JP7553151B1

JP7553151B1 - ボトリオコッセンを有効成分として含有する皮膚美容用組成物

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Publication number: JP7553151B1
Application number: JP2023138134A
Authority: JP
Inventors: 信渡邉; 欣也渥美; 宏美黒川
Original assignee: PHYCOCHEMY CORPORATION
Current assignee: PHYCOCHEMY CORPORATION
Priority date: 2023-08-28
Filing date: 2023-08-28
Publication date: 2024-09-18
Anticipated expiration: 2043-08-28
Also published as: WO2025047832A1; JP2025032703A

Abstract

【課題】本発明は、皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減するための、ボトリオコッセンを有効成分として含有する皮膚美容用組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】ボトリオコッセンが、皮膚の美容上望ましくない変化をもたらすＲＯＳの産生及びその下流の作用を抑制することを複数の試験により実証して、ボトリオコッセンが、皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減に利用できるという未知の可能性を見出すに至った。
【選択図】図７

Description

本発明は、皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減するための、ボトリオコッセンを有効成分として含有する皮膚美容用組成物に関する。

皮膚は、様々な外因性及び内因性因子によるストレスに絶え間無く晒されている。そのようなストレス因子としては、日光暴露（特に日光に含まれるＵＶＢ；光老化）、風、熱、乾燥、湿潤、家庭用界面活性剤等化学物質との接触、研磨剤等皮膚に機械的刺激を与える物質との接触、喫煙、アルコール、薬物の副作用、身体的又は心理的ストレス、加齢その他による皮膚の生化学的変化、ホルモン異常、疲労、座そう、栄養不良、疾病、生物時計の不調等が挙げられる。

これらの因子によるストレスは、皮膚の眼に見える外観、臨床的及び物理的性質、及び生理的及び組織的な機能に美容的に望ましくない低下をもたらす。皮膚は疲労し、皮膚組織の生物的及び機械的機能は時間と共に弱まり、皮膚の老化の徴候を生じることとなる。

顕著な美容上望ましくない変化としては、細かい線やしわの発生、弾力性の低下、皮膚のたるみ、固さの減少、皮膚のやせ、顔の血色の一様性の低下、顔色の悪さ、色素過剰、しみ、老人性黒子、赤斑、粗い表面の肌理、及びまだらな顔色、などがある。艶のない傷んだ毛髪、抜け毛、及び頭皮のアンバランス、もよく見られる症状である。

また、皮膚が老化するとき又は慢性的に穏和な環境のストレスに晒されるときは、上記のような直接的なストレス程顕著でないが測定できる美容上望ましくない変化が起こる。そのような変化として、組織と細胞の活性の一般的な低下、細胞の複製の鈍化、タンパク質合成の減少、タンパク質分解の増加、皮膚の血液循環の減少又は鬱血による血管の拡張、血液の浸潤、タンパク質の構造と機能のエラー蓄積、皮膚障壁の望ましくない変化、結合組織との付着、及び皮膚の再構築又は修復能力の低下等が挙げられる。

上記のような、様々なストレスや老化により顕著な又は測定できる皮膚の美容上望ましくない変化が生じる主要なプロセスとして、それら要因が酸化ストレスとして活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を促進し、ＲＯＳ濃度増大により、炎症性応答、脂質、タンパク、又はＤＮＡ損傷及びそれらに伴う細胞の機能低下若しくは細胞死や組織破壊等の傷害が引き起こされることが知られている。皮膚は常に何らかの酸化ストレスに晒されており、その酸化ストレスの強度が許容量を超える場合、又は体内の酸化ストレス処理機構が低下している場合、何らかの美容上望ましくない変化が生じることとなる。

従って、皮膚においてＲＯＳの発生を防止し、またこれを除去することが、皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減に有効であると考えられる。

生体内でＲＯＳを消去する仕組みとして、代表的なＲＯＳの消去酵素であるスーパオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、活性酸素種のスーパーオキシドを酸素及び過酸化水素に変換する反応を触媒する。形成された過酸化水素も有害であるが、これは更にカタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）によって消去される。

各種ビタミン、ポリフェノール、カテキン、グルタチオン、アスコルビン酸塩、トコフェロール、ユビキノン、ビリルビン、尿酸などの様々な低分子が、生体内の抗酸化機構と協調して、又は独立して、天然の抗酸化剤として機能し得る。例えばビタミンＢ２はＧＰｘの補酵素として作用し、ポリフェノールはＳＯＤ様活性を有する。カロテノイドも抗酸化剤として機能し、酸化的ストレス及び関連する慢性疾患に対し防御的効果を発揮し得る。例えば非特許文献１は、冠状動脈心疾患、白内障及び癌等種々の慢性疾患とカロテノイドとの間の関係についての報告をまとめている。

従って、そのような抗酸化活性を有する物質を有効成分とする美容製品は、ＲＯＳの作用に関連する皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減するのに利用され得る。実際に、様々な抗酸化物質を有効成分として用いた皮膚美容用組成物が報告されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。

良好な抗酸化活性を有する新規化合物や、既存の化合物が有する良好な抗酸化活性の発見は、医薬、食品及び化粧品の分野において需要の高い抗酸化剤の選択肢を広げるものとして、大いに歓迎される。

例えば、特許文献４は、優れた抗酸化作用を示すフラボノイド化合物としてルテオリン６－Ｃ－アラビノシドを合成し、当該化合物、その製造方法並びにそれを有効成分とする抗酸化剤を開示している。また、特許文献５は、エピガロカテキン二量体及び三量体がスーパーオキシドアニオンラジカルを消去する活性を有することを開示している。あるいは、特許文献６は、新規な含窒素ヘテロ環化合物又はその塩、それらを含有する酸化ストレス関連疾患の治療薬を開示している。

：再表０１／０２６６７０：特開２０２１－０９５３７０：特表２０１７－５３７０９１：特開２００６－２６５２４９：特開２０１０－２８０７１６：特開２００７－０１６０１１：特開平７－２６５０５９：特表２０１３－５０４３３２：特開２０１３－０３５７９１：再表２０１２／０７７８０１

：Ｃａｎｆｉｅｌｄ，ｅｔａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００：２６０：Ｋａｙａ，Ｋ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｃｕｌｔ．Ｃｏｌｌ．２６（１）：１－１０，２０１０

本発明は、皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減するための、ボトリオコッセンを有効成分として含有する皮膚美容用組成物を提供することを目的とする。

ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する藻類は、光エネルギーを利用して二酸化炭素を固定し、炭化水素を生産する微細藻類である。近年、化石エネルギーの枯渇が懸念されており、ボトリオコッカス属藻類による二酸化炭素固定は有効なエネルギー獲得法であると考えられている。また、化石エネルギーの燃焼などに伴う二酸化炭素量の増加による地球温暖化も問題となっており、二酸化炭素を炭化水素に変換する能力を有するボトリオコッカス属藻類の利用は、光エネルギーの利用のみならず二酸化炭素量の減少という面からも大きな期待がかけられている（特許文献７）。

群体性藻類ボトリオコッカス属の一種であるボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉ（Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ））は、産生する炭化水素の構造上の特徴に基づき、Ｒａｃｅ－Ａ、Ｒａｃｅ－Ｂ、Ｒａｃｅ－Ｌに分けられる。このうち、Ｒａｃｅ－Ｂは、Ｃ_ｎＨ_{２ｎ－１０}（ｎ＝３０～３７）で表される、分岐型トリテルペノイド炭化水素であるボトリオコッセン（ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｅｎｅ）を産生する（非特許文献２）。トリテルペノイド炭化水素は、例えばオクタン（ガソリン、ペトロール）、灯油、及びディーゼルを製造するための石油精製における水素化分解のための原料として使用され得る。ボトリオコッセンは、より高いオクタン価を有するバイオ燃料へと変換される可能性がある（特許文献８）。

一方、ボトリオコッセンの美容用有効成分としての用途も検討されている（特許文献９）。本文献は、本発明の出願人が共同出願人の一人となっている。本文献において、ボトリオコッセンと水素付加改質ボトリオコッセンの組合せ配合が、スクワランよりも効果がすぐれた保湿剤として利用できることが報告されている。ボトリオコッセンの美容用途はバイオ燃料用途より遥かに高い価値を付けることができるので、ボトリオコッカス・ブラウニー培養によるボトリオコッセン産生技術を発達させる強力なインセンティブとなり得る。

本発明の発明者らは、ボトリオコッセンの更なる美容用途研究を行ったところ、ボトリオコッセンが、皮膚の美容上望ましくない変化をもたらすＲＯＳの産生及びその下流の作用を抑制することを複数の試験により実証して、ボトリオコッセンが、皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減に利用できるという未知の可能性を見出すに至った。

上記特許文献９は、本発明と同じくボトリオコッセンの美容用途を示しているが、同文献が示す皮膚の保湿機能と、本発明が示すＲＯＳに関連する皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減とは、何ら関連しない別個の用途である。

従って、本願は、以下の発明を提供する。

１．皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減するための、ボトリオコッセンを有効成分として含有する、美容用組成物。
２．前記皮膚の美容上望ましくない変化が、乾燥及び細かい線やしわの発生、弾力性の低下、皮膚のたるみ、水分を失った皮膚、固さの減少、皮膚のやせ、顔の血色の一様性の低下、顔色の悪さ、色素過剰、老人性黒子、赤斑、粗い表面の肌理、まだらな顔色、組織と細胞の活性の一般的な低下、細胞の複製の鈍化、タンパク質合成の減少、タンパク質分解の増加、皮膚の血液循環の減少又は鬱血による血管の拡張、血液の浸潤、水分含有量の減少、タンパク質の構造と機能のエラー蓄積、皮膚障壁の望ましくない変化、結合組織との付着、及び皮膚の再構築又は修復能力の低下の１つ以上である、項目１に記載の美容用組成物。
３．前記皮膚の美容上望ましくない変化が、皮膚のしわ又はしみの形成である、項目１又は２のいずれかに記載の美容用組成物。
４．前記皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減が、前記ボトリオコッセンが、皮膚組織中のＲＯＳの発生の抑制、ＲＯＳにより引き起こされる炎症性サイトカイン産生の抑制、炎症性サイトカインにより引き起こされる色素細胞によるメラノソーム貪食の抑制、又は炎症性サイトカインにより引き起こされる線維芽細胞によるコラーゲン産生低下の抑制若しくはＭＭＰ－１産生亢進の抑制、のいずれか１つ以上に作用することにより達成される、項目１～３のいずれか１項に記載の美容用組成物。
５．前記皮膚組織中のＲＯＳが、皮膚の日光暴露、風、熱、乾燥、湿潤、化学物質との接触、機械的刺激を与える物質との接触、喫煙、アルコール、薬物の副作用、身体的又は心理的ストレス、加齢による皮膚の生化学的変化、ホルモン異常、疲労、座そう、栄養不良、疾病、生物時計の不調の１つ以上により発生するものである、項目４に記載の美容用組成物。
６．前記皮膚組織中のＲＯＳが、皮膚の日光暴露により発生するものである、項目４に記載の美容用組成物。
７．皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減する更に１つ以上の有効成分を含有する、項目１～６のいずれか１項に記載の美容用組成物。
８．前記更なる１つ以上の有効成分が抗酸化剤である、項目７に記載の美容用組成物。
９．前記抗酸化剤が、ビタミンＡ／レチノール、ビタミンＣ／アスコルビン酸、ビタミンＥ／α－トコフェロール、コエンザイムＱ１０、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｓ－メチルシステイン、グルタチオン、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、システインパースルフィド、システイントリスルフィド、尿酸、アリシン、アリイン、アリルジスルフィド、塩化シアニジン、シアニジン－３，５－ジグルコシド、アントシアニン、イソフラボン、ケルセチン、カテキン、テアフラビン、セサミン、セサミノール、レスベラトロール、クルクミン、クロロゲン酸、フェルラ酸、３，４－ジヒドロキシけい皮酸、β－カロテン、リコペン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（ＬＣＭ）、Ｌ－システインエチルエステル塩酸塩（ＬＣＥ）、Ｄ－システイン塩酸塩一水和物（ＤＣＨ）、Ｄ－システインメチルエステル塩酸塩（ＤＣＭ）、Ｄ－ペニシラミン（ＤＰＡ）、２－アミノエタンチオール（２－ＡＥＴ）、Ｌ－メチオニン、Ｌ－メチオニンメチルエステル塩酸塩（ＬＭＭ）からなる群から選択される、項目８に記載の美容用組成物。
１０．皮膚適用用の化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアロゾル、パック、洗浄剤、入浴剤、ファンデーション、粉末、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンスの形態である、項目１～９のいずれか１項に記載の美容用組成物。

図１は、ボトリオコッセン油滴を分泌するボトリオコッカス・ブラウニーの光学顕微鏡画像とボトリオコッセンの構造式を示す。

図２は、ボトリオコッセン処理による細胞毒性評価を示す。

図３は、ボトリオコッセン処理による細胞内ＲＯＳ消去（図３Ａ）及びＨ_２Ｏ_２添加による細胞生存率低下のボトリオコッセン処理による緩和（図３Ｂ）を示す。

図４は、ボトリオコッセン処理による炎症性サイトカインＩＬ－１α（図４Ａ）及びＰＧＥ_２（図４Ｂ）の産生抑制を示す。

図５は、ボトリオコッセン処理による線維芽細胞の蛍光ビーズ貪食抑制を示す。

図６は、ボトリオコッセン処理による表皮細胞のコラーゲン産生低下の抑制（図６Ａ）及びＭＭＰ－１産生抑制（図６Ｂ）を示す。

図７は、ＵＶＢが皮膚の美容上望ましくない変化を引き起こすプロセスの模式図及び図３～６においてボトリオコッセン処理による効果が見られた当該プロセス上の箇所を示す。

ボトリオコッセンは、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉ）の一部の株が生産する、Ｃ_ｎＨ_{２ｎ－１０}（ｎ＝３０～３７）で表される、分岐型トリテルペノイド炭化水素の一種である。このボトリオコッセンを生産するボトリオコッカス・ブラウニー・レース－Ｂは、ボトリオコッセンを高純度で大量に産生し、その９０％以上を細胞外に分泌して群体内に蓄積するという性質があるため、ボトリオコッセンの大量生産において有用である（特許文献１０）。

ボトリオコッセンは、それ自体ディーゼルオイルとして船舶や農耕作業用車に直接利用できるが、さらに既存の触媒クラッキングにより、軽油、ナフサ、灯油、ガソリンに転換することができる。また、ボトリオコッセンは優れた保湿性を有しているため、化粧品に配合する保湿成分としての用途も見出されている（特許文献９）。このようにボトリオコッセンは産業上の様々な用途における利用が見込まれるところ、本発明において提示する皮膚美容用途は、ボトリオコッセンの更なる有望な用途として、その価値を更に高めるものである。

本発明において、ボトリオコッセンを有効成分として含有する美容用組成物が調製され、斯かる美容用組成物により、皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減し得る。

このようなボトリオコッセンによる皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減効果は、実施例において後述するように、ボトリオコッセンが、皮膚のＲＯＳ濃度増大に起因する、炎症性サイトカイン産生、炎症性サイトカインにより引き起こされる色素細胞によるメラノソーム貪食、又は炎症性サイトカインにより引き起こされる線維芽細胞のコラーゲン産生低下若しくはＭＭＰ－１産生等、皮膚の美容上望ましくない変化を生じる様々な事象を抑制するという試験結果により、合理的に推定され得る。

皮膚のＲＯＳ濃度増大は、皮膚における様々なストレス因子の作用を媒介して、様々な皮膚の美容上望ましくない変化をもたらす。そのような間接的又は直接的にＲＯＳ濃度増大を引き起こすストレス因子として、限定されないが、日光暴露（日光に含まれるＵＶＢ；光老化）、風、熱、乾燥、湿潤、家庭用界面活性剤等化学物質との接触、研磨剤等皮膚に機械的刺激を与える物質との接触、喫煙、アルコール、薬物の副作用、身体的又は心理的ストレス、加齢その他による皮膚の生化学的変化、ホルモン異常、疲労、座そう、栄養不良、疾病、生物時計の不調等が挙げられる。

本発明において特に重要視されるストレス因子は、日光暴露である。そのような日光暴露により引き起こされる皮膚の美容上望ましくない変化のことを、一般に光老化と表現する。日光の構成要素である紫外線（ＵＶ）、特に中間ＵＶ（ＵＶＢと呼ばれる、波長２９０－３２０ｎｍ）が主として光老化を引き起こす。光老化を引き起こすのに必要なＵＶＢの被曝量は現在のところ知られていないが、一過的な紅斑や日焼けを引き起こすレベルでのＵＶＢへの繰り返しの被曝が、通常光老化に結び付く。臨床的には、光老化は肌荒れ、しわの形成、斑の着色、土色化、たるみの形成、毛細管拡張、黒子の形成、紫斑病、皮膚の脆弱化、萎縮、繊維症的色素欠乏部分の発生、前悪性腫瘍及び悪性腫瘍の発症等として同定され得る。光老化は、顔、耳、頭、首、手等の、日光に習慣的に曝される皮膚に起こる。

本発明の皮膚美容用組成物によって予防又は軽減されるべき美容上望ましくない変化として、限定されないが、細かい線やしわの発生、弾力性の低下、皮膚のたるみ、固さの減少、皮膚のやせ、顔の血色の一様性の低下、顔色の悪さ、色素過剰、老人性黒子、赤斑、粗い表面の肌理、及びまだらな顔色等が挙げられる。また、顕著ではないが測定できる美容上望ましくない変化として、組織と細胞の活性の一般的な低下、細胞の複製の鈍化、タンパク質合成の減少、タンパク質分解の増加、皮膚の血液循環の減少又は鬱血による血管の拡張、血液の浸潤、タンパク質の構造と機能のエラー蓄積、皮膚障壁の望ましくない変化、結合組織との付着、及び皮膚の再構築又は修復能力の低下等も、本発明の皮膚美容用組成物による予防又は改善が見込まれる。

本発明の皮膚美容用組成物において特に予防又は軽減すべき美容上望ましくない変化は、皮膚のしわ又はしみの形成である。皮膚のＲＯＳ濃度増大は、主に炎症性サイトカインＩＬ－１α及びＰＧＥ_２の産生を亢進し、それらの作用により、皮膚の表皮細胞のメラノソーム貪食が促進されて皮膚のしみが生じ、また真皮の線維芽細胞のコラーゲン産生が抑制され、若しくはＭＭＰ－１産生が促進されて、皮膚のしわが生じる。本願実施例において、本発明の皮膚美容用組成物が、ＲＯＳ濃度増大からこれらのしみ又はしわの形成に至る経路の各所において抑制的効果を示すことが実証されている（図７）。

本発明の皮膚美容用組成物は、美容上望ましくない変化を予防又は軽減すべき皮膚に適用されることを意図する任意の適切な剤形で調製され得る。従って、限定されないが、剤形として、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアロゾル、パック、洗浄剤、入浴剤、ファンデーション、粉末、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス等が挙げられる。本発明の皮膚美容用組成物をいかなる剤形で調製するかを決定すること、また所望の剤形を構成するのに適切な成分組成を設計することは、当業者にとって通常の製剤条件の最適化又は条件検討の範疇である。

所望の効果を達成するのに十分な本発明の皮膚美容用組成物へのボトリオコッセンの配合量は、組成物の剤形、用法、用量、所望の美容上の効果、対象とする美容上望ましくない変化の種類又は程度等の要素を考慮して、また当業者が美容分野で通常行われる予備試験を経て、適切に決定することができる。なお、本願実施例におけるボトリオコッセン濃度はインビトロ培養細胞に対し適用された濃度であって、本発明の皮膚美容用組成物へのボトリオコッセンの配合量の範囲を規定するものではない。

本発明の皮膚美容用組成物は、ボトリオコッセンに加えて１つ以上の追加の有効成分を配合し得る。斯かる追加の有効成分は、本発明の皮膚美容用組成物による美容上望ましくない変化を予防又は軽減する効果を補助し、又は相加的若しくは相乗的に強化するものであり得る。例えば、本発明の皮膚美容用組成物は、１つ以上の追加の有効成分として抗酸化剤を配合し得る。

本発明の皮膚美容用組成物に追加で配合される抗酸化剤として、限定されないが、ビタミンＡ／レチノール、ビタミンＣ／アスコルビン酸、ビタミンＥ／α－トコフェロール、コエンザイムＱ１０、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｓ－メチルシステイン、グルタチオン、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、システインパースルフィド、システイントリスルフィド、尿酸、アリシン、アリイン、アリルジスルフィド、塩化シアニジン、シアニジン－３，５－ジグルコシド、アントシアニン、イソフラボン、ケルセチン、カテキン、テアフラビン、セサミン、セサミノール、レスベラトロール、クルクミン、クロロゲン酸、フェルラ酸、３，４－ジヒドロキシけい皮酸、β－カロテン、リコペン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（ＬＣＭ）、Ｌ－システインエチルエステル塩酸塩（ＬＣＥ）、Ｄ－システイン塩酸塩一水和物（ＤＣＨ）、Ｄ－システインメチルエステル塩酸塩（ＤＣＭ）、Ｄ－ペニシラミン（ＤＰＡ）、２－アミノエタンチオール（２－ＡＥＴ）、Ｌ－メチオニン、Ｌ－メチオニンメチルエステル塩酸塩（ＬＭＭ）が挙げられる。

以下実施例において、皮膚の美容上望ましくない変化をもたらす様々な分子生物学的事象のインビトロモデルにおける、本発明の皮膚美容用組成物に配合されるボトリオコッセンの効果を示す。

細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫｓ）は、１０％ウシ胎児血清、１％抗生物質、１％ヒト表皮角化細胞増殖サプリメントを添加したＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（ＫＧ２）培地中、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。

正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦｓ）は、１０％ウシ胎児血清、１％抗生物質、１％ヒト表皮ケラチノサイト増殖サプリメントを添加したＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。

ボトリオコッセン処理による細胞傷害性測定
ＮＨＥＫｓ細胞を、ＫＧ２培地中２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、０、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００μＭボトリオコッセンを添加したＨｕＭｅｄｉａ－ＫＢ２（ＫＢ２）培地に交換し、２４時間インキュベートした。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．００３％ニュートラルレッドを含むＫＢ２培地に交換して２時間培養した。細胞内のニュートラルレッドを３０％ＭｅＯＨ中の１ＭＨＣｌで抽出した。５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

本試験の結果を図２に示す。ボトリオコッセン濃度０～２００μＭでは細胞生存率に変化は無かったが、４００μＭで顕著な低下が見られた。この結果を踏まえ、以降の試験においてボトリオコッセン処理濃度は最大で２００μＭとした。

実施例１．ボトリオコッセンの細胞内活性酸素種除去効果
ＮＨＥＫｓ細胞を、ＫＧ２培地中２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。上清を除去し、０、２５、５０、１００、２００μＭボトリオコッセンを添加したＫＢ２培地に交換し、２４時間インキュベートした。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２００μＭＨ_２Ｏ_２を含むＨＢＳＳバッファーに交換して１時間培養した。上清を除去し、２０μＭＤＣＦＨ－ＤＡ含有ＨＢＳＳバッファーで３０分間培養した。蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ＝４８５ｎｍ，Ｅｘｔａｔｉｏｎ＝５３０ｎｍ）。その後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む５０μＬのＰＢＳで細胞を溶解し、タンパク質量を定量し、単位タンパク質あたりの蛍光強度を規格化した。

上記試験の結果を図３Ａに示す。２００μＭＨ_２Ｏ_２処理により細胞内ＲＯＳ濃度が増大する。Ｈ_２Ｏ_２処理により増大した細胞内ＲＯＳ濃度及びＨ_２Ｏ_２未処理の細胞内ＲＯＳ濃度のいずれも、ボトリオコッセンの添加により、濃度依存的なＲＯＳ濃度低下が見られた。

実施例２．Ｈ_２Ｏ_２添加による細胞傷害に対するボトリオコッセンの効果
ＮＨＥＫｓ細胞を、ＫＧ２培地中２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、０、２５、５０、１００、２００μＭボトリオコッセンを添加したＫＢ２培地に交換し、２４時間インキュベートした。培養後、細胞をＰＢＳおよび３００μＭＨ_２Ｏ_２を含むＨＢＳＳで１時間洗浄し、その後細胞をＫＢ２培地で２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．００３％ニュートラルレッドを含むＫＢ２培地に交換し、２時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞内のニュートラルレッドを３０％ＭｅＯＨ中１ＭＨＣｌで抽出した。５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

上記試験の結果を図３Ｂに示す。３００μＭＨ_２Ｏ_２処理により細胞生存率が低下するのは細胞内ＲＯＳ濃度増大によるものと推定される。Ｈ_２Ｏ_２処理による細胞生存率の低下はボトリオコッセンの添加により濃度依存的に回復した。

実施例３．ＵＶＢ照射によるＩＬ－１α及びＰＧＥ_２産生促進に対するボトリオコッセンの効果
ＮＨＥＫｓ細胞を、ＫＧ２培地中２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、０、２５、５０、１００および２００μＭボトリオコッセンを含むＫＢ２培地に置き換えて２４時間培養し、その後ＰＢＳで細胞を洗浄しＨＢＳＳと交換した。その後、細胞にＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ、２０ｍＪ／ｃｍ^２）を照射し、新鮮なＫＢ２培地で２４時間培養した。培養上清中のＩＬ－１αおよびＰＧＥ_２発現量は、ＥＬＩＳＡ測定キットを用いて測定した。その後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む５０μＬのＰＢＳで細胞を溶解し、タンパク質量を定量し、単位タンパク質あたりのIL-1αおよびPGE₂産生量を算出した。

上記試験の結果を図４に示す。ＵＶＢ照射により、炎症性サイトカインＩＬ－１α及びＰＧＥ_２の濃度が顕著に増大し、これは、ＵＶＢ照射が細胞に酸化的ストレスを与え炎症性サイトカインの産生を誘導するというＵＶＢ照射に対する皮膚の炎症応答を再現するものである。ＵＶＢ照射によるＩＬ－１α及びＰＧＥ_２のいずれの産生誘導も、１００μＭまではボトリオコッセンの添加により濃度依存的に抑制された。ボトリオコッセン濃度２００μＭの条件では、ＩＬ－１α及びＰＧＥ_２のいずれの産生誘導も抑制されなかった。ＵＶＢ非照射条件下におけるＩＬ－１α及びＰＧＥ_２の産生量も、ＩＬ－１αについては１００μＭまで、ＰＧＥ_２については５０μＭまで、ボトリオコッセン濃度依存的な抑制が認められた。

実施例４．ＵＶＢ照射による蛍光ビーズ貪食促進に対するボトリオコッセンの効果
ＮＨＥＫｓ細胞を、ＫＧ２培地中２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、０、２５、５０、１００および２００μＭボトリオコッセンを含むＫＢ２培地に置き換えて２４時間培養し、その後ＰＢＳで細胞を洗浄しＨＢＳＳに置換した。その後、細胞にＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ、２０ｍＪ／ｃｍ^２）を照射し、新鮮なＫＢ２培地で２４時間培養した。培地をＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を含むＫＢ２培地に差し替えて４時間置いた後、５０μＬＰＢＳ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で細胞を溶解し、細胞溶解物の蛍光発光をマイクロプレートリーダーで測定した。細胞溶解物の蛍光発光は、蛍光リーダーで励起／発光波長５３５ｎｍ／５９０ｎｍで検出した。その後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む５０μＬのＰＢＳで細胞を溶解し、タンパク質量を定量し、単位タンパク質あたりの蛍光強度を規格化した。

上記試験の結果を図５に示す。ＮＨＥＫｓ細胞によるＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（商標）の貪食は、ＵＶＢ照射刺激（ＲＯＳ及び炎症性サイトカインを経て）を受けた色素細胞がメラノソームを貪食して細胞内に蓄積することにより皮膚のしみが形成される系をインビトロで再現するものである。ＵＶＢ照射による蛍光ビーズ貪食は、１００μＭまではボトリオコッセンの添加により濃度依存的に抑制された。ボトリオコッセン濃度２００μＭの条件では、５０μＭ及び１００μＭよりも蛍光ビーズ貪食抑制効果は小さかった。

実施例５．ＵＶＢ照射によるＩ型コラーゲン産生抑制およびＭＭＰ－１産生促進に対するボトリオコッセンの効果
ＮＨＥＫｓ細胞を、ＫＧ２培地中２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、０、２５、５０、１００および２００μＭボトリオコッセンを含むＫＢ２培地に置き換えて２４時間培養し、その後ＰＢＳで細胞を洗浄しＨＢＳＳに置換した。その後、細胞にＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ、２０ｍＪ／ｃｍ^２）を照射し、新鮮なＫＢ２培地で２４時間培養した。培養後、上清（Ｋ－ＣＭ）を回収した。ＮＨＤＦｓ細胞を、ＤＭＥＭ培地中２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベートした。培養後、Ｋ－ＣＭを添加して更に２４時間培養した。上清をＥＬＩＺＡによるＩ型コラーゲンおよびＭＭＰ－１産生の解析に供した。その後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む５０μＬのＰＢＳで細胞を溶解し、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にてタンパク質量を定量し、単位タンパク質あたりのＩ型コラーゲンおよびＭＭＰ－１産生を算出した。

上記試験の結果を図６に示す。この試験は、ＵＶＢ照射刺激を受けた表皮細胞が炎症性サイトカインを産生し、炎症性サイトカインにより線維芽細胞のコラーゲン産生が抑制され、又はＭＭＰ－１産生が促進されることにより皮膚のしわが形成される系をインビトロで再現するものである。ＵＶＢ照射したＮＨＥＫｓ細胞の培養上清は、強力なコラーゲン産生抑制作用、及びＭＭＰ－１産生促進作用を有しており、これはＵＶＢ照射したＮＨＥＫｓ細胞が培地中に放出した炎症性サイトカインによるものと推察される。コラーゲン産生低下及びＭＭＰ－１産生促進は、１００μＭまではボトリオコッセンの添加により濃度依存的に抑制された。ボトリオコッセン濃度２００μＭの条件では、５０μＭ及び１００μＭよりも抑制効果は小さかった。

Claims

皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減するための、ボトリオコッセンを有効成分として含有する、美容用組成物。
前記皮膚の美容上望ましくない変化が、細かい線やしわの発生、弾力性の低下、皮膚のたるみ、固さの減少、皮膚のやせ、顔の血色の一様性の低下、顔色の悪さ、色素過剰、老人性黒子、赤斑、粗い表面の肌理、まだらな顔色、組織と細胞の活性の一般的な低下、細胞の複製の鈍化、タンパク質合成の減少、タンパク質分解の増加、皮膚の血液循環の減少又は鬱血による血管の拡張、血液の浸潤、タンパク質の構造と機能のエラー蓄積、皮膚障壁の望ましくない変化、結合組織との付着、及び皮膚の再構築又は修復能力の低下の１つ以上である、請求項１に記載の美容用組成物。
前記皮膚の美容上望ましくない変化が、皮膚のしわ又はしみの形成である、請求項１に記載の美容用組成物。
前記皮膚の美容上望ましくない変化の予防又は軽減が、前記ボトリオコッセンが、皮膚組織中の活性酸素種（ＲＯＳ）の発生の抑制、ＲＯＳにより引き起こされる炎症性サイトカイン産生の抑制、炎症性サイトカインにより引き起こされる色素細胞によるメラノソーム貪食の抑制、又は炎症性サイトカインにより引き起こされる線維芽細胞によるコラーゲン産生低下の抑制若しくはＭＭＰ－１産生亢進の抑制、のいずれか１つ以上に作用することにより達成される、請求項１に記載の美容用組成物。
前記皮膚組織中のＲＯＳが、皮膚の日光暴露、風、熱、乾燥、湿潤、化学物質との接触、機械的刺激を与える物質との接触、喫煙、アルコール、薬物の副作用、身体的又は心理的ストレス、加齢による皮膚の生化学的変化、ホルモン異常、疲労、座そう、栄養不良、疾病、生物時計の不調の１つ以上により発生するものである、請求項４に記載の美容用組成物。
前記皮膚組織中のＲＯＳが、皮膚の日光暴露により発生するものである、請求項４に記載の美容用組成物。
皮膚の美容上望ましくない変化を予防又は軽減する更に１つ以上の有効成分を含有する、請求項１に記載の美容用組成物。
前記更なる１つ以上の有効成分が抗酸化剤である、請求項７に記載の美容用組成物。
前記抗酸化剤が、ビタミンＡ／レチノール、ビタミンＣ／アスコルビン酸、ビタミンＥ／α－トコフェロール、コエンザイムＱ１０、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｓ－メチルシステイン、グルタチオン、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、システインパースルフィド、システイントリスルフィド、尿酸、アリシン、アリイン、アリルジスルフィド、塩化シアニジン、シアニジン－３，５－ジグルコシド、アントシアニン、イソフラボン、ケルセチン、カテキン、テアフラビン、セサミン、セサミノール、レスベラトロール、クルクミン、クロロゲン酸、フェルラ酸、３，４－ジヒドロキシけい皮酸、β－カロテン、リコペン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、Ｌ－システインメチルエステル塩酸塩（ＬＣＭ）、Ｌ－システインエチルエステル塩酸塩（ＬＣＥ）、Ｄ－システイン塩酸塩一水和物（ＤＣＨ）、Ｄ－システインメチルエステル塩酸塩（ＤＣＭ）、Ｄ－ペニシラミン（ＤＰＡ）、２－アミノエタンチオール（２－ＡＥＴ）、Ｌ－メチオニン、Ｌ－メチオニンメチルエステル塩酸塩（ＬＭＭ）からなる群から選択される、請求項８に記載の美容用組成物。
皮膚適用用の化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアロゾル、パック、洗浄剤、入浴剤、ファンデーション、粉末、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンスの形態である、請求項１に記載の美容用組成物。