JP7512891B2 - ポリペプチドの分離方法、ポリペプチドの製造方法及びポリペプチドの精製装置 - Google Patents

Description

本発明は、ポリペプチドの分離方法、ポリペプチドの製造方法及びポリペプチドの精製装置に関する。

生理活性物質、特に、タンパク質、ペプチド、核酸等の生体由来物質に基づく生物医薬品の製造には、実プロセススケールでこれらの分子を製造し、精製することが必要とされる。特に、生理活性物質の代表例であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の需要の高まりは、高い発現レベルを伴う細胞培養技術の開発を促進し、結果として細胞培養液からのモノクローナル抗体のより効率的な精製プロセスについての需要が高まっている。

このような培養液からのモノクローナル抗体の精製方法として、例えば、特許文献１には、アフィニティ分離剤を用いる方法が開示されている。また、特許文献２には、濾過膜を用いる方法が開示されている。

国際公開第２０１５／１９９１９６号 日本国特開２００９－２２１１３７号公報

しかしながら、特許文献１に開示される精製方法は、ポリペプチドのアフィニティ分離剤への吸着量に限界があり、精製したポリペプチドの生産性に劣るという課題を有する。また、アフィニティ分離剤自体の生産性が高くなく、担体の製造及び固定化にエネルギーを要し、固定化したリガンドの離脱等を抑制するために厳しい条件でアフィニティ分離剤を保存しなければならず、アフィニティ分離剤そのものにも多くの課題を有する。

また、特許文献２に開示される精製方法は、単純な濾過であるため、精製したいポリペプチドと分子量が近い不純物がそのまま残存するという課題を有する。また、そのような不純物を残存させないようにするためには、厳しい濾過の条件設定が必要となるという課題を有する。

本発明は、このような課題を鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、工業化スケールにおいても適用可能な高効率のポリペプチドの分離方法を提供することにある。

従前、培養液からポリペプチドを高効率に得る方法として、アフィニティ分離剤を用いる方法や濾過膜を用いる方法等、種々検討されてきたが、更なる高効率のポリペプチドの分離方法が要求されている。本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、工業化スケールにおいても適用可能な高効率のポリペプチドの分離方法を見出した。

即ち、本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］以下の工程Ａ及び工程Ｂを含み、ポリペプチドがモノクローナル抗体である、ポリペプチドの分離方法。
工程Ａ：液体中でポリペプチドとリガンドとを混合して、ポリペプチドとリガンドとの複合体を形成し、前記複合体を含む液体を得る工程。
工程Ｂ：前記工程Ａで得た前記複合体を含む液体を濾過する工程。
［２］前記複合体が、前記リガンド１分子に対して前記ポリペプチド２分子以上が複合化したものである、前記［１］に記載の分離方法。
［３］前記工程Ａにおいて、前記リガンド１ｍｏｌに対して前記ポリペプチドを２．１ｍｏｌ以上混合する、前記［１］又は［２］に記載の分離方法。
［４］前記リガンドがプロテインＡである、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の分離方法。
［５］前記工程Ｂの濾過に用いる膜の分画分子量が１０，０００～２５０，０００である、前記［１］～［４］のいずれか１に記載の分離方法。
［６］更に、以下の工程Ｃを含む、前記［１］～［５］のいずれか１に記載の分離方法。
工程Ｃ：前記工程Ｂで分離された複合体をポリペプチドとリガンドとにさらに分離する工程。
［７］前記工程Ｃにおいて、前記分離された複合体をポリペプチドとリガンドとに解離させた後に、濾過又は液体クロマトグラフィーによりさらに分離する、前記［６］に記載の分離方法。
［８］前記工程Ｃにおけるさらなる分離を、イオン交換クロマトグラフィーにより行う、前記［６］又は［７］に記載の分離方法。
［９］前記［１］～［８］のいずれか１に記載の分離方法を用いた精製工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
［１０］被精製物の供給タンク、希釈液の供給タンク、濾過器及び検出器を含む、ポリペプチドの精製装置。

本発明のポリペプチドの分離方法は、濾過の条件を緩和することができ、工業化スケールにおいても適用可能で、ポリペプチドの生産性に優れる。
また、本発明のポリペプチドの製造方法は、濾過の条件を緩和することができ、工業化スケールにおいても適用可能で、ポリペプチドの生産性に優れる。
更に、本発明のポリペプチドの精製装置は、工業化スケールにおいても適用可能な高効率のポリペプチドの分離や製造が可能である。

図１は、本発明に係るポリペプチドの精製装置の一実施形態を示す模式図である。 図２は、参考例１～９で得られた各液体のクロマトグラムである。 図３は、実施例１で得られた各液体のクロマトグラムである。 図４は、比較例１で得られた各液体のクロマトグラムである。 図５は、実施例２で得られた各液体のクロマトグラムである。 図６は、比較例２で得られた各液体のクロマトグラムである。 図７は、実施例３で得られた各液体のクロマトグラムである。 図８は、実施例４で得られた各液体のクロマトグラムである。 図９は、参考例１０及び比較対象として得られた各液体のクロマトグラムである。

以下に本発明について詳述するが、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々に変更して実施することができる。尚、本明細書において「～」という表現を用いる場合、その前後の数値又は物性値を含む表現として用いるものとする。また、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」、「メタクリル」又はその両者をいい、「（メタ）アクリロニトリル」とは、「アクリロニトリル」、「メタクリロニトリル」又はその両者をいう。

（ポリペプチドの分離方法）
本発明に係るポリペプチドの分離方法は、ポリペプチドがモノクローナル抗体であり、以下の工程Ａ及び工程Ｂを含む。
工程Ａ：液体中でポリペプチドとリガンドとを混合して、ポリペプチドとリガンドとの複合体を形成し、前記複合体を含む液体を得る工程。
工程Ｂ：前記工程Ａで得た前記複合体を含む液体を濾過する工程。

また、本発明に係るポリペプチドの分離方法は、以下の工程Ｃをさらに含むことが好ましい。
工程Ｃ：前記工程Ｂで分離された複合体をポリペプチドとリガンドとにさらに分離する工程。

（工程Ａ）
工程Ａは、液体中でポリペプチドとリガンドとを混合して、ポリペプチドとリガンドとの複合体を形成し、前記複合体を含む液体を得る工程である。
工程Ａを有することで、不純物より遥かに大きい、ポリペプチドとリガントとの複合体（以下、単に「複合体」と称することがある。）を形成することができる。この複合体を形成することで、不純物とのサイズ差が大きくなり、後述する工程Ｂにおける濾過の条件を緩和することができ、好ましい。

モノクローナル抗体は、ポリペプチドの中でも分子量やサイズの分布が小さい。そこで、モノクローナル抗体と不純物とのサイズ差があれば、モノクローナル抗体と不純物とを濾過により分離することが可能となる。したがって、本発明に係る分離方法は、ポリペプチドがモノクローナル抗体である場合に極めて有効なものである。

複合体を含む液体を得るに際し、ポリペプチドやリガンドの性状は特に限定されず、固体でも液体でもよい。液体中でポリペプチドとリガンドとを混合する方法としては、例えば、ポリペプチドを含む液体にリガンドを添加して混合する方法、リガンドを含む液体にポリペプチドを添加して混合する方法、ポリペプチドを含む液体とリガンドを含む液体とを混合する方法、液体にポリペプチドとリガンドとを添加して混合する方法等が挙げられる。これらの方法の中でも、ポリペプチドを含む液体にリガンドを添加して混合する方法、ポリペプチドを含む液体とリガンドを含む液体とを混合する方法が好ましい。

液体としては、例えば、水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられる。これらの液体の中でも、リン酸緩衝液が好ましい。

ポリペプチドを含む液体とは、ポリペプチドを含んでいれば特に限定されないが、本発明の効果に顕著に優れることから、ポリペプチドと不純物を含む液体が好ましく、細胞培養液がより好ましい。
本明細書において、不純物とは、ポリペプチドの製造過程で副生する副生物をいう。

ポリペプチドの質量平均分子量は、１０，０００以上が好ましく、２０，０００以上がより好ましく、また、３００，０００以下が好ましく、２００，０００以下がより好ましい。ポリペプチドの質量平均分子量が１０，０００以上であると、より高次構造をとることができ、機能性に優れる。また、ポリペプチドの質量平均分子量が３００，０００以下であると、体内の患部への浸透性に優れる。
本明細書において、ポリペプチドの質量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー法により測定した値とする。ただし、ポリペプチドの種類等によってサイズ排除クロマトグラフィー法で質量平均分子量を測定するのが困難な場合には、分画ゲルによる電気泳動法や、高速液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合せた方法で測定した値を用いてもよい。

不純物の質量平均分子量は、得たいポリペプチドとの分離性に優れることから、１０以上が好ましく、１，０００以上がより好ましく、また、３００，０００以下が好ましく、１００，０００以下がより好ましい。
本明細書において、不純物の質量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー法で測定した値とする。

本明細書において、リガンドとは、ポリペプチドとの吸着相互作用を有する物質をいう。吸着相互作用を有するとは、分子間で引き合う力を有する状態のことをいう。

リガンドとしては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質等が挙げられる。これらのリガンドの中でも、分子認識選択性に優れることから、タンパク質、ペプチドが好ましく、タンパク質がより好ましく、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、それらの改変体が更に好ましく、プロテインＡが特に好ましい。
尚、ペプチドとは、１０～５０のアミノ酸が鎖状に結合した化合物をいう。また、タンパク質とは、５１以上のアミノ酸が鎖状に結合した化合物をいい、高次構造をとっていてもよい。

リガンドの質量平均分子量は、１０，０００以上が好ましく、２０，０００以上がより好ましく、また、１００，０００以下が好ましく、８０，０００以下がより好ましい。リガンドの質量平均分子量が１０，０００以上であると、ポリペプチドとリガンドとの吸着性に優れる。また、リガンドの質量平均分子量が１００，０００以下であると、ポリペプチドとリガンドとの分離が容易で、リガンドの特性に優れる。
本明細書において、リガンドの質量平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィー法により測定した値とする。ただし、リガンドの種類等によってサイズ排除クロマトグラフィー法では質量平均分子量を測定するのが困難な場合には、分画ゲルによる電気泳動法や、高速液体クロマトグラフィーと質量分析計とを組み合せた方法で測定した値を用いてもよい。

ポリペプチドとリガンドとの混合により得られる複合体は、リガンドとのサイズ差をより大きくすることができ、濾過の条件を大きく緩和することができる（例えば、用いる濾過膜の選択肢を増やすことができる、濾過の回数を削減することができる等）ことから、リガンド１分子に対して、前記ポリペプチド２分子以上が複合化したものであることが好ましい。また、ポリペプチドとリガンドとの混合により得られる複合体は、複合体の形成が容易であることから、リガンド１分子に対して、ポリペプチドは３分子以下が好ましい。

ポリペプチドとリガンドの混合割合は、リガンド１ｍｏｌに対してポリペプチドが２．１ｍｏｌ以上が好ましく、２．５ｍｏｌ以上がより好ましく、また、３．１ｍｏｌ以下が好ましく、２．９ｍｏｌ以下がより好ましい。ポリペプチドの割合が２．１ｍｏｌ以上であると、リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体を多く含み、リガンドとのサイズ差をより大きくすることができ、濾過の条件を大きく緩和することができる。また、ポリペプチドの割合が３．１ｍｏｌ以下であると、リガンドと複合化しないポリペプチドを少なくすることができ、工程Ｂにおいて濾液に含まれるポリペプチドを少なくすることができる。

リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体の存在率は、リガンドとのサイズ差をより大きくすることができ、濾過の条件を大きく緩和することができることから、７０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましい。
リガンド１分子に対してポリペプチド１分子が複合化した複合体の存在率は、リガンドとのサイズ差をより大きくすることができ、濾過の条件を大きく緩和することができることから、３０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、５％以下が更に好ましい。
リガンドと複合化していないポリペプチドの存在率は、１５％以下が好ましく、１０％以下がより好ましく、５％以下が更に好ましい。
尚、本明細書において、（ｉ）リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体、（ｉｉ）リガンド１分子に対してポリペプチド１分子が複合化した複合体及び（ｉｉｉ）リガンドと複合化していないポリペプチド、のそれぞれの存在率は、工程（Ａ）で得られた複合体を含む液体を液体クロマトグラフィーで測定したときの、クロマトグラムの３種のピークの面積の合計に対する各ピークの面積とする。前記３種のピークとは、前記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に起因したピークである。

液体中でポリペプチドとリガンドとを混合して複合体を形成し、前記複合体を含む液体を得るときの温度は、５℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましく、また、５０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。温度が５℃以上であると、ポリペプチドとリガンドとの吸着性に優れる。また、温度が５０℃以下であると、ポリペプチドやリガンドの変性を抑制することができ、ポリペプチドとリガンドとの吸着性の悪化を抑制することができる。

ポリペプチドとリガンドとを混合するときのｐＨは、生理活性物質であるポリペプチドが安定した構造をとることから、３以上が好ましく、４以上がより好ましく、また、１０以下が好ましく、９以下がより好ましい。

（工程Ｂ）
工程Ｂは、工程Ａで得た前記複合体を含む液体を濾過する工程である。
工程Ｂを有することで、ポリペプチドとリガントとの複合体を含む液体を、ポリペプチドとリガントとの複合体と、不純物とに分離することができる。工程Ａにより複合体を形成させることにより、当該複合体と不純物とのサイズ差が大きくなり、その結果濾過の条件を緩和することができるため好ましい。
本明細書において、濾過とは、濾材を介して液体中の分子を分離することをいう。濾過では、サイズが大きいものが上清に含まれ、サイズが小さいものが濾液に含まれる。

濾材としては、例えば、濾過膜、濾紙、濾過板、フェルト、マット等が挙げられる。これらの濾材の中でも、化学的安定性、精密濾過性に優れることから、濾過膜が好ましい。

濾過膜（濾過に用いる膜）は、孔径が小さ過ぎず、不純物の多くを濾液に含ませることができ、濾過の効率に優れることから、分画分子量は１０，０００以上が好ましく、３０，０００以上がより好ましい。また、孔径が大き過ぎず、複合体の多くを上清に含ませることができることから、分画分子量は２５０，０００以下が好ましく、２００，０００以下がより好ましい。
本明細書において、濾過膜の分画分子量は、その濾過膜で９０％以上保持できる分子量のことをいい、５種類の分子量が既知である標準物質に対する濾過膜の阻止率から算出した値を用いる。

濾過膜の材質としては、例えば、親水性スルホン系高分子膜、親水性芳香族エーテル系高分子膜、親水性フッ素系高分子膜、親水性オレフィン系高分子膜、セルロース系膜、（メタ）アクリル系高分子膜、（メタ）アクリロニトリル系高分子膜、ビニルアルコール系高分子膜等が挙げられる。これらの濾過膜の材質の中でも、親水性に優れることから、親水性スルホン系高分子膜、セルロース系膜が好ましく、親水性スルホン系高分子膜がより好ましい。

濾過の回数は、１回でもよく、複数回でもよいが、複合体と不純物との分離性に優れることから、複数回が好ましい。

濾過の方法としては、例えば、遠心法等の濾材に対し垂直に圧力をかけて液体を流して濾過する方法、タンジェンシャルフロー法等が挙げられる。これらの濾過の方法の中でも、ポリペプチドを安定に取り扱うことができ、工業化スケールにおいても濾過性能に優れることから、タンジェンシャルフロー法が好ましい。

（工程Ｃ）
工程Ｃは、前記工程Ｂで分離された複合体をポリペプチドとリガンドとにさらに分離する工程である。
工程Ｃを有することで、工程Ｂで分離して得られた複合体を、ポリペプチドとリガンドとにさらに分離することとなり、精製されたポリペプチドを得ることができることから、好ましい。

工程Ｃは、リガンドを回収して再利用することができ、環境負荷を抑制することができることから、工程Ｂで分離された複合体をポリペプチドとリガンドとに解離させた後に、ポリペプチドとリガンドとにさらに分離することが好ましい。

複合体をポリペプチドとリガンドとに解離させる方法としては、例えば、ｐＨを下げる等のｐＨの調整、温度を上げる等の温度の調整、塩濃度を上げる等の塩濃度の調整等が挙げられる。これらの解離方法の中でも、工業化スケールにおいても適用が容易であることから、ｐＨの調整、温度の調整が好ましく、ｐＨの調整がより好ましい。ポリペプチドとしてモノクローナル抗体、リガンドとしてプロテインＡを用いる場合、解離方法は、工業化スケールにおいても適用が容易であることから、ｐＨの調整が好ましい。

解離したポリペプチドとリガンドとを分離する方法としては、例えば、濾過、液体クロマトグラフィー、電気泳動等が挙げられる。これらの分離方法の中でも、分離性、効率性に優れることから、濾過、液体クロマトグラフィーが好ましく、液体クロマトグラフィーがより好ましい。

濾材としては、例えば、濾過膜、濾紙、濾過板、フェルト、マット等が挙げられる。これらの濾材の中でも、化学的安定性、精密濾過性に優れることから、濾過膜が好ましい。

濾過膜の材質としては、例えば、親水性スルホン系高分子膜、親水性芳香族エーテル系高分子膜、親水性フッ素系高分子膜、親水性オレフィン系高分子膜、セルロース系膜、（メタ）アクリル系高分子膜、（メタ）アクリロニトリル系高分子膜、ビニルアルコール系高分子膜等が挙げられる。これらの濾過膜の材質の中でも、親水性に優れることから、親水性スルホン系高分子膜、セルロース系膜が好ましく、親水性スルホン系高分子膜がより好ましい。

濾過の回数は、１回でもよく、複数回でもよいが、ポリペプチドとリガンドとの分離性に優れることから、複数回が好ましい。

濾過の方法としては、例えば、遠心法等の濾材に対し垂直に圧力をかけて液体を流して濾過する方法、タンジェンシャルフロー法等が挙げられる。これらの濾過の方法の中でも、ポリペプチドを安定に取り扱うことができ、工業化スケールにおいても濾過性能に優れることから、タンジェンシャルフロー法が好ましい。

液体クロマトグラフィーのモードとしては、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー等が挙げられる。これらの液体クロマトグラフィーのモードの中でも、ポリペプチドとリガンドの双方を安定的に回収することができることから、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが好ましく、効率性に優れることから、イオン交換クロマトグラフィーがより好ましい。

（ポリペプチドの製造方法）
本発明に係るポリペプチドの製造方法は、本発明の分離方法を用いた精製工程を含む。

ポリペプチドの製造方法は、工業生産の観点から、前記分離方法を用いた精製工程以外にも、生物培養又は合成工程、製剤工程を含むことが好ましい。

生物培養とは、細胞等を人工的に培養し、ポリペプチドを産生させる工程である。
合成工程とは、アミノ酸や短鎖のポリペプチドを原料とし、有機合成反応を用いてポリペプチドを生成する工程である。
生物培養又は合成工程は、特に限定されず、公知の生物培養又は合成工程を用いることができる。

製剤工程とは、精製したポリペプチドに必要な成分を配合し、成形する工程である。
製剤工程は、特に限定されず、公知の製剤工程を用いることができる。

前記分離方法を用いた精製工程は、省エネルギー化することができ、効率性に優れることから、以下の精製装置を用いて行うことが好ましい。

（ポリペプチドの精製装置）
本発明に係るポリペプチドの精製装置は、被精製物の供給タンク、希釈液の供給タンク、濾過器及び検出器を含む。

図１は、本発明に係るポリペプチドの精製装置の一実施形態を示す模式図である。以下、ポリペプチドの精製装置について図面を用いながら説明するが、本発明は、この図面に限定されるものではない。

図１に示す精製装置は、被精製物の供給タンク１０、希釈液の供給タンク２０、濾過器３０及び検出器４０を含む。希釈液の供給タンク２０は、被精製物の供給タンク１０に希釈液を供給できるように接続されている。被精製物の供給タンク１０と濾過器３０とは、循環して複数回精製できるように接続されている。検出器４０は、被精製物の供給タンク１０から濾過器３０までの間と、濾過器３０から被精製物の供給タンク１０までの間とに、各々接続されている。

被精製物の供給タンク１０は濾過器３０に被精製物を供給するためのタンクであり、ポリペプチドとリガンドとを含む。ポリペプチドとリガンドは複合体を形成した液体状態で被精製物の供給タンク１０に含まれており、これを濾過器３０に通すことで、ポリペプチドとリガントとの複合体（上清）と、不純物（濾液）とに、分離することができる。複合体と不純物との分離性に優れることから、被精製物を循環させて複数回濾過器３０に通すことが好ましい。

被精製物の供給タンク１０から濾過器３０に被精製物を安定的に供給するため、被精製物の供給タンク１０の出口付近に供給ポンプを接続することが好ましい。

被精製物の供給タンク１０の材質は、ポリペプチドやリガントと非特異吸着を起こさないことから、親水性の材質が好ましく、表面を親水化した樹脂がより好ましい。

希釈液の供給タンク２０は、被精製物の供給タンク１０に希釈液を供給するためのタンクである。
被精製物を濾過器３０に通すことで被精製物が濃縮され、徐々に濾過の効率性が下がるが、希釈液の供給タンク２０から希釈液を供給することで、濾過の効率性の低減を抑制することができる。
希釈の度合いは、適宜設定すればよいが、液体中の複合体の濃度が一定になるように希釈液を供給することが好ましい。

液体中の複合体の濃度は、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、５ｇ／Ｌ以上がより好ましく、また、３００ｇ／Ｌ以下が好ましく、２００ｇ／Ｌ以下がより好ましい。液体中の複合体の濃度が１ｇ／Ｌ以上であると、分離を短時間で完了することができる。また、液体中の複合体の濃度が３００ｇ／Ｌ以下であると、複合体の析出を抑制することができる。

濾過器３０は、被精製物を精製、即ち、複合体と不純物とを分離するためのものである。

濾材としては、例えば、濾過膜、濾紙、濾過板、フェルト、マット等が挙げられる。これらの濾材の中でも、化学的安定性、精密濾過性に優れることから、濾過膜が好ましい。

濾過膜の材質としては、例えば、親水性スルホン系高分子膜、親水性芳香族エーテル系高分子膜、親水性フッ素系高分子膜、親水性オレフィン系高分子膜、セルロース系膜、（メタ）アクリル系高分子膜、（メタ）アクリロニトリル系高分子膜、ビニルアルコール系高分子膜等が挙げられる。これらの濾過膜の材質の中でも、親水性に優れることから、親水性スルホン系高分子膜、セルロース系膜が好ましく、親水性スルホン系高分子膜がより好ましい。

検出器４０は、精製装置の系内を安定に保つために設置することが好ましい。
検出器４０としては、例えば、圧力検出器、濃度検出器、質量検出器、流量検出器、温度計等が挙げられる。これらの検出器４０の中でも、圧力耐久性が低い濾過膜を有する精製装置の系内の安定性に優れることから、流量検出器と圧力検出器とを併用することが好ましい。

（用途）
本発明のポリペプチドの分離方法及び本発明のポリペプチドの製造方法は、工業化スケールにおいても適用可能で、ポリペプチドの生産性に優れる。また、本発明のポリペプチドの精製装置は、工業化スケールにおいても適用可能な高効率のポリペプチドの分離や製造が可能である。

本発明の分離方法で得られたポリペプチド、本発明の製造方法で得られたポリペプチド、本発明の精製装置を用いて得られたポリペプチドは、例えば、医療用医薬品、機能性食品、高付加価値化合物合成の中間体等に好適に用いることができ、健康状態の改善効果に優れることから、特に医療用医薬品に好適に用いることができる。

以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。

［参考例１～９］
１０ｇ／Ｌのモノクローナル抗体水溶液、５０ｇ／ＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ水溶液及びリン酸緩衝液（０．００２７ｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、０．１３７ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸、ｐＨ７．４）を、表１に記載の配合量で２ｍＬポリプロピレン製チューブに添加して撹拌し、２０℃で２時間静置させ、ポリペプチドとリガンドとの複合体を含む液体を得た。
得られたポリペプチドとリガンドとの複合体を含む液体中の成分の分画状況を、サイズ排除クロマトグラフィーにより確認した。サイズ排除クロマトグラフィーの条件は、下記の条件とした。
カラム：「ＴＳＫゲル Ｇ３０００ ＳＷＸＬ」（商品名、内径８ｍｍ、長さ３００ｍｍ）
移動相：リン酸緩衝液（０．００２７ｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、０．１３７ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸、ｐＨ７．４）
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
サンプル量：０．０１ｍＬ

得られたクロマトグラムを、まとめて図２に示す。
標準物質のピーク位置から、保持時間約６分に存在するピークが次の（ｉ）に起因したピーク、保持時間約７分に存在するピークが次の（ｉｉ）に起因したピーク、保持時間約９分に存在するピークが次の（ｉｉｉ）に起因したピークであることを確認することができた。
また、得られたクロマトグラムより、次の（ｉ）～（ｉｉｉ）に起因したピークから、各々の複合体又はポリペプチドの存在率を算出した。
（ｉ）リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体
（ｉｉ）リガンド１分子に対してポリペプチド１分子が複合化した複合体
（ｉｉｉ）リガンドと複合化していないポリペプチド
結果を、表２に示す。

［実施例１］
１０ｇ／Ｌのモノクローナル抗体水溶液、５０ｇ／ＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ水溶液及びリン酸緩衝液（０．００２７ｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、０．１３７ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸、ｐＨ７．４）を、表１の参考例９の配合量で２ｍＬポリプロピレン製チューブ中に添加して撹拌し、２０℃で２時間静置させ、ポリペプチドとリガンドとの複合体を含む液体を得た。
得られた複合体を含む液体を、膜濾過デバイス「アミコンウルトラ－０．５」（商品名、メルク社製、ウルトラセル、分画分子量１００，０００）に注入し、下記（１）～（９）の手順にて遠心濾過を行い、上清と濾液を得た。遠心分離の条件は、いずれも１５，０００（×ｇ）で３分間とした。
（１）遠心分離にて濾過し、上清と濾液を得る。濾液は、全量を膜濾過デバイスから採取し、別に保存する。
（２）（１）で得られた上清に、リン酸緩衝液を添加する。
（３）遠心分離にて濾過し、上清と濾液を得る。濾液は、全量を膜濾過デバイスから採取し、別に保存する。
（４）（３）で得られた上清に、リン酸緩衝液を添加する。
（５）遠心分離にて濾過し、上清と濾液を得る。濾液は、全量を膜濾過デバイスから採取し、別に保存する。
（６）（５）で得られた上清に、リン酸緩衝液を添加する。
（７）遠心分離にて濾過し、上清と濾液を得る。濾液は、全量を膜濾過デバイスから採取し、別に保存する。
（８）（７）で得られた上清に、リン酸緩衝液を添加する。
（９）遠心分離にて濾過し、上清と濾液を得る。濾液は、全量を膜濾過デバイスから採取し、別に保存する。
前記（１）の濾過前の液体、前記（９）で得られた上清、前記（１）で得られた濾液、前記（５）で得られた濾液及び前記（９）で得られた濾液について、サイズ排除クロマトグラフィーにより、各液体中の成分の分画状況を確認した。サイズ排除クロマトグラフィーの条件は、参考例９と同様とした。
得られたクロマトグラムを、図３にまとめて示す。

［比較例１］
５０ｇ／ＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ水溶液を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様に操作し、各液体中の成分の分画状況を確認した。
得られたクロマトグラムを、図４にまとめて示す。

実施例１で得られたクロマトグラムから、リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体及びリガンド１分子に対してポリペプチド１分子が複合化した複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。また、不純物をより除去するために濾過を複数回行ったとしても、複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。
一方、比較例１で得られたクロマトグラムから、リガンドと複合化していないポリペプチドの一部が濾過膜を通過したことが確認された。

［実施例２］
膜濾過デバイスを「アミコンウルトラ－０．５」から「Ａｐｏｌｌｏ ７ｍｌ」（商品名、Ｏｒｂｉｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、分画分子量１５０，０００）へ変更したこと以外は、実施例１と同様に操作し、各液体中の成分の分画状況を確認した。
得られたクロマトグラムを、図５にまとめて示す。

［比較例２］
５０ｇ／ＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ水溶液を添加しなかったこと以外は、実施例２と同様に操作し、各液体中の成分の分画状況を確認した。
得られたクロマトグラムを、図６にまとめて示す。

実施例２で得られたクロマトグラムから、リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体及びリガンド１分子に対してポリペプチド１分子が複合化した複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。また、不純物をより除去するために濾過を複数回行ったとしても、複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。
一方、比較例２で得られたクロマトグラムから、リガンドと複合化していないポリペプチドの多くが濾過膜を通過したことが確認された。

［実施例３］
表１の参考例９の配合量を参考例３の配合量に変更した以外は、実施例１と同様に操作し、各液体中の成分の分画状況を確認した。
得られたクロマトグラムを、図７にまとめて示す。

実施例３で得られたクロマトグラムから、リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。また、不純物をより除去するために濾過を複数回行ったとしても、複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。
一方、比較例１で得られたクロマトグラムから、リガンドと複合化していないポリペプチドの一部が濾過膜を通過したことが確認された。

［実施例４］
表１の参考例９の配合量を参考例３の配合量に変更した以外は、実施例２と同様に操作し、各液体中の成分の分画状況を確認した。
得られたクロマトグラムを、図８にまとめて示す。

実施例４で得られたクロマトグラムから、リガンド１分子に対してポリペプチド２分子以上が複合化した複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。また、不純物をより除去するために濾過を複数回行ったとしても、複合体の多くを、濾過膜を通過させることなく上清に残すことができたことが確認された。
一方、比較例２で得られたクロマトグラムから、リガンドと複合化していないポリペプチドの多くが濾過膜を通過したことが確認された。

［参考例１０］
１０ｇ／Ｌのモノクローナル抗体水溶液２００μＬ、５０ｇ／ＬのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ水溶液２００μＬ及びリン酸緩衝液（０．００２７ｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、０．１３７ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸、ｐＨ７．４）１００μＬを、２ｍＬポリプロピレン製チューブ中で攪拌し、ポリペプチドとリガンドとの複合体を含む液体を得た。得られた液体を２０℃で２時間静置させ、その後、静置した液体を１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液でｐＨ４．５に調製した。
比較対象として、モノクローナル抗体水溶液２００μＬ及びリン酸緩衝液３００μＬを混和したポリペプチドを含む液体、並びに、プロテインＡ水溶液２００μＬ及びリン酸緩衝液３００μＬを混和したリガンドを含む液体を調製した。

調製した３種類の液体を、カチオン交換クロマトグラフィーにより、分画状況を確認した。カチオン交換クロマトグラフィーの条件は、下記の条件とした。
カラム：「ＣｈｒｏｍＳｐｅｅｄ Ｓ１０３」（商品名、三菱ケミカル株式会社製、内径５ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
移動相：２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．５）
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
サンプル量：０．０１ｍＬ
得られたクロマトグラムを、図９にまとめて示す。

図９から、参考例１０のようなｐＨの調整を行うことで、ポリペプチド（モノクローナル抗体）とリガンド（プロテインＡ）との複合体をポリペプチドとリガンドとに解離することができ、次ぐカチオン交換クロマトグラフィーによりポリペプチドとリガンドとを分離できることを確認することができた。

これらの実施例・比較例・参考例の結果から、煩雑な再生処理を必要とするアフィニティ分離剤を用いることなく、工業化スケールにおいても適用可能で、ｐＨ４以上という抗体にダメージを与えない温和なｐＨ条件のもと、ポリペプチドを高純度で回収し、リガンドをも高純度で回収できることを確認することができた。

本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。本出願は２０１８年６月２９日出願の日本特許出願（特願２０１８－１２３９８１）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。

本発明のポリペプチドの分離方法及び本発明のポリペプチドの製造方法は、工業化スケールにおいても適用可能で、ポリペプチドの生産性に優れる。また、本発明のポリペプチドの精製装置は、工業化スケールにおいても適用可能な高効率のポリペプチドの分離や製造が可能である。
本発明の分離方法で得られたポリペプチド、本発明の製造方法で得られたポリペプチド、本発明の精製装置を用いて得られたポリペプチドは、例えば、医療用医薬品、機能性食品、高付加価値化合物合成の中間体等に好適に用いることができ、健康状態の改善効果に優れることから、特に医療用医薬品に好適に用いることができる。

１０ 被精製物の供給タンク
２０ 希釈液の供給タンク
３０ 濾過器
４０ 検出器

Claims (7)

1. 以下の工程Ａ及び工程Ｂを含み、ポリペプチドがモノクローナル抗体であり、リガンドがプロテインＡである、ポリペプチドの分離方法。
   工程Ａ：液体中でポリペプチドとリガンドとを混合して、ポリペプチドとリガンドとの複合体を形成し、前記複合体を含む液体を得る工程であって、
   前記リガンド１ｍｏｌに対して前記ポリペプチドを１．８ｍｏｌ以上混合し、
   前記複合体が、前記リガンド１分子に対して前記ポリペプチド２分子以上が複合化したものを７０％以上含み、前記リガンド１分子に対して前記ポリペプチド１分子が複合化したものを３０％以下含む、工程。
   工程Ｂ：前記工程Ａで得た前記複合体を含む液体を濾過する工程。
2. 前記工程Ａにおいて、前記リガンド１ｍｏｌに対して前記ポリペプチドを２．１ｍｏｌ以上混合する、請求項１に記載の分離方法。
3. 前記工程Ｂの濾過に用いる膜の分画分子量が１０，０００～２５０，０００である、請求項１又は２に記載の分離方法。
4. 更に、以下の工程Ｃを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の分離方法。
   工程Ｃ：前記工程Ｂで分離された複合体をポリペプチドとリガンドとにさらに分離する工程。
5. 前記工程Ｃにおいて、前記分離された複合体をポリペプチドとリガンドとに解離させた後に、濾過又は液体クロマトグラフィーによりさらに分離する、請求項４に記載の分離方法。
6. 前記工程Ｃにおけるさらなる分離を、イオン交換クロマトグラフィーにより行う、請求項４又は５に記載の分離方法。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の分離方法を用いた精製工程を含む、ポリペプチドの製造方法。

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