JP7493751B2 - Methods for evaluating carbohydrate-degrading enzymes and prebiotics - Google Patents
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Description
本発明は、糖質分解酵素及びプレバイオティクスの評価方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating carbohydrate-degrading enzymes and prebiotics.
フルクトース（Ｆｒｕ）及びグルコース（Ｇｌｃ）は反応性が高い還元糖である。Ｆｒｕ及びＧｌｃを、水を加えずに加熱すると、水飴状に溶けるとともに、カラメル化の初期反応として糖同士が脱水縮合して様々な構造の重合物が生ずる。当該重合物は、フラン環構造のフラノース（フルクトフラノース；Ｆｒｕｆ）で構成されたＦｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃ及びα－Ｆｒｕｆ－β－Ｆｒｕｆ－１，２’：２，３’－ジアンハイドライド（ＤＦＡ－ＩＩＩ）等、α－グリコシド結合（α結合）を有するＦｒｕを含む。植物によって生合成されるスクロース及びイヌリン等のＦｒｕｆ重合物はβ結合のみが知られており、このようなα結合を有するＦｒｕを含む重合物は自然界においてまれである。 Fructose (Fru) and glucose (Glc) are highly reactive reducing sugars. When Fru and Glc are heated without adding water, they dissolve like a syrup, and as an initial reaction of caramelization, the sugars undergo dehydration condensation to produce polymers with various structures. These polymers include Fru with α-glycosidic bonds (α bonds), such as Fruf-α2,6-Glc and α-Fruf-β-Fruf-1,2':2,3'-dianhydride (DFA-III), which are composed of furanose with a furan ring structure (fructofuranose; Fruf). Fruf polymers such as sucrose and inulin, which are biosynthesized by plants, are known to have only β bonds, and polymers containing Fru with such α bonds are rare in nature.
例えば、カラメルの製造においては、砂糖（非還元糖であるスクロース）が１００℃以上に加熱されて、ＦｒｕとＧｌｃに分解する。その後、重合反応によりＦｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃ等が生成する。カラメル化は、含水量が少ない条件で糖を煮詰める工程で生ずる非酵素的重合反応である。カラメル化で生じた重合物はヒトの消化酵素で分解されない難消化性オリゴ糖である。カラメル化重合物は、ヒトが摂取すると分解されることなく大腸に到達する。非特許文献１によれば、カラメル化重合物に含まれるＦｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃは特定のビフィズス菌等によって資化されることが知られている。カラメル化重合物をＦｒｕ及びＧｌｃ等の単糖に分解できればビフィズス菌等の腸内細菌はそれを資化できる。 For example, in the production of caramel, sugar (sucrose, a non-reducing sugar) is heated to 100°C or higher and decomposed into Fru and Glc. After that, Fruf-α2,6-Glc and other substances are produced by polymerization. Caramelization is a non-enzymatic polymerization reaction that occurs during the process of boiling sugar under conditions of low water content. The polymers produced by caramelization are indigestible oligosaccharides that cannot be decomposed by human digestive enzymes. When ingested by humans, caramelized polymers reach the large intestine without being decomposed. According to Non-Patent Document 1, it is known that Fruf-α2,6-Glc contained in caramelized polymers is assimilated by certain bifidobacteria and the like. If caramelized polymers can be decomposed into monosaccharides such as Fru and Glc, intestinal bacteria such as bifidobacteria can assimilate them.
ビフィズス菌等においてＦｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃ等のカラメル化重合物を分解するα－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ活性を有する酵素は、これまでにクローニングされておらず、酵素活性も報告されていない。 An enzyme with α-D-fructofuranosidase activity that breaks down caramelized polymers such as Fruf-α2,6-Glc in bifidobacteria has not been cloned to date, and no enzyme activity has been reported.
本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、カラメル化重合物の資化に有用な糖質分解酵素及びプレバイオティクスの評価方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for evaluating carbohydrate-degrading enzymes and prebiotics that are useful for assimilation of caramelized polymers .
発明者は、結核菌の細胞壁に含まれるα－Ｄ－アラビノフラノース（Ｄ－Ａｒａｆ）を分解する酵素を土壌細菌から発見した（特許文献１参照）。発明者はα－Ｄ－Ａｒａｆとα－Ｄ－Ｆｒｕｆとの構造類似性に着目し、タンパク質ファミリーのデータベースであるＰｆａｍ（http://pfam.xfam.org）における当該酵素と同じファミリーにα－Ｄ－Ｆｒｕｆを分解するα－Ｄ－フルクトフラノシダーゼが含まれると考え、鋭意研究を重ね、本発明を完成させた。 The inventor discovered an enzyme from soil bacteria that breaks down α-D-arabinofuranose (D-Araf) contained in the cell wall of Mycobacterium tuberculosis (see Patent Document 1). Noting the structural similarity between α-D-Araf and α-D-Fruf, the inventor believed that α-D-fructofuranosidase that breaks down α-D-Fruf is included in the same family as the enzyme in question in Pfam (http://pfam.xfam.org), a database of protein families, and after extensive research, he completed the present invention.
本発明の第１の観点に係る糖質分解酵素は、
以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、糖質分解活性を有する。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
The carbohydrate-degrading enzyme according to the first aspect of the present invention comprises:
It has any one of the following amino acid sequences (a) to (d) and has carbohydrate decomposition activity .
(a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1; (b) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1; (c) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2; (d) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
この場合、上記本発明の第１の観点に係る糖質分解酵素は、
α－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ活性を有する、
こととしてもよい。
In this case, the carbohydrate-degrading enzyme according to the first aspect of the present invention is
having α-D-fructofuranosidase activity,
This may also be the case.
また、上記本発明の第１の観点に係る糖質分解酵素は、
前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有し、
α－Ｄ－アラビノフラノシダーゼ活性を有する、
こととしてもよい。
Moreover, the carbohydrate-degrading enzyme according to the first aspect of the present invention is
The amino acid sequence of (a) or (b) is
having α-D-arabinofuranosidase activity;
This may also be the case.
また、上記本発明の第１の観点に係る糖質分解酵素は、
前記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有し、
カラメル化重合物を脱水縮合し、アンヒドロ糖を生成する、
こととしてもよい。
Moreover, the carbohydrate-degrading enzyme according to the first aspect of the present invention is
having the amino acid sequence of (a) or (b);
Caramelized polymer is dehydrated and condensed to produce anhydrosugars.
This may also be the case.
本発明の第２の観点に係るプレバイオティクスの評価方法は、
上記本発明の第１の観点に係る糖質分解酵素で試料を処理する処理ステップと、
前記処理ステップで生成した分解物、重合物及び単糖の少なくとも１つを定量する定量ステップと、
を含む。
The method for evaluating prebiotics according to the second aspect of the present invention comprises:
A step of treating a sample with the carbohydrate degrading enzyme according to the first aspect of the present invention;
A quantification step of quantifying at least one of a decomposition product, a polymer product, and a monosaccharide produced in the treatment step;
including.
本発明によれば、カラメル化重合物の資化に有用な糖質分解酵素及びプレバイオティクスの評価方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a method for evaluating carbohydrate-degrading enzymes and prebiotics useful for assimilation of caramelized polymers .
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。 The following describes an embodiment of the present invention with reference to the drawings. Note that the present invention is not limited to the following embodiment and drawings. Note that in the following embodiment, the expressions "have", "include" and "contain" also include the meaning of "consisting of" or "consisting of".
（実施の形態１）
本実施の形態に係る糖質分解酵素は、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。当該糖質分解酵素による糖質分解活性には、少なくともα－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ活性が含まれる。α－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ活性は、図１（Ａ）に矢印で示されたα－Ｄ－Ｆｒｕｆの２位のα結合を切断する活性である。
(Embodiment 1)
The glycoside degrading enzyme according to the present embodiment has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. The glycoside degrading activity of the glycoside degrading enzyme includes at least α-D-fructofuranosidase activity. The α-D-fructofuranosidase activity is the activity of cleaving the α-bond at position 2 of α-D-Fruf, as indicated by the arrow in Figure 1 (A).
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、α－Ｄ－アラビノフラノシダーゼ活性をさらに有する。α－Ｄ－アラビノフラノシダーゼ活性は、図１（Ｂ）に矢印で示されたα－Ｄ－Ａｒａｆの１位のα結合を切断する活性である。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、カラメル化重合物を脱水縮合し、ＤＦＡ－Ｉ及びＤＦＡｘ等のアンヒドロ糖を生成する。 The glycolytic enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 further has α-D-arabinofuranosidase activity. The α-D-arabinofuranosidase activity is the activity of cleaving the α bond at position 1 of α-D-Araf, as indicated by the arrow in Figure 1(B). In addition, the glycolytic enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 dehydrates and condenses the caramelized polymer to produce anhydrosugars such as DFA-I and DFAx.
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素による下記実施例で示された酵素反応を図２に例示する。図２（Ａ）に示すように配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、イヌロビオース（Ｆｒｕｆ－β２，１－Ｆｒｕ）からＤＦＡ－Ｉを生成する。当該反応は平衡反応である。図２（Ｂ）に示すように配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、Ｆｒｕｐ－β２，１－ＦｒｕからＤＦＡｘを生成する。当該反応は平衡反応である。図２（Ｃ）及び図２（Ｄ）に示すように、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、Ｄ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅ及びＤ－Ａｒａｆ－α－ＯＭｅを分解する。 Figure 2 illustrates an enzymatic reaction shown in the following example by a carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. As shown in Figure 2 (A), a carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 produces DFA-I from inulobiose (Fruf-β2,1-Fru). This reaction is an equilibrium reaction. As shown in Figure 2 (B), a carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 produces DFAx from Frup-β2,1-Fru. This reaction is an equilibrium reaction. As shown in Figures 2 (C) and 2 (D), a carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 degrades D-Fruf-α-OMe and D-Araf-α-OMe.
下記実施例で示された、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素による酵素反応を図３に例示する。図３（Ａ）に示すように、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、Ｆｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃを分解する。また、図３（Ｂ）に示すように、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、Ｄ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅを分解する。 Figure 3 illustrates an enzymatic reaction by a carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, as shown in the following example. As shown in Figure 3 (A), the carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 degrades Fruf-α2,6-Glc. As shown in Figure 3 (B), the carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 degrades D-Fruf-α-OMe.
本実施の形態に係る糖質分解酵素のアミノ酸配列は、糖質分解活性等の上述の酵素活性が失われない限り、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。１又は数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によって異なる。置換等で変異したアミノ酸の個数は、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個である。 The amino acid sequence of the carbohydrate-degrading enzyme according to this embodiment may be an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, so long as the above-mentioned enzymatic activity, such as carbohydrate degrading activity, is not lost. The term "one or several" varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. The number of amino acids mutated by substitution or the like is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, even more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5.
置換の場合、好ましくは、酸性アミノ酸は、上述の酵素活性を失わない範囲で任意の別の酸性のアミノ酸に置換される。同様に、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸及びオキシアミノ酸がそれぞれ別の塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸及びオキシアミノ酸に置換されるのが好ましい。なお、特に言及しない限りアミノ酸はＬ体である。 In the case of substitution, preferably, the acidic amino acid is replaced with any other acidic amino acid as long as the above-mentioned enzyme activity is not lost. Similarly, it is preferable that the basic amino acid, aromatic amino acid, aliphatic amino acid, and oxyamino acid are replaced with another basic amino acid, aromatic amino acid, aliphatic amino acid, and oxyamino acid, respectively. Note that, unless otherwise specified, the amino acids are in the L-form.
本実施の形態に係る糖質分解酵素は、上述の酵素活性が失われない限り、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。一般に、２つのタンパク質間で、アミノ酸配列の配列同一性が８０％以上であれば、立体構造が極めて類似し、機能が維持される。アミノ酸配列の配列同一性が高ければ、立体構造の類似性も高くなるため、配列同一性は、上述の酵素活性が失われない限り、８５％以上または９０％以上であるのが好ましく、９５％以上であればさらに好ましい。 The carbohydrate decomposition enzyme according to this embodiment may be a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, so long as the above-mentioned enzymatic activity is not lost. In general, if the sequence identity of the amino acid sequences between two proteins is 80% or more, the three-dimensional structures will be very similar and the function will be maintained. If the sequence identity of the amino acid sequences is high, the similarity of the three-dimensional structures will also be high, so the sequence identity is preferably 85% or more or 90% or more, and more preferably 95% or more, so long as the above-mentioned enzymatic activity is not lost.
本実施の形態に係る糖質分解酵素は、公知の方法で合成することができる。例えば、当該糖質分解酵素は、化学的なポリペプチド合成法で合成されてもよいし、大腸菌等を用いた遺伝子工学的な方法で合成されてもよい。ポリペプチド合成法としては、液相法又は固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、得られた生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、結合させたアミノ酸に縮合反応を順次行い、ペプチドを伸長する方法である。上記の糖質分解酵素は、タンパク質を構成する部分ペプチド又はアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより合成することもできる。 The carbohydrate decomposition enzyme according to the present embodiment can be synthesized by a known method. For example, the carbohydrate decomposition enzyme may be synthesized by a chemical polypeptide synthesis method or a genetic engineering method using Escherichia coli or the like. Examples of the polypeptide synthesis method include a liquid phase method and a solid phase method. The liquid phase method is a method in which a reaction is carried out in a solution state, a product is isolated and purified from the reaction mixture, and the obtained product is used as an intermediate in the subsequent peptide elongation reaction. On the other hand, the solid phase method is a method in which amino acids are bound to a solid phase support that is insoluble in the reaction solvent, and the bound amino acids are sequentially subjected to a condensation reaction to elongate the peptide. The above carbohydrate decomposition enzyme can also be synthesized by condensing a partial peptide or amino acid that constitutes a protein with the remaining portion, and removing the protecting group if the product has a protecting group.
遺伝子工学的な方法では、例えば、上記の糖質分解酵素をコードする遺伝子を発現する発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養することによって糖質分解酵素を得ることができる。配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号３に示される。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号４に示される。なお、当該遺伝子は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ ＪＣＭ１１９５株が有する遺伝子である。 In a genetic engineering method, for example, a carbohydrate-degrading enzyme can be obtained by transforming a host cell with an expression vector that expresses a gene encoding the carbohydrate-degrading enzyme and culturing the transformant. The base sequence of a gene encoding a carbohydrate-degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown, for example, in SEQ ID NO: 3. The base sequence of a gene encoding a carbohydrate-degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown, for example, in SEQ ID NO: 4. The gene is a gene possessed by the Bifidobacterium dentium JCM1195 strain.
上記の糖質分解酵素をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー及び発現レベルを制御する種々のシスエレメント等）を用いて、宿主細胞に応じた発現ベクターを構築することができる。構築した発現ベクターは、例えば、大腸菌等の宿主細胞にエレクトロポレーション等の方法により導入すればよい。当該宿主細胞を所定の条件で培養することにより、当該糖質分解酵素が宿主細胞内で発現され、当該糖質分解酵素を抽出することができる。 An expression vector suitable for a host cell can be constructed using various regulatory elements (such as promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control the expression level) for expressing the gene encoding the above-mentioned carbohydrate-degrading enzyme in the host cell. The constructed expression vector can be introduced into a host cell such as Escherichia coli by a method such as electroporation. By culturing the host cell under specified conditions, the carbohydrate-degrading enzyme is expressed in the host cell, and the carbohydrate-degrading enzyme can be extracted.
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅの一部の細菌は、本実施の形態に係る糖質分解酵素をコードする遺伝子を有する。本実施の形態に係る糖質分解酵素をコードする遺伝子は、配列番号３又は４に塩基配列が示される遺伝子のホモログを有する細菌のゲノムＤＮＡから取得してもよい。 Some bacteria, such as Bifidobacterium dentium and Bifidobacterium breve, have a gene encoding the carbohydrate-degrading enzyme according to the present embodiment. The gene encoding the carbohydrate-degrading enzyme according to the present embodiment may be obtained from the genomic DNA of a bacterium having a homologue of the gene whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
得られた糖質分解酵素は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びエドマン分解法等により精製及び解析してもよい。 The resulting carbohydrate-degrading enzymes may be purified and analyzed, for example, by ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, and the Edman degradation method.
本実施の形態に係る糖質分解酵素が上述の酵素活性を示す条件は、特に限定されないが、例えば温度は、好ましくは３５～５０℃、より好ましくは４０～５０℃である。また、ｐＨは、好ましくは５．０～６．５、より好ましくは５．０～６．０である。 The conditions under which the carbohydrate decomposing enzyme according to this embodiment exhibits the above-mentioned enzymatic activity are not particularly limited, but for example, the temperature is preferably 35 to 50°C, more preferably 40 to 50°C. The pH is preferably 5.0 to 6.5, more preferably 5.0 to 6.0.
糖質分解酵素による糖質分解活性は、例えば以下の方法により確認することができる。Ｄ－Ｆｒｕｆの２位の炭素にＯを介してメチル基が結合したＤ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅ又はＤ－Ａｒａｆの１位の炭素にＯを介してメチル基が結合したＤ－Ａｒａｆ－α－ＯＭｅを有する糖類に糖質分解酵素を反応させて、ＴＬＣ及びＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ等のクロマトグラフィー法によって生成した単糖を検出し、その量から酵素活性を算出すればよい。また、ソモジーネルソン法のような切断により生ずる還元糖量を評価することにより、酵素活性を定量的に評価することもできる。 The carbohydrate degradation activity of a carbohydrate degrading enzyme can be confirmed, for example, by the following method. A carbohydrate degrading enzyme is reacted with a saccharide having D-Fruf-α-OMe, in which a methyl group is bonded to the carbon at the 2nd position of D-Fruf via O, or D-Araf-α-OMe, in which a methyl group is bonded to the carbon at the 1st position of D-Araf via O, and the resulting monosaccharides are detected by chromatography methods such as TLC and HPAEC-PAD, and the enzyme activity is calculated from the amount of monosaccharides. In addition, the enzyme activity can be quantitatively evaluated by evaluating the amount of reducing sugars generated by cleavage, such as by the Somogyi-Nelson method.
また、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素によるカラメル化重合物からアンヒドロ糖を生成する酵素活性は、例えば、イヌロビオース及びＦｒｕｐ－β２，１－Ｆｒｕ等のカラメル化重合物に当該糖質分解酵素を反応させて、生成する重合物を同様に検出することで確認できる。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素による糖質分解活性は、例えば、Ｆｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃに当該糖質分解酵素を反応させて、生成するＦｒｕ又はＧｌｃを同様に検出することで確認できる。 The enzymatic activity of a saccharide-degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 to produce anhydrosugars from caramelized polymers can be confirmed, for example, by reacting the saccharide-degrading enzyme with caramelized polymers such as inulobiose and Frup-β2,1-Fru, and similarly detecting the resulting polymers. The saccharide-degrading activity of a saccharide-degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 can be confirmed, for example, by reacting the saccharide-degrading enzyme with Fruf-α2,6-Glc, and similarly detecting the resulting Fru or Glc.
カラメル化重合物には、α結合を有するＤ－Ｆｒｕｆを含む多種の糖質が含まれる。α結合したＤ－Ｆｒｕｆを含む二糖等の糖質が分解されて生成するＦｒｕを腸内細菌は利用できる。本実施の形態に係る糖質分解酵素は、α結合したＤ－Ｆｒｕｆ等を含む糖質を分解するため、カラメル化重合物の資化に有用である。 Caramelized polymers contain many kinds of carbohydrates, including D-Fruf with α-linkages. Enterobacteriaceae can utilize Fru, which is generated by decomposition of carbohydrates, such as disaccharides, that contain α-linked D-Fruf. The carbohydrate-degrading enzyme according to the present embodiment decomposes carbohydrates that contain α-linked D-Fruf, and is therefore useful for assimilating caramelized polymers.
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、図２（Ａ）に示すイヌロビオースからＤＦＡ－Ｉを生成するため、１－ケストース（Ｇｌｃ－α１，２－Ｆｒｕｆ－β２，１－Ｆｒｕｆ）にβ－グルコシダーゼを作用させることで生成するイヌロビオースからＤＦＡ－Ｉを生成することができる。これにより、１－ケストースを出発物質として、ＤＦＡ－Ｉを製造することができる。なお、イヌロビオースは、ＤＡＦ－ＩＩＩにＤＡＦ－ＩＩＩヒドロラーゼを作用させて生成することができる。ＤＡＦ－ＩＩＩヒドロラーゼを併用することで、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素は、ＤＡＦ－ＩＩＩからＤＦＡ－Ｉを生成することができる。 The carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 can produce DFA-I from inulobiose shown in FIG. 2(A) by reacting β-glucosidase with 1-kestose (Glc-α1,2-Fruf-β2,1-Fruf) to produce DFA-I from inulobiose. This allows DFA-I to be produced using 1-kestose as a starting material. Inulobiose can be produced by reacting DAF-III with DAF-III hydrolase. By using DAF-III hydrolase in combination, the carbohydrate degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 can produce DFA-I from DAF-III.
（実施の形態２）
実施の形態１に係る糖質分解酵素をコードする核酸、特には遺伝子を有する細菌は、カラメル化重合物の資化に有用な細菌である。本実施の形態では、当該糖質分解酵素をコードする遺伝子を有する細菌の検出に使用できるプライマー対が提供される。本実施の形態に係るプライマー対は、実施の形態１に係る糖質分解酵素をコードする遺伝子に含まれる連続する少なくとも１０塩基を、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物の塩基配列中に含むように設計される。
(Embodiment 2)
The bacterium having a nucleic acid, particularly a gene, encoding the carbohydrate-degrading enzyme according to the first embodiment is a bacterium useful for assimilation of caramelized polymers. In this embodiment, a primer pair is provided that can be used to detect the bacterium having the gene encoding the carbohydrate-degrading enzyme. The primer pair according to this embodiment is designed so that at least 10 consecutive bases contained in the gene encoding the carbohydrate-degrading enzyme according to the first embodiment are contained in the base sequence of a PCR (Polymerase Chain Reaction) product.
ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ法によって増幅された核酸である。プライマー対とは、例えば、２本鎖の鋳型ＤＮＡのコーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのフォワードプライマーと、非コーディング鎖側を５’末端から３’末端の方向に伸長するためのリバースプライマーとの対をいう。 A PCR product is a nucleic acid amplified by the PCR method. A primer pair is, for example, a pair of a forward primer for extending the coding strand of a double-stranded template DNA in the direction from the 5' to the 3' end, and a reverse primer for extending the non-coding strand in the direction from the 5' to the 3' end.
プライマー対は、糖質分解酵素をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計される。好ましくは、プライマー対は、通常のＰＣＲで増幅可能であること、上記の糖質分解酵素をコードする核酸ではない核酸ではＰＣＲ産物が生じない塩基配列であること、定量的ＰＣＲにも適用可能なようにＰＣＲ産物が８０～５５０ｂｐの長さになるようにすること、かつ、Ｔｍ値が５５～６５℃の範囲内になること、を満たすように設計される。配列番号３に示す糖質分解酵素をコードする遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、例えば、それぞれ配列番号５及び配列番号６に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドである。また、配列番号４に示す糖質分解酵素をコードする遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、例えば、それぞれ配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドである。 The primer pair is designed based on the base sequence of the nucleic acid encoding the carbohydrate decomposition enzyme. Preferably, the primer pair is designed to satisfy the following: it can be amplified by normal PCR, it has a base sequence that does not produce a PCR product with a nucleic acid other than the above-mentioned carbohydrate decomposition enzyme, it produces a PCR product of 80 to 550 bp in length so that it can be applied to quantitative PCR, and it has a Tm value in the range of 55 to 65°C. The forward primer and reverse primer for amplifying the gene encoding the carbohydrate decomposition enzyme shown in SEQ ID NO: 3 are, for example, oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively. The forward primer and reverse primer for amplifying the gene encoding the carbohydrate decomposition enzyme shown in SEQ ID NO: 4 are, for example, oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively.
プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、既知の方法で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、固相ホスホルアミダイト法等を含む任意の核酸合成法により化学的に合成される。オリゴヌクレオチドは、トリエステル法でも合成できる。また、種々の自動オリゴヌクレオチド合成装置が市販されており、オリゴヌクレオチドは、当該自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる。また、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。 Oligonucleotides as primers can be synthesized by known methods. Oligonucleotides can be chemically synthesized by any nucleic acid synthesis method, including, for example, the solid-phase phosphoramidite method. Oligonucleotides can also be synthesized by the triester method. Various automated oligonucleotide synthesizers are commercially available, and oligonucleotides can also be synthesized on such automated oligonucleotide synthesizers. Multinucleotide synthesis methods can also be used as appropriate.
当該プライマー対は、公知の定量ＰＣＲ等で使用されてもよい。定量ＰＣＲの方法は、インターカレータ－法及びプローブ法等である。 The primer pair may be used in known quantitative PCR, etc. Methods for quantitative PCR include the intercalator method and the probe method, etc.
本実施の形態に係るプライマー対は、実施の形態１に係る糖質分解酵素をコードする核酸の少なくとも一部を特異的に増幅することができる。当該プライマー対を使用し、核酸の増幅を確認することで、糖質分解酵素をコードする遺伝子を有する細菌等を検出することができる。 The primer pair according to this embodiment can specifically amplify at least a portion of the nucleic acid encoding the carbohydrate-degrading enzyme according to embodiment 1. By using this primer pair and confirming the amplification of the nucleic acid, bacteria and the like having a gene encoding the carbohydrate-degrading enzyme can be detected.
また、別の実施の形態では、上記プライマー対を備えるカラメル化重合物資化菌の検出用キットが提供される。当該検出用キットは、糖質分解酵素をコードする遺伝子に含まれる連続する少なくとも１０塩基を塩基配列中に含む核酸、又はその核酸に相補的な核酸にハイブリダイズするプローブをさらに備えてもよい。 In another embodiment, a kit for detecting caramelized polymer-derived bacteria is provided, which includes the above-mentioned primer pair. The detection kit may further include a probe that hybridizes to a nucleic acid that includes at least 10 consecutive bases in a base sequence contained in a gene encoding a carbohydrate-degrading enzyme, or a nucleic acid complementary to the nucleic acid.
プローブとは、核酸の相補性に基づいたハイブリダイゼーション等を利用して核酸について解析するための核酸の断片をいう。プローブは、例えば、糖質分解酵素をコードする遺伝子の連続する１０塩基以上の塩基配列の核酸、好ましくは１０塩基から１００塩基の塩基配列の核酸、より好ましくは、１０塩基から５０塩基の塩基配列の核酸、又はそれらの核酸に相補的な核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。プローブは、糖質分解酵素をコードする遺伝子に含まれる連続する少なくとも１０塩基を含む核酸とはハイブリダイズするが、当該１０塩基を含まない核酸とはハイブリダイズしないものであれば、その塩基配列において１又は複数の置換、欠失及び付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等によって標識されたものであってもよい。 A probe is a nucleic acid fragment for analyzing a nucleic acid by using hybridization based on the complementarity of nucleic acids. A probe is, for example, a nucleic acid having a base sequence of 10 or more consecutive bases of a gene encoding a glycosidase, preferably a nucleic acid having a base sequence of 10 to 100 bases, more preferably a nucleic acid having a base sequence of 10 to 50 bases, or an oligonucleotide that hybridizes to a nucleic acid complementary to such a nucleic acid. A probe may contain one or more substitutions, deletions, and additions in its base sequence, so long as it hybridizes to a nucleic acid containing at least 10 consecutive bases contained in a gene encoding a glycosidase, but does not hybridize to a nucleic acid that does not contain the 10 bases. A probe may be labeled with a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like, as necessary.
ハイブリダイゼーションの条件は、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件では、例えば、プローブが、糖質分解酵素をコードする遺伝子に含まれる連続する少なくとも１０塩基を含む核酸とはハイブリダイズするが、当該１０塩基を含まない核酸とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション及び１×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理である。 The hybridization conditions are stringent conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Under stringent conditions, for example, the probe hybridizes to a nucleic acid containing at least 10 consecutive bases contained in a gene encoding a glycolytic enzyme, but does not hybridize to a nucleic acid that does not contain said 10 bases. Stringent conditions are, for example, hybridization at 42°C and washing at 42°C with a buffer containing 1x SSC (Saline Sodium Citrate Buffer) and 0.1% SDS.
プローブは、例えば、インベーダー（登録商標）法に用いられるものであってもよい。また、プローブは、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法に用いられるものであってもよい。 The probe may be, for example, one used in the Invader (registered trademark) method. The probe may also be, for example, one used in the TaqMan (registered trademark) method.
プローブとしてのオリゴヌクレオチドは、上記したプライマーの合成等と同様に既知の方法で合成することができる。 The oligonucleotide probe can be synthesized by known methods, similar to the synthesis of the primers described above.
上述のカラメル化重合物資化菌の検出用キットによれば、上記の糖質分解酵素をコードする遺伝子を有する細菌を効率よく検出できる。さらに当該検出用キットは、上述のプローブを備えることで、ＰＣＲ法で増幅された核酸を効率よく定量できる。なお、ここで“検出”とは、カラメル化重合物資化菌の有無を調べる定性的な検出に加え、カラメル化重合物資化菌の存在量を定量的に調べる定量的な検出（測定）も含む。 The above-mentioned kit for detecting caramelized polymer-derived bacteria can efficiently detect bacteria having genes encoding the above-mentioned carbohydrate-degrading enzymes. Furthermore, by including the above-mentioned probe, the detection kit can efficiently quantify the nucleic acid amplified by PCR. Note that "detection" here includes not only qualitative detection to check for the presence or absence of caramelized polymer-derived bacteria, but also quantitative detection (measurement) to quantitatively check the amount of caramelized polymer-derived bacteria present.
上述のプライマー対又はカラメル化重合物資化菌の検出用キットが適用される試料は、特に限定されないが、例えば、乳酸菌の混合培養物、乳酸菌を含むヨーグルト及びチーズ等の飲食品、マウス及びラット等の実験動物、並びにヒトの糞便及び腸液等である。これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ等の酵素又はビーズ等で物理的に細胞を破壊して抽出する方法、あるいは市販の核酸抽出キットを使用する方法等が挙げられる。 Samples to which the above-mentioned primer pair or kit for detecting caramelized polymer-utilizing bacteria can be applied include, but are not limited to, mixed cultures of lactic acid bacteria, foods and beverages containing lactic acid bacteria such as yogurt and cheese, laboratory animals such as mice and rats, and human feces and intestinal fluids. Methods for extracting nucleic acid from these samples include, for example, a method of physically destroying cells with an enzyme such as lysozyme or beads, or a method using a commercially available nucleic acid extraction kit.
上述のカラメル化重合物資化菌の検出用キットは、ＰＣＲ用試薬（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰ等）、緩衝液及び説明書等をさらに備えてもよい。また、カラメル化重合物資化菌の検出用キットは、カラメル化重合物資化菌の検出に必要な試薬及び他の細菌の検出に必要な試薬等を備えてもよい。 The above-mentioned kit for detecting caramelized polymerized product-utilizing bacteria may further include PCR reagents (such as heat-resistant DNA polymerase and dNTP), a buffer solution, and an instruction manual. The kit for detecting caramelized polymerized product-utilizing bacteria may also include reagents necessary for detecting caramelized polymerized product-utilizing bacteria and reagents necessary for detecting other bacteria.
（実施の形態３）
本実施の形態に係る食品添加用細菌のスクリーニング方法は、上記実施の形態１に係る糖質分解酵素をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡに有する細菌を取得する取得ステップを含む。取得ステップでは、例えば、実施の形態２に係るプライマー対又はカラメル化重合物資化菌の検出用キットで当該細菌を取得できる。食品添加用細菌のスクリーニング方法で取得される細菌は、好ましくは、ビフィズス菌等の公知の腸内細菌である。具体的には、当該細菌として、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ等に属する細菌が挙げられる。なお、取得した細菌は、公知の方法で培養してもよい。
(Embodiment 3)
The method for screening bacteria for food additives according to the present embodiment includes an acquisition step of acquiring bacteria having a gene encoding a carbohydrate decomposition enzyme according to the above-mentioned embodiment 1 in its genomic DNA. In the acquisition step, the bacteria can be acquired, for example, by using the primer pair according to the embodiment 2 or a kit for detecting caramelized polymer assimilation bacteria. The bacteria acquired by the method for screening bacteria for food additives are preferably known enterobacteria such as bifidobacteria. Specifically, examples of the bacteria include bacteria belonging to Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, or Bifidobacterium adolescentis. The acquired bacteria may be cultured by a known method.
当該細菌の用途は、食品添加用である。食品は、特に限定されないが、例えば、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶及び緑茶等の飲料、キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム及びゼリー等の菓子、麺、パン、米飯及びビスケット等の穀類加工品、ソーセージ、ハム及びかまぼこ等の練り製品、ふりかけ、並びに調味料等である。食品としては、バター、ヨーグルト及びチーズ等の飲食品が好ましい。なお、当該食品には、甘味料、香料及び着色料等の添加物が含まれてもよい。 The bacteria are used as food additives. Foods include, but are not limited to, beverages such as energy drinks, soft drinks, black tea and green tea, sweets such as candy, cookies, tablets, chewing gum and jelly, processed grain products such as noodles, bread, cooked rice and biscuits, paste products such as sausages, ham and kamaboko, furikake, seasonings, etc. Preferred foods include foods and beverages such as butter, yogurt and cheese. The foods may also contain additives such as sweeteners, flavorings and colorings.
本実施の形態に係る食品添加用細菌のスクリーニング方法によれば、α結合したＤ－Ｆｒｕｆ等を含む糖質を分解する糖質分解酵素を産生する細菌を特定できる。糖質分解酵素を産生する細菌によって、α結合したＤ－Ｆｒｕｆを含む二糖等の糖質から生成した単糖はビフィズス菌等の腸内細菌に資化され得る。したがって、糖質分解酵素を産生する細菌を摂取することで、腸内のビフィズス菌等を選択的に増殖させ得る。 According to the screening method for bacteria for food additives of this embodiment, it is possible to identify bacteria that produce carbohydrate-degrading enzymes that degrade carbohydrates containing α-linked D-Fruf and the like. Monosaccharides generated from carbohydrates such as disaccharides containing α-linked D-Fruf by the carbohydrate-degrading enzyme-producing bacteria can be assimilated by intestinal bacteria such as bifidobacteria. Therefore, by ingesting bacteria that produce carbohydrate-degrading enzymes, it is possible to selectively proliferate bifidobacteria and the like in the intestine.
また、別の実施の形態では、カラメル化重合物資化菌含有食品の製造方法が提供される。当該製造方法は、上述の取得ステップで取得された細菌を、原料として食品に加えるステップを含む。 In another embodiment, a method for producing a food containing bacteria that metabolize caramelized polymers is provided. The method includes adding the bacteria obtained in the obtaining step described above to the food as an ingredient.
（実施の形態４）
本実施の形態に係るプレバイオティクスの評価方法は、処理ステップと、定量ステップと、を含む。プレバイオティクスとは、大腸内の特定の細菌の増殖及び活性を選択的に変化させることで、宿主に有利な影響を与え、宿主の健康を改善する難消化性食品成分である。プレバイオティクスに要求される条件は次の（１）～（４）である。（１）消化管上部で加水分解、吸収されない。（２）大腸に共生する一種又は限定された数の有益なビフィズス菌等の細菌の選択的な基質であり、それらの細菌の増殖を促進し、または代謝を活性化する。（３）大腸の腸内細菌叢（フローラ）を健康的な構成に都合の良いように改変できる。（４）宿主の健康に有益な全身的な効果を誘導する。
(Embodiment 4)
The method for evaluating prebiotics according to the present embodiment includes a processing step and a quantification step. Prebiotics are indigestible food ingredients that have a beneficial effect on the host and improve the host's health by selectively changing the growth and activity of specific bacteria in the large intestine. The requirements for prebiotics are the following (1) to (4): (1) they are not hydrolyzed or absorbed in the upper digestive tract. (2) they are a selective substrate for one or a limited number of beneficial bacteria such as bifidobacteria that coexist in the large intestine, and they promote the growth of these bacteria or activate their metabolism. (3) they can modify the intestinal flora of the large intestine in a way that is favorable for a healthy composition. (4) they induce a systemic effect that is beneficial to the host's health.
処理ステップでは、実施の形態１に係る糖質分解酵素で試料を処理する。試料は、好ましくはプレバイオティクス、特にはカラメル化重合物が含まれることが見込まれる食品又は食品の原料等である。処理ステップでは、実施の形態１に係る糖質分解酵素が糖質分解活性を示す条件下で、当該糖質分解酵素に試料を暴露する。試料に糖質分解酵素によって分解される基質であるカラメル化重合物が存在する場合、処理ステップによって試料中のカラメル化重合物が分解され、単糖が生成する。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する糖質分解酵素を用いた処理ステップでは、試料中のカラメル化重合物が脱水縮合されて、ＤＦＡ－Ｉ及びＤＦＡｘ等のアンヒドロ糖が生成する。 In the treatment step, the sample is treated with the carbohydrate-degrading enzyme according to the first embodiment. The sample is preferably a food or food ingredient expected to contain prebiotics, particularly caramelized polymers. In the treatment step, the sample is exposed to the carbohydrate-degrading enzyme according to the first embodiment under conditions under which the carbohydrate-degrading enzyme exhibits carbohydrate decomposition activity. If the sample contains caramelized polymers, which are substrates decomposed by the carbohydrate-degrading enzyme, the caramelized polymers in the sample are decomposed in the treatment step to produce monosaccharides. In addition, in the treatment step using the carbohydrate-degrading enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, the caramelized polymers in the sample are dehydrated and condensed to produce anhydrosugars such as DFA-I and DFAx.
定量ステップでは、処理ステップで生成した分解物、重合物及び単糖の少なくとも１つを定量する。分解物、重合物及び単糖は、上記のクロマトグラフィー法等によって定量できる。この場合、分解物、重合物及び単糖の標品を対照として用いることで、分解物、重合物及び単糖が同定でき、生成量を正確に評価できる。なお、処理ステップにおいて、糖質分解酵素で処理しない試料についても同様の方法で定量して、処理ステップで生成した分解物、重合物及び単糖の結果と比較するのが好ましい。こうすることで、処理ステップで処理する前の試料に含まれる糖の含有量を確認することができる。 In the quantification step, at least one of the decomposition products, polymers, and monosaccharides produced in the treatment step is quantified. The decomposition products, polymers, and monosaccharides can be quantified by the above-mentioned chromatography method, etc. In this case, by using preparations of the decomposition products, polymers, and monosaccharides as controls, the decomposition products, polymers, and monosaccharides can be identified and the amounts produced can be accurately evaluated. It is preferable to also quantify samples that are not treated with the carbohydrate-degrading enzyme in the treatment step in the same manner and compare the results with those of the decomposition products, polymers, and monosaccharides produced in the treatment step. In this way, the sugar content in the sample before treatment in the treatment step can be confirmed.
本実施の形態に係るプレバイオティクスの評価方法は、腸内細菌によって分解される、試料中のカラメル化重合物を定量できる。腸内細菌によって分解されるカラメル化重合物は、腸内のビフィズス菌等を選択的に増殖させ得るため、カラメル化重合物は、保健食品又は健康増進を目的とする食品等に含まれるプレバイオティクスであると言える。 The prebiotic evaluation method according to the present embodiment can quantify the amount of caramelized polymers in a sample that are decomposed by intestinal bacteria. Caramelized polymers that are decomposed by intestinal bacteria can selectively grow bifidobacteria and the like in the intestine, so caramelized polymers can be said to be prebiotics contained in health foods or foods intended to promote health.
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be explained in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
（試験例１：組換え酵素の作製）
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ ＪＣＭ１１９５株（ＤＳＭ ２０４３６）のゲノムをテンプレートとして、ＢＢＤＥ２０４０遺伝子（Ｐｆａｍ：ＤＵＦ２９６１、ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＢＡＱ２８０３４）及びＢＢＤＥ２０３２遺伝子（Ｐｆａｍ：ＤＵＦ２９６１、ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＢＡＱ２８０２６）の全長をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いてｐＥＴ２３ｄベクター（ノバジェン社製）に組み込み、プラスミドを取得した。ＰＣＲは、フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）、リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（タカラバイオ社製）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒及び７２℃で２．５分を３０サイクルとし、４℃で終了した。１％アガロースゲル電気泳動を介して目的のバンドを切り出し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いてＰＣＲ産物を精製した。
(Test Example 1: Preparation of recombinant enzyme)
Using the genome of Bifidobacterium dentium JCM1195 strain (DSM 20436) as a template, the full length of the BBDE2040 gene (Pfam: DUF2961, NCBI-Protein ID: BAQ28034) and the BBDE2032 gene (Pfam: DUF2961, NCBI-Protein ID: BAQ28026) were amplified by PCR, and the PCR product was incorporated into the pET23d vector (Novagen) using In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to obtain a plasmid. PCR was performed using a forward primer (10 pmol / mL), a reverse primer (10 pmol / mL) and PrimeSTAR HS (Takara Bio). The PCR reaction consisted of 30 cycles of 98° C. for 10 seconds, 55° C. for 15 seconds, and 72° C. for 2.5 minutes, and was terminated at 4° C. The band of interest was excised via 1% agarose gel electrophoresis, and the PCR product was purified using Illustra GFX DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare Life Sciences).
ＢＢＤＥ２０４０遺伝子の増幅においてＰＣＲに用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号５及び配列番号６に示す。ＢＢＤＥ２０３２遺伝子の増幅においてＰＣＲに用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号７及び配列番号８に示す。 The nucleotide sequences of the forward primer and reverse primer used in PCR to amplify the BBDE2040 gene are shown in SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6, respectively. The nucleotide sequences of the forward primer and reverse primer used in PCR to amplify the BBDE2032 gene are shown in SEQ ID NO:7 and SEQ ID NO:8, respectively.
ＢＢＤＥ２０４０遺伝子を組み込んだプラスミドをｐＥＴ２３ｄ＿ＢＢＤＥ２０４０とし、ＢＢＤＥ２０３２遺伝子を組み込んだプラスミドをｐＥＴ２３ｄ＿ＢＢＤＥ２０３２とした。定法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴ２３ｄ_ＢＢＤＥ２０４０又はｐＥＴ２３ｄ＿ＢＢＤＥ２０３２で形質転換し、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（メルク社製）を用いて酵素を誘導生成した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いて菌体内酵素を抽出した後、タンパク質のＣ末端に付加したＨｉｓ－ｔａｇ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ；配列番号９）を利用してタンパク質を精製した。得られたタンパク質を定法によりＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。 The plasmid incorporating the BBDE2040 gene was designated pET23d_BBDE2040, and the plasmid incorporating the BBDE2032 gene was designated pET23d_BBDE2032. Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with pET23d_BBDE2040 or pET23d_BBDE2032 by a standard method, and the enzyme was induced and produced using Overnight Express Autoinduction System (Merck). After extracting the intracellular enzyme using BugBuster protein extraction reagent (Merck), the protein was purified using the His-tag (LEHHHHHH; SEQ ID NO: 9) added to the C-terminus of the protein. The resulting protein was evaluated by SDS-PAGE using standard methods.
（結果）
ＢＢＤＥ２０４０遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）から予想される、Ｈｉｓ－ｔａｇを含めた分子量は５２．９４ｋＤａである。一方、ＢＢＤＥ２０３２遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）から予想される、Ｈｉｓ－ｔａｇを含めた分子量は４４．０５９ｋＤａである。図４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドを示す。ＢＢＤＥ２０４０遺伝子がコードするタンパク質では５３ｋＤａ付近にシングルバンドが確認された。ＢＢＤＥ２０３２遺伝子がコードするタンパク質では４４ｋＤａ付近にシングルバンドが確認された。以下では、ＢＢＤＥ２０４０遺伝子がコードするタンパク質をαＦｒａｓｅ１とし、ＢＢＤＥ２０３２遺伝子がコードするタンパク質をαＦｒａｓｅ２とする。
(result)
The molecular weight including His-tag, predicted from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the protein encoded by the BBDE2040 gene, is 52.94 kDa. On the other hand, the molecular weight including His-tag, predicted from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the protein encoded by the BBDE2032 gene, is 44.059 kDa. FIG. 4 shows the bands of SDS-PAGE. A single band was confirmed in the vicinity of 53 kDa for the protein encoded by the BBDE2040 gene. A single band was confirmed in the vicinity of 44 kDa for the protein encoded by the BBDE2032 gene. Hereinafter, the protein encoded by the BBDE2040 gene is referred to as αFrase1, and the protein encoded by the BBDE2032 gene is referred to as αFrase2.
（試験例２：合成基質Ｄ－Ａｒａｆ－α－ＯＭｅ及びＤ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅに対する分解活性の確認）
２０μＬのＤ－Ａｒａｆ－α－ＯＭｅ（８ｍＭ）及びＤ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅ水溶液（８ｍＭ）、１０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）及び５μＬの滅菌水中に、試験例１で得た５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液又はαＦｒａｓｅ２溶液（いずれも０．１ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃にて１８時間反応させた。回収した反応液１μＬをＴＬＣプレートに供し、ｎ－プロパノール／エタノール／水＝７／１／２にて展開した。オリゴ糖はオルシノール硫酸によって発色させた。
(Test Example 2: Confirmation of decomposition activity for synthetic substrates D-Araf-α-OMe and D-Fruf-α-OMe)
5 μL of the αFrase1 solution or αFrase2 solution (both 0.1 mg/mL) obtained in Test Example 1 was added to 20 μL of D-Araf-α-OMe (8 mM) and D-Fruf-α-OMe aqueous solution (8 mM), 10 μL of 200 mM acetate buffer (pH 6.0), and 5 μL of sterile water, and the mixture was reacted at 37° C. for 18 hours. 1 μL of the recovered reaction solution was applied to a TLC plate and developed with n-propanol/ethanol/water=7/1/2. Oligosaccharides were colored with orcinol-sulfuric acid.
（結果）
図５に示すようにＴＬＣによって、αＦｒａｓｅ１では、Ｄ－Ａｒａｆ－α－ＯＭｅ及びＤ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅからの遊離糖のスポットが確認された。よって、αＦｒａｓｅ１がα－Ｄ－アラビノフラノシダーゼ活性及びα－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ活性を有していることが示された。一方、αＦｒａｓｅ２では、Ｄ－Ｆｒｕｆ－α－ＯＭｅからの遊離糖のスポットが確認されたが、Ｄ－Ａｒａｆ－α－ＯＭｅからの遊離糖のスポットは確認できなかった。これは、αＦｒａｓｅ２がα－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ活性を有していることを示している。
(result)
As shown in Figure 5, in αFrase1, spots of free sugars from D-Araf-α-OMe and D-Fruf-α-OMe were confirmed by TLC. This showed that αFrase1 has α-D-arabinofuranosidase activity and α-D-fructofuranosidase activity. On the other hand, in αFrase2, a spot of free sugars from D-Fruf-α-OMe was confirmed, but no spot of free sugars from D-Araf-α-OMe was confirmed. This shows that αFrase2 has α-D-fructofuranosidase activity.
（試験例３：αＦｒａｓｅ１の酵素反応条件）
パラ－ニトロフェニルα－Ｄ－アラビノフラノシド（ｐａｒａ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ α－Ｄ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ；ｐＮＰ－α－Ｄ－Ａｒａｆ）を基質として、以下のように酵素反応を行い、加水分解により遊離するｐ－ニトロフェノールをアルカリ条件下で定量することで至適ｐＨ及び至適温度を決定した。
(Test Example 3: Enzyme reaction conditions for αFrase1)
Using para-nitrophenyl α-D-arabinofuranoside (pNP-α-D-Araf) as a substrate, an enzymatic reaction was carried out as described below, and p-nitrophenol liberated by hydrolysis was quantified under alkaline conditions to determine the optimum pH and temperature.
至適温度の決定では、５μＬのｐＮＰ－α－Ｄ－Ａｒａｆ水溶液（４ｍＭ）、５μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）及び５μＬの滅菌水中に、試験例１で得た５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。各温度で２０分間反応させ、３０μＬの１２０ｍＭ ＮａＣＯ３を加えて反応を停止し、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。 In determining the optimum temperature, 5 μL of the αFrase1 solution (0.025 mg/mL) obtained in Test Example 1 was added to 5 μL of pNP-α-D-Araf aqueous solution (4 mM), 5 μL of 200 mM acetate buffer (pH 5.5), and 5 μL of sterilized water. The reaction was carried out at each temperature for 20 minutes, and the reaction was stopped by adding 30 μL of 120 mM NaCO 3 , and the absorbance at 400 nm was measured.
至適ｐＨの決定では、５μＬのｐＮＰ－α－Ｄ－Ａｒａｆ水溶液（４ｍＭ）、５μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０～６．０）又はリン酸バッファー（ｐＨ６．０～８．０）及び５μＬの滅菌水中に、試験例１で得た５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。３７℃において各ｐＨで２０分間反応させ、３０μＬの１２０ｍＭ ＮａＣＯ３を加えて反応を停止し、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。 In determining the optimum pH, 5 μL of the αFrase1 solution (0.025 mg/mL) obtained in Test Example 1 was added to 5 μL of pNP-α-D-Araf aqueous solution (4 mM), 5 μL of 200 mM acetate buffer (pH 4.0-6.0) or phosphate buffer (pH 6.0-8.0), and 5 μL of sterilized water. The reaction was carried out at 37° C. for 20 minutes at each pH, and the reaction was stopped by adding 30 μL of 120 mM NaCO 3 , and the absorbance at 400 nm was measured.
（結果）
図６（Ａ）に示すように、αＦｒａｓｅ１の至適ｐＨは５．５であった。図６（Ｂ）に示すように、αＦｒａｓｅ１の至適温度は５０℃であった。
(result)
As shown in Figure 6(A), the optimum pH of αFrase 1 was 5.5, and as shown in Figure 6(B), the optimum temperature of αFrase 1 was 50°C.
（試験例４：カラメル化重合物に対するαＦｒａｓｅ２の分解性の検討）
非特許文献（Ｙａｍａｍｏｒｉ Ａ、外８名、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｆｒｕｃｔｏｓｅ Ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ（ＤＦＡｓ） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５年、６２、ｐ１２１－１２５）に基づいて、カラメル化重合物を次のように調製した。フルクトース６０ｇを１３１℃で１２０分間（Ｆ１３０）又は１５０℃で９０分間（Ｆ１５０）、加熱した。また、グルコース３０ｇとフルクトース３０ｇとを含む混合物を、１３１℃で１２０分間（ＧＦ１３０）又は１５０℃で９０分間（ＧＦ１５０）、加熱した。加熱後、それぞれ２００ｍｌの水を添加して撹拌した。
(Test Example 4: Examination of the decomposition ability of αFrase2 against caramelized polymer)
Based on a non-patent document (Yamamori A, et al., "Structural Analysis of Difructose Anhydrides (DFAs) Synthesized from Monosaccharides by Thermal Treatment." Journal of Applied Glycoscience, 2015, 62, pp. 121-125), a caramelized polymer was prepared as follows: 60 g of fructose was heated at 131° C. for 120 minutes (F130) or at 150° C. for 90 minutes (F150). Also, a mixture containing 30 g of glucose and 30 g of fructose was heated at 131° C. for 120 minutes (GF130) or at 150° C. for 90 minutes (GF150). After heating, 200 ml of water was added to each mixture and stirred.
Ｆ１３０及びＧＦ１３０それぞれに、市販パン酵母（スーパーカメリアドライイースト、日清フーズ社製）を加え、３７℃で２４時間振とう培養し、単糖を消化させた。単糖を消化したＦ１３０又はＧＦ１３０を基質として、２５μＬの基質、２０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、５μＬのαＦｒａｓｅ２溶液及び５０μＬの水を含むサンプルを３７℃で１日間反応させ、水で１００倍に希釈して、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤに供した。サンプルにおけるαＦｒａｓｅ２溶液を水に置き換えた対照を同様に調製した。 Commercially available baker's yeast (Super Camellia Dry Yeast, Nissin Foods) was added to F130 and GF130, respectively, and cultured with shaking at 37°C for 24 hours to digest monosaccharides. Using F130 or GF130 with digested monosaccharides as substrate, a sample containing 25 μL of substrate, 20 μL of 200 mM acetate buffer (pH 5.5), 5 μL of αFrase2 solution, and 50 μL of water was reacted at 37°C for 1 day, diluted 100-fold with water, and subjected to HPAEC-PAD. A control was prepared in the same manner, in which the αFrase2 solution in the sample was replaced with water.
反応後、サンプル全量を、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで解析した。なお、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤにはＩＣＳ－３０００（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いた。カラムはＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ－１とした。移動相は溶離液Ａ（０．１Ｍ ＮａＯＨ）、溶離液Ｂ（０．５Ｍ酢酸ナトリウム及び０．１Ｍ ＮａＯＨ）、勾配溶離の条件は０－５分が１００％溶離液Ａ；５－３０分が０～１００％溶離液Ｂ；３０－３５分が１００％溶離液Ｂとした。流速は１．０ｍＬ／分で、温度は３０℃とした。検出器はＰＡＤである。 After the reaction, the entire sample was analyzed by HPAEC-PAD. ICS-3000 (Dionex) was used for HPAEC-PAD. The column was a CarboPac PA-1. The mobile phase was eluent A (0.1 M NaOH) and eluent B (0.5 M sodium acetate and 0.1 M NaOH), and the gradient elution conditions were 0-5 min: 100% eluent A; 5-30 min: 0-100% eluent B; 30-35 min: 100% eluent B. The flow rate was 1.0 mL/min, and the temperature was 30°C. The detector was a PAD.
（結果）
図７に示すように、αＦｒａｓｅ２を含むＦ１３０では、対照（図７（Ａ））で観測されなかったフルクトースに対応するピークが観測された（図７（Ｂ））。αＦｒａｓｅ２で処理したＧＦ１３０では、対照（図７（Ｃ））で観測されなかったグルコース及びフルクトースに対応するピークが観測された（図７（Ｄ））。このことから、αＦｒａｓｅ２がＦｒｕｆ－α２，６－Ｇｌｃ及びＦｒｕｆ－α２，６－Ｆｌｕを分解することが示された。
(result)
As shown in Figure 7, in GF130 containing αFrase2, a peak corresponding to fructose was observed (Figure 7(B)), which was not observed in the control (Figure 7(A)). In GF130 treated with αFrase2, peaks corresponding to glucose and fructose were observed (Figure 7(D)), which were not observed in the control (Figure 7(C)). This indicates that αFrase2 degrades Fruf-α2,6-Glc and Fruf-α2,6-Flu.
（試験例５：カラメル化重合物に対するαＦｒａｓｅ１の分解性の検討）
Ｆ１３０又はＦ１５０を基質とした。１０μＬの基質、１０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）、５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液及び１５μＬの水を含むサンプルを３７℃で一晩反応させた。サンプルにおける酢酸バッファーとαＦｒａｓｅ１溶液を水に置き換えた対照を同様に調製した。反応後、サンプルを１００倍に希釈して試験例４と同様にＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで解析した。
(Test Example 5: Examination of the decomposition ability of αFrase1 against caramelized polymer)
F130 or F150 was used as the substrate. A sample containing 10 μL of substrate, 10 μL of 200 mM acetate buffer (pH 6.0), 5 μL of αFrase1 solution, and 15 μL of water was reacted at 37° C. overnight. A control was prepared in the same manner, in which the acetate buffer and αFrase1 solution in the sample were replaced with water. After the reaction, the sample was diluted 100-fold and analyzed by HPAEC-PAD in the same manner as in Test Example 4.
（結果）
図８（Ａ）は、０．０５％フルクトース溶液のピークを示す。図８（Ｂ）及び図８（Ｃ）に示すように、Ｆ１３０では、カラメル化重合物７分ピーク（Ｆｒｕｐ－β－２，１－Ｆｒｕ）がαＦｒａｓｅ１の作用を受けてαＦｒａｓｅ１反応物４分ピーク（ＤＦＡｘ）に移行した。また、カラメル化重合物１１分ピーク（Ｆｒｕｆ－β２，１－Ｆｒｕ；イヌロビオース）がαＦｒａｓｅ１反応物１０分ピーク（ＤＦＡ－Ｉ）に移行した。Ｆ１５０についても図８（Ｄ）及び図８（Ｅ）に示すように、同様のピーク移行がみられた。
(result)
Fig. 8(A) shows the peaks of a 0.05% fructose solution. As shown in Fig. 8(B) and Fig. 8(C), in F130, the 7-minute peak of the caramelized polymer (Frup-β-2,1-Fru) was affected by the action of αFrase1 and shifted to the 4-minute peak of the αFrase1 reactant (DFAx). In addition, the 11-minute peak of the caramelized polymer (Fruf-β2,1-Fru; inulobiose) shifted to the 10-minute peak of the αFrase1 reactant (DFA-I). As shown in Fig. 8(D) and Fig. 8(E), a similar peak shift was observed for F150.
（試験例６：カラメル化重合物標品に対するαＦｒａｓｅ１及びαＦｒａｓｅ１の分解性の検討）
カラメル化重合物の標品Ｆｒｕｆ－α－２，６－Ｇｌｃを基質とした。５μＬの基質、５μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液又はαＦｒａｓｅ２溶液及び５μＬの水を含むサンプルを３７℃で１日間反応させた。サンプルにおけるαＦｒａｓｅ１溶液又はαＦｒａｓｅ２溶液を水に置き換えた対照を同様に調製した。反応後、サンプルを１０倍に希釈して試験例４と同様にＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで解析した。
(Test Example 6: Study on the decomposition ability of αFrase1 and αFrase1 on caramelized polymer sample)
A caramelized polymer sample, Fruf-α-2,6-Glc, was used as the substrate. A sample containing 5 μL of the substrate, 5 μL of 200 mM acetate buffer (pH 5.5), 5 μL of αFrase 1 solution or αFrase 2 solution, and 5 μL of water was reacted at 37° C. for 1 day. Controls were prepared in the same manner, except that the αFrase 1 solution or αFrase 2 solution in the sample was replaced with water. After the reaction, the sample was diluted 10-fold and analyzed by HPAEC-PAD in the same manner as in Test Example 4.
（結果）
図９（Ａ）はＦｒｕｆ－α－２，６－Ｇｌｃのピークを示す。図９（Ｂ）に示すように、αＦｒａｓｅ２を作用させたサンプルでは、Ｆｒｕｆ－α－２，６－Ｇｌｃのピークが小さくなり、グルコース及びフルクトースに対応する４～５分付近にピークが見られた。よって、αＦｒａｓｅ２はα－Ｄ－フルクトフラノシダーゼと考えられる。一方、図９（Ｃ）に示すように、αＦｒａｓｅ１を作用させたサンプルでは、グルコース及びフルクトースに対応するピークがほとんど検出されなかったため、αＦｒａｓｅ１はＦｒｕｆ－α－２，６－Ｇｌｃをほとんど分解しないと考えられた。
(result)
Figure 9(A) shows the peak of Fruf-α-2,6-Glc. As shown in Figure 9(B), in the sample treated with αFrase2, the peak of Fruf-α-2,6-Glc was smaller, and peaks corresponding to glucose and fructose were observed around 4 to 5 minutes. Therefore, αFrase2 is considered to be α-D-fructofuranosidase. On the other hand, as shown in Figure 9(C), in the sample treated with αFrase1, peaks corresponding to glucose and fructose were hardly detected, suggesting that αFrase1 hardly decomposes Fruf-α-2,6-Glc.
（試験例７：αＦｒａｓｅ１によるＦｒｕｐ－β－２，１－ＦｒｕからＤＦＡｘへの反応が平衡反応であるかの確認）
αＦｒａｓｅ１反応物４分ピークに示されるＤＦＡｘ及び７分ピークに示されるＦｒｕｐ－β－２，１－Ｆｒｕを単離し、これらを基質とした。１０μＬの基質、２５μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液及び６５μＬの水を含むサンプルを３７℃で一晩反応させた。サンプルにおけるαＦｒａｓｅ１溶液を水に置き換えた対照を同様に調製した。反応後、サンプルを試験例４と同様にＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで解析した。
(Test Example 7: Confirmation of whether the reaction from Frup-β-2,1-Fru to DFAx by αFrase1 is an equilibrium reaction)
DFAx, which is shown in the 4-minute peak of the αFrase1 reaction product, and Frup-β-2,1-Fru, which is shown in the 7-minute peak, were isolated and used as substrates. A sample containing 10 μL of substrate, 25 μL of 200 mM acetate buffer (pH 5.5), 5 μL of αFrase1 solution, and 65 μL of water was reacted at 37° C. overnight. A control was prepared in the same manner, in which the αFrase1 solution in the sample was replaced with water. After the reaction, the sample was analyzed by HPAEC-PAD in the same manner as in Test Example 4.
（結果）
ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤの結果を図１０に示す。なお、図１０（Ａ）～（Ｄ）中の数値は、各ピークの面積値を示す。図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）に示すように、ＤＦＡｘをＦｒａｓｅ１で処理することで、ＤＦＡｘのピークの約２％がＦｒｕｐ－β－２，１－Ｆｒｕのピークに移行した。また、図１０（Ｃ）及び図１０（Ｄ）に示すように、Ｆｒｕｐ－β－２，１－ＦｒｕをＦｒａｓｅ１で処理することで、Ｆｒｕｐ－β－２，１－ＦｒｕのピークがＤＦＡｘのピークに移行した。よって、αＦｒａｓｅ１によるＦｒｕｐ－β－２，１－ＦｒｕからＤＦＡｘへの反応は平衡反応だと言える。また、Ｆｒｕｐ－β－２，１－Ｆｒｕ→ＤＦＡｘの反応で移行したピークは、ＤＦＡｘ→Ｆｒｕｐ－β－２，１－Ｆｒｕの反応で移行したピークのよりも大きいことから、平衡反応はＦｒｕｐ－β－２，１－ＦｒｕからＤＦＡｘへの脱水縮合反応に偏っていることが示された。
(result)
The results of HPAEC-PAD are shown in FIG. 10. The values in FIG. 10(A) to (D) indicate the area values of each peak. As shown in FIG. 10(A) and FIG. 10(B), by treating DFAx with Frase1, about 2% of the DFAx peak shifted to the Frup-β-2,1-Fru peak. Also, as shown in FIG. 10(C) and FIG. 10(D), by treating Frup-β-2,1-Fru with Frase1, the Frup-β-2,1-Fru peak shifted to the DFAx peak. Therefore, it can be said that the reaction from Frup-β-2,1-Fru to DFAx by αFrase1 is an equilibrium reaction. Furthermore, the peak shifted in the reaction from Frup-β-2,1-Fru to DFAx was larger than the peak shifted in the reaction from DFAx to Frup-β-2,1-Fru, indicating that the equilibrium reaction was biased toward the dehydration condensation reaction from Frup-β-2,1-Fru to DFAx.
（試験例８：αＦｒａｓｅ１によるイヌロビオースからＤＦＡ－Ｉへの反応が平衡反応であるかの確認）
αＦｒａｓｅ１反応物１０分ピークに示されるＤＦＡ－Ｉを単離し、２ｍＭとして基質とした。５μＬの基質、２０μＬの２５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）及び７５μＬの水を含むサンプルＳ１と、５μＬの基質、２０μＬの２５０ｍＭ酢酸バッファー、５μＬのパン酵母由来のインバーターゼ溶液（β－フルクトフラノシダーゼともいう、１ｍｇ／ｍＬ、シグマ社製）及び７５μＬの水を含むサンプルＳ２と、５μＬの基質、２０μＬの２５０ｍＭ酢酸バッファー、５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液及び７０μＬの水を含むサンプルＳ３と、５μＬの基質、２０μＬの２５０ｍＭ酢酸バッファー、５μＬのαＦｒａｓｅ１溶液、５μＬのインバーターゼ溶液及び７０μＬの水を含むサンプルＳ４と、調製し、３７℃で一晩反応させた。反応後、サンプルＳ１～Ｓ４を試験例４と同様にＨＰＡＥＣ－ＰＡＤで解析した。
(Test Example 8: Confirmation of whether the reaction from inulobiose to DFA-I by αFrase1 is an equilibrium reaction)
DFA-I, which is shown in the 10-minute peak of the αFrase1 reaction product, was isolated and used as a substrate at 2 mM. Sample S1 containing 5 μL of substrate, 20 μL of 250 mM acetate buffer (pH 5.5) and 75 μL of water, sample S2 containing 5 μL of substrate, 20 μL of 250 mM acetate buffer, 5 μL of invertase solution derived from baker's yeast (also called β-fructofuranosidase, 1 mg/mL, Sigma) and 75 μL of water, sample S3 containing 5 μL of substrate, 20 μL of 250 mM acetate buffer, 5 μL of αFrase1 solution and 70 μL of water, and sample S4 containing 5 μL of substrate, 20 μL of 250 mM acetate buffer, 5 μL of αFrase1 solution, 5 μL of invertase solution and 70 μL of water were prepared and reacted at 37 ° C. overnight. After the reaction, Samples S1 to S4 were analyzed by HPAEC-PAD in the same manner as in Test Example 4.
（結果）
ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤの結果を図１１に示す。なお、図１１（Ａ）～（Ｄ）中の数値は、各ピークの面積値を示す。図１１（Ａ）に示すように、ＤＦＡ－ＩをαＦｒａｓｅ１で処理すると、その一部がイヌロビオースに移行した。なお、平衡反応はイヌロビオースからＤＦＡ－Ｉへの脱水縮合反応に偏っていた。一方、ＤＦＡ－Ｉをインバーターゼで処理した図１１（Ｂ）に示されたピークは、図１１（Ｄ）に示すＤＦＡ－Ｉ（対照）のピークからほとんど変化がないため、ＤＦＡ－Ｉはインバーターゼで切断されなかった。ＤＦＡ－ＩをαＦｒａｓｅ１及びインバーターゼで処理すると、図１１（Ｃ）に示すように、αＦｒａｓｅ１の作用によりＤＦＡ－Ｉの一部がイヌロビオースに変換された後、インバーターゼによりフルクトースに分解された。以上の結果から、αＦｒａｓｅ１が平衡反応を触媒していることが確認された。また、β－フルクトフラノシダーゼを共存させることにより、平衡反応がイヌロビオースからＤＦＡ－Ｉへの脱水縮合反応に偏っていたとしても、徐々にフルクトースに分解されることが確認された。
(result)
The results of HPAEC-PAD are shown in FIG. 11. The values in FIG. 11(A) to (D) indicate the area values of each peak. As shown in FIG. 11(A), when DFA-I was treated with αFrase1, a part of it was transferred to inulobiose. The equilibrium reaction was biased toward the dehydration condensation reaction from inulobiose to DFA-I. On the other hand, the peak shown in FIG. 11(B) in which DFA-I was treated with invertase shows almost no change from the peak of DFA-I (control) shown in FIG. 11(D), so DFA-I was not cleaved by invertase. When DFA-I was treated with αFrase1 and invertase, a part of DFA-I was converted to inulobiose by the action of αFrase1, and then decomposed to fructose by invertase, as shown in FIG. 11(C). From the above results, it was confirmed that αFrase1 catalyzed the equilibrium reaction. It was also confirmed that, by allowing β-fructofuranosidase to coexist, inulobiose was gradually decomposed to fructose even if the equilibrium reaction was biased toward the dehydration condensation reaction from inulobiose to DFA-I.
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。 The above-described embodiment is intended to explain the present invention, and does not limit the scope of the present invention. In other words, the scope of the present invention is indicated by the claims, not by the embodiment. Furthermore, various modifications made within the scope of the claims and within the scope of the meaning of the invention equivalent thereto are considered to be within the scope of the present invention.
本発明は、健康食品及びプレバイオティクス含有食品の製造に好適である。 The present invention is suitable for producing health foods and prebiotic-containing foods.
Claims (5)
糖質分解酵素。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列 The present invention relates to a method for producing a glycolytic enzyme comprising the steps of:
Carbohydrate-degrading enzyme.
(a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1; (b) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1; (c) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2; (d) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
請求項１に記載の糖質分解酵素。 having α-D-fructofuranosidase activity,
The carbohydrate-degrading enzyme described in claim 1.
α－Ｄ－アラビノフラノシダーゼ活性を有する、
請求項１又は２に記載の糖質分解酵素。 having the amino acid sequence of (a) or (b);
having α-D-arabinofuranosidase activity;
A carbohydrate-degrading enzyme according to claim 1 or 2.
カラメル化重合物を脱水縮合し、アンヒドロ糖を生成する、
請求項１から３のいずれか一項に記載の糖質分解酵素。 having the amino acid sequence of (a) or (b);
Caramelized polymer is dehydrated and condensed to produce anhydrosugars.
A carbohydrate-degrading enzyme described in any one of claims 1 to 3.
前記処理ステップで生成した分解物、重合物及び単糖の少なくとも１つを定量する定量ステップと、
を含む、プレバイオティクスの評価方法。 A processing step of treating a sample with the carbohydrate degrading enzyme according to any one of claims 1 to 4;
A quantification step of quantifying at least one of a decomposition product, a polymer product, and a monosaccharide produced in the treatment step;
A method for evaluating prebiotics, including:
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