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JP7488323B2 - 抗ｌａｇ－３抗体および組成物 - Google Patents

抗ｌａｇ－３抗体および組成物 Download PDF

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JP7488323B2
JP7488323B2 JP2022195869A JP2022195869A JP7488323B2 JP 7488323 B2 JP7488323 B2 JP 7488323B2 JP 2022195869 A JP2022195869 A JP 2022195869A JP 2022195869 A JP2022195869 A JP 2022195869A JP 7488323 B2 JP7488323 B2 JP 7488323B2
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ギュンター・ローラン・ガラー
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Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が引用により本明細書に取り込まれる配列表を含む。２０１７年１０月５日に作成された配列表の電子コピーの名称は022675_WO057_SL.txtであり、そのサイズは６４，６９３バイトである。
ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３；ＣＤ２２３としても知られている）は、免疫チェックポイント受容体として機能する免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質である。成熟タンパク質は、４つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む５０３アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質である。これは様々な種類の細胞（活性化Ｔ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞および形質細胞様樹状細胞を含む）上に発現する。ＬＡＧ－３の配列データ、エクソン／イントロン構造および染色体内分布に関する情報は、ＬＡＧ－３がＣＤ４に密接に関連していることを示す。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ－３はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、ＣＤ４と比較してより高い親和性で異なる部位に結合する。
ＬＡＧ－３は、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１と類似の様式でＴ細胞増殖、活性化および恒常性を制御すると考えられている共抑制性受容体である。細胞外ドメインとのリガンド結合により、ＬＡＧ－３は細胞質ドメインを介したその後のシグナル伝達を通してその効果を発揮する。最も良く特徴付けられているＬＡＧ－３のリガンドはＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）であるが、他のＬＡＧ－３リガンド（ＬＳＥＣｔｉｎを含む）も記述されている。
ＬＡＧ－３は古典的なＩＴＩＭまたはＩＴＳＭモチーフを有さないが、Ｔ細胞活性に対する阻害効果を達成するのに不可欠であると考えられている保存されたＫＩＥＥＬＥモチーフ（配列番号７３）を有する。ＬＡＧ－３がＴ細胞活性に影響を与える正確な機構はほとんど解明されていない。ＬＡＧ－３は、活性化Ｔ細胞が細胞周期の増殖期に移行するのを阻止し、Ｓ期における細胞の蓄積をもたらすことによってＴ細胞増殖を阻害する。ＬＡＧ－３はまた、制御性Ｔ細胞の抑制活性の増強および樹状細胞機能の調節に関与していると考えられている。がん細胞はＭＨＣＩＩの発現を上方制御する能力を有し、ＭＨＣＩＩはエフェクターＴ細胞上のＬＡＧ－３に結合し、したがってそれらの活性を阻害し、腫瘍免疫回避を誘導する。
免疫調節物質としてのＬＡＧ－３の重要な役割を考慮すると、がんおよび免疫系の特定の障害を処置するためにＬＡＧ－３を標的とする新規な改良された免疫療法が必要とされている。
本発明は、ＬＡＧ－３を標的とする新規組換え抗体、１以上のこれらの抗体を含む医薬組成物、ならびに患者の免疫の増強、および組織（皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓など）から生じたがんの処置のための抗体および医薬組成物の使用に関する。このようながんのための現在利用可能な処置（抗体の処置を含む）と比較して、本発明の抗体は単独または別のがん治療法（別の免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体など）との組合せのいずれにおいても優れた臨床応答を提供し得ることが想定される。
ある実施態様において、本発明は抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗ＬＡＧ－３抗体は、本明細書で抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２もしくは１５０１１と呼ばれる抗体のうちいずれかまたはその変異体であり、変異体は例えば異なるアイソタイプまたはアイソタイプサブクラスであり得、かつ／または抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１と比較して親抗体の抗原結合特異性を失わない特定の最小限のアミノ酸変化を含み得る。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、重鎖（Ｈ）ＣＤＲ１～３および軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ１～３が抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３と同一またはそれに由来している抗体と、ヒトＬＡＧ－３への結合について競合する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、重鎖（Ｈ）ＣＤＲ１～３および軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ１～３が抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３と同一またはそれに由来している抗体と、同一のヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＨ－ＣＤＲ３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ１～３配列をそれぞれ含むＨ－ＣＤＲ１～３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＬ－ＣＤＲ３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＬ－ＣＤＲ１～３配列をそれぞれ含むＬ－ＣＤＲ１～３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ３およびＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１と、ヒトＬＡＧ－３への結合について競合する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１と、同一のヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３７、４３、４６、５０、５５、５８または６４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ－ＣＤＲ）３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３５～３７；４１～４３；３５、４２および４６；４８～５０；５３～５５；５６～５８；または６２～６４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ－ＣＤＲ１～３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨを有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７を含むＶＨを有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７のＶＨアミノ酸配列および配列番号３０の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４０、５２、６１または６７のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ－ＣＤＲ）３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３８～４０；４４、４５および４０；４４、４７および４０；５１、４７および５２；５９～６１；または６５～６７のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬ－ＣＤＲ１～３を含む。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４または２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４または２８を含むＶＬを有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４または２８のＶＬアミノ酸配列および配列番号３２または３４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、それぞれ配列番号３７および４０；４３および４０；４６および４０；５０および５２；５５および４０；５８および６１；または６４および６７のＨ－ＣＤＲ３およびＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は以下のＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む：
ａ）それぞれ配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０；
ｂ）それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４０；
ｃ）それぞれ配列番号３５、４２、４６、４４、４７および４０；
ｄ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、５１、４７および５２；
ｅ）それぞれ配列番号５３、５４、５５、４４、４５および４０；
ｆ）それぞれ配列番号５６、５７、５８、５９、６０および６１；または
ｇ）それぞれ配列番号６２、６３、６４、６５、６６および６７。
ある実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体はまたはその抗原結合部分は：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する；
ｂ）配列番号７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する；
ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号１２のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する；
ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する；
ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号２０のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する；
ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する；または
ｇ）配列番号２７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＨ、および配列番号２８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一であるＶＬを有する。
ある実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する；
ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する；
ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する；
ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する；
ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する；
ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する；または
ｇ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＨ、および配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＶＬを有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は：
ａ）配列番号４および３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号３および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する；
ｂ）配列番号８および３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号７および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する；
ｃ）配列番号１２および３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号１１および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する；
ｄ）配列番号１６および３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号１５および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する；
ｅ）配列番号２０および３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号１９および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する；
ｆ）配列番号２４および３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号２３および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する；または
ｇ）配列番号２８および３２のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＬＣ；ならびに配列番号２７および３０のアミノ酸配列を含むか、またはからなるＨＣを有する。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、以下の性質のうち少なくとも１つを有する：
ａ）２０μｇ／ｍＬの濃度において、フローサイトメトリーによる競合アッセイによって決定された場合に、ヒトＬＡＧ－３のＡ３７５細胞上のヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を陰性対照抗体と比較して８５％よりも大きく減少させる；
ｂ）２０μｇ／ｍＬの濃度において、フローサイトメトリーによる競合アッセイによって決定された場合に、ヒトＬＡＧ－３のＡ３７５細胞上のヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を陰性対照抗体と比較して３５％～８５％減少させる；
ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞上に発現しているヒトＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞上に発現しているヒトＭＨＣクラスＩＩとの間の結合を遮断する；
ｄ）フローサイトメトリーによって測定された場合、ヒトＬＡＧ－３に０．１ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する；
ｅ）フローサイトメトリーによって測定された場合、カニクイザルＬＡＧ－３に０．３ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する；
ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合、ヒトＬＡＧ－３に３．０×１０－８以下のＫＤで結合する；
ｇ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合、カニクイザルＬＡＧ－３に１．５×１０－７以下のＫＤで結合する；
ｈ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合、マウスＬＡＧ－３に３．５×１０－８以下のＫＤで結合する；
ｉ）ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で処理されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ－２産生を刺激する；
ｊ）ヒトＴ細胞中のＬＡＧ－３の細胞内レベルを減少させる；
ｋ）ヒトＴ細胞の培養物中のＬＡＧ－３の溶解レベルを減少させる
ｌ）インビボ(in vivo)において腫瘍増殖の退縮を誘導する；
ｍ）インビボにおいて腫瘍増殖を遅延させる；および
ｎ）抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５と同一のヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合しない。
このような抗体の例には、限定されないが、抗体１５６４６（少なくともｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉおよびｎの性質を有する）、抗体１５５３２（少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｋ、ｍおよびｎの性質を有する）、抗体１５７２３（少なくともｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉおよびｎの性質を有する）、抗体１５５９５（少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉおよびｎの性質を有する）、抗体１５４３１（少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉおよびｎの性質を有する）、抗体１５５７２（少なくともｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉおよびｎの性質を有する）、および抗体１５０１１（少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍおよびｎの性質を有する）が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗ＴＩＭ－３抗体または抗原結合部分は、前記性質のうち少なくとも１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つを有する。いくつかの実施態様において、本発明の抗ＴＩＭ－３抗体または抗原結合部分は、少なくともｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉおよびｎの性質；少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、ｊ、ｋ、ｍおよびｎの性質；少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｉおよびｎの性質；少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉおよびｎの性質；少なくともｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉおよびｎの性質；または少なくともａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍおよびｎの性質を有する。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、抗体１５０１１、１５５７２および／または１５４３１とヒトＬＡＧ－３への結合について競合する。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分はヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合し、このエピトープは以下を有する：
ａ）配列番号６８のアミノ酸残基Ｈ８５、Ｐ８６、Ａ８７、Ｐ８９、Ｓ９１、Ｗ９２およびＧ９３；
ｂ）配列番号６８のアミノ酸残基Ａ４０、Ｑ４１、Ｐ４３、Ｐ４６、Ｐ４９、Ｄ５２、Ｔ６２、Ｑ６４、Ｈ６５、Ｑ６６、Ｐ６７、Ｄ６８、Ｇ９３、Ｐ９４、Ｐ９６、Ｒ９８、Ｙ９９、Ｔ１００、Ｖ１０１、Ｐ１０６、Ｇ１０７、Ｒ１１９、Ｅ１２４、Ｒ１２９、Ｇ１３０、Ｄ１３１、Ｓ１３３、Ｒ１３７、Ｐ１３８、Ｄ１４３、Ｒ１４８およびＲ１６３；
ｃ）配列番号６８のアミノ酸残基Ａ４０、Ｑ４１、Ｐ４３、Ｐ４６、Ｐ４９、Ｄ５２、Ｔ６２、Ｑ６４、Ｈ６５、Ｑ６６、Ｐ６７、Ｄ６８、Ｐ９６、Ｙ９９、Ｔ１００、Ｖ１０１、Ｐ１０６、Ｇ１０７、Ｒ１１９、Ｅ１２４、Ｒ１２９、Ｇ１３０、Ｄ１３１、Ｓ１３３、Ｒ１３７、Ｐ１３８、Ｄ１４３、Ｒ１４８およびＲ１６３；または
ｄ）配列番号６８のアミノ酸残基Ｇ１０７、Ｌ１０９、Ｒ１１０およびＳ１１１。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、配列番号６８のアミノ酸残基９８～１０５を有するエピトープに結合する。このような抗体の例には、限定されないが、抗体１５５３２、１５４３１、１５５７２および１５０１１が含まれる。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は以下を有するエピトープに結合する：
ａ）配列番号６８のアミノ酸残基７８～１０５および１２３～１３１；
ｂ）配列番号６８のアミノ酸残基２３～３０、４０～６６、８８～１０５、１２３～１３７および１４８～１５２；または
ｃ）配列番号６８のアミノ酸残基２３～３０、４０～６６、９８～１０５、１１８～１３７および１４８～１６１。
いくつかの実施態様において、本発明の抗体はアイソタイプＩｇＧ（例えばアイソタイプＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ２）である。ある実施態様において、抗体はＦｃ領域に少なくとも１つの変異を含む。特定の実施態様において、抗体は重鎖アミノ酸位置２２８、２３４および２３５（これらはＩＭＧＴ(登録商標)ナンバリングスキームに従って番号付けされている）のうち１つ以上に変異を含む。例えば、２３４位および２３５位におけるアミノ酸残基の一方または両方がＬｅｕからＡｌａに変異されてい得、かつ／または２２８位のアミノ酸残基がＳｅｒからＰｒｏに変異されてい得る。
別の態様において、本発明は、（任意に、抗がん抗体治療法などのさらなる治療法を伴う）本明細書に記載の少なくとも１つ（例えば１つ）の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、そのような単離された核酸分子を含むベクターを提供し、前記ベクターは発現制御配列をさらに含み得る。
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む宿主細胞を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分を作製する方法を提供し、これは本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列および軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を抗体または部分の発現に適した条件下で培養すること、および得られた抗体または部分を単離することを含む。
本発明はまた、多特異性（例えば二重特異性）結合分子を提供し、この分子は、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体の抗原結合部分、および別の異なる抗体（（例えば本明細書に記載の）別の抗ＬＡＧ－３抗体、または異なるタンパク質（別の免疫チェックポイントタンパク質、がん抗原またはその活性ががんなどの疾患状態を媒介する別の細胞表面分子など）を標的とする抗体など）の抗原結合部分を含む。
本発明はまた、ＬＡＧ－３関連障害に罹患している患者を処置する方法を提供し、この方法は前記患者に、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、医薬組成物または二重特異性結合分子を投与することを含む。他の指示がない限り、本明細書における患者はヒト患者を指す。
本発明はまた、患者の免疫を増強する方法を提供し、この方法は前記患者に、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、医薬組成物または二重特異性結合分子を投与することを含む。
本発明はさらに、患者のがんを処置する方法を提供し、この方法は前記患者に、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、医薬組成物または二重特異性結合分子を投与することを含む。いくつかの実施態様において、がんは、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓から選択される組織から生じる。ある実施態様において、がんは、線維肉腫、非小細胞肺がん、黒色腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫または大腸がんである。
上記のあらゆる方法は、例えば、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＬＡＧ－３経路阻害剤または放射線療法の投与をさらに含み得る。いくつかの実施態様において、本方法は、レチノイン酸、フェニルブチレート、オールトランスレチノイン酸および／または活性型ビタミンＤの投与をさらに含む。
本発明はさらに、ＬＡＧ－３関連障害に罹患している患者を処置し、患者のがんを処置し、かつ／またはそれを必要とする患者の免疫を増強する薬物の製造のための、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分を含む抗体組成物の使用を提供する。
本発明はさらに、ＬＡＧ－３関連障害に罹患している患者を処置し、患者のがんを処置し、かつ／またはそれを必要とする患者の免疫を増強する本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分を含む製品を提供し、ここで前記製品は、ＬＡＧ－３関連障害に罹患している患者を処置し、患者のがんを処置し、かつ／またはそれを必要とする患者の免疫を増強するのに適している。
図１Ａ～１Ｃは、実施例２に記載されるように作製された抗体の代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。図１Ａ：ヒトＬＡＧ－３遺伝子導入細胞に特異的に結合する抗体クローン。 図１Ａ～１Ｃは、実施例２に記載されるように作成された抗体の代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。図１Ｂ：ＣＨＯ－Ｓ細胞に非特異的に結合する抗体クローン。 図１Ａ～１Ｃは、実施例２に記載されるように作成された抗体の代表的なフローサイトメトリードットプロットを示す。図１Ｃ：スクリーニングに使用されたいかなる細胞集団にも結合しない抗体クローン。
図２は、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体で処理した後のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＬ－２産生のレベルを示す。
図３は、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体で処理した後のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＬ－２産生のレベルを示す。各点は単一のＰＢＭＣドナーからのＩＬ－２分泌のレベルを表す。
図４は、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体で処理した後のＬＡＧ－３－ＭＨＣクラスＩＩ遮断アッセイにおける発光のレベルを示す。データを平均値±ＳＥＭとして表す。
図５は、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体で処理した後のＬＡＧ－３遺伝子導入Ｔ細胞株からの溶解物および上清におけるＬＡＧ－３のレベルを示す。データを平均値±ＳＥＭとして表す。アスタリスクは１５５３２と参照抗体類似体との間の統計的有意差を示す（＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
図６は、２つの同系マウス腫瘍モデルにおける抗体１５０１１のインビボ有効性を示す。
図７は、ＮＯＧマウスの免疫系をヒトＰＢＭＣで再構成し、マウスにヒトメラノーマＡ３７５細胞を移植した半ヒト化異種移植腫瘍モデルにおける抗体１５５３２のインビボ有効性を示す。
図８は、１３種の抗ＬＡＧ－３抗体のパネルの結合競合分析によって同定されたエピトープ群（エピトープビン(epitope bin)）の概要を示す。黒線で結ばれた抗体は両方向（リガンドおよび分析物）の交差遮断活性を示す。点線で結ばれた抗体は、抗体が分析物としてテストされた場合にのみ遮断される一方向の遮断を示す。抗体は、他の抗ＬＡＧ－３抗体との競合パターンに従って分類されている。
図９は、リガンド抗体のエピトープ多様性のクラスター解析を示す。ｘ軸の０より大きな値に分岐点を有する抗体は、パネル内の他の抗体のＬＡＧ－３結合についての競合に基づいて異なるエピトープを有する。
本発明は、ヒト患者（がん患者など）の免疫系を増強するために使用され得る新規な抗ヒトＬＡＧ－３抗体を提供する。他の記載がない限り、本明細書において「ＬＡＧ－３」はヒトＬＡＧ－３を指す。ヒトＬＡＧ－３ポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１８６２７（ＬＡＧ３＿ＨＵＭＡＮ）（配列番号６８）として入手可能である。
本明細書における用語「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって相互接続されている２つの重（Ｈ）鎖（約５０～７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含む四量体を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨおよびＶＬドメインは、より保存された領域（「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる）の間に散在している超可変領域（「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲ（本明細書においてＨ－ＣＤＲは重鎖由来のＣＤＲを指し、Ｌ－ＣＤＲは軽鎖由来のＣＤＲを指す）および４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖または軽鎖におけるアミノ酸番号の指定は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義(Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003))；またはＫａｂａｔの定義、Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991))；Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；またはChothia et al., Nature 342:878-883 (1989)に従い得る。
用語「組換え抗体」は、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む細胞または細胞株から発現される抗体を指し、ここで前記ヌクレオチド配列は天然には細胞に関連しない。
用語「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」は、その起源または誘導の供給源のために、（１）天然状態においてそれに付随する天然で関連した成分に関連していない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、および／または（４）天然に存在しない、タンパク質、ポリペプチドまたは抗体を指す。したがって、化学合成されるか、または天然で生じる細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然で関連する成分から「単離」されている。タンパク質はまた、当分野で周知のタンパク質精製技術を用いて単離によって天然で関連する成分を実質的に含まないようにされ得る。
本明細書において、用語「生殖系列」は、親から子孫に生殖細胞を介して伝達される抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程で組換えおよび超変異イベントによって変化した成熟Ｂ細胞中の抗体をコードするヌクレオチド配列とは区別される。特定の生殖系列配列を「利用する」抗体は、その生殖系列ヌクレオチド配列またはそれが特定するアミノ酸配列と他のあらゆる生殖系列ヌクレオチドまたはアミノ酸配列よりも厳密にアラインするヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。
用語「親和性」は、抗原と抗体との間の引力の尺度を指す。抗原に対する抗体の固有の誘引性は通常、特定の抗体－抗原相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表される。抗体はＫＤが≦１ｍＭ（好ましくは≦１００ｎＭ）である場合、抗原に特異的に結合すると考えられる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））またはバイオレイヤー干渉法によって、例えばＩＢＩＳ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲシステムまたはＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ（商標）システムを用いて測定され得る。
用語「ｋｏｆｆ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。ｋｏｆｆ解離速度定数は、例えばＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって、例えばＩＢＩＳ ＭＸ９６システムを用いて測定され得る。
本明細書における用語「エピトープ」は、抗体または関連分子（二重特異性結合分子など）に特異的に結合する抗原の部分（決定基）を指す。エピトープ決定基は一般に、分子（アミノ酸または炭水化物もしくは糖側鎖など）の化学的に活性な表面基群（surface grouping）からなり、一般に特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。エピトープは「直線状」エピトープまたは「立体構造」エピトープであり得る。直線状エピトープにおいて、タンパク質（例えば抗原）と相互作用分子（抗体など）との間の全ての相互作用点はタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線上に存在する。立体構造エピトープにおいて、相互作用点は一次アミノ酸配列において互いに分離されているタンパク質上のアミノ酸残基にわたって存在する。抗原上の所望のエピトープが決定されると、そのエピトープに対する抗体を当分野で周知の技術を用いて作成できる。例えば、直線状エピトープに対する抗体は、例えば直線状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドで動物を免疫することによって作成され得る。立体構造エピトープに対する抗体は、例えば立体構造エピトープの関連するアミノ酸残基を含むミニドメインで動物を免疫することによって作成され得る。また、特定のエピトープに対する抗体は、例えば対象の標的分子（例えばＬＡＧ－３）またはその関連部分で動物を免疫し、次いでエピトープに対する結合についてスクリーニングすることによって作成され得る。
抗体が本発明の抗ＬＡＧ－３抗体と同一のエピトープに結合するか、または本発明の抗ＬＡＧ－３抗体と結合について競合するかは、当分野で公知の方法（限定されないが、競合アッセイ、エピトープビニングおよびアラニンスキャニングを含む）を用いて決定され得る。ある実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体を飽和条件下でＬＡＧ－３に結合させ、次いでテスト抗体がＬＡＧ－３に結合する能力を測定する。テスト抗体が参照抗ＬＡＧ－３抗体と同時にＬＡＧ－３に結合できる場合、テスト抗体は参照抗ＬＡＧ－３抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、テスト抗体がＬＡＧ－３に同時に結合できない場合、テスト抗体は同一のエピトープ、重複しているエピトープまたは本発明の抗ＬＡＧ－３抗体が結合するエピトープの近位にあるエピトープに結合する。この実験は、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法またはフローサイトメトリーを用いて実行され得る。抗ＬＡＧ－３抗体が別の抗ＬＡＧ－３抗体と交差競合(cross-compete)するか否かを検証するために、上述の競合法が両方向において（すなわち、公知の抗体がテスト抗体を遮断するか否かおよびその逆を決定するのに）使用され得る。そのような交差競合実験は、例えばＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ装置またはＯｃｔｅｔ（商標）システムを用いて実行され得る。
本発明の抗体と同一のエピトープに結合するか、または本発明の抗体と結合について競合する抗体は、好ましくは（例えば実施例６に記載されるフローサイトメトリーによる競合アッセイを用いて決定される）ＭＨＣＩＩ遮断活性を有する。本発明の抗体と同一のエピトープに結合するか、または本発明の抗体と結合について競合する抗体は、結合を少なくとも例えば３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％、または好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％減少させ得る。
用語「キメラ抗体」は、その最も広い意味において、ある抗体由来の１以上の領域および他の１以上の抗体由来の１以上の領域を含む抗体を指し、通常、部分的にヒト起源であり、部分的に非ヒト起源である（すなわち非ヒト動物（例えばマウス、ラットもしくは他の齧歯類、またはニワトリなどの鳥類）に部分的に由来する）抗体を指す。キメラ抗体はヒト抗抗体応答（例えばマウス抗体の場合におけるヒト抗マウス抗体応答）のリスクを減少させるため、非ヒト抗体よりも好ましい。典型的なキメラ抗体の例は、可変領域配列がマウスであり、定常領域配列がヒトであるキメラ抗体である。キメラ抗体の場合、抗体をヒト化するために非ヒト部分にさらなる変更が行われ得る。本明細書に記載のキメラ抗体は、例えばニワトリ可変領域配列およびヒト定常領域配列を有し得る。
用語「ヒト化」は、抗体が完全または部分的に非ヒト起源（例えば、対象の抗原を用いたマウスもしくはニワトリの免疫からそれぞれ得られたマウス抗体もしくはニワトリ抗体、またはそのようなマウス抗体もしくはニワトリ抗体に基づくキメラ抗体）である場合、ヒトの免疫応答を回避または最小限にするために、（特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域および定常領域における）特定のアミノ酸を交換できるという事実を指す。特定の抗体の免疫原性およびそれによるヒト抗抗体応答を正確に予測することはできないが、非ヒト抗体はヒト抗体よりもヒトにおいてより免疫原性である傾向がある。外来性（例えば齧歯類または鳥類）の定常領域がヒト起源の配列に交換されているキメラ抗体は、一般に完全に外来性起源の抗体より免疫原性が低いことが示されており、治療抗体の傾向はヒト化抗体または完全ヒト抗体に向かっている。したがって、キメラ抗体または非ヒト起源の他の抗体は、ヒトの抗抗体応答のリスクを減少させるためにヒト化され得る。
キメラ抗体について、ヒト化は通常、可変領域配列のフレームワーク領域の改変を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）の部分であるアミノ酸残基のほとんどはヒト化に関連して変化しないが、特定の場合において（例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位、アスパラギン酸異性化部位または望ましくないシステインもしくはメチオニン残基を除去するために）、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましい場合がある。Ｎ結合型グリコシル化は、オリゴ糖鎖のトリペプチド配列Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン残基への結合によって生じる。Ｎ－グリコシル化部位の除去は、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に（好ましくは保存的置換によって）変異させることによって達成され得る。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの要素に依存して生じ得る。アスパラギン残基は主に配列Ａｓｎ－Ｇｌｙ中に存在する場合、および程度は低いが他のジペプチド配列（Ａｓｎ－Ａｌａなど）中に存在する場合、特に脱アミド化されやすい。したがって、そのような脱アミド化部位（特にＡｓｎ－Ｇｌｙ）がＣＤＲ配列中に存在する場合、関与する残基のうち１つを除去するために典型的に保存的置換によってその部位を除去することが望ましい場合がある。
抗体配列のヒト化のための多数の方法が当分野で公知である；例えば、Almagro & Fransson, Front Biosci. 13:1619-1633 (2008)による総説を参照。通常使用される方法のうち１つはＣＤＲ移植法であり、これは例えばマウス由来のキメラ抗体について、マウス可変領域遺伝子に対するヒト生殖系列遺伝子対応物の同定、およびマウスＣＤＲ配列のこのフレームワークへの移植を含む。抗体の標的抗原との相互作用の特異性は、主に重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基に存在する。したがって、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間においてはるかに可変である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体－抗原相互作用の原因であるため、例えば異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特異的抗体由来のＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することによって、天然に存在する特異的抗体またはより一般的には所定のアミノ酸配列を含む任意の特異的抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現できる。結果として、非ヒト抗体を「ヒト化」し、元の抗体の結合特異性および親和性を未だ実質的に維持することが可能である。ＣＤＲ移植法はＫａｂａｔのＣＤＲの定義に基づき得るが、より最近の刊行物（Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 64:210-225 (2007)）は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）, www.imgt.org）がヒト化の結果を改善し得ることを示唆している（Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)参照）。
ＣＤＲ移植は、ＣＤＲが得られる親抗体と比較してＣＤＲ移植された抗体の結合特異性および親和性、ならびにしたがって生物活性を減少させ得る場合がある。親抗体の結合特異性および親和性を再確立するために、復帰変異（「フレームワーク修復」と呼ばれる場合がある）がＣＤＲ移植された抗体の（通常、フレームワーク領域内の）選択された位置に導入され得る。復帰変異が可能な位置は、文献および抗体データベースにおいて利用可能な情報を用いて同定され得る。復帰変異の候補となるアミノ酸残基は通常、抗体分子の表面に位置するアミノ酸残基であり、埋もれている残基または表面露出の程度が低い残基は通常変化されない。ＣＤＲ移植および復帰変異に対する代替のヒト化技術はリサーフェシング(resurfacing)であり、これは非ヒト起源の表面に露出していない残基を保持し、表面残基をヒト残基に変化させる。
特定の場合において、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために、１以上のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましい場合がある。これは「親和性成熟」として知られ、例えば抗体のヒト化が結合特異性または親和性の減少を導き、復帰変異のみでは結合特異性または親和性を十分に改善できない状況において、任意でヒト化に関連して実行され得る。様々な親和性成熟法（例えば、Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)に記載されるインビトロ(in vitro)でのスキャニング飽和変異誘発法(scanning saturation mutagenesis method)、およびWu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037-6042 (1998)の段階的インビトロ親和性成熟法）が当分野で公知である。
本明細書における抗体の用語「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えばヒトＬＡＧ－３またはその一部）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上の部分またはフラグメントを指す。完全長抗体の特定のフラグメントは、抗体の抗原結合機能を実施できることが示されている。用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結している２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；ならびに（ｖｉ）抗原に特異的に結合できる単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、これらを単一のタンパク質鎖として作成できる合成リンカーによって組換え法を用いて連結され得、ＶＬおよびＶＨドメインは対を形成して一価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する。また、ＶＨおよび／またはＶＬを含む抗原結合分子も本発明に含まれる。ＶＨの場合、分子はまた、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域のうち１つ以上を含み得る。このような単鎖抗体もまた、抗体の用語「抗原結合部分」に包含されることが意図される。単鎖抗体の他の形態（ダイアボディなど）もまた包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同一の鎖上の２つのドメイン間において対形成するには短すぎるリンカーを用いることで、ドメインを別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作製する二価の二重特異性抗体である。
抗体部分（ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）は、通常の技術（抗体全体のパパインまたはペプシン消化など）を用いて抗体全体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分およびイムノアドヘシン分子は（例えば本明細書に記載の）標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて取得され得る。
抗ＬＡＧ－３抗体のクラス（アイソタイプ）およびサブクラスは、当分野で公知のあらゆる方法によって決定され得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定され得る。このような抗体は市販されている。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよび他の技術によって決定され得る。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域の全部または一部を配列決定すること、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラスおよびサブクラスの公知のアミノ酸配列と比較すること、ならびに抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定され得る。
他の指示がない限り、本開示において言及されるあらゆる抗体アミノ酸残基の番号は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従う番号である。
抗ＬＡＧ－３抗体
本発明は、ＬＡＧ－３に対する抗体およびその抗原結合部分を提供する。特定の実施態様において、本明細書に開示される抗体は、ヒトイディオタイプを有する抗体を作成できるトランスジェニックラットから作成されたヒト抗体である。別の実施態様において、抗体はニワトリＣＤＲ配列およびヒトフレームワーク領域を含むニワトリ由来キメラ抗体であり、ここでフレームワーク領域はヒト化されている。
本発明の新規な抗ＬＡＧ－３抗体の利点の１つは、ＩＬ－２産生の増加によって測定されるように、この抗体がＴ細胞の活性を増強できることである（例えば実施例７参照）。いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体は、ＬＡＧ－３とその推定リガンド（ＭＨＣＩＩおよびＬＳＥＣｔｉｎなど）との相互作用を遮断できると考えられる。抗体は、（例えば実施例６に示されるように）リガンド結合領域の遮断によって、またはＬＡＧ－３インターナリゼーションの誘導（これは実施例９に示される結果の背景にある可能性がある作用機構として想定される）によって、これを直接的に達成し得る。本発明の抗ＬＡＧ－３抗体の別の潜在的な利点は、「ＬＡＬＡ」変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を有する抗体における低いレベルの二次のエフェクター機能であり、これはヒトＦｃｇＲ（Ｆｃガンマ受容体）への重要な抗体結合を妨げ、したがってエフェクターＴ細胞の枯渇を妨げる。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３７、４３、４６、５０、５５、５８および６４のうちいずれかと配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３７、４３、４６、５０、５５、５８および６４のうちいずれかと少なくとも９２％（少なくとも９５％、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７のうちいずれかと配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７のうちいずれかと少なくとも９２％（少なくとも９５％、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）重鎖可変領域（ＶＨ）を有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７のうちいずれかと配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７のうちいずれかと少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）重鎖可変領域（ＶＨ）；および配列番号３０と配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３０と少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）重鎖定常領域を有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３または２７のいずれかのＶＨアミノ酸配列、および配列番号３０の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）を有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４０、５２、６１および６７のうちいずれかと配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号４０、５２、６１および６７のうちいずれかと少なくとも９２％（少なくとも９５％、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４または２８のうちいずれかの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４または２８のうちいずれかと少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）ＶＬを有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０または２４のうちいずれかの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号４、８、１２、１６、２０または２４のうちいずれかと少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）ＶＬ；および配列番号３４と配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３４と少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）軽鎖定常領域アミノ酸配列を有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号２８の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号２８と少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）ＶＬ；および配列番号３２と配列が少なくとも９０％同一である（例えば、配列番号３２と少なくとも９２％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％など）同一である）軽鎖定常領域アミノ酸配列を有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０または２４のうちいずれかおよび配列番号３４を含む軽鎖を有する。
別の実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、配列番号２８および配列番号３２を含む軽鎖を有する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、上述の重鎖のいずれかおよび上述の軽鎖のいずれかを含む。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、以下のＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む：
ａ）それぞれ配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０；
ｂ）それぞれ配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４０；
ｃ）それぞれ配列番号３５、４２、４６、４４、４７および４０；
ｄ）それぞれ配列番号４８、４９、５０、５１、４７および５２；
ｅ）それぞれ配列番号５３、５４、５５、４４、４５および４０；
ｆ）それぞれ配列番号５６、５７、５８、５９、６０および６１；または
ｇ）それぞれ配列番号６２、６３、６４、６５、６６および６７。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＨ－ＣＤＲ３およびＬ－ＣＤＲ３を含む：
ａ）それぞれ配列番号３７および４０；
ｂ）それぞれ配列番号４３および４０；
ｃ）それぞれ配列番号４６および４０；
ｄ）それぞれ配列番号５０および５２；
ｅ）それぞれ配列番号５５および４０；
ｆ）それぞれ配列番号５８および６１；または
ｇ）それぞれ配列番号６４および６７。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＶＨおよびＶＬを含む：
ａ）それぞれ配列番号３および４；
ｂ）それぞれ配列番号７および８；
ｃ）それぞれ配列番号１１および１２；
ｄ）それぞれ配列番号１５および１６；
ｅ）それぞれ配列番号１９および２０；
ｆ）それぞれ配列番号２３および２４；または
ｇ）それぞれ配列番号２７および２８。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬを含む：
ａ）それぞれ配列番号３および４；
ｂ）それぞれ配列番号７および８；
ｃ）それぞれ配列番号１１および１２；
ｄ）それぞれ配列番号１５および１６；
ｅ）それぞれ配列番号１９および２０；
ｆ）それぞれ配列番号２３および２４；または
ｇ）それぞれ配列番号２７および２８。
いくつかの実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は以下を含む：
ａ）配列番号３および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号４および３４のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｂ）配列番号７および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号８および３４のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１１および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１２および３４のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号１５および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号１６および３４のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号１９および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２０および３４のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｆ）配列番号２３および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４および３４のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｇ）配列番号２７および３０のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２８および３２のアミノ酸配列を含むＬＣ。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のＶＨおよびＶＬとアミノ酸配列がそれぞれ少なくとも９０％同一であるＶＨおよびＶＬを含む。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２または１５０１１のそれぞれＶＨおよびＶＬであるＶＨおよびＶＬを含む。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体は、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２もしくは１５０１１、または前記抗体と同一のアミノ酸配列を含む抗体である。
本発明はまた、ヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合する抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分を提供し、このエピトープは以下を有する：
ａ）配列番号６８のＨ８５、Ｐ８６、Ａ８７、Ｐ８９、Ｓ９１、Ｗ９２およびＧ９３から選択される１、２、３、４、５、６または全７個のアミノ酸残基（例えば抗体１５５３２）；
ｂ）配列番号６８のＡ４０、Ｑ４１、Ｐ４３、Ｐ４６、Ｐ４９、Ｄ５２、Ｔ６２、Ｑ６４、Ｈ６５、Ｑ６６、Ｐ６７、Ｄ６８、Ｇ９３、Ｐ９４、Ｐ９６、Ｒ９８、Ｙ９９、Ｔ１００、Ｖ１０１、Ｐ１０６、Ｇ１０７、Ｒ１１９、Ｅ１２４、Ｒ１２９、Ｇ１３０、Ｄ１３１、Ｓ１３３、Ｒ１３７、Ｐ１３８、Ｄ１４３、Ｒ１４８およびＲ１６３から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または全３２個のアミノ酸残基（例えば抗体１５４３１）；
ｃ）配列番号６８のＡ４０、Ｑ４１、Ｐ４３、Ｐ４６、Ｐ４９、Ｄ５２、Ｔ６２、Ｑ６４、Ｈ６５、Ｑ６６、Ｐ６７、Ｄ６８、Ｐ９６、Ｙ９９、Ｔ１００、Ｖ１０１、Ｐ１０６、Ｇ１０７、Ｒ１１９、Ｅ１２４、Ｒ１２９、Ｇ１３０、Ｄ１３１、Ｓ１３３、Ｒ１３７、Ｐ１３８、Ｄ１４３、Ｒ１４８およびＲ１６３から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または全２９個のアミノ酸残基（例えば抗体１５５７２）；または
ｄ）配列番号６８のＧ１０７、Ｌ１０９、Ｒ１１０およびＳ１１１から選択される１、２、３または全４個のアミノ酸残基（例えば抗体１５０１１）。
本発明はまた、残基９８～１０５を有するヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。いくつかの実施態様において、抗体または抗原結合部分はヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合し、このエピトープは以下を有する：
ａ）配列番号６８の残基７８～１０５および１２３～１３１から選択される２または３個のアミノ酸セグメント（例えば抗体１５５３２）；
ｂ）配列番号６８の残基２３～３０、４０～６６、８８～１０５、１２３～１３７および１４８～１５２から選択される１、２、３、４または５個のアミノ酸セグメント（例えば抗体１５４３１）；
ｃ）配列番号６８の残基２３～３０、４０～６６、９８～１０５、１１８～１３７および１４８～１６１から選択される１、２、３、４または５個のアミノ酸セグメント（例えば抗体１５５７２）；または
ｄ）配列番号６８のアミノ酸残基９８～１０５（例えば抗体１５０１１）。
本発明はまた、配列番号６８の残基２３～３０および４０～６６を有するヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。いくつかの実施態様において、エピトープは配列番号６８の残基８８～１０５、１２３～１３７および／または１４８～１５２をさらに有する。いくつかの実施態様において、エピトープは配列番号６８の残基９８～１０５、１１８～１３７および１４８～１６１をさらに有する。
本発明はまた、１５５３２、１５６４６、１５７２３、１５５９５、１５４３１、１５５７２および１５０１１からなる群から選択される抗体と同一のエピトープとの結合について競合もしくは交差競合するか、または該エピトープに結合する抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分は、抗体２５Ｆ７－ＬＡＧ３．５と同一のヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合しない。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分は、ＩＧＨＶ４－３４、ＩＧＨＶ１－２４、ＩＧＨＶ６－１、ＩＧＨＶ４－３９およびＩＧＨＶ３－２３からなる群から選択されるヒト重鎖生殖系列遺伝子を利用する。ある実施態様において、重鎖生殖系列遺伝子は、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分における対応する重鎖配列と少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。ある実施態様において、前記重鎖生殖系列遺伝子のフレームワーク領域配列は、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分における対応する重鎖フレームワーク領域配列と少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分は、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＫＶ１－５およびＩＧＬＶ３－１９からなる群から選択されるヒト軽鎖生殖系列遺伝子を利用する。ある実施態様において、軽鎖生殖系列遺伝子は、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分における対応する軽鎖配列と少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。ある実施態様において、前記軽鎖生殖系列遺伝子のフレームワーク領域配列は、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分における対応する軽鎖フレームワーク領域配列と少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
特定の実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分は、上記のヒト重鎖生殖系列遺伝子およびヒト軽鎖生殖系列遺伝子の任意の組み合わせ（例えば、ＩＧＨＶ４－３４およびＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＨＶ１－２４およびＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＨＶ６－１およびＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＨＶ４－３９およびＩＧＫＶ１－５、またはＩＧＨＶ３－２３およびＩＧＬＶ３－１９）を利用する。いくつかの実施態様において、重鎖および軽鎖生殖系列遺伝子は、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分における対応する重鎖配列および軽鎖配列とそれぞれ少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。ある実施態様において、前記重鎖および軽鎖生殖系列遺伝子のフレームワーク領域配列は、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分における対応する重鎖および軽鎖フレームワーク領域配列とそれぞれ少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、例えば０．２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０９ｎＭ以下、０．０８ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下または０．０４ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＬＡＧ－３に結合し得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、例えば０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０９ｎＭ以下、０．０８ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０４ｎＭ以下または０．０３ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＬＡＧ－３に結合し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、例えば０．１ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＬＡＧ－３に結合し得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、例えば０．３ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＬＡＧ－３に結合し得る。特定の実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、例えば０．１ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＬＡＧ－３に結合し得、かつ例えば０．３ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＬＡＧ－３に結合し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、リガンド（ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）またはＬＳＥＣｔｉｎなど）のＬＡＧ－３への結合を阻害し得る。例えば、２０μｇ／ｍＬにおいて、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は陰性対照抗体存在下における結合と比較して、ＬＡＧ－３のＭＨＣＩＩへの結合を少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％減少させ得る。ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合タンパク質は、陰性対照と比較してＬＡＧ－３のＭＨＣＩＩへの結合を８５％よりも大きく減少させ得る。ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合タンパク質は、陰性対照と比較してＬＡＧ－３のＭＨＣＩＩへの結合を約３５％～８５％減少させ得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは（例えば、０．１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬの濃度において）、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞上に発現されているヒトＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞上に発現されているヒトＭＨＣクラスＩＩ）との間の結合を遮断し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５．０×１０－８以下、４．０×１０－８以下、３．０×１０－８以下、２．０×１０－８以下、１．０×１０－８以下、９．０×１０－９以下、８．０×１０－９以下、７．０×１０－９以下、６．０×１０－９以下、５．０×１０－９以下、４．０×１０－９以下、３．０×１０－９以下、２．０×１０－９以下または１．０×１０－９以下のＫＤでヒトＬＡＧ－３に結合し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、１．５×１０－７以下、１．０×１０－７以下、９．０×１０－８以下、８．０×１０－８以下、７．０×１０－８以下、６．０×１０－８以下、５．０×１０－８以下、４．０×１０－８以下、３．０×１０－８以下、２．０×１０－８以下または１．０×１０－８以下のＫＤでカニクイザルＬＡＧ－３に結合し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、表面プラズモン共鳴によって測定された場合、５．０×１０－８以下、４．５×１０－８以下、４．０×１０－８以下、３．５×１０－８以下または３．０×１０－８以下のＫＤでマウスＬＡＧ－３に結合し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、（例えばＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの）ＩＬ－２産生を刺激し得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、例えばヒトＴ細胞株（ＬＡＧ－３を過剰発現するヒトＴ細胞株など）において、ＬＡＧ－３の細胞内レベルおよび／または溶解レベルを減少させ得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、インビボにおいて腫瘍増殖の退縮を誘導し得、かつ／または腫瘍増殖を遅延させ得る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分のいずれかは、抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５とは異なるヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合し得る。
ある実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分の投与は、Ｔ細胞を活性化し得、抗腫瘍活性の増強を生じ得る。
本明細書に記載の方法によって得られた抗ＬＡＧ－３抗体のクラスは、別のクラスまたはサブクラスに変化またはスイッチされ得る。本発明のある態様において、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、それぞれＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列を含まないように当分野で周知の方法を用いて単離される。ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、異なるクラスの免疫グロブリン分子由来のＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列にそれぞれ動作可能に連結される。これは、上述されるＣＬ鎖またはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成され得る。例えば、元々ＩｇＭであった抗ＬＡＧ－３抗体はＩｇＧにクラススイッチされ得る。さらに、クラススイッチはあるＩｇＧサブクラスを別のサブクラス（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２）に変換するのに使用され得る。κ軽鎖定常領域は、例えばλ軽鎖定常領域に変化され得る。所望のＩｇアイソタイプを有する本発明の抗体を産生する好ましい方法は、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖をコードする核酸分子および抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖をコードする核酸分子を単離する工程、重鎖の可変領域を得る工程、重鎖の可変領域を所望のアイソタイプの重鎖の定常領域に連結する工程、細胞内に軽鎖および連結した重鎖を発現させる工程、ならびに所望のアイソタイプを有する抗ＬＡＧ－３抗体を回収する工程を含む。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ分子であり得るが、通常、ＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）である。ある実施態様において、抗体はＩｇＧ１である。別の実施態様において、抗体はＩｇＧ２である。ある実施態様において、抗体はＩｇＧ１である。別の実施態様において、抗体はＩｇＧ２である。ある実施態様において、本明細書に記載されるＬＡＧ－３エピトープに結合する本発明のＩｇＧ１抗体は、ＬＡＧ－３機能を調整（例えば阻害）する優れた活性を提供し、がん処置または免疫賦活性効果を達成する。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの変異を含み得る。多数の異なるＦｃ変異が公知であり、これらの変異はエフェクター機能の変化を与える。例えば、多くの場合（例えばリガンド／受容体相互作用が望ましくない場合、または抗体－薬物コンジュゲートの場合）、エフェクター機能を減少または除去することが望ましい。
ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、エフェクター機能を減少させる少なくとも１つの変異をＦｃ領域に含む。エフェクター機能を低減させるために変異させることが有利であり得るＦｃ領域のアミノ酸位置は、２２８、２３３、２３４および２３５位のうち１つ以上を含む（アミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って番号付けされている）。
ある実施態様において、２３４位および２３５位のアミノ酸残基の一方または両方が（例えばＬｅｕからＡｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）に）変異され得る。これらの変異は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を減少させる。さらにまたはあるいは、２２８位のアミノ酸残基が（例えばＰｒｏに）変異され得る。いくつかの実施態様において、２３３位のアミノ酸残基が（例えばＰｒｏに）変異され得、２３４位のアミノ酸残基が（例えばＶａｌに）変異され得、かつ／または２３５位のアミノ酸残基が（例えばＡｌａに）変異され得る。アミノ酸位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って番号付けされている。
いくつかの実施態様において、抗体がＩｇＧ４サブクラスである場合、抗体は変異Ｓ２２８Ｐを含み得（すなわち２２８位にプロリンを有し得）、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングスキームに従って番号付けされている。この変異は、望ましくないＦａｂアーム交換を減少させることが知られている。
ある実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成される、より大きいイムノアドヘシン分子の一部であり得る。そのようなイムノアドヘシンの例には、４量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995))、ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)）が含まれる。他の例には、抗体由来の１以上のＣＤＲを分子内に共有結合または非共有結合のいずれかによって組み込み、この分子を対象の抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンにすることが含まれる。そのような実施態様において、ＣＤＲは、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれ得、別のポリペプチド鎖に共有結合され得、または非共有結合によって組み込まれ得る。
別の実施態様において、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ＬＡＧ－３抗体の全部または一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンが作製され得る。ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体の可変領域のみがポリペプチドに連結される。ある実施態様において、抗ＬＡＧ－３抗体のＶＨドメインは第一のポリペプチドに連結され、抗ＬＡＧ－３抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成し得るように第一のポリペプチドに結合する第二のポリペプチドに連結される。別の好ましい実施態様において、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用し得るように、ＶＨドメインはリンカーによってＶＬドメインから分離されている（例えば、単鎖抗体）。ＶＨ－リンカー－ＶＬ抗体は、対象のポリペプチドに連結される。さらに、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結している融合抗体が作製され得る。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価もしくは多価抗体を作製したい場合、または二重特異性抗体を作製したい場合に有用である。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨおよびＶＬ配列がフレキシブルリンカーによって結合されたＶＬおよびＶＨドメインを含む連続する一本鎖タンパク質として発現され得るように、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする（例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３（配列番号７４）をコードする）別のフラグメントに動作可能に連結される。例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); およびMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照。単鎖抗体は、１つのＶＨおよびＶＬのみを使用する場合、一価であり得る；２つのＶＨおよびＶＬを使用する場合、二価であり得る；または、３つ以上のＶＨおよびＶＬを使用する場合、多価であり得る。例えば、ヒトＬＡＧ－３および別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体または多価抗体が作製され得る。
他の実施態様において、他の修飾抗体が、抗ＬＡＧ－３抗体をコードする核酸分子を用いて調製され得る。例えば、「カッパボディ(kappa body)」（Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)）、「ミニボディ」（Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994)）、「ダイアボディ」（Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)）、または「ジャヌシン(Janusin)」（Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)およびTraunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)）が本明細書の教示に従って標準的な分子生物学技術を用いて調製され得る。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分は誘導体化され得、または別の分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。一般に、抗体またはその部分は、ＬＡＧ－３結合が誘導体化または標識化によって不利な影響を受けないように誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載のヒト抗ＬＡＧ－３抗体のインタクトな形態および修飾された形態の両方を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、１以上の他の分子実体（別の抗体（例えば二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出物質、医薬品、および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子との結合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチド（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）など）に（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合、またはその他によって）機能的に連結され得る。
ある種の誘導体化抗体は、（例えば二重特異性抗体を作製する、同じ種類または異なる種類の）２以上の抗体を架橋することによって作成される。適切な架橋剤には、適切なスペーサーで分離された明確な２つの反応基を有するヘテロ二官能性（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）の架橋剤が含まれる。このようなリンカーは、例えばPierce Chemical Company, Rockford, Ilから入手できる。
抗ＬＡＧ－３抗体はまた、化学基（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基など）を用いて誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改善するのに（例えば血清半減期を増加させるのに）有用であり得る。
また、本発明における抗体は標識され得る。本明細書において、用語「標識」または「標識される」は、抗体への別の分子の取り込みを指す。ある実施態様において、標識は検出可能なマーカー（例えば、放射性標識アミノ酸の取り込み、または標識されたアビジン（例えば、光学法または比色法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン化部分のポリペプチドへの結合）である。別の実施態様において、標識またはマーカーは治療用（例えば薬物コンジュゲートまたは毒素）であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド燐光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁性物質（ガドリニウムキレートなど）、毒素（百日咳毒素など）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体またはホモログ。いくつかの実施態様において、標識は潜在的な立体妨害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合されている。
ある実施態様において、本発明の抗体は、中性型（両性イオン型を含む）または正に荷電した種もしくは負に荷電した種として存在し得る。いくつかの実施態様において、抗体は対イオンとともに複合体形成され得、薬学的に許容され得る塩を形成し得る。
用語「薬学的に許容され得る塩」は、１以上の抗体および１以上の対イオンを含む複合体を指し、ここで対イオンは薬学的に許容され得る無機および有機の酸および塩基に由来する。
二重特異性結合分子
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体の結合特異性（例えば抗原結合部分を含む）、および別の抗ＬＡＧ－３抗体（例えば、本明細書に記載の別の抗ＬＡＧ－３抗体）または異なるタンパク質（別の免疫チェックポイントタンパク質、がん抗原、またはその活性が疾患状態（がんなど）を媒介する別の細胞表面分子など）を標的とする抗体の結合特異性を有する二重特異性結合分子を提供する。そのような二重特異性結合分子は当分野で公知であり、様々な種類の二重特異性結合分子の例が本明細書の他の箇所で与えられる。
核酸分子およびベクター
本発明はまた、本明細書に記載の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子および配列を提供する。いくつかの実施態様において、種々の核酸分子が、抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードしている。他の実施態様において、同じ核酸分子が、抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードしている。
ヌクレオチド配列についての言及は、他に明記されない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸についての言及は、その相補配列を含む相補鎖を包含することが理解されるはずである。本明細書における用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー型を意味し、該ヌクレオチドはリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型である。この用語は一本鎖型および二本鎖型を含む。
本発明はまた、本明細書に記載の１以上のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５および２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５、１６、１９、２０、２３、２４、２７および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を提供する。核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」は、一致が最大となるようにアラインさせた場合に２つの配列において同一である残基を指す。配列同一性比較の長さは、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド、一般的には少なくとも約１８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６、４８またはそれ以上のヌクレオチドにわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用され得る当分野で公知の多数の異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較され得、これらはWisconsin Packageバージョン１０．０、Genetics Computer Group (GCG)、Madison、Wisconsinにおけるプログラムである。ＦＡＳＴＡ（例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含む）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する（例えば、Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996);およびPearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998)参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。他に明記されない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムの初期設定パラメータが使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡを初期設定パラメータ（ワードサイズ６およびスコアマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）で用いて、またはＧａｐをＧＣＧバージョン６．１（これは参照により本明細書に組み込まれる）において提供される初期設定パラメータで用いて決定され得る。
ある態様において、本発明は、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５および２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ある実施態様において、核酸分子は、配列番号１および２、配列番号５および６、配列番号９および１０、配列番号１３および１４、配列番号１７および１８、配列番号２１および２２、または配列番号２５および２６のヌクレオチド配列を含む。
上記のあらゆる実施態様において、核酸分子は単離され得る。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分の鎖のうち１つを発現するのに適したベクターを提供する。本明細書における用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。いくつかの実施態様において、ベクターはプラスミド（すなわち、その中にさらなるＤＮＡセグメントが連結され得るＤＮＡの環状二本鎖断片）である。いくつかの実施態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中に連結され得る。いくつかの実施態様において、ベクターは、導入された宿主細胞中で自己複製できる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他の実施態様において、ベクター（例えば非エピソームの哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、動作可能に連結している遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と呼ばれる。
本発明は、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部分、または本発明の抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖および軽鎖の両方もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾抗体、抗体フラグメントおよびそのプローブをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖および／または軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子は、そのような抗体または部分を産生するあらゆる供給源から単離され得る。様々な実施態様において、核酸分子は、ヒトＬＡＧ－３抗原で免疫された動物から単離された抗ＬＡＧ－３抗体を発現するＢ細胞、またはそのようなＢ細胞から作成された不死化細胞から単離される。抗体をコードする核酸を単離する方法は当分野で周知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングにおいて使用されるｃＤＮＡを作成するために、ｍＲＮＡが単離および使用され得る。ある実施態様において、本発明の核酸分子は単離されるのではなく、合成され得る。
いくつかの実施態様において、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合した、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体由来のＶＨドメインまたは抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み得る。同様に、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列にインフレームで結合した、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体由来のＶＬドメインまたは抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
本発明のさらなる態様において、重鎖（ＶＨ）および／または軽鎖（ＶＬ）の可変領域をコードする核酸分子は、完全長の抗体遺伝子に「変換」され得る。ある実施態様において、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸分子は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに動作可能に連結され、かつ／またはＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに動作可能に連結されるように、重鎖定常（ＣＨ）領域または軽鎖定常（ＣＬ）領域を既にコードしている発現ベクターにそれぞれ挿入されることによって完全長の抗体遺伝子に変換される。別の実施態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を、標準的な分子生物学の技術を用いてＣＨおよび／またはＣＬ領域をコードする核酸分子に結合（例えば連結）させることによって、完全長の抗体遺伝子に変換される。そして、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子は該分子が導入されている細胞から発現され得、抗ＬＡＧ－３抗体が単離され得る。
核酸分子は、大量の抗ＬＡＧ－３抗体を組換え発現するのに使用され得る。核酸分子はまた、本明細書に記載のキメラ抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、変異抗体および抗体誘導体を産生するのに使用され得る。
別の実施態様において、本発明の核酸分子は、特異的抗体配列のためのプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される。例えば、核酸は診断方法におけるプローブとして、または（特に、抗ＬＡＧ－３抗体の可変領域をコードするさらなる核酸分子を単離するのに使用され得る）ＤＮＡの領域を増幅するＰＣＲプライマーとして使用され得る。いくつかの実施態様において、核酸分子はオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、対象の抗体の重鎖および軽鎖の高可変領域(highly variable domain)に由来する。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分の１以上のＣＤＲの全部または一部をコードする。
別の実施態様において、核酸分子およびベクターは、変異した抗ＬＡＧ－３抗体を作製するのに使用され得る。抗体は、（例えば抗体の結合特性を変化させるために）重鎖および／または軽鎖の可変領域において変異され得る。例えば、変異は、抗ＬＡＧ－３抗体のＫＤを増加もしくは減少させるために、ｋｏｆｆを増加もしくは減少させるために、または抗体の結合特異性を変化させるために、１以上のＣＤＲにおいて作成され得る。別の実施態様において、１以上の変異は、本発明のモノクローナル抗体において生殖系列と比較して変化していることが公知のアミノ酸残基に作成される。変異は、可変領域のＣＤＲもしくはフレームワーク領域、または定常領域において作成され得る。好ましい実施態様において、変異は可変領域に作成される。いくつかの実施態様において、１以上の変異は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の可変領域のＣＤＲまたはフレームワーク領域において生殖系列と比較して変化していることが公知のアミノ酸残基に作成される。
別の実施態様において、フレームワーク領域は、得られたフレームワーク領域が対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように変異される。変異は、抗ＬＡＧ－３抗体の半減期を増加させるためにフレームワーク領域または定常領域に作成され得る。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ００／０９５６０参照。フレームワーク領域または定常領域における変異はまた、抗体の免疫原性を変化させるために、かつ／または別の分子に共有結合もしくは非共有結合する部位を与えるために作成され得る。本発明において、単一の抗体は、可変領域のＣＤＲもしくはフレームワーク領域のうち任意の１つ以上において、または定常領域において変異を有し得る。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分は、遺伝子が必要とされる発現制御配列（転写および翻訳制御配列など）に動作可能に連結されるように、上述されるように得られた部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって発現される。

発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス（カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなど）、コスミド、ＹＡＣおよびＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。抗体をコードする配列は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体をコードする配列の転写および翻訳を調節するという意図される機能を発揮するように、ベクターに連結され得る。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択され得る。抗体の軽鎖をコードする配列および抗体の重鎖をコードする配列は別々のベクターに挿入され得、同一または異なる発現制御配列（例えばプロモーター）に動作可能に連結され得る。ある実施態様において、両方のコード配列は同一の発現ベクターに挿入され、同一の発現制御配列（例えばプロモーター）を分離するために同一の発現制御配列（例えば共通のプロモーター）に、または異なる発現制御配列（例えばプロモーター）に動作可能に連結され得る。抗体をコードする配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的な制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端の連結）によって発現ベクターに挿入され得る。
簡便なベクターは、任意のＶＨまたはＶＬ配列が上述のように容易に挿入および発現され得るように設計された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。そのようなベクター内のＨＣおよびＬＣをコードする遺伝子は、関連するｍＲＮＡを安定化させることによって全体的な抗体タンパク質の産生量の増強をもたらすイントロン配列を含み得る。イントロン配列はスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位に隣接し、これらはＲＮＡスプライシングが起こる位置を決定する。イントロン配列の位置は、抗体鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかであり得、または複数のイントロンが使用される場合には可変領域および定常領域の両方であり得る。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位において起こり得る。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有し得る。発現ベクターの設計（調節配列の選択を含む）は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者に認識される。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント（レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび強力な哺乳類プロモーター（天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなど）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなど）を含む。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる記述については、例えば米国特許第５，１６８，０６２号、第４，５１０，２４５号および第４，９６８，６１５号参照。植物において抗体を発現させる方法（プロモーターおよびベクターの記述、ならびに植物の形質転換を含む）は当分野で公知である。例えば米国特許第６，５１７，５２９号参照。細菌細胞または真菌細胞（例えば酵母細胞）においてポリペプチドを発現させる方法もまた、当分野で周知である。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターはさらなる配列（宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子など）を保有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号参照）。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は通常、ベクターが導入された宿主細胞に薬物（Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなど）に対する抵抗性を与える。例えば、選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ－宿主細胞において使用される）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、（Ｇ４１８選択のための）ｎｅｏ遺伝子、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子が含まれる。
本明細書における用語「発現制御配列」は、それが連結されているコード配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなど）；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；および所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存して異なる；原核生物において、そのような制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む；真核生物において一般に、そのような制御配列はプロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必須であるあらゆる成分を少なくとも含むことが意図され、その存在が有利であるさらなる成分（例えばリーダー配列および融合パートナー配列）も含み得る。
抗体および抗体組成物産生のための宿主細胞および方法
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体組成物ならびに抗体およびその抗原結合部分を産生する方法に関する。本発明のこの態様のある実施態様は、本明細書に規定される抗体を産生する方法に関し、この方法は、抗体を発現できる組換え宿主細胞を提供すること、前記宿主細胞を抗体の発現に適した条件下で培養すること、および得られた抗体を単離することを含む。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生した抗体は、本明細書において「組換え抗体」と呼ばれる。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、およびこの子孫細胞によって産生された抗体も提供する。
本明細書における用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。本発明は、例えば上述の本発明におけるベクターを含み得る宿主細胞を提供する。本発明はまた、例えば本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはその両方を含む宿主細胞を提供する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も意味することが理解されるはずである。その後の世代では、特定の修飾が変異または環境の影響のいずれかによって生じ得るため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書における用語「宿主細胞」の範囲に未だ含まれる。
抗ＬＡＧ－３抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳類、植物、細菌、または酵母宿主細胞の遺伝子導入のために使用され得る。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための公知のあらゆる方法によって行われ得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は当分野で周知であり、これにはデキストラン介在性遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在性遺伝子導入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、およびＤＮＡの核内への直接マイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子はウイルスベクターによって哺乳類細胞に導入され得る。細胞を形質転換する方法は当分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号参照。植物細胞を形質転換する方法は当分野で周知であり、これには例えばアグロバクテリウム介在性の形質転換、微粒子銃での形質転換、直接注入、エレクトロポレーションおよびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換する方法もまた当分野で周知である。
発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当分野で周知であり、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Invitrogen）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および他の多くの細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有しているかを決定することによって選択される。使用され得る他の細胞株は昆虫細胞株（Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞など）である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現を可能にするために、またはより好ましくは宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収され得る。植物宿主細胞には例えば、タバコ、シロイヌナズナ、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌およびストレプトマイセス種が含まれる。酵母宿主細胞には、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロマイセス・セレビジエおよびピキア・パストリスが含まれる。
さらに、産生細胞株からの本発明の抗体またはその抗原結合部分の発現は、多数の公知の技術を用いて増強され得る。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は特定の条件下で発現を増強するための一般的な手法である。ＧＳ系は全体または一部が、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、第０３２３９９７号および第０３３８８４１号に関連して議論されている。
異なる細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現された抗体は、互いに異なるグリコシル化パターンを有する可能性がある。しかしながら、本明細書において提供される核酸分子によってコードされ、または本明細書において提供されるアミノ酸配列を含むあらゆる抗体は、抗体のグリコシル化状態に依らず（より一般には、翻訳後修飾の有無に依らず）、本発明の一部である。
医薬組成物
本発明の別の態様は、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性結合分子または抗体組成物を活性成分として（または唯一の活性成分として）含む医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書に記載のあらゆる抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性結合分子または抗体組成物を含み得る。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、ＬＡＧ－３関連障害および／またはがんの改善、予防および／または処置を対象とする。本明細書において、ＬＡＧ－３関連障害またはＬＡＧ－３介在性障害は、ＬＡＧ－３活性の調節によって改善し、またはその進行が遅延する障害、疾患または状態を指す。いくつかの実施態様において、組成物は、免疫系の活性化を対象とする。ある実施態様において、組成物は、組織（皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓など）から生じたがんの改善、予防および／または処置を対象とする。ある実施態様において、がんは、線維肉腫、肺がんまたは黒色腫である。ある実施態様において、がんは、神経膠芽腫、神経膠肉腫または大腸がんである。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は乾癬の処置を対象とする。
一般に、本発明の抗体、抗原結合部分および二重特異性結合分子は、例えば以下に記述されるように、１以上の薬学的に許容され得る賦形剤と共に製剤として投与されるのに適している。
本発明の医薬組成物は、本発明の１以上の抗ＬＡＧ－３抗体、結合部分または二重特異性結合分子（例えば、１つまたは２つの抗ＬＡＧ－３抗体、結合部分または二重特異性結合分子）を含む。ある実施態様において、組成物は、本発明の単一の抗ＬＡＧ－３抗体またはその結合部分を含む。
別の実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つの抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分（例えば１つの抗ＬＡＧ－３抗体または部分）、および１以上の関連する細胞表面受容体（例えば１以上のがん関連受容体）を標的とする１以上のさらなる抗体を含み得る。
用語「賦形剤」は本明細書において、本発明の化合物以外のあらゆる成分を記述するのに使用される。賦形剤の選択は、特定の投与様式、溶解度および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに剤形の性質などの要因に大きく依存する。本明細書において、「薬学的に許容され得る賦形剤」には、生理的に適合するあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容され得る賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロールおよびエタノールなど、ならびにそれらの組合せである。多くの場合、等張剤（例えば糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）または塩化ナトリウム）が組成物中に含まれることが好ましい。薬学的に許容され得る物質のさらなる例は、湿潤剤または微量の補助物質（湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤など）であり、これらは抗体の有効期間または有効性を増強する。
本発明の医薬組成物およびその調製方法は当業者には容易に明らかである。そのような組成物およびその調製方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)に見出され得る。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ（医薬品等の製造管理および品質管理の基準）条件に従って製造される。
本発明の医薬組成物は、バルクにおいて、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として調製、パッケージ化または販売され得る。本明細書において、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む別々の量の医薬組成物である。活性成分の量は、一般に対象に投与される活性成分の用量に等しいか、またはそのような用量の都合の良い分画（例えばそのような用量の２分の１または３分の１など）に等しい。
当分野において承認されている、ペプチド、タンパク質または抗体を投与するあらゆる方法が、本発明の抗体および抗原結合部分のために適切に使用され得る。
本発明の医薬組成物は通常、非経口投与に適している。本明細書において、医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的な侵害を特徴とするあらゆる投与経路および組織の侵害を介する医薬組成物の投与を含み、したがって一般に血流、筋肉または内臓への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与は、組成物の注射、外科的切開による組成物の適用、および非外科的な組織穿通性外傷による組成物の適用などによる医薬組成物の投与を含むが、これらに限定されない。特に、非経口投与には、限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内および滑液嚢内の注射または注入；ならびに腎臓透析注入技術が含まれることが想定される。局所灌流もまた想定される。特定の実施態様は、静脈内経路および皮下経路を含む。
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は通常、薬学的に許容され得る担体（滅菌水または滅菌等張生理食塩水など）と組み合わされた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または継続投与に適した剤形で調製、パッケージ化または販売され得る。注射用製剤は、単位投与剤形（保存剤を含むアンプルまたは複数回投与量の容器など）で調製、パッケージ化または販売され得る。非経口投与用の製剤には、限定されないが、懸濁剤、液剤、油性または水性媒体中の乳剤、およびペースト剤などが含まれる。そのような製剤は、１以上のさらなる成分（限定されないが、懸濁剤、安定化剤または分散剤を含む）をさらに含み得る。非経口投与用の製剤のある実施態様において、活性成分は、適切な媒体（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）と共に再構成し、その後再構成された組成物を非経口投与するために乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。また、非経口製剤はまた、賦形剤（塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくはｐＨ３～９）など）を含み得る水溶液を含むが、いくつかの適用について非経口製剤は、滅菌の非水性溶液として、または適切な媒体（発熱物質を含まない滅菌水など）と共に使用される乾燥形態として、より適切に製剤化され得る。例示的な非経口投与剤形には、滅菌水溶液（例えば含水プロピレングリコールまたはデキストロース溶液）中の溶液または懸濁液が含まれる。そのような投与剤形は、必要に応じて適切に緩衝され得る。他の有用な非経口投与製剤には、微結晶型の、またはリポソーム調製物中の活性成分を含む製剤が含まれる。非経口投与用の製剤は、即時放出および／または調節された放出であるように製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、瞬間放出、制御放出、標的化放出およびプログラム放出が含まれる。
例えば、ある態様において、滅菌注射溶液は、必要量の抗ＬＡＧ－３抗体、その抗原結合部分、二重特異性結合分子または抗体組成物を、上記で列挙された成分のうち１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、その後必要に応じて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本分散培地および上記で列挙された成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは予め濾過滅菌された溶液から活性成分プラス所望の任意の追加成分の粉末を生じる。溶液の適切な流動性は、例えばコーティング（レシチンなど）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する物質（例えばモノステアリン酸塩およびゼラチン）を組成物中に含めることによって、および／または放出調節コーティング（例えば徐放性コーティング）を用いることによってもたらされ得る。
本発明の抗体は、典型的に乾燥粉末インヘラーから（単独、混合物として、または（例えば適切な薬学的に許容され得る賦形剤と混合された）混合された成分の粒子として）乾燥粉末の形状で、適切な噴霧剤の使用を含む、もしくは含まない加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは霧状ミストを産生するために電気流体力学を用いるアトマイザー）もしくはネブライザーからエアロゾルスプレーとして、または点鼻剤として、鼻腔内または吸入によって投与され得る。
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは一般に、例えば分散し、可溶化し、または活性物質の放出を持続させるのに適した物質である溶媒としての噴霧剤を含む、本発明の抗体の溶液または懸濁液を含む。
乾燥粉末または懸濁剤製剤における使用の前に、製剤は一般に、吸入による送達に適したサイズ（通常５ミクロン未満）に微粒子化される。これは、あらゆる適切な粉砕方法（スパイラルジェットミル、流動床ジェットミル、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧ホモジナイズ法または噴霧乾燥など）によって達成され得る。
インヘラーまたは吸入器における使用のためのカプセル剤、ブリスターおよびカートリッジは、本発明の化合物、適切な粉末基剤および性能修飾物質の粉末混合物を含むように製剤化され得る。
電気流体力学を用いて霧状ミストを産生するアトマイザーにおける使用に適した液剤は、作動毎に適切な用量の本発明の抗体を含み得、作動容積は例えば１μＬ～１００μＬまで様々であり得る。
吸入投与／鼻腔内投与用の製剤は、即時放出および／または調節された放出であるように製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、瞬間放出、制御放出、標的化放出およびプログラム放出が含まれる。
乾燥粉末インヘラーおよびエアロゾルの場合、用量単位は一定量を送達するバルブによって決定される。本発明における単位は通常、一定用量または「一吹き」の本発明の抗体を投与するように配置される。１日当たりの総投与量は通常、単回投与で投与されるか、またはより一般には１日を通して分割量で投与される。
本発明の抗体および抗体部分はまた、経口経路の投与のために製剤化され得る。経口投与は、化合物が消化管に入るように飲み込むこと、および／または化合物が口から直接血流に入る口腔投与、舌への投与または舌下投与を含み得る。
経口投与に適した製剤には、固体、半固体および液体系（錠剤；複数の粒子、ナノ粒子、液体または粉末を含む軟カプセルまたは硬カプセル；トローチ剤（液体充填型を含む）；咀嚼剤(chew)；ゲル；速分散剤形(fast dispersing dosage form)；フィルム；胚珠(ovule)；スプレー；および口腔内／粘膜付着性パッチなど）が含まれる。
液体製剤には、懸濁剤、溶液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。そのような製剤は、（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される）軟または硬カプセル内の充填剤として利用され得、通常、担体（例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロースまたは適切な油）ならびに１以上の乳化剤および／または懸濁剤を含む。液体製剤はまた、例えば小袋からの固体の再構成によって調製され得る。
本発明の抗体および組成物の治療的使用
ある態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗ＬＡＧ－３組成物ならびに二重特異性結合分子は、それを必要とするヒトの免疫系を増強または活性化するのに使用される。いくつかの実施態様において、患者は免疫抑制されている。例えば、医師は、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体を単独または他の治療物質と組み合わせて（連続的または同時に）投与することによって、患者自身の免疫系の抗がん活性を増強し得る。ＬＡＧ－３抗体は免疫細胞におけるＬＡＧ－３の活性を調節し、抗がん免疫の増強をもたらす。
ある実施態様において、抗体もしくはその抗原結合部分、組成物または二重特異性結合分子は、がん（例えば皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頚部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓などの組織から生じたがん、ならびにＬＡＧ－３活性に依存し、かつ／または患者がＬＡＧ－３リガンド（例えば、ＭＨＣＩＩ、ＬＳＥＣｔｉｎまたはその両方）を発現または過剰発現しているあらゆるがんまたは他の状態）の処置において使用される。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体、抗原結合部分、二重特異性結合分子および／または抗体組成物によって処置されるがんには、例えば、黒色腫（例えば進行黒色腫または転移性黒色腫）、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫、神経膠腫、肺扁平上皮がん、小細胞肺がん、肝細胞がん、膀胱がん、上部尿路がん、食道がん、胃食道接合部がん、胃がん、肝がん、結腸がん、大腸がん、多発性骨髄腫、肉腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、卵巣がん、消化管がん、原発性腹膜がん、卵管がん、尿路上皮がん、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺がん、尿生殖器がん、髄膜腫、副腎皮質がん、神経膠肉腫、線維肉腫、腎がん、乳がん、膵がん、子宮内膜がん、基底細胞皮膚がん、虫垂がん、胆道がん、唾液腺がん、進行メルケル細胞がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、中皮腫または固形腫瘍が含まれ得る。がんは例えば、早期、中期、後期または転移期であり得る。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体、抗原結合部分、組成物および／または二重特異性結合分子によって処置されるがんには、例えば、血液悪性腫瘍、神経膠芽腫（例えば再発性神経膠芽腫）、神経膠肉腫、非小細胞肺がん（例えば進行非小細胞肺がん）、大腸がんおよび固形腫瘍が含まれ得る。
ある態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、免疫介在疾患（乾癬、全身性エリテマトーデス、ＭＬＳ（硬化症）、クローン病、真性糖尿病および／または潰瘍性大腸炎(colitis ulcerotis)など）を処置するのに使用され得る。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、（例えば病原体が宿主免疫応答を阻害する）ウイルス感染症および／または寄生虫感染症を処置するのに使用され得る。例えば、病原体は、例えばＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、アデノウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス(cornovirus)、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、デングウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ジョンカニンガム（ＪＣ）ウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌または緑膿菌であり得る。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、（例えば、化学療法または放射線療法のために）免疫不全である、または免疫不全のリスクがある患者を処置するのに使用され得る。
いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、抗原特異的なＴ細胞のエクスビボ(ex vivo)での活性化および増殖のために使用され得る。
「処置する」、「処置している」および「処置」は、生物学的障害および／またはそれに付随する症状のうち少なくとも１つを軽減または抑制する方法を指す。本明細書において、疾患、障害または状態を「軽減する」ことは、疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を減少させることを意味する。さらに、本明細書における「処置」についての言及は、治癒的処置、緩和的処置および予防的処置についての言及を含む。
「治療有効量」は、処置される障害の症状のうち１つ以上をある程度軽減する投与される治療物質の量を指す。治療有効量の抗がん治療は例えば、腫瘍の縮小、生存期間の増加、がん細胞の消失、疾患進行の減少、転移の回復または、医療専門家によって望まれる他の臨床エンドポイントをもたらし得る。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、単独で、または１以上の他の薬物もしくは抗体と組み合わせて（またはそのあらゆる組合せとして）投与され得る。したがって、本発明の医薬組成物、方法および使用はまた、以下に詳述されるように他の活性物質との組合せ（同時投与）の実施態様を包含する。
本明細書において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物ならびに二重特異性結合分子を１以上の他の治療物質と共に参照する用語「同時投与」、「同時投与される」および「組み合わせて」という用語は、以下を意味することが意図され、以下を指し、以下を含む：
ａ）そのような成分が、処置を必要とする患者に前記成分を実質的に同時に放出する単回投与形態に共に製剤化されている場合における、本発明の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子および治療物質のそのような組み合わせの前記患者への同時投与、
ｂ）そのような成分が、処置を必要とする患者によって実質的に同時に服用される別々の投与形態に互いに別々に製剤化されている場合（これにより前記成分は前記患者に実質的に同時に放出される）における、本発明の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子および治療物質のそのような組み合わせの前記患者への実質的な同時投与、
ｃ）そのような成分が、処置を必要とする患者によって各投与間に有意な時間間隔を伴って連続して服用される別々の投与形態に互いに別々に製剤化されている場合（これにより前記成分は前記患者に実質的に異なる時間に放出される）における、本発明の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子および治療物質のそのような組み合わせの前記患者への連続投与；および
ｄ）そのような成分が、前記成分を制御された様式で放出する単回投与形態に共に製剤化されている場合（これにより、これらは前記患者に同時および／または異なる時間に、同時に、連続的に、および／または重複して放出される）における、本発明の抗体／抗原結合部分／抗体組成物／二重特異性結合分子および治療物質のそのような組み合わせの前記患者への連続投与、ここで各部分は同じ経路または異なる経路のいずれかで投与され得る。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、さらなる治療的処置を伴わずに（すなわち単独の治療法（単独療法）として）投与され得る。あるいは、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子による処置は、少なくとも１つのさらなる治療的処置（例えば、別の免疫賦活性物質、抗がん物質、抗ウイルス物質またはワクチン（例えば腫瘍ワクチン））を含み得る（併用療法）。
いくつかの実施態様において、抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、がんの処置のための別の薬剤／薬物と共に同時投与または製剤化され得る。さらなる治療的処置は、例えば化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、種々の抗がん抗体および／または放射線療法を含み得る。
本発明の抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子を、がん細胞の最終分化を誘導することが知られている物質と組み合わせることによって、効果がさらに改善され得る。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、シスレチノイン酸、フェニル酪酸塩、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ、１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール１３－アセタート、ヘキサメチレンビスアセトアミド、トランスフォーミング増殖因子ベータ、酪酸、環状ＡＭＰおよびベスナリノンからなる群から選択され得る。いくつかの実施態様において、化合物は、レチノイン酸、フェニル酪酸塩、オールトランスレチノイン酸および活性型ビタミンＤからなる群から選択される。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子および少なくとも１つの他の物質（例えば、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤または抗血管新生剤）を含む医薬品は、がん療法において同時投与、個別投与または連続投与のために併用処置として使用され得る。他の物質は、問題となる特定のがんの処置に適したあらゆる物質（例えば、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチンおよび／またはオキサリプラチンなどの白金誘導体）；植物アルカロイド(plant alkoid)（例えばパクリタキセル、ドセタキセルおよび／またはイリノテカン）；抗腫瘍抗生物質（例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシンおよび／またはマイトマイシン）；トポイソメラーゼ阻害剤（トポテカンなど）；および／または代謝拮抗物質（例えばフルオロウラシルおよび／または他のフルオロピリミジン）からなる群から選択される物質）であり得る。いくつかの実施態様において、他の物質はダカルバジンまたはゲムシタビンである。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子はまた、他の抗がん療法（ワクチン、サイトカイン、酵素阻害剤、免疫賦活性化合物およびＴ細胞療法など）と組み合わせて使用され得る。ワクチンの場合、これは例えば、処置されるがんに関連する１以上の抗原を含むタンパク質、ペプチドもしくはＤＮＡワクチン、または抗原と共に樹状細胞を含むワクチンであり得る。適切なサイトカインには、例えばＩＬ－２、ＩＦＮガンマおよびＧＭ－ＣＳＦが含まれる。抗がん活性を有するある種の酵素阻害剤の例は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、例えば１－メチル－Ｄ－トリプトファン（１－Ｄ－ＭＴ）である。養子Ｔ細胞療法は、自身の腫瘍を認識および攻撃する患者自身のＴ細胞を増殖させ、または設計することを含む様々な免疫療法技術を指す。
本発明の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、チロシンキナーゼ阻害剤に関連して補助療法において使用され得ることも想定される。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ－ＡＴＰ結合部位について競合することによってリガンド誘導受容体リン酸化を阻害する、（主にキナゾリン由来の）低分子量合成分子である。
いくつかの実施態様において、抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、免疫系の活性化を媒介する別の薬剤／薬物（限定されないが、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ７３、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＣＴＬＡ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＧＦＲベータ、ＶＩＳＴＡ、ＬＩＬＲＢ２、ＣＭＴＭ６および／または２Ｂ４の発現または活性を調節する物質を含む）と組み合わせて使用され得る。ある実施態様において、物質は上記の分子のうち１つに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。本発明の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１）、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤などと組み合わせて使用され得ることが想定される。
ある態様において、本発明の抗体および抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、ＬＡＧ－３経路の別の阻害剤と組み合わせて投与され得、これはＬＡＧ－３または１以上のそのリガンドを標的とし得る。そのような阻害剤の例には、他の抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＭＨＣＩＩ抗体、抗ガレクチン３抗体および抗ＬＳＥＣｔｉｎ抗体が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性抗体または抗体組成物は、ＢＭＳ－９８６０１６、ＧＳＫ２８３１７８１、ＲＥＧＮ３７６７、ＢＡＰ０５０もしくはＢＡＰ０５０－ｃｈｉまたはＬＡＧ５２５と組み合わせて投与され得る。
本発明の抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物ならびに二重特異性結合分子は、本明細書に記載の処置方法において使用され得、本明細書に記載の処置において使用され得、かつ／または本明細書に記載の処置のための薬剤の製造において使用され得ることが理解される。本発明はまた、本明細書に記載の抗体およびその抗原結合部分、抗体組成物ならびに二重特異性結合分子を含むキットおよび製品を提供する。
投与量および投与経路
本発明の抗体もしくはその抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、問題となる状態の処置のために有効量で（すなわち所望の結果を達成するのに必要な用量および期間で）投与される。治療有効量は、処置される特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに抗体が単独の処置として投与されるか、または１以上のさらなる抗がん処置と組み合わせて投与されるかなどの要因に従って変動し得る。
投与レジメンは、最適な所望の応答を与えるように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与され得、いくつかの分割用量が経時的に投与され得、または用量が治療状況の緊急性に示されるように比例的に減少もしくは増加され得る。非経口組成物を投与の容易さおよび用量の均一性のために単位投与形態で製剤化することは特に有利である。本明細書における単位投与形態は、処置される患者／対象のための単位用量として適した物理的に分離された単位を指し、各単位は必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形態の仕様は、（ａ）化学療法剤の固有の特徴および達成される特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物を配合する当分野に固有の制限によって一般的に決定され、これらに直接依存する。
したがって、当業者は本明細書に提供される本開示に基づいて、用量および投与レジメンが治療の分野において周知の方法に従って調整されることを認識する。すなわち、最大耐容量は容易に確立され得、患者に検出可能な治療効果を与えるように各物質を投与する時間的要求と同様に、患者に検出可能な治療効果を与える有効量もまた、決定され得る。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されているが、これらの例は、本発明を実行する際に患者に提供され得る用量および投与レジメンをいかなる方法においても限定しない。
用量の値は、軽減される状態の種類および重症度によって様々であり得、単回用量または複数回用量を含み得ることに注意すべきである。任意の特定の対象について、具体的な用量レジメンは、個々の要求および組成物を投与する人または組成物の投与を管理する人の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、かつ本明細書に記載の用量範囲は例示的なものに過ぎず、具体化された組成物の範囲または実行を限定することは意図されていないことがさらに理解されるはずである。さらに、本発明の組成物を含む投与レジメンは、多様な要因（疾患の種類、患者の年齢、体重、性別、病状、状態の重症度、投与経路および利用される特定の抗体を含む）に基づき得る。したがって、投与レジメンは多種多様であり得るが、標準的な方法を用いて日常的に決定され得る。例えば、用量は薬物動態または薬力学的パラメータ（これは、毒作用および／または臨床検査値などの臨床効果を含み得る）に基づいて調整され得る。したがって、本発明は、当業者によって決定される患者内の用量漸増を包含する。適切な用量およびレジメンの決定は関連する分野において周知であり、本明細書において開示される教示が提供された場合、当業者によって包含されることが理解される。
本発明の抗体、抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子の適切な用量は、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ（約０．５～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１～２０ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であることが想定される。例えば、抗体、抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子は、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇなど、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇなど、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇなど、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ；および例えば最大で５０ｍｇ／ｋｇ、最大で３０ｍｇ／ｋｇなど、例えば最大で２０ｍｇ／ｋｇ、最大で１５ｍｇ／ｋｇなどの用量で投与され得る。投与は通常、適切な間隔で（例えば週に１回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回、および（必要に応じて用量を適宜増加または減少させ得る）担当医が適切であると考える間隔で）反復される。
腫瘍療法の有効量は、患者の疾患の進行を安定化させる能力、および／または症状を改善する能力、ならびに好ましくは（例えば腫瘍サイズを減少させることによって）疾患の進行を逆転させる能力によって測定され得る。本発明の抗体、抗原結合部分、抗体組成物または二重特異性結合分子ががんを阻害する能力は、（例えば実施例に記載の）インビトロアッセイによって、およびヒト腫瘍における有効性を予測するのに適した動物モデルにおいて評価され得る。適切な投与レジメンは、（例えば単回ボーラスとして、または連続注入として投与される）特定の各状況において最適な治療応答を与えるために、各場合の緊急性によって示される用量の調整の可能性を伴って選択される。
診断的使用および組成物
本発明の抗体はまた、診断プロセス（例えばインビトロ、エクスビボ）において有用である。例えば、抗体は、患者由来の試料（例えば組織試料または体液試料（炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液または尿など））中のＬＡＧ－３のレベルを検出および／または測定するのに使用され得る。適切な検出および測定方法には、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイおよび免疫組織学などの免疫学的方法が含まれる。本発明はさらに、本明細書に記載の抗体を含むキット（例えば診断キット）を包含する。
本明細書において他に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。例示的な方法および物質を以下に記述するが、本明細書に記載の方法および物質と類似または同等の方法および物質もまた、本発明の実行または試験に使用され得る。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医化学および薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法およびそれらの技術は、当分野で周知であり、当分野で一般的に使用される。酵素反応および精製技術は、当分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されるように製造者の仕様書に従って実行される。
さらに、文脈によって他の場合が必要でない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。本明細書および実施態様のあらゆる箇所において、単語「有する」および「含む」またはその変形（「有している」または「含んでいる」など）は記載された整数または整数の群を含むが、他のあらゆる整数または整数の群を除外しないことを示すことが理解される。
本明細書で言及されているあらゆる刊行物および他の参考文献は、参照によってそれらの全体が組み込まれる。多数の文書が本明細書で引用されているが、この引用は、これらのあらゆる文書が当分野の一般知識の一部を形成するということの承認を構成しない。
本発明がよりよく理解され得るために、以下に実施例を記載する。これらの実施例は単に説明の目的であり、いかなる様式においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：抗ＬＡＧ－３抗体レパートリーの作製およびスクリーニング
２つの抗ＬＡＧ－３抗体レパートリーを、ＬＡＧ－３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＬＡＧ－３ ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質での免疫によって作製した。１つの抗体ライブラリーを、免疫化ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラット由来の単一細胞ソーティングされたＢ細胞からＳｙｍｐｌｅｘ（商標）抗体発見技術(Osborn et al., J Immunol. 190(4): 1481-90 (2013); Meijer et al., J Mol Biol. 358(3): 764-72 (2006))を用いて調製した。この抗体レパートリー由来の発現コンストラクトは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のエフェクター機能を減少させることが知られている２つの変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）(Hezareh et al., J Virol. 75(24):12161-8 (2001))を有するＩｇＧ１形式の完全ヒト免疫グロブリンをコードしていた。第２の抗体レパートリーを、免疫化野生型ニワトリ（セキショクヤケイ）のリンパ器官から生じた単一細胞ソーティングされたＢ細胞を用いて構築した。
両方の抗ＬＡＧ－３レパートリーからのクローン化抗体を、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）遺伝子導入試薬（Invitrogen、カタログ番号１２３４７－０１９）を用いて３８４ウェル形式でＨＥＫ２９３細胞に個別に遺伝子導入して発現させ、抗体を含む上清を遺伝子導入の６日後に回収した。
細胞に基づく抗体スクリーニングについて、ＣＨＯ－Ｓ細胞に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（Invitrogen、カタログ番号１６４４７－１００）を用いて３８４ウェル形式で遺伝子導入し、ＧＰＩ結合ヒトＬＡＧ－３を発現させた。無関係のＧＰＩ結合対照タンパク質を遺伝子導入した細胞を陰性対照として使用した。マルチプレックススクリーニングの設定を可能にするために、対照細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて標識し、非標識ＬＡＧ－３を遺伝子導入した細胞と１対１の比率で、１ｍＬ当たり１×１０６細胞の密度で混合した。３８４ウェルプレートにおいて、４０μＬのこの細胞混合物を、１０μＬの抗体を含む上清と混合した。細胞に結合した抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＦ６４７二次抗体（Molecular Probes、カタログ番号Ａ２１４４５）を添加することによって明らかにした。並行して、抗体をカニクイザルＬＡＧ－３との結合について類似の設定でスクリーニングした。ハイスループットフローサイトメトリー(iQue（登録商標） Screener、Intellicyt)を用いて試料を得、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてＣＦＳＥに対してヒトＩｇＧ結合（ＡＦ６４７）をプロットすることによってデータを分析した。ＬＡＧ－３特異的な一次ヒットを、ヒトおよびカニクイザルＬＡＧ－３遺伝子導入細胞（ＣＳＦＥ陰性）両方に結合するが、対照細胞（ＣＳＦＥ陽性）には結合しない抗体クローンとして同定し、プレート番号およびプレート座標をヒットの選別(hit picking)およびその後の配列分析のために収集した。
６つの機能的なＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）由来の抗ＬＡＧ－３抗体（１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１および１５５７２）および１つの機能的なニワトリ由来抗ＬＡＧ－３抗体（１５０１１；実施例２参照）の重鎖および軽鎖可変領域ＤＮＡならびにタンパク質配列を、以下の配列表の節に与える。可変および定常領域ＤＮＡおよびタンパク質配列の配列番号の概要を表８および９に与える。ＣＤＲの配列番号は表９に見出される。本明細書におけるＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２についてＩＭＧＴ（登録商標）の定義に従って決定された。重鎖および軽鎖ＣＤＲ３について、本明細書における定義は、ＩＭＧＴ－ＣＤＲ３の上流に１つの追加のアミノ酸残基（Ｃｙｓ）および下流に１つの追加のアミノ酸残基（Ｈ－ＣＤＲ３についてＴｒｐ、Ｌ－ＣＤＲ３についてＰｈｅ）を含む。６つのＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）由来抗体の生殖系列遺伝子の使用は表１０に示される。
実施例２：ニワトリ由来抗ＬＡＧ－３抗体のヒト化
ヒトに投与した場合に最小限の免疫原性を有するが、親のニワトリ抗体の特異性および親和性を実質的に保持する抗体分子を作製するために、ニワトリ由来抗ＬＡＧ－３抗体のフレームワーク領域のヒト化を行った。
ニワトリ由来抗体のヒト化を「ＣＤＲ移植」の手法（この方法はJones et al., Nature 321(6069):522-5 (1986)によって最初に記述された）を用いて行った。最初に、抗体の可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域を、最も近いヒト生殖系列遺伝子を見出すためにヒトＩｇＧデータベースに対してｂｌａｓｔ検索した。これは、ニワトリＶＨおよびＶＬ遺伝子に最も近い遺伝子としてそれぞれＩＧＨＶ３－２３＊０１（Ｍ９９６６０）およびヒトＩＧＬＶ３－１９＊０１（Ｘ５６１７８）遺伝子を同定した。同様に、Ｊ遺伝子領域のヒト化について選択されたヒトアミノ酸配列は、ＶＨおよびＶＬについてそれぞれＩＧＨＪ１＊０１（Ｊ００２５６）およびＩＧＬＪ６＊０１（Ｍ１８３３８）に由来していた。次に、抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子をニワトリ生殖系列遺伝子に対してアラインし、抗体の機能および／または構造に関与し得るフレームワーク領域内の体細胞変異を同定した。最後に、対応する生殖系列由来のヒトまたはニワトリ残基のいずれかを含む代替のヒト化抗体変異体を作製するために、抗体の構造、安定性および機能に重要な役割を果たしていることが知られている特定のアミノ酸位置（いわゆる「バーニア残基(Vernier residue)」(Nishibori et al., Mol Immunol. 43(6):634-42 (2006))）を考慮した。
ニワトリＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域の構築をインシリコ(in silico)で行い、ヒト化ＶＨおよびＶＬをコードする合成遺伝子をGenscript Incから注文した。ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、ヒト抗体軽鎖および重鎖の定常領域を有する発現ベクター（プラスミド）にクローン化した。具体的には、ＶＬをヒトラムダ定常ＩＧＬＣ１＊０１（Ｊ００２５２）に連結した。ラムダ鎖の上流のシグナルペプチドの正確な切断を増加させるために、ラムダ遺伝子ＩＧＬＶ３．１９の２位のアミノ酸（Ｓｅｒ）を、他のヒト生殖系列（例えばＩＧＬＶ３．２５）に存在する別のアミノ酸（Ｔｙｒ）に交換した。
この実施例に記載されるように作製された抗体クローンの代表的なフローサイトメトリードットプロットを図１Ａ～Ｃに示す：（Ａ）ヒトＬＡＧ－３遺伝子導入細胞に特異的に結合する抗体クローン、（Ｂ）ＣＨＯ－Ｓ細胞に非特異的に結合する抗体クローン、および（Ｃ）スクリーニングに使用されたいかなる細胞集団にも結合しない抗体クローン。
実施例３：抗ＬＡＧ－３参照抗体類似体のクローン化
２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５およびＢＡＰ０５０の抗体類似体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列を、それぞれ米国特許出願公開２０１４／００９３５１１ Ａ１（配列番号１２および１４）およびＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１５／１３８９２０ Ａｌ（配列番号６および１６）から取得した。タンパク質配列を、ヒトコドンの使用を伴ってＤＮＡ配列に逆翻訳した。次に、対応するＤＮＡ配列を合成し、ヒトＩｇＧ４重鎖またはカッパ軽鎖定常領域のコード配列を含む発現ベクターにクローン化し、これは完全長抗体の発現をもたらした。Ｆａｂアームの交換を妨げるために、２２８位のセリン残基をプロリンに置換した(Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993))。得られた発現プラスミドをＣＨＯ細胞に標準的なタンパク質発現系を用いて遺伝子導入した。対応する抗体上清を標準的なプロテインＡ精製カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
実施例４：ＳＥＢ＋ＰＢＭＣアッセイにおけるＬＡＧ－３特異的ｍＡｂのパネルのスクリーニング
大規模なパネルのＬＡＧ－３特異的ｍＡｂがブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で処理された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ－２分泌を刺激する能力を、単一のドナー由来のＰＢＭＣを用いて評価した。ＳＥＢはＭＨＣクラスＩＩ分子およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異的なＶβ領域に結合するスーパー抗原であり、Ｔ細胞の非特異的な刺激を誘導する。これは、ポリクローナルＴ細胞活性化／増殖およびサイトカイン（ＩＬ－２を含む）の放出をもたらす。健常なドナー由来のバフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣを３８４ウェルプレートに播種し、未処理のまま放置したか、または１０ｎｇ／ｍＬ ＳＥＢおよび１０μｇ／ｍＬの抗体で処理した。加湿インキュベーター中において３７℃で４８時間後、上清を取り出し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（Life Technologies）を用いてＩＬ－２レベルを分析した。
抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂレパートリーまたは２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体で処理した後のＩＬ－２分泌の増加が図２に見られる。種々の抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂでの処理後におけるＩＬ－２レベルは非常に様々であったことは明白であり、これは、レパートリー中のいくつかの抗体はこのアッセイにおいて機能性を有しておらず、他の抗体は２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体に類似するレベルまでＩＬ－２分泌を誘導したことを示している。
実施例５：細胞が発現したヒトまたはカニクイザルＬＡＧ－３への抗体結合
抗体の結合についてのＥＣ５０値をフローサイトメトリーによって決定するために、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ＭＡＸ試薬（Invitrogen、カタログ番号１６４４７－１００）を用いて、ＣＨＯ－Ｓ細胞に一過性に遺伝子導入し、ヒトまたはカニクイザルＬＡＧ－３を発現させた。抗体を染色緩衝液（ＰＢＳ；２％ ＦＢＳ；ＮａＮ３）中に１０μｇ／ｍＬから０．０５μｇ／ｍＬまで３倍希釈で滴定し、ヒトまたはカニクイザルＬＡＧ－３遺伝子導入細胞のいずれかと混合およびインキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞に結合した抗体をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＦ６４７二次抗体（Molecular Probes、カタログ番号Ａ２１４４５）の添加によって明らかにした。ハイスループットフローサイトメトリー（iQue（登録商標） Screener、Intellicyt)を用いて試料を取得し、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてＡＦ６４７について抗体濃度に対して平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットすることによってデータを分析した。ＥＣ５０値をＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）の「用量反応グラフ」機能を用いて計算した。
滴定によって測定された抗体結合特性の要約が以下の表１に見出され、ここでｈｕＬＡＧ－３およびｃｙＬＡＧ－３はそれぞれヒトＬＡＧ－３遺伝子導入細胞およびカニクイザルＬＡＧ－３遺伝子導入細胞である。表１に示されるように、抗体１５６４６、１５５３２、１５７２３、１５５９５、１５４３１および１５５７２はヒトＬＡＧ－３およびカニクイザルＬＡＧ－３の両方に結合する。
表１．抗体特性の概要
実施例６：ＭＨＣＩＩ遮断活性についての抗ＬＡＧ－３抗体のフローサイトメトリー分析
この実施例は、表面ＭＨＣＩＩ陽性Ａ３７５細胞および蛍光色素標識された可溶性ＬＡＧ－３を用いてフローサイトメトリー競合アッセイを行うことによって、抗ＬＡＧ－３抗体が主要組織適合複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）遮断活性についてどのようにテストされたかを説明する。
ＭＨＣＩＩ遮断活性を、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１６１９（商標））を用いて細胞に基づくアッセイにおいて調べた。Ｒ－ＰＥ標識ヒトＬＡＧ－３－Ｆｃキメラタンパク質はＡ３７５上の表面に発現したＭＨＣＩＩに特異的に結合でき、これはフローサイトメトリーによるこの相互作用の定量化を可能にする。市販の組換えヒトＬＡＧ－３－Ｆｃキメラタンパク質(R&D Systems、USA)を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒ－フィコエリトリン結合キット(Innova Biosciences、UK)を用いてＲ－ＰＥと結合させた。Ａ３７５細胞を酵素不含細胞解離緩衝液(Gibco（商標）)を用いて回収し、洗浄し、冷やした染色緩衝液（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、ＮａＮ３）中に再懸濁した。テストする抗ＬＡＧ－３抗体を９６ウェル形式で播種し、５０μＬ染色緩衝液で２０μｇ／ｍＬに調整した。１μＬのＬＡＧ－３－Ｆｃ－ＰＥ（約０．１７μｇ ＬＡＧ－３－Ｆｃに対応する）を各ウェルに添加して混合し、プレートを４℃で３０分間インキュベートし、ＬＡＧ－３抗体複合体を形成させた。インキュベーション中に、１×１０５個のＡ３７５細胞（１００μＬ染色緩衝液中）を９６ウェル形式で播種し、遠心分離によって沈降させ、細胞ペレットをプレインキュベートしたＬＡＧ－３／抗体混合物中に再懸濁した。細胞を４℃でさらに２０分間インキュベートし、２００μＬの冷やした染色緩衝液で１ｘ洗浄し、収集のために１００μＬ染色緩衝液中に再懸濁した。
テストされた７種の抗ＬＡＧ－３抗体（２０μｇ／ｍＬ）のうち、４種（１５５３２、１５５９５、１５４３１および１５０１１）は、ＬＡＧ－３のＭＨＣＩＩへの結合（ＭＦＩ）の、陰性対照抗体存在下における結合と比較して約９０％の減少を誘導した。したがって、これら４種は相互作用の有効な遮断物質であると考えられる。残りの３種の抗体（１５６４６、１５７２３および１５５７２）はＬＡＧ－３－ＭＨＣＩＩ結合に対する制限された効果のみを有し、不十分な遮断物質であると考えられ得る。参照抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体は中間の遮断活性を示した。結果を表２に要約する。
表２．抗ＬＡＧ－３抗体存在下におけるＬＡＧ－３のＡ３７５細胞上のＭＨＣＩＩへの結合の遮断
＊陰性対照抗体存在下におけるＬＡＧ－３結合に対して規格化された中央値。
実施例７：ＳＥＢ＋ＰＢＭＣアッセイにおける抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体の有効性
７種の抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂがブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で処理された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ－２分泌を刺激する能力を評価した。この実施例は、数種のＰＢＭＣドナーにおける７種の抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂの有効性を記述する。さらに、他の配列クラスター由来の４種の抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂの有効性を記述する。配列クラスターの番号は抗体番号の後の括弧内に示され、実施例１３にさらに記述される。抗ＬＡＧ－３抗体を、実施例４に記載されるようにＳＥＢ＋ＰＢＭＣアッセイにおいて１０または１２．５μｇ／ｍＬでテストした。
抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂ １５４３１、１５５３２、１５５７２、１５５９５、１５６４６、１５７２３および１５０１１または２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体での処理後におけるＩＬ－２分泌の増加を図３に示す。各点は、単一のＰＢＭＣドナーからのＩＬ－２分泌のレベルを表す。抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂでの処理後におけるＩＬ－２レベルは種々のＰＢＭＣドナー間で様々であることが明白であるが、全７種の抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂは類似のレベルでＩＬ－２産生を刺激した。これは、ＩＬ－２産生を増加させない抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂ １５４４５、１５４２９および１５４９１とは対照的である。
実施例８：細胞に基づくＬＡＧ－３－ＭＨＣクラスＩＩ遮断アッセイにおける抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体の効果
７種の抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂをさらに特徴付けるため、ＬＡＧ－３－ＭＨＣクラスＩＩ相互作用を遮断する能力を細胞に基づくアッセイにおいてテストした。
ＮＦＡＴ－ＲＥで制御されたルシフェラーゼ遺伝子を有し、改変ＴＣＲおよびＬＡＧ－３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞(Promega)を、ＭＨＣクラスＩＩを発現するＲａｊｉ細胞株、５０ｎｇ／ｍＬブドウ球菌エンテロトキシンＤ（ＳＥＤ）および実施例４に示される種々の濃度のモノクローナル抗体と共にインキュベートした。加湿インキュベーター中で３７℃で６時間後に、ルシフェラーゼ基質(Promega)を添加し、発光を測定した。発光はルシフェラーゼ発現の尺度であり、これはＴＣＲシグナル伝達によって制御され、ＬＡＧ－３シグナル伝達によって阻害される。したがって、（例えばＬＡＧ－３－ＭＨＣＩＩ相互作用を遮断することによる）より低いＬＡＧ－３シグナル伝達は発光の増加を導く。
抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂ １５４３１、１５５３２、１５５７２、１５５９５、１５６４６、１５７２３および１５０１１または２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体での処理後における発光の増加を図４に示す。テストされた全ての抗ＬＡＧ－３抗体は類似のレベルで発光を増加させることが見出された。
実施例９：ＬＡＧ－３の細胞内レベルに対する抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体の効果
選択された抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂをさらに特徴付けるために、ＬＡＧ－３レベルを下方制御する能力を、ＬＡＧ－３を過剰発現するＴ細胞株においてテストした。
改変ＴＣＲおよびＬＡＧ－３を発現するＪｕｒｋａｔ細胞(Promega)を、実施例５に示される２５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体と共にインキュベートした。加湿インキュベーター中で３７℃で２４時間後に上清を回収し、細胞溶解させた。細胞中のＬＡＧ－３のレベルを、抗ＬＡＧ－３検出抗体(Novus Biologicals)およびシンプルウェスタンの技術(Sally Sue, Proteinsimple)を用いて評価した。上清中のＬＡＧ－３のレベルを抗ＬＡＧ－３ ＥＬＩＳＡ(R&D Systems)を用いて評価した。結合競合研究によって、テストされた抗ＬＡＧ－３抗体が溶解ＬＡＧ－３への結合についてＥＬＩＳＡ検出抗体と競合しないことが確認された。多重比較についての補正を伴う一元配置分散分析およびその後のボンフェローニ補正された事後ｔ検定を用いて統計解析を行った。
抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂ １５４３１、１５５３２、１５０１１、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体またはＢＡＰ０５０類似体での処理後における細胞内ＬＡＧ－３および溶解ＬＡＧ－３のレベルを図５に示す。１５５３２、１５０１１、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体またはＢＡＰ０５０類似体は、細胞内ＬＡＧ－３および溶解ＬＡＧ－３のレベルを減少させた。１５５３２は、細胞内ＬＡＧ－３レベルを２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体よりも統計的に有意に低いレベルまで減少させ、溶解ＬＡＧ‐３レベルを２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体およびＢＡＰ０５０類似体よりも統計的に有意に低いレベルまで減少させた。１５４３１は、細胞内または溶解ＬＡＧ‐３レベルのいずれも低下させなかった。
実施例１０：２つの同質遺伝子的なマウス腫瘍モデルにおける抗体１５０１１のインビボ有効性
この実施例は、２つの同質遺伝子的なマウス腫瘍モデルにおける抗体１５０１１のインビボ有効性を示す。
方法
２×１０５個のＳａ１Ｎ（線維肉腫）細胞および５×１０６個のＡＳＢ－ＸＩＶ（肺がん）細胞を、６～８週齢の雌性Ａ／Ｊ（Ｓａ１Ｎ）マウスまたはＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＲｊ（ＡＳＢ－ＸＩＶ）マウスの側腹部に皮下接種した。腫瘍を２つの寸法においてキャリパーで週に３回測定し、ｍｍ３における腫瘍体積を、式：（幅）２×長さ×０．５に従って計算した。接種後５～７日目の３０～５０ｍｍ３の平均腫瘍サイズにおいて、マウスを１０匹の動物の２つの群に無作為に分け、処理を開始した。マウスを、賦形剤緩衝液またはモノクローナル抗体１５０１１の腹腔内注射によって週に３回、全体で６回処理し、その後を観察期間とした。抗体処理を１０ｍｇ／ｋｇで投与した。ボンフェローニの多重比較検定を伴う二元配置分散分析を適用し、処理群間の各時点における腫瘍体積を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０(GraphPad Software, Inc.)を用いて統計解析を行った。
結果
結果は、テストされた同質遺伝子的腫瘍モデルにおける抗体１５０１１の著しい腫瘍阻害効果を示した（＊Ｐ＜０．００１）（図６）。１５０１１は、Ｓａ１Ｎ腫瘍を移植されたマウスの５０％において腫瘍増殖の退縮を誘導し、ＡＳＢ－ＸＩＶ同質遺伝子的腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の遅延をもたらした。
実施例１１：ヒトＰＢＭＣを用いて再構成され、ヒトメラノーマＡ３７５細胞を移植されたＮＯＧマウスにおける抗体１５５３２のインビボ有効性
この実施例は、半ヒト化異種移植腫瘍モデルにおける抗体１５５３２のインビボ有効性を示し、ここでＮＯＧマウスの免疫系はヒトＰＢＭＣを用いて再構成され、マウスにヒトメラノーマＡ３７５細胞を移植した。
方法
試験の０日目において、ＮＯＧマウスに２～４．５×１０６個のＡ３７５メラノーマ細胞を皮下注射し、試験の２日目においてマウスは９または１２×１０６個のＰＢＭＣを腹腔内に受けた。各実験において単一のドナー由来のＰＢＭＣを用いた。ＰＢＭＣを接種した日に処理を開始し、マウスを賦形剤緩衝液またはモノクローナル抗体１５５３２（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって週に３回、全体で６または９回処理し、その後を観察期間とした。腫瘍を２つの寸法においてキャリパーで週に３回測定し、ｍｍ３における腫瘍体積を、式：（幅）２×長さ×０．５に従って計算した。ボンフェローニの多重比較検定を伴う二元配置分散分析を適用し、処理群間の各時点における腫瘍体積を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０(GraphPad Software, Inc.)を用いて統計解析を行った。
結果
図７は、抗ＬＡＧ－３処理に応答した２つの異なるヒトＰＢＭＣドナーを用いた２つの実験からの結果を示す。１５５３２での処理は、賦形剤で処理した群と比較して有意な腫瘍増殖の遅延をもたらした[Ｐ＜０．０５（ドナー１）およびＰ＜０．００１（ドナー２）]。
実施例１２：抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体のヒト、カニクイザルおよびマウスＬＡＧ－３への親和性の測定
この実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される抗ＬＡＧ－３抗体のヒト、カニクイザルおよびマウスＬＡＧ－３細胞外ドメインへの結合を示す。ヒトＬＡＧ－３のタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１８６２７（配列番号６８）として入手可能である。カニクイザルＬＡＧ－３のタンパク質配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００５５７００１１．１（配列番号６９）として入手可能である。マウスＬＡＧ－３のタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６１７９００（配列番号７２）として入手可能である。
材料と方法
速度論的結合解析を、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ装置(IBIS Technologies, The Netherlands)と組み合わせた連続フローマイクロスポッター(Continuous Flow Microspotter)(ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US)を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行った。
Genovis(Sweden)によって提供されたキットを用いてＩｇＧ１抗体をＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ酵素で消化することによって、抗ＬＡＧ－３ Ｆａｂ抗体を作製した
ヒトおよびカニクイザルＬＡＧ－３の細胞外ドメインをコードするＬＡＧ－３ ｃＤＮＡを合成し、それぞれをＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＡＡ Ｐ１０１－Ｋ３３０）を含むベクター中にクローン化し、これはクローン化されたＬＡＧ－３ ＥＣＤのＣ末端へのＩｇＧ１ Ｆｃの融合をもたらした。ＬＡＧ－３ Ｆｃ融合コンストラクトを標準的なＰＣＲおよび設計技術によって作製し、タンパク質をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系を用いて２ｍＬ培地中に一過性に発現させた。ヒトＬＡＧ－３ Ｆｃ融合コンストラクトを９日後に回収し、上清をＬＡＧ－３ Ｆａｂ抗体への結合親和性についてＳＰＲによってテストした。抗原を標準的な手段を用いて精製し、連続フローマイクロスポッター(ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US)を用いてＧ－ａ－ｈｕ－ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）(Ssens BV, The Netherlands)上に１５分間捕獲した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサー内に配置し、残りの捕獲部位を遮断した。いわゆる速度論的滴定系列(kinetic titration series)(Karlsson R. 2006)を適用することによって動態解析を行い、ここで本発明の抗体の単量体Ｆａｂフラグメントを、各Ｆａｂ注入後に表面再生の工程を適用することなく、１ｎＭから１０００ｎＭまでの増加していく濃度で注入した。Ｆａｂ結合を１５分間行い、抗原解離を１５分間行った。オン速度(on-rate)（ｋｏｎまたはｋａ）、オフ速度(off-rate)（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性（ＫＤ）定数の計算のために、記録された結合応答をＳｃｒｕｂｂｅｒ ２ソフトウェアを用いて単純なラングミュアの１：１結合モデルにフィットさせた。
結果
親和性測定の結果は、評価された抗体１５５３２、１５４３１、１５５７２、１５０１１および参照抗体類似体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５が種々の親和性でヒトおよびカニクイザルＬＡＧ－３に結合することを示す。１５０１１はマウスＬＡＧ－３との交差反応性を有する唯一の抗体である。詳細な結合の速度論を以下の表３に示す。
表３．ＳＰＲによって測定された抗ＬＡＧ－３ Ｆａｂフラグメントの、ヒト、カニクイザルおよびマウスＬＡＧ－３ ＥＣＤへの結合の速度論
＊ＮＢ：結合なし
実施例１３：抗ＬＡＧ－３抗体のエピトープビニング
この実施例は、サンドウィッチアッセイにおける対での競合パターンに基づいて、抗ＬＡＧ－３抗体をどのようにエピトープビンに分類したかを説明する。異なるエピトープビンに属する抗体は、ＬＡＧ－３ ＥＣＤ上の異なるエピトープを認識する。
材料および方法
対の抗体競合の調査を、ＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲ装置(IBIS Technologies, The Netherlands)と組み合わせた連続フローマイクロスポッター（ＣＦＭ）(Wasatch Microfluidics, US)を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって行った。表面プラズモン共鳴イメージング分析を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標） ＳＰＲセンサー(Ssens BV, The Netherlands)上で行った。全１３種の抗ＬＡＧ－３抗体（参照抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５を含む）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）、ｐＨ７．０で７．５μｇ／ｍＬに希釈した。抗体を、連続フローマイクロスポッターを用いて１５分間スポッティングすることによって抗Ｆｃセンサー表面上に捕獲した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサー内に配置し、残りの抗Ｆｃ部位を３０μｇ／ｍＬの非特異的ヒトＩｇＧ１の注入によって遮断した。捕獲された抗体をＦｉｘＩｔ ｋｉｔ(Ssens BV、The Netherlands)を用いて表面に結合した。センサーを調製した後、センサー上に注入された場合に、固定化された抗体（リガンド）を用いて溶液中の一価のＬＡＧ－３抗原（５０ｎＭ、Acro Biosystems, China）を捕獲した。次に、（ＰＢＳ－Ｔ緩衝液で１５μｇ／ｍＬに希釈された）ＬＡＧ－３抗体のパネルを分析物としてセンサー上に１つずつ注入し、サンドウィッチアッセイにおいて捕獲されたＬＡＧ－３への結合についてテストし、抗体競合パターンを確立した。各抗体の注入後、センサー表面を１００ｍＭ Ｈ３ＰＯ４緩衝液、ｐＨ３．０を用いて再生した。
結果
１３種の抗ＬＡＧ－３抗体の競合パターンを図８に示す。抗体をそれらのＩＤ番号に従って名付け、クラスター群を括弧内に記載している。クラスターメンバー由来のタンパク質配列は高度に関連しており、数個の位置が異なるのみであるため、同一のクラスター群由来のｍＡｂは同一のエピトープビンに結合することが予想される。
全ての抗体はうまくエピトープビニングされたが、抗体１５５９５（５２）、１５６１３（３３）および１５４３１（３８）はリガンドとして使用した場合に機能せず、分析物としてのみテストすることができた。抗体１５６４６（１５）および１５０１１（９４）はリガンドとしてのみテストした。
競合分析は、ＬＡＧ－３抗体のパネルが６つの主要なエピトープビンを包含していることを示した（図８）。抗体１５０１１（９４）は、パネル由来の他のいかなる抗体によっても交差遮断(closs block)されなかった固有のエピトープに結合し、したがってこの抗体をエピトープビン１に帰属させた。エピトープビン２は、この群由来の他のｍＡｂのうちいくつかと交差競合(cross compete)する７種の抗体を含み、これらの抗体は下位(sub)のビンにさらに分割された。ｍＡｂ １５５８４（５４）はリガンドまたは分析物としてテストした場合に、１５５３２（１７）および１５５９５（５２）を共に交差遮断することを特徴としていたが、分析物としてテストした場合に参照ｍＡｂ ２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５によって遮断されなかった。ｍＡｂ １５６１３（３３）は分析物としてのみテストされ、１５７２３（３９）、１５５３２（１７）および１５６４６（１５）によって遮断されたが２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５によって遮断されなかったことが示された。結果として、１５５３２（１７）は２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５と重複するエピトープに結合したが、１５５８４（８４）および１５６１３（３３）との競合における差異のため、１５５３２（１７）のエピトープは２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５のエピトープとは異なっており、これらの抗体は結果として異なる下位のビンに帰属された。同様に、エピトープビン２における他のｍＡｂは、ビン２における他の抗体との競合パターンに基づいて下位のビンに帰属された（図８）。
ｍＡｂ １５５７２（９１）はｍＡｂ １５５８４（５４）と交差競合することのみが見出され、別個のビン３に帰属された。同様に、ｍＡｂ １５４３１（８３）はｍＡｂ １５７２３（３９）のみと交差競合するため、別個のビン４に帰属された。最終的に、非機能的活性を有する抗体を含む２つの別個のエピトープビンが同定された。エピトープビン５は交差遮断する抗体１５４４５（７０）および１５４９１（８４）を含み、エピトープビン６はパネル由来のいかなる抗体も交差遮断しなかったｍＡｂ １５４２９（７２）を含んでいた。ビン５の抗体はまた、これらを分析物としてテストした場合に、ビン２由来の抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５、１５５３２（１７）および１５７２３（３９）を遮断した（図８）。リガンド抗体の競合パターンの要約を図９に示し、ここでｍＡｂのエピトープ関連性がユークリッド距離を用いたクラスター化に基づいて示されている。クラスターの図から、ｘ軸の０より大きな値に分岐点を有する抗体は、テストされたＬＡＧ－３パネル内の他の抗体と比較して異なるエピトープを有することが観察できる。ｍＡｂ １５５９５（５２）、１５６１３（３３）および１５４３１（３８）はリガンドとして機能しなかったため、クラスター分析に含めなかった。
実施例１４：ＬＡＧ－３変異誘発によるＬＡＧ－３抗体のエピトープマッピング
抗体エピトープは一般に、直線状エピトープ（連続エピトープとも呼ばれる）または立体構造エピトープ（不連続エピトープとも呼ばれる）として特徴付けられ得る。直線状エピトープは単一の連続するアミノ酸配列に基づいて規定されるが、立体構造エピトープは多くのより小さく不連続な直鎖状配列または単一の接触残基からなり得る。抗体と抗原との間の分子間タンパク質界面でクラスター形成する接触残基の一群はホットスポットとも呼ばれる(Moreira et al., Proteins 68(4):803-12 (2007))。現在、ほとんどのＢ細胞エピトープは、２～５アミノ酸が結合の大部分に寄与する１５～２２アミノ酸残基に及ぶ平均的なエピトープを伴って(Sivalingam and Shepherd, Mol Immunol. 51(3-4):304-92012 (2012), Kringelum et al., Mol Immunol. 53(1-2):24-34 (2013))、本質的に不連続であることが広く認められている(Sivalingam and Shepherd、上記)。
１０８種のＬＡＧ－３変異体への結合親和性を順位付けすることによって、この実施例は、抗ＬＡＧ－３抗体１５５３２、１５４３１、１５５７２および１５０１１の結合エピトープが参照抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体によって認識されるエピトープとは異なる直線状エピトープおよびホットスポットにどのように分類され得るかを説明する。
方法
ヒトＬＡＧ－３受容体（ＣＤ２２３）は、４２７アミノ酸（２３～４５０残基）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ならびにそれに続く膜貫通ドメイン（４５１～４７１残基）および細胞質ドメイン（４７２～５２５残基）を含む５２５アミノ酸（ＡＡ）の膜貫通タンパク質である。ＬＡＧ－３ ＥＣＤは４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１～Ｄ４）を含み、第１のドメイン（ＩｇＶ型ドメイン）はリガンド結合（ＭＨＣＩＩ結合）に関与し、残りの３つのドメインはＩｇＣ２型ドメインである。リガンド結合には最初の２つのＮ末端ドメイン（Ｄ１～Ｄ２）のみで十分であり、Ｄ２は正確な受容体提示に必要であることが示されている(Huard et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:5744-5749 (1997), Andrews et al., Immunol Rev. 276(1):80-96 (2017))。ドメイン１は、他のＩｇＶドメインには見出されない、リガンド結合に重要であることが示されている３０アミノ酸のさらなる固有の区間（追加のループ）を含む。アミノ酸（ＡＡ）９９、１１０、１２５、１３１および１３７はまた、リガンド結合に重要なアミノ酸（成熟タンパク質におけるＹ７７、Ｒ８８、Ｒ１０３、Ｄ１０９、Ｒ１１５）として同定されている(Huard et al.、上記；Andrews et al.、上記)。ＬＡＧ－３の構造は公表されていない。しかしながら、ＬＡＧ－３とＣＤ４との間の配列相同性および進化的相同性が同定されており、したがってＣＤ４のホモロジーモデリングに基づいてＬＡＧ－３の構造情報を利用することが可能である(Huard et al.、上記；Andrews et al.、上記)。
ヒトＬＡＧ－３およびオルソログのタンパク質配列をＵｎｉＰｒｏｔまたはＮＣＢＩからダウンロードした；ヒト（Ｐ１８６２７；配列番号６８）、カニクイザル（カニクイザル(Macaca fascicularis)、ＸＰ＿００５５７００１１．１；配列番号６９）、ラット（ドブネズミ(Rattus norvegicus)、Ｑ５ＢＫ５４；配列番号７０）およびイヌ（イヌ(Canis Lupus Familiaris)、Ｆ１Ｐ７Ｚ３；配列番号７１）。種々のＬＡＧ－３細胞外ドメインアミノ酸配列の配列同一性を以下の表４に示す。
表４．異なる種由来のＬＡＧ－３の細胞外ドメインにおけるヒトＬＡＧ－３とのアミノ酸の差異および配列同一性の表
天然のヒトＬＡＧ－３構造に関連して直線状エピトープをマッピングするために、ヒトＬＡＧ－３ ＥＣＤ配列における１０アミノ酸を５アミノ酸が重複したセグメントにおいてラット配列に連続的に交換し、特に興味がある領域（例えば重要なＡＡ挿入配列およびループ区間）においてイヌおよびカニクイザルのバージョンを追加した３５種のキメラタンパク質を設計した。配列交換を、アミノ酸２３～１７０に及ぶヒトＬＡＧ－３のドメイン１において行った。ＣＤ４の結晶構造（１ＷＩＯ、１ＷＩＱ）およびアミノ酸配列アラインメントに基づいて構築された相同性モデルから、表面に露出したアミノ酸が同定され、ヒトＬＡＧ－３ドメイン１上に８０個の置換が設計された。導入された点変異は主にアラニン置換であった。表面に露出した残基がアラニンであった場合、この位置はセリンに交換された。
ヒトＬＡＧ－３細胞外ドメイン（ＡＡ１～２６６）のドメイン１および２をコードするＬＡＧ－３ ｃＤＮＡを遺伝子合成し、ＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＡＡ Ｐ１０１～Ｋ３３０）を含むベクターにクローン化し、これはＬＡＧドメイン１～２ Ｆｃ融合タンパク質の発現をもたらした。変異ヒトＬＡＧ－３ Ｆｃ融合コンストラクトを標準的なＰＣＲおよび設計技術によって作製し、タンパク質をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系を用いて２ｍＬ培養物中に一過性に発現させた。ヒトＬＡＧ－３ Ｆｃ融合コンストラクトを回収および精製し、抗ＬＡＧ－３ ｍＡｂへの結合親和性について表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってテストした。ＬＡＧ－３融合タンパク質を、連続フローマイクロスポッター(ＣＦＭ、Wasatch Microfluidics、Salt Lake City、US)を用いてＧ－ａ－ｈｕ－ＩｇＧ Ｆｃ ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）(Ssens BV, The Netherlands)上に１５分間固定化した。スポッティング後、ＳｅｎｓＥｙｅ（登録商標）をＩＢＩＳ ＭＸ９６バイオセンサー内に配置し、捕獲されたタンパク質を結合親和性について評価した。いわゆる速度論的滴定系列(Karlsson R. 2006)を適用することによって動態解析を行い、ここで本発明の抗体の単量体Ｆａｂフラグメントを、各Ｆａｂ注入後に表面再生の工程を適用することなく、０．４ｎＭから３００ｎＭまでの増加していく濃度で注入した。Ｆａｂ結合を１５分間行い、抗原解離を１５分間行った。オン速度（ｋｏｎまたはｋａ）、オフ速度（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性（ＫＤ）定数の計算のために、記録された結合応答をＳｃｒｕｂｂｅｒ ２ソフトウェアを用いて単純なラングミュアの１：１結合モデルにフィットさせた。
結果
抗ＬＡＧ－３抗体１５５３２、１５４３１、１５５７２、１５０１１および参照抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体のＦａｂフラグメントの結合親和性を、ＬＡＧ－３変異体構成物への結合の変化に関して評価した。Ｆａｂフラグメントの変異ＬＡＧ－３構成物への結合の結合親和性を、ＫＤ変異体／ＫＤ野生型の比（規格化された結合親和性）として表した。以下の表５および６はそれぞれ、テストされた全てのキメラタンパク質への規格化された結合親和性、およびアラニンスキャニング実験の規格化された結合親和性を示す。少なくとも５倍の親和性減少のカットオフを、変異ＬＡＧ－３構成物への有意に減少した結合親和性を検出する基準として利用した。いくつかの例において、特異的抗体への結合は検出できなかった。これらの構成物は結合なし（Ｎ．Ｂ．）として記載されている。
この分析は、抗ＬＡＧ－３抗体１５５３２、１５４３１、１５５７２、１５０１１の結合エピトープが参照抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体の結合エピトープとは異なることを示した。１５５３２の結合エピトープは、７８～８７、８４～９２、８８～９７位に挿入されたＡＡを含むキメラタンパク質から明白であった：ＬＡＧ－３のドメイン１の追加のループ内にある集団的なアミノ酸区間。しかしながら、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５とは異なり、１５５３２の直線状エピトープはこの区間を超えて広がっており、ＡＡ９５～１００、ＡＡ９８～１０５およびＡＡ１２３～１３１を含んでいる。興味深いことに、リガンド相互作用に重要なアミノ酸が９９～１３１のセグメントにおいて同定されている（Ｙ９９、Ｒ１２５およびＤ１３１；Huard et al、上記）。２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体は、リガンド結合に重要な領域内の変異についていかなる感受性も示さなかった。アラニン置換によって測定された１５５３２の接触残基はＨ８５、Ｐ８６、Ａ８７、Ｐ８９、Ｓ９１、Ｗ９２およびＧ９３として同定されたが、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体はＰ８６およびＳ９１への感受性を示さず、これはＡＡ８５～９３領域内の接触残基が区別されていることを示していた。１５５３２はカニクイザルＡＡ復帰変異（Ｐ８４Ｈ；Ｈ８５Ｒ；Ｓ９０Ｙ）を伴うキメラ構成物＃２８に結合できたが、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体は結合できず、これはＡＡ８４～９０領域内の精密に区別されたエピトープを再度反映していた。
２つの抗体１５４３１および１５５７２はともに、ＡＡ２３～３０および４０～６６のセグメントにおける直線状エピトープに結合することが見出された。さらなるアラニンスキャニングは、両方の抗体がＡ４０、Ｑ４１、Ｐ４３、Ｐ４６、Ｐ４９、Ｄ５２、Ｔ６２、Ｑ６４、Ｈ６５、Ｑ６６、Ｐ６７およびＤ６８の位置において同一の接触残基を共有していたことを示した。１５４３１はさらに、キメラ構成物８８～９７、９５～１００および９８～１０５（セグメントＡＡ８８～１０５）に感受性であった。ＡＡ領域９８～１０５は、１５５３２、１５４３１、１５５７２および１５０１１の間で共有される唯一のエピトープであることが示された。２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体はこのエピトープに結合しなかった。アラニンスキャニングは、１５４３１および１５５７２が接触残基Ｐ９６、Ｙ９９、Ｔ１００、Ｖ１０１、Ｐ１０６およびＧ１０７を共有し、１５４３１がＧ９３、Ｐ９４およびＲ９８の位置に固有の接触を有していたことを示した。抗体１５４３１はまた、ＡＡ１２３～１３１、１２８～１３７および１４８～１５４のセグメントにおいて直線状エピトープを有していた。興味深いことに、１２５位、１３１位および１３７位はリガンド結合に重要であることが以前に示されている(Huard et al、上記)。また、これらのセグメント（ＡＡ１２３～１３１、１２８～１３７および１４８～１５４）は１５５７２において重要であり、１５５７２はＡＡ１１８～１３７および１４８～１６１のセグメントにおいて直線状エピトープを認識した。アラニンスキャニングは、１５４３１および１５５７２の両方がＲ１１９、Ｅ１２４、Ｒ１２９、Ｇ１３０、Ｄ１３１、Ｓ１３３、Ｒ１３７、Ｐ１３８、Ｄ１４３、Ｒ１４８およびＲ１６３の位置において接触残基を共有し、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体はこれらのエピトープ領域またはアミノ酸位置のいずれにも感受性を示さなかったことをさらに示した。
抗体１５０１１はＡＡ９８～１０５の範囲に変異を有するキメラ構成物によって規定された直線状エピトープを含み、アラニンスキャニングは、Ｇ１０７、Ｌ１０９、Ｒ１１０およびＳ１１１の位置における接触残基を含むように固有のエピトープをさらに広げた。興味深いことに、Ｒ１１０はリガンド結合に重要であることが示されている(Huard et al、上記)。この領域（ＡＡ９８～１１３）のアミノ酸配列は、ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットオルソログの間で良く保存されており、これはこの抗体のマウスおよびカニクイザルＬＡＧ－３への交差反応性を説明する（実施例１２）。収集されたエピトープマッピングの知見の要約を以下の表７に示す。
要約すると、我々は１０８種のＬＡＧ－３変異体のパネルへの結合を単一アミノ酸分解能で分析することによって、４つの抗体１５５３２、１５４３１、１５５７２および１５０１１がＬＡＧ－３のドメイン１において固有であるが部分的に重複したエピトープを認識することを示した。この知見は実施例１３のエピトープビニング分析と一致しており、この分析は１５５３２が２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５類似体と交差競合するが、他のＬＡＧ－３抗体との区別された競合パターンを有し、したがって異なるエピトープを有していることを示した（表７）。１５４３１、１５５７２および１５０１１は１５５３２または２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５との結合について競合せず、別々のエピトープビン２抗体との固有の競合パターンを有していた。帰属されたエピトープビン（実施例１３）は、各抗体が固有の区別されるエピトープを示したことを明らかにしたエピトープマッピング（表７）と良く一致している。キメラ構成物＃２８を含むエピトープデータはまた、１５５３２がカニクイザルＬＡＧ－３との有意な結合を示し、２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５が示さなかった（これは区別される接触残基による抗体の異なる性質を反映している）結合親和性分析（実施例１２）を良く裏付けた。
表５．抗ＬＡＧ－３抗体のＦａｂフラグメントの、ラット、イヌまたはカニクイザル配列セグメントの挿入を含む変異ＬＡＧ－３ ＥＣＤ構成物への結合についての結合親和性分析の要約。規格化された結合はＫＤ変異体／ＫＤ野生型として表した。
表６．抗ＬＡＧ－３抗体のＦａｂフラグメントの、点変異スキャンされたヒトＬＡＧ－３への結合の結合親和性分析の要約。規格化された結合はＫＤ変異体／ＫＤ野生型として表した。
表７．テストされた抗ＬＡＧ－３抗体について同定された結合エピトープの要約
表８．ＶＨ、ＶＬ、ＨＣおよびＬＣ ＤＮＡおよびタンパク質配列の配列番号
表９．抗ＬＡＧ－３抗体のＶＨおよびＶＬ ＤＮＡおよびタンパク質配列ならびにＨ－ＣＤＲ１～３およびＬ－ＣＤＲ１～３アミノ酸配列の配列番号
表１０．抗ＬＡＧ－３抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＯＭＴラット由来抗体の生殖系列遺伝子起源
＊ヒト化のために使用された遺伝子、実施例２参照。

配列表
ＶＨおよびＶＬ ＤＮＡおよびタンパク質配列
配列番号１（１５６４６ ＶＨ ＤＮＡ配列）
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGTGCCGGTCTGCTGAAGCCTTCTGAAACTCTGTCTCTGACTTGTGCCGTCTATGGTGGATCATTCAGCGGCTACTATTGGTCCTGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCACCGGGGCTCTACCAACTACAATCCCTCTCTGAAGAGCAGGGTGACCATCTCCGTGGACACATCTAAGAATCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACCGCCGCTGATACAGCCGTGTACTATTGCACAAGGGGGGAGGAATGGGAGTCACTGTTCTTTGATTACTGGGGGCAGGGGACACTGGTCACAGTCTCGAGT

配列番号２（１５６４６ ＶＬ ＤＮＡ配列）
GAAATCGTCCTGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGAGAAAGAGCCACCCTGTCCTGCCGAGCAAGCCAGTCCATCAGCTCCTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGCCAGGCTCCCCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCAACAGAGCTACAGGAATCCCAGCCCGCTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACAATCTCTAGCCTGGAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGAGATCTAATTGGCCACTGACATTCGGCGGCGGCACACGGGTGGAGATCAAG

配列番号３（１５６４６ ＶＨタンパク質配列）
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRGEEWESLFFDYWGQGTLVTVSS

配列番号４（１５６４６ ＶＬタンパク質配列）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTRVEIK

配列番号５（１５５３２ ＶＨ ＤＮＡ配列）
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCCGGCCTGCTGAGACCAAGCGAGACCCTGTCCCTGACATGCGCCGTGTATGGCGAGAGCTTCTCCGGCTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAATCACTCCGGCTCCACCAATTACAACCCATCCCTGAAGTCTCGGGTGACAATCAGCGTGGATACAAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACAGCTGCCGATACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGAGGCTGGGACCTGCTGGATTGGAATGACTACTGGAATGAGTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTCTCGAGT

配列番号６（１５５３２ ＶＬ ＤＮＡ配列）
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCTCTGTCCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGTAGAGCTTCTCAGTCCGTGTCTTCCTACCTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCAAGACTGCTGATCTATGACGCTTCCAATCGGGCTACCGGCATCCCAGCTCGCTTTAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGGAGCCAGAGGATTTTGCCGTGTATTACTGTCAGCAGAGGTCCAATTGGCCACTGACATTTGGCGGCGGCACAAAGGTTGAGATCAAG

配列番号７（１５５３２ ＶＨタンパク質配列）
QVQLQQWGAGLLRPSETLSLTCAVYGESFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKTQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGWDLLDWNDYWNEYWGQGTLVTVSS

配列番号８（１５５３２ ＶＬタンパク質配列）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK

配列番号９（１５７２３ ＶＨ ＤＮＡ配列）
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTGGGGCGCTGGCCTGCTGAAGCCCTCTGAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCGTGTATGGCGGCAGCTTCTCCGGCTATTACTGGAACTGGATCCGCCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCAACCACTCCGGCTCTACCAACTACAATCCTTCTCTGAAGTCCAGGGTGACAATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTTAGCCTGAAGCTGTCCAGCGTGACAGCTGCCGATACAGCCGTGTATTACTGCGCCAGAGGCGAGGATTGGGGCGAGAGCTTCTTTGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTCTCGAGT

配列番号１０（１５７２３ ＶＬ ＤＮＡ配列）
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCTCTGTCCCCTGGCGAGCGGGCCACCCTGAGCTGTCGGGCCTCCCAGTCCGTGAGCTCCTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCAAGACTGCTGATCTACGCCGCTTCCAATCGGGCCACCGGCATCCCCGCCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGATTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGGAGCCAGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGGTCTAATTGGCCACTGACATTTGGCGGCGGCACCAAGGTTGAGATCAAG
配列番号１１（１５７２３ ＶＨタンパク質配列）
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGEDWGESFFDYWGQGTLVTVSS

配列番号１２（１５７２３ ＶＬタンパク質配列）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYAASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK

配列番号１３（１５５９５ ＶＨ ＤＮＡ配列）
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGGTTTCCTGTAAGGTTTCCGGCTATAGCCTGACCGAGATCTCTATGCACTGGGTACGGCAAGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGGCTTTGACCCAGAGGATGGCGAGACCATCTACGCTCAGAGGTTTCAGGGGCGCGTGATCATGACCGAGGATACCAGCACCGATACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGCGCTACTGGTGGCTGGGGCCCCAATTGGTTCGATCCTTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACCGTCTCGAGT

配列番号１４（１５５９５ ＶＬ ＤＮＡ配列）
GACATCCAGATGACACAGTCTCCTTCCTCTGTGAGCGCCTCTGTGGGCGACCGCGTGACCATCACATGCCGCGCTTCCCAGGGGATCTCTTCCTGGCTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGCTGCCAGCAGCCTGCAGTCCGGCGTGCCTTCCAGGTTTAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTTACACTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGATTTTGCCACCTATTACTGTCAGCAGGCGAATTCCTTCCCTTTTACATTCGGCCCTGGCACCAAGGTTGATATCAAG

配列番号１５（１５５９５ ＶＨタンパク質配列）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYSLTEISMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQRFQGRVIMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGGWGPNWFDPWGQGTLVTVSS

配列番号１６（１５５９５ ＶＬタンパク質配列）
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK

配列番号１７（１５４３１ ＶＨ ＤＮＡ配列）
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCAAGCCAGACCCTGTCTCTGACATGCGCCATCTCCGGCGACAGCGTGTCCTCTAACTCCGCCGCTTGGAATTGGATCCGGCAGTCTCCATCCAGAGGCCTGGAGTGGCTGGGCAGAACCTATTACCGGTCCAAGTGGTACAACGATTATGCCGTGTCCGTGAAGAGCAGAATCACCATCAACCCTGATACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGCAGCTGAATTCCGTGACCCCAGAGGATACAGCCGTGTATTACTGTGCTAGGGACGATGATTGGAATGACTTCGATTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCGAGT

配列番号１８（１５４３１ ＶＬ ＤＮＡ配列）
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCAGCTACACTGTCCCTGTCTCCCGGCGAGCGGGCCACCCTGAGCTGTAGAGCTTCCCAGTCCGTGTCTTCCTATCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCAAGGCTGCTGATCTACGACGCCTCCAATAGAGCCACCGGCATCCCAGCTAGATTTTCTGGCTCCGGCTCCGGCACCGATTTCACACTGACCATCTCTAGCCTGGAGCCAGAGGATTTTGCTGTATATTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCTGACATTTGGCGGCGGCACCAAGGTTGAGATCAAG

配列番号１９（１５４３１ ＶＨタンパク質配列）
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDDDWNDFDYWGQGTLVTVSS

配列番号２０（１５４３１ ＶＬタンパク質配列）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
配列番号２１（１５５７２ ＶＨ ＤＮＡ配列）
CAGCTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCTCTGAGACCCTGTCCCTGACATGCACCGTGAGCGGCGATTCCATCAGCTCTTCCAGCTATTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGCATCTTCTACTCCGGCAATACATATTATAATCCTTCTCTGAAGAGCAGGGTGACAATCAGCGTGGATACCTCCAAGAATCAGTTTAGCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACAGCTGCCGATACAGCCGTGTATTACTGCGCTAGGGAGGACGATTTTCTGACCGATTATTACGGCGCTTTCGACATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTGACAGTCTCGAGT

配列番号２２（１５５７２ ＶＬ ＤＮＡ配列）
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCAAGCACCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGATCGGGTGACCATCACATGTCGGGCTTCTCAGTCCATCAGCAGCTGGCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAAGGCCTCTTCCAGCGAGAGCGGCGTGCCATCCAGGTTTAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCTTCCCTGCAGCCCGATGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGCAGTACAATTCCTATCTGACATTCGGCGGCGGCACCAAGGTTGAGATCAAG

配列番号２３（１５５７２ ＶＨタンパク質配列）
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIFYSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREDDFLTDYYGAFDIWGQGTMVTVSS

配列番号２４（１５５７２ ＶＬタンパク質配列）
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSSESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYLTFGGGTKVEIK

配列番号２５（１５０１１ ＶＨ ＤＮＡ配列）
GAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGATCCCTGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCTGGCTTCGACTTTAGAAGCTACGCAATGATGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTGGGAGGGATCAACGGTGAAGTCGGTGGCTCTAATACATACTATGCACCTGCCGTCAAGGGAAGGGCTACTATTAGTCGGGACAACTCAAAAAATACCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGTGAAAGGTGCTGGCGCATGCGGCATCTGTAATGACGATATTGATGCATGGGGACAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCGAGT

配列番号２６（１５０１１ ＶＬ ＤＮＡ配列）
AGTTATGAGCTGACTCAGGACCCAGCAGTGTCAGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCAGTGGGGCTGGTTCATATGCAGGCTCCTACTATTACGGATGGCACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCACCTGTGACAGTCATCTACGACAACGATAAAAGGCCAAGCAATATTCCCGACCGGTTCTCTGGGTCCAGCTCTGGTAACACCGCCTCCCTGACCATTACTGGGGCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTATTACTGTGGCTCTACAAACGATAATGACGATGGCGGACTGTTTGGCTCCGGAACTAAGGTCACCGTCCTA

配列番号２７（１５０１１ ＶＨタンパク質配列）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFRSYAMMWVRQAPGKGLEWVGGINGEVGGSNTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKGAGACGICNDDIDAWGQGTLVTVSS

配列番号２８（１５０１１ ＶＬタンパク質配列）
SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGAGSYAGSYYYGWHQQKPGQAPVTVIYDNDKRPSNIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSTNDNDDGGLFGSGTKVTVL

定常領域ＤＮＡおよびタンパク質配列

配列番号２９（ＩｇＨＣ定常領域ＤＮＡ配列）
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

配列番号３０（ＩｇＨＣ定常領域タンパク質配列）
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３１（ＩｇＬＣ定常領域ＤＮＡ配列）
GGCCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA

配列番号３２（ＩｇＬＣ定常領域タンパク質配列）
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

配列番号３３（ＩｇＫＣ定常領域ＤＮＡ配列）
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

配列番号３４（ＩｇＫＣ定常領域タンパク質配列）
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号３５（１５６４６／１５７２３ Ｈ－ＣＤＲ１）
GGSFSGYY

配列番号３６（１５６４６ Ｈ－ＣＤＲ２）
INHRGST

配列番号３７（１５６４６ Ｈ－ＣＤＲ３）
CTRGEEWESLFFDYW

配列番号３８（１５６４６ Ｌ－ＣＤＲ１）
QSISSY

配列番号３９（１５６４６ Ｌ－ＣＤＲ２）
GAS

配列番号４０（１５６４６／１５５３２／１５７２３／１５４３１ Ｌ－ＣＤＲ３）
CQQRSNWPLTF
配列番号４１（１５５３２ Ｈ－ＣＤＲ１）
GESFSGYY

配列番号４２（１５５３２／１５７２３ Ｈ－ＣＤＲ２）
INHSGST

配列番号４３（１５５３２ Ｈ－ＣＤＲ３）
CARGWDLLDWNDYWNEYW

配列番号４４（１５５３２／１５７２３／１５４３１ Ｌ－ＣＤＲ１）
QSVSSY

配列番号４５（１５５３２／１５４３１ Ｌ－ＣＤＲ２）
DAS

配列番号４６（１５７２３ Ｈ－ＣＤＲ３）
CARGEDWGESFFDYW

配列番号４７（１５７２３／１５５９５ Ｌ－ＣＤＲ２）
AAS

配列番号４８（１５５９５ Ｈ－ＣＤＲ１）
GYSLTEIS

配列番号４９（１５５９５ Ｈ－ＣＤＲ２）
FDPEDGET

配列番号５０（１５５９５ Ｈ－ＣＤＲ３）
CATGGWGPNWFDPW
配列番号５１（１５５９５ Ｌ－ＣＤＲ１）
QGISSW

配列番号５２（１５５９５ Ｌ－ＣＤＲ３）
CQQANSFPFTF

配列番号５３（１５４３１ Ｈ－ＣＤＲ１）
GDSVSSNSA

配列番号５４（１５４３１ Ｈ－ＣＤＲ２）
TYYRSKW

配列番号５５（１５４３１ Ｈ－ＣＤＲ３）
CARDDDWNDFDYW

配列番号５６（１５５７２ Ｈ－ＣＤＲ１）GDSISSSSYY

配列番号５７（１５５７２ Ｈ－ＣＤＲ２）
IFYSGNT

配列番号５８（１５５７２ Ｈ－ＣＤＲ３）
CAREDDFLTDYYGAFDIW

配列番号５９（１５５７２ Ｌ－ＣＤＲ１）
QSISSW
配列番号６０（１５５７２ Ｌ－ＣＤＲ２）
KAS

配列番号６１（１５５７２ Ｌ－ＣＤＲ３）
CQQYNSYLTF

配列番号６２（１５０１１ Ｈ－ＣＤＲ１）
GFDFRSYA

配列番号６３（１５０１１ Ｈ－ＣＤＲ２）
INGEVGGSNT

配列番号６４（１５０１１ Ｈ－ＣＤＲ３）
CVKGAGACGICNDDIDAW

配列番号６５（１５０１１ Ｌ－ＣＤＲ１）
GSYAGSY

配列番号６６（１５０１１ Ｌ－ＣＤＲ２）
DND

配列番号６７（１５０１１ Ｌ－ＣＤＲ３）
CGSTNDNDDGGLF

配列番号６８（ヒトＬＡＧ－３）
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAG
VTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRV
QLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLR
ASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWG
CILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTP
PGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGS
PGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERL
LGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRP
RRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL

配列番号６９（カニクイザルＬＡＧ－３）
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPPQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSG
PPAXAPGHPPVPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPAR
RADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGR
VPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVEL
PCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAI
ITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERL
LGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALRAGHLPLFLILGVLFLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGI
HPPQAQSKIEELEQEPELEPEPELERELGPEPEPGPEPEPEQL

配列番号７０（ラットＬＡＧ－３）
MRQDLFLDLLLLQLLWEAPVVSSGPGKELSVVWAQEGAPVHLPCSLEFPHLDPNFLRRGW
VTWQHRPDSDQPASIPALDLLQGMPSTRRHPPHRYTVLSVAPGGLRSGRQPLLSHVQLEK
RGPQRGDFSLWLRPATRKDAGEYHAFVRLPDRDFSCSLRLRVGQASMIASPPGTLKPSDW
VILNCSFSRPDRPVSVHWFQGQSRVPVHNSPRHYLAESFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYR
DGFNVSITYNLKVQGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPVVGTPSLLIAKWTPPGGGPE
LPVTGKSGNFTLQLENVGRAQAGTYTCSIHLQGRQLSAAVTLAVITVTPKSFGLPGSPQK
LLCEVVPASGEGRFVWRPLSDLSRSSLGPVLELQEAKLLAEQWQCQLYEGQKLLGATVYT
AESSSGAWSAKRISGDLKGGHLFLSLILGALALFLLVTGAFGFHLWRRQLLRRRFSALEH
GIRPPPVQSKIEELEREPETEMEPETEPDPEPQPEPELEPESRQL
配列番号７１（イヌＬＡＧ－３）
MWEVQFLVLLLLQLLWVAPVAAPGSGTEVQVVWAQEGAPVQLPCSPTIPLQDVSLLRNAG
VTWYHLPESGPAAPALSLRPAAPSARGPGPRSYVVLMRAPGGLRSGLVPTVNALALNSPG
PTRFSLALQTVISLPHSWLFPGPSSLPGQPLASCWPSPHVGVGCVCEHPPFIHLTLLPAR
QSPLLFLLPSLQPQCSASLYLSLSASTLASSFPGLEPSGPLTVYTGAGSRVGLPCRLPPG
VGTQSFLTAKWTPPGGGPDLLVAGDDGNFTLQLEVVNQAQAGTYTCHIHLQGQQLSTTVT
LAVITVTPKSSGLPGNLRKLLCEVTPASGQERFVWSPLDKQSWRGSPGPCLEMQETRLLS
QPWQCHVYQAERLLGTAVYLIDPAGPGAQRSGRAQGVLKTGHLSLLLILGILFLLLLMTG
AFGFQLWRRQWRPRRFSALELGTHPPQAQSKIGELEQEPELELEPEPELEPEPEPE

配列番号７２（マウスＬＡＧ－３）
MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGG
VIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEE
RGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDW
VLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYR
DGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPE
LPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGK
LLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYA
AESSSGAHSARRISGDLKGGHLVLVLILGALSLFLLVAGAFGFHWWRKQLLLRRFSALEH
GIQPFPAQRKIEELERELETEMGQEPEPEPEPQLEPEPRQL

Claims (20)

  1. 配列番号７におけるＨ－ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列および配列番号８におけるＬ－ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を含む、抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分、ここで各ＣＤＲはＩＭＧＴ（登録商標）、Ｋａｂａｔ、またはＣｈｏｔｈｉａの定義に従うものである。
  2. 前記抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）が配列番号７のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一であり、前記抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）が配列番号８のアミノ酸配列と配列が少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分。
  3. 前記抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項１または２に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分。
  4. 前記抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１または２に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分。
  5. 前記抗体が、配列番号３０の重鎖定常領域アミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分。
  6. 前記抗体が、配列番号３４の軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分。
  7. 前記抗体が、アイソタイプＩｇＧである、請求項１～６のいずれかに記載の抗ＬＡＧ－３抗体。
  8. 前記抗体が、アイソタイプＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１である、請求項７に記載の抗ＬＡＧ－３抗体。
  9. 前記抗体が、Ｆｃ領域に少なくとも１つの変異を含む、請求項７に記載の抗ＬＡＧ－３抗体。
  10. （１）前記抗体がアイソタイプＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１であり、２３４位および２３５位のアミノ酸残基の一方または両方がＬｅｕからＡｌａに変異されているか、または（２）前記抗体がアイソタイプＩｇＧのサブクラスＩｇＧ４であり、２２８位のアミノ酸残基がＳｅｒからＰｒｏに変異されている、請求項７に記載の抗ＬＡＧ－３抗体。
  11. 以下から選択される少なくとも１つの性質を有する、請求項１～１０のいずれかに記載の抗ＬＡＧ－３抗体または抗原結合部分：
    ａ）２０μｇ／ｍＬの濃度において、フローサイトメトリーによる競合アッセイによって決定された場合に、ヒトＬＡＧ－３のＡ３７５細胞上のヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を陰性対照抗体と比較して８５％よりも大きく減少させる；
    ｂ）２０μｇ／ｍＬの濃度において、フローサイトメトリーによる競合アッセイによって決定された場合に、ヒトＬＡＧ－３のＡ３７５細胞上のヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を陰性対照抗体と比較して３５％～８５％減少させる；
    ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞上に発現しているヒトＬＡＧ－３とＲａｊｉ細胞上に発現しているヒトＭＨＣクラスＩＩとの間の結合を遮断する；
    ｄ）フローサイトメトリーによって測定された場合、ヒトＬＡＧ－３に０．１ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する；
    ｅ）フローサイトメトリーによって測定された場合、カニクイザルＬＡＧ－３に０．３ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する；
    ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合、ヒトＬＡＧ－３に３．０×１０－８Ｍ以下のＫＤで結合する；
    ｇ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合、カニクイザルＬＡＧ－３に１．５×１０－７Ｍ以下のＫＤで結合する；
    ｈ）表面プラズモン共鳴によって測定された場合、マウスＬＡＧ－３に３．５×１０－８Ｍ以下のＫＤで結合する；
    ｉ）ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で処理されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ－２産生を刺激する；
    ｊ）ヒトＴ細胞中のＬＡＧ－３の細胞内レベルを減少させる；
    ｋ）ヒトＴ細胞の培養物中のＬＡＧ－３の溶解レベルを減少させる；
    ｌ）インビボにおいて腫瘍増殖の退縮を誘導する；
    ｍ）インビボにおいて腫瘍増殖を遅延させる；および
    ｎ）抗体２５Ｆ７－Ｌａｇ３．５と同一のヒトＬＡＧ－３のエピトープに結合しない。
  12. 請求項１～１１のいずれかに記載の抗ＬＡＧ－３抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
  13. 請求項１～１１のいずれかに記載の抗ＬＡＧ－３抗体の抗原結合部分、および別の異なる抗体の抗原結合部分を含む、二重特異性結合分子。
  14. 請求項１～１１のいずれかに記載の抗ＬＡＧ－３抗体もしくは抗原結合部分、または請求項１３に記載の二重特異性結合分子を含む、ＬＡＧ－３関連障害を有する患者を処置するための医薬組成物。
  15. 請求項１～１１のいずれかに記載の抗体もしくは抗原結合部分、または請求項１３に記載の二重特異性結合分子を含む、患者のがんを処置するための医薬組成物。
  16. がんが、皮膚、肺、腸、結腸、卵巣、脳、前立腺、腎臓、軟部組織、造血系、頭頸部、肝臓、膀胱、乳房、胃、子宮および膵臓からなる群から選択される組織から生じている、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. がんが、線維肉腫、非小細胞肺がん、黒色腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、大腸がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小細胞肺がん、肝細胞がん、膀胱がん、上部尿路がん、食道がん、胃食道接合部がん、胃がん、肝がん、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、卵巣がん、消化管がん、原発性腹膜がん、卵管がん、尿路上皮がん、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺がん、尿生殖器がん、髄膜腫、副腎皮質がん、腎がん、乳がん、膵がん、子宮内膜がん、基底細胞皮膚がん、虫垂がん、胆道がん、唾液腺がん、進行メルケル細胞がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または中皮腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１～１１のいずれかに記載の抗ＬＡＧ－３抗体もしくは抗原結合部分、または請求項１３に記載の二重特異性結合分子を含む、それを必要とする患者の免疫を増強させるための医薬組成物。
  19. 患者が、免疫賦活性物質、ワクチン、化学療法剤、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＬＡＧ－３経路阻害剤、放射線療法、レチノイン酸、フェニルブチレート、オールトランスレチノイン酸、または活性型ビタミンＤをさらに受けている、請求項１４～１８のいずれかに記載の医薬組成物。
  20. 患者が、ヒト患者である、請求項１４～１９のいずれかに記載の医薬組成物。
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