JP7590631B1 - 肺サーファクタントプロテインｄの測定方法、測定キット、モノクローナル抗体及び細胞 - Google Patents

Abstract

この肺サーファクタントプロテインＤの測定方法は、肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されている。

Description

NITE BP-03825 NITE BP-03826

本発明は、肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、モノクローナル抗体及び細胞に関する。
本願は、２０２３年３月２３日に日本に出願された特願２０２３－０４６６３３号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。

肺サーファクタントは、肺のＩＩ型肺胞上皮細胞より産生及び分泌されるタンパク質である。肺サーファクタントは、肺胞表面の表面張力を弱めることで肺胞を膨らみやすくし、呼吸やガス交換を助ける働きがある。

肺サーファクタントは、肺サーファクタントプロテイン－Ａ（以降、ＳＰ－Ａと記載することがある。）、肺サーファクタントプロテイン－Ｂ（以降、ＳＰ－Ｂと記載することがある。）、肺サーファクタントプロテイン－Ｃ（以降、ＳＰ－Ｃと記載することがある。）及び肺サーファクタントプロテイン－Ｄ（以降、ＳＰ－Ｄと記載することがある。）を含む。ＳＰ－Ａ及びＳＰ－Ｄは、親水性糖タンパク質である。ＳＰ－Ａ及びＳＰ－Ｄは、生体防御作用を有しており、特異脂質と結合する。ＳＰ－Ｂ及びＳＰ－Ｃは、疎水性タンパク質であり、リン脂質と会合する。

ＳＰ－Ｄの測定は、間質性肺炎の鑑別、活動性の指標及び予後予測において有用である。またＳＰ－Ｄは、間質性肺炎の治療が効果的であると速やかに減少することから、治療経過観察にも用いられる。血液中のＳＰ－Ｄの測定は、例えば非特許文献１に記載のように、２種の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により行うことができる。

Preston E. Bratcher et al., Factors Influencing the Measurement of Plasma/Serum Surfactant Protein D Levels by ELISA PLOS ONE, November 2014, Volume 9, Issue 11

ＳＰ－Ｄは、生体内で３量体から３６量体、若しくはそれ以上の幅広い多量体を形成することが知られている。血液中のＳＰ－Ｄの多量体の分布は、試料提供者の体質や病態により異なる。一方で、これまでのサンドイッチＥＬＩＳＡ等によるＳＰ－Ｄの測定方法では、多量体を構成する単量体の数の変化（例えば、１２量体から３６量体への変化）に伴いエピトープが集中してアビディティが変動したり、エピトープの露出面が変化したりすることで、抗体と各多量体のＳＰ－Ｄとの反応性が異なることがある。そのため、ＳＰ－Ｄの多量体の分布が異なると、ＳＰ－Ｄの定量値が変化する場合がある。

本発明の目的は、肺サーファクタントプロテインＤの多量体を構成する単量体数の多寡によらず正確な定量が可能である肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、及びこれらに用いられるモノクローナル抗体並びにこの抗体を生産するハイブリドーマを提供することにある。

本発明の一態様は、以下を包含する。
［１］肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、
前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、
前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されている、肺サーファクタントプロテインＤの測定方法。
［２］前記不溶性担体がラテックス粒子である、［１］に記載の測定方法。
［３］前記不溶性担体が平板状であり、
前記複合体が前記不溶性担体に担持されている前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体とを含む、［１］に記載の測定方法。
［４］前記試料が血清または血漿である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の測定方法。
［５］前記肺サーファクタントプロテインＤが３量体の肺サーファクタントプロテインＤである基本ユニットを少なくとも１つ含み、
１つの前記基本ユニットに対し、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体が１つのみ結合する、［１］～［４］のいずれか一項に記載の測定方法。
［６］前記検出する工程において３量体の肺サーファクタントプロテインＤが検出されない、［１］～［５］のいずれか一項に記載の測定方法。
［７］前記検出する工程において、前記基本ユニットが２つ以上会合した肺サーファクタントプロテインＤを検出する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の測定方法。
［８］抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む肺サーファクタントプロテインＤの測定キット。
［９］前記不溶性担体と前記標識物とが同一の物質である、［８］に記載の測定キット。
［１０］３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合するモノクローナル抗体であって、１つの前記３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する、モノクローナル抗体。
［１１］１２量体の肺サーファクタントプロテインＤに少なくとも２つが結合する、［１０］に記載のモノクローナル抗体。
［１２］［１０］又は［１１］に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
［１３］独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６として寄託された、ハイブリドーマ。

上記態様によれば、多量体の肺サーファクタントプロテインＤを構成する単量体数の多寡によらず正確な定量が可能である肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、及びこれらに用いられるモノクローナル抗体並びにこの抗体を生産する細胞を提供することができる。

抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と生体試料由来のＳＰ－Ｄとの反応性を示すグラフである。 Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した際のクロマトグラムである。 Ｒ＆Ｄ社製のｒＳＰ－Ｄ及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した際のクロマトグラムである。 実施例２における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。 比較例３における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。 比較例４における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。

＜肺サーファクタントプロテインＤの測定方法＞

本発明の一態様における肺サーファクタントプロテインＤ（以降、ＳＰ－Ｄと記載する）の測定方法は、ＳＰ－Ｄを含む試料と、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、前記ＳＰ－Ｄと少なくとも２つの前記抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、前記不溶性担体は、前記抗ＳＰ－Ｄ抗体として一種の抗体のみが担持されている。

以下に本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定方法について説明する。ただし、以下に示す実施形態は、あくまでも例示に過ぎず、実施形態で明示しない種々の変形例や技術の適用は排除されない。すなわち、本実施形態をその趣旨を逸脱しない範囲で種々変更して実施することができる。

（試料）
本明細書における「試料」としては、主に生体由来の体液を挙げることができる。試料としては、血液、血清、血漿及び羊水が挙げられ、血清及び血漿が好ましい。試料を採取する対象は、ヒト又は動物（例えば、サル、イヌ、又はネコ）を含み、好ましくはヒトである。試料は、対象からの試料そのものであってもよく、採取した試料に通常行われる希釈又は濃縮等の処理を行ったものであってもよい。なお、本発明に用いられる試料の採取や調製を行う者は、本発明の測定方法を行う者と同一人物でもよく、別人物であってもよい。また、本発明の測定方法に用いられる試料は、本発明の測定方法の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。

（ＳＰ－Ｄ）
ＳＰ－Ｄは、モノマーであるが、モノマー３つが会合している３量体を形成する。本明細書では、この３量体を基本ユニットと記載することがある。ＳＰ－Ｄは、基本ユニットが４つ会合して１２量体を形成する。さらに、この１２量体が更に会合して３６量体等を形成する。本明細書において、ＳＰ－Ｄの多量体とは基本ユニットが２つ以上会合して形成されたものを示す。ＳＰ－Ｄの多量体は、基本ユニットが４つ以上会合したものであることが好ましい。本明細書において、単にＳＰ－Ｄと記載している場合、単量体、３量体及び各多量体のＳＰ－Ｄを含む総称を意味する。

（モノクローナル抗体）
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するハイブリドーマから得られた抗体又は抗体分子を意味する。本発明の測定方法では、本発明の効果が得られる限りにおいて、このモノクローナル抗体の機能を有する抗体断片も使用することができる。モノクローナル抗体の機能を有する抗体断片としては、例えば、モノクローナル抗体の酵素的消化により得られる前記モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、遺伝子組換えによって作製される前記モノクローナル抗体のＦａｂ部分を含む機能性断片、及びファージディスプレイ法で作製されたｓｃＦｖを含む機能性断片等が挙げられる。

（モノクローナル抗体の調製方法）
本発明の一態様におけるモノクローナル抗体は、抗原（免疫原ともいう）として、ＳＰ－Ｄをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を非ヒト動物に投与して免疫することにより調製できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質又はペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。

免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、アルパカ、マウス、又はラットが好ましく、より好ましくはマウス又はラットを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は、最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体を得るために、引き続き以下の操作が行われることができるが、これらに限定されることはない。モノクローナル抗体それ自体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されている。よって当業者は、前記の抗原を用いることによって本発明のモノクローナル抗体を調製することが可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８） 第６章などを参照のこと）。

最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株と細胞融合することによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質及び量）が高い細胞を用いることが好ましい。また骨髄腫由来の細胞株は、融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることがより好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、又は電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、本分野の汎用の条件に従って増殖させることができる。産生される抗体の性質を確認しつつ、所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの周知の方法により行うことが可能である。

クローニング工程後、産生されるモノクローナル抗体とＳＰ－Ｄとの結合能をＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ法、又は蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることができる。これらの操作により、選択されたハイブリドーマが所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するか否かを確認することができる。

前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法、及び哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中にモノクローナル抗体を産生させる方法などを挙げることができる。

本発明の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、Genscript社製の組換えヒトＳＰ－Ｄを免疫原とし、Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＦ３４４／Ｊｃ１ラットに対し皮下免疫及び腹腔免疫して得られた細胞由来の抗体であることが好ましい。例えば、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０２３年２月１４日に、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６及び受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５として受託されたハイブリドーマから産生されるＳ２１２０８及びＳ２１２０２であることが好ましく、Ｓ２１２０８であることがより好ましい。

本発明におけるＳＰ－Ｄの測定方法において、ＳＰ－Ｄと結合するモノクローナル抗体は、１種類のみ、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のみであり、かつサンドイッチ系を構築する。本明細書において、サンドイッチ系とは、被検出物質、すなわちＳＰ－Ｄを少なくとも２つのモノクローナル抗体で挟みこむ方法である。

サンドイッチ系を構築する場合、少なくとも２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のうち少なくとも１つは、固相抗体であり、少なくとも１つは、標識抗体であることが好ましい。本明細書において、固相抗体とは、固相、すなわち不溶性担体上に直接的又は間接的に固相化されたモノクローナル抗体を意味する。本明細書において、標識抗体とは、後述する当業者に周知慣用の標識物質で直接的又は間接的に標識されているモノクローナル抗体を意味する。本発明において、固相抗体と標識抗体とは、同一種、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体である。

抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、３量体のＳＰ－Ｄ（つまり、基本ユニット）に１つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のみが結合する。このメカニズムとして、エピトープが基本ユニットの１ヶ所に集中しており、１つ目の抗体が結合すると、２つ目の抗体が１つ目の抗体によって立体障害を受けてエピトープに近づけないことが考えられる。したがって基本ユニットを２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によりサンドイッチすることができず、複合体を形成することができない。よって、本実施形態の測定方法において３量体のＳＰ－Ｄを検出することができない。

一方で基本ユニットが２つ以上含まれるＳＰ－Ｄ、例えば１２量体及び３６量体等のＳＰ－Ｄは、異なる２つの基本ユニットそれぞれに異なる２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が結合することができる。よって、本実施形態の測定方法では、１２量体及び３６量体等の基本ユニットが２つ以上含まれるＳＰ－Ｄを検出することができる。

固相抗体は、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる、又は化学的に結合（適当なスペーサーを介してよい）させることにより製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、又はセルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる固相を用いることができる。不溶性担体の形状は特に限定されず、平板状（例えば、マイクロプレート及びメンブレン）、ビーズ若しくは粒子状（例えば、ラテックス粒子及び磁性粒子）、又は筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。

本発明のＳＰ－Ｄの測定方法に使用されるモノクローナル抗体と直接的に結合可能な標識抗体を用いることにより、ＳＰ－Ｄの量を測定することもできる。本明細書では、本発明のモノクローナル抗体に結合し、且つ標識物質を結合させた抗体を二次抗体と称する。この二次抗体を用いて、標識物質を本発明のモノクローナル抗体に間接的に結合させてもよい。

標識物質が発するシグナルの強さや標識物質の凝集による濁度を測定して、試料中のＳＰ－Ｄの量を測定することができる。標識抗体を調製するための標識物質としては、例えば金属錯体、酵素、不溶性粒子、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックスが挙げられる。標識物質とモノクローナル抗体との結合法としては、当業者に利用可能な物理吸着、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法を用いることができる。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質を用いて酵素活性を測定することができる。例えば、酵素がＨＲＰの場合には、Ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いることができ、ＡＬＰの場合にはｐ―ニトロフェニル・ホスフェートを用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には、モノクローナル抗体をビオチンで標識し、酵素、色素、又は蛍光標識（好ましくはＨＲＰ）で標識したアビジン又はストレプトアビジンを反応させることもできる。

本明細書において、抗原や抗体を固相に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定化」又は「固相化」と表現することがある。また、「分析」、「検出」、又は「測定」という用語は、ＳＰ－Ｄの定量を含む。

本発明におけるＳＰ－Ｄの測定方法は、抗原と抗体の反応を利用して、試料の中に含まれるＳＰ－Ｄの濃度を測定する方法である。本発明におけるＳＰ－Ｄの測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ法）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の免疫測定方法は、好ましくは、ＬＴＩＡである。

本発明のＳＰ－Ｄの測定方法は、インビボ又はインビトロの免疫測定方法であってもよい。また、感度を増強するために、増感剤を使用することもできる。本発明のＳＰ－Ｄの測定方法において、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と試料を測定系に添加する順序は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されることはない。すなわち、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を、試料の添加前に、試料の添加と同時に、又は試料の添加の後に、測定系に添加することができる。

以下、採用する測定方法毎に、測定の手順及び原理を説明する。下記は、本発明の一実施形態における測定の手順及び原理を単に例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

下記の免疫測定方法の各々において、モノクローナル抗体の固相への固定化の方法、モノクローナル抗体と標識物質との結合方法及び標識物質の種類等の具体的な方法は、前述のものを含め、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。

（ラテックス免疫比濁法）
ラテックス免疫比濁法とは、ラテックス粒子表面に担持された抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体とＳＰ－Ｄとが結合することによって生じるラテックス粒子の凝集を利用した免疫測定方法である。ラテックス粒子としては、体外診断薬に一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されない。凝集反応測定時のラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子の平均粒径等は、感度又は性能に応じて適宜設定することができる。本発明のＳＰ－Ｄの測定方法として、ラテックス免疫比濁法を使用する場合の測定手順及び原理は、以下のとおりである。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体が担持されたラテックス粒子と試料と接触させる。
（２）試料中のＳＰ－Ｄが少なくとも２つの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と複合体を形成し、ラテックス粒子が凝集する。
（３）試料に近赤外光（例えば波長６００ｎｍ）を照射して、吸光度の測定又は散乱光の測定を行う。測定値に基づき、ＳＰ－Ｄの濃度を求める。

本発明のＳＰ－Ｄの測定方法としてラテックス免疫比濁法を使用する場合、ラテックス粒子は、不溶性担体であり且つ標識物質として作用する。ラテックス粒子に担持されるＳＰ－Ｄと結合するモノクローナル抗体は、１種類のみ、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体のみである。

測定装置としては、生化学自動分析装置（例えば日立社製、日立自動分析装置３５００）を用いることができる。

（ＥＬＩＳＡ）
本明細書においてＥＬＩＳＡとは、試料中に含まれる被検出物質であるＳＰ－Ｄを、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を利用して捕捉した後に、酵素反応を利用して検出する方法を意味する。固相はプレート（イムノプレートともいう）が好ましい。標識としては、ＨＲＰ又はＡＬＰを使用することができる。本発明のＳＰ－Ｄ測定方法として、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する場合の測定手順及び原理は、以下のとおりである。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化した固相に試料を接触させ、試料中のＳＰ－Ｄが抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、つまり固相抗体と結合する。
（２）標識した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、すなわち標識抗体を固相に添加して反応させると、標識抗体がＳＰ－Ｄに結合して固相抗体－ＳＰ－Ｄ－標識抗体の複合体、すなわちサンドイッチを形成する。
（３）洗浄後、標識物質を発色させ吸光度を測定する。

測定した標識物質の量に応じて、試料中のＳＰ－Ｄの量を測定することができる。

サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、二次抗体を用いることもできる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され、検出感度を高めることができる。二次抗体は、下記の例の場合は、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を特異的に認識する抗体である。二次抗体を用いる場合、以下の手順（１）～（５）を採用することができる。
（１）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を固定化した固相に試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。
（２）抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行う。
（３）さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行う。
（４）基質を加えて発色させる。
（５）プレートリーダー等を用いて発色を測定することによりＳＰ－Ｄの量を測定する。

本発明のＳＰ－Ｄの測定方法としてＥＬＩＳＡを使用する場合、ＳＰ－Ｄと結合する固相抗体と標識抗体は、同一種、すなわち同一のアミノ酸配列の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体である。

上記の態様によれば、多量体のＳＰ－Ｄを構成する単量体数の多寡によらず、正確なＳＰ－Ｄの定量が可能である。

＜測定キット＞
本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定キットは、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含む。

不溶性担体と標識物とは、同一の物質であってもよく、ラテックス粒子であってもよい。不溶性担体に担持されているＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と、標識抗体のＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、同一種、つまり同一のアミノ酸配列の抗体である。

ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合し、１つの３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する。少なくとも２つのＳＰ－Ｄモノクローナル抗体は、１２量体又は３６量体のＳＰ－Ｄと結合する。

ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体、不溶性担体、標識物及び標識抗体については、上述の通りであり、その内容を適用することができる。

本発明の一態様におけるＳＰ－Ｄの測定キットは、ＳＰ－Ｄの測定に使用される標準抗原物質、精度管理用抗原試料といった、他の検査試薬及び検体希釈液の少なくとも１つを含んでいてもよい。

なお、以上説明した、本発明のモノクローナル抗体の調製方法、本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子、この核酸分子を含むベクター又はプラスミド、この核酸分子やベクター又はプラスミドを含む細胞、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ等も、本発明の対象となる。

以下では実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は後述する実施例に限定されるものではない。

＜モノクローナル抗体の調製＞
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製の組換えヒトＳＰ－Ｄ（以下、ｒＳＰ－Ｄ）を免疫原とした。ｒＳＰ－Ｄを、初回免疫はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２回目免疫以降はＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１：１で混合して用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＦ３４４／Ｊｃｌラットに対し、初回免疫は２５μｇ、２回目免疫以降２０μｇ（ＰＢＳで希釈）の免疫原量を用い、隔週で皮下免疫を継続した。３回免疫実施後に抗原固相化ＥＬＩＳＡにより血中抗体力価を評価した。十分な力価上昇の確認できた個体については、解剖の１～３日前にＰＢＳで希釈した免疫原を腹腔免疫した。その後、脾臓細胞、腸骨リンパ節細胞及び鼠頸部リンパ節細胞を回収し、電気融合法によりミエローマ細胞ＳＰ２／０と融合した。融合細胞（すなわちハイブリドーマ）は、９６ｗｅｌｌプレートで培養し、融合から７又は８日後に培養上清を回収した。その後、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを実施し、ｒＳＰ-Ｄに反応性を示す株を選択した。なお、スクリーニング前日に培地交換を行った。

＜抗ＳＰ－Ｄ抗体のスクリーニング＞
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ＮＵＮＣ４４２４０４）にｒＳＰ－Ｄ（１μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴを４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間あるいは４℃で終夜静置した。ブロッキング液を除去後、細胞培養上清と１０００及び１００００倍希釈の抗血清をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，９５００倍希釈）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，８５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、反応停止後、プレートリーダーで測定した（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）。これにより、ｒＳＰ-Ｄに反応性を示す抗体を選抜した。獲得した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を表１に示す。

＜分析例１＞ 抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体の特異性確認
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ＮＵＮＣ４４２４０４）にｒＳＰ－Ｄ、組換えヒトサーファクタントＡ（ＳＰ-Ａ）、組換えヒトＣｏｌｌｅｃｔｉｎ Ｌｉｖｅｒ１（ＣＬＬ１）及び組換えヒトＭａｎｎａｎ-Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｌｅｃｔｉｎ（ＭＢＬ）抗原の混合液（各１μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間あるいは４℃で終夜静置した。ブロッキング液を除去後、表２に示す各抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，１０３１－０５、９５００倍希釈）又はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＡｂ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製，３０５０－１５、８５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、反応停止後、プレートリーダーで測定した（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）。各ウェルの測定値から、抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を分注せずに測定したウェルの測定値を減算して検出値を算出した結果を表２に示す。いずれの抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体もｒＳＰ－Ｄのみに強く反応し、ＳＰ－Ｄ以外の抗原との反応性は全くないか極めて低かった。

＜分析例２＞ 抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と生体試料由来のＳＰ－Ｄとの反応性評価
Ｏｃｔｅｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｒｅｄ３８４）を用い、分子間相互作用測定により抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体と羊水中に含まれる生体由来ＳＰ－Ｄとの反応性を評価した。Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体をストレプトアビジンセンサーに結合させ、ブロッキング処理を行った。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ツイーン（登録商標）入りリン酸緩衝食塩水）で５倍希釈した羊水、又は、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬに調整したｒＳＰ－Ｄと抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体との反応性を評価した。結果を図１に示す。図１に示す通り、獲得したすべての抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体がｒＳＰ－Ｄ及び羊水中の生体由来ＳＰ－Ｄと反応した。

＜分析例３＞ サンドイッチＥＬＩＳＡによる生体試料由来ＳＰ－Ｄ検出
獲得した抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を組み合わせて、血清中のＳＰ－Ｄを検出可能か検討した。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体としての抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。各ウェルを５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳＴ（洗浄液）が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄し、各ウェルに１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ブロッキング液）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して室温で１時間静置した。各ウェルからブロッキング液を除去し、各ウェルに血清を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴでＳＰ－Ｄ濃度が１００ｎｇ／ｍＬになるように希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注して室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄し、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるようそれぞれ分注し、室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。

吸光度が０．１未満の抗体組合せを－、０．１以上０．５未満のモノクローナル抗体組合せを＋、０．５以上１．０未満のモノクローナル抗体組合せを＋＋、１．０以上のモノクローナル抗体組合せを＋＋＋とした結果を表３に示す。同じモノクローナル抗体同士の組合せを含む、複数の抗体組合せで血清中のＳＰ－Ｄを検出可能であった。特に、Ｓ２１２０２、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０８抗体を組み合わせた場合に生体試料由来のＳＰ－Ｄを高感度に検出可能であった。

＜分析例４＞ ｒＳＰ－Ｄの多量体分布解析１
ＴＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄを５５μｇ含む溶液をそれぞれ添加し、流速０．７ｍＬ／分でゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。その際のＵＶ吸光度を記録した。１００μＬの５％ＢＳＡを含むＴＢＳを予め分注したチューブに、４００μＬずつ溶出液を分取した。分取後のフラクションはよく混合後、分注して－３０℃で保存した。

図２に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した際のクロマトグラムを示す。主に、１２量体のＳＰ－Ｄはフラクション１４、３量体のＳＰ－Ｄはフラクション２３で溶出した。

＜抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出１＞
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体Ｓ２１２０８、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０２を用いて、Ｓ２１２０８固相―Ｓ２１２０８液相（実施例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０２液相（実施例２）、Ｓ２１２０５固相―Ｓ２１２０８液相（比較例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０５液相（比較例２）の四つのＥＬＩＳＡ系を用い、以下に記載の手順で分析例４で得られた各フラクションのｒＳＰ－Ｄを測定した。

ＥＬＩＳＡ用プレートにＰＢＳで５μｇ／ｍＬに調製した固相抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で２時間静置した。５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳＴが４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ（ブロッキング液）を１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。ブロッキング液を除去後、５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで１０００倍希釈した分析例４で得られた各フラクションを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）で定法通りにビオチン化したビオチン化抗体を５ｍＭの塩化カルシウムを含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに調製した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１時間静置した。洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、５ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳで０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液が４００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう用いて３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、室温で１０分間静置した。停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう分注し、プレートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。

これらの結果を表４に示す。同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体でＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する実施例１及び２においては、フラクション１４に含まれる１２量体のＳＰ－Ｄを検出した一方で、フラクション２３に含まれる３量体のＳＰ－Ｄを検出しなかった。異なる抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体２種を用いてＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する比較例１及び２においては、１２量体、３量体いずれのＳＰ－Ｄも検出可能であった。以上の結果から、同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体でＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出することによって、３量体よりも大きい量体のＳＰ－Ｄのみを検出可能であることが分かった。

＜分析例５＞ ｒＳＰ－Ｄの多量体分布解析２
分析例４と同様の方法でＲ＆Ｄ社製又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄのゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。２１７μｇのｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーに供した。

図３に、Ｒ＆Ｄ社製のｒＳＰ－Ｄ及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄをゲル濾過クロマトグラフィーで分析した際のクロマトグラムを示す。主に、３６量体以上のＳＰ－Ｄはフラクション８、１２量体のＳＰ－Ｄはフラクション１２、３量体のＳＰ－Ｄはフラクション２０で溶出した。Ｒ＆Ｄ社製のｒＳＰ－Ｄは、３６量体以上のＳＰ－Ｄが、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のｒＳＰ－Ｄは、１２量体のＳＰ－Ｄが主たる構成物であった。以降、Ｒ＆Ｄ社製のＳＰ－Ｄを分析した際にｎ番目に溶出したフラクションをフラクションＲｎ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製のＳＰ－Ｄを分析した際にｎ番目に溶出したフラクションをフラクションＧｎとする。３６量体以上のＳＰ－Ｄが多く含まれるフラクションＲ８のＵＶ吸光度は２４．６８ｍＡＵ、１２量体のＳＰ－Ｄが多く含まれるフラクションＧ１２のＵＶ吸光度は１１．５３ｍＡＵであった。ｒＳＰ－Ｄのタンパク質濃度は、ＵＶ吸光度と比例するため、フラクションＲ８中の３６量体以上のＳＰ－Ｄと、フラクションＧ１２中の１２量体のＳＰ－Ｄのタンパク質量比は２．１４：１である。

＜ｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出２＞
抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体Ｓ２１２０８、Ｓ２１２０５及びＳ２１２０２を用いて、Ｓ２１２０８固相―Ｓ２１２０８液相（実施例１）、Ｓ２１２０５固相―Ｓ２１２０８液相（比較例１）、Ｓ２１２０２固相―Ｓ２１２０５液相（比較例２）の三つのＥＬＩＳＡ系を用い、＜抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの検出１＞と同様の手順により分析例５で得られた各フラクションのｒＳＰ－Ｄを測定した。

これらの結果を表５に示す。同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体でＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する実施例１では、３６量体以上のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＲ８を測定した際の吸光度と１２量体のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＧ１２を測定した際の吸光度との比は、２．７６：１であり、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける３６量体以上のＳＰ－Ｄと１２量体のＳＰ－Ｄとのタンパク質量比である２．１４：１と同等であった。また、実施例１は、フラクションＧ２０に含まれる３量体のＳＰ－Ｄを検出しなかった。

異なる抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体２種を用いてＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する比較例１及び２においては、３量体のＳＰ－Ｄを検出可能であった。一方で、３６量体以上のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＲ８を測定した際の吸光度と１２量体のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションＧ１２を測定した際の吸光度の比はそれぞれ１：０．８７、１：０．４４であり、ゲル濾過クロマトグラフィーにおけるＳＰ－Ｄの多量体それぞれのタンパク質の量比を反映していなかった。より具体的には、ゲル濾過クロマトグラフィーの結果からタンパク質の量が３６量体以上のＳＰ－Ｄよりも少ないはずである１２量体のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションを測定した吸光度の方が３６量体以上のＳＰ－Ｄが含まれるフラクションを測定した際の吸光度より高くなった。

以上の結果から、同一の抗ＳＰ－Ｄモノクローナル抗体で１２量体以上のＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出すると、ＳＰ－Ｄの多量体における基本ユニットの数に依らず、実際のタンパク質の量を反映した測定が可能であると考えられた。

＜ＳＰ－Ｄ測定用ＬＴＩＡ試薬の調製＞
１）第一試薬
第一試薬として下記の組成の溶液を調製した。
１００ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ （ｐＨ６．０）
５００ｍＭ ＮａＣｌ
０．５％ ＢＳＡ

２）抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス粒子溶液
平均粒子径３１７ｎｍ、臨界凝集濃度２８０ｍＭの１％ポリスチレンラテックス溶液（積水メディカル社製）（１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液）に、等量の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液で０．３５ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＳＰ－Ｄ抗体溶液を添加して４℃、２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液を添加して４℃、１時間攪拌し、抗ヒトＳＰ－Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス溶液を作製した。

３）第二試薬
３－１）実施例２
２）に記載の手順で調製したＳ２１２０８抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液で希釈して第二試薬とした。

３－２）比較例３
２）に記載の手順で調製したＳ２１２０５抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍの吸光度が３．０Ａｂｓ．、Ｓ２１２０８抗体感作ラテックス粒子溶液の波長６００ｎｍにおける吸光度が６．０Ａｂｓ．となるように５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）緩衝液と抗体感作ラテックス粒子溶液とを混合して第二試薬とした。

＜ＳＰ－Ｄ測定試薬によるｒＳＰ－Ｄゲルろ過フラクションの定量＞
１）ＬＴＩＡ試薬による測定方法
第一試薬と第二試薬とを組み合わせ、生化学自動分析装置（日立社製、日立自動分析装置３５００）を用いて、以下の手順により分析例５で得られた各フラクション中のＳＰ－Ｄ濃度を測定及び算出した（実施例２及び比較例３）。各フラクション５μＬに第一試薬を１２０μＬずつ加えて、３７℃、５分間加熱した。第二試薬を４０μＬずつ添加して攪拌した。５分間の吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。既知濃度の組み換えＳＰ－Ｄ（Ｒ＆Ｄ社）測定時の単位時間における吸光度変化量を横軸に、組み換えＳＰ－Ｄ濃度を縦軸にプロットして作成した検量線を用いて、各フラクション中のＳＰ－Ｄ濃度を算出した。

２）ＣＬ ＳＰ－Ｄ「ヤマサ」ＮＸ（ヤマサ醤油株式会社、既認証体外用診断薬（以下、既認証試薬とする））による測定方法
既認証試薬の添付文書に従って分析例５で得られた各フラクションを測定した（比較例４）。既認証試薬の添付文書によると、当該試薬は、異なる２種類の抗ヒトＳＰ－Ｄマウスモノクローナル抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法を原理として、血清中のＳＰ－Ｄを測定する試薬である。

表６は、分析５で得られたフラクションＲ８、Ｒ１２及びＲ２０を用いたときのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示す。図４は、実施例２における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。図５は、比較例３における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。図６は、比較例４における分析５で得られた各フラクションのＳＰ－Ｄ濃度測定値を示すグラフである。

実施例２では、実施例１のＥＬＩＳＡと同様にゲル濾過クロマトグラフィーにおける３６量体以上のＳＰ－Ｄと１２量体のＳＰ－Ｄのタンパク質量比（２．１４：１）と同等の量比でＳＰ－Ｄを検出した。また実施例２では３量体のＳＰ－Ｄを含むフラクションＧ２０の測定値と、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいてフラクションＧ２０よりもタンパク質含有量が低く測定されているフラクションＧ１８の測定値とが同等であり、実施例２は３量体のＳＰ－Ｄを実質的には検出しないと考えられた。

一方、異なる抗体２種を用いた比較例３及び比較例４ではゲル濾過クロマトグラフィーの結果とは異なり、３６量体以上のＳＰ－Ｄを含むフラクションＲ８の測定値よりも１２量体のＳＰ－Ｄを含むフラクションＧ１２の測定値の方が低く算出された。また、比較例３及び比較例４は、いずれも３量体のＳＰ－Ｄを含むフラクションＧ２０測定時にフラクションＧ１８を測定した際よりも高い測定値を示し、３量体のＳＰ－Ｄを検出していた（図５、６）。以上より、同一抗体を用いてＳＰ－Ｄをサンドイッチ検出する場合、ＬＴＩＡ試薬によってもＳＰ－Ｄの多量体における基本ユニットの数に依らず、実際のタンパク質の量を反映した測定が可能であった。

上記態様によれば、多量体の肺サーファクタントプロテインＤを構成する単量体数の多寡によらず正確な定量が可能である肺サーファクタントプロテインＤの測定方法、測定キット、及びこれらに用いられるモノクローナル抗体並びにこの抗体を生産する細胞を提供することができる。

［受託番号］
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５
ＮＰＭＤ ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６
なお、ＮＰＭＤは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）を示すアクロニムである。

Claims (12)

1. 肺サーファクタントプロテインＤを含む試料と、抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体を担持させた不溶性担体とを接触させる工程と、
   前記肺サーファクタントプロテインＤと少なくとも２つの前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体との複合体を検出する工程と、を含み、
   前記不溶性担体は、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体として一種の抗体のみが担持されており、
   前記検出する工程において３量体の肺サーファクタントプロテインＤが検出されない、
   肺サーファクタントプロテインＤの測定方法。
2. 前記不溶性担体がラテックス粒子である、請求項１に記載の測定方法。
3. 前記不溶性担体が平板状であり、
   前記複合体が前記不溶性担体に担持されている前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体とを含む、請求項１に記載の測定方法。
4. 前記試料が血清または血漿である、請求項１に記載の測定方法。
5. 前記肺サーファクタントプロテインＤが３量体の肺サーファクタントプロテインＤである基本ユニットを少なくとも１つ含み、
   １つの前記基本ユニットに対し、前記抗肺サーファクタントプロテインＤ抗体が１つのみ結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の測定方法。
6. 前記検出する工程において、前記基本ユニットが２つ以上会合した肺サーファクタントプロテインＤを検出する、請求項５に記載の測定方法。
7. 抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体が担持されている不溶性担体を含む第１試薬と、前記抗肺サーファクタントプロテインＤモノクローナル抗体と標識物とを含む標識抗体を含む第２試薬と、を含み、
   ３量体の肺サーファクタントプロテインＤを検出しない、
   肺サーファクタントプロテインＤの測定キット。
8. 前記不溶性担体と前記標識物とが同一の物質である、請求項７に記載の測定キット。
9. ３量体の肺サーファクタントプロテインＤに結合するモノクローナル抗体であって、
   １つの前記３量体の肺サーファクタントプロテインＤに対し、１つのみが結合する、モノクローナル抗体。
10. １２量体以上の肺サーファクタントプロテインＤに少なくとも２つが結合する、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
11. 請求項９又は１０に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
12. 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２５又は受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３８２６として受託された、ハイブリドーマ。

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