JP7560185B2 - 補体経路阻害剤及び血管新生阻害剤を含む融合タンパク質並びにその使用 - Google Patents

Description

[0001]本発明は、補体経路阻害タンパク質及び血管新生阻害タンパク質を含有する融合タンパク質、並びにそれを使用して眼疾患、詳細には黄斑変性を治療するための組成物に関する。

[0002]黄斑変性は、ブルッフ膜、脈絡膜、神経網膜及び／又は網膜色素上皮の異常と関係がある中心視野喪失を特徴とする疾患を指す。直径が約１／３～１／２ｃｍである黄班は、網膜の中心に存在する。網膜より下に、線維組織中に包埋された血管の集まりである脈絡膜及び脈絡膜層の上に形成されている色素上皮（ＰＥ）が存在する。この場合、脈絡膜血管は栄養素を網膜に供給する。脈絡膜及びＰＥは眼の前部に見られる。

[0003]黄斑変性の１種である加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、視野の中心部の進行性視力喪失、色識別の変化並びに異常な暗順応及び感度の関係がある疾患である。ＡＭＤはおおまかに乾燥型又は湿潤型ＡＭＤとして分類される。乾燥型ＡＭＤは、読書、運転又は顔認識などの活動のために使用される優れた視力に必要とされる中心網膜又は黄班の萎縮性細胞死と関係がある。乾燥型ＡＭＤの患者の約１０％～２０％は、湿潤型ＡＭＤとして公知である２型ＡＭＤに進行する。

[0004]疾患の発症の２つの形態における最も重大な危険因子は、加齢及び網膜色素上皮の後ろの異常な細胞外沈着物であるドルーゼンの沈着である。ドルーゼンはＡＭＤと関係がある特徴的な沈着物である。ドルーゼンは、補体活性化因子、阻害剤、活性化特異的補体断片及び末端経路因子、例えば細胞膜侵襲複合体（ＭＡＣ又はＣ５ｂ－９）を含むことが公知である。さらに、湿潤型ＡＭＤは脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と関係がある。新しい脈絡膜血管新生の発症機構はほとんど知られていないが、炎症、虚血及び血管新生因子の局所的生成などの因子が重要であると考えられる。

[0005]一方、補体系は、微生物感染に対する先天免疫の重要な要素であり、通常は血清中に不活性状況で存在するタンパク質の集団を含む。これらのタンパク質は、古典的経路、レクチン経路及び代替経路を通じて活性化される。微生物の表面上の分子は、前述の経路を活性化して、Ｃ３転換酵素として公知であるプロテアーゼ複合体の形成を引き起こす。

[0006]補体経路の活性化は、補体タンパク質、例えば、白血球走化性における炎症反応、マクロファージ、好中球、血小板、肥満細胞及び内皮細胞の活性化、増大した血管透過性、細胞溶解並びに組織損傷を媒介する、Ｃ３ａ及びＣ５ａ及びＣ５ｂ－９細胞膜侵襲複合体（ＭＡＣ）などのアナフィラトキシンのものを含めて、生物学的に活性な断片を生成する。さらに、眼疾患のいくつかは補体に関連していることが報告されている（特願第２００７－５３６９６４号）。しかし、眼疾患、特に黄斑変性を効果的に治療するための薬物に対する必要性がこれまで増加しており、したがって、黄斑変性に対する治療剤の研究は依然として進行中である。

[0007]したがって、眼疾患、特に黄斑変性を効果的に治療及び予防するための研究の結果として、本発明者らは補体関連経路及び血管新生促進経路を遮断する融合タンパク質を黄斑変性に対する治療剤として使用することができることを確認し、それによって、本発明を完成した。

[0008]本発明の一態様は、免疫グロブリンスーパーファミリーの補体受容体（ＣＲＩｇ）の細胞外ドメイン又はその断片及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合するタンパク質を含有する融合タンパク質を提供する。

[0009]本発明の別の態様は、２つの融合タンパク質が連結された融合タンパク質二量体を提供する。

[0010]本発明のさらに別の態様は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

[0011]本発明のさらに別の態様は、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。

[0012]本発明のさらになお別の態様は、該ベクターが導入された形質転換細胞を提供する。

[0013]本発明のさらになお別の態様は、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体を活性成分として含む、眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。

[0014]本発明のさらになお別の態様は、眼疾患を治療するための融合タンパク質又はその二量体の使用であって、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含有する使用を提供する。

[0015]本発明のさらになお別の態様は、眼疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための融合タンパク質又はその二量体の使用であって、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含有する使用を提供する。

[0016]本発明のさらになお別の態様は、眼疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、融合タンパク質又はその二量体を対象に投与することを含み、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含有する方法を提供する。

[0017]補体関連経路を阻害するためのタンパク質であり、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含有する融合タンパク質は、補体関連機構を効率的に阻害することができるだけでなく、血管新生も効率的に阻害することができる。したがって、補体系によって引き起こされる眼疾患及び血管新生によって引き起こされる眼疾患を効果的に治療又は予防することができる。したがって、黄斑変性、特に、乾燥型黄斑変性と湿潤型黄斑変性症の両方を効果的に治療するために、融合タンパク質を有効に使用することができる。

[0018]例示的実施形態は、添付の図面と併せて解釈される以下の説明からより詳細に理解することができる。

Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０３、Ｃ１．０４、Ｃ１．０５及びＣ１．０６のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す画像である。 Ｃ１．０３ｍ、Ｃ１．０４ｍ及びアフリベルセプトのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す画像である。 Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す画像である。 ウサギＣ３、ウサギＣ３ｂ、ラットＣ３及びラットＣ３ｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す画像である。 融合タンパク質の模式図であり、ＣＲＩｇ－Ｆｃ（Ｃ１．０１、左）、ＣＲＩｇ－Ｆｃ－ＶＥＧＦバインダー（Ｃ１．０２、中央）及びＶＥＧＦバインダー－Ｆｃ－ＣＲＩｇ（Ｃ１．０４、右）を順次示す図である。 ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）解析によるヒトＣ３ｂ及びヒトＶＥＧＦ１６５へのＣ１．０１及びＣ１．０２の結合親和性を濃度によって示すグラフである。 ビアコア解析によるヒトＣ３ｂ及びヒトＶＥＧＦ１６５へのＣ１．０１及びＣ１．０２の結合親和性を濃度によって示すグラフである。 ビアコア解析によるマウスＣ３ｂ及びヒトＶＥＧＦ１６５へのＣ１．０１ｍ及びＣ１．０２ｍの結合親和性を濃度によって示すグラフである。 ビアコア解析によるマウスＣ３ｂ及びヒトＶＥＧＦ１６５へのＣ１．０１ｍ及びＣ１．０２ｍの結合親和性を濃度によって示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるヒトＣ３ｂへのＣ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０３及びＣ１．０４の結合親和性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦ１６５へのアフリベルセプト、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４及びＣ１．０５の結合親和性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるマウスＣ３ｂへのＣ１．０１、Ｃ１．０２及びＣ１．０３の結合親和性を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるヒトＣ３ｂ、ヒトＣ２及びヒトＣ４へのＣ１．０２の結合親和性を示すグラフである。 動的光散乱解析によるＣ１．０１の流体力学的半径を示すグラフである。 動的光散乱解析によるＣ１．０２の流体力学的半径を示すグラフである。 Ｃ１．０２の濃度に応じた粘度を示すグラフである。 溶血解析（ＡＨ５０）によるＣ１．０１、Ｃ１．０２及びＣ１．０６の代替補体経路阻害効果を示すグラフである。 溶血解析（ＡＨ５０）によるＣ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０４ｍ及びＣ１．０５の代替補体経路阻害効果を示すグラフである。 溶血解析（ＡＨ５０）によるＣ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍの代替補体経路阻害効果を示すグラフである。 溶血解析（ＣＨ５０）によるＣ１．０１、Ｃ１．０２及びＣ１．０６の古典的補体経路阻害効果を示すグラフである。 溶血解析（ＣＨ５０）によるＣ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０４ｍ及びＣ１．０５の古典的補体経路阻害効果を示すグラフである。 溶血解析（ＣＨ５０）によるＣ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍの古典的補体経路阻害効果を示すグラフである。 レポーター細胞を使用したアフリベルセプト、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０５及びＣ１．０６のＶＥＧＦシグナリング阻害効果を示すグラフである。 創傷治癒アッセイ方法によるＣ１．０１、Ｃ１．０２及びＣ１．０５のＶＥＧＦシグナリング阻害効果経路を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるＣ１．０２へのヒト及びカニクイザルのＣ３ｂの結合能力並びにＣ１．０６へのヒト及びカニクイザルのＣ３ｂの結合能力を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるＣ１．０２へのヒト、ラット及びウサギのＣ３ｂの結合能力並びにＣ１．０６へのヒト、ラット及びウサギのＣ３ｂの結合能力を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるＣ１．０２へのヒト、カニクイザル、ラット及びウサギのＶＥＧＦの結合能力並びにＣ１．０１へのヒト、カニクイザル、ラット及びウサギのＶＥＧＦの結合能力を示すグラフである。 脈絡膜血管新生のマウスモデルを誘導した直後（０日目）～誘導から７日後（７日目）まで各実験群の脈絡膜血管新生を蛍光眼底造影によって確認することによって得られた画像を示す。 脈絡膜血管新生のマウスモデルを誘導した直後（０日目）、誘導から３日後（３日目）及び誘導から７日後（７日目）の各実験群の体重を示すグラフである。 脈絡膜血管新生のマウスモデルを誘導した直後（０日目）～誘導から７日後（７日目）までの各実験群について脈絡膜血管新生の程度の定量化を示すグラフである。 脈絡膜血管新生のウサギモデルを誘導してから７日後及び１４日後の各実験群について脈絡膜血管新生の強度の定量化を示すグラフである。 脈絡膜血管新生のラットモデルを誘導した直後及び誘導から１０日後の各実験群における脈絡膜血管新生の有無の定量化を示すグラフである。 脈絡膜血管新生のラットモデルを誘導した直後及び誘導から１０日後の各実験群における血管漏出面積の定量化を示すグラフである。 乾燥型黄斑変性のモデルの各実験群の外顆粒層（ＯＮＬ）を示す画像（図１９のａ～１９のｃ）、外顆粒層の細胞数（図１９のｄ）、外顆粒層の面積（図１９のｅ）及び網膜のＣ３発現レベル（図１９のｆ）を示す図である。 硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２をウサギに投与した後の硝子体液中のＣ１．０２の濃度を示すグラフである。 硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２をウサギに投与した後の眼房水中のＣ１．０２の濃度を示すグラフである。

[0054]ＣＲＩｇの細胞外ドメインを含む融合タンパク質
[0055]本発明の一態様は、免疫グロブリンスーパーファミリーの補体受容体（ＣＲＩｇ）の細胞外ドメイン又はその断片及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。

[0056]本明細書で使用される用語「ＣＲＩｇ」は、ＶＳＩＧ４遺伝子にコードされる補体受容体免疫グロブリンを指し、タンパク質Ｚ３９Ｉｇとも呼ばれる。ＣＲＩｇは、４種の補体受容体の中の４型補体受容体に属する受容体であり、肝臓で食作用を行うクッパー細胞などのマクロファージの表面で発現している。ＣＲＩｇは、免疫グロブリンドメインを含む細胞外領域に結合した膜タンパク質（内在性膜タンパク質）である。ＣＲＩｇは補体断片Ｃ３ｂ及びｉＣ３ｂに結合し、人体に進入する細菌又は血液中の感染性細菌を認識し、食細胞によって排除するように機能する。

[0057]ＣＲＩｇは、ＣＲＩｇのアイソフォーム又はスプライス形態を含む。アイソフォームはＣＲＩｇアイソフォーム１、２又は３を含む。スプライス形態はＣＲＩｇ（Ｌ）又はＣＲＩｇ（Ｓ）を含む。ＣＲＩｇ（Ｌ）はＶ及びＣ２型末端Ｉｇドメインを含み得、ＣＲＩｇ（Ｓ）はＶ型ドメインのみを含む。具体的には、ＣＲＩｇ（Ｓ）は配列番号２０の配列を含み得る。

[0058]ＣＲＩｇの細胞外ドメインは、膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメイン部分を除いた受容体の一部であってもよい。

[0059]ＣＲＩｇはＣＲＩｇの細胞外ドメインの断片を含み得る。ＣＲＩｇの細胞外ドメインの断片は、ＣＲＩｇの細胞外ドメインの活性と等しいか又は同様である活性を有する、切断形態を指す。具体的には、該断片は、Ｃ３ｂ又はｉＣ３ｂに結合することによって補体作用又は食作用を促進する活性を有する、ＣＲＩｇの断片を指す。

[0060]一実施形態では、ＣＲＩｇは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号７４又は配列番号１５１のアミノ酸配列を含み得る。具体的には、ヒトＣＲＩｇは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を含み得る、マウスＣＲＩｇは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み得る。さらに、マウスＣＲＩｇの細胞外ドメインは配列番号７５のアミノ酸配列を含み得、ヒトＣＲＩｇの細胞外ドメインは配列番号２２又は配列番号７４のアミノ酸配列を含み得る。

[0061]本明細書で使用される用語「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」は、血管新生を刺激する細胞によって産生される血管内皮増殖因子を指す。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞を分裂及び増殖させ、且つ血管透過性を増大させることによって、血管新生に関与する、重要なシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦは、湿潤型ＡＭＤにおいて網膜の異常な血管増殖を刺激することが公知である。

[0062]さらに、本明細書において、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦベースのタンパク質を、まとめて用語「ＶＥＧＦ」と呼ぶことがある。ＶＥＧＦベースのタンパク質は、ＶＥＧＦの活性と等しいか又は同様である活性を有することができる。ここで、「活性」は、例えば、ＶＥＧＦ受容体への特異的結合を指し得、この特異的結合は、当業者に既知の方法によって測定することができる。

[0063]一実施形態では、ＶＥＧＦベースのタンパク質は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）及び組換えＶＥＧＦからなる群から選択される１つ又は複数であってもよい。好ましくは、ＶＥＧＦはＶＥＧＦ－Ａ若しくはＢ又はＰｌＧＦであってもよい。

[0064]本明細書で使用される用語「胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）」は、染色体２ｐ２１－ｐ１６にコードされる膜貫通タンパク質を指す。ＰｌＧＦはＶＥＧＦＲ－１に対する選択的リガンドとして作用し、且つ血管新生を促進することができる。ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦのアミノ酸組成と４０％以上の同一性を有する。一実施形態では、ＰｌＧＦはＰｌＧＦ－１又はＰｌＧＦ－２であってもよい。

[0065]本明細書で使用される用語「組換えＶＥＧＦ」は、選択的エクソンスプライシングによって組み換えられたＶＥＧＦを指す。組換えＶＥＧＦは、アミノ酸の番号に従って、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９又はＶＥＧＦ２０６であってもよい。一実施形態では、組換えＶＥＧＦはＶＥＧＦ１６５であってもよい。

[0066]本明細書で使用される用語「ＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質」は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を指す。

[0067]本明細書で使用される用語「ＶＥＧＦ受容体」は、ＶＥＧＦに結合する受容体を指す。この場合、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ－１）、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ－２）及びＶＥＧＦ受容体３（ＶＥＧＦＲ－３）からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。ＶＥＧＦ受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、細胞外ドメイン、及び細胞内で分離されたキナーゼドメインを含む。ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦリガンドへの結合によって活性化され、その結果、二量体化又はリン酸化が生じ得る。一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦ受容体１又は２であってもよい。

[0068]本明細書で使用される用語「ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン」は、ＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦ受容体のドメインを指す。具体的には、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦ受容体の膜貫通領域及び細胞質内領域を除いた、ＶＥＧＦのリガンドを含む細胞外ドメイン部分を指す。

[0069]さらに、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦ受容体の断片であってもよい。一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の断片は、ＶＥＧＦが結合する領域である、ＶＥＧＦ受容体のドメインＤ１、Ｄ２若しくはＤ３又はこれらの組み合わせを含む。好ましくは、ＶＥＧＦ受容体の断片はＤ２及びＤ３を含み得る。

[0070]一実施形態では、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインはＶＥＧＦ受容体１又は２のＤ２及びＤ３ドメインを含む。さらに、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ又はＰｌＧＦに結合して、血管新生を阻害することができる。この場合、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一実施形態は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み得る。さらに、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、配列番号１４を含むＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部が切断されているか又は変化している形態であってもよい。

[0071]本明細書で使用される用語「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」は、抗ＶＥＧＦ抗体とも呼ばれる、ＶＥＧＦ又はその断片に特異的に結合することによって抗原抗体反応を引き起こす抗体を指す。

[0072]抗体は、ＶＥＧＦと特異的な抗原抗体結合を形成することができる分子の総称である。さらに、抗体は、抗体がＶＥＧＦに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む限り、任意の形態で使用することができる。抗体又はその断片は、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ）_２、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はこれらのバリアントであってもよい。

[0073]抗ＶＥＧＦ抗体はナノボディであってもよい。この場合、抗体は、配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を含み得る。具体的には、抗体はＢＩ－８３６８８０であってもよい。

[0074]抗ＶＥＧＦ抗体は、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ラムシルマブ、ブロルシズマブ、ファリシマブ、ＫＳＩ－３０１、バヌシズマブ、ＢＩ－８３６８８０、ＨｕＭａｂ Ｇ６－３１、Ｂ２０－４．１、ＢＡＴ－５９０６、ナビシキシズマブ、ジルパキマブ、ｈＰＶ－１９及びＡＴ－００１からなる群から選択されるいずれか１つの可変領域を含み得る。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、ＫＳＩ－３０１、バヌシズマブ、ＢＩ－８３６８８０又はＢＡＴ－５９０６の可変領域を含み得る。

[0075]この場合、アフリベルセプトは、血管においてＶＥＧＦ－Ａ及びＰｌＧＦを阻害する組換えヒト化融合タンパク質を指す。ここで、アフリベルセプトを眼球に直接注射することができる。ベバシズマブは、血管においてＶＥＧＦ－Ａを阻害して血管の増殖を阻害する血管新生阻害剤である抗体である。黄斑変性の治療の場合には、ベバシズマブを眼球に直接注射することができる。ラニビズマブは、血管新生を阻害することによって湿潤型黄斑変性症を治療する効果を有するＦａｂである。ラムシルマブは、ＶＥＧＦ受容体２を阻害する血管新生媒介性物質又は抗体である。ブロルシズマブは、ＶＥＧＦ－Ａに結合し、血管新生を阻害し、湿潤型黄斑変性症を治療するｓｃＦｖである。ファリシマブは、ＶＥＧＦ－Ａ及びアンジオポエチン－２を阻害する二重特異性抗体である。

[0076]ＫＳＩ－３０１は、湿潤型黄斑変性症を治療する効果を有する抗体である。バヌシズマブは、ＶＥＧＦ－Ａ及びアンジオポエチン－２を阻害する二重特異性ヒト化モノクローナル抗体である。ＢＩ－８３６８８０は、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン－２を阻害するヒト化二重特異性ナノボディである。Ｇ６－３１は、ヒトＶＥＧＦを阻害するＦａｂ断片である。Ｂ２０－４．１は、ヒトＶＥＧＦを阻害するｓｃＦｖ断片である。

[0077]ＢＡＴ－５９０６は、湿潤型黄斑変性症を治療する効果を有する抗体である。ナビシキシズマブは抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。ジルパキマブは抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重特異性抗体であり、ＡＢＴ－１６５とも称される。ｈＰＶ－１９はＶＥＧＦに対する抗体であり、抗血管新生促進及び抗腫瘍活性を有する。ＡＴ－００１は、ヒトＶＥＧＦ受容体３を阻害して血管新生を阻害する抗体である。

[0078]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＢＩ－８３６８８０の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２及び配列番号５１のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み得る。

[0079]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号７７のＨＣＤＲ１、配列番号７８のＨＣＤＲ２及び配列番号７９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号８０のＬＣＤＲ１、配列番号８１のＬＣＤＲ２及び配列番号８２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0080]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はラニビズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号８３のＨＣＤＲ１、配列番号８４のＨＣＤＲ２及び配列番号８５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号８６のＬＣＤＲ１、配列番号８７のＬＣＤＲ２及び配列番号８８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0081]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はラムシルマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号８９のＨＣＤＲ１、配列番号９０のＨＣＤＲ２及び配列番号９１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号９２のＬＣＤＲ１、配列番号９３のＬＣＤＲ２及び配列番号９４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0082]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はファリシマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１０１のＨＣＤＲ１、配列番号１０２のＨＣＤＲ２及び配列番号１０３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１０４のＬＣＤＲ１、配列番号１０５のＬＣＤＲ２及び配列番号１０６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0083]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＫＳＩ－３０１の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１０７のＨＣＤＲ１、配列番号１０８のＨＣＤＲ２及び配列番号１０９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１１０のＬＣＤＲ１、配列番号１１１のＬＣＤＲ２及び配列番号１１２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0084]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はバヌシズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１１３のＨＣＤＲ１、配列番号１１４のＨＣＤＲ２及び配列番号１１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１１６のＬＣＤＲ１、配列番号１１７のＬＣＤＲ２及び配列番号１１８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0085]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＢＡＴ－５９０６の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１１９のＨＣＤＲ１、配列番号１２０のＨＣＤＲ２及び配列番号１２１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１２２のＬＣＤＲ１、配列番号１２３のＬＣＤＲ２及び配列番号１２４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0086]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はナビシキシズマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１２５のＨＣＤＲ１、配列番号１２６のＨＣＤＲ２及び配列番号１２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１２８のＬＣＤＲ１、配列番号１２９のＬＣＤＲ２及び配列番号１３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0087]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はジルパキマブの可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１３１のＨＣＤＲ１、配列番号１３２のＨＣＤＲ２及び配列番号１３３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１３４のＬＣＤＲ１、配列番号１３５のＬＣＤＲ２及び配列番号１３６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0088]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はｈＰＶ－１９の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１３７のＨＣＤＲ１、配列番号１３８のＨＣＤＲ２及び配列番号１３９のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１４０のＬＣＤＲ１、配列番号１４１のＬＣＤＲ２及び配列番号１４２のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0089]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体はＡＴ－００１の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号１４３のＨＣＤＲ１、配列番号１４４のＨＣＤＲ２及び配列番号１４５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号１４６のＬＣＤＲ１、配列番号１４７のＬＣＤＲ２及び配列番号１４８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0090]一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３６の重鎖及び配列番号３７の軽鎖；配列番号３８の重鎖及び配列番号３９の軽鎖；配列番号４０の重鎖及び配列番号４１の軽鎖；配列番号４３の重鎖及び配列番号４４の軽鎖；配列番号４５の重鎖及び配列番号４６の軽鎖；配列番号４７の重鎖及び配列番号４８の軽鎖；配列番号６４の重鎖及び配列番号６５の軽鎖；配列番号６６の重鎖及び配列番号６７の軽鎖；配列番号６８の重鎖及び配列番号６９の軽鎖；配列番号７０の重鎖可変領域及び配列番号７１の軽鎖可変領域；又は配列番号７２の重鎖可変領域及び配列番号７３の軽鎖可変領域を含み得る。

[0091]抗ＶＥＧＦ抗体の断片は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であってもよい。この場合、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された形態を指す。具体的には、配列番号９５のＣＤＲ１、配列番号９６のＣＤＲ２、配列番号９７のＣＤＲ３、配列番号９８のＣＤＲ４、配列番号９９のＣＤＲ５及び配列番号１００のＬＣＤＲ６を含むｓｃＦｖ可変領域を含み得る。さらに、ｓｃＦｖは配列番号４２のアミノ酸配列を含み得る。この場合、ｓｃＦｖの一実施形態はブロルシズマブであってもよい。

[0092]抗ＶＥＧＦ抗体はＨｕＭａｂ Ｇ６－３１又はＢ２０－４．１の可変領域を含み得る。具体的には、該抗体は、配列番号５２のＨＣＤＲ１、配列番号５３のＨＣＤＲ２及び配列番号５４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２及び配列番号５７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。さらに、抗体は、配列番号５８のＨＣＤＲ１、配列番号５９のＨＣＤＲ２及び配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域並びに配列番号６１のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２及び配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み得る。

[0093]ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、限定されないが、当業者に既知の抗体を指し得る。別の実施形態では、米国特許第９，５２７，９２５号、米国特許第８，２６８，３１４（Ｂ２）号又は米国特許出願公開第２０１９－０１６７７９０号に開示されている抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片を抗体として使用することができる。

[0094]ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片とＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質とをリンカーによって連結することができる。

[0095]さらに、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片と免疫グロブリン断片とをリンカーによって連結することができる。リンカーは２つのタンパク質を連結する。リンカーの一実施形態は、１～５０個のアミノ酸、アルブミン若しくはその断片又は免疫グロブリンのＦｃドメインを含み得る。この場合、免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、重鎖及び軽鎖の可変領域並びに免疫グロブリンの軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を指す。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってもよく、好ましくはＩｇＧ１であってもよい。本明細書のＦｃドメインは、ヒンジ領域を除いて、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む領域を指し得る。

[0096]さらに、融合タンパク質は構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）からなってもよい。
[0097]Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
[0098]Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
[0099]構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
[00100]Ｎ’は融合タンパク質のＮ末端であり、
[00101]Ｃ’は融合タンパク質のＣ末端であり、
[00102]ＸはＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片であり、
[00103]ＹはＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質であり、
[00104]リンカー（１）及びリンカー（２）はペプチドリンカーであり、
[00105]ｎ及びｍはそれぞれ独立的に０又は１である。

[00106]ＶＥＧＦ、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片に特異的に結合するタンパク質及びＦｃドメインは上記の通りである。Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＦｃ重鎖のＣＨ２及びＣＨ３領域を含み得る。さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインだけでなく、Ｆｃドメインバリアントであってもよい。さらに、本明細書で使用される用語「Ｆｃドメインバリアント」は、野生型Ｆｃドメインのものと異なるグリコシル化パターンを有し得るか、又は野生型Ｆｃドメインと比較してグリコシル化が増加した、野生型Ｆｃドメインと比較してグリコシル化が減少した、若しくは脱グリコシル化されている形態であり得るＦｃドメインを指す。さらに、グリコシル化されていないＦｃドメインも含まれる。Ｆｃドメイン又はこれらのバリアントは、宿主の培養条件又は遺伝子操作を通じて、調整された数のシアル酸、フコシル化及びグリコシル化を有し得る。

[00107]さらに、免疫グロブリンのＦｃドメインのグリコシル化を従来の方法、例えば、化学的方法、酵素的方法及び微生物を使用する遺伝子工学的方法によって修飾することができる。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭのＦｃ領域が混合された形態であってもよい。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている形態であってもよい。

[00108]本明細書で使用される用語「Ｆｃドメインバリアント」は、野生型Ｆｃドメインのグリコシル化を変化させることによって形成されるバリアント、Ｆｃドメイン間の配列が混合されているＦｃドメイン又は野生型Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸を欠失させる、変化させる、置換する及び／又は付加することによって形成されるバリアントを指す。野生型Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸を欠失させる、変化させる、置換する及び／又は付加することによって形成されるバリアントは、当業者に既知の方法によって調製することができる。一実施形態では、Ｆｃドメインバリアントは、野生型Ｆｃドメインのいくつかのアミノ酸配列を置換及び／又は付加することによって形成することができる。

[00109]置換及び／又は付加によって導入される「アミノ酸」は、リジン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。

[00110]Ｆｃドメインバリエーションは、抗体の活性又は機能を調節するためであり得る。一実施形態では、Ｆｃドメインバリエーションは、抗体のエフェクター機能又は細胞毒性活性を調節するためであり得る。

[00111]一実施形態では、ＦｃドメインバリアントはＤＡＮＧバリエーション又はＮＧバリエーションを含み得る。さらに、Ｆｃドメインバリアントは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの２６５番目の配列がＤからＡに置換されているバリアント、２９７番目の配列がＮからＧ又に置換されているバリアント又はこれらの組み合わせであってもよい。

[00112]一実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号６、配列番号１１及び配列番号７６からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有し得る。Ｆｃドメインは、配列番号２８又は配列番号３３のポリヌクレオチド配列にコードされ得る。

[00113]ペプチドリンカー（１）は、５～８０個の連続したアミノ酸、２０～６０個の連続したアミノ酸、２５～５０個の連続したアミノ酸又は３０～４０個のアミノ酸からなり得る。一実施形態では、ペプチドリンカー（１）は３０個のアミノ酸からなり得る。さらに、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも１つのシステインを含み得る。具体的には、１つ、２つ又は３つのシステインを含み得る。さらに、ペプチドリンカー（１）は免疫グロブリンのヒンジに由来し得る。一実施形態では、ペプチドリンカー（１）は、配列番号１５又は１７のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。

[00114]ペプチドリンカー（２）は、１～５０個の連続したアミノ酸、３～３０個の連続したアミノ酸又は５～１５個のアミノ酸からなり得る。一実施形態では、ペプチドリンカー（２）は（Ｇ４Ｓ）ｎである（ここで、ｎは１～１０の整数である）。この場合、（Ｇ４Ｓ）ｎのｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい。一実施形態では、ペプチドリンカー（２）は、配列番号１６又は１８のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。

[00115]好ましくは、融合タンパク質は構造式（Ｉ）からなり得る。

[00116]一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号８及び配列番号１０からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。

[00117]別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号８及び配列番号１０からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。この場合、同一性は、例えば、相同性パーセント及び相同性比較ソフトウェア、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から提供されるＢｌａｓｔＮソフトウェアによって、決定することができる。

[00118]融合タンパク質二量体
[00119]本発明の別の態様は、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む２つの融合タンパク質が連結されている二量体を提供する。

[00120]この場合、二量体を構成する融合タンパク質の間の連結は、リンカー中に存在するシステインを通じて、ジスルフィド結合によって形成され得るが、これに限定されない。二量体を構成する融合タンパク質は同じであってもよいが、互いに異なっていてもよい。好ましくは、二量体はホモ二量体であってもよい。

[00121]融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
[00122]本発明のさらに別の態様は、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

[00123]一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号８又は配列番号１０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％の同一性を有する核酸配列を含み得る。

[00124]一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３２からなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％の同一性を有し得る。

[00125]ポリヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列をコードする核酸をさらに含み得る。本明細書で使用される用語「シグナル配列」は、標的タンパク質の分泌を導くシグナルペプチドを指す。シグナルペプチドは宿主細胞で翻訳され、次いで切断される。具体的には、シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）膜を横断したタンパク質の輸送を起こすアミノ酸配列である。

[00126]シグナル配列のそのような特徴は当技術分野で周知であり、シグナル配列は１６～３０個のアミノ酸残基を典型的に含むが、前述の数のアミノ酸残基よりも多くの又は少ないアミノ酸残基を含み得る。典型的なシグナルペプチドは、３領域：塩基性Ｎ末端領域；中央疎水性領域；及びより極性のＣ末端領域からなる。中央疎水性領域は、未成熟ポリペプチドの輸送中に膜脂質二重層を介してシグナル配列を固定する４～１２個の疎水性残基を含む。

[00127]開始後、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼとして一般に公知である細胞酵素によってＥＲの内腔で切断される。この場合、シグナル配列は、組織プラスミノーゲン活性化（ｔＰａ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ＨＳＶ ｇＤｓ）のシグナル配列又は成長ホルモン分泌シグナル配列であってもよい。好ましくは、哺乳動物などを含めた高等真核細胞で使用される分泌シグナル配列を使用することができる。さらに、シグナル配列として、野生型シグナル配列を使用することができるか、又は宿主細胞で高発現頻度のコドンで置換されたシグナル配列を使用することができる。

[00128]融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクター
[00129]本発明のさらに別の態様は、前述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

[00130]ベクターは、宿主細胞に導入され、宿主細胞ゲノム中に組み換えられ、挿入され得る。或いは、ベクターは、エピソームとして自発的に複製することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸手段と理解される。ベクターとしては、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター及びこれらの類似体が挙げられる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられるが、これらの例に限定されない。

[00131]具体的には、ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどであってもよく、商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰなど）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰなど）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなど）又は昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルスなど）であってもよい。ベクターは宿主細胞に応じて異なるタンパク質発現レベル及び修飾を示すので、目的に最も適した宿主細胞を選択及び使用することが好ましい。

[00132]本明細書で使用される標的タンパク質の「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳及び融合タンパク質生成物又はその断片の分泌を意味すると理解される。有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）又はそのバリアントであり得る。発現ベクターは、哺乳動物細胞で標的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及び転写後にＲＮＡの定常レベルを増加させるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含み得る。

[00133]融合タンパク質を発現する形質転換細胞
[00134]本発明のさらになお別の態様は、前述のベクターが導入された形質転換細胞を提供する。

[00135]形質転換細胞の宿主細胞の例としては、原核細胞、真核細胞及び哺乳動物植物、昆虫、真菌又は細胞起源の細胞を挙げることができるが、これらの例に限定されない。原核細胞の例として、大腸菌を使用することができる。さらに、真核細胞の例として、酵母を使用することができる。さらに、哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などを使用することができるが、本発明はこれらに限定されない。当業者に公知の哺乳類宿主細胞として使用することができる任意の細胞をすべて使用することができる。

[00136]さらに、発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、ＣａＣｌ_２沈殿法、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と呼ばれる還元物質をＣａＣｌ_２沈殿法で使用することによって効率が高められるＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、細胞質融合法、炭化ケイ素繊維を使用する撹拌法、アグロバクテリウム媒介性形質転換法、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミンを使用する形質転換法、及び乾燥／阻害媒介性形質転換法などを使用することができる。

[00137]上記のように、治療剤として融合タンパク質の特性を最適化するために、又は他の目的のために、当業者に公知の方法を介して宿主細胞のグリコシル化関連遺伝子を操作することによって、融合タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、シアル酸、フコシル化及びグリコシル化）を調整することができる。

[00138]融合タンパク質を生成するための方法
[00139]本発明のさらになお別の態様は、融合タンパク質又はその二量体を生成するための方法であって、形質転換細胞を培養することを含み、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む方法を提供する。

[00140]生成方法は、ｉ）形質転換細胞を培養して培養された培地を得ること、及びｉｉ）融合タンパク質又はその二量体を培養された培地から収集することを含み得る。

[00141]形質転換細胞を培養するための方法は、当技術分野で広く既知である方法を使用して行うことができる。具体的には、培養は、バッチプロセス又はフェドバッチ若しくは反復フェドバッチプロセスで連続的に行うことができる。

[00142]融合タンパク質又はその二量体の使用
[00143]本発明のさらになお別の態様は、融合タンパク質又は２つの融合タンパク質が結合した融合タンパク質二量体を活性成分として含む、眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。

[00144]融合タンパク質及び融合タンパク質二量体は上記の通りである。

[00145]本明細書で使用される用語「眼疾患」は、眼が疾患の部位である疾患の総称であり得る。眼疾患は、補体活性若しくは血管新生によって誘発されるか若しくは悪化する眼疾患、又は主な疾患症状として過剰な血管新生を含む眼疾患を指し得る。眼疾患は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病網膜症及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生並びに網膜血管新生からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。

[00146]ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質は上記の通りである。

[00147]医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態及び体重、疾患の重症度、薬物形態並びに投与の経路及び継続期間に応じて変動するが、当業者が適切に選択することができる。本発明による眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物中の活性成分は、活性成分が眼疾患を治療する活性を示すか、又は特に、黄斑変性に対して治療効果を示すことができる限り、使用、剤形、調合目的などに従って任意の量（有効量）で含めることができるが、典型的な有効量は、組成物の総重量に基づいて、０．００１ｗｔ％～２０．０ｗｔ％の範囲内で決定されるであろう。本明細書で使用される用語「有効量」は、眼疾患の状況を改善又は治療する効果、特に、黄斑変性の状況を改善又は治療する効果を誘導することができる活性成分の量を指す。そのような有効量は、当業者の通常の能力内で実験的に決定することができる。

[00148]本明細書で使用される用語「治療」は、本用語が療法的治療と予防的治療の両方を含むという意味で使用することができる。この場合、予防は、対象の病態又は疾患を緩和する又は低減させることを意味するように使用することができる。一実施形態では、用語「治療」は、ヒトを含めた哺乳動物で疾患を治療するための投与又は適用の任意の形態を含む。さらに、本用語は、疾患又は疾患の進行を阻害又は緩徐化することを含み、且つ部分的若しくは完全に疾患を緩和するために、損なわれたか若しくは失われた機能を回復させるか若しくは修復する；非効率的なプロセスを刺激する；又は重大な疾患を緩和する意味を含む。

[00149]バイオアベイラビリティなどの薬物動態パラメーター及びクリアランス速度などの根底にあるパラメーターも有効性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、「増強された有効性」（例えば、有効性の向上）は、向上した薬物動態パラメーター及び向上した有効性に起因する可能性があり、実験動物又はヒト対象においてクリアランス速度及び眼疾患の治療又は改善などのパラメーターを比較することによって、測定することができる。

[00150]本明細書で使用される用語「治療有効量」又は「医薬的有効量」は、標的疾患を予防又は治療するのに有効な化合物又は組成物の量を指し、医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険比で疾患を治療するのに十分であり、且つ副作用を引き起こさない量も指す。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路、排出速度、治療期間、組み合わせ又は同時に使用される薬物及び医療分野で周知の他の因子を含めた因子に従って、決定することができる。一実施形態では、治療有効量は、眼疾患を治療するのに有効な薬物の量を指す。

[00151]この場合、医薬組成物は医薬的に許容可能な担体をさらに含み得る。医薬的に許容可能な担体は、担体が患者への送達に適した非有害物質である限り、いかなる担体であってもよい。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性な固体を担体として含有することができる。医薬的に許容可能な補助剤（バッファー又は分散剤）も医薬組成物中に含有することができる。

[00152]具体的には、医薬組成物は活性成分に加えて医薬的に許容可能な担体を含み、当技術分野で公知の従来の方法によって、投与経路に従って非経口剤形で調製することができる。ここで、表現「医薬的に許容可能な」は、活性成分の活性を阻害せず、且つ適用（処方）標的が適合可能なものを越えた毒性がないことを意味する。

[00153]医薬組成物が非経口剤形で調製される場合、医薬組成物は、適切な担体とともに、当技術分野で公知の方法に従って、注射、経皮投与薬剤、鼻吸入剤又は坐剤の形態で製剤化することができる。注射として製剤化される場合、滅菌水、エタノール、ポリオール、例えば、グリセロール若しくはプロピレングリコール又はこれらの混合物を適切な担体として使用することができ、好ましくは、リンゲル溶液、トリエタノールアミン含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、等張液、例えば、注射用無菌水又は５％デキストロースなどを使用することができる。医薬組成物の製剤は当技術分野で既知であり、具体的には、［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、１９９５）］などを参照することができる。本文献は、本明細書の一部として組み込まれる。

[00154]医薬組成物の好ましい投薬量は、患者の状態、体重、性別若しくは年齢、患者の重症度又は投与経路に従って、１日あたり０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲又は０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であってもよい。投与は１日１回行うことができるか又は分割して数回行うことができる。そのような投薬量は、いかなる態様においても本発明の範囲を限定するとして理解されるべきではない。

[00155]医薬組成物を適用する（処方する）ことができる対象は哺乳動物及びヒトであり、特に好ましくはヒトである。本出願の医薬組成物は、活性成分に加えて、眼疾患、特に黄斑変性を治療する効果があることが公知である任意の化合物又は天然抽出物をさらに含み得る。

[00156]本発明のさらになお別の態様は、眼疾患を治療するための融合タンパク質又はその二量体の使用であって、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む使用を提供する。

[00157]本発明のさらになお別の態様は、眼疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための融合タンパク質又はその二量体の使用であって、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含有する使用を提供する。

[00158]本発明のさらになお別の態様は、眼疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、融合タンパク質又はその二量体を対象に投与することを含み、融合タンパク質がＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含む方法を提供する。

[00159]融合タンパク質、二量体及び眼疾患は、上記の通りである。この場合、対象は、眼疾患を罹患する対象であってもよい。さらに、対象は哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。

[00160]融合タンパク質又は融合タンパク質二量体の投与経路、投薬量及び投与頻度に関して、対象への投与は、患者の状態及び副作用の有無及び最適な投与方法に従って、様々な様式及び量で行うことができ、投薬量及び投与頻度は、当業者が適切な範囲内で選択することができる。さらに、融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、治療される疾患に対して公知の治療効果を有する他の薬物若しくは生理活性物質と組み合わせて投与することができるか、又は他の薬物との配合製剤の形態で製剤化することができる。

[00161]一実施形態では、融合タンパク質は補体経路、食作用及び／又は血管新生を阻害することができる。したがって、湿潤型又は乾燥型黄斑変性などの眼疾患に対して融合タンパク質を効果的に使用することができる。特に、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン又はその断片とＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を組み合わせた場合、これらのうちの１つを含む場合と比較して、高い効果があり、相乗効果もあることが確認された。したがって、融合タンパク質は、補体経路及び血管新生を効果的に阻害することによって、乾燥型及び湿潤型黄斑変性症を効果的に治療することができる。

[00162]以下に、以下の実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。ここで、以下の実施例は、本発明を例示的に記載するためだけであり、本発明の範囲を限定しない。

[00163]調製実施例１．ＣＲＩｇを含有する融合タンパク質の調製

[00164]

[00165]Ｃ１．０１（配列番号１）は、ヒトＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～２８３）、リンカー及びＤＡＮＧ変異（Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ）によってエフェクター機能が除去されているヒトＩｇＧ１ Ｆｃからなる。

[00166]Ｃ１．０２（配列番号２）は、ヒトＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～２８３）、リンカー、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合領域からなる。

[00167]Ｃ１．０３（配列番号３）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びヒトＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～２８３）からなる。

[00168]Ｃ１．０４（配列番号４）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合領域、リンカー、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びヒトＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～２８３）からなる。

[00169]Ｃ１．０５（配列番号５）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合領域、リンカー及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧからなる。

[00170]Ｃ１．０６（配列番号６）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧからなる。

[00171]Ｃ１．０１ｍ（配列番号７）は、マウスＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～１８７）、リンカー及びＤＡＮＧ変異（Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ）によってエフェクター機能が除去されているマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃからなる。

[00172]Ｃ１．０２ｍ（配列番号８）は、マウスＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～１８７）、リンカー、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合領域からなる。

[00173]Ｃ１．０３ｍ（配列番号９）は、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びマウスＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～１８７）からなる。

[00174]Ｃ１．０４ｍ（配列番号１０）は、アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合領域、リンカー、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びマウスＣＲＩｇタンパク質の細胞外ドメイン領域（２０～１８７）からなる。

[00175]Ｃ１．０６ｍ（配列番号１１）は、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧからなる。

[00176]Ｃ１．０７ｍ（配列番号１２）は、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ、リンカー及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合領域からなる。

[00177]［配列番号１］ｈｕ ＣＲＩｇ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ
[00178]RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[00179]［配列番号２］ｈｕ ＣＲＩｇ－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー
[00180]RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK

[00181]［配列番号３］ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ｈｕ ＣＲＩｇ
[00182]DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG

[00183]［配列番号４］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ｈｕ ＣＲＩｇ
[00184]SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSRPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG

[00185]［配列番号５］ＶＥＧＦバインダー－ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ
[00186]SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[00187]［配列番号６］ｈｕ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＤＡＮＧ
[00188]SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[00189]［配列番号７］ｍｕ ＣＲＩｇ－ｍｕ ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ
[00190]HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

[00191]［配列番号８］ｍｕ ＣＲＩｇ－ｍｕ ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー
[00192]HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK

[00193]［配列番号９］ｍｕ ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ｍｕ ＣＲＩｇ
[00194]EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSHPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG

[00195]［配列番号１０］ＶＥＧＦバインダー－ｍｕ ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ｍｕ ＣＲＩｇ
[00196]SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSHPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG

[00197]［配列番号１１］ｍｕ ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ
[00198]APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

[00199]［配列番号１２］ｍｕ ＩｇＧ２ａ Ｆｃ ＤＡＮＧ－ＶＥＧＦバインダー
[00200]EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK

[00201]［配列番号１３］アフリベルセプト
[00202]SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[00203]調製実施例２．ヒトタンパク質（Ｃ１．０１～Ｃ１．０６及びアフリベルセプト）並びにマウスタンパク質（Ｃ１．０３ｍ及びＣ１．０４ｍ）の調製

[00204]調製実施例２．１．ベクター構築及びプラスミドマキシプレップ
[00205]表２及び３は、以下のとおり使用した試薬及び機器を列挙する。

[00206]

[00207]

[00208]合成ＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物をゲルによって精製した。ｐＴＴ５ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、次いで、ゲルによって精製した。インフュージョンキットを使用して、各ＰＣＲ産物及び直鎖状ベクターをライゲーションした。生成したベクターでＥＣＯＳ１０１ ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ寒天プレート上でこれを培養した。すべての操作プロセスは、標準的な形質転換プロトコールに従って行った。コロニーＰＣＲによって陽性の組換え体を確認し、組換えプラスミドに対して配列検証シークエンシングを行った。単一コロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍＬの２×ＹＴ培地に種菌（ｓｐａｗｎ）を播種した。振盪しながら３７℃で８時間培養した。

[00209]その後、２００ｍＬの２×ＹＴ選択培地に１：１，０００の比で種菌を希釈した。振盪しながら３７℃で１６時間培養した。４℃及び４，７００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細菌細胞を収集した。細菌ペレットを１２ｍＬのＲＥＳ－ＥＦバッファーに再懸濁した。続いて、１２ｍＬのＬＹＳ－ＥＦバッファーを加え、密閉したチューブを勢いよく反転させて完全に混合し、それに続いて、室温で５分間培養した。１２ｍＬのＮＥＵ－ＥＦバッファーを可溶化液に加え、チューブを勢いよく反転させて、急速且つ完全に混合した。

[00210]ヌクレオボンド（ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ）（登録商標）エクストラ（ＸＴＲＡ）カラムフィルターに可溶化液を注入する前に、フィルターの目詰りを防止するために、可溶化液チューブを３回反転させることによって沈殿物の均一な懸濁液を調製した。続いて、ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤ（登録商標）カラムフィルター及びヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムを１０ｍＬのフィルター洗浄バッファーＦＩＬ－ＥＦで洗浄した。カラムを反転させることによってヌクレオボンド（登録商標）Ｘｔｒａカラムフィルターを取り外すか又は除去した。ヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムを９０ｍＬの洗浄バッファーＥＮＤＯで洗浄した。

[00211]ヌクレオボンド（登録商標）エクストラカラムを４５ｍＬの洗浄バッファーＷＡＳＨ－ＥＦで洗浄した。プラスミドＤＮＡを１５ｍＬの溶出バッファーＥＬＵで溶出した。溶出液を５０ｍＬの遠心チューブに収集した。１０．５ｍＬの室温のイソプロパノールを加えて、溶出したプラスミドＤＮＡを沈殿させた。ボルテックスした後、混合物を２分間放置した。

[00212]その後、５ｍＬの７０％エタノールをペレットに加えた。ピペットチップを使用して、エタノールを慎重且つ完全にチューブから除去した。室温（２０℃～２５℃）でペレットを乾燥させた。次いで、１，０００μｌのＨ_２ＯでＤＮＡペレットを溶解した。

[00213]調製実施例２．２．細胞トランスフェクション及びタンパク質発現
[00214]表４は、以下のとおり使用した材料及び試薬を列挙する。
[00215]

[00216]完全培地を含有する２９３Ｆ種株を１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で維持した。０．３×１０^６細胞／ｍｌ～０．４×１０^６細胞／ｍｌの密度で細胞を培養し、２～３日ごとに培地を交換した。トランスフェクションの２４時間前に、新しく継代培養された２９３Ｆ細胞を２．６×１０^６細胞／ｍｌで調製した。調製した細胞を１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で培養した。トランスフェクションの当日に、新鮮な培地を使用して、細胞の密度を５．０×１０^６細胞／ｍｌに調整した。調整は、３Ｌシェーカーフラスコ中で１Ｌの全量で行った。０．４ｍｇのＨＣプラスミド及び０．６ｍｇのＬＣプラスミドを５０ｍｌのＯＰＴＩ ＭＥＭ Ｉで希釈し、これを０．２２μｍのフィルターで濾過した。次いで、２ｍｇのＰＥＩを５０ｍｌのＯＰＴＩ ＭＥＭ Ｉで希釈して、トランスフェクション試薬を調製した。

[00217]希釈したＰＥＩをＤＮＡ混合物に加え、次いで、直ちに混合した。続いて、室温で１５分間培養した。２．６×１０^６細胞／ｍｌで調製した２９３Ｆ細胞にＤＮＡ－ＰＥＩ混合物を加えた。次いで、１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で２４時間細胞を連続培養した。トランスフェクション後２４時間目に、１０％ペプトンを１／２０の培養培地に加え、その結果、終濃度が０．５％になった。次いで、１３０ｒｐｍ、３７℃及び８％ＣＯ_２で、インキュベーターシェーカー中で細胞を連続培養した。細胞の密度／生存率を毎日測定し、トランスフェクションから２～５日後の期間にわたって記録した。トランスフェクションから７日後に、又は細胞生存率が７０％未満の時に、精製のために細胞を収集した。

[00218]調製実施例２．３．タンパク質精製
[00219]表５～７は、以下のとおり、タンパク質精製に使用した試薬、各バッファーの組成及び機器を示す。

[00220]

[00221]

[00222]

[00223]マブセレクトシュア（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅ）カラムを使用してタンパク質を精製した。具体的には、４℃及び２，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって、上清を収集した。続いて、ザルトポア（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ）２フィルターで上清を濾過した。バッファーＡで平衡化した５ｍｌマブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ）カラムに浄化した上清をロードした。次いで、Ａ２８０吸光度がベースラインに達するまでバッファーＡでカラムを洗浄した。カラムを１０ＣＶのバッファーＢで洗浄した。カラムを１０ＣＶのバッファーＡで洗浄した。結合したタンパク質を６ＣＶのバッファーＣ溶出し、１／６量のバッファーＤを加えて溶出液を中和し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析を行った。

[00224]その後、ＨＩＣカラムを通してタンパク質を精製した。次いで、バッファーＥに対して４℃で一晩タンパク質を透析した。バッファーＥで平衡化したＨＩＣカラムに上清をロードした。次いで、Ａ２８０吸光度がベースラインに達するまで、バッファーＥでカラムを洗浄した。勾配溶出（１０ＣＶのバッファーＦ、０％～４０％）を通して、結合したタンパク質を溶出した。結合したタンパク質を２ＣＶの１００％バッファーＦで溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を行った。

[00225]タンパク質を精製した後、タンパク質を一か所に収集し、次いで、最終バッファーに対して４℃で一晩透析した。続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析を行った。

[00226]したがって、図１及び２に示すように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、精製されたＣ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０３、Ｃ１．０４、Ｃ１．０５、Ｃ１．０６、Ｃ１．０３ｍ、Ｃ１．０４ｍ及びアフリベルセプトが確認された。

[00227]調製実施例３．マウス融合タンパク質（Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍ）の調製

[00228]調製実施例３．１．タンパク質の調製
[00229]表８は、以下のとおり使用した材料及び試薬を示す。

[00231]タンパク質配列に対応するＤＮＡ断片をＧｅｎｅｗｉｚにおいて合成した（番号８０－３８３０３４８４９）。対応するＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、直鎖状にしたｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターを使用して導入した。シークエンシングによってそれらの構築を検証し、次いで、大規模なプラスミド調製プロセスによって、細胞トランスフェクションを行うのに十分な量のＤＮＡを得た。

[00232]最初に、９５％以上が２Ｌの細胞培養培地中で生存するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を２．９４×１０^６細胞／ｍＬで調製した。プラスミドＤＮＡ及びエクスピフェカタミン（ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（商標）２９３試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に最初に希釈し、次いで、混合し、細胞培養培地に加えた。１５０ｒｐｍの撹拌速度で、プラットフォームシェーカー中で細胞培養を行った。温度は３７℃で維持し、ＣＯ_２の濃度は８％で維持した。トランスフェクション後１８～２０時間目に、エンハンサー１及びエンハンサー２を細胞培養培地に加えた。

[00233]６日間の細胞培養後、４，０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間細胞を遠心分離した。精製及びゲル電気泳動のために上清を収集した。ニューページ（ＮＵＰＡＧＥ）（商標）４％～１２％ビス－トリスタンパク質ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の説明書に従って、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに上清をロードした。タンパク質の分子量を測定するために、タンパク質試料とともにページャールーラー（ＰＡＧＥＲＵＬＥＲ）（商標）未染色タンパク質ラダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。各タンパク質の残りの上清は、その後の精製プロセスで使用した。

[00234]以下のようにタンパク質精製を行った。具体的には、プロテインＡカラムをマブセレクトシュア樹脂とともに予めパッケージ化した。細胞培養培地をロードする前に、０．１Ｍトリス（ｐＨ７．０）でカラムを平衡化した。細胞培養培地をロードした後、カラムを０．１Ｍトリス（ｐＨ７．０）で洗浄し、次いで、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．５）で溶出した。０．１Ｍトリス（ｐＨ９．０）を加えることによって、溶出液を中和した。続いて、ＰＢＳバッファー（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂ５４８１１７－０５００）中で試料を透析した。

[00235]試料をロードする前に、ＳＥＣカラム（ＧＥ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、スーパーデックス２００インクリーズ１０／３００）をＰＢＳで平衡化した。ロードした後、試料をＰＢＳで溶出し、クロマトグラフィーを通して収集した。それらの各ピークを解析するためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。配合バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３～０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８）中で各試料を透析した。

[0236]ＣＨＴカラムをＣＨＴ樹脂（Ｂｉｏ－ｒａｄ、ＭＰＣ（商標）セラミックヒドロキシフルオロアパタイト）とともに予めパッケージ化し、バッファーＡ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８）で平衡化してから試料をロードした。ロードした後、カラムを３０％バッファーＢ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８）で溶出し、次いで、３０％～９０％の直線勾配 バッファーＢ及び最終的な１００％のバッファーＢで溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで溶出液を特徴づけし、配合バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３～０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８）中で試料を透析した。最終的なタンパク質を０．２μｍのフィルターで濾過し、１．５ｍＬチューブのそれぞれに０．５ｍＬの量で無菌的に分注した。

[00237]したがって、図３に示すように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、精製されたＣ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍが確認された。

[00238]調製実施例３．２．タンパク質の特徴づけ
[00239]ナノドロップ（Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ）を使用して、タンパク質の濃度を２８０ｎｍで測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣによって、タンパク質の純度を確認した。

[00240]１５μＬの精製したタンパク質及び５μＬの４×ローディングバッファーを混合し、混合物を５分間ボイルすることによって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料を調製した。ＮｕＰＡＧＥビス－トリスミニゲルの４％～１２％ゲルに１５μＬの混合した試料をロードした。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析を進めるために、ＨＰＬＣシステム１２６０インフィニティＩＩのＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷｘｌカラムに８０μＬの精製したタンパク質をロードし、ランニングバッファーとして、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを使用した。

[00241]調製実施例４．ウサギ及びラットのＣ３及びＣ３ｂの精製

[00242]調製実施例４．１．ウサギ及びラットのＣ３の精製
[00243]表９～１１は、以下のとおり、ウサギ及びラットのＣ３の精製に使用した試薬、各バッファーの組成及び装置を示す。

[00244]

[00245]

[00246]

[00247]タンパク質精製より前に、高分子量物質を血漿から除去するステップを行った。血漿の体積を測定し、次いで、粉末化塩結晶の１０％（重量／体積の比）Ｎａ_２ＳＯ_４（無水）をタンパク質溶液に撹拌しながらゆっくりと加えた。続いて、４℃で２時間撹拌した。ソルボール（Ｓｏｒｖａｌｌ）超遠心機を使用して４℃及び２６，８９２×ｇで３０分間遠心分離を行った後、上清を得て、その体積を測定した。得られた上清を５ＬのＤＥＡＥバッファーＡに対して透析し、２時間後に、５Ｌの新しい溶液と交換した。最良の結果のために、４℃で一晩透析を行った。透析が完了したかどうかを確認するために、透析物の体積、Ａ２８０及び伝導率を測定した。溶液が濁っていたか又は沈殿していた場合、４℃及び４，０００×ｇで１５分間遠心分離を行って、沈殿物を除去した。透析物を０．２μｍのフィルターで濾過し、精製が進行するまで、氷上で保存した。

[00248]陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの順序でタンパク質精製を行った。透析物をロードする前に、ＤＥＡＥカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ハイプレップ（ＨＩＰＲＥＰ）（商標）ＤＥＡＥファストフロー１６／１０）をバッファーＡ（１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジン、ｐＨ７．８）で平衡化した。ロードした後、カラムをバッファーＡで洗浄し、０％～５０％の直線勾配バッファーＢ（１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で溶出した。溶出液の画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析し、Ｃ３を含む画分を収集し、それらのＡ２８０を測定した。得られた溶出物質を２ＬのモノＳ（Ｍｏｎｏ Ｓ）バッファーＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウム）中で４℃で２時間透析した。

[00249]モノＳカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、モノＳ（ＭОＮО Ｓ）（登録商標）５／５０ＧＬ）をバッファーＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウム）で平衡化してから透析物をロードした。ＤＥＡＥ溶出液をロードした後、カラムをバッファーＡで洗浄し、０％～３５％直線勾配バッファーＢ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）で溶出した。溶出物質の画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析し、中心に位置するピーク画分をプールし、それらのＡ２８０を測定した。

[00250]試料をロードする前に、ＳＥＣカラム（ＧＥ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、スーパーデックス２００インクリーズ１０／３００）をＰＢＳで平衡化した。ロードした後、試料をＰＢＳで溶出し、クロマトグラフィーを通して収集した。それらの各ピークを解析するためにＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。中心に位置するピークＣ３画分をプールし、それらのＡ２８０を測定した。

[00251]調製実施例４．２．ウサギ及びラットのＣ３ｂの精製
[00252]０．５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳで希釈することによってＣ３を調製した。０．４μＭ Ｂ因子、０．０５μＭ Ｄ因子及び５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を加え、生成物を２５℃で３０分間培養することによって、Ｃ３をＣ３ｂに変換した。スーパーデックス２００（６０ｍＬ）ゲル濾過カラムを通して、Ｃ３ｂをさらに精製した。続いて、ウサギＣ３、ウサギＣ３ｂ、ラットＣ３及びラットＣ３ｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析を行った。

[00253]したがって、図４に示すように。ウサギＣ３、ウサギＣ３ｂ、ラットＣ３及びラットＣ３ｂが精製されたことが確認された。

[00254]実験実施例１．融合タンパク質の結合力の測定

[00255]実験実施例１．１．ビアコア表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）解析技法
[00256]融合タンパク質の結合力を測定するために、ビアコア８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２９１２９９５１）装置を使用して、調製した融合タンパク質の物理的な特性を解析した。

[00257]表１２は、以下のとおり使用した材料及び試薬を示す。
[00258]

[00259]実験実施例１．２．ＣＭ５センサーチップへの抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃ）抗体の固定化
[00260]１００ｍＬの１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーと９００ｍＬのミリＱ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）水を混合することによって、１Ｌの１×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを調製した。５０ｍＭ ＮＨＳと２００ｍＭ ＥＤＣを１：１の比で４２０秒間混合した後、１０μＬ／分の流速でＣＭ５チップを活性化した。約１０，０００ＲＵの固定化レベルに到達させるために、２５μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃ）抗体（ｐＨ５．０のアセテート）を１０μＬ／ｍｌの速度で４００秒間注入した。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を１０μＬ／分の速度で４２０秒間注入することによって、残りの活性化エステル基をブロックした。ベースラインを安定化するために、センサーチップを１０μＬ／分の速度で１６時間１×ＨＢＳ－ＥＰ＋で洗浄した。

[00261]実験実施例１．３．結合動態の測定
[00262]ベースラインを安定化するために、試料ステップ及び再生ステップからなるスタートアップサイクルを３回行った。試料ステップ：１×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを３０μＬ／分の流速で１２０秒間フローセルに注入し、その後に、１２０秒間の切断フェーズ及び３０秒間の安定化フェーズを続けた。再生ステップ：１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を３０μＬ／分の速度で３０秒間フローセルに注入し、その後に、３０秒間の安定化ステップを続けた。

[00263]その後、結合動態の測定を以下の様式で行った。

[00264]１×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを使用して、Ｃ３ｂの原液を５０ｎＭに希釈した。１×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーを使用して、ヒトＶＥＧＦ１６５を５ｎＭに希釈した。次いで、５０ｎＭ及び５ｎＭの溶液を０．７８１２５ｎＭ及び０．０７８１２５ｎＭに希釈した。試料ステップでは、希釈した抗原を３０μＬ／分の速度でフローセルに注入した。２つの０ｎＭ抗原（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー）を使用し、参照シグナルから除去した。１８０秒間の結合及び４００秒間の分離を行った。分離の時間の後、６０秒間の安定化ステップを行った。再生ステップでは、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を３０μＬ／分の速度で３０秒間フローセルに注入し、その後に、６０秒間の安定化ステップを続けた。

[00265]実験実施例１．４．解析及び結果
[00266]試料値から参照及び０ｎＭ値を引いた後、ビアコアインサイトソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（バージョン２．０．１５．１２９３３）及び曲線当てはめのための１：１結合モデルを使用して、結合動態を計算した。

[00267]表１３は、以下のとおり試験物質の結合親和性を示す。
[00268]

[00269]ヒトＣ３ｂ及びヒトＶＥＧＦ１６５へのＣ１．０１及びＣ１．０２の結合親和性並びにマウスＣ３ｂ及びヒトＶＥＧＦ１６５へのＣ１．０１ｍ及びＣ１．０２ｍの結合親和性をビアコア解析によって測定した。

[00270]したがって、表１３及び図６ａ、６ｂ及び７ａ、７ｂに示すように、ヒト及びマウスのＣ１．０１及びＣ１．０２の両方がＣ３ｂへの高い結合親和性を有すること、並びにヒト及びマウスのＣ１．０２がヒトＶＥＧＦ１６５への高い結合親和性を有することが確認された。

[00271]実験実施例２．酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による補体タンパク質及びＶＥＧＦへの融合タンパク質の結合親和性の測定
[00272]一実施形態による融合タンパク質二量体によって補体経路が阻害されるかどうかを確認するために、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０３、Ｃ１．０４及びＣ１．０１ｍ～Ｃ１．０３ｍがＣ３ｂタンパク質に結合するかどうかを酵素結合免疫吸着測定アッセイによって解析した。

[00273]具体的には、ヒトＣ３ｂタンパク質をプレートに固定化し、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０３及びＣ１．０４並びに対照としてのｈＩｇＧ１をそれらに結合させた。次に、抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体及び抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を順次それらに結合させた。さらに、マウスＣ３ｂタンパク質をプレートに固定化し、マウスＣＲＩｇを含むＣ１．０１ｍ～Ｃ１．０３ｍマウスＣ３ｂに結合させた。

[00274]したがって、図８ａに示すように、ＣＲＩｇを含むＣ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０３及びＣ１．０４が濃度依存的にヒトＣ３ｂに結合することが確認された。さらに、図８ｃに示すように、マウスＣＲＩｇを含むＣ１．０１ｍ～Ｃ１．０３ｍも濃度依存的にマウスＣ３ｂに結合することが確認された。

[00275]一実施形態による融合タンパク質が抗ＶＥＧＦ作用を有するかどうかを確認するために、融合タンパク質とヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質が結合するかどうかを酵素結合免疫吸着測定アッセイによって解析し、ヒトＶＥＧＦ１６５へのアフリベルセプト、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４及びＣ１．０５の結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定した。

[00276]具体的には、ヒトＶＥＧＦ１６５タンパク質をプレートに固定化し、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４及びＣ１．０５及びアフリベルセプト及び対照としてのｈＩｇＧ１をそれらに結合させた。次に、抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体及び抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を順次それらに結合させた。

[00277]したがって、図８ｂに示すように、酵素結合免疫吸着測定アッセイによる測定の結果として、抗ＶＥＧＦを有するアフリベルセプト、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４及びＣ１．０５が濃度依存的にヒトＶＥＧＦ１６５に結合することが確認された。

[00278]一実施形態による融合タンパク質が代替経路のＣ３ｂに結合して代替経路を阻害するが、古典的経路のヒトＣ２又はＣ４タンパク質に結合せず、それにより古典的経路を阻害しないことを確認するために、一実施形態による融合タンパク質Ｃ１．０１とヒトＣｂ３、Ｃ２及びＣ４タンパク質が結合するかどうかをＥＬＩＳＡによって解析した。

[00279]具体的には、ヒトＣｂ３、Ｃ２又はＣ４タンパク質をプレートに固定化し、Ｃ１．０２をそれらに結合させた。次に、抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体及び抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を順次それらに結合させた。

[00280]したがって、図８ｄに示すように、Ｃ１．０２はＣ３ｂに結合するが、Ｃ２及びＣ４に結合しないことが確認された。

[00281]実験実施例３．動的光散乱（ＤＬＳ）解析
[00282]ＶＥＧＦバインダーが含まれるかどうかに従って融合タンパク質の流体力学的半径を測定するために、Ｃ１．０１及びＣ１．０２の流体力学的半径を動的光散乱方法によって解析した。

[00283]具体的には、Ｃ１．０１及びＣ１．０２を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を９６ウェルプレートに加え、それに続いて、ＤＬＳ解析機器としてゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）ＡＰＳ（Ｍａｒｌｖｅｒｎ）を使用して２５℃で測定した。

[00284]表１４は、以下のとおり、Ｃ１．０１及びＣ１．０２の流体力学的半径を示す表である。
[00285]

[00286]したがって、表１４及び図９ａ及び９ｂに示すように、ＶＥＧＦバインダーを含むＣ１．０２の流体力学的半径は、ＶＥＧＦバインダーがないＣ１．０１よりも長く測定されることが確認された。

[00287]実験実施例４．Ｃ１．０２の粘度の測定
[00288]濃度によってＣ１．０２の粘度を測定するために、マイクロ粘度計（ｍ－ＶＲＯＣ、ＲｈｅｏＳｅｎｃｅ）及びｖＲＯＣ－ｍＢ０５（ＲｈｅｏＳｅｎｃｅ）チップを使用して、３３、６５及び１３０ｍｇ／ｍｌのＣ１．０２の粘度を測定した。さらに、対照として、１３４ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンの粘度も測定した。

[00289]表１５は、以下のとおり、測定された粘度を示す。
[00290]

[00291]したがって、表１５及び図１０に示すように、Ｃ１．０２の粘度は、その濃度が高まるにつれて高まることが確認された。

[00292]実験実施例５．溶血解析による代替補体経路阻害効果の解析
[00293]表１６は、以下のとおり使用した試薬を示す表である。
[00294]

[00295]一実施形態による融合タンパク質が代替補体経路を阻害することを確認するために、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ及びＣ１．０４ｍの溶血解析（ＡＨ５０）を行った。

[00296]具体的には、４００×ｇで１０分間の遠心分離を使用して３ｍＬのウサギ赤血球をＴＢＳで洗浄し、このプロセスを２回繰り返した後、４００×ｇで１０分間の遠心分離を使用してウサギ赤血球をＧＶＢ ＥＧＴＡバッファーで再度洗浄した。次に、ＧＶＢ ＥＧＴＡバッファーを使用してウサギ赤血球の濃度を１×１０^９細胞／ｍＬに調整した。

[00297]感作赤血球によってＡＨ５０を解析するために、９％のヒトＣ１ｑ枯渇血清を９６ウェルプレートに加えた（５０μＬ／ウェル）。さらに、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０１ｍ及びＣ１．０２ｍを様々な濃度で処理した。４℃で３０分間培養した後、ウサギ赤血球を加えた（２×１０^６細胞／ウェル、５０μＬ／ウェル）。３７℃で１．５時間培養し、６００×ｇで１０分間遠心分離を行った。１１０μＬの上清を収集した後、そのＯＤ_４１５値を測定した。

[00298]Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ及びＣ１．０４ｍの代替補体経路阻害効果をＡＨ５０溶血解析によって確認した。

[00299]したがって、表１６及び図１１ａ～１１ｃに示すように、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ及びＣ１．０４ｍが代替補体経路による溶血作用を濃度依存的に阻害することが確認された。

[00300]実験実施例６．溶血解析による古典的補体経路阻害効果の解析
[00301]
表１７は、以下のとおり使用した試薬を示す表である。

[00302］一実施形態による融合タンパク質二量体が古典的補体経路を阻害しないことを確認するために、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０５、Ｃ１．０６、Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０４ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍの溶血解析（ＣＨ５０）を行った。

[00303]具体的には、ヒツジ赤血球をＴＢＳ中で４００×ｇで１０分間遠心分離し、このプロセスを２回繰り返した後、１ｍＬの２０％ヒツジ赤血球及び溶血素を４℃で３０分間インキュベートした。続いて、４００×ｇで１０分間の遠心分離を使用してヒツジ赤血球をＴＢＳで洗浄し、このプロセスを２回繰り返した後、４００×ｇで１０分間の遠心分離を使用してヒツジ赤血球をＧＶＢ＋＋バッファーで洗浄した。次に、ＧＶＢ＋＋バッファーを使用して、感作ヒツジ赤血球の濃度を１×１０^９細胞／ｍＬに調整した。

[00304]感作赤血球によってＣＨ５０を解析するために、３％又は４．５％のヒトＢ因子枯渇血清を９６ウェルプレートに加え（５０μＬ／ウェル）、次いで、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０６、Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍを様々な濃度で処理した。４℃で３０分間培養した後、感作ヒツジ赤血球を加えた（２．５×１０^６細胞／ウェル、５０μＬ／ウェル）。３７℃で３０分間培養した。６００×ｇで１０分間遠心分離を行い、１１０μＬの上清を収集し、次いで、そのＯＤ_４１５値を測定した。

[00305]したがって、表１６及び図１２ａ～１２ｃに示すように、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０４、Ｃ１．０５、Ｃ１．０６、Ｃ１．０１ｍ、Ｃ１．０２ｍ、Ｃ１．０４ｍ、Ｃ１．０６ｍ及びＣ１．０７ｍはすべて古典的補体経路による溶血作用を阻害しないことが確認された。

[00306]実験実施例７．ＶＥＧＦレポーター細胞を使用した、融合タンパク質の有効性解析
[00307]一実施形態による融合タンパク質がＶＥＧＦタンパク質を効果的に阻害するかどうかを確認するために、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体への結合が阻害されるかどうかを解析した。

[00308]レポーター細胞を使用して、アフリベルセプト、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２、Ｃ１．０５及びＣ１．０６のＶＥＧＦシグナリング阻害効果を確認した。具体的には、ＶＥＧＦが結合すると、受容体媒介性シグナリングによって発光性の光を生成するＶＥＧＦレポーター細胞（ＧＡ３００１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を使用して、発光の程度を介して、アフリベルセプト、Ｃ１．０２及びＣ１．０５がＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体への結合を阻害するかどうかを解析した。

[00309]したがって、図１３に示すように、アフリベルセプト、Ｃ１．０２及びＣ１．０５がＶＥＧＦによる受容体媒介性シグナリングを濃度依存的に阻害することが確認された。

[00310]実験実施例８．融合タンパク質による創傷治癒アッセイの評価
[00311]融合タンパク質二量体の創傷治癒能力阻害効果を介して、一実施形態による融合タンパク質二量体がＶＥＧＦタンパク質を効果的に阻害するかどうかを確認した。

[00312]具体的には、細胞ベースの創傷治癒アッセイ方法によって、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２及びＣ１．０５のＶＥＧＦシグナリング経路阻害効果を確認した。成人網膜色素上皮細胞株－１９（ＡＲＰＥ－１９）を解析に使用した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を使用して、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地中で、ＡＲＰＥ－１９細胞を培養した。ＡＲＰＥ－１９細胞（８０，０００細胞／ウェル）を２４ウェルプレートで一晩培養した。翌日、それぞれのウェルを一様に傷つけ、次いで、ＶＥＧＦ（６ｎｇ／ｍｌ）並びにＣ１．０１、Ｃ１．０２及びＣ１．０５（３５ｎＭ）を培養培地に加え、２４時間後に、各融合タンパク質の創傷治癒阻害能力を解析した。

[00313]したがって、図１４に示すように、Ｃ１．０２は、対照と比較して創傷治癒を有意に阻害すること（ｐ＝０．００３１）、並びにこの効果は、Ｃ１．０１（ｐ＝０．０１４６）及びＣ１．０５（ｐ＝０．０４８２）と比較して有意であることが確認された。

[00314]実験実施例９．種交差反応性試験
[00315]一実施形態による融合タンパク質二量体の種交差反応性を確認するために、Ｃ１．０２が他の種に由来するＣ３ｂ及びＶＥＧＦに結合するかどうかをＥＬＩＳＡによって解析した。

[00316]Ｃ１．０２へのヒト及びカニクイザルのＣ３ｂの結合能力、Ｃ１．０６へのヒト及びカニクイザルのＣ３ｂの結合能力、Ｃ１．０２へのヒト、カニクイザル、ラット及びウサギのＶＥＧＦの結合能力、並びにＣ１．０１へのヒト、カニクイザル、ラット及びウサギのＶＥＧＦの結合能力をＥＬＩＳＡによって確認した。具体的には、ヒト、カニクイザル、ラット又はウサギのＣ３ｂ又はＶＥＧＦをプレートに固定化し、Ｃ１．０１、Ｃ１．０２又はＣ１．０６をそれらに結合させた。次に、抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体及び抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を順次それらに結合させた。

[00317]したがって、図１５ａ～１５ｃに示すように、Ｃ１．０２は、カニクイザル、ウサギ及びラットのＣ３ｂ及びＶＥＧＦへの結合を介して、種交差反応性を有することが確認された。

[00318]実験実施例１０．湿潤型黄斑変性症についてのマウス動物モデルを使用した有効性評価
[00319]湿潤型黄斑変性症（湿潤型加齢性黄斑変性症）に対する一実施形態による融合タンパク質の治療効果を確認するために、マウス動物モデルで脈絡膜血管新生を誘導し、次いで、一実施形態による融合タンパク質二量体を眼球に直接注射し、効果を解析した。

[00320]マウスで脈絡膜血管新生表現型を誘導するために、誘導前にスペクトルドメイン光干渉断層撮影（Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ２２００ ＳＤ－ＯＣＴシステム；Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）によって、マウスに構造的な異常があるかどうかを確認した。

[00321]次に、ダイオードレーザー（ＯｃｕＬｉｇｈｔ ＴＸ－緑色５３２ｎｍレーザー；Ｉｒｉｄｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ、ＵＳＡ）を使用してマウスの右眼のブルッフ膜を貫通することによって、３つの脈絡膜血管新生を誘導した（０日目）。脈絡膜血管新生の誘導後、スペクトルドメイン光干渉断層撮影及び蛍光眼底造影（ＨＲＡ２ ＦＡシステム；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、モデルが首尾よく誘導されたかどうかを確認した。

[00322]誘導の直後に、Ｃ１．０２ｍ（３５０μＭ；４８．３μｇ／μｌ、２μｌ）、アフリベルセプト（アイリーア（Ｅｙｌｅａ）；３５０μＭ；４０．０μｇ／μｌ、２μｌ）又はビヒクル対照（２μｌ）を硝子体内注射によって注射した。スペクトルドメイン光干渉断層撮影及び蛍光眼底造影システムを使用して、脈絡膜血管新生の誘導の直後（０日目）及び誘導から７日後（７日目）にインビボイメージングを行った。蛍光眼底造影システムの写真中の各脈絡膜血管新生について、血管漏出があった場合１ポイントをスコア化し、血管漏出がない場合０ポイントをスコア化した、次いで、病変確率を計算した。例えば、１００％の表記は、３つの脈絡膜血管新生で観察された血管漏出を意味する。

[00323]したがって、図１６ａ～１６ｃに示すように、投与の７日後に、Ｃ１．０２ｍ群はアフリベルセプト群と同様の保護効果を有し、ビヒクル群と比較して、有意な保護効果を有することが確認された。

[00324]実験実施例１１．湿潤型黄斑変性症についてのウサギ動物モデルを使用した有効性評価
[00325]湿潤型黄斑変性症（湿潤型加齢性黄斑変性症）に対する一実施形態による融合タンパク質の治療効果を確認するために、ウサギ動物モデルで脈絡膜血管新生を誘導し、次いで、一実施形態による融合タンパク質を眼球に直接注射し、効果を解析した。

[00326]６個の脈絡膜血管新生を誘導したことを除いて実験実施例１０の前述の方法と同様の方法によって、ウサギで脈絡膜血管新生を誘導することにより、湿潤型黄斑変性症についてのウサギモデルを調製した。脈絡膜血管新生の誘導の直後に、Ｃ１．０１（３５０μＭ；３８．４５μｇ／μｌ、５０μｌ）、アフリベルセプト（３５０μＭ；４０μｇ／μｌ、５０μｌ）又はビヒクル対照（５０μｌ）を硝子体内注射によって注射した。蛍光眼底造影システムを使用して、脈絡膜血管新生の誘導の直後（０日目）、誘導から７日後（７日目）及び誘導から１４日後（１４日目）にインビボイメージングを行った。脈絡膜血管新生中のフルオレセイン強度を測定することによって、血管漏出を測定した。

[00327]したがって、図１７に示すように、投与の７日後に、Ｃ１．０１群はアフリベルセプト群と同様の保護効果を有し、ビヒクル群と比較して有意な保護効果を有することが確認された。

[00328]実験実施例１２．湿潤型黄斑変性についてのラット動物モデルを使用した有効性評価
[00329]湿潤型黄斑変性症に対する一実施形態による融合タンパク質の治療効果を確認するために、ラット動物モデルで脈絡膜血管新生を誘導し、次いで、一実施形態による融合タンパク質を眼球に直接注射し、効果を解析した。

[00330]４つの脈絡膜血管新生を誘導したことを除いて実験実施例１０の前述の方法と同様の方法によって、ラットで脈絡膜血管新生を誘導することにより、湿潤型黄斑変性症についてのラットモデルを調製した。脈絡膜血管新生の誘導の直後に、Ｃ１．０２（３５０μＭ；５４．９３μｇ／μｌ、５μｌ）、アフリベルセプト（３５０μＭ；４０μｇ／μｌ、５μｌ）又はビヒクル対照（５μｌ）を硝子体内注射によって注射し、次いで、蛍光眼底造影システム及びスペクトルドメイン光干渉断層撮影を使用して、０日目及び１０日目にインビボイメージングを行った。イメージングによって、誘導直後及び誘導から１０日後の脈絡膜血管新生の有無及び血管漏出面積を定量化し、これらを示す。

[00331]したがって、図１８ａ及び１８ｂに示すように、投与の１０日後に、脈絡膜血管新生の数及び血管漏出面積が有意にＣ１．０２群で低減し、その結果、Ｃ１．０２群はアフリベルセプト群と同様の保護効果を有し、ビヒクル群と比較して有意な保護効果を有することが確認された。

[00332]実験実施例１３．乾燥型黄斑変性についてのマウス動物モデルを使用した有効性評価
[00333]乾燥型黄斑変性（乾燥型加齢性黄斑変性症）に対する一実施形態による融合タンパク質の治療効果を確認するために、マウス動物モデルで乾燥型黄斑変性を誘導し、次いで、一実施形態による融合タンパク質を眼球に直接注射し、効果を解析した。

[00334]最初に、２０ｍｇ／ｋｇのヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_３）を８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈注射によって投与することによって、乾燥型黄斑変性についてのマウス動物モデルを誘導した。

[00335]モデルを誘導した後、Ｃ１．０２ｍ（２６０μＭ；３６．１μｇ／μｌ、１．５μｌ）又はビヒクル対照（１．５μｌ）を硝子体内注射によって０日目及び７日目に投与した。モデルを誘導してから２週後に、実験動物を安楽死させ、次いで、眼を摘出し、４℃で２４時間ダビットソン溶液中で固定した。続いて、固定した試料を３０％ショ糖溶液中で４℃で３日間保存した。ＯＣＴ化合物（カタログ番号４５８３、Ｓａｋｕｒａ）中で試料を凍結し、次いで、これを２０μｍの厚さにスライスした。スライスした組織において、免疫蛍光を使用して、Ｃ３（カタログ番号ＭＡ１－４００４６、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）タンパク質を染色し、ＤＡＰＩ（カタログ番号Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）染色方法を使用して、外顆粒層（ＯＮＬ）を染色した。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００；Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、染色した試料を解析した。具体的には、乾燥型黄斑変性のモデルの各実験群の外顆粒層（ＯＮＬ）、外顆粒層の細胞数、外顆粒層の面積及び網膜のＣ３発現レベルを測定した。

[00336]したがって、図１９のａ～１９のｆに示すように、細胞数及び外顆粒層の面積の測定において、網膜変性症は、ビヒクル群と比較してＣ１．０２ｍ群で有意に阻害されることが確認された。さらに、Ｃ３の発現は、非ＡＭＤ群と比較してビヒクル群で有意に増加しており、Ｃ３の発現は、Ｃ１．０２ｍ群で有意に減少していることが確認された。

[00337]実験実施例１４．Ｃ１．０２の薬物動態プロファイルの解析
[00338]一実施形態による融合タンパク質二量体の薬物動態プロファイルを解析するために、１５匹のニュージーランドホワイトウサギを３匹のウサギからなる５つの群（Ｇ０１～Ｇ０５）にグループ化した。グループ化した後、２，５００μｇのＣ１．０２（５０μｌ／眼）を硝子体内注射によって投与した。

[00339]薬物動態プロファイルを解析するための試料を得るために、最初に、ウサギの静脈から０．５ｍｌの血液を毎時間収集した。得られた血液試料から血漿を分離し、次いで、これを－６０℃で凍結保存した。さらに、硝子体液（０．２ｍｌ）及び眼房水（０．２ｍｌ）を毎時間得て、次いで、これらを－６０℃で凍結保存した。

[00340]表１８は、以下のとおり、ウサギの群、対象及び収集時間によって、得られたウサギ試料を示す。
[00341]

[00342]酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、血漿、硝子体液及び眼房水中のＣ１．０２の濃度を測定した。測定値を用いて非コンパートメント薬物動態解析を行うことによって、薬物動態パラメーターを得た。表１９は、以下のとおり、非コンパートメント薬物動態解析によって得られた薬物動態パラメーターを示す。

[00343]

[00344]以下の表２０は、硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２をウサギに投与した後の硝子体液中のＣ１．０２の濃度を示す表である。ＲＢ＃は動物の番号を示し、ＢＱＬは「定量化限界未満」を示し、ＮＤは「未決定」を示す。

[00345]

[00346]以下の表２１は、硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２をウサギに投与した後の眼房水中のＣ１．０２の濃度を示す表である。ＲＢ＃は動物の番号を示し、ＢＱＬは「定量化限界未満」を示し、ＮＤは「未決定」を示す。

[00347]

[00348]以下の表２２は、硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２をウサギに投与した後の血漿中のＣ１．０２の濃度を示す表である。ＲＢ＃は動物の番号を示し、ＢＱＬは「定量化限界未満」を示し、ＮＤは「未決定」を示す。

[00349]

[00350]硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２をウサギに投与した後の硝子体液及び眼房水中のＣ１．０２の濃度を測定した。

[00351]したがって、表２０～２２及び図２０ａ及び２０ｂに示すように、硝子体内注射によって２，５００μｇのＣ１．０２を投与した場合、硝子体液中の半減期は２２６時間であり、眼房水中の半減期は１１４時間であることが確認された。血漿では有意な濃度が観察されなかったので、血漿において薬物動態プロファイル解析は不可能であった。

Claims (20)

1. 免疫グロブリンスーパーファミリーの補体受容体（ＣＲＩｇ）の細胞外ドメイン、及び
   血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合するタンパク質
   を含む、融合タンパク質であって、
   構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
   Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
   Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
   からなり、
   構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
   Ｎ’は前記融合タンパク質のＮ末端であり、
   Ｃ’は前記融合タンパク質のＣ末端であり、
   Ｘは前記ＣＲＩｇの前記細胞外ドメインであり、
   ＹはＶＥＧＦに特異的に結合する前記タンパク質であり、
   前記リンカー（１）及び前記リンカー（２）はペプチドリンカーであり、
   ｎ及びｍはそれぞれ独立的に０又は１である、融合タンパク質。
2. 前記ＦｃドメインがＤＡＮＧバリエーション又はＮＧバリエーションを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記Ｆｃドメインが配列番号６、配列番号１１又は配列番号７６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. ＶＥＧＦに特異的に結合する前記タンパク質が、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片と、ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインとを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
5. 前記ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ受容体１又はＶＥＧＦ受容体２である、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 前記ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインが配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
7. 前記リンカー（１）が配列番号１５又は配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 前記リンカー（２）が配列番号１６又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
9. 構造式（Ｉ）からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
10. 配列番号２、配列番号４、配列番号８及び配列番号１０からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の融合タンパク質。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の２つの融合タンパク質が結合した、融合タンパク質二量体。
12. ホモ二量体である、請求項１１に記載の融合タンパク質二量体。
13. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
14. 配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０及び配列番号３２からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
15. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
16. 請求項１５に記載のベクターが導入された、形質転換細胞。
17. 請求項１に記載の融合タンパク質又は請求項１１に記載の融合タンパク質二量体を活性成分として含む、眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
18. 前記眼疾患が、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病網膜症及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生並びに網膜血管新生からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１７に記載の眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
19. 医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１７に記載の眼疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
20. 眼疾患の治療又は予防のための医薬の製造のための融合タンパク質又はその二量体の使用であって、
    前記融合タンパク質は、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン、及びＶＥＧＦに特異的に結合するタンパク質を含み、構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
    Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
    Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
    からなり、
    構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
    Ｎ’は前記融合タンパク質のＮ末端であり、
    Ｃ’は前記融合タンパク質のＣ末端であり、
    Ｘは前記ＣＲＩｇの前記細胞外ドメインであり、
    ＹはＶＥＧＦに特異的に結合する前記タンパク質であり、
    前記リンカー（１）及び前記リンカー（２）はペプチドリンカーであり、
    ｎ及びｍはそれぞれ独立的に０又は１である、使用。