JP7579581B2 - 無煙たばこ製品におけるイソチオシアネートの使用 - Google Patents

Description

本発明の分野は、たばこ消費の悪影響を低減するためのたばこ製品である。

背景技術の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるかまたは現在特許請求されている発明に関連していること、あるいは具体的または暗黙的に参照されている刊行物が先行技術であることを認めるものではない。

２０１７年、１８歳以上の米国成人の１００人中１４人（１４．０％）が現在たばこを吸っている。つまり、米国では推定３，４００万人の成人が現在たばこを吸っていることになる。１，６００万人以上の米国人が、喫煙に関連する疾患と共存している。喫煙健康課（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｎ Ｓｍｏｋｉｎｇ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ）によると、米国ではたばこの喫煙は毎年４８万人以上を死に至らしめており、これは米国の死者のほぼ５人に１人にあたる。

喫煙者は非喫煙者よりも肺がんを発症しやすい。例えば、喫煙者の男女は、非喫煙者の男女に比べて２５倍も肺がんを発症する。米国がん協会によると、たばこの煙は何千もの化学物質で構成されており、その中には、アセトアルデヒド、アクリロニトリル、ホルムアルデヒド、鉛、Ｎ－ニトロソピペリジン、塩化ビニルなど、がんを引き起こすことが知られている少なくとも７０種類の化学物質（発がん物質）が含まれている。喫煙は、膀胱、血液、子宮頸部、結腸、食道、腎臓、尿管、喉頭、肝臓、中咽頭、膵臓、胃、気管、気管支、肺など、身体のほとんどの場所でがんを引き起こすことがよく知られている。

多くの喫煙者は禁煙を切望しているが、ニコチン中毒のためにそれは非常に困難である。ニコチンはたばこに自然に含まれる薬物で、ヘロインやコカインと同じくらいの中毒性があると考えられている。喫煙者は、禁煙すると身体的・精神的な禁断症状に悩まされる。ニコチン中毒を治療する一般的な方法の１つに、ニコチンパッチやニコチンガムなどのニコチン置換療法（ＮＲＳ）の使用がある。ＮＲＳを使って禁煙しようとしていた人々に関する２０１５年の研究では、対照群の喫煙者の約２０％が禁煙した。一方、ＮＲＳを少なくとも２カ月使用した人では、約５２％が禁煙に成功した（非特許文献１）。この結果は、ＮＲＳが禁煙したい喫煙者に効果的に作用することを示している。一方で、同研究では、５０％近くの喫煙者がＮＲＳを使用したにもかかわらず、禁煙に失敗している。加えて、禁煙には多大な努力と時間が必要なため、禁煙しようともしない喫煙者も多くいる。

本明細書に記載されているすべての出版物は、個々の出版物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に明示されている場合と同程度に、参照により組み込まれる。組み込まれた参照における用語の定義または使用が、本明細書に提供されるその用語の定義と矛盾するかまたは反対である場合、本明細書に提供されるその用語の定義が適用され、参照におけるその用語の定義は適用されない。

喫煙者の中には、喫煙をやめるためにたばこ代替品を使用する人もいる。たばこ代替品がニコチンを含まないとしても、喫煙行動の単純な運動効果により、たばこへの渇望を軽減することができるかもしれない。特許文献１は、イソチオシアネートを含むたばこ代替品を教示している。イソチオシアネートは、肺がん、乳がん、口腔がんを含むがん細胞で抗がん剤として機能する。喫煙者が代替品を使い続けることで、がんの発症を予防または低減するのに役立つ。しかしながら、依然として多くの喫煙者は、ニコチンへの渇望のために本物のたばこ製品を吸うことに戻ってしまう。

特許文献２は、喫煙者のがんの発症を予防および／または低減するための、イソチオシアネートを含む無煙たばこ製品を教示している。上述したように、イソチオシアネートは、抗がん剤として機能する。したがって、このたばこ製品を吸うことは、他の喫煙者と比較して、がんの発症に関しては害が少ないと思われるが、非喫煙者に対してはまだ害が大きいと思われる。

いくつかの実施形態において、本発明の特定の実施形態を説明および請求するために使用される、成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数値は、「約」という用語によっていくつかの例で修正されていると理解される。したがって、いくつかの実施形態において、記載された説明および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態において、数値パラメータは、報告された有効桁数を考慮し、通常の丸め手法を適用して解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、具体的な例に示された数値は、実行可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態で示された数値は、それらのそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を含んでいる可能性がある。

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲で使用されているように、「ａ、ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含む。また、本明細書の記載において使用されるように、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。

本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内にある各個別の値を個別に参照するための略記法としての役割を果たすことを意図しているに過ぎない。本明細書で別段の指示がない限り、各個別の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書において特定の実施形態に関して提供される任意のおよびすべての例、または例示的な文言（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本出願をよりよく照らすことを意図しており、そうでなければ請求される本発明の範囲に制限を課すものではない。明細書の如何なる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本明細書に開示された本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素との任意の組み合わせで参照し、特許請求することができる。グループの１つまたは複数のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含んだり、グループから削除したりすることができる。そのような包含または削除が行われた場合、本明細書において、同明細書は、修正されたグループを含むものとみなされ、それにより、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述が満たされる。

カナダ国特許出願公開第２８６６９１２号明細書 国際公開第２００９／０５１４２号

ボ（Ｂｏ）他、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ Ｅｐｉ、２０１５、５１３－５２０

このように、たばこ消費の負の影響を低減するための、有効性が高められたたばこ製品が依然として必要とされている。

本発明の主題は、たばこ消費の負の影響を低減するための有効性を高めたたばこ製品のための装置、システムおよび方法を提供する。
摂取可能な製品、例えば、無煙たばこ、噛みたばこ、スナッフ（ｓｎｕｆｆ）、スヌース（ｓｎｕｓ）、溶解性たばこ、紙巻きたばこ、ツイスト、葉巻たばこおよびシガリロは、ニコチン、イソチオシアネートまたはイソチオシアネート前駆体の少なくとも１つ、およびミロシナーゼを含む。

ニコチン（ｎｉｃｏｔｎｉｎｅ）は、粉末状のたばこ葉およびたばこ葉抽出物の少なくとも一方から得られる。イソチオシアネート前駆体は、ウォータークレス、ウォータークレス抽出物、ガーデンクレス、ガーデンクレス抽出物の少なくとも１つに由来し得る。イソチオシアネートは、合成品（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）であってもよい。ミロシナーゼは、マスタードシードおよびマスタードシード抽出物の少なくとも１つに由来に由来し得る。摂取可能な製品は、チモキノン、ブラック、クミンシード抽出物、レスベラトロールおよび合成ビタミンＣの少なくとも１つをさらに含むことができる。

いくつかの実施形態において、摂取可能な製品は、ニコチンの供給源として粉末状のたばこ葉およびたばこ葉抽出物の少なくとも１つと、イソチオシアネート前駆体の供給源としてウォータークレス、ウォータークレス抽出物、ガーデンクレスおよびガーデンクレス抽出物の少なくとも１つと、ミロシナーゼの供給源としてマスタードシード抽出物と、を含む。摂取可能な製品は、合成イソチオシアネート、チモキノン、レスベラトロール、合成ビタミンＣ、チモキノンおよび合成ビタミンＣ、をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態において、ニコチンおよびイソチオシアネート前駆体の両方またはそれぞれをカプセル化して、摂取可能な製品に含めることができる。カプセル化は、ミセルおよびナノ粒子のうちの少なくとも１つを用いて形成することができる。いくつかの実施形態において、イソチオシアネート前駆体の少なくとも一部は、粉末状のたばこ葉およびたばこ葉抽出物の少なくとも一方と直接接触させてもよい。摂取可能な製品は、フィルタを含むことができる。

集団におけるがんを予防または治療するが、ニコチン、イソチオシアネートおよびイソチオシアネート前駆体の少なくとも１つ、およびミロシナーゼを含む摂取可能な製品を、同集団の少なくとも一部のメンバーに利用可能にする方法。

本発明の主題はさらに、集団におけるがんを予防または治療する方法であって、ニコチン、イソチオシアネートおよびイソチオシアネート前駆体のうちの少なくとも１つ、およびミロシナーゼを含む摂取可能な製品を、集団の少なくとも一部のメンバーに利用可能にする方法を含む。

本明細書において使用される場合、文脈がそうでないことを示していない限り、「結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ）」という用語は、直接結合（互いに結合された２つの要素が互いに接触する）と間接結合（少なくとも１つの追加要素が２つの要素の間に配置される）の両方を含むことを意図している。したがって、「ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ」および「ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ」という用語は同義的に使用される。

本明細書の記載において、およびそれに続く特許請求の範囲で使用されているように、「ａ、ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含む。また、本明細書の記載において使用されるように、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。

本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書においてそうでないことを示していない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書において特定の実施形態に関して提供される任意のおよびすべての例、または例示的な文言（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本出願をよりよく照らすことを意図しており、そうでなければ請求される本発明の範囲に制限を課すものではない。明細書の如何なる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様、および利点は、同様の符号が同様の構成要素を表す添付した図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

ＤＭＳＯの非存在下／存在下におけるＡ５４９の明視野画像（左）および蛍光画像（右）を示す。 ＡＩＴＣで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 ＰＥＩＴＣで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 チモキノンで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 レスベラトロールで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 ＡＩＴＣおよびＰＥＩＴＣで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 ＡＩＴＣ、ＰＥＩＴＣ、およびチモキノンで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 チモキノンおよびレスベラトロールで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。 ＡＩＴＣ、ＰＥＩＴＣ、チモキノン、およびレスベラトロールで処理したＡ５４９の明視野画像および蛍光画像を示す。

以下の議論は、本発明の主題の多くの例示的な実施形態を提供する。各実施形態は、本発明の要素の単一の組み合わせを表すが、本発明の主題は、開示された要素のすべての可能な組み合わせを含むと見なされる。したがって、一実施形態が要素Ａ、Ｂ、およびＣを含み、第２の実施形態が要素ＢおよびＤを含む場合、本発明の主題はまた、明示的に記載されていなくても、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤの他の残りの組み合わせを含むと見なされる。

いくつかの実施形態において、本発明の特定の実施形態を説明および請求するために使用される、成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数値は、「約」という用語によっていくつかの例で修正されていると理解される。したがって、いくつかの実施形態において、記載された説明および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態において、数値パラメータは、報告された有効桁数を考慮し、通常の丸め手法を適用して解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、具体的な例に示された数値は、実行可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態で示された数値は、それらのそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を含んでいる可能性がある。

本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内にある各個別の値を個別に参照するための略記法としての役割を果たすことを意図しているに過ぎない。本明細書で別段の指示がない限り、各個別の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。

文脈から反対の指示がない限り、本明細書に記載されているすべての範囲は、その終点を含むものと解釈されるべきであり、オープンエンドの範囲は、商業的に実用的な値のみを含むものと解釈されるべきである。同様に、すべての値のリストは、文脈から反対の指示がない限り、中間値を含むものと考えるべきである。

本明細書で企図されているたばこ製品は、（ａ）製品から放出されるジュースが飲み込まれるように口内に保持されるか、または（ｂ）吸い込まれた成分が唾液と混合された後に飲み込まれるように、吸われるかまたはベイプされるかのいずれかであるため、「摂取可能（ｉｎｇｅｓｔｉｂｌｅ）」であると称される。そのような摂取可能な製品には、無煙たばこ、たばこ葉抽出物、噛みたばこ、スナッフ、スヌース、溶解性たばこ、紙巻きたばこ、ツイスト、葉巻たばこおよびシガリロのうちの少なくとも１つが含まれる。

好ましい実施形態は、（ａ）ニコチン、（ｂ）イソチオシアネートまたはイソチオシアネート前駆体のうちの少なくとも１つ、および（ｂ）ミロシナーゼを含む。ニコチンは、任意の適切なニコチン源、例えば、粉末状のたばこ葉および／またはたばこ葉抽出物に由来する。

イソチオシアネート（ＩＴＣ）、Ｒ－Ｎ＝Ｃ＝Ｓはよく知られた抗がん分子であり、ｐ５３の発現を増加させ、変異型ｐ５３の発現を枯渇させ、乳房、肺、およびがん細胞株を含むがん細胞において有糸分裂細胞周期停止およびアポトーシスを誘導する。本明細書で使用される場合、ＩＴＣという用語には、イソチオシアネート類似体およびＩＴＣの前駆体が含まれ、そのような分子がｐ５３発現を増加させ、変異型ｐ５３発現を枯渇させ、がん細胞において有糸分裂細胞周期停止およびアポトーシスを誘導するものであればよい。ＩＴＣ類似体には、アブラナ科の野菜に由来するアリルＩＴＣ（ＡＩＴＣ）、フェネチルＩＴＣ（ＰＥＩＴＣ）、およびベンジルＩＴＣ（ＢＩＴＣ）が含まれる（３７）。いくつかの実施形態において、野菜および／または野菜抽出物は、摂取可能な製品に添加することができる。

ＩＴＣの前駆体であるウォータークレスおよび／またはウォータークレス抽出物に由来するエチルグルコシノレート（ＰＥＧＬＳ）は、酵素的に加水分解してＰＥＩＴＣとなり得る（４）。内因性または外因的に得られた酵素であるミロシナーゼは、グルコシノレートを加水分解するために使用することができる。ＩＴＣの他の前駆体としては、ＢＩＴＣの場合はグルコトロペオリン、ＰＥＩＴＣの場合はグルコナスツルチイン、ＡＩＴＣの場合はアリルグルコシノレート（シニグリン）が含まれ、いずれもＩＴＣに酵素的に変換することができる。前駆体ＩＴＣの他の供給源としては、グルコトロペオリンを豊富に含むガーデンクレスやガーデンクレス抽出物がある。

いくつかの実施形態において、ＩＴＣ前駆体を提供するためにウォータークレス、その抽出物、ガーデンクレスおよび／またはその抽出物を添加することができ、ＩＴＣへの加水分解を促進するために内因性および／または外因性のミロシナーゼを添加することができる。付随的にまたは代替的に、摂取可能な製品は、精製されたＩＴＣを含むことができる。

ミロシナーゼは、マスタードシードおよびマスタードシード抽出物の少なくとも１つに由来し得る。いくつかの実施形態において、ウォータークレス抽出物（ＰＥＧＬＣの供給源）およびマスタードシード抽出物（ミロシナーゼの供給源）の混合物を、ＰＥＩＴＣを生成する可能性のある摂取可能な製品に添加することができる。別の実施形態において、反応物（例：ＰＥＩＴＣ）を摂取可能な製品に直接加えることができる。いくつかの実施形態において、ＩＴＣを合成して、摂取可能な製品に直接加えることもできる。

いくつかの実施形態において、製品は、チモキノンおよびビタミンＣのうちの少なくとも１つをさらに含む。チモキノンは、ニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ ｓａｔｉｖａ）（ブラッククミンシード）または他の植物から抽出することができる。チモキノンは抗がん作用を示し、転移能の抑制（２５）、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどの抗酸化酵素能の維持（７，２６）を含む抗酸化作用の維持、肺がんや乳がんを含むがん細胞におけるｐ５３発現のアップレギュレーション（２８）を示す。抽出または精製されたチモキノンおよび／または植物の抽出物を摂取可能な製品に加えることができる。

天然のスチルベンであり、非フラボノイド系ポリフェノールであるレスベラトロールは、抗酸化作用、抗炎症作用、心筋保護作用、抗がん作用を有する植物性エストロゲンである（コ（Ｋｏ）ら、「ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｉｎｔ Ｊ．Ｍｏ．Ｓｃｉ．，２０１７）。レスベラトロールは、がん細胞の多剤耐性を逆転させることができ、臨床的に使用されている薬剤と組み合わせて使用すると、標準的な化学療法剤に対して、がん細胞を感作することができると報告されている。レスベラトロールのいくつかの新規な類似体は、抗がん活性、バイオアベイラビリティ、および薬物動態プロファイルを改善して開発されている。

ビタミンＣも抗がん作用を示し、Ｐ５３発現のアップレギュレーションを示す（３５）。ビタミンＣは、柑橘系の果実から抽出することができ、摂取可能な製品に添加することができる。

摂取可能な製品に存在するＩＴＣ、チモキノン、レスベラトロールおよびビタミンＣの任意の組み合わせによって、相乗的な抗がん活性が期待され、相乗効果の結果は以下の図に示されている。

いくつかの実施形態において、喫煙可能な製品は、ニコチン、たばこ葉またはたばこ葉抽出物を含まないが、ＩＴＣ、チモキノン、レスベラトロールおよびビタミンＣのうちの少なくとも１つを含む。そして、たばこ葉またはたばこ葉抽出物の代わりに、喫煙可能な製品は、１つまたは複数のニコチンを含まないハーブなどのニコチンを含まない植物の葉、または抽出物を含む。そのような製品は、ニコチンを含まず、抗がん活性を有し、そのようなものとして、現在の喫煙者だけでなく、潜在的な喫煙者もその製品の喫煙を楽しむことができることが企図されている。

いくつかの実施形態において、ニコチン、ＩＴＣ、ミロシナーゼ、チモキノン、レスベラトロールおよびビタミンＣのうちの少なくとも１つがカプセル化されており、そのようなカプセル化は、摂取可能な製品において物理的または化学的に分離された、捕捉された、または懸濁された成分を提供する。カプセル化することで、少なくとも２つの利点が得られる。第一に、たばこの葉や抽出物から生成される酸による分子の劣化や変形を防ぐことができる。第二に、ユーザは、摂取可能な製品がたばこの葉または抽出物に加えて他の材料を含んでいても、同摂取可能な製品の味を十分に楽しむことができる。

カプセル化物は、結合剤および／または界面活性剤を含んでいてもよい。結合剤の例としては、リン酸ジカリシウム（ｄｉｃａｌｉｃｉｕｍ）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム、二酸化チタン、シリカ、パラベン、ラクトース、マルドデキストリン、グルタミン酸モノドシウム、タルク、微結晶セルロース、ゼラチン、ジェランガム、タートラジン、アルラレッド、インジゴチン、インジゴチン、ポリビニルピロリドン、およびフマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸などが挙げられる。

界面活性剤は、アニオン性または非イオン性として分類される。本明細書の主題について企図される界面活性剤は無毒であり、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸（Ｃｌ６－Ｃ２４）脂肪酸、脂肪酸の長鎖（Ｃ１６－Ｃ２４）エステル、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールのアルキルエーテル、ポリエチレングリコールのモノまたはジ脂肪酸エステル、脂肪酸モノ、ポリオキシエチレンモノおよびジステアレート、およびポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、モノパルミテート、モノステアレートまたはモノエステル、ポリオキシエチレンアルキルフェノールおよびアルキルフェニルエーテル、ポリソルベート、ステアリルアミン、オレイン酸トリエタノールアミン、植物油、ポリオキシエチレンベリーカイロ（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｖｅｒｙ ｃａｉｌｌｏｕ）、ソルビタン脂肪酸エステル、コレステロールが含まれる。

カプセル化には、ミセル、マイクロ粒子、およびナノ粒子がある。ミセルは、例えば、リン脂質、糖脂質、イオン化脂肪酸などを用いて形成される。
マイクロ粒子およびナノ粒子に適した材料の例は、シリカ、アルミナ、チタニア、カーボンブラック、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、カルシウムアルミノケイ酸ナトリウム含有（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｕｍｉｎｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、ケイ酸三カルシウム、シリカエアゲル（ｓｉｌｉｃａ ａｉｒｇｅｌ）、タルク、酸化鉄、その他の金属酸化物の組み合わせである。

喫煙者のような集団におけるがんを予防または治療する方法は、ニコチン、ＩＴＣおよびＩＴＣ前駆体の少なくとも１つ、およびミロシナーゼを含む摂取可能な製品を提供する。ニコチンは、粉末状のたばこ葉およびたばこ葉抽出物の少なくとも１つに由来し得る。ＩＴＣは、ウォータークレス、ウォータークレス抽出物、ガーデンクレス、ガーデンクレス抽出物の少なくとも１つに由来し得る。ミロシナーゼは、マスタードシード抽出物に由来し得る。いくつかの実施形態において、摂取可能な製品は、チモキノン、レスベラトロール、およびビタミンＣを含む分子の少なくとも１つをさらに含む。製品は、無煙たばこ、噛みたばこ、スナッフ、スヌース、および溶解性たばこ、紙巻きたばこ、ツイスト、葉巻たばこおよびシガリロの少なくとも１つを含む、任意の適切な形態でパッケージ化することができる。

企図された実験において、摂取可能な製品の効果は、乳がん細胞（ＭＣＦ７）、Ｈｅｌａ細胞、口腔がん細胞、Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）において調べることができる。同数の細胞をプレーティングし、ＩＴＣ、チモキノン、ビタミンＣの単独およびそれらの組み合わせとともにインキュベートした。アポトーシスの進行は、フローサイトメトリー、およびＴＵＮＥＬやカスパーゼ－３などのアポトーシスを担うタンパク質に対する免疫染色を用いて測定することができる。野生型および変異型ｐ５３の発現レベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲならびに野生型および変異型ｐ５３に対する免疫染色を用いて決定することができる。Ｇ２／Ｍでの細胞周期停止は、サイクリンＢ１およびｃｄｃ２などのＧ２－Ｍチェックポイント制御因子に対する免疫染色を適用して観察することができる。

細胞は、１．処理なし、２．ＩＴＣのみ、３．チモキノンのみ、４．ビタミンＣのみ、５．レスベラトロールのみ、６．ＩＴＣ＋チモキノン、７．チモキノン＋ビタミンＣ、８．ＩＴＣ＋レスベラトロール、９．ビタミンＣ＋ＩＴＣ、１０．ＩＴＣ＋チモキノン＋ビタミンＣ＋レスベラトロール、１１．チモキノン＋レスベラトロール、１２．ビタミンＣ＋レスベラトロ－ルを含む、いくつかのグループに分けられる。ＩＴＣ、チモキノン、ビタミンＣ、レスベラトロール、およびそれらの組み合わせの効果を観察するために、いくつかの異なるインキュベーション時間と異なる濃度の分子が調べられる。

アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、フェニルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ）、チモキノンまたはレスベラトロールの各々は、インビトロで細胞死を効果的に誘導する。

実験は、以下の手順で実施した。
Ａ５４９細胞を４８ウェル培養プレートに３．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングした。３７℃での５分間のインキュベーションの後、０．０５％トリプシンＥＤＴＡで細胞を解離させ、１：１の比率の標準培地で中和し、プレーティングの前に血球計を用いてカウントした。ＡＩＴＣ、ＰＥＴＩＣ、チモキノン、またはレスベラトロールのいずれかの処理化合物を添加する前に、すべてのウェルを一晩静置した。すべての処理は、最初のプレーティングから２４時間以内に行った。

Ａ５４９細胞の処理は、以下の時点および濃度で行った：ＡＩＴＣ－２５μＭ、５０μＭおよび１００μＭで２４時間、４８時間および９６時間。ＰＥＩＴＣ－２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭで２４、４８、および９６時間。ＴＱ－２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭで、２４時間、４８時間、および９６時間。レスベラトロール－２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭで４８時間および９６時間。各化合物の溶解にはＤＭＳＯを使用し、試験化合物のいずれも含まないＤＭＳＯで処理した細胞を対照とした。処理された細胞は、実験の最後の時点まで、同じ濃度で毎日処理された。

アポトーシスは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ ３／７ ｇｒｅｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ／ａｓｓａｙを用いて検出した。細胞は、分析の前に希釈したアッセイ試薬とともに３７℃で３０分間インキュベートし、明視野および蛍光顕微鏡で画像化した。

ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬は、４個のアミノ酸ペプチド（ＤＥＶＤペプチド）がＤＮＡに結合する色素の能力を阻害するので、本質的に非蛍光性である。しかしながら、アポトーシス細胞でカスパーゼ－３／７が活性化されると、ＤＥＶＤペプチドが切断され、色素がＤＮＡに結合して明るく蛍光を発するようになる。色素－５３０の蛍光発光は、蛍光顕微鏡で観察することができる。

図１は、ＤＭＳＯで処理された同じＡ５４９肺がん細胞に対応する、左側の明視野画像（ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ ｉｍａｇｅ）および右側の蛍光画像を示す。図２～５は、さまざまな処理化合物、ＡＩＴＣ、ＰＥＩＴＣ、チモキノン、およびレスベラトロールのさまざまな濃度に対するさまざまな時点での明視野画像と蛍光画像を示す。

図２は、ＡＩＴＣががん細胞の細胞死を誘導することを示している。５０μＭ以上の濃度では、４８時間にて、低濃度に比べてより多くの細胞が指数関数的にアポトーシスを起こしている。低濃度では、より緩やかな速度で細胞死が起こることが観察された。

図３は、ＰＥＩＴＣが細胞死を誘導することを示している。１００μＭ以上の濃度では、低濃度に比べてより多くの細胞がより早期に指数関数的にアポトーシスを受けている。低濃度では、より緩やかな速度で細胞死が起こることが観察された。

図４は、チモキノンが細胞死を誘導することを示している。１００μＭ以上の濃度では、低濃度に比べてより多くの細胞がより早期に指数関数的にアポトーシスを受けている。低濃度では、より緩やかな速度で細胞死が起こることが観察された。

図５は、レスベラトロールが細胞死を誘導することを示している。５０μＭ以上の濃度では、低濃度に比べてより多くの細胞がより早期に指数関数的にアポトーシスを受けている。一方、２５μＭでは高濃度のレスベラトロールに比べてアポトーシス効果が低下していた。レスベラトロールのアポトーシス効果は４８時間と９６時間にしか認められず、実際には他の化合物に比べて効果が遅れていることは注目に値する。処理の４日後、アリルイソチオシアネート、フェニルイソチオシアネート、チモキノン、またはレスベラトロールのいずれかを投与された各Ａ５４９非小細胞肺がん細胞培養物は、最大９５％のアポトーシス率に達したことが観察された。

図６は、アリルイソチオシアネートとフェニルイソチオシアネートの組み合わせが、がん細胞死を誘導することを示している。２５μＭのフェニルイソチオシアネートよりも高い濃度では、低濃度の場合よりも多くの細胞が４８時間にて指数関数的にアポトーシスを受けている。低濃度のフェニルイソチオシアネートでは、より緩やかな速度で細胞死が起こっている。

図７は、先のアリルイソチオシアネートとフェニルイソチオシアネートとの組み合わせにチモキノンを加えると、がん細胞死が誘導されることを示している。すべての化合物について２５μＭの濃度で、４８時間にて、多くの細胞がチモキノンを含まない培養物に比べて指数関数的にアポトーシスを受けている。

図８は、チモキノンとレスベラトロールの組み合わせが、がん細胞死を誘導することを示している。この組み合わせで観察された細胞死の割合は、チモキノンも含む図７で観察された化合物の組み合わせと同様である。どちらも、４８時間経過すると、指数関数的にアポトーシスを誘導するようである。

図９は、フェニルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、チモキノン、およびレスベラトロールの組み合わせが、がん細胞死を誘導することを示している。各化合物が１０μＭ以上の濃度では、低濃度の場合よりも４８時間にて、多くの細胞が指数関数的にアポトーシスを受けている。低濃度（＜１０μＭ）では、アポトーシスの速度はそれほど顕著ではないようである。

化合物の組み合わせ（図６～９）は、アポトーシスが、４つの化合物すべてを含む組み合わせにおいて１０μＭの最低濃度で観察されることを示している。１０μＭよりも高い濃度の化学物質の組み合わせでは、２４時間から７２時間の期間に、より高い程度のアポトーシスが観察された（最大８０％のアポトーシス）。化合物の組み合わせで処理された細胞のアポトーシスは、図１～５に見られるように、時間の短さのため、７２時間まで観察されるが、９６時間までは観察されない。その理由の一つは、図１～５と同様に９０％以上のアポトーシス率が９６時間以内に達成された可能性があることである。

本明細書の本発明の概念から逸脱することなく、すでに記載されたもの以外のさらに多くの修正が可能であることは、当業者には明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神を除いて制限されるべきではない。さらに、明細書と特許請求の範囲の両方を解釈する際には、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り広い方法で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的な方法で要素、構成要素、またはステップを指すものとして解釈されるべきであり、参照されている要素、構成要素、またはステップが、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、またはステップと存在したり、利用されたり、組み合わされたりする可能性があることを示している。本明細書の請求項において、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．およびＮからなる群から選択されたものの少なくとも１つに言及している場合、本文はその群から１つの要素のみを必要とすると解釈されるべきであり、Ａ＋ＮやＢ＋Ｎなどではない。

Claims (11)

1. ニコチンと、ミロシナーゼと、（ａ）イソチオシアネートまたはイソチオシアネート前駆体、および（ｂ）レスベラトロールのうちの少なくとも１つと、を含み、マスタードシードおよびマスタードシード抽出物のうちの少なくとも１つが前記ミロシナーゼの供給源である、摂取可能な製品。
2. 無煙たばこ、噛みたばこ、スナッフ、スヌース、溶解性たばこ、紙巻きたばこ、ツイスト、葉巻たばこおよびシガリロのいずれか１つとして処方された、請求項１に記載の摂取可能な製品。
3. 前記ニコチンの供給源として粉末状のたばこ葉またはたばこ葉の抽出物を含む、請求項１または請求項２に記載の摂取可能な製品。
4. 前記イソチオシアネート前駆体の供給源として、ウォータークレス、ウォータークレス抽出物、ガーデンクレス、およびガーデンクレス抽出物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の摂取可能な製品。
5. チモキノン、ブラッククミンシード抽出物、合成ビタミンＣ、およびレスベラトロールの１つ以上を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の摂取可能な製品。
6. 前記ニコチン、前記イソチオシアネート前駆体、および前記イソチオシアネートのうちの少なくとも１つがカプセル化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の摂取可能な製品。
7. カプセル化物は、ミセルおよびナノ粒子のうちの少なくとも１つの状態にある、請求項６に記載の摂取可能な製品。
8. 前記イソチオシアネート前駆体および前記イソチオシアネートの少なくとも一部が、粉末状のたばこ葉およびたばこ葉抽出物のうちの少なくとも１つの形態にあるニコチンと直接接触している、請求項１～７のいずれか一項に記載の摂取可能な製品。
9. 集団内のがんを予防または治療するための摂取可能な製品において、前記摂取可能な製品が、ニコチンと、イソチオシアネート、イソチオシアネート前駆体、ミロシナーゼおよび合成イソチオシアネートのうちの少なくとも１つと、を含み、
   前記ニコチンの供給源として粉末状のたばこ葉およびたばこ葉の抽出物のうちの少なくとも１つが使用され；
   前記イソチオシアネートの供給源としてウォータークレス、ウォータークレス抽出物、ガーデンクレスおよびガーデンクレス抽出物のうちの少なくとも１つが使用され；かつ
   前記ミロシナーゼの供給源としてマスタードシード抽出物が使用される、摂取可能な製品。
10. チモキノン、レスベラトロールおよびビタミンＣのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項９に記載の摂取可能な製品。
11. 前記摂取可能な製品が、無煙たばこ、噛みたばこ、スナッフ、スヌース、溶解性たばこ、紙巻きたばこ、ツイスト、葉巻たばこおよびシガリロのうちの少なくとも１つとして提供される、請求項９または請求項１０に記載の摂取可能な製品。