JP7417985B2 - primer set - Google Patents
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Description
本発明は、プライマーセット、LAMP法反応用組成物、チクングニア熱の検査方法等に関する。 The present invention relates to a primer set, a composition for LAMP reaction, a method for testing chikungunya fever, and the like.
チクングニア熱は、未だにワクチンや治療薬が開発されていない蚊媒介性のウイルス疾患であり、強い関節痛を主症状とするため、患者のQOLを著しく低下させる。過去に、世界各地でチクングニア熱の大流行が起きているが、そのリスクを軽減させるためには、二次感染拡大を防ぐための早期診断が必須である。 Chikungunya fever is a mosquito-borne viral disease for which no vaccine or therapeutic drug has yet been developed, and the main symptom is severe joint pain, which significantly reduces the quality of life of patients. Large-scale outbreaks of chikungunya fever have occurred in many parts of the world in the past, but early diagnosis is essential to prevent the spread of secondary infections in order to reduce the risk.
現状ではチクングニア熱の検査は血清を用いたRT-PCR法が標準的である。しかし、RT-PCR法はRNAの抽出、PCRでの3段階における温度変化、電気泳動などのステップが必要であるため、診断には最低5-6時間必要である。さらに、高価な機器（サーマルサイクラー）や試薬の冷蔵設備、熟練した技術などが必要となる。しかし、多くの流行地ではこれらの設備が不十分であったり、技術者が不足していたりといった問題がある。 Currently, the standard method for testing for chikungunya fever is the RT-PCR method using serum. However, the RT-PCR method requires steps such as RNA extraction, temperature changes in three stages of PCR, and electrophoresis, so it takes at least 5 to 6 hours for diagnosis. Furthermore, expensive equipment (thermal cycler), reagent refrigeration equipment, and skilled techniques are required. However, in many endemic areas, there are problems such as insufficient equipment or a shortage of technicians.
Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)システムは遺伝子増幅法の一種であり、迅速、簡便、精確なシステムである。標的領域に対して4種類または6種類のプライマーを設定し、反応させるが、システムの感度や精度はプライマーに大きく依存する。非特許文献１には、チクングニアウイルスに対するLAMPシステムについて報告されている。 The Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) system is a type of gene amplification method that is rapid, simple, and accurate. Four or six types of primers are set and reacted against the target region, but the sensitivity and accuracy of the system largely depend on the primers. Non-Patent Document 1 reports on the LAMP system for chikungunya virus.
本発明は、簡便且つ効率的にチクングニア熱を検査することができる技術を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a technique that can easily and efficiently test for chikungunya fever.
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、特定の塩基配列を含むプライマーセットを用いて、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅の有無をLAMP法により検出することにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。 As a result of extensive research, the present inventors have discovered that the above problems can be solved by detecting the presence or absence of amplification of the target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method using a primer set containing a specific base sequence. . The present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this knowledge.
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 That is, the present invention includes the following aspects.
項１． （A）5’側から配列番号1で示される塩基配列、リンカー配列、配列番号2で示される塩基配列が順に配置されてなる塩基配列を含むフォワードインナープライマー、
（B）5’側から配列番号4で示される塩基配列、リンカー配列、配列番号5で示される塩基配列が順に配置されてなる塩基配列を含むバックワードインナープライマー、
（C）配列番号7で示される塩基配列を含むフォワードアウタープライマー、及び
（D）配列番号8で示される塩基配列を含むバックワードアウタープライマー
を含む、プライマーセット。
Item 1. (A) A forward inner primer comprising a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1, the linker sequence, and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 2 are arranged in this order from the 5'side;
(B) a backward inner primer comprising a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 are arranged in this order from the 5'side;
A primer set including (C) a forward outer primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, and (D) a backward outer primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 8.
項２． さらに、
（E）配列番号9で示される塩基配列を含むフォワードループプライマー、及び
（F）配列番号10で示される塩基配列を含むバックワードループプライマー
を含む、項１に記載のプライマーセット。
Item 2. moreover,
Item 2. The primer set according to Item 1, comprising (E) a forward loop primer comprising the base sequence shown by SEQ ID NO: 9, and (F) a backward loop primer comprising the base sequence shown by SEQ ID NO: 10.
項３． 項１又は２に記載のプライマーセット、及びトレハロースを含有する、乾燥形態のLAMP法反応用組成物。 Item 3. Item 3. A dry composition for LAMP reaction, comprising the primer set according to Item 1 or 2 and trehalose.
項４． 項１又は２に記載のプライマーセット、又は項３に記載の反応用組成物を含む、チクングニア熱の検査キット。 Item 4. A test kit for chikungunya fever, comprising the primer set according to item 1 or 2 or the reaction composition according to item 3.
項５． 項１又は２に記載のプライマーセット、又は項３に記載の反応用組成物を用いて、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅の有無をLAMP法により検出することを含む、チクングニア熱の検査方法。 Item 5. A method for testing chikungunya fever, which comprises detecting the presence or absence of amplification of a target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method using the primer set according to item 1 or 2 or the reaction composition according to item 3.
本発明によれば、簡便且つ効率的にチクングニア熱を検査することができる技術、具体的には、LAMP法によりチクングニアウイルスの標的核酸領域を増幅するために使用することができるプライマーセット、乾燥形態のLAMP法反応用組成物、チクングニア熱の検査キット等を提供することができる。 According to the present invention, a technique that can easily and efficiently test for chikungunya fever, specifically, a primer set that can be used to amplify a target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method, and a dry form We can provide compositions for LAMP reaction, chikungunya test kits, etc.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 In this specification, the expressions "contain" and "including" include the concepts of "containing", "comprising", "consisting essentially" and "consisting only".
1．プライマーセット
本発明は、その一態様において、フォワードインナープライマー（A）、バックワードインナープライマー（B）、フォワードアウタープライマー（C）、及びバックワードアウタープライマー（D）を含む、プライマーセット（本明細書において、「本発明のプライマーセット」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
1. Primer set In one aspect, the present invention provides a primer set (hereinafter referred to as , it may also be referred to as "the primer set of the present invention"). This will be explained below.
本発明のプライマーセットは、LAMP法によりチクングニアウイルスの標的核酸領域を増幅するために使用することができる。LAMP法（ループ媒介等温増幅法）は、PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な核酸増幅法（国際公開第00/28082号パンフレット）である。当該方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、LAMP法では、プライマーの3'末端が常にサンプルに由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度に且つ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。 The primer set of the present invention can be used to amplify a target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method. The LAMP method (loop-mediated isothermal amplification method) is a nucleic acid amplification method that does not require temperature control, which is essential in the PCR method (International Publication No. 00/28082 pamphlet). In this method, the 3' end of the nucleotide serving as a template is annealed to serve as the starting point for complementary strand synthesis, and the complementary strand synthesis reaction is carried out at an isothermal temperature by combining a primer that anneals to the loop formed at this time. This is a nucleic acid amplification method that has made it possible. In addition, in the LAMP method, the 3' end of the primer always anneals to the region derived from the sample, so the check mechanism based on complementary binding of base sequences functions repeatedly, resulting in high sensitivity and specificity. This enables highly efficient nucleic acid amplification reactions.
チクングニアウイルスは、トガウイルス科アルファウイルス属に属する節足動物媒介性ウイルスであり、プラス一本鎖RNAをゲノムとする。カプシドは直径60-70 nmである。58℃程度で失活し、また乾燥に弱い。ウイルス株はアフリカ西部、アフリカ南部から東部、アジアの3系統に大別される。本発明のプライマーセットは、チクングニアウイルスのRNAゲノムの塩基配列（例えば、配列番号13）（アンチセンス鎖）を含む核酸（例えばRNA）又は該ゲノムの相補塩基配列（センス鎖）を含む核酸（例えばcDNA、DNA等）を鋳型核酸とする。 Chikungunya virus is an arthropod-borne virus belonging to the genus Alphavirus in the family Togaviridae, and its genome is positive single-stranded RNA. The capsid is 60-70 nm in diameter. It loses its activity at around 58℃ and is sensitive to dryness. Virus strains are broadly divided into three strains: those from western Africa, southern to eastern Africa, and Asia. The primer set of the present invention includes a nucleic acid (e.g., RNA) containing the nucleotide sequence of the RNA genome of chikungunya virus (e.g., SEQ ID NO: 13) (antisense strand) or a nucleic acid (e.g., RNA) containing the complementary nucleotide sequence (sense strand) of the genome of the chikungunya virus. cDNA, DNA, etc.) as the template nucleic acid.
LAMP反応で使用される必須のプライマーは、鋳型核酸の計6領域、すなわち3'末端側からF3c、F2c、F1cという領域と、5'末端側からB3、B2、B1という領域の塩基配列、或いはその相補配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって、各々フォワードインナープライマー（FIP）及びバックワードインナープライマー（BIP）とフォワードアウタープライマー（F3）及びバックワードアウタープライマー（B3）と呼ぶ。また、F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補鎖をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをフォワードインナープライマー（FIP）、そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをバックワードインナープライマー（BIP）と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の3'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをフォワードアウタープライマー（F3）、「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをバックワードアウタープライマー（B3）と呼ぶ。ここで、各プライマーにおける「フォワード（F）」とは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方、「バック（B）」とは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。 The essential primers used in the LAMP reaction are base sequences of a total of six regions of the template nucleic acid, namely regions F3c, F2c, and F1c from the 3' end, and regions B3, B2, and B1 from the 5' end, or There are at least four types of primers that recognize the complementary sequence, and they are called forward inner primer (FIP), backward inner primer (BIP), forward outer primer (F3), and backward outer primer (B3), respectively. Furthermore, the complementary sequences of F1c, F2c, and F3c are called F1, F2, and F3, respectively, and the complementary strands of B1, B2, and B3 are called B1c, B2c, and B3c. An inner primer has a base sequence at its 3' end that recognizes a "specific nucleotide sequence region" on the target base sequence and provides a starting point for synthesis, and at the same time, it is used to generate a nucleic acid synthesis reaction product using this primer as a starting point. It is an oligonucleotide that has a complementary base sequence to an arbitrary region at its 5' end. Here, the primer containing the "base sequence selected from F2" and "base sequence selected from F1c" is used as a forward inner primer (FIP), and the "base sequence selected from B2" and "base sequence selected from B1c" are used as forward inner primers (FIP). A primer containing the nucleotide sequence is called a backward inner primer (BIP). On the other hand, an outer primer is an oligonucleotide having a base sequence that recognizes "a specific nucleotide sequence region present on the 3' end side of a particular nucleotide sequence region" on the target base sequence and provides a starting point for synthesis. It is a nucleotide. Here, the primer containing "the nucleotide sequence selected from F3" is called a forward outer primer (F3), and the primer containing "the nucleotide sequence selected from B3" is called a backward outer primer (B3). Here, the "forward (F)" in each primer is a primer designation that binds complementary to the sense strand of the target base sequence and provides a starting point for synthesis, while the "back (B)" This is a primer designation that binds complementary to the antisense strand of the base sequence and provides a starting point for synthesis.
フォワードインナープライマー（A）は、5’側から配列番号1で示される塩基配列（F1c）、リンカー配列、配列番号2で示される塩基配列（F2）が順に配置されてなる塩基配列（塩基配列A）を含む。塩基配列Aは、配列番号1で示される塩基配列、リンカー配列、及び配列番号2で示される塩基配列からなり、これらが5’側からこの順で並んで配置されてなる塩基配列である。 The forward inner primer (A) is a nucleotide sequence (base sequence )including. Base sequence A consists of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, the linker sequence, and the base sequence shown by SEQ ID NO: 2, which are arranged in this order from the 5' side.
リンカー配列としては、LAMP法において使用されるFIPにおけるリンカー配列として使用し得る塩基配列である限り、特に制限されない。リンカー配列の塩基数は、例えば1～50、好ましくは2～20、より好ましくは2～10、さらに好ましくは3～6、よりさらに好ましくは4である。リンカー配列を構成する塩基は、特に制限されない。塩基には、RNA、DNA等の天然核酸中の典型的な塩基（アデニン（A）、チミン（T）、ウラシル（U）、グアニン（G）、シトシン（C）等）のみならず、これ以外の塩基、例えばヒポキサンチン（I）、修飾塩基等も包含される。修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル、ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウラシル）、2-チオウラシル、4-チオウラシル、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5’-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2，2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2，6-ジアミノプリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられる。リンカー配列を構成する塩基は、好ましくはピリミジン塩基であり、より好ましくはチミンである。リンカー配列を構成する塩基中の、ピリミジン塩基（好ましくはチミン塩基）の割合は、例えば50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは100％である。 The linker sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence that can be used as a linker sequence in FIP used in the LAMP method. The number of bases in the linker sequence is, for example, 1 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, still more preferably 3 to 6, and even more preferably 4. The bases constituting the linker sequence are not particularly limited. Bases include not only typical bases found in natural nucleic acids such as RNA and DNA (adenine (A), thymine (T), uracil (U), guanine (G), cytosine (C), etc.), but also other bases. bases such as hypoxanthine (I), modified bases, etc. are also included. Examples of the modified base include pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (e.g., 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (e.g., 5-ethyluracil), 5-halouracil (5- Bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl)uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl- 2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine, 7-Methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2-thiouracil, 2-methylthio-N6-iso Examples include pentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid, 2-thiocytosine, purine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, isoguanine, indole, imidazole, xanthine, and the like. The bases constituting the linker sequence are preferably pyrimidine bases, more preferably thymine. The proportion of pyrimidine bases (preferably thymine bases) in the bases constituting the linker sequence is, for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, particularly preferably 100% or more. %.
塩基配列Aは、好ましくは、配列番号3で示される塩基配列である。 Base sequence A is preferably the base sequence shown in SEQ ID NO:3.
フォワードインナープライマー（A）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列A以外の他の配列（塩基配列A1）を含むことができる。塩基配列A1を含む場合は、塩基配列A1は、塩基配列Aの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列A1の総塩基数は、例えば0～5、好ましくは0～3、より好ましくは0～2、さらに好ましくは0～1、特に好ましくは0（すなわち、フォワードインナープライマー（A）が塩基配列Aからなる）である。 The forward inner primer (A) can contain a sequence other than the base sequence A (base sequence A1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. . When the base sequence A1 is included, the base sequence A1 may be added only to either the 5' end or the 3' end of the base sequence A, or may be added to either the 5' end or the 3' end of the base sequence A. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence A1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, even more preferably 0 to 1, and particularly preferably 0 (that is, the forward inner primer (A) consisting of A).
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような塩濃度及び／又は温度条件のことをいい、例えばKCl、MgSO4及び／又は(NH4)2SO4をそれぞれ5～15mM含む増幅反応液を55～70℃でインキュベートするという条件であってもよい。 In addition, in this specification, "stringent conditions" refers to salt concentration and/or temperature conditions such that only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur; for example, KCl , MgSO 4 and/or (NH4) 2 SO 4 at a temperature of 55 to 70°C.
フォワードインナープライマー（A）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The forward inner primer (A) may be used alone or in combination of two or more types.
バックワードインナープライマー（B）は、5’側から配列番号4で示される塩基配列（B1c）、リンカー配列、配列番号5で示される塩基配列（B2）が順に配置されてなる塩基配列（塩基配列B）を含む。塩基配列Bは、配列番号4で示される塩基配列、リンカー配列、及び配列番号5で示される塩基配列からなり、これらが5’側からこの順で並んで配置されてなる塩基配列である。 The backward inner primer (B) is a nucleotide sequence (base sequence B) includes. Base sequence B consists of the base sequence shown by SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, and is a base sequence in which these are arranged in this order from the 5' side.
リンカー配列については、フォワードインナープライマー（A）におけるリンカー配列と同様である。 The linker sequence is the same as that in the forward inner primer (A).
塩基配列Bは、好ましくは、配列番号6で示される塩基配列である。 Base sequence B is preferably the base sequence shown by SEQ ID NO: 6.
バックワードインナープライマー（B）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列B以外の他の配列（塩基配列B1）を含むことができる。塩基配列B1を含む場合は、塩基配列B1は、塩基配列Bの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列B1の総塩基数は、例えば0～5、好ましくは0～3、より好ましくは0～2、さらに好ましくは0～1、特に好ましくは0（すなわち、バックワードインナープライマー（B）が塩基配列Bからなる）である。 The backward inner primer (B) may contain a sequence other than base sequence B (base sequence B1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. can. When base sequence B1 is included, base sequence B1 may be added only to either the 5' end or 3' end of base sequence B, or may be added to either the 5' end or 3' end of base sequence B. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence B1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, even more preferably 0 to 1, and particularly preferably 0 (that is, the backward inner primer (B) consisting of array B).
バックワードインナープライマー（B）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The backward inner primer (B) may be used alone or in combination of two or more types.
フォワードアウタープライマー（C）は、配列番号7で示される塩基配列（塩基配列C）を含む。 The forward outer primer (C) includes the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 (base sequence C).
フォワードアウタープライマー（C）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列C以外の他の配列（塩基配列C1）を含むことができる。塩基配列C1を含む場合は、塩基配列C1は、塩基配列Cの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列C1の総塩基数は、例えば0～5、好ましくは0～3、より好ましくは0～2、さらに好ましくは0～1、特に好ましくは0（すなわち、フォワードアウタープライマー（C）が塩基配列Cからなる）である。 The forward outer primer (C) can contain a sequence other than base sequence C (base sequence C1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. . When the base sequence C1 is included, the base sequence C1 may be added only to either the 5' end or the 3' end of the base sequence C, or it may be added to either the 5' end or the 3' end of the base sequence C. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence C1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, even more preferably 0 to 1, and particularly preferably 0 (that is, the forward outer primer (C) C).
フォワードアウタープライマー（C）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The forward outer primer (C) may be used alone or in combination of two or more types.
バックワードアウタープライマー（D）は、配列番号8で示される塩基配列（塩基配列D）を含む。 The backward outer primer (D) includes the base sequence shown by SEQ ID NO: 8 (base sequence D).
バックワードアウタープライマー（D）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列D以外の他の配列（塩基配列D1）を含むことができる。塩基配列D1を含む場合は、塩基配列D1は、塩基配列Dの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列D1の総塩基数は、例えば0～5、好ましくは0～3、より好ましくは0～2、さらに好ましくは0～1、特に好ましくは0（すなわち、バックワードアウタープライマー（D）が塩基配列Dからなる）である。 The backward outer primer (D) may contain a sequence other than base sequence D (base sequence D1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. can. When the base sequence D1 is included, the base sequence D1 may be added only to either the 5' end or the 3' end of the base sequence D, or it may be added to either the 5' end or the 3' end of the base sequence D. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence D1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, even more preferably 0 to 1, and particularly preferably 0 (that is, the backward outer primer (D) consists of array D).
バックワードアウタープライマー（D）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The backward outer primer (D) may be used alone or in combination of two or more types.
本発明のプライマーセットは、さらにフォワードループプライマー及びバックワードループプライマーを含むことが好ましい。フォワードループプライマー及びバックワードループプライマーは、ダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。ループプライマーの塩基配列は上述のダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列又はその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。 Preferably, the primer set of the present invention further includes a forward loop primer and a backward loop primer. The forward loop primer and the backward loop primer are primers having a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded portion of the loop structure on the 5' end side of the dumbbell structure. Use of this primer increases the number of starting points for nucleic acid synthesis, making it possible to shorten reaction time and increase detection sensitivity. The nucleotide sequence of the loop primer may be selected from the nucleotide sequence of the target gene or its complementary strand, as long as it is complementary to the nucleotide sequence of the single-stranded portion of the loop structure on the 5' end side of the dumbbell structure described above; The nucleotide sequence may also be used.
フォワードループプライマーとしては、（E）配列番号9で示される塩基配列を含むフォワードループプライマーが特に好ましい。 As the forward loop primer, (E) a forward loop primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 9 is particularly preferred.
フォワードループプライマー（E）は、配列番号9で示される塩基配列（塩基配列E）を含む。 The forward loop primer (E) includes the base sequence shown by SEQ ID NO: 9 (base sequence E).
フォワードループプライマー（E）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列E以外の他の配列（塩基配列E1）を含むことができる。塩基配列E1を含む場合は、塩基配列E1は、塩基配列Eの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列E1の総塩基数は、例えば0～5、好ましくは0～3、より好ましくは0～2、さらに好ましくは0～1、特に好ましくは0（すなわち、フォワードループプライマー（E）が塩基配列Eからなる）である。 The forward loop primer (E) can contain a sequence other than the base sequence E (base sequence E1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions. . When the base sequence E1 is included, the base sequence E1 may be added only to either the 5' end or the 3' end of the base sequence E, or may be added to either the 5' end or the 3' end of the base sequence E. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence E1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, even more preferably 0 to 1, and particularly preferably 0 (that is, the forward loop primer (E) consisting of E).
フォワードループプライマー（E）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The forward loop primer (E) may be used alone or in combination of two or more types.
バックワードループプライマーとしては、（F）配列番号10で示される塩基配列を含むバックワードループプライマーが特に好ましい。 As the backward loop primer, (F) a backward loop primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is particularly preferred.
バックワードループプライマー（F）は、配列番号10で示される塩基配列（塩基配列F）を含む。 The backward loop primer (F) includes the base sequence shown by SEQ ID NO: 10 (base sequence F).
バックワードループプライマー（F）は、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な限りにおいて、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、塩基配列F以外の他の配列（塩基配列F1）を含むことができる。塩基配列F1を含む場合は、塩基配列F1は、塩基配列Fの5’末端側及び3’末端側のいずれか一方にのみ付加されていてもよいし、5’末端側及び3’末端側の両方に付加されていてもよい。塩基配列F1の総塩基数は、例えば0～5、好ましくは0～3、より好ましくは0～2、さらに好ましくは0～1、特に好ましくは0（すなわち、バックワードループプライマー（F）が塩基配列Fからなる）である。 The backward loop primer (F) contains a sequence other than base sequence F (base sequence F1) as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably as long as it can hybridize under stringent conditions. be able to. When the base sequence F1 is included, the base sequence F1 may be added only to either the 5' end or the 3' end of the base sequence F, or may be added to either the 5' end or the 3' end of the base sequence F. It may be added to both. The total number of bases in the base sequence F1 is, for example, 0 to 5, preferably 0 to 3, more preferably 0 to 2, even more preferably 0 to 1, and particularly preferably 0 (that is, the backward loop primer (F) is consists of array F).
バックワードループプライマー（F）は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The backward loop primer (F) may be used alone or in combination of two or more.
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーを構成するポリヌクレオチドは、通常DNAであるが、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な限りにおいて、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、公知の化学修飾が施されていてもよい。各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。 The polynucleotides constituting each primer included in the primer set of the present invention are usually DNA, but as long as they can hybridize with the target base sequence, preferably under stringent conditions, they can be made using publicly known polynucleotides. may be chemically modified. The phosphate residue of each nucleotide can be replaced with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, or the like. In addition, the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is replaced by -OR (R is, for example, CH3 (2´-O-Me), CH2CH2OCH3 (2´-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.) may be substituted. Furthermore, the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, such as introducing a methyl group or cationic functional group to the 5-position of the pyrimidine base, or replacing the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl. can be mentioned. Further examples include, but are not limited to, those in which the phosphoric acid moiety or hydroxyl moiety is modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like. In addition, BNA (LNA), etc., in which the conformation of the sugar moiety of the nucleotide is fixed to N-type by cross-linking the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar moiety, can also be preferably used.
本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーにおいては、標的塩基配列とハイブリダイズ可能な限りにおいて、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な限りにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドが標識されていてもよい。ポリヌクレオチドは、公知の方法に従って、例えば標識物質を用いて標識することができる。 In each primer included in the primer set of the present invention, at least one nucleotide may be labeled as long as it can hybridize with the target base sequence, preferably as long as it can hybridize under stringent conditions. . Polynucleotides can be labeled according to known methods, for example using a labeling substance.
標識物質は、核酸の標識物質として公知のものであれば特に限定されない。標識物質としては、例えば蛍光標識が挙げられる。蛍光標識としては、後述の融解温度解析に適しているという観点から、例えば、蛍光標識されたポリヌクレオチドが1本鎖の場合は蛍光を発し、2本鎖の場合は蛍光が減少（例えば消光）するようなものが好ましい。蛍光標識としては、例えばフルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光標識としては、例えばBODIPY FL（商標名、モレキュラー核酸プローブ社製）、FluorePrime（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Fluoredite（商品名、ミリポア社製）、FAM（ABI社製）、Cy3およびCy5（アマシャムファルマシア社製）、TAMRA(モレキュラー核酸プローブ社製)等が挙げられる。 The labeling substance is not particularly limited as long as it is a known labeling substance for nucleic acids. Examples of labeling substances include fluorescent labels. As a fluorescent label, from the viewpoint of being suitable for the melting temperature analysis described below, for example, if the fluorescently labeled polynucleotide is single-stranded, it emits fluorescence, and if it is double-stranded, the fluorescence decreases (e.g., quenching). Preferably something that does. Examples of fluorescent labels include fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives, etc. Commercially available fluorescent labels include, for example, BODIPY FL (trade name, manufactured by Molecular Nucleic Acid Probes), FluorePrime (trade name, manufactured by Amersham Pharmacia). Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (manufactured by ABI), Cy3 and Cy5 (manufactured by Amersham Pharmacia), and TAMRA (manufactured by Molecular Nucleic Acid Probes).
標識部位は、核酸の標識部位として公知のものであれば特に限定されない。標識部位は、例えば3’末端及び／又は5’末端のヌクレオチドであることができる。 The labeling site is not particularly limited as long as it is a known labeling site for nucleic acids. The labeling site can be, for example, a nucleotide at the 3' end and/or the 5' end.
LAMP反応の核酸増幅産物の検出の一態様としては、蛍光標識プローブを用いる方法が挙げられる。例えば、蛍光消光プローブ（Quenching Probe：Qprobe（登録商標））と称される3'末端または5'末端に蛍光標識されたプローブは、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素がその発光を減少させることで、増幅産物を検出又は定量することができる（特開2001-286300号公報）。また末端部分において、ハイブリダイゼーションの塩基対がG（グアニン）とC（シトシン）のペアを形成するように設計されることを特徴としている。ここで使用される蛍光標識としては、例えば、BODIPY-FL、カルボキシローダミン6G（CR6G）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、Pacific Blue、フルオレセイン-4-イソチオシアネート（FITC）等が挙げられる。 One embodiment of detecting the nucleic acid amplification product of the LAMP reaction includes a method using a fluorescently labeled probe. For example, a probe with a fluorescent label at the 3' or 5' end, called a fluorescence quenching probe (Qprobe®), has a fluorescent dye that reduces its luminescence when hybridized to a target nucleic acid. This allows the amplification product to be detected or quantified (Japanese Patent Application Laid-open No. 2001-286300). It is also characterized in that the base pairs for hybridization are designed to form a G (guanine) and C (cytosine) pair at the terminal end. Examples of fluorescent labels used here include BODIPY-FL, carboxyrhodamine 6G (CR6G), carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), Pacific Blue, and fluorescein-4-isothiocyanate (FITC).
本発明のプライマーセットの形態は特に制限されない。本発明のプライマーセットは、例えば、各プライマーが1つの容器に収容されてなる形態（例えば組成物）の形態、各プライマーが複数の容器に分かれて収容されてなる形態（例えばキット）の形態、又は担体に担持されてなる形態である。容器の種類としては、化合物ライブラリに使用されるものであれば特に制限されず、例えばマルチウェルプレート、マイクロチューブ等が挙げられる。担体としては、プライマーを保持できるものであれば特に制限されず、例えばセルロース繊維等の繊維質の担体（例えば紙、ろ紙）等が挙げられる。また、各プライマーは、乾燥状態であっても、（溶液中に）溶解状態であってもよい。また、本発明のプライマーセットには、緩衝剤などの他の成分が含まれていてもよい。 The form of the primer set of the present invention is not particularly limited. The primer set of the present invention includes, for example, a form in which each primer is housed in one container (for example, a composition), a form in which each primer is housed in a plurality of containers (for example, a kit), Or it is in the form of being supported on a carrier. The type of container is not particularly limited as long as it is used for compound libraries, and examples thereof include multiwell plates, microtubes, and the like. The carrier is not particularly limited as long as it can hold the primer, and examples include fibrous carriers such as cellulose fibers (eg, paper, filter paper), and the like. Further, each primer may be in a dry state or in a dissolved state (in a solution). Further, the primer set of the present invention may contain other components such as a buffer.
本発明のプライマーセットは、公知の核酸合成方法に従って又は準じて、製造することができる。 The primer set of the present invention can be produced according to or in accordance with known nucleic acid synthesis methods.
2．LAMP法反応用組成物
本発明は、その一態様において、本発明のプライマーセットを含有する、LAMP法反応用組成物（本明細書において、「本発明のLAMP法反応用組成物」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
2. Composition for LAMP method reaction In one aspect, the present invention provides a composition for LAMP method reaction (herein referred to as "composition for LAMP method reaction of the present invention") containing the primer set of the present invention. ). This will be explained below.
本発明のLAMP法反応用組成物は、本発明のプライマーセットを含有し、且つLAMP法反応液に含まれ得るに成分を少なくとも1種含むものである限り、特に制限されない。 The composition for LAMP method reaction of the present invention is not particularly limited as long as it contains the primer set of the present invention and at least one component that can be included in the LAMP method reaction solution.
LAMP法反応液に含まれ得るに成分としては、例えば核酸合成酵素、逆転写酵素、dNTPs、RNaseインヒビター、核酸検出試薬（指示薬）、安定化剤、緩衝剤、イオン又は溶液中で該イオンを遊離する化合物、界面活性剤、被検サンプル、溶媒（水等）等が挙げられる。 Components that may be included in the LAMP method reaction solution include, for example, nucleic acid synthase, reverse transcriptase, dNTPs, RNase inhibitors, nucleic acid detection reagents (indicators), stabilizers, buffers, ions, or ions that release the ions in the solution. compounds, surfactants, test samples, solvents (water, etc.), and the like.
核酸合成酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Csa DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。 The nucleic acid synthase is not particularly limited as long as it is a template-dependent nucleic acid synthase that has strand displacement activity. Examples of such enzymes include Bst DNA polymerase (large fragment), Bca (exo-) DNA polymerase, Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I, Csa DNA polymerase, etc., and preferably Bst DNA polymerase (large fragment). can be mentioned.
逆転写酵素としては、RNAを鋳型としてDNAを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばAMV、Cloned AMV、MMLV、Recombinant HIVの逆転写酵素、SuperscriptII/III/IV、ReverTraAce、Thermoscript、Ominiscript、Sensiscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はCloned AMV逆転写酵素が挙げられる。またBca DNAポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、RT-LAMP反応を1つの酵素で行うことができる。 The reverse transcriptase is not particularly limited as long as it is an enzyme that has the activity of synthesizing DNA using RNA as a template. Examples of such enzymes include AMV, Cloned AMV, MMLV, Recombinant HIV reverse transcriptase, SuperscriptII/III/IV, ReverTraAce, Thermoscript, Ominiscript, Sensiscript, etc., and preferably AMV or Cloned AMV reverse transcriptase. can be mentioned. Furthermore, by using an enzyme that has both reverse transcriptase and DNA polymerase activities, such as Bca DNA polymerase, the RT-LAMP reaction can be performed with one enzyme.
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでもよい。 Enzymes and reverse transcriptases used in nucleic acid synthesis may be purified from viruses, bacteria, etc., or may be produced by genetic recombination technology. These enzymes may also be modified by fragmentation, amino acid substitution, etc.
核酸検出試薬としては、LAMP反応後の核酸増幅産物の検出に使用できるものである限り特に制限されず、公知の試薬を採用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター（特開2001-242169号公報）を用いたり、また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなる。このため、マグネシウム指示薬（マグネシウム濃度により発色が変化する指示薬）を、核酸検出試薬として使用することができる。 The nucleic acid detection reagent is not particularly limited as long as it can be used to detect nucleic acid amplification products after LAMP reaction, and any known reagent can be used. For example, labeled oligonucleotides or fluorescent intercalators that specifically recognize the amplified base sequence are used, and in the LAMP method, a large amount of substrate is consumed during nucleic acid synthesis. Pyrophosphate, a by-product, reacts with coexisting magnesium to form magnesium pyrophosphate. Therefore, a magnesium indicator (an indicator whose color changes depending on the magnesium concentration) can be used as a nucleic acid detection reagent.
安定化剤は、酵素や核酸等の安定化に寄与するものである限り、特に制限されない。本発明では、トレハロースを使用することにより、乾燥状態の本発明のLAMP法反応用組成物を使用してLAMP法による核酸増幅を行う、乾燥RT-LAMPシステムが可能であることを見出した。この観点から、安定化剤として、トレハロースを使用することが特に好ましい。また、本発明の好ましい一態様において、本発明のLAMP法反応用組成物は、本発明のプライマーセット、及びトレハロースを含有する、乾燥形態のLAMP法反応用組成物、である。 The stabilizer is not particularly limited as long as it contributes to stabilizing enzymes, nucleic acids, and the like. In the present invention, we have found that by using trehalose, it is possible to create a dry RT-LAMP system in which nucleic acid amplification is performed by the LAMP method using the dry LAMP method reaction composition of the present invention. From this point of view, it is particularly preferred to use trehalose as a stabilizer. In a preferred embodiment of the present invention, the composition for LAMP reaction of the present invention is a dry composition for LAMP reaction containing the primer set of the present invention and trehalose.
緩衝剤は、特に制限されず、例えばTris緩衝剤等を使用することができる。 The buffer is not particularly limited, and for example, Tris buffer or the like can be used.
イオンとしては、プライマーのアニーリングの安定性の調整に使用し得るイオンや、核酸合成酵素等の酵素の補因子として機能するイオン等が使用される。前者のイオンとしては、例えばカリウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。後者のイオンと しては、例えばマグネシウムイオン等が挙げられる。 Examples of ions used include ions that can be used to adjust the stability of primer annealing, and ions that function as cofactors for enzymes such as nucleic acid synthase. Examples of the former ions include potassium ions and magnesium ions. Examples of the latter ions include magnesium ions.
被検サンプルとしては、チクングニアウイルス感染が疑われるヒト又は他の動物の生体由来のサンプル、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液および羊水等の体液、糞便、組織等が挙げられる。また、感染実験等に用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞等から分離したウイルスを含む検体等も被検サンプルとなりうる。これらの被検サンプルは分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を経て得られたものであってもよい。 Test samples include biological samples from humans or other animals suspected of being infected with chikungunya virus, such as sputum, bronchoalveolar lavage fluid, nasal discharge, nasal aspirate fluid, nasal cavity wash fluid, nasal swab fluid, throat swab fluid, and gargle fluid. Examples include body fluids such as saliva, blood, serum, plasma, spinal fluid, urine, semen and amniotic fluid, feces, and tissues. In addition, test samples may include cells used in infection experiments, culture fluids thereof, specimens containing viruses isolated from biological specimens, cultured cells, and the like. These test samples may be obtained through pretreatment such as separation, extraction, concentration, and purification.
上記成分は、終濃度（LAMP法の反応を開始する際のLAMP法反応液における濃度）が、LAMP法の反応が適切に行われる濃度となるように、本発明のLAMP法反応用組成物に添加される。特に、トレハロースの終濃度は、感度、特異性等の観点から、好ましくは0.1～0.3M、より好ましくは0.15～0.25M、特に好ましくは0.18～0.22Mである。また、マグネシウムイオンの終濃度は、感度、特異性等の観点から、好ましくは3～12mM、より好ましくは5～9mM、さらに好ましくは6～8mM、特に好ましくは6.5～7.5mMである。 The above components are added to the composition for LAMP reaction of the present invention so that the final concentration (concentration in the LAMP reaction solution at the time of starting the LAMP reaction) is a concentration at which the LAMP reaction is appropriately carried out. added. In particular, the final concentration of trehalose is preferably 0.1 to 0.3M, more preferably 0.15 to 0.25M, particularly preferably 0.18 to 0.22M from the viewpoint of sensitivity, specificity, etc. Further, the final concentration of magnesium ions is preferably 3 to 12 mM, more preferably 5 to 9 mM, even more preferably 6 to 8 mM, particularly preferably 6.5 to 7.5 mM, from the viewpoint of sensitivity, specificity, etc.
フォワードインナープライマー（A）及びバックワードインナープライマー（B）のそれぞれの終濃度は、好ましくは0.8～3.2μM、より好ましくは1.2～2.0μM、さらに好ましくは1.4～1.8μMである。 The final concentration of each of the forward inner primer (A) and backward inner primer (B) is preferably 0.8 to 3.2 μM, more preferably 1.2 to 2.0 μM, and still more preferably 1.4 to 1.8 μM.
フォワードアウタープライマー（C）及びバックワードアウタープライマー（D）のそれぞれの終濃度は、好ましくは0.1～0.4μM、より好ましくは0.15～0.3μM、さらに好ましくは0.18～0.25μMである。 The final concentration of each of the forward outer primer (C) and the backward outer primer (D) is preferably 0.1 to 0.4 μM, more preferably 0.15 to 0.3 μM, and even more preferably 0.18 to 0.25 μM.
ループプライマーを含む場合、フォワードループプライマー及びバックワードループプライマーのそれぞれの終濃度は、好ましくは0.2～0.8μM、より好ましくは0.3～0.6μM、さらに好ましくは0.35～0.5μMである。 When a loop primer is included, the final concentration of each of the forward loop primer and the backward loop primer is preferably 0.2 to 0.8 μM, more preferably 0.3 to 0.6 μM, and still more preferably 0.35 to 0.5 μM.
本発明のLAMP法反応用組成物は、乾燥状態であってもよいし、溶液状態であってもよい。保存安定性に優れるという観点から、乾燥状態が好ましい。乾燥状態の場合、好ましくは、常温で保存可能である。 The composition for LAMP reaction of the present invention may be in a dry state or in a solution state. A dry state is preferable from the viewpoint of excellent storage stability. If it is in a dry state, it can preferably be stored at room temperature.
本発明の一態様において、本発明のLAMP法反応用組成物は、互いに混合されない状態で存在する、2つの乾燥物（乾燥物1及び乾燥物2）を含むことが好ましい。乾燥物1は、好ましくは核酸合成酵素、逆転写酵素、dNTPs、及びトレハロースを含有する。乾燥物2は、好ましくは本発明のプライマーセット、及びトレハロースを含有する。トレハロースは、終濃度が上記した範囲になるように、乾燥物1と乾燥物2に、分けて添加される。乾燥物1と乾燥物2とにおけるトレハロースの含有比は、それぞれに含まれる成分の量、種類等に応じて適宜調節することができる。本発明の好ましい一態様においては、乾燥物2中のトレハロース含有量に対する乾燥物1中のトレハロース含有量（乾燥物1中のトレハロース含有量／乾燥物2中のトレハロース含有量）は、好ましくは1～3.5、より好ましくは1.3～2.5、さらに好ましくは1.5～2である。乾燥物1及び乾燥物2は、例えば容器の別々の場所（例えば一方はチューブの蓋の裏側、他方はチューブの底）に付着させておくことができる。 In one embodiment of the present invention, the composition for LAMP reaction of the present invention preferably contains two dry products (Dry Product 1 and Dry Product 2) that are present in an unmixed state. Dry product 1 preferably contains nucleic acid synthase, reverse transcriptase, dNTPs, and trehalose. Dry product 2 preferably contains the primer set of the present invention and trehalose. Trehalose is added separately to dry product 1 and dry product 2 so that the final concentration is within the above range. The content ratio of trehalose in dried product 1 and dried product 2 can be adjusted as appropriate depending on the amount, type, etc. of the components contained in each. In a preferred embodiment of the present invention, the trehalose content in dry product 1 relative to the trehalose content in dry product 2 (trehalose content in dry product 1/trehalose content in dry product 2) is preferably 1 -3.5, more preferably 1.3-2.5, even more preferably 1.5-2. The dried material 1 and the dried material 2 can be attached, for example, to different locations in the container (for example, one on the back side of the lid of the tube and the other on the bottom of the tube).
本発明のLAMP法反応用組成物は、そのまま、或いは必要に応じて他の成分を添加して、LAMP法反応液として使用される。 The composition for LAMP reaction of the present invention is used as a LAMP reaction solution as it is, or with other components added as necessary.
3．チクングニア熱の検査キット
本発明は、その一態様において、本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物を含む、チクングニア熱の検査キット（本明細書において、「本発明の検査キット」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
3. Test kit for chikungunya fever In one aspect, the present invention provides a test kit for chikungunya fever (herein referred to as "test kit of the present invention"), which includes the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention. ). This will be explained below.
本発明の検査キットは、本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物に加えて、必要に応じて、LAMP法反応液に含まれ得る成分、LAMP法の実行に使用され得る器具等を含むことができる。 The test kit of the present invention includes, in addition to the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention, components that may be included in the LAMP method reaction solution, instruments that may be used for carrying out the LAMP method, etc., as necessary. can include.
LAMP法反応液に含まれ得る成分については、上記「2．LAMP法反応用組成物」における説明の通りである。 The components that can be contained in the LAMP reaction solution are as explained in "2. Composition for LAMP reaction" above.
LAMP法の実行に使用され得る器具としては、例えば被検サンプルの採取器具、反応容器等が挙げられる。 Examples of instruments that can be used to carry out the LAMP method include test sample collection instruments, reaction vessels, and the like.
本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物に、必要に応じて他の成分を添加して、LAMP法反応液として使用し、チクングニア熱を検査することができる。 If necessary, other components may be added to the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention, and the mixture may be used as a LAMP method reaction solution to test for chikungunya fever.
4．チクングニア熱の検査方法
本発明は、その一態様において、本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物を用いて、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅の有無をLAMP法により検出することを含む、チクングニア熱の検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
Four. Method for testing chikungunya fever In one aspect, the present invention provides a method for detecting the presence or absence of amplification of a target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method using the primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention. The present invention relates to a method for testing chikungunya fever (herein sometimes referred to as the "testing method of the present invention"), including: This will be explained below.
本発明のプライマーセット、又は本発明の反応用組成物に、必要に応じて他の成分を添加して、LAMP法反応液として使用する。 The primer set of the present invention or the reaction composition of the present invention is used as a LAMP method reaction solution by adding other components as necessary.
LAMP法反応温度は、感度、特異性等の観点から、好ましくは57～61℃、より好ましくは58～60℃、特に好ましくは58.5～59.5℃である。 The reaction temperature of the LAMP method is preferably 57 to 61°C, more preferably 58 to 60°C, particularly preferably 58.5 to 59.5°C, from the viewpoint of sensitivity, specificity, etc.
LAMP法反応時間は、チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅が起こる限りにおいて特に制限されず、例えば1～180分間、好ましくは5～120分間、より好ましくは10～90分間、さらに好ましくは15～70分間である。 The LAMP method reaction time is not particularly limited as long as the target nucleic acid region of the chikungunya virus is amplified, for example, 1 to 180 minutes, preferably 5 to 120 minutes, more preferably 10 to 90 minutes, and even more preferably 15 to 70 minutes. It is a minute.
LAMP法反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。反応液に核酸検出試薬が含まれている場合は、そのシグナルを検出することにより、増幅産物を検出することができる。また、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけたりしても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。従って、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である。 Known techniques can be applied to detect the nucleic acid amplification product after the LAMP reaction. If the reaction solution contains a nucleic acid detection reagent, the amplification product can be detected by detecting its signal. Furthermore, it can be easily detected by directly subjecting the reaction solution after the completion of the reaction to agarose gel electrophoresis. In agarose gel electrophoresis, the LAMP amplification product is detected as a ladder of many bands with different base lengths. Furthermore, in the LAMP method, a large amount of substrate is consumed during nucleic acid synthesis, and the byproduct pyrophosphate reacts with coexisting magnesium to form magnesium pyrophosphate, making the reaction solution cloudy enough to be seen with the naked eye. Therefore, this white turbidity can be detected by using a measurement device that can optically observe the increase in turbidity over time after the completion of the reaction or during the reaction, such as by checking the change in absorbance at 400 nm using a normal spectrophotometer. It is also possible to detect.
チクングニアウイルスの標的核酸領域の増幅が認められた場合は、LAMP法に使用した被検サンプルの由来する被検体が、チクングニアウイルスに感染している、チクングニア熱に罹患している、チクングニア熱を発症している、又はチクングニア熱を発症する可能性があると判定することができる。 If amplification of the target nucleic acid region of chikungunya virus is observed, it is possible that the subject from whom the test sample used for the LAMP method was derived is infected with chikungunya virus, has chikungunya fever, or has developed chikungunya fever. It can be determined that the person is suffering from the disease or is likely to develop chikungunya fever.
本発明の検査方法の好ましい一態様よれば、RNAの抽出ステップがなく、等温で反応が進むことに加え、結果をサンプルの色の変化で判定できる、電気泳動不要の検査方法を提供することができる。この態様の一部においては、トータルで必要な時間は50分、乾燥RT-LAMP法であっても65分程度であり、また、高価な機器や試薬、熟練した技術、さらに乾燥RT-LAMP法の場合には冷蔵設備も不要である。 According to a preferred embodiment of the testing method of the present invention, it is possible to provide a testing method that does not require electrophoresis, which does not require an RNA extraction step, allows the reaction to proceed isothermally, and allows the result to be judged by a change in the color of the sample. can. In some of these embodiments, the total time required is about 50 minutes, and even dry RT-LAMP is about 65 minutes, and the dry RT-LAMP method requires expensive equipment, reagents, and skilled techniques. In this case, refrigeration equipment is not required.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below based on Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
実験方法
特に断りの無い限り、各試験例は以下の方法に従って行った。
Experimental Method Unless otherwise specified, each test example was conducted according to the following method.
RT-LAPM システムに用いるプライマーは、チクングニアウイルスのS27-African prototype系統（GenBank accession number AF369024）の遺伝子配列データを用いてenvelope protein 1 (E1) 領域内に設計した。6種類のプライマーの内訳は、２種類のinner primer (FIPおよびBIP)、2種類のouter primer (F3およびB3) および２種類のloop primer (FLPおよびBLP)である。また、FIPとBIPにはTTTT spacerを設けた。プライマー配列の詳細は表１に記載する。 Primers used in the RT-LAPM system were designed within the envelope protein 1 (E1) region using gene sequence data of the S27-African prototype strain of chikungunya virus (GenBank accession number AF369024). The six types of primers include two types of inner primers (FIP and BIP), two types of outer primers (F3 and B3), and two types of loop primers (FLP and BLP). Additionally, TTTT spacer was provided for FIP and BIP. Details of the primer sequences are listed in Table 1.
RT-LAMPの反応は、 1チューブにつき総量25μLにて59℃で60分間行った。反応液中の2μLがウイルスサンプルである。試薬の組成は、1μLの25X LAMP buffer (500 mM Tris-HCl [pH 8.8], 250 mM KCl, 25 mM MgSO4)、1.5μLの100mM MgSO4、1.4μLの25mM dNTPs、1μLのBst DNA Polymerase (8 U/μL) 、0.1μLのRNase inhibitor (40 U/μL)、0.03μLのAMV reverse transcriptase (20 U/μL) 、2.5μLの2 Mトレハロース、1μLの40μM FIPとBIP、1μLの5μM F3とB3、1μLの10μM FLPとBLP、1μの指示薬 (3mM hydroxynaphthol blue [HNB; MP Biomedicals], 0.35% v/v GelGreen [10,000X in DMSO])、最後に0.1% TritonX-100を含有するDDWで25μLにした。表２に、添加した試薬の濃度、添加量、及び終濃度をまとめたものを示す。 The RT-LAMP reaction was performed at 59°C for 60 minutes in a total volume of 25 μL per tube. 2 μL of the reaction solution is the virus sample. The composition of the reagent was 1μL of 25X LAMP buffer (500mM Tris-HCl [pH 8.8], 250mM KCl, 25mM MgSO4 ), 1.5μL of 100mM MgSO4 , 1.4μL of 25mM dNTPs, 1μL of Bst DNA Polymerase ( 8 U/μL), 0.1μL RNase inhibitor (40 U/μL), 0.03μL AMV reverse transcriptase (20 U/μL), 2.5μL 2 M trehalose, 1μL 40μM FIP and BIP, 1μL 5μM F3 and B3, 1 μL of 10 μM FLP and BLP, 1 μ of indicator (3mM hydroxynaphthol blue [HNB; MP Biomedicals], 0.35% v/v GelGreen [10,000X in DMSO]), and finally 25 μL in DDW containing 0.1% TritonX-100. I made it. Table 2 shows a summary of the concentrations, amounts, and final concentrations of the added reagents.
反応液にはGelGreenとHNBの指示薬が含まれており、2通りの方法でDNAの増幅が起こったことを確認できる。GelGreenは、PCR産物である2本鎖DNAが増幅されると、2本鎖DNA分子の空隙に侵入し可逆反応を起こし（インターカレーション）、波長470 nmの青色光を当てると波長500 nmの黄色の蛍光を発する。RT-LAMPの反応チューブは、青色LEDライトで照射し、オレンジ色フィルターを介して撮影した。一方、HNBは、マグネシウム測定の指示薬であり、PCR反応が進行してチューブ内のマグネシウム濃度が低下すると、紫色から水色に変色する。RT-LAMPの反応チューブは、可視光下で撮影した。 The reaction solution contains GelGreen and HNB indicators, and it is possible to confirm that DNA amplification has occurred in two ways. When double-stranded DNA, which is a PCR product, is amplified, GelGreen invades the void in the double-stranded DNA molecule and causes a reversible reaction (intercalation). Emits yellow fluorescence. The RT-LAMP reaction tube was illuminated with a blue LED light and photographed through an orange filter. On the other hand, HNB is an indicator for measuring magnesium, and as the PCR reaction progresses and the magnesium concentration in the tube decreases, the color changes from purple to light blue. RT-LAMP reaction tubes were photographed under visible light.
乾燥RT-LAMPの反応チューブは、試薬をキャップ、底部の2箇所に分けて乾燥化させた。乾燥RT-LAMPシステムの詳細：1.6μLの2Mトレハロース、1.4μLの25 mM dNTPs、0.05μLの120 U/μL Bst DNA Polymerase、0.25μLの8 U/μL Bst DNA Polymerase、0.1μLの40 U/μL RNase inhibitor、0.04μLの20 U/μL AMV reverse transcriptase、0.5μLのindicatorを混ぜてチューブキャップの中心に付着させた。さらに、0.4μLの100μM FIPとBIP、0.05μLの100μM F3とB3、0.2μLの100μM FLPとBLP、0.9μLの2 Mトレハロース、0.14μLの50% glycerol、0.5μLのindicatorを混ぜてチューブキャップの底に付着させた。その後、これを乾燥化させた。各プライマーの最終濃度は1.6μM (FIP and BIP)、0.2μM (F3 and B3)、 0.4μM (FLP and BLP)である。試薬の乾燥化はclean airを用いて6時間行った。その後、チューブをさらに一晩phosphorus oxide (P2O5)とsilica gelを備えたデシケーターに入れ、真空状態で乾燥させた。ここへ、2 μLのテンプレート（ウイルスサンプル）、1 μLの25X LAMP buffer、1.5 μLの100 mM MgSO4、19.5μL の0.1% TritonX-100 in DDWを加えて、転倒混和し、反応を開始した。 The dry RT-LAMP reaction tube was dried by dividing the reagent into two parts: the cap and the bottom. Dry RT-LAMP system details: 1.6 μL 2M Trehalose, 1.4 μL 25 mM dNTPs, 0.05 μL 120 U/μL Bst DNA Polymerase, 0.25 μL 8 U/μL Bst DNA Polymerase, 0.1 μL 40 U/μL RNase inhibitor, 0.04 μL of 20 U/μL AMV reverse transcriptase, and 0.5 μL of indicator were mixed and attached to the center of the tube cap. Furthermore, mix 0.4 μL of 100 μM FIP and BIP, 0.05 μL of 100 μM F3 and B3, 0.2 μL of 100 μM FLP and BLP, 0.9 μL of 2 M trehalose, 0.14 μL of 50% glycerol, and 0.5 μL of indicator and cap the tube. Attached to the bottom. This was then dried. The final concentration of each primer is 1.6 μM (FIP and BIP), 0.2 μM (F3 and B3), 0.4 μM (FLP and BLP). The reagents were dried using clean air for 6 hours. The tube was then placed in a dessicator with phosphorus oxide (P 2 O 5 ) and silica gel for another night and dried under vacuum. To this, 2 μL of template (virus sample), 1 μL of 25X LAMP buffer, 1.5 μL of 100 mM MgSO 4 , and 19.5 μL of 0.1% TritonX-100 in DDW were added and mixed by inversion to start the reaction.
Templateとして用いたサンプルは4 種のチクングニアウイルス株(SL11131, SL10571, BaH306, and S27), ジカウイルス, デングウイルスセロタイプ 4, 日本脳炎ウイルス, ロスリバーウイルスである。 The samples used as templates were four chikungunya virus strains (SL11131, SL10571, BaH306, and S27), Zika virus, dengue virus serotype 4, Japanese encephalitis virus, and Ross River virus.
RT-LAMPのリアルタイムモニタリングはreal-time PCR engine (LightCyclerTM96; Roche Diagnostics, Mannhein, Germany)を用いて実施した。反応温度は59℃で、 1分ごとに90分にわたってGelGreenによる蛍光を測定した。 Real-time monitoring of RT-LAMP was performed using a real-time PCR engine (LightCycler ™ 96; Roche Diagnostics, Mannhein, Germany). The reaction temperature was 59°C, and GelGreen fluorescence was measured every minute for 90 minutes.
10μL のウイルスストック、マウス血清より、a QuickGene RNA Tissue Kit SIIを用いて終量100μLのelution bufferでRNAを抽出した。5.6μLの抽出RNA をサンプルとし、a SuperScript III One-Step RT-PCR System、Platinum Taq、CHIKV E1 specific primers (表１)、を用いてRT-PCRを実施した。反応条件は、50℃ 30 分、94℃ 2 分、[94℃ 30 秒、53℃ 30 秒、68℃ 1 分]を35 サイクル、68℃ 2 分でDNA増幅を行った。増幅産物は1% agarose gel を用いて電気泳動し、UV下で300 bpのバンドを観察した。 RNA was extracted from 10 μL of virus stock and mouse serum using a QuickGene RNA Tissue Kit SII with a final volume of 100 μL of elution buffer. Using 5.6 μL of extracted RNA as a sample, RT-PCR was performed using a SuperScript III One-Step RT-PCR System, Platinum Taq, and CHIKV E1 specific primers (Table 1). The reaction conditions were 50°C for 30 minutes, 94°C for 2 minutes, 35 cycles of [94°C for 30 seconds, 53°C for 30 seconds, 68°C for 1 minute], and DNA amplification at 68°C for 2 minutes. The amplified product was electrophoresed using 1% agarose gel, and a 300 bp band was observed under UV.
試験例1
はじめにRT-LAMPの感度を調べた。それぞれのチューブには段階的に希釈したウイルスサンプルが含まれている。具体的には、1チューブに1000, 200, 40, 8 PFU（プラーク形成単位：ウイルス粒子の数を表す）のウイルスサンプルと陰性対照として滅菌蒸留水を用いた。RT-LAMPを開始し、10, 20, 30, 60分後にサンプルの色を確認した（図１A）。図１Aの左はGelGreen、右はHNBによる判定結果を示す。RT-LAMPを開始し、20分後には40 PFUが陽性に、30分後には8 PFUが陽性になった。その後、60分まで反応時間を延ばしても陰性対照（Negative control）に偽陽性反応は確認されなかった。GelGreenとHNBによる判定は完全に一致していた。Supplementaly dataのSet13およびSet16はPrimerExplorer V5 softwareを用いて設計したその他のプライマーセットである。Set13は感度が低く、60分で偽陽性反応が確認された。Set16は20分ですでに偽陽性反応が確認された。図１Bは、図１Aと同様のRT-LAMP反応をリアルタイムPCRで解析した結果である。4サンプル共に反応開始10分程度でGelGreenの蛍光上昇が認められ、反応開始30分後には蛍光はプラトーに達した。90分後においても4つのネガティブコントロールいずれも反応は起こっていなかった。また、図１Aの60分後の反応サンプルを1% agarose gel で電気泳動した結果を図１Cに示す。RT-LAMP陽性サンプルでは梯子状のバンドが確認された。さらに、RT-LAMPとRT-PCRの感度の比較をするため、RT-LAMP法と同量のウイルスサンプルからRNAを抽出し RT-PCR を行い1% agarose gel で電気泳動した結果が図１Dである。RT-PCRでは、1000, 200 PFU で強いバンドが確認された。しかし、40 , 8 PFUでは非常に薄いバンドしか検出されなかった。
Test example 1
First, we investigated the sensitivity of RT-LAMP. Each tube contains a serially diluted virus sample. Specifically, virus samples of 1000, 200, 40, and 8 PFU (plaque forming units: representing the number of virus particles) were used in one tube, and sterile distilled water was used as a negative control. RT-LAMP was started and the color of the sample was confirmed 10, 20, 30, and 60 minutes later (Figure 1A). The left side of FIG. 1A shows the determination results by GelGreen, and the right side shows the determination results by HNB. After starting RT-LAMP, 40 PFU became positive after 20 minutes, and 8 PFU became positive after 30 minutes. Thereafter, even when the reaction time was extended to 60 minutes, no false positive reaction was observed in the negative control. The judgments made by GelGreen and HNB were in complete agreement. Set13 and Set16 in Supplementary data are other primer sets designed using PrimerExplorer V5 software. Set13 had low sensitivity and a false positive reaction was confirmed after 60 minutes. For Set 16, a false positive reaction was already confirmed after 20 minutes. Figure 1B shows the results of real-time PCR analysis of the same RT-LAMP reaction as in Figure 1A. For all four samples, an increase in GelGreen fluorescence was observed about 10 minutes after the start of the reaction, and the fluorescence reached a plateau 30 minutes after the start of the reaction. Even after 90 minutes, no reaction occurred in any of the four negative controls. Furthermore, the results of electrophoresis of the reaction sample shown in FIG. 1A after 60 minutes on a 1% agarose gel are shown in FIG. 1C. Ladder-like bands were confirmed in the RT-LAMP positive sample. Furthermore, in order to compare the sensitivity of RT-LAMP and RT-PCR, RNA was extracted from the same amount of virus sample as in the RT-LAMP method, subjected to RT-PCR, and electrophoresed on a 1% agarose gel. The results are shown in Figure 1D. be. In RT-PCR, strong bands were confirmed at 1000 and 200 PFU. However, only a very faint band was detected at 40,8 PFU.
以上の結果より、本RT-LAMPシステムは感度が高いが、偽陽性反応はおこらないことが分かった。また、本RT-LAMPシステムは、従来法であるRT-PCR法に比べてより感度が高いと言える。 From the above results, it was found that this RT-LAMP system has high sensitivity but does not cause false positive reactions. Furthermore, it can be said that the present RT-LAMP system has higher sensitivity than the conventional RT-PCR method.
試験例2
RT-LAMPの反応の特異性を調べるために、チクングニアウイルスの4種の株（SL11131, SL10571, BaH306, S27）とその他のアルボウイルス（ジカウイルスZIKV、デングウイルス4型DENV4、日本脳炎ウイルスJEV、ロスリバーウイルスRRV）を1チューブ当たり200 PFUを用いて、図1と同様の条件でRT-LAMPを行った。20分の反応で、チクングニアウイルスの4種の株は全て陽性反応を示した（図２A）。一方、20分の反応でも、その他のアルボウイルスおよびNCは偽陽性反応を示さなかった（図２A）。GelGreenとHNBによる判定は完全に一致していた。上記サンプルを60分反応させた後に1% agarose gel で電気泳動したところ、RT-LAMP陽性サンプルでは梯子状のバンドが確認された（図２B）。
Test example 2
To investigate the specificity of the RT-LAMP reaction, we tested four strains of chikungunya virus (SL11131, SL10571, BaH306, S27) and other arboviruses (Zika virus ZIKV, dengue virus type 4 DENV4, Japanese encephalitis virus JEV, and Ross RT-LAMP was performed using 200 PFU per tube of River virus (RRV) under the same conditions as in Figure 1. All four strains of chikungunya virus showed positive reactions after 20 minutes of reaction (Figure 2A). On the other hand, other arboviruses and NC did not show false positive reactions even after 20 minutes of reaction (Fig. 2A). The judgments made by GelGreen and HNB were in complete agreement. When the above samples were reacted for 60 minutes and electrophoresed on a 1% agarose gel, ladder-like bands were observed in the RT-LAMP positive samples (Figure 2B).
以上より、本RT-LAMPシステムはチクングニアウイルス特異的に反応することが分かった。 From the above, it was found that the present RT-LAMP system reacts specifically to chikungunya virus.
試験例3
次に血液中のチクングニアウイルスの検出にRT-LAMP システムが有効か否かを調べた。野生型マウスはチクングニアウイルス感染に対して耐性であり感染が成立しない。そこで、ウイルス感染防御に重要なType1インターフェロンのシグナルが障害されるIFNAR1-ノックアウトマウスが様々なウイルス感染に高感受性を示すことに着目し、このマウスがチクングニアウイルスにも感受性を示し感染約6日後には死亡することを確認した。5匹のIFNAR1-ノックアウトマウスにチクングニアウイルスを104PFU皮下投与し、5匹の非感染IFNAR1-ノックアウトマウスをコントロール群として、感染4日後に血清を回収した。
Test example 3
Next, we investigated whether the RT-LAMP system is effective in detecting chikungunya virus in blood. Wild-type mice are resistant to chikungunya virus infection and are not infected. Therefore, we focused on the fact that IFNAR1-knockout mice, in which Type 1 interferon signals, which are important for defense against viral infections, are impaired, show high susceptibility to various viral infections. confirmed to be dead. Five IFNAR1-knockout mice were subcutaneously administered 10 4 PFU of chikungunya virus, five uninfected IFNAR1-knockout mice were used as a control group, and serum was collected 4 days after infection.
2 μLの血清サンプルを図1と同様の条件で直接RT-LAMP 反応にかけたところ、反応開始後30分で全ての感染マウスサンプルが陽性反応を示した（図３A）。また、60分の反応でも偽陽性反応は観察されなかった。また、2 μLの血清からRNAを抽出し、RT-PCR反応後、1%アガロースゲルで電気泳動を行ったところ、感染マウス5匹中3匹が陽性反応を示した（図３B）。さらに、lysis buffer（0.1% TritonX-100 in RNase free water）で10倍希釈した血液を図1と同様の条件でRT-LAMP 反応にかけたところ、反応が早いものは 20分で陽性反応を示し、90分後には全ての感染マウスサンプルが陽性反応を示した（図３C）。 When 2 μL of serum samples were directly subjected to RT-LAMP reaction under the same conditions as in Figure 1, all infected mouse samples showed a positive reaction 30 minutes after the start of the reaction (Figure 3A). Furthermore, no false positive reactions were observed even after 60 minutes of reaction. In addition, when RNA was extracted from 2 μL of serum and electrophoresed on a 1% agarose gel after RT-PCR reaction, 3 out of 5 infected mice showed a positive reaction (Figure 3B). Furthermore, when blood diluted 10 times with lysis buffer (0.1% TritonX-100 in RNase free water) was subjected to RT-LAMP reaction under the same conditions as in Figure 1, those that reacted quickly showed a positive reaction within 20 minutes. After 90 minutes, all infected mouse samples showed positive reactions (Fig. 3C).
以上より、本RT-LAMPシステムは血清や全血といった生体材料をサンプルに用いた場合でも、高感度でチクングニアウイルスを検出できることが分かった。 From the above, it was found that this RT-LAMP system can detect chikungunya virus with high sensitivity even when biological materials such as serum and whole blood are used as samples.
試験例4
次に乾燥RT-LAMPシステムを作製した。乾燥RT-LAMPシステムを使用する際は、2 μLのサンプル、1 μLの25X LAMP buffer、1.5 μLの100 mM MgSO4、19.5μL の0.1% TritonX-100 in DDWを加えて、転倒混和し、反応を開始した。反応条件は図１と同様である。
Test example 4
Next, we created a dry RT-LAMP system. When using the dry RT-LAMP system, add 2 μL of sample, 1 μL of 25X LAMP buffer, 1.5 μL of 100 mM MgSO 4 , and 19.5 μL of 0.1% TritonX-100 in DDW, mix by inversion, and react. started. The reaction conditions are the same as in FIG.
はじめに、乾燥RT-LAMPシステムの感度を調べた。それぞれのチューブには1000、200、40、8 PFUが含まれている。陰性対象には滅菌蒸留水を用いた。1000 PFUが60分で、200 PFUが80分で陽性反応を示した。陰性対象に偽陽性反応は観察されなかった（図４A）。同様の乾燥RT-LAMP反応でのGelGreenの蛍光をリアルタイムPCRで解析したところ、50分程度で反応が開始した（図４B）。さらに、IFNAR1-ノックアウトマウスに104PFUのチクングニアウイルスを皮下投与し、感染4日後に血清を回収し、乾燥RT-LAMPシステムにかけた。最も反応が早いものは30分で陽性反応を示した。70分後には チクングニア感染個体5匹中4匹が陽性反応を示した。非感染個体のサンプルに偽陽性反応は観察されなかった（図４C）。 First, we investigated the sensitivity of the dry RT-LAMP system. Each tube contains 1000, 200, 40, and 8 PFU. Sterile distilled water was used for negative controls. 1000 PFU showed a positive reaction in 60 minutes and 200 PFU showed a positive reaction in 80 minutes. No false positive reactions were observed in negative controls (Fig. 4A). When GelGreen fluorescence in a similar dry RT-LAMP reaction was analyzed by real-time PCR, the reaction started in about 50 minutes (Figure 4B). Additionally, 10 4 PFU of chikungunya virus was administered subcutaneously to IFNAR1-knockout mice, and serum was collected 4 days after infection and subjected to a dry RT-LAMP system. The fastest-reacting test showed a positive result within 30 minutes. After 70 minutes, four out of five chikungunya-infected animals tested positive. No false positive reactions were observed in samples from uninfected individuals (Fig. 4C).
以上より、乾燥RT-LAMPシステムは生体材料を用いた場合においても偽陽性反応が起きないことが明らかになった。 The above results revealed that the dry RT-LAMP system does not cause false positive reactions even when biomaterials are used.
試験例5
最後にバングラデシュのヒト患者サンプルを用いてRT-LAMPシステムおよび乾燥RT-LAMPシステムの有効性を評価した。患者サンプルは、バングラデシュのInstitute of Epidemiology, Disease Control and Research (IEDCR)でRT-PCR法で陽性反応が確認された血清から抽出したRNAを用いた。
Test example 5
Finally, we evaluated the effectiveness of the RT-LAMP system and the dry RT-LAMP system using human patient samples from Bangladesh. The patient sample used was RNA extracted from serum that had been confirmed to have a positive reaction by RT-PCR at the Institute of Epidemiology, Disease Control and Research (IEDCR) in Bangladesh.
2μLの上記サンプルを用いて図１と同様の反応条件でRT-LAMP反応を行ったところ、20分の反応で、10サンプル中9サンプル (90%) が陽性を示した（図５A）。一方、乾燥RT-LAMP システムは、20分の反応で10サンプル中6サンプル (60%) が陽性を示し、30分では10サンプル中7サンプル (70%)、 40分では10サンプル中8サンプル (80%) 、60 分では10サンプル中9サンプル(90%) が陽性となった。一方、Nagasaki’s primer set（非特許文献１）を用いると60分で全てのサンプルが陽性反応を示したが、陽性対象が陽性にならなかった（図５B）。このように、Nagasaki’s primer set（非特許文献１）を用いた場合は、結果が安定しなかった。 When RT-LAMP reaction was performed using 2 μL of the above sample under the same reaction conditions as in Figure 1, 9 out of 10 samples (90%) showed positive results after 20 minutes of reaction (Figure 5A). On the other hand, the dry RT-LAMP system showed positive results in 6 out of 10 samples (60%) after 20 minutes of reaction, 7 out of 10 samples (70%) at 30 minutes, and 8 out of 10 samples (at 40 minutes). 80%), and 9 out of 10 samples (90%) were positive at 60 minutes. On the other hand, when Nagasaki's primer set (Non-Patent Document 1) was used, all samples showed a positive reaction within 60 minutes, but the positive target did not become positive (FIG. 5B). As described above, when Nagasaki's primer set (Non-Patent Document 1) was used, the results were not stable.
本発明のRT-LAMPシステムおよび乾燥RT-LAMPシステムに用いているプライマーセットは感度、特異性、正確性に優れており、本システムは流行地におけるスクリーニングキットとしての使用が期待される。 The primer sets used in the RT-LAMP system and dry RT-LAMP system of the present invention have excellent sensitivity, specificity, and accuracy, and this system is expected to be used as a screening kit in endemic areas.
Claims (5)
（B）5’側から配列番号4で示される塩基配列、リンカー配列、配列番号5で示される塩基配列が順に配置されてなる塩基配列を含むバックワードインナープライマー、
（C）配列番号7で示される塩基配列を含むフォワードアウタープライマー、及び
（D）配列番号8で示される塩基配列を含むバックワードアウタープライマー
を含む、LAMP法によりチクングニアウイルスの標的核酸領域を増幅するためのプライマーセット。 (A) A forward inner primer comprising a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1, the linker sequence, and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 2 are arranged in this order from the 5'side;
(B) a backward inner primer comprising a nucleotide sequence in which the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 4, the linker sequence, and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 are arranged in this order from the 5'side;
(C) A forward outer primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, and (D) a backward outer primer containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 8. Amplify the target nucleic acid region of chikungunya virus by the LAMP method. Primer set for .
（E）配列番号9で示される塩基配列を含むフォワードループプライマー、及び
（F）配列番号10で示される塩基配列を含むバックワードループプライマー
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。 moreover,
The primer set according to claim 1, comprising (E) a forward loop primer comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, and (F) a backward loop primer comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
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