ1、VEGF、およびHGFの全ての分泌を促進することによって、MSC集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善する最も高い能力を有する。従って、Ang-1、TGFβ1、VEGF、およびHGFの分泌レベルの決定は、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定するために使用され得る。
本発明の範囲および本旨を逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して、様々な置換および修飾がなされ得ることが、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書において言及された特許および刊行物は、全て、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。個々の刊行物が各々特別に個々に参照により組み入れられると示されたのと同じ程度に、全ての特許および刊行物が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されない任意の因子、限定の非存在下で、適当に実施され得る。従って、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」等の用語は、拡張的に、非限定的に解釈されるべきである。さらに、本明細書において利用される用語および表現は、限定のためではなく、説明のために使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され、記載された特徴、またはそれらの一部分の等価物を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で、様々な修飾が可能であることが認識される。従って、好ましい態様および任意選択の特徴によって本発明を具体的に開示したが、本明細書において開示された具体化された本発明の修飾および変動が、当業者に想到され得ること、そのような修飾および変動は、本発明の範囲内にあると見なされることが、理解されるべきである。本発明は、本明細書において、広範に、包括的に、記載された。包括的な開示の範囲内に含まれる、より狭い種および亜属も、各々、本発明の一部を形成する。これは、削除される材料が本明細書に具体的に記載されるか否かに関わらず、属から何らかの主題を除去する条件または負の限定を含む、本発明の包括的な説明を含む。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群によって記載される場合、それにより、マーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーの亜群によっても、本発明が記載されることを、当業者は認識するであろう。本発明のさらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明は、以下の項をさらに特徴とする。
1. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定する方法。
2. 組織または組織から単離された細胞の試料によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、薬学的に使用するための間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定する方法。
3. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、cGMP条件下で幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択する方法。
4. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択する方法。
5. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、マスター細胞バンクを生成するための間葉系幹細胞集団を選択する方法。
6. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも2種、少なくとも3種、または4種全てのタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、項1～5のいずれかの方法。
7. 閾値と等しいまたは閾値を超える分泌レベルが、
（i）間葉系幹細胞集団の創傷治癒の効力；または
（ii）間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織もしくは単離された細胞
を示す、項1～6のいずれかの方法。
8. アンジオポエチン1（Ang-1）についての閾値が約400pg/mlまたは約500pg/mlである、項7の方法。
9. トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）についての閾値が約400pg/mlまたは約500pg/mlである、項7または8の方法。
10. 血管内皮増殖因子（VEGF）についての閾値が約80mg/mlまたは約100pg/mlである、項7～9のいずれかの方法。
11. 肝細胞増殖因子（HGF）についての閾値が約80pg/mlまたは約100pg/mlである、項7～10のいずれかの方法。
12. 4種全てのタンパク質の分泌レベルがそれぞれの閾値と等しいかまたはそれぞれの閾値を超えており、閾値が
－ アンジオポエチン1（Ang-1）について、約400pg/mlの閾値、
－ トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、約400pg/mlの閾値、
－ 血管内皮増殖因子（VEGF）について、約80pg/mlの閾値、
－ 肝細胞増殖因子（HGF）について、約80pg/mlの閾値
である、項8～11のいずれかの方法。
13. 4種全てのタンパク質の分泌レベルがそれぞれの閾値と等しいかまたはそれぞれの閾値を超えており、閾値が
－ アンジオポエチン1（Ang-1）について、約500pg/mlの閾値、
－ トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、約500pg/mlの閾値、
－ 血管内皮増殖因子（VEGF）について、約100pg/mlの閾値、
－ 肝細胞増殖因子（HGF）について、約100pg/mlの閾値
である、項8～11のいずれかの方法。
14. 間葉系幹細胞集団が、臍帯の間葉系幹細胞集団、胎盤間葉系幹細胞集団、臍帯胎盤付着部の間葉系幹細胞集団、臍帯血の間葉系幹細胞集団、骨髄の間葉系幹細胞集団、および脂肪組織由来の間葉系幹細胞集団からなる群より選択される、項1～13のいずれかの方法。
15. 臍帯の間葉系幹細胞集団が、羊膜（AM）の間葉系幹細胞集団、血管周囲（PV）間葉系幹細胞集団、ワルトン膠様質（WJ）の間葉系幹細胞集団、臍帯の羊膜の間葉系幹細胞集団、および臍帯の混合間葉系幹細胞集団（MC）からなる群より選択される、項14の方法。
16. 組織が臍帯または臍帯の羊膜であり、間葉系幹細胞集団が臍帯の羊膜の幹細胞集団である、項2の方法。
17. 臍帯の羊膜の間葉系幹細胞集団が、幹細胞集団の少なくとも約90％以上の細胞が以下のマーカー：CD73、CD90、およびCD105の各々を発現する間葉系幹細胞集団である、項15または16の方法。
18. 間葉系幹細胞集団の少なくとも約90％以上の細胞が以下のマーカー：CD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠く、項17の方法。
19. 間葉系幹細胞集団の少なくとも約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、約99％以上の細胞がCD73、CD90、およびCD105の各々を発現し、CD34、CD45、およびHLA-DRの各々の発現を欠く、項17または18の方法。
20. 培地が、細胞培養培地または保存培地である、前記項のいずれかの方法。
21. 保存培地が、HypothermosolまたはPlasmalyteである、項20の方法。
22. 培地が、約55～65％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、約5～15％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、約15～30％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および約1～8％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む、項1～19のいずれかの方法。
23. 培地が、約57.5～62.5％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、約7.5～12.5％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、約17.5～25.0％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および約1.75～3.5％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む、項22の方法。
24. 培地が、約61.8％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、約11.8％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、約23.6％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および約2.5％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む、項23の方法。
25. 無血清基本培地が、M171である、項23または24の方法。
26. 培地が、約1ng/ml～約20ng/mlの最終濃度の上皮増殖因子（EGF）をさらに含む、項22～25のいずれかの方法。
27. 培地が、約10ng/mlの最終濃度の上皮増殖因子（EGF）を含む、項26の方法。
28. 培地が、約1μg/ml～10μg/mlの最終濃度のインスリンを含む、項22～27のいずれかの方法。
29. 培地が、約5μg/mlの最終濃度のインスリンを含む、項28の方法。
30. 培地が、以下の補助剤：アデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）のうちの少なくとも1種をさらに含む、項22～29のいずれかの方法。
31. 培地が、アデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）のうちの3種全てを含む、項22～30のいずれかの方法。
32. 培地が、約0.01～約0.1μg/mlアデニンの最終濃度のアデニン、約0.1～約10μg/mlヒドロコルチゾンの最終濃度のヒドロコルチゾン、および/または約0.5～約5ng/mlの最終濃度の3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）を含む、項30または31の方法。
33. 前記項22～32のいずれかにおいて定義された培地における間葉系幹細胞集団の培養が、DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）、F12（ハムF12培地）、M171（培地171）、およびFBS（ウシ胎仔血清）の全てを含むわけではない参照培地と比べて、間葉系幹細胞集団によるアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ；具体的には、TGFβ1）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択されるタンパク質のうちの少なくとも1種の発現および/または分泌の増加をもたらす、項1～32のいずれかの方法。
34. 細胞培地が、適当な培養期間の後に遠心分離に供される、項1～33のいずれかの方法。
35. 適当な培養期間が約12時間、約24時間、約36時間、約46時間、約48時間、または約50時間、好ましくは、約48時間を含む、項34の方法。
36. 遠心分離された細胞培養培地の上清がマルチプレックスアッセイに供される、項34または35の方法。
37. マルチプレックスアッセイがビーズベースである、項36の方法。
38. 間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用。
39. cGMP条件下で幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用。
40. 後に薬学的に投与するための幹細胞集団を作製するための間葉系幹細胞集団を選択するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用。
41. マスター細胞バンクを生成するための間葉系幹細胞集団を選択するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用。
42. 薬学的に使用するための間葉系幹細胞集団を作製するための出発材料として適当な組織を同定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用。
43. 組織が臍帯または臍帯の羊膜であり、間葉系幹細胞集団が臍帯の羊膜の幹細胞集団である、項42の使用。
44. 間葉系幹細胞集団によって細胞培養培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを細胞培養培地において決定する工程を含む、項38～41のいずれかの使用。
45. 組織または組織から単離された細胞の試料によって細胞培養物中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang 1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを細胞培養培地において決定する工程を含む、項42または43の使用。
46. 間葉系幹細胞集団によって細胞培養培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも2種、少なくとも3種、または4種全てのタンパク質のレベルを細胞培養培地において決定する工程を含む、項38～44のいずれかの使用。
47. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質のレベルを決定する工程を含む、間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定する方法。
48. 間葉系幹細胞集団の創傷治癒特性を誘導するまたは改善するために適当な培地を同定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質の使用。
49. 間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌された少なくとも2種、少なくとも3種、または4種全てのタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含む、項48の使用。

Claims (26)

  1. 間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定する方法であって、間葉系幹細胞集団が、臍帯の間葉系幹細胞集団であり、臍帯の間葉系幹細胞集団が、臍帯の羊膜の間葉系幹細胞集団であり、方法が、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌されたアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される4種全てのタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含み、閾値と等しいまたは閾値を超える4種全てのタンパク質の分泌レベルが、間葉系幹細胞集団の創傷治癒の効力を示す、方法。
  2. アンジオポエチン1（Ang-1）について、閾値が400pg/mlまたは500pg/mlである、請求項1記載の方法。
  3. トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、閾値が400pg/mlまたは500pg/mlである、請求項2記載の方法。
  4. 血管内皮増殖因子（VEGF）について、閾値が80pg/mlまたは100pg/mlである、請求項2～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 肝細胞増殖因子（HGF）について、閾値が80pg/mlまたは100pg/mlである、請求項2～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 4種全てのタンパク質の分泌レベルがそれぞれの閾値と等しいかまたはそれぞれの閾値を超えており、閾値が
    － アンジオポエチン1（Ang-1）について、400pg/mlの閾値、
    － トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、400pg/mlの閾値、
    － 血管内皮増殖因子（VEGF）について、80pg/mlの閾値、および
    － 肝細胞増殖因子（HGF）について、80pg/mlの閾値
    である、請求項2～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 4種全てのタンパク質の分泌レベルがそれぞれの閾値と等しいかまたはそれぞれの閾値を超えており、閾値が
    － アンジオポエチン1（Ang-1）について、500pg/mlの閾値、
    － トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）について、500pg/mlの閾値、
    － 血管内皮増殖因子（VEGF）について、100pg/mlの閾値、および
    － 肝細胞増殖因子（HGF）について、100pg/mlの閾値
    である、請求項2～5のいずれか一項記載の方法。
  8. 臍帯の羊膜の間葉系幹細胞集団が、幹細胞集団の少なくとも90％以上の細胞が以下のマーカー：CD73、CD90、およびCD105の各々を発現する間葉系幹細胞集団である、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 間葉系幹細胞集団の少なくとも90％以上の細胞が以下のマーカー：CD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠く、請求項8記載の方法。
  10. 間葉系幹細胞集団の少なくとも91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上の細胞がCD73、CD90、およびCD105の各々を発現し、CD34、CD45、およびHLA-DRの各々の発現を欠く、請求項8または9記載の方法。
  11. 培地が、細胞培養培地または保存培地である、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. 培地が、55～65％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、5～15％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、15～30％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および1～8％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  13. 培地が、57.5～62.5％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、7.5～12.5％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、17.5～25.0％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および1.75～3.5％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む、請求項12記載の方法。
  14. 培地が、61.8％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、11.8％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、23.6％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および2.5％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む、請求項13記載の方法。
  15. 無血清基本培地が、M171である、請求項13または14記載の方法。
  16. 培地が、1ng/ml～20ng/mlの最終濃度の上皮増殖因子（EGF）をさらに含む、請求項13～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 培地が、10ng/mlの最終濃度の上皮増殖因子（EGF）を含む、請求項16記載の方法。
  18. 培地が、1μg/ml～10μg/mlの最終濃度のインスリンを含む、請求項1～17のいずれか一項記載の方法。
  19. 培地が、5μg/mlの最終濃度のインスリンを含む、請求項18記載の方法。
  20. 培地が、以下の補助剤：アデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）のうちの少なくとも1種をさらに含む、請求項12～19のいずれか一項記載の方法。
  21. 55～65％(v/v)の最終濃度のダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、5～15％(v/v)の最終濃度のハムF12培地（F12）、15～30％(v/v)の最終濃度の無血清基本培地、および1～8％(v/v)の最終濃度のウシ胎仔血清（FBS）を含む培地における間葉系幹細胞集団の培養が、DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）、F12（ハムF12培地）、M171（培地171）、およびFBS（ウシ胎仔血清）の全てを含むわけではない参照培地と比べて、間葉系幹細胞集団によるアンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ；具体的には、TGFβ1）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択されるタンパク質のうちの少なくとも1種の発現および/または分泌の増加をもたらす、請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
  22. 培地が、適当な培養期間の後に遠心分離に供される、請求項1～21のいずれか一項記載の方法。
  23. 適当な培養期間が12時間、24時間、36時間、46時間、48時間、または50時間を含む、請求項22記載の方法。
  24. 遠心分離された細胞培養培地の上清がマルチプレックスアッセイに供される、請求項22または23記載の方法。
  25. マルチプレックスアッセイがビーズベースである、請求項24記載の方法。
  26. 臍帯の間葉系幹細胞集団の創傷治癒効力を査定するための、アンジオポエチン1（Ang-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、血管内皮増殖因子（VEGF）、および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される4種全てのタンパク質の使用であって、臍帯の間葉系幹細胞集団が臍帯の羊膜の間葉系幹細胞集団であり、該使用が、間葉系幹細胞集団によって培地中に分泌された4種全てのタンパク質のレベルを培地において決定する工程を含み、閾値と等しいまたは閾値を超える4種全てのタンパク質の分泌レベルが、間葉系幹細胞集団の創傷治癒の効力を示す、使用。
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