JP7649735B2

JP7649735B2 - 改善されたヌクレアーゼのための組成物及び方法

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Publication number: JP7649735B2
Application number: JP2021512437A
Authority: JP
Inventors: アンナ－リナ・カヴァッロ
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2025-03-21
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Description

本開示は、野生型Ｃａｓ９よりも急速な分解速度を有する組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。本開示は、低減されたオフターゲット修飾を有する組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系も提供する。本開示の組換えＣａｓ９タンパク質を利用する、低減されたオフターゲット修飾を有する部位特異的修飾の方法も本明細書で提供される。

クラスター化された規則的に間隔が空いた短鎖回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＩｓｈｉｎｏにより最初に発見された原核生物免疫系である（非特許文献１）。原核生物免疫系は、ウイルス及びプラスミドの核酸を配列特異的に標的化することにより、ウイルス及びプラスミドに対する免疫を提供する。（非特許文献２）も参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ免疫応答は、２つの主段階を伴い、その第１のものが獲得であり、第２のものが干渉である。獲得段階は、侵入ウイルス及びプラスミドのゲノムを切断することと、侵入ウイルス及びプラスミドのゲノムのセグメントを生物体のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むこととを伴う。生物のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれるセグメントは、プロトスペーサーとして公知であり、同一のウイルス又はプラスミドによる後続の攻撃からの生物の保護に役立つ。第２の段階は、侵入ウイルス又はプラスミドへの攻撃を伴う。第２の段階では、プロトスペーサーは、ＲＮＡに転写され、このＲＮＡは、いくらかのプロセシング後に侵入ウイルス又はプラスミドのＤＮＡ中の相補的配列とハイブリダイズする一方、そのＤＮＡを有効に開裂させるタンパク質又はタンパク質複合体とも会合する。

細菌種に応じて、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡプロセシングは、異なって進行する。例えば、細菌のストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）において最初に記載されたＩＩ型系では、転写されたＲＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合してからＲＮアーゼＩＩＩにより開裂されて、個々のＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が形成される。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる結合後に更にプロセシングされて成熟ｃｒＲＮＡが産生される。続いて、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、捕捉領域（プロトスペーサーと称される）に相補的な配列を含有するＤＮＡに結合する。次いで、Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡの両方の鎖を部位特異的に開裂させ、二本鎖分解（ＤＳＢ）を形成する。これは、ＤＮＡベースの「記憶」を提供し、反復曝露及び／又は感染時にウイルス又はプラスミドＤＮＡの急速な分解をもたらす。天然のＣＲＩＳＰＲ系は、広範に精査されている（例えば、（非特許文献３）を参照されたい）。

その最初の発見以来、複数のグループは、遺伝子編集を含む遺伝子工学におけるＣＲＩＳＰＲ系の応用可能性に関して広範な調査を実施してきた（（非特許文献４）、（非特許文献５）及び（非特許文献６））。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集系は、広範な生物及び細胞株において問題なく用いられてきた。ゲノム編集に加えて、ＣＲＩＳＰＲ系は、複数の他の用途、例としてとりわけ調節遺伝子発現、遺伝子回路構築及び機能的ゲノム学を有する（（非特許文献７）に概説）。

治療用途に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の適性は、関心の高いテーマである。しかしながら、標的ゲノムのオフターゲット修飾（すなわち目的の標的配列以外の遺伝子座における二本鎖ＤＮＡの切断）は、予測不可能であり且つ望ましくない結果をもたらす場合があり、そのため、臨床用途でＣＲＩＳＰＲ系を使用することに対する懸念が生じる。例えば、（非特許文献８）、（非特許文献９）及び（非特許文献１０）を参照されたい。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の細胞毒性も懸念である。研究は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ効率が上昇すると、細胞内でｔｐ５３依存性の毒性反応がトリガされたことを実証した（非特許文献１１）。

Ｃａｓ９のオフターゲット修飾を低減させるための取り組みが行われてきた。Ｆｕらは、ガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡ界面の長さを低減させることにより、Ｃａｓ９のオフターゲット効果を低減させるために、短い標的相補性領域を有するトランケートガイドＲＮＡを用いる方法について説明している（非特許文献１２）。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらは、標的ＤＮＡ配列との接触を低減させてオフターゲット結合を最小化した改変Ｃａｓ９変異体について説明している（非特許文献１３）。しかしながら、Ｃａｓ９のオフターゲット活性が低減した一方、いずれの研究も、対応するオンターゲットヌクレアーゼ効率の低下を示した。

Ｉｓｈｉｎｏｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６９（１２）：５４２９－５４３３（１９８７）Ｓｏｒｅｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６（３）：１８１－１８６（２００８）Ｂａｒｒａｎｇｏｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ５４（２）：２３４－２４４（２０１４）Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）Ｃｏｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）Ｍａｌｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８２３－８２６（２０１３）Ｓａｎｄｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２：３４７－３５５（２０１４）Ｈｓｕｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３１（９）：８２７－８３４（２０１３）Ｈｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５７（６）：１２６２－１２７８（２０１４）Ｓｃｈａｅｆｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ１４（６）：５４７－５４８（２０１７）Ｉｈｒｙｅｔａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ（２０１７），ｄｏｉ：１０．１１０１／１６８４４３ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２（３）：２７９－２８４（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ５２９（７５８７）：４９０－４９５（２０１６）

したがって、当技術分野では、オンターゲット効率を維持する、低減されたオフターゲット活性を有する改善されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に対する必要性が依然として存在する。

いくつかの実施形態では、本開示は、野生型Ｃａｓ９よりも急速な分解速度を有する組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、低減されたオフターゲット修飾を有する組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明される組換えＣａｓ９タンパク質を利用する、低減されたオフターゲット修飾を有する部位特異的修飾の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）、ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）、ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）、ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）、ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）、ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）、ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）、ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）、ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）、ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）、ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）、ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）、ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）、ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）、ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）、ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）、ＮＫＫＦＥ（配列番号４１）及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質のＲＥＣローブ中にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＲＥＣローブのＲｅｃ２ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質のＨＮＨドメイン、ＲｕｖＣドメイン又はＰＩドメイン中にある。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域中にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端にある。

いくつかの実施形態では、本開示は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質であって、１つ以上のアミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）標的モチーフ又はエンドソームミクロオートファジー（ｅＭＩ）標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する、組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも５０％急速に分解する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも８０％急速に分解する。

いくつかの実施形態では、本開示は、野生型Ｃａｓ９タンパク質中に１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質であって、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフは、ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）、ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）、ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）、ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）、ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）、ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）、ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）、ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）、ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）、ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）、ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）、ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）、ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）、ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）、ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）、ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）、ＮＫＫＦＥ（配列番号４１）及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域中にある。

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）を提供する。

いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、以下の変異：Ｆ１８５Ｎ；Ａ５４７Ｅ／Ｉ５４８Ｌ；Ｔ５６０Ｅ／Ｖ５６１Ｑ；Ｄ８２９Ｌ／Ｉ８３０Ｒ；Ｌ１０８７Ｅ／Ｓ１０８８Ｑ；又はＰ１１９９Ｄ／Ｋ１２００Ｑの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、Ｆ１８５における変異である。いくつかの実施形態では、変異は、Ｆ１８５Ｎである。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフをもたらす。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一である。

いくつかの実施形態では、本開示は、７０ｋＤの熱ショック同族タンパク質（ＨＳＣ７０）に結合することが可能な組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えタンパク質（ＳｐＣａｓ９）を提供する。いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１の位置Ｄ１０、Ｈ８４０又はこれらの組み合わせにおける変異を更に含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｄ１０Ａ又はＤ１０Ｎ；Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ又はＨ８４０Ｙ及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、粘着末端を生成する。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、１つ以上の核局在化シグナルを更に含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質と、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントと、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、ガイド配列は、ダイレクトリピート配列に連結されている。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドを含む。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びガイドポリヌクレオチドは、単一のベクター上にある。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、単一のベクター上にある。

いくつかの実施形態では、送達粒子は、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスのものである。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞のゲノム中の標的配列において部位特異的修飾を提供する方法であって、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を細胞中に導入することを含む方法を提供する。

方法のいくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の少なくとも一部の欠失を含む。方法のいくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の変異を含む。方法のいくつかの実施形態では、修飾は、目的配列（ＳｏＩ）を標的配列において挿入することを含む。

方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の修飾の約５％未満である。方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の修飾の約２％未満である。方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の修飾の約１％未満である。方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９と比較して少なくとも約５０％だけ低減される。

方法のいくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である。方法のいくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。方法のいくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。方法のいくつかの実施形態では、細胞は、誘発された多能性幹細胞である。

方法のいくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、細胞のゲノム中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。方法のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、送達粒子、ベシクル又はウイルスベクターを介して細胞中に導入される。

実施例４に記載される実験に関する。図１Ａは、Ｃａｓ９をヒト尿路上皮細胞（ＳＶＨＵＣ－１）に安定してトランスフェクトした後、細胞数が減少することを示す。図１Ｂは、Ｃａｓ９発現を誘発すると、Ｃａｓ９を発現するマウスの体重が減少することを示す。図２の左側のパネルは、誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の顕微鏡画像である。図２の右のパネルは、Ｃａｓ９を発現するｉＰＳＣの顕微鏡画像である。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）の図を示す。ガイドＲＮＡ（ＳｇＲＮＡ）及びＤＮＡに結合したＳｐＣａｓ９の結晶構造を示す。実施例１に記載される実験に関する。図５Ａは、野生型Ｃａｓ９及びＫＦＥＲＱモチーフを含むＣａｓ９を含有するプラスミドの図を示す。図５Ｂは、それぞれＦＬＡＧ標識で標識された野生型Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９を含有するプラスミドの図を示す。図６Ａ及び６Ｂは、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９の存在を検出するウエスタンブロット（免疫ブロット）を示す。図６Ａでは、Ｃａｓ９特異性抗体によって野生型Ｃａｓ９が検出可能であるが、ＫＦＥＲＱ－Ｃａｓ９は、検出されない。図６Ｂでは、ＦＬＡＧ及びＣａｓ９に特異性の抗体によってＦＬＡＧで標識化された野生型Ｃａｓ９が検出可能であるが、ＦＬＡＧで標識化されたＫＦＥＲＱ－Ｃａｓ９は、いずれの抗体によっても検出可能ではない。図７Ａ及び７Ｂは、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９の経時的な発現を示す。図７Ａのウエスタンブロットは、野生型Ｃａｓ９レベルが経時的に増加するが、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９がＣａｓ９特異性抗体によって検出されないことを示す。Ｌｏｗｅｘｐ：低暴露；ｈｉｇｈｅｘｐ：高暴露；ｃｔｒ：対照（Ｃａｓ９なし）。図７Ｂは、Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９のｍＲＮＡ転写レベルが同じ時点で同等であることを示す。図８は、ＧＦＰ融合Ｃａｓ９を発現させるための１つのプロモーター及びｍＣｈｅｒｒｙを発現させるための第２のプロモーターを含むデュアルレポーターベクターの図を示す。図９Ａ及び９Ｂは、それぞれＣａｓ９－ＧＦＰ及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦｐを発現させる細胞を示す蛍光顕微鏡画像である。図１０Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光によって測定したＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９のトランスフェクション効率を示す。図１０Ｂは、ＧＦＰ蛍光によって測定したＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９の発現レベルを示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、それぞれＣａｓ９－ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光顕微鏡画像を示す。図１１Ｃは、図１１ａ及び１１Ｂを統合したものであり、ＧＦＰを発現する同じ細胞がｍＣｈｅｒｒｙも発現することを示す。図１２は、Ｃａｓ９特異性抗体によって検出した、異なる細胞タイプにおけるＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９の経時的な発現レベルを表示するウエスタンブロットを示す。実施例２に記載される実験に関する。図１３Ａは、ＨＳＣ７０特異的抗体によって検出した、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９とＨＳＣ７０との共免疫沈降ブロットを示す。図１３Ｂは、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９とＬａｍｐ－２Ａとの免疫蛍光画像を示す。図１４は、２つのプラスミド図を示す。第１のプラスミドは、ｄｓＲｅｄ融合Ｌａｍｐ－２Ａを発現し、第２のプラスミドは、ＧＦＰ融合ＦａＤｅ－Ｃａｓ９を発現する。図１５は、Ｌａｍｐ－２Ａ－ｄｓＲｅｄ、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ及びＬａｍｐ－２ＡとＦａＤｅ－Ｃａｓ９との共局在化を示す統合画像の蛍光顕微鏡画像を示す。図１６は、サイトゾル又は核中のＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９の局在化を表示するウエスタンブロットを示す。実施例３に記載される実験に関する。図１７Ａは、ＨＥＫ細胞中でＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を試験するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ（Ｃｅｌ１アッセイ）の結果を示す。図１７Ｂは、Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９のヌクレアーゼ効率を表示する次世代配列決定を示す。図１８は、ｈｉＰＳｃにおけるＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を試験するアッセイの結果を示す。ＲＮＰ：リボヌクレオタンパク質；ｐｌ：プラスミド。図１９は、ＥＭＸ及びＦＡＮＣＦ遺伝子座におけるＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９によるオフターゲット修飾の分析結果を示す。左側、中央、右側のパネルは、Ｃａｓ９とＦａＤｅ－Ｃａｓ９との間でオンターゲット効率、オフターゲット効率及び正規化されたオンターゲット効率をそれぞれ比較する。ＦａＤｅ－Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９と比較して同等のオンターゲット効率及び低減されたオフターゲット活性を有することを示すデータを表す。Ｃａｓ９でトランスフェクトされた細胞が、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９及びトランスフェクトされていない細胞と比較して低減された増殖速度を有することを示す。ＦａＤｅ－Ｃａｓ９で編集された細胞が、Ｃａｓ９と比較して低減された染色体転座をもたらすことを示す。Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９の細胞トレランスを試験する実験の図を示す。細胞がＣａｓ９と比較してより多くのＦａＤｅ－Ｃａｓ９のコピーを許容できることを示す。０～１００時間の時点（図２３Ａ）及び０～２４時間の時点のクローズアップ（図２３Ｂ）における、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９でトランスフェクトした細胞のＣａｓ９のウエスタンブロットの定量化を示す。

ゲノム編集、ゲノムエンジニアリング並びに遺伝子及び／又は遺伝因子の発現の改変に用いることのできるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の構成要素が本明細書で説明される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、遺伝病の治療を含む様々な治療用途において有用であり得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のオフターゲット活性の低減を促進する、Ｃａｓ９タンパク質の急速分解型変異体（「ＦａＤｅ－Ｃａｓ９」と称される場合もある）も本明細書で説明される。急速分解型Ｃａｓ９タンパク質の更なる利点は、本明細書で説明され、野生型Ｃａｓ９のオンターゲット効率と同等のオンターゲット効率及び／又は野生型Ｃａｓ９と比較して低減した毒性を含むが、これらに限定されない。

定義
本明細書において使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用され、語「含む」と共に使用される場合、語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書において使用される「別の」又は「更なる」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。

本出願全体にわたり、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられている方法／装置についての誤差の固有の変動又は試験対象間で存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じておよそ又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％未満の変動性を包含することを意味する。

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すと明示されない限り又はその代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、語「含んでいる」（並びに含んでいるの任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有している」（並びに有しているの任意の形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「包含している」（並びに包含しているの任意の形態、例えば、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）又は「含有している」（並びに含有しているの任意の形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包含的又はオープンエンドであり、追加の引用されない要素又は方法工程を除外するものではない。本明細書において考察される任意の実施形態は、本開示の任意の方法、系、宿主細胞、発現ベクター及び／又は組成物に関して実行できることが企図される。更に、本開示の組成物、系、宿主細胞及び／又はベクターを使用して本開示の方法及びタンパク質を達成することができる。

用語「例えば」及びその対応する略語「ｅ．ｇ．（イタリックであるか又はそうでないかを問わない）」の使用は、引用される特定の用語が、特に明示されない限り、参照又は引用される特定の例に限定されるものではない本開示の代表例及び実施形態であることを意味する。

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、共有結合ヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。用語「核酸」には、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、その両方とも一本鎖又は二本鎖であり得る。ＤＮＡとしては、限定されるものではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミド又はベクターＤＮＡ及び合成ＤＮＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示のポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを提供し、例えばＣａｓタンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを対象とする。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、それにはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子が含まれる。「遺伝子」は、コード配列に先行（５’非コード配列）及び後行（３’非コード配列）する調節配列として作用し得る核酸フラグメントも指す。

核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに「ハイブリダイズ可能である」又は「ハイブリダイズされる」。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章及び表１１．１に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似するフラグメント、例えば遠縁生物からの相同配列を、高度に類似するフラグメント、例えば密接に関連する生物からの機能的酵素を複製する遺伝子に対してスクリーニングするように調整することができる。相同核酸の予備スクリーニングのため、５５℃のＴ_ｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルク及びホルムアミドなし；又は３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを使用することができる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴ_ｍ、例えば４０％のホルムアミドと５×又は６×ＳＣＣに対応する。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最大Ｔ_ｍ、例えば５０％のホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに対応する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが考えられる。

用語「相補的」は、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンは、チミンに相補的であり、シトシンは、グアニンに相補的である。したがって、本開示には、本明細書で開示又は使用される完全配列に相補的な単離核酸フラグメント及びそれらと実質的に類似する核酸配列も含まれる。

ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下で配置される場合、インビトロ又はインビボにおいて細胞中で転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その中又はその下流（３’非コード配列）に局在し、転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を挙げることができる。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列及び更に合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。コード配列が真核細胞中での発現を目的とされる場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に位置する。

「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略され、翻訳開始シグナル又は開始コドン、例えばＡＴＧ又はＡＵＧ及び終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る長さの核酸配列、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを意味する。

用語「相同組換え」は、外来ＤＮＡ配列の別のＤＮＡ分子中への挿入、例えば染色体中のベクターの挿入を指す。場合により、ベクターは、相同組換えについて特異的な染色体部位を標的化する。特異的相同組換えのため、ベクターは、典型的には、相補的結合及び染色体中へのベクターの組み込みを可能とするために染色体の配列と相同性の十分に長い領域を含有する。より長い相補性の領域及びより大きい配列類似性の程度は、相同組換えの効率を増加させ得る。

当技術分野において既知の方法を使用して、本明細書の開示に従ってポリヌクレオチドを伝播させることができる。好適な宿主系及び成長条件を確立したら、組換え発現ベクターを伝播させ、多量に調製することができる。本明細書で説明する通り、使用され得る発現ベクターとしては、以下のベクター又はその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト又は動物ウイルス、例えばワクシニアウイルス又はアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。

本明細書で使用するとき、「操作可能に連結される」とは、目的のポリヌクレオチド、例えばＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されることを意味する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、発現ベクター上でプロモーターに操作可能に連結されている。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、且つ下流のコード配列又は非コード配列の転写の開始に関与するＤＮＡ調節領域／配列を指す。本開示の一部の例において、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルにおいて転写を開始するために使用される最小数の塩基又はエレメントを含むように上流に伸びる。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位及びＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多いが、常にではない。種々のプロモーター、例として誘導性プロモーターを使用して、本開示の種々のベクターを駆動することができる。

「ベクター」は、宿主細胞中に核酸をクローニングし、且つ／又は移行させる任意の手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントを付着させて付着セグメントの複製を生じさせることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわちそれ自体の制御下で複製し得る任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、非対称分配により多数の細胞世代後に細胞の集団から除去／消失されるエピソーマルベクターである。用語「ベクター」には、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞中に核酸を導入するためのウイルス及び非ウイルス手段の両方が含まれる。当技術分野で既知の多くのベクターを、核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子に組み込むなどのために用いることができる。可能なベクターとしては、例えば、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、又はＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、又はブルースクリプトベクターなどを含むプラスミド又は修飾ウイルスが挙げられる。例えば、好適ベクター中への、応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡフラグメントの挿入は、相補的粘着末端を有する選択ベクター中に適切なＤＮＡフラグメントをライゲートすることにより達成することができる。代わりに、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変することができるか、又はヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端中にライゲートすることにより任意の部位を産生することができる。このようなベクターは、細胞ゲノム中にマーカーを組み込んだ細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含有するように改変することができる。このようなマーカーは、マーカーを組み込み、そのマーカーによりコードされるタンパク質を発現する宿主細胞の同定及び／又は選択を可能とする。

ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞及び生存動物対象における広範な遺伝子送達用途において使用されている。使用することができるウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタインバール、アデノウイルス、ジェミニウイルス及びカリモウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、リポソーム、荷電脂質、ＤＮＡ－タンパク質複合体及び生体ポリマーが挙げられる。ベクターは、核酸に加え、核酸移行結果（移行する組織、発現の継続期間など）の選択、計測及びモニタリングにおいて有用な１つ以上の調節領域及び／又は選択マーカーも含み得る。

ベクターは、既知の方法、例として、限定されるものではないが、トランスフェクション、形質導入、細胞融合及びリポフェクションにより所望の宿主細胞中に導入することができる。ベクターは、種々の調節エレメント、例としてプロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター設計は、Ｍａｌｉｅｔａｌ．，“Ｃａｓ９ａｓａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｆｏｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂｉｏｌｏｇｙ，”ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ１０：９５７－６３（２０１３）により設計された構築物をベースとすることができる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクター、例えばＣａｓタンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓ９タンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

用語「プラスミド」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を担持することが多く、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である外部染色体エレメントを指す。このようなエレメントは、任意の資源に由来する自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線状、環状又はスーパーコイルドの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、その中では、多数のヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列と共に、選択遺伝子産物についてのプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を細胞中に導入し得るユニーク構築物中に結合するか又は組換えされている。

本明細書において使用される「トランスフェクション」は、細胞中への外因性核酸分子、例としてベクターの導入を意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内部の外因性核酸分子を含み、「形質転換」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導する細胞である。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができ、且つ／又は一時的若しくは長期間にわたり染色体外で細胞により維持させることができる。外因性核酸分子又はフラグメントを発現する宿主細胞又は生物は、「組換え」、「形質転換」又は「トランスジェニック」生物と称される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の発現ベクターのいずれか、例えばＣａｓタンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓ９タンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入された細胞（「親」細胞）のみでなく、こうした細胞の後代も指す。例えば、変異又は環境の影響により特定の修飾が後の世代に発生する場合があるため、そのような後代は、親細胞と同一ではない場合があるが、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、それは、コード及び非コードアミノ酸、化学的若しくは生化学的改変又は誘導体化アミノ酸並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを含む。

タンパク質又はポリペプチドの始点は、「Ｎ末端」（又はアミノ末端、ＮＨ_２末端、Ｎ末端部若しくはアミン末端）として知られ、これは、タンパク質又はポリペプチドの第１のアミノ酸残基の遊離アミン（－ＮＨ_２）基を指す。タンパク質又はポリペプチドの終点は、「Ｃ末端」（又はカルボキシ末端、カルボキシル末端、Ｃ－末端部若しくはＣＯＯＨ末端）として知られ、これは、タンパク質又はポリペプチドの最後のアミノ酸残基の遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を指す。

本明細書で使用するとき、「アミノ酸」は、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）及びアミノ（－ＮＨ_２）基の両方を含有する化合物を指す。「アミノ酸」は、天然及び非天然（すなわち合成）のアミノ酸の両方を指す。３文字及び１文字の略記を有する天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。

「アミノ酸置換」は、野生型又は天然発生アミノ酸の、その野生型又は天然発生アミノ酸に対して異なるアミノ酸によるそのアミノ酸残基における１つ以上の置換を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。置換アミノ酸は、合成又は天然発生アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される天然発生アミノ酸である。置換変異は、略語系を用いて記載され得る。例えば、５番目のアミノ酸残基が置換されている置換突然変異は、「Ｘ５Ｙ」と略記することができ、「Ｘ」は、置き換えられる野生型又は天然発生アミノ酸であり、「５」は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基位置であり、「Ｙ」は、置換、又は非野生型、又は非天然発生アミノ酸である。

「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、その天然環境から取り出された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、賦形剤、例えば希釈剤又は助剤と配合することができ、依然として単離されているとみなされることも理解すべきである。

用語「組換え」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、天然に存在することが公知でない遺伝子材料の新たな組合せのそれら又はその組合せから生じるそれらを意味する。組換え分子は、組換え技術の分野において利用可能な周知技術のいずれか、例として、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子スプライシング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用）及び核酸分子、ペプチド又はタンパク質の固相合成により産生することができる。

用語「ドメイン」は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、タンパク質中の区別される機能的及び／又は構造的単位を意味する。ドメインは、タンパク質の全体的な役割に寄与する特定の機能又は相互作用を担う場合がある。ドメインは、種々の生物学的コンテクストで存在し得る。類似のドメインは、異なる機能を有するタンパク質中で見出すことができる。代わりに、低い配列同一性（すなわち約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満又は約１％未満の配列同一性）を有するドメインは、同一の機能を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、ＲｕｖＣドメインである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、ＨＮＨドメインである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｒｅｃドメインである。

ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、用語「モチーフ」は、一般的に、タンパク質の機能に重要であり得る、典型的には長さが２０アミノ酸より短い保存アミノ酸残基を指す。特定の配列モチーフは、様々なタンパク質において、特定の細胞内位置に対するタンパク質の結合又は標的化などの一般的な機能を媒介することができる。モチーフの例としては、核局在化シグナル、マイクロボディ標的化モチーフ、分泌を防止又は促進するモチーフ並びにタンパク質の認識及び結合を促進するモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。モチーフデータベース及び／又はモチーフ検索ツールは、当業者に既知であり、例えばＰＲＯＳＩＴＥ（ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ）、Ｐｆａｍ（ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）、ＰＲＩＮＴＳ（ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＰＲＩＮＴＳ／ＰＲＩＮＴＳ．ｈｔｍｌ）及びＭｉｎｉｍｏｔｉｆＭｉｎｅｒ（ｃｓｅ－ｍｎｍ．ｅｎｇｒ．ｕｃｏｎｎ．ｅｄｕ：８０８０／ＭＮＭ／ＳＭＳＳｅａｒｃｈＳｅｒｖｌｅｔ）を含む。

本明細書で使用するとき、「改変」タンパク質とは、タンパク質中に所望の特性を達成するための１つ以上の修飾を含むタンパク質を意味する。例示的な修飾としては、挿入、欠失、置換又は別のドメイン若しくはタンパク質との融合が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の改変タンパク質としては、改変Ｃａｓ９タンパク質が挙げられる。

いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、野生型タンパク質から生成される。本明細書で使用するとき、「野生型」タンパク質又は核酸は、天然発生の未修飾タンパク質又は核酸である。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、生物であるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離することができ、また、これは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。野生型は、「変異型」と対比され、変異型は、タンパク質又は核酸のアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列中に１つ以上の修飾を含む。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の突然変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含み得、これは、野生型のＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号１）と比較して単一のアミノ酸置換を有する。

用語「分解する」又は「分解」は、ポリペプチド又はタンパク質に関して用いられる場合、一般的に、一般にプロテオリシスと称されるプロセスを介して、タンパク質がより小さいペプチドフラグメント又は個々のアミノ酸に崩壊することを指す。タンパク質の細胞内分解は、リソソーム又はプロテアソームのいずれかの中で達成され得る。リソソーム分解は、例えば、本明細書で説明する選択的シャペロン介在性オートファジー経路などの経路を除いて、典型的には非選択的プロセスである。リソソーム分解中、サイトゾルタンパク質は、分解のためにリソソームにエンドサイトーシスされる。プロテアソーム分解は、典型的には、選択的であり、分解対象のタンパク質がユビキチンで標識される。プロテアソームタンパク質分解経路の概要については、例えば、Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ｃｅｌｌ７９（１）：１３－２１（１９９４）；Ｈａｓｓｅｌｇｒｅｎｅｔａｌ．，ＡｎｎＳｕｒｇ２２５（３）：３０７－３１６（１９９７）；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６９（５）：７９２－８０６（２０１７）を参照されたい。一般に、タンパク質の分解速度は、細胞及び生化学的特徴におけるその機能に関連している。例えば、プロリン、グルタミン酸、セリン及びスレオニン豊富なセグメントを含むタンパク質（ＰＥＳＴタンパク質と称される場合もある）は、短い半減期を有する（例えば、参照によりその全体が援用されるＶｏｅｔ＆Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２ｎｄｅｄ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐｐ．１０１０－１０１４（１９９５）を参照されたい）。タンパク質の分解速度に影響を及ぼす他の因子としては、グルタミン及びアスパラギンの脱アミノ化速度、システイン、ヒスチジン及びメチオニンの酸化速度、安定化リガンドの欠如、結合した炭水化物基又はリン酸基の存在、遊離αアミノ基の存在、タンパク質の電荷並びにタンパク質の柔軟性及び安定性が挙げられる（例えば、参照によりその全体が援用されるＣｒｅｉｇｈｔｏｎ”Ｃｈａｐｔｅｒ１０－Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ”ｉｎＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ２ｎｄｅｄ．ＷＨＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ｐｐ．４６３－４７３（１９９３）を参照されたい）。タンパク質の分解速度を測定する方法としては、例えば、アミノ酸同位体のパルスチェイス（例えば、細胞培養又はＳＩＬＡＣにおけるアミノ酸を用いた安定同位体標識化）、合成後放射性同位元素標識化又は例えばＧＦＰをレポータータンパク質として使用するグローバルタンパク質安定性プロファイリング（ＧＰＳＰ）などのレポーター依存性アプローチが挙げられる（例えば、Ｙｅｗｄｅｌｌｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ３５（５）：４５７－４６２（２０１１）を参照されたい）。タンパク質の分解速度を測定する別の方法は、例えば、免疫ブロットの濃度測分析を用いて、異なる時点における細胞中のタンパク質の量を定量化することと、経時的なタンパク質レベルをプロットすることと、タンパク質レベル対時間プロットから分解速度を判定することとによるものである。タンパク質の分解速度を判定する方法は、当業者によって選択され得る。

本明細書において使用される用語「配列類似性」又は「％類似性」は、核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性又は対応性の程度を指す。本明細書において使用される「配列類似性」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が１つ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない核酸配列を指す。「配列類似性」は、得られる転写産物の機能的特性に実質的に影響しない核酸の修飾、例えば１つ以上のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入も指す。したがって、本開示は、特定の例示的な配列よりも多くのものを包含することが理解される。ヌクレオチド塩基の置換を行う方法は、コードされた生成物の生物活性の保持の判定方法と同様に既知である。

更に、当業者は、本開示により包含される類似の配列が、ストリンジェントな条件下において、本明細書に例示される配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。本開示の類似の核酸配列は、ＤＮＡ配列が本明細書に開示の核酸のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一である核酸である。本開示の類似の核酸配列は、ＤＮＡ配列が本明細書に開示の核酸のＤＮＡ配列と約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９９％、少なくとも約９９％又は約１００％同一である核酸である。

本明細書において使用される「配列類似性」は、アミノ酸の約４０％超が同一であるか、又はアミノ酸の約６０％超が機能的に同一である２つ以上のアミノ酸配列を指す。機能的に同一又は機能的に類似のアミノ酸は、化学的に類似の側鎖を有する。例えば、アミノ酸は、機能的類似性に従って以下のようにグループ分けすることができる：
正電荷側鎖：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ；
負電荷側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
極性非電荷側鎖：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
疎水性側鎖：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；
その他：Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。

いくつかの実施形態では、本開示の類似のアミノ酸配列は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸を有する。

いくつかの実施形態では、本開示の類似のアミノ酸配列は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％機能的に同一であるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、本開示の類似のアミノ酸配列は、約４０％、少なくとも約４０％、約４５％、少なくとも約４５％、約５０％、少なくとも約５０％、約５５％、少なくとも約５５％、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％又は約１００％同一であるアミノ酸を有する。

いくつかの実施形態では、本開示の類似のアミノ酸配列は、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％又は約１００％機能的に同一であるアミノ酸を有する。

本明細書で使用するとき、用語「同じタンパク質」とは、比較タンパク質と同じ生化学的機能を実施する、比較タンパク質と実質的に同様の構造又はアミノ酸配列を有するタンパク質を指し、アミノ酸配列中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換又は欠失、すなわち少なくとも約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％又は約１００％同一のアミノ酸の欠失によって比較タンパク質と異なるタンパク質を含み得る。一態様では、「同じタンパク質」とは、比較タンパク質と同一のアミノ酸配列を備えるタンパク質を指す。

配列類似性は、当技術分野における定型的な方法を使用する配列アラインメント、例えばＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｃｌｕｓｔａｌ（例として、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸ）及びＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（変種、例えばＭ－Ｃｏｆｆｅｅ、Ｒ－Ｃｏｆｆｅｅ及びＥｘｐｒｅｓｓｏなどを含む）などにより決定され得る。

核酸配列又はアミノ酸配列に関する用語「配列同一性」又は「％同一性」は、配列を規定の比較窓にわたりアラインした場合に同一である比較配列中の残基の割合を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定の一部のみをアラインして配列同一性が決定される。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定のドメインのみをアラインして配列類似性が決定される。比較窓は、配列をアラインし、比較することができる少なくとも１０個～１０００個超の残基、少なくとも２０～約１０００個の残基又は少なくとも５０～５００個の残基のセグメントであり得る。配列同一性の決定のためのアラインメントの方法は、周知であり、公的に利用可能なデータベース、例えばＢＬＡＳＴを使用して実施することができる。「パーセント同一性」又は「％同一性」は、アミノ酸配列を指す場合、当技術分野において公知の方法により決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９０：５８７３－５８７７（１９９３）の通り修正されたＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアルゴリズムを用いて判定される。こうしたアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラム、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴ＋又はＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、プログラム、例えばＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３などを用いて実施して、本開示のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間のギャップが存在する場合、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載の通り利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、それぞれ参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子のフラグメント）と７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％又は少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、それぞれ参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子のフラグメント）と約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の概要
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）は、バクテリアの中でもとりわけ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）及びナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されないバクテリア中に見出される、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ適応免疫系のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の概要については、例えば、Ｓａｎｄｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２：３４７－３５５（２０１４）を参照されたい。一般に、ＣＲＩＳＰＲ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（本明細書では「Ｃａｓ９タンパク質」又は「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」と互換的に称される）など、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素を特徴とする。天然発生のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系中では、外来ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイに組み込まれ、続いて、ＣＲＩＳＰＲアレイは、外来ＤＮＡ部位と相補的な「プロトスペーサー」領域を有するｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ）を産生する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ系によってコードもされる）にハイブリダイズし、このＲＮＡのペアがＣａｓ９ヌクレアーゼと会合する。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、プロトスペーサー配列を有する外来ＤＮＡを認識してこれを開裂させる。

いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。いくつかの実施形態では、改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、改変Ｃａｓ９タンパク質を含み、改変Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９に対する１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９中に存在しない１つ以上のモチーフを含む。野生型Ｃａｓ９に導入される１つ以上のモチーフは、「改変」モチーフと称され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質中の１つ以上の改変モチーフは、シャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）モチーフである。

いくつかの実施形態では、改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、改変ガイドポリヌクレオチドを含み、改変ガイドポリヌクレオチドは、野生型ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡに対する１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部との間の融合、すなわち単一のガイドポリヌクレオチドを用いる。したがって、この場合、複合体は、Ｃａｓ９と単一のガイドポリヌクレオチドとの間で形成される。単一のガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９と複合体を形成して、ガイドポリヌクレオチドの第１の（５’）２０個のヌクレオチド（すなわちガイドポリヌクレオチドのガイド配列部分）に相補的であり、且つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する標的配列の開裂を媒介する。他の実施形態では、改変ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドを含み、すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドの部分ではない。この場合、複合体がＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ間で形成される。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９タンパク質を活性化させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の活性化は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を活性化又は増加させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、これがｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体を形成するまでは活性でない。

Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流で二本鎖ＤＮＡの切断を生成する。二本鎖切断の修復は、二本鎖切断部位における挿入又は欠失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、目的配列は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用して標的配列中に挿入される。内因性ＤＮＡ修復経路としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路及び相同性配向型修復（ＨＤＲ）経路が挙げられる。ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ及びＨＤＲ経路は、二本鎖ＤＮＡ切断を修復する。ＮＨＥＪにおいて、相同テンプレートは、ＤＮＡ中の切断の修復に必要ではない。ＮＨＥＪ修復は、エラープローンであり得るが、エラーは、ＤＮＡ切断が適合性オーバーハングを含む場合に減少する。ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪは、それらのそれぞれに関与するＤＮＡ修復酵素の異なるサブセットにより機序的に区別されるＤＮＡ修復経路である。場合により正確であり得、場合によりエラープローンであり得るＮＨＥＪと異なり、ＭＭＥＪは、常にエラープローンであり、修復中の部位における欠失及び挿入の両方をもたらす。ＭＭＥＪ関連欠失は、二本鎖切断の両側におけるマイクロホモロジー（２～１０塩基対）に起因する。対照的に、ＨＤＲは、修復を指示するために相同テンプレートを必要とするが、ＨＤＲ修復は、典型的には、高フィデリティ且つ低エラープローンである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ修復のエラープローン性質を活用して、標的配列中の非特異的ヌクレオチド置換を導入する。

本明細書で説明する通り、一部のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、望ましくないオフターゲット活性又はオフターゲットゲノム編集を有する場合がある。ゲノム編集に関連して用いられる「オフターゲット」とは、非特異的且つ意図されたものでない遺伝子修飾を指し、これは、目的の遺伝子座での修飾を指す「オンターゲット」とは対照的である。オフターゲット修飾は、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがその目的の標的配列（すなわちガイドポリヌクレオチド上のガイド配列に対して相補的なゲノム配列）で結合しない場合に生じる場合があり、これは、相同配列及び／又はミスマッチ耐性によって生じ得る。オフターゲット修飾としては、意図されたものではない点突然変異、欠失、挿入、逆位及び転座が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比較して低減されたオフターゲット活性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比較してオフターゲット活性が少なくとも約５０％低減している。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９と比較してオフターゲット活性が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％低減している。オフターゲット修飾は、例えば、標的化配列決定、エキソーム配列決定、全ゲノム配列決定、ＢＬＥＳＳ（直接インサイチュの切断標識、ストレプトアビジン上での濃縮及び次世代配列決定）、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（配列決定によって評価されるゲノムワイドで非バイアスのＤＳＢの同定）、ＬＡＭ－ＨＴＧＴＳ（線形増幅媒介高スループットゲノムワイド転座配列決定）及びＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑインビトロＣａｓ９ダイジェスト全ゲノム配列決定）を用いて検出され得る。オフターゲット修飾の検出及び定量化方法は、例えば、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ４：ｅ２６４（２０１４）；及びＺｉｓｃｈｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ３５：９５－１０４（２０１７）に記載されている。

Ｃａｓ９タンパク質
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、以下の種に由来する：ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）又はクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｉｓｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｉｓｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｃａｓ９タンパク質（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。

いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、配列番号１を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％同一である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、粘着末端を生成可能なＣａｓ９を指す。本明細書において使用される用語「粘着末端」、「段違い末端」又は「粘着末端」は、不均等の長さの鎖を有する核酸フラグメントを指す。「平滑末端」と対照的に、粘着末端は、核酸、典型的にはＤＮＡ上の段違い切断により産生される。付着又は粘着末端は、非対合ヌクレオチド又は「オーバーハング」、例えば３’又は５’オーバーハングを有する突出する一本鎖の鎖を有する。それぞれのオーバーハングは、別の相補的オーバーハングとアニールして塩基対を形成し得る。２つの相補的粘着末端は、相互作用、例えば水素結合を介して一緒にアニールし得る。アニールされる粘着末端の安定性は、対合オーバーハングの融解温度に依存する。２つの相補的粘着末端は、化学的又は酵素的ライゲーションにより、例えばＤＮＡリガーゼにより一緒に結合させることができる。

いくつかの実施形態では、用語Ｃａｓ９とは、例えば、Ｃａｓ９ハイブリッドタンパク質などの変容した機能を有するＣａｓ９変異体を指す。例えば、Ｃａｓ９の結合ドメイン又は不活性のＤＮＡ開裂ドメインを有するＣａｓ９タンパク質は、ガイドポリヌクレオチドを介して所望の標的配列に特異的に結合するための結合ドメインとして用いることができる。結合ドメイン（すなわち不活性Ｃａｓ９）は、開裂ドメイン、例えばエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの開裂ドメインに融合又は共役されて、改変ハイブリッドヌクレアーゼを生成することができる。Ｃａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７１８９９号明細書及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２：５７７－５８２（２０１４）で更に説明されている。改変ハイブリッドヌクレアーゼの他の例は、例えば、Ｗａｈｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉ９５：１０５６４－１０５６９（１９９６）；Ｌｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ３９（１）：３５９－３７２（２０１１）；及びＫｉｍｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉ９３：１１５６－１１６０（１９９６）で説明されている。

Ｃｐｆ１（セントロメア及びプロモーター因子１）もＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、粘着末端を生成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と相似である。しかしながら、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１との間にいくらかの差が存在する。Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを利用しない。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９と異なるＰＡＭ配列を認識し、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９と異なる部位で開裂する。Ｃａｓ９は、ＰＡＭに隣接する配列において開裂する一方、Ｃｐｆ１は、ＰＡＭから更に遠い配列において開裂する。Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、外国の特許公報である英国特許出願公開第１５０６５０９．７号明細書、米国特許第９，５８０，７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号明細書及びＺｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６３（３）：７５９－７７１（２０１５）で更に説明されている。Ｃｐｆ１と機能的に類似する酵素を本開示に基づいて使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるアミノ酸修飾を含む組換えＣｐｆ１タンパク質を提供する。

例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質などの一部の野生型又は天然発生Ｃａｓ９タンパク質は、６つのドメインを有する：Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＢｒｉｄｇｅＨｅｌｉｘ（ＢＨ）、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）、ＨＮＨ及びＲｕｖＣ。Ｒｅｃ１ドメインは、ガイドポリヌクレオチドの結合を司る。ＢＨドメインは、標的配列の結合時に開裂活性の開始を司る。ＰＩドメインは、ＰＡＭ特異性を付与し、標的配列への結合の開始を司る。ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインである。Ｃａｓ９タンパク質の構造的研究により、タンパク質は、ＢＨ、Ｒｅｃ１及びＲｅｃ２ドメインを含む認識ローブ（「ＲＥＣローブ」）と、ＲｕｖＣ（ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ及びＲｕｖＣＩＩＩサブドメインに分けられる）、ＨＮＨ及びＰＩドメインを含むヌクレアーゼローブ（「ＮＵＣローブ」）とを有することが明らかになった。図３及び４を参照されたい。タンパク質ドメインは、タンパク質のアミノ酸配列に基づき、例えばＳＭＡＲＴ（Ｌｅｔｕｎｉｃｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ９２２）、ＰＡＮＤＡ（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ８：３４８４（２０１８））又はＩｎｔｅｒＰｒｏ（Ｆｉｎｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ１１０７）などのドメイン構造予測ツールを用いて同定することができる。タンパク質ドメインは、タンパク質構造に基づき、例えば目視検査又はＰＵＵ（Ｈｏｌｍｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１９（３）：２５６－２６８（１９９４））、ＲｉｇｉｄＦｉｎｄｅｒ（Ａｂｙｚｏｖｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７８（２）：３０９－３２４（２０１０））若しくはＰｉＳＱＲＤ（Ａｌｅｋｓｉｅｖｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５（２０）：２７４３－２７４４（２００９））などのアルゴリズムを用いることによって同定することもできる。構造特徴決定に基づくＣａｓ９ドメインの同定は、例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６－８２１（２０１２）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５６（５）：９３５－９４９（２０１４）；Ａｎｄｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５１３：５６９－５７３（２０１４）；及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５０７（７４９０）：６２－６７（２０１４）に記載されている。

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲＥＣローブを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号６～７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＮＵＣローブを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＢＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号９～１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲｅｃ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲｅｃ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１２～１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＰＩドメインを含む。

Ｃａｓ９タンパク質の構造研究、例えば結晶構造により、表面露出したタンパク質の領域が明らかになり得る。本明細書で使用するとき、「表面露出領域」とは、周辺環境にアクセス可能なタンパク質の領域、すなわちタンパク質の外「表面」上の領域を指す。同様に、「表面露出残基」としては、表面露出領域内にあるタンパク質のアミノ酸残基が挙げられる。表面露出残基は、タンパク質の中心に向けて内側を向き、周辺環境によりアクセス不可能な「埋没領域」を形成する「埋没」残基と対照をなす。タンパク質上の表面露出残基は、例えば、他のタンパク質又は細胞組織などの他の分子との相互作用に重要な役割を果たすことができる。このため、いくつかの実施形態では、タンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質上の特定の残基は、ある立体配座状態で表面露出しているが、異なる立体配座状態で表明露出していない。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡに結合すると、立体構造変化を受ける場合があり、その結果、Ｃａｓ９タンパク質中の以前には露出していなかった領域は、ガイドＲＮＡが結合すると、表面露出するようになるか又はその逆である（例えば、Ｆａｇｅｒｌｕｎｄｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉ１１４（２６）：Ｅ５２１１－Ｅ５１２８（２０１７）を参照されたい）。

表面露出残基は、タンパク質の物理的特性を判定し、タンパク質の折り畳み構造を強制することもできる。表面露出残基は、例えば、ＰｙＭＯＬ（ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）又はＳｗｉｓｓＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（ｓｐｄｂｖ．ｖｉｔａｌ－ｉｔ．ｃｈ）などのプログラム中でタンパク質結晶構造を閲覧すると判定することができる。表面露出残基は、例えば、ＮＡＣＣＥＳＳ（ｂｉｏｉｎｆ．ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｎａｃｃｅｓｓ）などのプログラムを用いてコンピュータで計算することもできる。タンパク質の表面露出残基は、例えば、結晶構造が利用不可能である場合、コンピュータ予測によって判定することもできる。タンパク質配列中の表面露出残基のコンピュータ予測ツールとしては、例えば、ＳＡＲｐｒｅｄ（Ｇａｒｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ６１：３１８－２４（２００５））、ｔｈｅＪＯＹＰａｃｋａｇｅからのＰＳＡ／ＴＥＭ（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１４：６１７－６２３（１９９８））及びＲＳＡＲＦ（ｃａｐｓ．ｎｃｂｓ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｐｕｇａｌ／ＲＳＡＲＦ）が挙げられる。

シャペロン介在性オートファジーの概要
「シャペロン介在性オートファジー」又はＣＭＡとは、サイトゾルタンパク質のシャペロン依存性選択、続いてタンパク質を分解のためにリソソームに標的化すること及びこれらをリソソーム膜全体にわたり転座させることを伴う選択的タンパク質分解プロセスを指す。ＣＭＡの例示的なシャペロンタンパク質は、７０ｋＤの熱ショック同族タンパク質又はＨＳＣ７０である。「エンドソームミクロオートファジー」又はｅＭＩとは、ＣＭＡと同様のタンパク質分解プロセスを指すが、ｅＭＩは、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むタンパク質を、分解のために、リソソームではなく、後期エンドソームに選択的に標的化する点が異なる。ＣＭＡと同様に、ＨＳＣ７０は、ｅＭＩのためのシャペロンタンパク質でもある。例えば、Ｋａｕｓｈｉｋｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ２２（８）：４０７－４１７（２０１２）；Ｔｅｋｉｒｄａｇｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２９３：５４１４－５４２４（２０１８）；及びＰｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣｅｌｌＢｉｏｌ２０１２（４）：９３１９５６（２０１２）を参照されたい。

本明細書で称される「ＫＦＥＲＱモチーフ」とは、ペンタペプチド配列：Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ（配列番号２４）である。本明細書で称される「ＫＦＥＲＱ様モチーフ」とは、ＫＦＥＲＱと生化学的に同様であるか、又は生化学的に関連したモチーフである。生化学的に同様であるか、又は生化学的に関連したモチーフとしては、本明細書で論じられる機能的に同等のアミノ酸残基が挙げられ得る。したがって、ＫＦＥＲＱモチーフは、以下のパラメータを有する任意のペンタペプチドであり得る：正電荷残基（例えば、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）の１つ又は２つ；バルキーな疎水性残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ又はＶａｌ）の１つ又は２つ；負電荷残基（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）；及びペンタペプチドのいずれかの側にフランキングするＧｌｎ又はＡｓｎ。例えば、Ｄｉｃｅｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ１５（８）：３０５－３０９（１９９０）；及びＫａｕｓｈｉｋｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ２２（８）：４０７－４１７（２０１２）を参照されたい。ＫＦＥＲＱ様モチーフの例としては、表１に列挙したモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。

少なくとも１つのＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むタンパク質は、ＣＭＡ又はｅＭＩの構成要素によって認識され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、シャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）標的モチーフである。いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、エンドソームミクロオートファジー（ｅＭＩ）標的モチーフである。特定の理論に束縛されるものではないが、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、他のタンパク質分解経路のための標的として機能することができ、また、他のコンセンサス配列又はモチーフ（本明細書で説明するＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフ以外）は、ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフであるという理解のもと、ＣＭＡ及びｅＭＩは、本開示を例示する目的で本明細書に記載される。

ＨＳＣ７０は、タンパク質上で例えばＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフなどのＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを認識し、これと結合して、シャペロン－タンパク質複合体を形成する。続いて、シャペロン－タンパク質複合体は、リソソーム関連膜タンパク質２Ａ型（ＬＡＭＰ－２Ａ）受容体に結合する。タンパク質は、アンフォールドして、ＬＡＭＰ－２Ａの多量体化をトリガする。アンフォールドしたタンパク質は、その後、Ｌａｍｐ－２Ａを介してリソソーム膜全体にわたり転座され、最終的に、転座タンパク質は、分解する。例えば、Ｋａｕｓｈｉｋｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ２２（８）：４０７－４１７（２０１２）を参照されたい。

組換えＣａｓ９タンパク質
本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、機能性Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、野生型Ｃａｓ９と比較して低減されたオフターゲット修飾を有する。「機能性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」とは、組換えＣａｓ９タンパク質が、Ｃａｓ９活性アッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質と少なくともほぼ同じレベルのヌクレアーゼ活性を有することを意味する。「機能性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」とは、組換えＣａｓ９が、Ｃａｓ９効率アッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質とほぼ同じレベルのオンターゲット修飾（すなわちゲノム編集効率）を有することも意味する。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９活性アッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９活性アッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも高いヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９活性アッセイの非限定例としては、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ及びＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（Ｖｏｕｉｌｌｏｔｅｔａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）５（３）：４０７－４１５（２０１５）で審査されている）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９効率アッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％のオンターゲット修飾を有する。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９効率アッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも高いオンターゲット修飾を有する。Ｃａｓ９効率アッセイの非限定例としては、ミスマッチ検出アッセイ及び配列決定に基づくアッセイが挙げられる（Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ３５：９５－１０４（２０１７）で審査されている）。

本明細書に記載される通り、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＣＭＡ又はｅＭＩの構成要素によって認識される。したがって、いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ又はｅＭＩの構成要素によって認識される。いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号２４～４１のいずれか１つである。したがって、いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）、ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）、ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）、ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）、ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）、ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）、ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）、ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）、ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）、ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）、ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）、ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）、ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）、ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）、ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）、ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）又はＮＫＫＦＥ（配列番号４１）である。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、アミノ酸配列ＮＫＫＦＥ（配列番号４１）を有する改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１の第１のアミノ酸残基の前にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１のアミノ酸残基１～１００にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１のアミノ酸残基１００～３００にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１のアミノ酸残基３００～７００にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１のアミノ酸残基７００～９００にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１のアミノ酸残基９００～１１００にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１のアミノ酸残基１１００～１３００にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、配列番号１の最後のアミノ酸残基の後にある。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質のＲＥＣローブ中にある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のＲＥＣローブは、ＢＨドメイン、Ｒｅｃ１ドメイン及びＲｅｃ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＲＥＣローブは、配列番号５のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＲＥＣローブのＲｅｃ１ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、Ｒｅｃ１ドメインは、配列番号９～１０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＲＥＣローブのＲｅｃ２ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、Ｒｅｃ２ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＲＥＣローブのＢＨドメイン中にある。いくつかの実施形態では、ＢＨドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質のＮＵＣローブ中にある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン及びＰＩドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＵＣローブは、配列番号６～７のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン又はＰＩドメイン中にある。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＲｕｖＣドメイン中にある。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣドメインは、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＨＮＨドメイン中にある。いくつかの実施形態では、ＨＮＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＰＩドメイン中にある。いくつかの実施形態では、ＰＩドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するローブを含む。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号６～７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するローブを含む。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＢＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号９～１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲｅｃ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲｅｃ２ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号１２～１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含むＣａｓ９タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は約１００％の同一性を有するＰＩドメインを含む。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域中にある。本明細書に記載される通り、表面露出領域とは、周辺環境にアクセス可能である、例えばタンパク質分解経路の構成要素にアクセス可能であるＣａｓ９タンパク質の領域を指す。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域は、Ｃａｓ９タンパク質のＲＥＣローブ中にある。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域は、Ｃａｓ９タンパク質のＮＵＣローブ中にある。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域は、Ｃａｓ９タンパク質のＲｅｃ１ドメイン、Ｒｅｃ２ドメイン、ＢＨドメイン、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン又はＰＩドメイン中にある。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域は、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸残基１５０～２５０の間にある。

いくつかの実施形態では、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端にある。本明細書に記載される通り、Ｎ末端は、タンパク質又はポリペプチドの「開始点」であり、Ｃ末端は、タンパク質又はポリペプチドの「終点」である。したがって、いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端「開始点」にある。いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端「終点」にある。いくつかの実施形態では、改変モチーフをタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加しても、タンパク質の折り畳み、構造又は動態に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９のＮ末端は、表面露出している。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９のＣ末端は、表面露出している。

いくつかの実施形態では、本開示は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質であって、アミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）標的モチーフ又はエンドソームミクロオートファジー（ｅＭＩ）標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する、組換えＣａｓ９タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも５０％急速に分解する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも８０％急速に分解する。

本明細書に記載される通り、ＣＭＡモチーフ又はｅＭＩモチーフを含有するタンパク質は、ＣＭＡ又はｅＭＩタンパク質分解経路の標的である。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを導入する１つ以上のアミノ酸修飾を含む本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ又はｅＭＩを介したタンパク質分解の標的となる。同様に、いくつかの実施形態では、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ又はｅＭＩを介したタンパク質分解の標的となる。

いくつかの実施形態では、ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを含む組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、免疫ブロッティング又はＧＦＰレポーターアッセイにより測定して、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に、少なくとも３０％急速に、少なくとも４０％急速に、少なくとも５０％急速に、少なくとも６０％急速に、少なくとも７０％急速に、少なくとも８０％急速に、少なくとも９０％急速に、少なくとも１００％急速に、少なくとも１５０％急速に、少なくとも２００％急速に、少なくとも５００％急速に分解する。いくつかの実施形態では、同じ細胞が、（ａ）ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを導入する１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９、及び（ｂ）野生型Ｃａｓ９を発現する場合、組換えＣａｓ９は、完全に分解される一方、野生型Ｃａｓ９の少なくとも５０％は、細胞内に依然として残る。同様に、いくつかの実施形態では、同じ細胞が、（ａ）ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを導入する１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９、及び（ｂ）ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質を発現する場合、組換えＣａｓ９は、完全に分解される一方、ＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質の少なくとも５０％は、細胞内に依然として残る。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９は、完全に分解される一方、野生型Ｃａｓ９又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％は、細胞内に依然として残る。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９は、細胞に導入してから１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内又は７２時間以内に完全に分解される。本明細書の実施形態で使用するとき、「完全に分解される」とは、ＧＦＰレポーターアッセイ又は免疫ブロッティング法の検出レベルを下回るタンパク質を指す。本明細書に記載される通り、タンパク質の分解速度を測定する方法としては、例えば、アミノ酸同位体のパルスチェイス（例えば、細胞培養又はＳＩＬＡＣにおけるアミノ酸を用いた安定同位体標識化）、合成後放射性同位元素標識化又は例えばＧＦＰをレポータータンパク質として使用するグローバルタンパク質安定性プロファイリング（ＧＰＳＰ）などのレポーター依存性アプローチが挙げられる（例えば、Ｙｅｗｄｅｌｌｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔ３５（５）：４５７－４６２（２０１１）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の分解速度は、例えば、免疫ブロットの濃度測定分析を用いて、異なる時点におけるＣａｓ９細胞中のタンパク質の量を定量化することと、経時的なタンパク質レベルをプロットすることと、Ｃａｓ９タンパク質レベル対時間プロットから分解速度を判定することとによって測定される。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｆ１８５における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｆ１８５Ｎである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ａ５４７及びＩ５４８における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ａ５４７Ｅ及びＩ５４８Ｌである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｔ５６０及びＶ５６１における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｔ５６０Ｅ及びＶ５６１Ｑである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｄ８２９及びＩ８３０における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｄ８２９Ｌ及びＩ８３０Ｒである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｌ１０８７及びＳ１０８８における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｌ１０８７Ｅ及びＳ１０８８Ｑである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｐ１１９９及びＫ１２００における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｐ１１９９Ｄ及びＫ１２００Ｑである。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、本明細書に記載した変異のいずれかの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される通り、組換えＣａｓ９タンパク質中の１つ以上のアミノ酸修飾は、１つ以上のＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフをもたらす。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｆ１８５における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｆ１８５Ｎである。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ａ５４７及びＩ５４８における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ａ５４７Ｅ及びＩ５４８Ｌである。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｔ５６０及びＶ５６１における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｔ５６０Ｅ及びＶ５６１Ｑである。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｄ８２９及びＩ８３０における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｄ８２９Ｌ及びＩ８３０Ｒである。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｌ１０８７及びＳ１０８８における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｌ１０８７Ｅ及びＳ１０８８Ｑである。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、配列番号１の位置Ｐ１１９９及びＫ１２００における変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｐ１１９９Ｄ及びＫ１２００Ｑである。

いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、本明細書に記載した変異のいずれかの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｆ１８５Ｎ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。

いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ａ５４７Ｅ、Ｉ５４８Ｌ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｔ５６０Ｅ、Ｖ５６１Ｑ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｄ８２９Ｌ、Ｉ８３０Ｒ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸修飾としては、Ｌ１０８７Ｅ、Ｓ１０８８Ｑ、Ｐ１１９９Ｄ、Ｋ１２００Ｑ及びこれらの組み合わせから選択される変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質中の１つ以上のアミノ酸修飾は、１つ以上のＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフをもたらす。ＣＭＡ標的モチーフ及びｅＭＩ標的モチーフは、本明細書で説明される。

いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であり、本明細書に記載される１つ以上のアミノ酸修飾を含むアミノ酸配列を有する。

本明細書に記載される通り、ＨＳＣ７０は、ＣＭＡ及びｅＭＩタンパク質分解経路の両方におけるシャペロンタンパク質である。ＨＳＣ７０は、分解の標的であるタンパク質に結合し、タンパク質を分解のためにリソソーム（ＣＭＡの場合）又は後期エンドソーム（ｅＭＩの場合）に輸送する。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＣ７０に対してより高い結合親和性を有するタンパク質は、ＨＳＣ７０に対してより低い結合親和性を有するタンパク質と比較して急速に分解する。いくつかの実施形態では、タンパク質の結合能及び／又はＨＳＣ７０に対する親和性は、タンパク質上のＣＭＡ又はｅＭＩ標的モチーフ、例えばＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフの存在によって判定される。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、ＨＳＣ７０に結合することが可能である。本明細書で説明及び例示される通り、野生型Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質は、ＨＳＣ７０に結合しない。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％高い親和性でＨＳＣ７０に結合することが可能である。タンパク質間の結合親和性を判定する方法は、当技術分野で既知であり、例えば共免疫沈降法、蛍光蛋白質再構成法、アフィニティー電気泳動法、プルダウンアッセイ法、ファージディスプレイ法、インビボ架橋法、タンデムアフィニティー精製、架橋後質量分析法及び近接ライゲーションアッセイなどの生化学的方法；生体層干渉法、動的光散乱法、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法及び等温滴定熱量法などの生物物理学方法；並びに／又は酵母ツーハイブリッドスクリーニング法及び細菌ツーハイブリッドスクリーニング法などの遺伝的方法を含む。結合親和性の測定及びタンパク質相互作用の検出方法の概要に関しては、例えば、ＭｅｙｅｒｋｏｒｄａｎｄＦｕ，Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ２ｎｄＥｄ．２０１５，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓを参照されたい。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９は、ＨＳＣ７０を用いたインキュベーション期間後にＨＳＣ７０抗体によって検出されることが可能である一方、野生型Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質は、同じインキュベーション期間後にＨＳＣ７０抗体によって検出されない。

いくつかの実施形態では、ＨＳＣ７０と組換えＣａｓ９との間の結合親和性は、ＨＳＣ７０と野生型Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質との間の結合親和性よりも少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、少なくとも５００倍高い又は少なくとも１０００倍高い。

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）を提供する。

本明細書に記載される通り、配列番号１は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）のアミノ酸配列を含む。配列番号１のアミノ酸位置１８５は、ＳｐＣａｓ９のＲｅｃ２ドメインに対応する領域中にある。いくつかの実施形態では、配列番号１の位置１８５におけるアミノ酸残基は、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを生成するために修飾される。いくつかの実施形態では、配列番号１の位置１８５におけるＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮである。いくつかの実施形態では、組換えＳｐＣａｓ９タンパク質は、配列番号１の位置１８５に変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｆ１８５Ｎである。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９は、配列番号１の位置Ｄ１０及び／又はＨ８４０における変異を更に含む。野生型Ｃａｓ９の位置Ｄ１０及び／又はＨ８４０における変異は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を生成し、これは、本明細書では「Ｃａｓ９ニッカーゼ」とも称される。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを開裂させ得る（すなわちＤＮＡを「ニッキングする」）。Ｃａｓ９ニッカーゼは、例えばＣｈｏｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ２４：１３２－１４１（２０１３）で説明される。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置Ｄ１０における変異を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置Ｈ８４０における変異を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置Ｄ１０に変異及びアミノ酸位置Ｈ８４０における変異を更に含む。いくつかの実施形態では、位置Ｄ１０における変異は、Ｄ１０Ａである。いくつかの実施形態では、位置Ｄ１０における変異は、Ｄ１０Ｎである。いくつかの実施形態では、位置Ｈ８４０における変異は、Ｈ８４０Ａである。いくつかの実施形態では、位置Ｈ８４０における変異は、Ｈ８４０Ｎである。いくつかの実施形態では、位置Ｈ８４０における変異は、Ｈ８４０Ｙである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異及びＤ１０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異及びＤ１０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｆ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、粘着末端を生成する。本明細書に記載される通り、粘着末端とは、不均等な長さの鎖を有する核酸フラグメントを指す。いくつかの実施形態では、粘着末端を生成する組換えＣａｓ９タンパク質は、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異及びＤ１０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異及びＤ１０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ａ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ａ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｎ変異を有する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９－ＦｏｋＩハイブリッドタンパク質は、Ｃａｓ９中にＦ１８５Ｎ変異、Ｄ１０Ｎ変異及びＨ８４０Ｙ変異を有する。

いくつかの実施形態では、粘着末端を生成する組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質上において、粘着末端を生成することが可能な改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、粘着末端を生成することが可能な野生型Ｃａｓ９タンパク質は、フランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）から単離される（ＦｎＣａｓ９）（配列番号２３）。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号２３と少なくとも約９０％配列同一性のアミノ酸配列を有し、また本明細書に記載される改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号２３と少なくとも約９０％配列同一性のアミノ酸配列を有し、またＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９は、配列番号２３と少なくとも約９０％配列同一性のアミノ酸配列を有し、野生型Ｃａｓ９よりも高い親和性でＨＳＣ７０に結合することが可能である。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９は、配列番号２３と少なくとも約９０％配列同一性のアミノ酸配列を有し、野生型Ｃａｓ９よりも急速に分解する。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９は、１つ以上の核局在化シグナルを含む。「核局在化シグナル」又は「核局在化配列」（ＮＬＳ）は、核輸送による細胞核中への輸送のためにタンパク質を「タグ付けする」アミノ酸配列であり、すなわち、ＮＬＳを有するタンパク質は、細胞核中に輸送される。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上で露出される正電荷Ｌｙｓ又はＡｒｇ残基を含む。例示的な核局在化配列としては、ＳＶ４０ラージＴ－抗原、核質、ＥＧＬ－１３、ｃ－Ｍｙｃ及びＴＵＳ－タンパク質由来のＮＬＳが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４２）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号４３）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号４４）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号４５）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号４６）を含む。他の核局在化配列としては、ｈｎＲＮＰＡ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写抑制因子Ｍａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ（配列番号４７）及びＰＹ－ＮＬＳが挙げられるが、これらに限定されない。

ヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、アミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する、ポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、野生型Ｃａｓ９タンパク質中に１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む、ポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＳＣ７０に結合することが可能な組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも５０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも６０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列は、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ｓｔｉＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列は、動物細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒト細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列は、植物細胞中での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、組換え又は異種タンパク質発現の収量及び効率を増加させるためにその発現を宿主のｔＲＮＡ存在量にマッチさせるようにコドンを調整することである。コドン最適化法は、当技術分野における定型作業であり、ソフトウェアプログラム、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツール、ＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎのＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＴａｂｌｅ分析ツール、ＧＥＮＥＭＡＫＥＲのＢｌｕｅＨｅｒｏｎソフトウェア、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅＦｏｒｇｅソフトウェア、ＤＮＡＢｕｉｌｄｅｒソフトウェア、ＧｅｎｅｒａｌＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア、公的に利用可能なＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅアルゴリズムなどを使用して実施することができる。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される組換えＣａｓ９タンパク質と、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質としては、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフが挙げられる。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質中に１つ以上のアミノ酸修飾を含み、組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離されており（ＳｐＣａｓ９）、配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、ＨＳＣ７０と結合することが可能である。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離されており（ＳｐＣａｓ９）、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に連結された調節エレメントと、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供する。

いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のポリヌクレオチドは、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む組換えＣａｓ９をコードする。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のポリヌクレオチドは、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質をコードし、アミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のポリヌクレオチドは、野生型Ｃａｓ９タンパク質中に１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質をコードし、組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のポリヌクレオチドは、配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）をコードする。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のポリヌクレオチドは、ＨＳＣ７０と結合することが可能な組換えＣａｓ９タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）をコードする。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と結合した調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、細菌プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、真核生物調節エレメント、すなわち真核生物プロモーターである。いくつかの実施形態では、真核生物調節エレメントは、哺乳動物プロモーターである。

いくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成成分に結合し、それらを標的ＤＮＡ内の特異的位置に標的化するＲＮＡ分子は、本明細書において「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」又は「小分子ガイドＲＮＡ」と称され、本明細書において「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」と称することもできる。ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント、すなわち少なくとも１つの「ＤＮＡ結合セグメント」及び少なくとも１つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」とは、分子の一部、セクション又は領域、例えばガイドポリヌクレオチド分子のヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。「セグメント」の定義は、特に具体的に定義されない限り、特定数の合計塩基対に限定されない。

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメント（又は「ＤＮＡ標的化配列」）は、細胞中の標的配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントは、標的ＤＮＡ内で特定の配列に対して相補的なポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のガイドポリヌクレオチドは、細菌細胞中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を有する。方法のいくつかの実施形態では、標的配列は、細菌細胞中にある。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、実験室株である。こうした細胞の例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｖ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ．サブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．クレセンタス（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、Ｍ．ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ａ．フィシェリ（Ａ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ａ．ビネランジイ（Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、食料及び／又は飲料の調製に用いられる細菌からなる。こうした細胞の非限定的な例示の属としては、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、グルコナセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、Ｋｏｃｕｒｉａ（コクリア）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｌ．アセトトレランス（Ｌ．ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｌ．アシジピスシス（Ｌ．ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アリメンタリウス（Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブチエリ（Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ヒルガルジイ（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．キムチイ（Ｌ．ｋｉｍｃｈｉｉ）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びＬ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）を含む）リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）及びザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本開示のガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を有する。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト、又はげっ歯類、又はウシ細胞系、又は細胞株である。このような細胞、細胞系又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫＪｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞株である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＦＵＴ８ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴＣＨＯＫ１ＳＶ（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞は、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えばＥＢＸ細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３などでもあり得る。

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、多能性幹細胞、例として、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。

いくつかの実施形態では、真核細胞は、肝細胞、例えばヒト肝細胞、動物肝細胞又は非実質細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（例として、１０－ドナー及び２０－ドナープール肝細胞）、ヒト肝臓クッパー細胞、ヒト肝臓星細胞、イヌ肝細胞（例として、単一及びプールビーグル肝細胞）、マウス肝細胞（例として、ＣＤ－１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞）、ラット肝細胞（例として、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、ＷｉｓｔａｒＨａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞）、サル肝細胞（例として、カニクイザル又はアカゲザル肝細胞）、ネコ肝細胞（例として、ドメスティックショートヘア肝細胞）及びウサギ肝細胞（例として、ニュージーランドホワイト肝細胞）であり得る。

いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、作物植物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はイネのものであり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜のものであり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物のもの又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実若しくは野菜のものであり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば柑橘樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；堅果樹木、例えばアーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス属の植物、例えばジャガイモ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどのものであり得る。

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約５～約５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約６～約４５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約７～約４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約８～約３５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約９～約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１０～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１２～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１４～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１６～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１８～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約５～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約６～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約７～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約８～約１０ヌクレオチドである。ガイド配列の長さは、例えば、ＣＲＩＳＰＲＤｅｓｉｇｎＴｏｏｌ（Ｈｓｕｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１（９）：８２７－８３２（２０１３））、ａｍｐｌｉＣａｎ（Ｌａｂｕｎｅｔａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ２０１８，ｄｏｉ：１０．１１０１／２４９４７４）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ（Ａｌａｃｈｅｔａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ２０１４，ｄｏｉ：１０．１１０１／００５０７４）、ＣＨＯＰＣＨＯＰ（Ｌａｂｕｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２０１６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３９８）などのガイド配列の設計ツールを用いて、当業者によって判定され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、ポリペプチド結合配列／セグメントを含む。ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、本開示のＣａｓタンパク質のポリヌクレオチド結合ドメインと相互作用する。こうしたポリペプチド結合セグメント又は配列、例えばその開示全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、同第２０１４／０２７３０３７号明細書、同第２０１４／０２７３２２６号明細書、同第２０１４／０２９５５５６号明細書、同第２０１４／０２９５５５７号明細書、同第２０１４／０３４９４０５号明細書、同第２０１５／００４５５４６号明細書、同第２０１５／００７１８９８号明細書、同第２０１５／００７１８９９号明細書及び同第２０１５／００７１９０６号明細書に開示されるものは、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、Ｃａｓ９に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、本明細書で提供される組換えＣａｓ９タンパク質に結合する。

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、１５、２０、２５又は３０ヌクレオチド且つ最大で約２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約１０～約１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約２０～約１２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約３０～約１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約４０～約８０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約５０～約６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約１０～約３５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約１５～約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約２０～約２５ヌクレオチドである。

ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、単離分子、例えばＲＮＡ分子として標的細胞中に導入することができるか、又はガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用して細胞中に導入する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドポリヌクレオチドは、ダイレクトリピート配列に連結されている。ダイレクトリピート又はＤＲ配列は、非反復配列（スペーサー）の短鎖ストレッチが介在しているＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の反復配列のアレイである。スペーサー配列は、標的配列上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を標的化する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の非コード部分（すなわちガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ）が転写される場合、転写産物は、ＤＲ配列において個々のスペーサー配列を含有する短鎖ｃｒＲＮＡに開裂され、それがＣａｓ９ヌクレアーゼをＰＡＭに指向する。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、核酸によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ガイドポリヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列に結合している。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、二次構造を含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、１０～２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、少なくとも１６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、少なくとも１６ヌクレオチドであり、単一のステムループを含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ＲＮＡアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＲの二次構造又はステムループは、開裂のためのヌクレアーゼにより認識される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＩＩＩである。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又はトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡ又はプレＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡとのＲＮＡ二本鎖を形成し、次いでＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＲＮアーゼＩＩＩにより開裂されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９タンパク質を活性化させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びダイレクトリピート配列は、単一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ヒト発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、植物発現ベクターである。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びダイレクトリピート配列は、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、ヒト発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、植物発現ベクターである。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９とガイドポリヌクレオチドとの複合体は、天然に生じない。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の送達に関する様々な方法が当技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、送達粒子によって送達される。送達粒子は、粒子を含む生物送達系又は配合物である。本明細書に定義される「粒子」とは、約１００ミクロン（μｍ）の最大直径を有する実体である。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０μｍの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２０００ナノメートル（ｎｍ）の最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０００ｎｍの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約９００ｎｍ、約８００ｎｍ、約７００ｎｍ、約６００ｎｍ、約５００ｎｍ、約４００ｎｍ、約３００ｎｍ、約２００ｎｍ又は約１００ｎｍの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２５ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約７５ｎｍ～約１００ｎｍの直径を有する。

送達粒子は、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない任意の形態で提供され得る：固体、半固体、エマルション又はコロイド粒子。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベース系、リポソーム、ミセル、マイクロベシクル、エキソソーム又は遺伝子銃である。いくつかの実施形態では、送達粒子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含み、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。

いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質、糖、金属又はタンパク質を更に含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質エンベロープである。脂質エンベロープ又は脂質を含む送達粒子を用いたｍＲＮＡの送達は、例えば、Ｓｕｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ８（３）：７７４－７８４（２０１１）に記載されている。いくつかの実施形態では、送達粒子は、糖ベース粒子、例えばＧａｌＮＡｃである。糖ベース粒子は、国際公開第２０１４／１１８２７２号パンフレット及びＮａｉｒｅｔａｌ．，ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ１３６（４９）：１６９５８－１６９６１（２０１４）に記載されている。

いくつかの実施形態では、送達粒子は、ナノ粒子である。本開示に包含されるナノ粒子は、様々な形態において、例えば固体ナノ粒子（例えば、金属、例えば銀、金、鉄、チタン）、非金属、脂質ベース固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液又はそれらの組合せとして提供することができる。金属、誘電体及び半導体ナノ粒子並びにハイブリッド構造（例えば、コア－シェルナノ粒子）を調製することができる。半導体材料製のナノ粒子は、それらが電子エネルギーレベルの量子化が生じるほど十分に小さい場合（典型的には１０ｎｍ未満）、標識量子ドットであり得る。このようなナノスケール粒子は、生物医学用途において薬物担体又はイメージング剤として使用され、本開示における類似の目的に適合させることができる。

送達粒子の調製は、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書及び同第２０１３／０３０２４０１号明細書並びに米国特許第５，５４３，１５８号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，８９５，３０９号明細書、同第６，００７，８４５号明細書及び同第８，７０９，８４３号明細書に更に記載されている。

いくつかの実施形態では、ベシクルは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。「ベシクル」は、脂質二重層により封入される流体を有する細胞内の小型構造である。いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ベシクルにより送達される。いくつかの実施形態では、ベシクルは、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含み、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。いくつかの実施形態では、ベシクルは、組換えＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、組換えＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。いくつかの実施形態では、ベシクルは、エキソソームである。いくつかの実施形態では、エキソソームを使用して本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達し得る内因性ナノベシクル（すなわち約３０～約１００ｎｍの直径を有する）である。外因性生物材料を標的器官に送達するための改変エキソソームは、例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：３４１（２０１１）、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ７：２１１２－２１１６（２０１２）及びＷａｈｌｇｒｅｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ４０（１７）：ｅ１３０（２０１２）によって説明されている。

いくつかの実施形態では、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むベシクルは、リポソームである。いくつかの実施形態では、リポソームを使用して本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を送達する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状ベシクル構造であり、栄養及び医薬物の投与用ビヒクルとして使用することができる。リポソームは、リン脂質、特にホスファチジルコリンから構成されることが多いが、他の脂質、例えば卵ホスファチジルエタノールアミンからも構成される。リポソームの型としては、限定されるものではないが、マルチラメラベシクル、スモールユニラメラベシクル、ラージユニラメラベシクル及び渦巻き型ベシクルが挙げられる。例えば、ＳｐｕｃｈａｎｄＮａｖａｒｒｏ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ４６９６７９（２０１１）を参照されたい。生物材料、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成成分を送達するためのリポソームは、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３（８）：１００２－１００７（２００５）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ４４１：１１１－１１４（２００６）及びＬｉｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１９：７７５－７８０（２０１２）によって説明されている。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ウイルスベクターにより送達される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含み、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスのものである。ウイルスベクターの例は、本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／又はレンチウイルスは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のエレメントを含むウイルスベクターとして使用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ウイルスベクターにより形質導入された細胞により細胞内で発現される。

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質及び方法は、エクスビボ遺伝子編集、例えばＣＡＲ－Ｔ型療法において使用される。これらの実施形態は、ヒトドナーからの細胞の修飾を含み得る。これらの例では、ウイルスベクターを使用することもできるが、Ｃａｓ９タンパク質を（インビトロ転写ガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡと共に）培養細胞中に直接形質移入する追加の選択肢も存在する。

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、組換えＣａｓ９タンパク質の他に約又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。Ｃａｓ９融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列及び必要に応じて任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。組換えＣａｓ９タンパク質に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：エピトープ標識、レポーター遺伝子配列及び以下の活性の１つ以上を有するタンパク質ドメイン：メチラーゼ酵素活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性及び核酸結合活性。エピトープ標識の非限定例としては、以下のものが挙げられる：ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、Ｖ５標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ－Ｇ標識及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子と結合するか、又は他の細胞分子と結合するタンパク質又はタンパク質のフラグメントと融合し、これには以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－標識、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン及び単純ヘルペス（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質。Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインについては、米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、標識された組換えＣａｓ９タンパク質を使用して標的配列の位置を同定する。

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９タンパク質は、誘導性系の構成成分を形成し得る。系の誘導性は、エネルギーの形態を使用する遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間制御を可能とする。エネルギーの形態としては、以下のものが挙げられ得るが、これらに限定されない：電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギー。誘導性系の非限定例としては、以下のものが挙げられる：テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列特異的に転写活性の変化を指向するための光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部である。光の構成成分としては、Ｃａｓ９タンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）からのもの）及び転写活性化／抑制ドメインが挙げられ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらの使用方法の更なる例は、国際特許出願公開の国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び同第２０１４／０９３６３５号パンフレット；米国特許第８，８８９，４１８号明細書及び同第８，８９５，３０８号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号明細書、同第２０１４／０２４２７００号明細書、同第２０１４／０２７３２３４号明細書及び同第２０１４／０３３５６２０号明細書に提供されている。

部位特異的修正の方法
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞のゲノム中の標的配列において部位特異的修飾を提供する方法であって、本明細書に記載される非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を細胞中に導入することを含む方法を提供する。

方法のいくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質としては、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフが挙げられる。方法のいくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含み、アミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する。方法のいくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質中に１つ以上のアミノ酸修飾を含み、組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む。方法のいくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離されており（ＳｐＣａｓ９）、配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む。方法のいくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、ＨＳＣ７０と結合することが可能である。方法のいくつかの実施形態では、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離されており（ＳｐＣａｓ９）、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む。

標的配列の「修飾」は、核酸の単一ヌクレオチド置換、複数ヌクレオチド置換、挿入（すなわちノックイン）及び欠失（すなわちノックアウト）、フレームシフト突然変異及び他の核酸修飾を包含する。

方法のいくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の少なくとも一部の欠失である。標的配列は、２つの異なる部位において開裂させ、相補的粘着末端を生成することができ、相補的粘着末端を再ライゲートさせ、それによりその２つの部位間の配列部分を除去することができる。

方法のいくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の変異である。部位特異的突然変異誘発は、目的突然変異を含有する外因性ポリヌクレオチドテンプレート（「ドナーポリヌクレオチド」又は「ドナーベクター」とも呼ばれる）の相同組換えを促進する部位特異的ヌクレアーゼの使用により達成され得る。いくつかの実施形態では、目的配列（ＳｏＩ）は、目的突然変異を含む。

方法のいくつかの実施形態では、修飾は、標的配列中への目的配列（ＳｏＩ）の挿入である。ＳｏＩは、外因性ポリヌクレオチドテンプレートとして導入することができる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、粘着末端を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、標的配列中の粘着末端に相補的な粘着末端を含む。

外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、任意の好適な長さ、例えば約又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００又は１０００以上のヌクレオチド長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、最適にアラインされる場合、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００以上のヌクレオチド）と重複する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドテンプレート及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされる場合、外因性ポリヌクレオチドテンプレートの最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１００、１５００、２０００、２５００、５０００、１００００以上のヌクレオチド以内に存在する。

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ片、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲフラグメント、ネイキッド核酸又は送達ビヒクル、例えばリポソームと複合体化している核酸などである。

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用して標的配列中に挿入される。内因性ＤＮＡ修復経路としては、ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ及びＨＤＲが挙げられ、これらは、それぞれ本明細書で説明される。修復プロセス中、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートを標的配列中に導入することができる。いくつかの実施形態では、上流配列及び下流配列によりフランキングされたＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートを細胞中に導入し、上流及び下流配列は、標的配列中の組込みの部位のいずれかの側と配列類似性を共有する。いくつかの実施形態では、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性又は外因性である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は非コード配列、例えばマイクロＲＮＡなどを含む。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、調節エレメントに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、調節エレメントである。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、耐性カセット、例えば抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、野生型標的配列の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、フレームシフト突然変異又はヌクレオチド置換を作出することにより標的配列を破壊又は補正する。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、マーカーを含む。標的配列中へのマーカーの導入は、標的化組込みのスクリーニングを容易にし得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、制限部位、蛍光タンパク質又は選択マーカーである。いくつかの実施形態では、ＳｏＩは、ＳｏＩを含むベクターとして導入される。

外因性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流及び下流配列は、標的配列及び外因性ポリヌクレオチド間の相同組換えを促進するように選択される。上流配列は、組込みのための標的部位の上流の配列（すなわち標的配列）との配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組込みのための標的化部位の下流の配列との配列類似性を共有する核酸配列である。したがって、いくつかの実施形態では、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、上流及び下流配列において相同組換えにより標的配列中に挿入する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流及び下流配列は、標的化ゲノム配列の上流及び下流配列とそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、上流又は下流配列は、少なくとも約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は５００の塩基対、且つ最大で約６００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０又は２０００の塩基対を有する。いくつかの実施形態では、上流又は下流配列は、約２０～２０００の塩基対、又は約５０～１７５０の塩基対、又は約１００～１５００の塩基対、又は約２００～１２５０の塩基対、又は約３００～１０００の塩基対、又は約４００～約７５０の塩基対、又は約５００～６００の塩基対を有する。いくつかの実施形態では、上流又は下流配列は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約１００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０又は約２５００の塩基対を有する。

方法のいくつかの実施形態では、標的配列中の修飾は、細胞中の標的配列の発現の不活性化である。例えば、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体の結合時、標的配列は不活性化され、その結果、その配列は、転写されず、コードされるタンパク質は、産生されず、且つ／又は配列は、その野生型配列が機能するように機能しない。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列は、不活性化され得、その結果、タンパク質は、産生されない。

いくつかの実施形態では、調節配列は、それが調節配列としてもはや機能しないように不活性化させることができる。調節配列の例としては、本明細書に記載のプロモーター、転写終結因子、エンハンサー及び他の調節エレメントが挙げられる。不活性化標的配列としては、欠失突然変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの挿入）又はナンセンス突然変異（すなわち終止コドンが導入されるような別のヌクレオチドでの単一ヌクレオチドの置換）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、標的配列の不活性化は、標的配列の「ノックアウト」をもたらす。

本明細書で提供される組換えＣａｓ９を含む方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、野生型Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９と比較して少なくとも約５０％だけ低減される。本明細書に記載される通り、オフターゲット修飾は、例えば、意図されたものではない点突然変異、欠失、挿入、逆位及び転座など、非特異的且つ意図されたものではない遺伝子修飾である。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、分解速度がより速いため、細胞中のオフターゲッティングが低減する。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９の細胞利用可能性がより低いため、細胞中のオフターゲッティングが低減する。いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９に対する細胞の暴露時間がより短いため、細胞中のオフターゲッティングが低減する。

本明細書で提供される組換えＣａｓ９を含む方法のいくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９と比較して、オフターゲット修飾は、低減し、オンターゲット修飾は、少なくともほぼ同じレベルである。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９のオンターゲット修飾は、野生型Ｃａｓ９のオンターゲット修飾の少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、少なくとも約１％、少なくとも約０．５％以内である。本明細書で提供される組換えＣａｓ９を含むいくつかの実施形態では、野生型Ｃａｓ９と比較して、オフターゲット修飾は、低減し、オンターゲット修飾は、増加する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９のオンターゲット修飾は、野生型Ｃａｓ９よりも少なくとも約５％高い、少なくとも約１０％高い、少なくとも約１１％高い、少なくとも約１２％高い、少なくとも約１３％高い、少なくとも約１４％高い、少なくとも約１５％高い、少なくとも約１６％高い、少なくとも約１７％高い、少なくとも約１８％高い、少なくとも約１９％高い又は少なくとも約２０％高い。

いくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、野生型Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％又は少なくとも約２００％だけ低減される。

本明細書で提供される組換えＣａｓ９を含む方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、野生型Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍又は少なくとも約１０００倍低減される。

方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを有する組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の全修飾の約５％未満である。方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを有する組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の全修飾の約２％未満である。方法のいくつかの実施形態では、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを有する組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の全修飾の約１％未満である。本明細書に記載される通り、野生型Ｃａｓ９によるオフターゲット修飾は、野生型Ｃａｓ９によるゲノム中の全修飾の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％であり得る。いくつかの実施形態では、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを有する組換えＣａｓ９によるオフターゲット修飾は、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを有する組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の全修飾の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満、約０．５％未満又は約０．１％未満である。オフターゲット修飾の量は、ガイドポリヌクレオチドの配列及び標的ゲノム遺伝子座に応じて変化し得る。一般に、同じガイドポリヌクレオチドを用いる場合、ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを有する組換えＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９と比較してオフターゲット修飾が低減する。

方法のいくつかの実施形態では、標的配列は、細菌細胞中にある。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、実験室株である。こうした細胞の例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｖ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ．サブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．クレセンタス（Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、Ｍ．ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、Ａ．フィシェリ（Ａ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ａ．ビネランジイ（Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、食料及び／又は飲料の調製に用いられる細菌からなる。こうした細胞の非限定的な例示の属としては、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、グルコナセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、Ｋｏｃｕｒｉａ（コクリア）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｌ．アセトトレランス（Ｌ．ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｌ．アシジピスシス（Ｌ．ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アリメンタリウス（Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブチエリ（Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ヒルガルジイ（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．キムチイ（Ｌ．ｋｉｍｃｈｉｉ）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びＬ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）を含む）リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）及びザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

方法のいくつかの実施形態では、標的細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト、又はげっ歯類、又はウシ細胞系、又は細胞株である。このような細胞、細胞系又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫＪｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞株である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＦＵＴ８ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴＣＨＯＫ１ＳＶ（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞は、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えばＥＢＸ細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３などでもあり得る。

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、多能性幹細胞、例として胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、誘発された多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。

方法のいくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメントは、細胞中の標的配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントは、標的ＤＮＡ内で特定の配列に対して相補的なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、細菌細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、真核細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、哺乳動物細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、ヒト細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、多能性幹細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、誘発された多能性幹細胞中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、植物細胞で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０ヌクレオチド及び最大で約２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約５～約５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約６～約４５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約７～約４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約８～約３５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約９～約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１０～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１２～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１４～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１６～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１８～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約５～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約６～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約７～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約８～約１０ヌクレオチドである。ガイド配列の長さは、本明細書に記載されるガイド配列の設計ツールを用いて当業者によって判定され得る。

方法のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、送達粒子、ベシクル又はウイルスベクターを介して細胞に導入される。方法のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、送達粒子を介して細胞中に導入される。方法のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ベシクルを介して細胞中に導入される。方法のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ベクターを介して細胞中に導入される。方法のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ウイルスベクターを介して細胞中に導入される。方法のいくつかの実施形態では、組換えＣａｓ９を含む複合体の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター上に導入される。送達粒子、ベシクル、ベクター、ウイルスベクター及び細胞への送達方法（例えば、ベクターのトランスフェクション）の例を本明細書で提供する。

本明細書に引用される全ての参考文献、例えば特許、特許出願、論文、教科書など、及びそれらに引用される参考文献は、それらが依然として引用されていない限りに、その全体が参照により本明細書に援用される。

追加の例示的実施形態
実施形態１は、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む組換えＣａｓ９タンパク質である。

実施形態２は、実施形態１の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）、ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）、ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）、ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）、ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）、ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）、ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）、ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）、ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）、ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）、ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）、ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）、ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）、ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）、ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）、ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）、ＮＫＫＦＥ（配列番号４１）及びこれらの組み合わせから選択される。

実施形態３は、実施形態１又は２の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。

実施形態４は、実施形態１の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質のＲＥＣローブ中にある。

実施形態５は、実施形態２の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＲＥＣローブのＲｅｃ２ドメイン中にある。

実施形態６は、実施形態１の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質のＨＮＨドメイン、ＲｕｖＣドメイン又はＰＩドメイン中にある。

実施形態７は、実施形態１～４のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域中にある。

実施形態８は、実施形態１～６のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、組換えＣａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端にある。

実施形態９は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質であり、アミノ酸修飾は、Ｃａｓ９タンパク質中にシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）標的モチーフ又はエンドソームミクロオートファジー（ｅＭＩ）標的モチーフを導入し、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも２０％急速に分解する。

実施形態１０は、実施形態９の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも５０％急速に分解する。

実施形態１１は、実施形態９又は１０の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、組換えＣａｓ９タンパク質は、インビボで、野生型Ｃａｓ９タンパク質又はＣＭＡ若しくはｅＭＩ標的モチーフを含まないＣａｓ９タンパク質よりも少なくとも８０％急速に分解する。

実施形態１２は、野生型Ｃａｓ９タンパク質中に１つ以上のアミノ酸修飾を含む組換えＣａｓ９タンパク質であり、組換えＣａｓ９タンパク質は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフを含む。

実施形態１３は、実施形態９～１２のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフは、ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）、ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）、ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）、ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）、ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）、ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）、ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）、ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）、ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）、ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）、ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）、ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）、ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）、ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）、ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）、ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）、ＮＫＫＦＥ（配列番号４１）及びこれらの組み合わせから選択される。

実施形態１４は、実施形態１３の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。

実施形態１５は、実施形態９～１４のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、１つ以上のアミノ酸置換は、組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域中にある。

実施形態１６は、配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）を含む。

実施形態１７は、実施形態９～１６のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、アミノ酸修飾は、以下の変異：Ｆ１８５Ｎ；Ａ５４７Ｅ／Ｉ５４８Ｌ；Ｔ５６０Ｅ／Ｖ５６１Ｑ；Ｄ８２９Ｌ／Ｉ８３０Ｒ；Ｌ１０８７Ｅ／Ｓ１０８８Ｑ；又はＰ１１９９Ｄ／Ｋ１２００Ｑの１つ以上を含む。

実施形態１８は、実施形態９～１７のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、アミノ酸修飾は、Ｆ１８５における変異である。

実施形態１９は、実施形態１８の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、変異は、Ｆ１８５Ｎである。

実施形態２０は、実施形態１６～１９のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、アミノ酸修飾は、ＣＭＡ標的モチーフ又はｅＭＩ標的モチーフをもたらす。

実施形態２１は、実施形態９～２０のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含み、組換えＣａｓ９タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一である。

実施形態２２は、７０ｋＤの熱ショック同族タンパク質（ＨＳＣ７０）に結合することが可能な組換えＣａｓ９タンパク質である。

実施形態２３は、配列番号１のアミノ酸位置１８５に改変ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＳｐＣａｓ９）から単離された組換えＣａｓ９タンパク質である。

実施形態２４は、実施形態２３の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、ＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である。

実施形態２５は、配列番号１の位置Ｄ１０、Ｈ８４０又はこれらの組み合わせにおける変異を更に含む、実施形態１～２４のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含む。

実施形態２６は、実施形態２５の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、変異は、Ｄ１０Ａ又はＤ１０Ｎ；Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｎ又はＨ８４０Ｙ及びこれらの組み合わせから選択される。

実施形態２７は、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の組換えＣａｓ９タンパク質を含み、組換えＣａｓ９タンパク質は、粘着末端を生成する。

実施形態２８は、１つ以上の核局在化シグナルを更に含む、実施形態１～２７のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質を含む。

実施形態２９は、実施形態１～２８のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。

実施形態３０は、実施形態２９のポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列は、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている。

実施形態３１は、実施形態１～２８のいずれか１つの組換えＣａｓ９タンパク質と、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。

実施形態３２は、実施形態２９又は３０のポリヌクレオチド配列と、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列とを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。

実施形態３３は、実施形態２９又は３０のポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された調節エレメントと、組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドとを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。

実施形態３４は、実施形態３１～３３のいずれか１つの系を含み、ガイド配列は、ダイレクトリピート配列に連結されている。

実施形態３５は、実施形態３１～３４のいずれか１つの系を含み、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。

実施形態３６は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドを更に含む、実施形態３１～３４のいずれか１つの系を含む。

実施形態３７は、実施形態３１～３５のいずれか１つの系を含み、組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びガイドポリヌクレオチドは、単一のベクター上にある。

実施例３８は、実施形態３６の系を含み、組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、単一のベクター上にある。

実施形態３９は、実施形態３１～３８のいずれか１つの系を含む送達粒子である。

実施形態４０は、実施形態３１～３８のいずれか１つの系を含むベシクルである。

実施形態４１は、実施形態４０のベシクルを含み、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。

実施形態４２は、実施形態３１～３８のいずれか１つの系を含むウイルスベクターである。

実施形態４３は、実施形態４２のウイルスベクターを含み、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスのものである。

実施形態４４は、細胞のゲノム中の標的配列において部位特異的修飾を提供する方法であって、実施形態３１～３８のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を細胞中に導入することを含む方法である。

実施形態４５は、実施形態４４の方法を含み、修飾は、標的配列の少なくとも一部の欠失を含む。

実施形態４６は、実施形態４４の方法を含み、修飾は、標的配列の変異を含む。

実施例４７は、実施形態４４の方法を含み、修飾は、目的配列（ＳｏＩ）を標的配列において挿入することを含む。

実施形態４８は、実施形態４４～４７のいずれか１つの方法を含み、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の修飾の約５％未満である。

実施形態４９は、実施形態４４～４８のいずれか１つの方法を含み、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の修飾の約２％未満である。

実施形態５０は、実施形態４４～４９のいずれか１つの方法を含み、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、組換えＣａｓ９によってなされるゲノム中の修飾の約１％未満である。

実施形態５１は、実施形態４４～５０のいずれか１つの方法を含み、細胞のゲノム中のオフターゲット修飾は、野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９と比較して少なくとも約５０％だけ低減される。

実施形態５２は、実施形態４４～５１のいずれか１つの方法を含み、細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である。

実施形態５３は、実施形態５２の方法を含み、細胞は、ヒト細胞である。

実施形態５４は、実施形態５３の方法を含み、細胞は、多能性幹細胞である。

実施形態５５は、実施形態５４の方法を含み、細胞は、誘発された多能性幹細胞である。

実施形態５６は、実施形態４４～５５のいずれか１つの方法を含み、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、細胞のゲノム中で標的配列にハイブリダイズすることが可能である。

実施形態５７は、実施形態４４～５６のいずれか１つの方法を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、送達粒子、ベシクル又はウイルスベクターを介して細胞に導入される。

配列
下記の表４は、本明細書で提供される配列を列挙する。

ＳｐＣａｓ９－ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（配列番号１）

ＦａＤｅ－ＳｐＣａｓ９－Ｆ１８５Ｎ変異を有するＳｐＣａｓ９（配列番号２）

ＳｐＣａｓ９ヌクレオチド配列（配列番号３）

ＦａＤｅ－ＳｐＣａｓ９ヌクレオチド配列（配列番号４）

ＳｐＣａｓ９ＲＥＣローブ：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸６１～７１８（配列番号５）

ＳｐＣａｓ９ＮＵＣローブ１：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１～６０（配列番号６）
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＤＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥ

ＳｐＣａｓ９ＮＵＣローブ２：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸７１９～１３６８（配列番号７）

ＳｐＣａｓ９ＢＨドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸６１～９４（配列番号８）
ＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤ

ＳｐＣａｓ９Ｒｅｃ１ドメイン１：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸９５～１８０（配列番号９）

ＳｐＣａｓ９Ｒｅｃ１ドメイン２：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸３０９～７１８（配列番号１０）

ＳｐＣａｓ９Ｒｅｃ２ドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１８１～３０８（配列番号１１）

ＳｐＣａｓ９ＲｕｖＣＩドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１～５９（配列番号１２）
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＤＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡ

ＳｐＣａｓ９ＲｕｖＣＩＩドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸７１８～７７４（配列番号１３）
ＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱ

ＳｐＣａｓ９ＲｕｖＣＩＩＩドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸９０９～１０９８（配列番号１４）

ＳｐＣａｓ９ＨＮＨドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸７７５～９０８（配列番号１５）

ＳｐＣａｓ９ＰＩドメイン：ＳｐＣａｓ９のアミノ酸１０９９～１３６８（配列番号１６）

ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来Ｃａｓ９（配列番号１７）

ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）由来Ｃａｓ９（配列番号１８）

ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）由来Ｃａｓ９（配列番号１９）

リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ）由来Ｃａｓ９（配列番号２０）

スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９（配列番号２１）

クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来Ｃａｓ９（配列番号２２）

ＦｎＣａｓ９－フランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）由来Ｃａｓ９（配列番号２３）

材料及び方法
実施例に記載する実験では、以下の材料及び方法を使用した。オリゴヌクレオチド及びガイドＲＮＡ合成は、Ｓｉｇｍａ及びＳｙｎｔｈｅｇｏにより提供された。別段の指摘がない限り、試薬及びキットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒより入手した。

試薬及びキットのリスト
細胞内分画キット；
ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）；
ＮＯＶＥＸＮＵＰＡＧＥタンパク質ゲル、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ４～１２％、１．５ｍｍ厚、１０ウェル；
４×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（ＢｉｏＲａｄ）；
ＮＵＰＡＧＥＭＯＰＳ２０×ＳＤＳランニングバッファー；
ＮＵＰＡＧＥ２０×転写バッファー；
ＮＯＶＥＸＳｈａｒｐ予染色タンパク質標準分子量マーカー；
ニトロセルロース予切断ブロッティング膜、孔径０．４５μｍ；
一次抗体：Ｃａｓ９マウスモノクローナル（Ａｂｃａｍ）；
モノクローナルＡＮＴＩ－ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）；
モノクローナル抗α－チューブリン（Ｓｉｇｍａ）；
二次抗体：ＩＲＤＹＥ６８０ＲＤＤｏｎｋｅｙ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、０．１ｍｇ（Ｌｉ－ＣＯＲ）；
ＨＳＣ７０マウスモノクローナル（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）；
タンパク質Ａセファロース（Ａｂｃａｍ）；
ＲＥＶＥＲＴＡＩＤＲＴキット；
ＤＮアーゼＩ、ＲＮアーゼフリー；
ＰｈｕｓｉｏｎＦｌａｓｈＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ；
Ｑ５ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２× ＭａｓｔｅｒＭｉｘ；
ＧｅｎｔｒａＰｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）；
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸＰｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
ＦＵＧＥＮＥＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）ＥＬＩＳＡキット（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）
シクロヘキシミドＣＨＸ（Ｓｉｇｍａ）
ロイペプチン（ＳＩＧＭＡ）
抗ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９抗体［ＥＰＲ１９７９９］（ａｂ２０３９３３）
抗Ｋｉ６７抗体（ａｂ１５５８０）
抗開裂カスパーゼ－３抗体（ａｂ２３０２）
抗γＨ２Ａ．Ｘ（ｐｈｏｓｐｈｏＳ１３９）抗体［９Ｆ３］（ａｂ２６３５０）
抗ＣＤ８α抗体［１４４Ｂ］（ａｂ１７１４７）
抗ＣＤ４抗体［ＥＰＲ１９５１４］－低エンドトキシン、アジドフリー（ａｂ２２１７７５）

本明細書に記載される実験で用いられるプライマーを表２に列挙する。

本明細書に記載される実験で用いられるガイドＲＮＡを表３に列挙する。

実験手順
細胞培養。ＳＶ－ＨＵＣ－１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン）を追加したＦ－１２Ｋ培地（Ｋａｉｇｈｎ’ｓＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨａｍ’ｓ）中で培養した。

ＨＥＫ２９３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン）を追加したダルベッコー修飾イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。全ての細胞を、５％のＣＯ_２を含む３７℃の湿気環境中で育成した。

Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン）を追加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。

ＨＣＴ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン）を追加したＲＰＭＩ－１６４０培地（ＡＴＣＣ３０－２００１）中で培養した。

ヒトｉＰＳＣを、ＧＦ－１添加剤（１：３３３に希釈）、ＧＦ－２添加剤（１：１０００に希釈）及びＧＦ－３添加剤（１：１０００に希釈）を追加したＣＥＬＬＡＲＴＩＳＤＥＦ－ＣＳ基本培地中で培養した。

プラスミド変異。変異をＧ－Ｂｌｏｃｋｓの遺伝子フラグメント及び合成によって行った。

実施例１．Ｃａｓ９対ＦａＤｅ－Ｃａｓ９：タンパク質代謝回転の分析
プラスミドトランスフェクション。不死化ヒト又はマウス細胞株を、リバーストランスフェクションにより、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９（ＦａＤｅ－Ｃａｓ９：Ｆ１８５Ｎ変異を有する野生型Ｃａｓ９；図５ＡのＫＦＥＲＱ－Ｃａｓ９として示される）をコードするプラスミドでトランスフェクトした。３μｇのプラスミド（Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９）をＯＰＴＩＭＥＭ培地中でトランスフェクション剤（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ）と混合し、６ウェルプレートに２５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を剥離し、計数し（５０×１０^４）、２ｍＬの完全培地中に再懸濁し、トランスフェクション試薬ミックスを含有するウェルに添加した。トランスフェクション後２４時間で細胞をＧＦＰ発現により分析して、トランスフェクション効率を評価し、ウエスタンブロット法のために様々な時点で採取した。

ウエスタンブロットのための細胞溶解及びタンパク質抽出。トランスフェクト細胞をトリプシンで採取し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。冷ＰＢＳ１Ｘで洗浄した後、細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を加えた冷「２工程溶解バッファー」（２工程溶解バッファー」：１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、０．８％のＴＲＩＴＯＮ）に懸濁させ、ボルテックスし、超音波処理し、氷上で２０分間インキュベートした。超音波処理プログラムは、２つの処理を含んだ：最大出力２０．０－衝撃係数４０．０－サイクルバースト５０－期間１５秒間。続いて細胞溶解液を４２０ｎＭのＮａＣｌで５分間インキュベートして核酸からタンパク質を分離させ、４℃で３０分間にわたる１５，０００ｒｐｍの遠心分離により清澄化した。遠心分離後、ＤＮＡ及び膜を含有するペレットを廃棄し、上澄みのタンパク質濃度をＮＡＮＯＤＲＯＰにより測定した。

免疫ブロッティング。上記の通りトランスフェクトした細胞からの清澄化溶解液をローディングバッファー（１０％β－メルカプトエタノール）と混合し、８分間煮沸した。試料をＮＵＰＡＧＥＢｉｓ－ＴｒｉｓＳＤＳタンパク質ゲルに投入し、２００Ｖ（ＭＯＰＳ１Ｘ）で４０分間運転することによって分離した。続いて、タンパク質ゲルを、２０％のメタノールを加えたＮＵＰＡＧＥ転写バッファーを用いて３５Ｖでニトロセルロース膜に転写した（タンク転写）。膜を１％ＢＳＡ中で１時間ブロックし、一次抗体を用いて４℃でインキュベートした。ＰＢＳＴＷＥＥＮ０．２％で３回洗浄した後、二次抗体（１％ＢＳＡ中１：１００００）を用いて、室温で１時間膜をインキュベートしてからＰＢＳＴＷＥＥＮ０．２％で３回洗浄した。ＯＤＹＳＳＥＹイメージングシステムを用いて検出を実施した。

結果を図６Ａ、６Ｂ及び７に示す。Ｃａｓ９対ＦａＤｅ－Ｃａｓ９の分析は、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９の発現がウエスタンブロットの検出レベル未満であったことを示した（図６Ａ）。図６Ｂに示すように、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９を生成するためのＣａｓ９中の変異は、Ｃａｓ９抗体特異性を損なわない。図７Ａに示すように、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９と比較して短い時間窓内で非常に低い発現を示した。Ｃａｓ９は、トランスフェクション後８時間から７２時間まで、増加するレベルで抗Ｃａｓ９によって検出可能であったが、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、トランスフェクション後８時間であっても抗Ｃａｓ９によって検出されなかった。

ＧＦＰ融合タンパク質発現によるタンパク質代謝回転の分析。９６ウェルプレートに７×１０^３細胞密度で播種したＨＥＫ２９３細胞を、それ自体のプロモーター下で発現したＣａｓ９－ＧＦＰ融合体又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦｐ融合体及びｍＣｈｅｒｒｙをコードする１００ｎｇのデュアルプロモーター駆動レポーターベクターでトランスフェクトした。ＦＵＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬でトランスフェクションを実施した。続いて、プレートをＩＮＣＵＣＹＴＥ内に置いて、経時的なＧＦＰ蛍光シグナルを測定することによってＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９タンパク質のインビボレベルを監視した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を分析してトランスフェクション効率を評価した。トランスフェクション効率評価のために細胞にトランスフェクトされたデュアルレポーターベクターの図面については、図８を参照されたい。

結果を図９～１１に示す。トランスフェクション効率は、同等である（ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光により測定して、図１０Ａ）が、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦｐ融合体は、Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合体と比較するとより低い発現レベルを示した（ＧＦＰ蛍光により測定して、図１０Ｂ）。図１２は、ＨＥＫ、ＨＣＴ、ｈＩＰＳｃ及びＮｅｕｒｏ－２ａ細胞中の類似のＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９タンパク質代謝回転実験の結果を示し、これは、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９の高い代謝回転が細胞の種類とは無関係であることを示す。

半定量的ＲＴ－ＰＣＲによるｍＲＮＡ安定性の評価。Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＳＶＨＵＣ１細胞からＲＮＡを単離した。様々な時点で採取した細胞ペレットを１ｍＬのＴＲＩＺＯＬに懸濁させた。ＲＴで５分間後、２００μＬのクロロホルムを添加し、続いて室温で３分間インキュベートした。試料を４℃で１５分間にわたり１５，０００ｒｐｍで遠心分離し、水相（ＲＮＡ含有）を別の管に回収した。続いて、５００μＬのイソプロパノールを水相に添加し、室温で１０分間インキュベートし、１５，０００ｒｐｍで遠心分離することによりＲＮＡを沈殿させた。底部のゲル状ペレットとしてＲＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄して、ＲＮアーゼフリーの水に溶解した。ＲＮＡ試料を、１μｇのＲＮＡ、１×のＤＮアーゼバッファー並びに超純水を加えた１μＬのＤＮアーゼを含有する１０μＬ反応中のＤＮアーゼで処理した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、ＲＮＡ濃度をＮＡＮＯＤＲＯＰで測定した。

ｃＤＮＡ合成。５００ｎｇのＲＮＡ、１μＬのランダムヘキサマープライマー、４μＬの５×反応バッファー、１μＬのＲＩＢＯＬＯＣＫＲＮアーゼ阻害剤（２０Ｕ／μＬ）、２μＬの１０ｍＭｄＮＴＰミックス、１μＬのＲＥＶＥＲＴＡＩＤＲＴ（２００Ｕ／μＬ）及びヌクレアーゼフリー水を含む２０μＬ反応中で反応を実施した。反応を４２℃で６０分間インキュベートし、７０℃で５分間加熱することにより終了させた。

ＰＣＲ。ＰＣＲを２０μＬの反応容量中の１μＬのＱ５ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２× ＭａｓｔｅｒＭｉｘで実施した（０．５μＬのフォワード及びリバースプライマー（１０μＭ）、１μＬのｃＤＮＡ及び水）。各反応は、３重で実行した。ＰＣＲは、以下の通り実施した：９５℃で１分間の熱変性、続いて２４サイクルの９５℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長及び２分間の最終伸長。

結果は、図７Ｂに示され、これは、Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９からの同様のｍＲＮＡ転写レベルを示す。これらのデータは、Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９のトランスフェクション効率が同等であったことを立証する。

実施例２．ＦａＤｅ－Ｃａｓ９のタンパク質代謝回転及び細胞内位置に対するＣＭＡの役割の評価。
Ｃａｓ９－ＨＳＣ７０の共免疫沈降。７０％の密集度で播種されたＳＶ－ＨＵＣ－１細胞を、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で細胞を採取し、ＣＯ－ＩＰ溶解バッファーで溶解した（１４０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５％のＮＯＮＩＤＥＴＰ－４０、２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤のカクテル））。細胞ペレットを、冷たい新たに調製した溶解バッファーに懸濁させ、１ｍＬシリンジを用いて２５ゲージ針に５～６回通した。溶解液を氷上で３０分間インキュベートし、４℃で２０分間にわたり１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。清澄化溶解液を新しい管に回収し、ＮＡＮＯＤＲＯＰで分析してタンパク質濃度を測定した。Ｃａｓ９の免疫沈降を、溶解バッファー中で希釈され、Ｃａｓ９一次抗体（１：１００）を用いて４℃で終夜インキュベートされた８００μｇの清澄化溶解液上で実施した。翌日、免疫複合体を４℃で４時間にわたりタンブリングホイール上の５０μＬのタンパク質Ｇ－セファロースビーズ上に固定化した。続いて、ビーズをＣＯ－ＩＰ溶解バッファーで洗浄し（３×）、３０μＬのＳＤＳ試料バッファーに再懸濁させ、５分間煮沸し、ＨＳＣ７０一次抗体を用いたウエスタンブロットに供した（１：１０００）。

結果を図１３Ａに示す。共免疫沈降法は、ＣＭＡシャペロンＨＳＣ７０とＦａＤｅ－Ｃａｓ９とが相互作用するが、Ｃａｓ９と相互作用しないことを示した。抗ＨＳＣ７０ブロットによって示されるように、抗ＨＳＣ７０抗体を用いてＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、検出されたが、Ｃａｓ９は、検出されなかった。

ＦａＤｅ－Ｌａｍｐ２Ａの共局在化。９６ウェルプレートに７×１０^３の細胞密度で播種したＨＥＫ２９３細胞を５０ｎｇのＣａｓ９－ＧＦＰ融合体又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦｐ融合体及び３０ｎｇのＬａｍｐ２Ａ－ｄｓＲｅｄ融合体で共トランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で細胞をＩＮＣＵＣＹＴＥｚｏｏｍによって分析した。細胞にトランスフェクトしたプラスミドの概略については、図１４を参照されたい。

結果を図１３Ｂ及び１５に示す。ＧＦＰ標識化Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、緑色蛍光を呈する一方、ｍＣｈｅｒｒｙ標識化Ｌａｍｐ２Ａは、赤色蛍光を示した。免疫蛍光シグナルの可視化により、サイトゾル中でリソソームタンパク質及びＣＭＡレギュレーターＬａｍｐ２Ａと共局在化するＦａＤｅ－Ｃａｓ９が示された。Ｌａｍｐ２Ａとの共局在化は、活性な分解を示唆する。

細胞内タンパク質分画。細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで採取し、続いて５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを氷冷ＰＢＳで洗浄し、乾燥させて、上澄みを除去し廃棄した。細胞質抽出物のために、プロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷細胞抽出バッファー（ＣＥＢ）を細胞ペレットに添加し、４℃で１０分間インキュベートした。溶解液を５００×ｇで５分間遠心分離した。続いて、上澄み（細胞質抽出物）を、氷上で予め冷却された清浄な管に移した。プロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷膜抽出バッファー（ＭＥＢ）をペレットに添加して膜を抽出し、４℃で１０分間インキュベートし、続いて３０００×ｇで５分間遠心分離した。核抽出のために、１００μＬあたり５μＬの１００ｍＭのＣａＣｌ_２及び３μＬの小球菌ヌクレアーゼ（３００単位）を加えたプロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷核抽出バッファー（ＮＥＢ）をペレットに添加し、４℃で１０分間、続いて室温で５分間インキュベートした。続いて、溶解液を、４℃で１０分間にわたり１５，０００ｒｐｍで遠心分離することにより清澄化した。各細胞区画から抽出されたタンパク質を測定してタンパク質濃度を定量化し、ＮＵＰＡＧＥＢｉｓ－ＴｒｉｓＳＤＳタンパク質ゲル上で分離した。

トランスフェクションから４８時間後のＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９の細胞内局在化の結果を図１６に示す。Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、同じ細胞内位置で発見され、これは、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９中のＦ１８５Ｎ変異が区画化に影響を及ぼさなかったことを示す。

実施例３．酵素活性、オンターゲット及びオフターゲットインデルの分析
ゲノムＤＮＡ抽出。ゲノムＤＮＡ抽出を、ＧｅｎｔｒａＰｕｒｅｇｅｎｅキットを用いて実施した。細胞ペレットを３００μＬの溶解バッファーに懸濁させ、タンパク質沈殿バッファー（１００μＬ）の添加後、氷上で５分間インキュベートした。続いて溶解液を１０分間にわたり１４，０００ｒｐｍで遠心分離し（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｅｄ）、上澄みをＤＮＡ沈殿のために３００μＬのイソプロパノールと混合し、続いて１０分間にわたり１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＤＮＡペレットを１００μＬの７０％エタノールで洗浄し、３０μＬの水に懸濁させた。ＤＮＡ濃度をＮＡＮＯＤＲＯＰで測定した。

Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ。ＰＣＲ：１００ｎｇのｇＤＮＡ及び１μＬのフォワード及びリバースプライマー（１０μＭ）を加えた１０μＬの２× ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰＨＵＳＩＯＮＦｌａｓｈＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲ）を含む２０μＬの合計容量中でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、以下の通り実施した：９５℃で３分間の熱変性、続いて３５サイクルの９５℃で５秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング及び７２℃での伸長（１分／１，０００ｂｐｓ）及び５分間の最終伸長。

消化：ＰＣＲ生成物を、９９℃で５分間加熱することにより熱変性させ、続いてヘテロ二本鎖形成のために、６５℃で３０分間及び２３℃で３０分間冷却することにより再アニーリングした。

ハイブリダイズされたヘテロ二本鎖又はホモ二本鎖を、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ中に存在するミスマッチを認識し、ミスマッチひずみの３’側上で両方の鎖を開裂させるＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ（ＣＥＬヌクレアーゼとしても知られる）で処理した。したがって、５０μＬ中の反応容量中の２０μＬの未精製ＰＣＲ生成物（約２５０ｎｇ）を４２℃で２０分間にわたり、１μＬのｓｕｒｖｅｙｏｒ酵素＋１μＬのエンハンサーで消化した。続いて１０μＬの処理済みＤＮＡを電気泳動によって１０％アクリルアミドゲル上で４０分間にわたり分離した。

ＨＥＫ細胞中のＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９のヌクレアーゼ効率を判定するアッセイの結果を図１７Ａに示す。「切断」ＤＮＡを示すゲルバンドにより示されるように、Ｃａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性は、同等であった。図１７Ｂに示される次世代配列分析は、Ｃａｓ９（１２．８％）及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９（１６．５％）で同等のヌクレアーゼ効率を立証した。図１８は、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９がｈｉＰＳＣ中でＣａｓ９と同等レベルのヌクレアーゼ活性を有したことを示した。

ＥＭＸ１／ＦＡＮＣＦ１オフターゲット分析。ＨＥＫ２９３細胞を６０×１０^４の密度で１２ウェルプレートに播種し、Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９をコードするプラスミド８００ｎｇ及びｇＲＮＡをコードするプラスミド２００ｎｇで共トランスフェクトした（ＥＭＸ１又はＦＡＮＣＦ１）。ＦＵＧＥＮＥＨＤトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後７２時間で細胞を採取し、ゲノムＤＮＡ抽出のために溶解した。１００ｎｇのｇＤＮＡ、１μのＰＨＵＳＩＯＮＦＬＡＳＨＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ並びにＩｌｌｕｍｉｎａからの製造者推薦に基づいて設計されたアダプター融合フォワード及びリバースプライマーでオンターゲット及びオフターゲット領域のＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲは、以下の通り実施した：９５℃で１分間の熱変性、続いて３０サイクルの９５℃で３０秒間の熱変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長及び２分間の最終伸長。ＰＣＲ生成物を精製し、次世代配列決定法により分析した。

結果を図１９に示す。ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９と比較してわずかに低いオンターゲット修飾を有していたが、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９のオフターゲット修飾は、Ｃａｓ９と比較して著しく低下した。したがって、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９よりも増加した正規化オンターゲット修飾の効率を示した。

リボ核タンパク質（ＲＮＰ）エレクトロポレーション。Ｃａｓ９／ＲＮＰの予複合体化：１．５ｍＬの管中において、１００ｐｍｏｌのＣａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９を１０μＬの１×Ｃａｓ９バッファー中で１２０ｐｍｏｌの合成デュアルｇＲＮＡと混合し、室温で２０分間インキュベートした。２０×１０^４の密度のＨＥＫ２９３細胞を２０μＬのエレクトロポレーションバッファーＳＦに懸濁させ、ＲＮＰ複合体で２分間インキュベートした。細胞を、４ＤＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（Ｌｏｎｚａ）を用いてエレクトロポレーションした。ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）後、細胞を、１ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ）を備える１２ウェルプレートに播種し、様々な時点で採取した（３時間、６時間、１０時間、２４時間）。

ＲＮＰトランスフェクション。ヒトｉＰＳＣを、２０×１０^４の密度で播種し、濃度が増加するＣａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９及び３μＭのデュアルｇＲＮＡでトランスフェクトした。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＣＲＩＳＰＲＭＡＸトランスフェクション試薬でトランスフェクションを実施した。感染後４８時間で細胞をゲノムＤＮＡ抽出のために溶解させ、ＰＣＲにより欠失を立証した。

実施例４．細胞に対するＣａｓ９発現の効果
実施例４．１
ヒト尿路上皮細胞（ＳＶＨＵＣ－１）を野生型Ｃａｓ９でトランスフェクトした。Ｃａｓ９を含有する細胞クローンをｄｄＰＣＲにより立証した（図１Ａ、上部のパネル）。Ｃａｓ９の安定細胞株の生成から４週間後、細胞は、増殖し、２４、４８及び７２時間で計数した。野生型細胞（Ｃａｓ９なし）、クローン１（異型Ｃａｓ９組込み）及びクローン３（同型Ｃａｓ９組み込み）からの細胞計数は、低減傾向を示した（図１Ａ、下部のパネル）。

実施例４．２
マウスをドキシサイクリン誘導性プロモーター上において野生型Ｃａｓ９でトランスフェクトした。誘導後、マウス（「ｉＣａｓｄｏｘ」）の体重を測定し、野生型マウス（「ＷＴｗａｔｅｒ」）、ドキシサイクリンを含む野生型マウス（「ＷＴｄｏｘ」）及びＣａｓ９でトランスフェクトさせたが、Ｃａｓ９を発現していないマウス（「ｉＣａｓｗａｔｅｒ」）と比較した。図１Ｂの結果は、野生型Ｃａｓ９でトランスフェクトされ、野生型Ｃａｓ９を発現したマウスは、Ｃａｓ９を発現していないマウスと比較して体重の減少を呈することを示す。

実施例４．３
ヒトの誘発された多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を野生型Ｃａｓ９で一過性にトランスフェクトした。Ｃａｓ９の一過性発現から５週間後に細胞の顕微鏡画像を取得した。図２に示すように、ｈｉＰＳＣは、Ｃａｓ９を一過性発現したときにその未分化表現型を喪失する。

実施例５．タンパク質代謝回転のＣａｓ９対ＦａＤｅ－Ｃａｓ９分析
実施例５．１ＥＬＩＳＡアッセイにより測定したＣａｓ９及びＦａＤｅ－Ｃａｓ９の細胞内タンパク質レベル
２０×１０^４の密度のＨＥＫ２９３細胞を２０μＬのエレクトロポレーションバッファーＳＦに懸濁させ、ＲＮＰ複合体で２分間インキュベートした。細胞を、４Ｄヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を用いてエレクトロポレーションした（４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＣｏｒｅＵｎｉｔ：Ｌｏｎｚａ，ＡＡＦ－１００２Ｂ；４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸＵｎｉｔ：ＡＡＦ－１００２Ｘ；Ｌｏｎｚａ）。ヌクレオフェクション後、細胞を、１ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ）を含む１２ウェルプレートに播種し、２４時間で採取した。細胞を溶解させ、市販キットのＥＬＩＳＡアッセイ（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）により、使用説明書に従い、タンパク質レベルを分析した：ＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ－４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）などの溶解バッファー中で細胞又は組織溶解液を超音波処理又は均質化し、アッセイ前に４℃で１０分間にわたり１０，０００×ｇで遠心分離した。

結果を図２４Ａに示す。７．５μｇ／１０＾５細胞のＲＮＰエレクトロポレーションでは、２４時間で約５％の細胞内Ｃａｓ９が回復した（＜０．１％のＦａＤｅ－Ｃａｓ９と比較して）。ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、エレクトロポレーション後２４時間で細胞中の豊富さが＞９７％少なかった。

実施例５．２タンパク質代謝回転及び分解の測定
ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＦＰ融合Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９を用いて３０×１０^４の密度でトランスフェクトさせ、ｉｎｃｕｃｙｔｅによりＧＦＰ発現を経時的に分析した。

トランスフェクション後１２時間で細胞をＣＨＸ（１０μｇ／ｍｌ）で処理して、タンパク質合成を阻害し、ＧＦＰシグナルに従い、未処理細胞と比較して、Ｃａｓ９対ＦａＤｅ－Ｃａｓ９の分解タンパク質を測定した。

ＧＦＰ発現により、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９の豊富さが減少し、Ｃａｓ９で観察された細胞内タンパク質レベルに決して到達しなかった（図２４Ｂ）。タンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）に暴露された細胞は、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９レベルの時間依存的な低下を示し、経時的に一定を維持したＣａｓ９タンパク質レベルとは対照的であった（図２４Ｃ）。

実施例６．ＦａＤｅ－Ｃａｓ９の高いタンパク質代謝回転及びタンパク質の細胞内局在化に対するＣＭＡの役割
実施例６．１Ｌａｍｐ２Ａノックダウン
ＨＥＫ２９３細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬及びＯＰＴＩＭＥＭを使用し、ＧＦＰ融合発現ベクターＣａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９、加えてＤｓ－Ｒｅｄｌａｍｐ２ａベクター（２：１）、加えてｇＲＮＡ（３：１）及び増加用量のｓｉＲＮＡ（１０～２０～４０～６０～９０～１００ｎｇ）を用いて、７×１０^３の密度で共トランスフェクトした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞をスクランブルｓｉＲＮＡで共トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をｉｎｃｕｃｙｔｅｚｏｏｍで経時的に監視し、ＧＦＰシグナルによりＫＤｌａｍｐ２ａ効率及びタンパク質蓄積を分析した。

ＣＭＡを阻害するために、リソソーム受容体Ｌａｍｐａ２ａの発現をｓｉＲＮＡにより低下させた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、Ｌａｍｐ２Ａ受容体の用量依存的な低減がもたらされた（図２５Ａ／Ｂ）が、Ｃａｓ９のタンパク質レベルは、不変である一方（図２５Ａ）、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、用量依存的な蓄積を示し、これは、その分解がＣＭＡ依存的であることを示唆した（図２５Ｂ）。

実施例６．２Ｃａｓ９－ＨＳＣ７０の共免疫沈降。
ＭａｘＣｙｔｅを使用して、ＨＥＫ２９３ｓ細胞（５，０００万）を２０μｇのＦＬＡＧ標識融合Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後２４時間で細胞を１００μＭのロイペプチン（カテプシンＢ阻害剤）で処理し、リソソームによる分解を一時的に阻害した。エレクトロポレーション後４８時間で細胞を採取し、ＣＯ－ＩＰ溶解バッファーで溶解した（１４０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ－４０、２０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤のカクテル－Ｓｉｇｍａ）。細胞ペレットを、冷たい新たに調製した溶解バッファーに懸濁させ、１ｍＬシリンジを用いて２５Ｇａ針に５～６回通した。溶解液を氷上で３０分間インキュベートし、４℃で２０分間にわたり１５，０００で遠心分離した。清澄化溶解液を新しい管に回収し、Ｎａｎｏｄｒｏｐで分析してタンパク質濃度を測定した。Ｃａｓ９の免疫沈降を、溶解バッファー中で希釈され、４℃で終夜にわたりＦＬＡＧ一次抗体（抗ＦＬＡＧＦ７４２５ＳＩＧＭＡ１：５００）を用いてインキュベートされた８００μｇの清澄化溶解液上で実施した。翌日、免疫複合体を、４℃で４時間にわたり、タンブリングホイール上でタンパク質Ｇ－セファロースビーズ（５０μＬ）上に固定化した。ビーズをＣＯ－ＩＰ溶解バッファーで洗浄し（３×）、ＳＤＳ試料バッファー（３０μＬ）に再懸濁させ、５分間煮沸し、Ｃａｓ９及びＨＳＣ７０一次抗体を用いたウエスタンブロットに供した（１：１０００）。３０μｇの溶解液を投入量（ＩＮＰＵＴ）として用いて、タンパク質の合計量を立証した。

免疫沈降法は、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９がシャペロン介在性オートファジーＨＳＣ７０のマスターレギュレーターに対する高親和性の結合を有することを示した。結果を図２６に示す。

実施例７．Ｃａｓ９対ＦａＤｅ－Ｃａｓ９インビボマウスモデル
実施例７．１アデノウイルス作成物
Ｃａｓ９又はＦａＤｅ－Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを発現するアデノウイルス（Ａｄ－Ｃａｓ９－ｇＭＨ及びＡｄ－Ｃａｓ９－ｇＰ並びにＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ｇＭＨ及びＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ｇＰ）を、ＶｅｃｔｏｒＢｉｏｌａｂｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により生成した。ＡｄｖＣａｓ９／ＦａＤｅ及びｇＲＮＡを複製欠損性アデノウイルス－血清型５（ｄＥ１／Ｅ３）骨格中でそれぞれニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）及びＵ６プロモーターから発現させた。ＣＢｈ及びＣＭＶプロモーターからそれぞれＣａｓ９及びＧＦＰを発現するが、ｇＲＮＡを発現しない陰性対照アデノウイルス（Ａｄ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ及びＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ）も生成した。

実施例７．２インビボでのオン／オフ標的分析
インビボでのオフターゲット編集分析のために、複数のオフターゲット変異マウスゲノムを誘発する高い可能性のために選択されたマウスＰＣＳＫ９遺伝子座を標的化する広宿主域ガイドＲＮＡ（ｇＰ）（図２７Ａ）。

９～１１週齢の雄マウスが、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した２００μＬ中の１×１０^９感染単位（ＩＦＵ）用量のアデノウイルス（Ａｄ－Ｃａｓ９－ｇｐ若しくはＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ｇｐ又はＡｄ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ又はＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ）の尾静脈注射を受けた。ウイルス投与前（ベースライン）、ウイルス投与から１週間後及び終了時（ウイルス投与から４日又は３週間後）に末梢血をサンプリングした。

処理後７日目に、アデノウイルスを注射されたマウスの肝組織由来のゲノムＤＮＡをインデル分析のために抽出した。標的化ディープ配列決定のために、オフターゲットを、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑにより、オンターゲットの５０％を超える読取計数を有する部位及び様々なより下位にランクされる部位（オンターゲットと比較して最大で６つのミスマッチを含む）を選択することにより同定した。マウスモデルにおけるｇＰのオンターゲット＋９つのオフターゲット部位での遺伝子編集頻度の評価は、９つのうちの４つの異なるオフターゲット部位が、Ｃａｓ９と比較して、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９による著しく低減した遺伝子編集を示したことを示した（図２７Ｂ）。

実施例７．３次世代配列決定（ＮＧＳ）
ＰＣＲ生成物を、電磁ビーズを用いて精製し、ＱｕａｎｔｉＦｌｏｒｄｓＤＮＡＳｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量化し、単位複製配列あたり１０ｎｇ／μＬに正規化し、プールした。プールした試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔＵｌｔｒａＩＩＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐキットからのＥｎｄＰｒｅｐＥｎｚｙｍｅＭｉｘ及び反応バッファーを用いて末端修復及びＡ－テーリングし、同じキットからのライゲーションマスターミックス及びライゲーションエンハンサーを用いてＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑアダプターにライゲートさせる。続いて、ライブラリ試料を電磁ビーズで精製し、ＰＥＧ／ＮａＣｌＳＰＲＩ溶液（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサイズ選択し、ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量化し、ディープ配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ上に搭載した。

実施例７．４インビボゲノム編集及び生存率評価
インビボでのＰｃｓｋ９遺伝子編集のために、マウス又はヒトＰＳＣＫ９の単一対立遺伝子を収容する９～１１週齢ヒト化ＰＣＳＫ９マウス（ＰＣＳＫ９ＫＩＫＯ）が、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した２００μＬ中の１×１０９感染単位（ＩＦＵ）の用量のアデノウイルス（Ａｄ－Ｃａｓ９－ｇＭＨ又はＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ｇＭＨ及びＡｄ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ又はＡｄ－ＦａＤｅ－Ｃａｓ９－ＧＦＰ）で尾静脈注射を受けた。処理後７日目に、アデノウイルスを注射されたマウスの肝組織由来のゲノムＤＮＡを、それぞれヒト及びマウスＰＣＳＫ９遺伝子座上でのＮＧＳによるインデル分析のために抽出した。肝臓ローブをパラフィンブロックに収め、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）、有糸分裂マーカーＫｉ６、Ｃａｓ９、開裂カスパーゼ３、ｐ－Ｈ２ＡＸ及びＣＤ４／ＣＤ８のために染色した。

ＦａＤｅ－Ｃａｓ９に暴露されたマウス肝臓は、その肝組織中での急速な分解（これは、したがって、図２８Ａに示されるように編集された細胞のより高い生存率をもたらす）の結果として、より高い遺伝子編集を示した。インビボでのＦａＤｅ－Ｃａｓ９の急速な代謝回転により、肝毒性は、Ｃａｓ９と比較してより低くなり、これは、未変化の肝臓グリコーゲン、ほぼ検出不可能な有糸分裂マーカーＫｉ６７、より少ない浸潤物及び最小限の細胞壊死によって確認された。（図２８Ｂ／Ｃ）。

更に、インビボでのＦａＤｅ－Ｃａｓ９のウイルス媒介発現により、細胞傷害性Ｔ－リンパ球免疫応答は、より低くなった（図２９）。ＡｄＶ送達後１週間で、Ｃａｓ９は、肝細胞中で依然として高度に発現していたが、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９は、検出不可能であった（Ａ、Ｅ）。ＦａＤｅ－Ｃａｓ９のより短い潜伏時間のために、肝細胞中のアポトーシス（開裂カスパーゼ３ＩＨＣ；Ｂ、Ｆ）及びＤＮＡ二本鎖の切断（ホスホ－Ｈ２ＡＸＩＨＣ；Ｃ、Ｇ）のレベルがより低くなった。マウス肝臓中のＣａｓ９送達に対する免疫反応は、中程度数のＣＤ４^＋（メモリー）リンパ球及び多数のＣＤ８^＋（細胞傷害性）リンパ球からなったが、後者は、ＦａＤｅ－Ｃａｓ９ＡｄＶに感染した肝臓中で著しく減少した（ＣＤ４－ＣＤ８ＩＨＣ；Ｄ、Ｈ）。

Claims

ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、Ｃａｓ９として機能する組換えＣａｓ９タンパク質であって、前記ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）、ＲＫＶＥＱ（配列番号２５）、ＱＤＬＫＦ（配列番号２６）、ＱＲＦＦＥ（配列番号２７）、ＮＲＶＶＤ（配列番号２８）、ＱＲＤＫＶ（配列番号２９）、ＱＫＩＬＤ（配列番号３０）、ＱＫＫＥＬ（配列番号３１）、ＱＦＲＥＬ（配列番号３２）、ＩＫＬＤＱ（配列番号３３）、ＤＶＶＲＱ（配列番号３４）、ＱＲＩＶＥ（配列番号３５）、ＶＫＥＬＱ（配列番号３６）、ＱＫＶＦＤ（配列番号３７）、ＱＥＬＬＲ（配列番号３８）、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）、ＲＩＫＥＮ（配列番号４０）、ＮＫＫＦＥ（配列番号４１）及びこれらの組み合わせから選択され、ここで、前記ＫＦＥＲＱ（配列番号２４）はＳタグを構成するものではなく、前記組換えＣａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９よりも急速な分解速度を有する、組換えＣａｓ９タンパク質。
前記ＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）である、請求項１に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
前記ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、前記Ｃａｓ９タンパク質のＲＥＣローブ中にある、請求項１に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
前記ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、前記ＲＥＣローブのＲｅｃ２ドメイン中にある、請求項３に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
前記ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、前記組換えＣａｓ９タンパク質のＨＮＨドメイン、ＲｕｖＣドメイン又はＰＩドメイン中にある、請求項１に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
前記ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、前記組換えＣａｓ９タンパク質の表面露出領域中にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
前記ＫＦＥＲＱモチーフ又はＫＦＥＲＱ様モチーフは、前記組換えＣａｓ９タンパク質のＮ末端又はＣ末端にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
配列番号１の位置Ｆ１８５、Ａ５４７、Ｉ５４８、Ｔ５６０、Ｖ５６１、Ｄ８２９、Ｉ８３０、Ｌ１０８７、Ｓ１０８８、Ｐ１１９９、Ｋ１２００又はこれらの組み合わせの１つ以上にアミノ酸修飾を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された、Ｃａｓ９として機能する組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）であって、前記アミノ酸修飾は、以下の変異：
（ａ）Ｆ１８５Ｎ；
（ｂ）Ａ５４７Ｅ／Ｉ５４８Ｌ；
（ｃ）Ｔ５６０Ｅ／Ｖ５６１Ｑ；
（ｄ）Ｄ８２９Ｌ／Ｉ８３０Ｒ；
（ｅ）Ｌ１０８７Ｅ／Ｓ１０８８Ｑ；又は
（ｆ）Ｐ１１９９Ｄ／Ｋ１２００Ｑ
の１つ以上を含み、前記組換えＣａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９よりも急速な分解速度を有する、組換えＣａｓ９タンパク質。
前記変異は、Ｆ１８５Ｎである、請求項８に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項８又は９に記載の組換えＣａｓ９タンパク質。
配列番号１のアミノ酸位置１８５にＫＦＥＲＱ様モチーフを含む、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離された、Ｃａｓ９として機能する組換えＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）であって、前記ＫＦＥＲＱ様モチーフは、ＶＤＫＬＮ（配列番号３９）であり、前記組換えＣａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９よりも急速な分解速度を有する、組換えＣａｓ９タンパク質。
（ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えＣａｓ９タンパク質と、
（ｂ）前記組換えＣａｓ９タンパク質との複合体を形成し、且つガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドと
を含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
前記ガイド配列は、ダイレクトリピート配列に連結されている、請求項１２に記載の系。
前記ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１２又は１３に記載の系。
（ｃ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドを更に含む、請求項１２又は１３に記載の系。
前記組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及び前記ガイドポリヌクレオチドは、単一のベクター上にある、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の系。
前記組換えＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、前記ガイドポリヌクレオチド及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、単一のベクター上にある、請求項１５に記載の系。
請求項１２～１７のいずれか一項に記載の系を含む送達粒子。
請求項１２～１７のいずれか一項に記載の系を含むベシクル。
エキソソーム又はリポソームである、請求項１９に記載のベシクル。
請求項１２～１７のいずれか一項に記載の系を含むウイルスベクター。
アデノウイルス、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスのものである、請求項２１に記載のウイルスベクター。
細胞のゲノム中の標的配列において部位特異的修飾を提供するための組成物であって、請求項１２～１７のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、請求項１８に記載の送達粒子、請求項１９若しくは２０に記載のベシクル、又は請求項２１若しくは２２に記載のウイルスベクターを含み、前記細胞中に導入される、組成物。
前記修飾は、前記標的配列の少なくとも一部の欠失を含む、請求項２３に記載の組成物。
前記修飾は、前記標的配列の変異を含む、請求項２３に記載の組成物。
前記修飾は、目的配列（ＳｏＩ）を前記標的配列において挿入することを含む、請求項２３に記載の組成物。
前記細胞の前記ゲノム中のオフターゲット修飾は、前記組換えＣａｓ９によってなされる前記ゲノム中の修飾の５％未満である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の組成物。
前記細胞の前記ゲノム中のオフターゲット修飾は、前記組換えＣａｓ９によってなされる前記ゲノム中の前記修飾の２％未満である、請求項２３～２７のいずれか一項に記載の組成物。
前記細胞の前記ゲノム中のオフターゲット修飾は、前記組換えＣａｓ９によってなされる前記ゲノム中の前記修飾の１％未満である、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の組成物。
前記細胞の前記ゲノム中のオフターゲット修飾は、野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はＫＦＥＲＱモチーフ若しくはＫＦＥＲＱ様モチーフを含まないＣａｓ９と比較して少なくとも５０％だけ低減される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の組成物。
前記細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の組成物。
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項３１に記載の組成物。
前記細胞は、多能性幹細胞である、請求項３２に記載の組成物。
前記細胞は、誘発された多能性幹細胞である、請求項３３に記載の組成物。
前記ガイドポリヌクレオチドの前記ガイド配列は、前記細胞の前記ゲノム中で前記標的配列にハイブリダイズすることが可能である、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の組成物。