[go: up one dir, main page]

JP7222888B2 - Ｃｄ１２３及びｔｃｒアルファ／ベータに結合することが可能なｔ細胞動員ポリペプチド - Google Patents

Ｃｄ１２３及びｔｃｒアルファ／ベータに結合することが可能なｔ細胞動員ポリペプチド Download PDF

Info

Publication number
JP7222888B2
JP7222888B2 JP2019526298A JP2019526298A JP7222888B2 JP 7222888 B2 JP7222888 B2 JP 7222888B2 JP 2019526298 A JP2019526298 A JP 2019526298A JP 2019526298 A JP2019526298 A JP 2019526298A JP 7222888 B2 JP7222888 B2 JP 7222888B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
polypeptide
binding
seq
polypeptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019526298A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020500510A (ja
JP2020500510A5 (ja
Inventor
ファン・ホーリック，ダイアン
ルーブルック，アンリース
ストルトラー，カトリーン
ヴィエイラ，ジョアン
マクゴーワン，エドワード
Original Assignee
アブリンクス エン．ヴェー．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アブリンクス エン．ヴェー． filed Critical アブリンクス エン．ヴェー．
Publication of JP2020500510A publication Critical patent/JP2020500510A/ja
Publication of JP2020500510A5 publication Critical patent/JP2020500510A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7222888B2 publication Critical patent/JP7222888B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001119—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

発明の分野
本発明は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常ドメインに特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び標的細胞上に発現されるＣＤ１２３に結合する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多特異性Ｔ細胞動員ポリペプチドを提供する。本発明はまた、これらの多特異性ポリペプチドにおける使用のための一価ＣＤ１２３結合ポリペプチドに関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードする核酸、並びに本発明のポリペプチドの産生のためのベクター、宿主、及び方法を提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドを利用する処置の方法及びこれを提供するキットに関する。
背景
ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体のαサブユニット、ＩＬ－３Ｒα）は７５kDaの糖タンパク質であり、これはＮ－グリコシダーゼを用いた消化時に４３kDaになる（Sato et al. 1993, Blood 82: 752-761）。ＣＤ１２３は３つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び短い細胞内領域からなる。Ｎ末端細胞外ドメインは、ＣＤ１２３とＩＬ－３との相互作用に有意に寄与し、細胞内領域はシグナル伝達のために必要である（Barry et al. 1997, Blood 89: 842-852）。ＣＤ１２３は低親和性を伴いＩＬ－３に特異的に結合する。ＣＤ１２３と共通β（βｃ）サブユニット（それ自体ではＩＬ－３に結合せず）とのヘテロ二量体化は、ＩＬ－３について高親和性受容体であるＩＬ－３Ｒの形成をもたらす。βｃサブユニットはシグナル伝達において重要な役割を果たし、そのため広範な生物学的機能を誘発する（Hara et al, 1996 Stem cells 14: 605-618）。
βｃサブユニットは種々の細胞の表面上に発現され、ＣＤ１２３発現はＩＬ－３応答性細胞（例えば造血幹／前駆細胞、単球、巨核球、Ｂリンパ球、及び形質細胞様樹状細胞など）にさらに限定されている。ＩＬ－３の結合は、造血細胞の増殖及び分化を刺激する。これらの細胞の成熟の間に、ＣＤ１２３発現は徐々に減少し、成熟リンパ球及び顆粒球中では検出できない。
ＣＤ１２３は白血病幹細胞（ＬＳＣ）で高発現し、多くの疾患（例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び有毛細胞白血病（ＨＣＬ）など）の開始及び発生に関連付けられると報告されている。ＣＤ１２３及び白血病における関連する臨床応用の詳細については、Liuらの総説を参照のこと（2015 Life Sciences 122: 59-64）。正常な造血幹細胞及びＬＳＣでのＣＤ１２３発現における違いを考えると、ＣＤ１２３は造血器癌における興味深い治療標的である。
ＡＭＬは、ＣＤ１２３の過剰発現を伴うＬＳＣ細胞の小集団から由来するクローン性悪性疾患である。ＡＭＬは、骨髄及び末梢血における骨髄性前駆細胞の増殖により特徴付けられ、正常な造血の破壊をもたらす。ＡＭＬ患者のための治療計画及び支持療法は長年にわたり改善されてきたが、過去３０年間に標準処置の選択肢において大きな変化は生じなかった。ＡＭＬにおける新規アプローチ及び治療選択肢の総説については、Medingerらを参照のこと（2016 Leukemia Research Reports 6: 39-49）。現在、６０歳未満の患者の３５～４０%だけがこの疾患から治癒している。高齢患者（６０歳以上）については、全体的な予後は依然として悪い。同種造血幹細胞移植は現在、治癒のための最良の機会を提供している。それ故に、ＡＭＬを治癒するための新規の治療薬が依然として必要である。
ＡＭＬの予防及び再発の処置のための可能な戦略は免疫療法の使用であり、これは癌研究の急速に成長している分野である。免疫療法によって、身体の免疫監視システム、特にＴ細胞が癌細胞に向けられる。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、癌細胞、（特にウイルスに）感染した細胞、又は他の方法で損傷された細胞を殺すＴリンパ球である。Ｔリンパ球（又はＴ細胞）は、細胞表面にＴ細胞受容体又はＴＣＲ分子及びＣＤ３受容体を発現する。αβＴＣＲ－ＣＤ３複合体（又は「ＴＣＲ複合体」）は、６つの異なるＩ型１回膜貫通型タンパク質：リガンド認識に関与するＴＣＲヘテロ二量体を形成するＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖、並びに非共有結合ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、及びζ鎖で構成され、これらは、受容体活性化時にリン酸化され、多数のシグナル伝達成分を動員する細胞質配列モチーフを持つ（Call et al. 2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305）。
Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖の両方が定常ドメイン及び可変ドメインからなる。生理学的には、Ｔ細胞受容体のαβ鎖はペプチド負荷ＭＨＣ複合体を認識し、ＣＤ３鎖と会合とをつなぐ。これらのＣＤ３鎖によって、その後に細胞内環境に会合シグナルが伝達される。
細胞溶解を媒介する天然の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の潜在力を考慮し、腫瘍細胞死滅を媒介するための免疫細胞を動員するための種々の戦略が探求されてきた。特異的Ｔ細胞応答の誘発は、しかし、癌細胞によるＭＨＣ分子の発現及び特異的ペプチド抗原の存在、生成、輸送、及び提示に依存している。より最近の開発では、組み換え抗体に基づく技術を介してポリクローナル様式で患者の全Ｔ細胞を会合させることにより免疫療法の利点と抗体療法とを組み合わせることによる代替アプローチが試みられてきた：「二重特異性」。
１つのアーム（標的結合アーム）で腫瘍認識部分を有するのに対し、分子の他のアームがＴ細胞抗原（エフェクター結合アーム）、大半がＣＤ３についての特異性を有する二重特異性抗体が設計されてきた。２つのアームがそれらのそれぞれの抗原に同時に結合することによって、Ｔリンパ球は、それらがそれらの細胞溶解機能を発揮することができる腫瘍細胞に向けられて活性化される。
Ｔ細胞を腫瘍細胞に対して活性化するために二重特異性抗体を使用するという概念は２０年以上前に記載されていたが、製造上の問題及び臨床的失敗によってこの分野は停滞した。抗体をそれらの可変フラグメントに縮小することでもたらされるより小さなフォーマットの二重特異性が開発された際、さらなる進歩がなされた。
最初のＴ細胞会合フォーマットであるブリナツモマブ（ＣＤ１９及びＣＤ３を認識するＢｉＴＥ分子）が、２０１４年１２月にＦＤＡによる第二選択処置のために承認されたが、多くのハードルを克服しなければならなかった。ブリナツモマブの最初の臨床試験は、一方では神経学的有害事象、サイトカイン放出症候群、及び感染症のために、他方では客観的な臨床応答又は生物学的活性の頑強な徴候の非存在のために時期を早めて中止された。
ＡＭＬのための処置の選択肢として、MacroGenicsは最近、ＭＧＤ００６、ＣＤ３×ＣＤ１２３二重特異性ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化分子）を開発した。Husainiら（2016 Blood 127:122-131）に記載されているように、ＭＧＤ００６はＣＤ１２３陽性白血病細胞を認識し、Ｔ細胞活性化を誘導し、インビトロ及びインビボでＣＤ１２３過剰発現腫瘍細胞の死滅をもたらすことができる。しかし、ＤＡＲＴはまた、ＣＤ１２３陰性細胞株Ｋ５６２ＧＦＰとのインキュベーション時にＴ細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５を上方調節する（図１Ｄ、Hussaini et al. 2016）。さらに、標的非依存的な死滅が２つのＣＤ１２３陰性細胞株を用いて観察された（図２Ｂ、Hussaini et al. 2016）。従って、このＤＡＲＴを用いると、安全性の問題がこの標的非依存的なＴ細胞活性化から生じうる。
有害事象及び全身性副作用（例えばサイトカインストームなど）のリスクを最小限するために、腫瘍及びＴ細胞抗原アームの両方の選択時には最大の注意を払わなければならない。後者は一価の様式でＴＣＲ複合体の定常ドメインに結合しなければならず、標的となる癌細胞の非存在においてＴ細胞シグナル伝達を誘発しないであろう。両方のアームのそれらの標的（腫瘍及びＴ細胞抗原）への特異的結合だけが、細胞溶解性シナプスの形成及びその後の腫瘍細胞の死滅を誘発しうる。腫瘍認識アームのその抗原についての特異性は、標的外結合（これは必然的に標的非依存的なＴ細胞活性化をもたらすであろう）を回避するための必要条件である。
有効性は別として、ＭＧＤ００６並びにブリナツモマブはサイズが非常に小さく、Ｆｃドメインを欠いている。従って、継続的な静脈内注入がＭＧＤ００６については要求され、これは患者の服薬遵守には寄与しない。MacroGenicsは現在、Ｆｃドメインをその次世代ＤＡＲＴに融合させることによりこの問題を解決しようと試みており（ＷＯ ２０１５０２６８９２）、これによって分子が大きくなるだけでなく、製造上の問題及び他のＦｃ機能の導入がもたらされうる。Ｆｃを伴うより大きなフォーマットは、より良好なＰＫを有すると予想されるが、標的外活性のリスクを再導入する。
それ故に、半減期を調整することができる、最小限の標的非依存的なＴ細胞活性化を伴う代替の二重特異性ＣＤ１２３×Ｔ細胞抗原結合ポリペプチドの必要性が依然としてある。
発明の要約
本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常ドメインに特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含む多特異性ポリペプチドを提供することによりこの問題を解決する。特定の態様では、ポリペプチドはＴ細胞をＣＤ１２３発現細胞にリダイレクトし、Ｔ細胞媒介死滅を誘導する。
Ｔ細胞受容体結合ＩＳＶ及びＣＤ１２３結合ＩＳＶの組み合わせが、ＣＤ１２３発現細胞（の部位）での効率的なＴ細胞活性化をもたらすように特に選択されてきたが、標的非依存的なＴ細胞活性化は最小限に見える。
このように、第１の態様では、本発明は、ＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞を向け直すポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含み、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び、それにおいて、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び、それにおいて、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の２、４、５、６、８、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２７、２９、３０、３１、３３、及び／又は３５位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の１、３、５、７、８、及び／又は９位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５０、５２、５４、５６、５７、及び／又は５８位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の１、４、５、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９５、９８、９９、及び／又は１０１位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
一態様では、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ１は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号１８１；又は
ｂ） 配列番号１８１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ２位では、ＤをＡ、Ｓ、Ｅ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＨをＹに変化させている；
－ ５位では、ＫをＬに変化させている；
－ ６位では、ＩをＬに変化させている；
－ ８位では、ＦをＩ又はＶに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＧをＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
これとは別に、又は加えて、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ２は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号１９２；又は
ｂ） 配列番号１９２のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＨをＴ又はＲに変化させている；
－ ３位では、ＳをＴ又はＡに変化させている；
－ ５位では、ＧをＳ又はＡに変化させている；
－ ７位では、ＱをＤ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶに変化させている；
－ ８位では、ＴをＡ又はＶに変化させている；及び／又は
－ ９位では、ＤをＡ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
これとは別に、又は加えて、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ３は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号２１８；又は
ｂ） 配列番号２１８のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＦをＹ、Ｌ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＩをＬに変化させている；
－ ５位では、ＹをＷに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＮ又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１；又は
ｂ） 配列番号１８１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ２位では、ＤをＡ、Ｓ、Ｅ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＨをＹに変化させている；
－ ５位では、ＫをＬに変化させている；
－ ６位では、ＩをＬに変化させている；
－ ８位では、ＦをＩ又はＶに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＧをＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２；又は
ｄ） 配列番号１９２のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＨをＴ又はＲに変化させている；
－ ３位では、ＳをＴ又はＡに変化させている；
－ ５位では、ＧをＳ又はＡに変化させている；
－ ７位では、ＱをＤ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶに変化させている；
－ ８位では、ＴをＡ又はＶに変化させている；及び／又は
－ ９位では、ＤをＡ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８；又は
ｆ） 配列番号２１８のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＦをＹ、Ｌ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＩをＬに変化させている；
－ ５位では、ＹをＷに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＮ又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
好ましい態様では、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１～１９１からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１９２～２１７からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２１８～２２５からなる群より選択される。
したがって、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なるＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶを含むポリペプチドを提供し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１～１９１からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１９２～２１７からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２１８～２２５からなる群より選択され、並びに、本明細書にさらに記載するようにＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶを含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１９２であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１８であり、並びに、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
本発明のポリペプチドにおける使用のための好ましいＩＳＶは、配列番号４２及び７８～１８０からなる群より、又は配列番号４２及び７８～１８０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択されてもよい。したがって、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、配列番号４２及び７８～１８０からなる群より、又は配列番号４２及び７８～１８０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択され、並びに、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本発明のポリペプチド中の任意の位置に存在しうる。好ましくは、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本発明のポリペプチドのＮ末端に存在する。したがって、さらなる様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、ポリペプチドのＮ末端に位置する。本発明のポリペプチドはさらに１つ以上のＩＳＶを包含する。本発明のポリペプチドにおける使用のためのＩＳＶは、ＣＤ１２３発現標的細胞上に存在するＣＤ１２３に対するそれらの高い特異性について特に選択されている。
さらなる態様では、従って、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは本明細書に記載する通りであり、及びここにおいてＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の３、６、７、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２８、３１、３２、及び／又は３３位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の３、６、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５２、５４、及び／又は５８位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の３、４、及び／又は５位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９７、９８、及び／又は９９位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
本発明では、選択された抗原結合部位又はパラトープを用いてＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶを同定した。一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、ＩＳＶ５６Ａ１０により結合されるエピトープに結合する（即ち、５６Ａ１０と同じファミリーに属するＩＳＶ又は５６Ａ１０に関連するＩＳＶ）。
一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ１は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
これとは別に、又は加えて、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ２は、配列番号１７でありうる。
これとは別に、又は加えて、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ３は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号２１；又は
ｂ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは本明細書に記載する通りであり、及びここにおいてＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は配列番号１７である；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２１；又は
ｄ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
好ましい態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１～１５からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１～２２からなる群より選択される。
したがって、本発明は、本明細書に記載するＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶを含み、並びに４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なるＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含むポリペプチドを提供し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１～１５からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１～２２からなる群より選択される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここにおいてＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１であり、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１である。
本発明のポリペプチドにおける使用のための好ましいＩＳＶは、配列番号１～６からなる群より、又は配列番号１～６の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択されてもよい。したがって、本発明はまた、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、配列番号１～６からなる群より、又は配列番号１～６の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択される。
別の態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、ナノボディ５５Ｆ０３により結合されるエピトープに結合する（即ち、５５Ｆ０３と同じファミリーに属するＩＳＶ又は５５Ｆ０３に関連するＩＳＶ）。
一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ１は配列番号１６である。
これとは別に、又は加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ２は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
これとは別に、又は加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ３は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号２３；又は
ｂ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは本明細書に記載する通りであり、及び、それにおいて、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は配列番号１６である；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２３；又は
ｄ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
好ましい態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８～２０からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２３～２５からなる群より選択される。
したがって、本発明は、本明細書に記載するＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶを含み、並びに４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なるＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含むポリペプチドを提供し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８～２０からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２３～２５からなる群より選択される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは本明細書に記載する通りであり、及びここにおいてＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８であり、及びＣＤＲ３は配列番号２３である。
本発明のポリペプチドにおける使用のための好ましいＩＳＶは、配列番号７～１０からなる群より、又は配列番号７～１０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択されてもよい。したがって、さらなる態様では、本発明はまた、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、配列番号７～１０からなる群より、又は配列番号７～１０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択される。
本発明のポリペプチドは、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つのＩＳＶ又はＣＤ１２３に特異的に結合する１つを上回る、例えば２つ、３つ、又はさらにそれ以上のＩＳＶを包含しうる。さらなる様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、本明細書に記載するＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶを含み、及びＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上、好ましくは２つのＩＳＶを含む。
本発明のポリペプチドに包含される２つ以上、好ましくは２つのＩＳＶは、本明細書に記載するＣＤ１２３に特異的に結合する任意のＩＳＶでありうる。本発明のポリペプチドに包含される２つ以上、好ましくは２つのＩＳＶは、同じＩＳＶでありうる（即ち、同じアミノ酸配列を伴う）、又はそれらは異なるＩＳＶでありうる（即ち、異なるアミノ酸配列を伴う）。一態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶは、第１のＩＳＶ及び第２のＩＳＶを含む二重パラトープであり、ここで第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶにより結合されたＣＤ１２３上のエピトープとは異なるＣＤ１２３上のエピトープに結合する。
好ましくは、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上、好ましくは２つのＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶ及び５５Ｆ０３に関連するＩＳＶである。したがって、一態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで第１のＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶより選択され、第２のＩＳＶは、５５Ｆ０３に関連するＩＳＶより選択される。
ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上、好ましくは２つのＩＳＶは、本発明のポリペプチド中の任意の位置に存在しうる。一態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで第２のＩＳＶは第１のＩＳＶのＮ末端に位置する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで第２のＩＳＶは第１のＩＳＶのＣ末端に位置する。
本発明のポリペプチド中に存在するＩＳＶは、当技術分野において公知であり、本明細書にさらに記載するような任意のＩＳＶでありうる。一態様では、本発明のポリペプチド中に存在するＩＳＶは、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は親和性成熟により得られたＶＨＨより選択される。したがって、さらなる様態では、本発明は、本書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶ及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は親和性成熟により得られたＶＨＨから（本質的に）なる。
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１からなる群より、又は配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択される。
より好ましくは、ポリペプチドは配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１からなる群より選択される。
上で考察するように、本発明のポリペプチドはＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞を向け直す。一様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで前記ポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで前記Ｔ細胞活性化はＭＨＣ認識から非依存的である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、標的細胞上のＣＤ１２３に結合した前記ポリペプチドをＴ細胞に提示することに依存する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、前記Ｔ細胞による１つ以上の細胞応答を起こし、ここで前記細胞応答は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害性活性、活性化マーカーの発現、及び向け直された標的細胞の溶解からなる群より選択される。
特定の態様では、本発明のポリペプチドにより誘導されるＴ細胞活性化は、１nMと１pMの間の平均ＥＣ５０値、例えば５００pM以下の平均ＥＣ５０値など、例えば４００、３００、２００、或いは１００pM未満又はさらに小さい値など、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、或いは３０pM未満又はさらに小さい値などでＣＤ１２３発現細胞の死滅を起こし、前記ＥＣ５０値は、好ましくは、標的細胞としてのＭＯＬＭ－１３細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定される。
別の特定の態様では、本発明のポリペプチドにより誘導されるＴ細胞活性化は、約１０%超、例えば１５%、１６%、１７%、１８%、１９%、或いは２０%又はさらにそれ以上など、例えば２５%超、又はさらに３０%超などの平均溶解パーセンテージでＣＤ１２３発現細胞の溶解を起こし、前記溶解パーセンテージは、好ましくは、標的細胞としてのＭＯＬＭ－１３細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定される。
別の特定の態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで本発明のポリペプチドにより誘導されるＴ細胞活性化は、１００nMと１０pMの間の平均ＥＣ５０値、例えば５０nM以下の平均ＥＣ５０値など、例えば４０、３０、２０、１０、或いは９nM未満又はさらに小さい値など、例えば８、７、６、５、４、３、２、或いは１nM未満又はさらに小さい値など、例えば５００pM未満又はさらに小さい値など、例えば４００、３００、２００、或いは１００pM未満又はさらに小さい値などでＩＦＮ－γ分泌を起こし、前記ＥＣ５０値は、好ましくは、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて決定される。
さらなる様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで前記Ｔ細胞活性化は前記Ｔ細胞の増殖を起こす。
上で考察するように、本発明のポリペプチドは、標的非依存的なＴ細胞活性化が最小となるように選択される。さらなる様態では、従って、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＣＤ１２３陽性細胞の非存在におけるＴ細胞活性化は最小である。
より具体的には、本発明のポリペプチドによるＣＤ１２３陰性細胞のＴ細胞活性化誘導性溶解は、約１０%以下、例えば９%以下など、例えば８、７、或いは６%又はさらにそれ以下などであり、前記溶解は、好ましくは、標的細胞としてのＵ－９３７細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて平均溶解パーセンテージとして決定される。
本発明はまた、構成要素、即ち、本発明のポリペプチドを構成するＩＳＶに関する。したがって、本発明はまた、ＣＤ１２３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらからなるＩＳＶであるポリペプチドを提供し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
より好ましくは、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶであるポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又は（本質的に）それからなり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明はまた、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又は（本質的に）それらからなる、上に記載するポリペプチドを提供し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の３、６、７、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２８、３１、３２、及び／又は３３位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の３、６、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５２、５４、及び／又は５８位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の３、４、及び／又は５位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９７、９８、及び／又は９９位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
本発明では、選択された抗原結合部位又はパラトープを用いてＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶを同定した。一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、ＩＳＶ５６Ａ１０により結合されるエピトープに結合する（即ち、５６Ａ１０と同じファミリーに属するＩＳＶ又は５６Ａ１０に関連するＩＳＶ）。
したがって、一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ１は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
これとは別に、又は加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ２は配列番号１７である。
これとは別に、又は加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ３は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号２１；又は
ｂ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明はまた、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又は（本質的に）それらからなる、上に記載するポリペプチドを提供し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は配列番号１７である；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２１；又は
ｄ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１～１５からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１～２２からなる群より選択される。好ましくは、ＣＤＲ１は配列番号１１であり、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１である。
５６Ａ１０に関連する本発明の好ましいＩＳＶは、配列番号１～６からなる群より、或いは配列番号１～６の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択されてもよい。したがって、さらなる様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでポリペプチドは、配列番号１～６からなる群より、或いは配列番号１～６の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択されてもよい。好ましくは、ポリペプチドは配列番号１～６からなる群より選択される。
一態様では、本発明のポリペプチドは、１０nMと１００pMの間の平均ＥＣ５０値、例えば５nM以下の平均ＥＣ５０値など、例えば４、３、２、或いは１nM未満又はさらに小さい値など（好ましくはフローサイトメトリーにより測定）で、ＭＯＬＭ－１３細胞で発現されたヒトＣＤ１２３に結合する。
別の態様では、本発明のポリペプチドは、１０nMと１００pMの間の平均ＫＤ値、例えば５nM以下の平均ＫＤ値など、例えば４、３、或いは２nM未満又はさらに小さい値などでヒトＣＤ１２３に結合し、前記ＫＤ値は、好ましくは、表面プラズモン共鳴により決定される。
さらに別の態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、ＩＳＶ ５５Ｆ０３により結合されるエピトープに結合する（即ち、５５Ｆ０３と同じファミリーに属するＩＳＶ又は５５Ｆ０３に関連するＩＳＶ）。
したがって、一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ１は配列番号１６である。
これとは別に、又は加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ２は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
これとは別に、又は加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶに包含されるＣＤＲ３は、以下からなる群より選択されてもよい：
ａ） 配列番号２３；又は
ｂ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明はまた、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又は（本質的に）それらからなる、上に記載するポリペプチドを提供し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は配列番号１６である；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２３；又は
ｄ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８～２０からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２３～２５からなる群より選択される。好ましくは、ＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８であり、及びＣＤＲ３は配列番号２３である。
５６Ａ１０に関連する本発明の好ましいＩＳＶは、配列番号７～１０からなる群より、或いは配列番号７～１０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択されてもよい。したがって、さらなる様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでポリペプチドは、配列番号７～１０からなる群より、或いは配列番号７～１０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択されてもよい。好ましくは、ポリペプチドは配列番号７～１０からなる群より選択される。
一態様では、本発明のポリペプチドは、１０μMと１００nMの間の平均ＥＣ５０値、例えば５μM以下の平均ＥＣ５０値など、例えば４、３、２、或いは１μM未満又はさらに小さい値など（好ましくはフローサイトメトリーにより測定）で、ＭＯＬＭ－１３細胞で発現されたヒトＣＤ１２３に結合する。
別の態様では、本発明のポリペプチドは、１μMと１０nMの間の平均ＫＤ値、例えば５００nM以下の平均ＫＤ値など、例えば４００、３００、或いは２００nM未満又はさらに小さい値などでヒトＣＤ１２３に結合し、前記ＫＤ値は、好ましくは、表面プラズモン共鳴により決定される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドの少なくとも１つのＣＤ１２３への結合を交差遮断する、又は配列番号１～１０を伴うポリペプチドの１つのＣＤ１２３への結合を交差遮断するポリペプチドを提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドの少なくとも１つによりＣＤ１２３への結合から交差遮断されている、又は配列番号１～１０を伴うポリペプチドの１つによりＣＤ１２３への結合から交差遮断されているポリペプチドを提供する。
本明細書に記載するＣＤ１２３に特異的に結合するポリペプチドは、好ましくは、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は親和性成熟により得られたＶＨＨから（本質的に）なる。
ＣＤ１２３に特異的に結合する本発明のポリペプチドは、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含みうる。したがって、さらなる態様では、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合する、２つ以上、好ましくは２つのＩＳＶを含むポリペプチドを提供する。好ましい態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶ、好ましくは２つのＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶの群より又は５５Ｆ０３に関連するＩＳＶの群より選択される。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つのＩＳＶを含む、ＣＤ１２３に特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここでＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶの群より又は５５Ｆ０３に関連するＩＳＶの群より選択される。
ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶ、好ましくは２つのＩＳＶを含む本発明のポリペプチドは、好ましくは第１のＩＳＶ及び第２のＩＳＶを含む二重パラトープであり、ここで第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶにより結合されたＣＤ１２３上のエピトープとは異なるＣＤ１２３上のエピトープに結合する。好ましい態様では、第１のＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶの群より選択され、第２のＩＳＶは、５５Ｆ０３に関連するＩＳＶの群より選択される。
ＩＳＶは、ＣＤ１２３に結合する本発明の二重パラトープポリペプチド中の任意の位置に存在しうる。一態様では、第２のＩＳＶは第１のＩＳＶのＮ末端に位置する。別の態様では、第２のＩＳＶは第１のＩＳＶのＣ末端に位置する。
本発明のポリペプチド中に存在するＩＳＶは互いに直接連結されてもよく、又はそれらは１つ以上のリンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結されてもよい。したがって、さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここでＩＳＶは互いに直接連結されている、又はリンカーを介して互いに連結されている。本発明のポリペプチドにおける使用のための好ましいリンカーを表Ｂ－３（配列番号３２５～３３６）に示す。そのため、さらなる様態では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、それにおいてリンカーは配列番号３２５～３３６からなる群より選択される。
本発明はさらに、本明細書に記載するポリペプチドを含み、及び１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含み、場合により１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されている構築物（本明細書において「本発明の構築物」ともいう）を包含する。
さらなる態様では、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位を伴わない対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期を伴う構築物を提供しうる。増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、血清中でのポリペプチドの保持を提供する任意の分子でありうる。一態様では、増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質又はそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質に結合することができる小型タンパク質又はペプチドからなる群より選択される。
したがって、一態様では、本発明は、本明細書に記載する構築物を提供し、それにおいて増加した半減期を伴う構築物を提供する前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）からなる群より選択される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載する構築物を提供し、それにおいて増加した半減期を伴う構築物を提供する前記の１つ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）に結合することができる結合単位からなる群より選択される。好ましくは、増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する、前記の１つ以上の他の結合単位は、血清タンパク質に結合するＩＳＶである。さらなる態様では、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶは、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、又はラクダ化ＶＨから（本質的に）なりうる。
本明細書に記載する構築物における使用のために好ましいＩＳＶは、血清アルブミンに結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から（本質的に）なるＩＳＶであり、それにおいてＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳ（配列番号３６３）又はＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳ（配列番号３６４）であり、ＣＤＲ２はＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬ（配列番号３６５）であり、及びＣＤＲ３はＧＧＳＬＳＲ（配列番号３６６）である。血清アルブミンに結合する好ましいＩＳＶは、配列番号４３および３５１～３６２からなる群より選択される。
本発明のポリペプチドに関して、他の基、残基、部分、又は結合単位（例えばＩＳＶなど）は、互いに直接連結してもよく、又はリンカーを介して互いに連結してもよい。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載する構築物を提供し、それにおいてリンカーは配列番号３２５～３３６からなる群より選択される。
本発明の好ましい構築物は、配列番号６３～６７からなる群より、或いは配列番号６３～６７の１つ、好ましくは配列番号６３～６７と８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有する構築物より選択されてもよい。
本発明の構築物は配列最適化してもよく、例えば、構築物をよりヒト様にする、構築物の発現を改善する、保存時の構築物の安定性を増加させる、及び／又は血清中に前から存在する抗体による構築物の結合傾向を減らす。一態様では、本発明は、Ｃ末端延長（Ｘ）ｎをさらに含む、本明細書に記載する構築物を提供し、それにおいてｎは１～５、例えば１、２、３、４、又は５などであり、それにおいてＸは天然に存在するアミノ酸であり、好ましくはシステインではない。好ましい構築物は配列番号３３８～３４２からなる群より選択される。
本発明はまた、本明細書に定義するポリペプチド及び構築物をコードする核酸を提供する（すなわち、それらが、それをコードする核酸の発現により得られるようにする）。一態様では、本明細書に記載する核酸は遺伝子構築物の形態である。
本発明はまた、本明細書に定義する核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明はまた、本明細書に定義する核酸又は本明細書に定義する発現ベクターを含む宿主又は宿主細胞を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義するポリペプチド又は構築物の産生のための方法を提供し（すなわち、それが、それをコードする核酸の発現により得ることができるようにする）、前記方法は以下の工程を少なくとも含む：
ａ） 適切な宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適切な発現系において、本明細書に定義する核酸を発現させること；場合により、以下が続く：
ｂ） 本明細書に定義するポリペプチド又は構築物を単離及び／又は精製すること。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に定義する少なくとも１つのポリペプチドもしくは構築物又は本明細書に定義する核酸を含む組成物を提供する。一態様では、組成物は医薬的組成物である。一態様では、組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤、及び／又はアジュバントをさらに含み、場合により、１つ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む。
本発明はまた、医薬としての使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を提供する。さらなる態様では、本発明は、医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供する。さらなる様態では、本発明は、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする被験者に医薬的に活性な量の本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を投与する工程を含む、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解のための方法を提供する。本発明はまた、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供する。限定するものではないが、ＣＤ１２３関連疾患又は状態は増殖性疾患又は炎症状態でありうる。したがって、さらなる態様では、本発明は、増殖性疾患又は炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする被験者に医薬的に活性な量の本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を投与する工程を含む、増殖性疾患又は炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解のための方法を提供する。本発明はまた、増殖性疾患又は炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供する。
限定するものではないが、増殖性疾患は癌でありうる。したがって、さらなる態様では、本発明は、癌の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、本明細書に記載する組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする被験者に医薬的に活性な量の本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を投与する工程を含む、癌の予防、処置、及び／又は寛解のための方法を提供する。本発明はまた、癌の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供する。
本発明の方法により処置される癌は、ＣＤ１２３標的細胞死滅により処置されることが公知である任意の癌でありうる。異常に増殖する細胞でのＣＤ１２３発現を含むことが公知である癌は、（限定されるものではないが）リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫を含む。したがって、さらなる態様では、本発明は、リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫から選択される癌の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、本明細書に記載する組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする被験者に医薬的に活性な量の本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を投与する工程を含む、リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫から選択される癌の予防、処置、及び／又は寛解のための方法を提供する。本発明はまた、リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される癌の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供する。
本発明の方法により処置される炎症状態は、ＣＤ１２３標的細胞死滅により処置されることが公知である任意の炎症状態でありうる。細胞でのＣＤ１２３発現を含むことが公知である炎症状態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチを含む（これらに限定しない）。したがって、さらなる態様では、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択された炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、本明細書に記載する組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする被験者に医薬的に活性な量の本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物を投与する工程を含む、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択される炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解のための方法を提供する。本発明はまた、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択される炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供する。
本発明のポリペプチド、構築物、及び組成物はまた、別の治療薬物との組み合わせにおいて使用することができる。したがって、さらなる態様では、本発明は、併用処置における使用のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、本明細書に記載する組成物を提供する。
本発明はまた、本明細書に記載する方法を提供し、ここで処置は併用処置である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載する予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、又は本明細書に記載する組成物の使用を提供し、ここで処置は併用処置である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド、本明細書に記載する構築物、本明細書に記載する核酸、本明細書に記載する発現ベクター、又は本明細書に記載する宿主もしくは宿主細胞を含むキットを提供する。
１００nM抗ヒトＴＣＲα／β抗体（クローンＢＷ２４２／４１２）（黒色）及び１００nM抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ－３）（灰色）を使用した、トランスフェクトＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、及びＬiａｎａ細胞株におけるヒトＴＣＲ／ＣＤ３及びヒトＣＤ３の発現の評価。ＭＣＦ値（平均チャンネル蛍光）を各々の細胞株についてプロットした。Ｘ軸は細胞型及びトランスフェクトされた遺伝子を表す；ＣＤ３はＣＤ３複合体（イプシロン、デルタ、ガンマ、及びゼータ鎖）を用いたトランスフェクションを示し、ｈｕＴＣＲはＴＣＲα／β鎖を用いたトランスフェクションを示し、ここで使用される可変ドメインは括弧の間にある。 抗非ヒト霊長類／ラットＴＣＲα／β抗体クローンＲ７３；抗ヒトＴＣＲα／β抗体（黒丸）及び無関係の抗卵リゾチームナノボディ（ｃＡｂｌｙｓ）（白丸）を使用した可溶性組換えカニクイザルＴＣＲα／βタンパク質の品質評価。ＯＤ値を ナノボディの濃度に対してプロットした。 ＣＨＯ－Ｋ１細胞で発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３（図３Ａ）及び初代ヒトＴ細胞（図３Ｂ）への一価抗ＴＣＲナノボディＴ０１７００５５Ａ０２の用量依存的結合。ＣＨＯ－Ｋ１細胞で発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３（図３Ｃ）及び初代ヒトＴ細胞（図３Ｄ）への一価抗ＴＣＲナノボディＴ０１７００５６Ｇ０５の用量依存的結合。ＭＣＦ値（平均チャンネル蛍光）をナノボディの濃度に対してプロットした。 ＨＥＫ２９３ＨヒトＴＣＲ（２ＩＡＮ／ＣＤ３（黒丸）、ＨＥＫ２９３ＨヒトＣＤ３（十字）、及びＨＥＫ２９３Ｈ参照細胞株（白丸）への一価抗ＴＣＲナノボディＴ０１７００５５Ａ０２（図４Ａ）及びＴ０１７００５６Ｇ０５（図４Ｂ）の用量依存的結合（図４Ｂ）。ＭＣＦ値（平均チャンネル蛍光）をナノボディの濃度に対してプロットした。 可溶性組換えヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）－ジッパータンパク質への一価抗ＴＣＲナノボディＴ０１７００５５Ａ０２（図４Ａ、黒丸）及びＴ０１７００５６Ｇ０５（図４Ｂ、黒丸）並びに無関係のナノボディ（図４Ａ及び図４Ｂ、白丸）の用量依存的結合。４５０nmでのＯＤをナノボディの濃度に対してプロットした。 Octet RED384機器でのBioLayer Interferometryを介した可溶性組換えヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）－ジッパータンパク質相互作用に関するＴ０１７０００５５Ａ０２（図６Ａ）及びＴ０１７０００５６Ｇ０５（図６Ｂ）の動態解析。適用した分析物濃度は、１０００、３３３、１１１、３７、１２．３、４．１、及び１．４nMであった。動態データへのラングミュア適合を、黒線を用いて示しているのに対し、センサーグラムを灰色線により提示している。 可溶性組換えカニクイザルＴＣＲα／β－ジッパータンパク質への一価抗ＴＣＲナノボディＴ０１７００５５Ａ０２（図７Ａ、黒丸）及びＴ０１７００５６Ｇ０５（図７Ｂ、黒丸）並びに無関係のナノボディ（図７Ａ及び図７Ｂ、白丸）の用量依存的結合。４５０nmでのＯＤをナノボディの濃度に対してプロットした。 Octet RED384機器でのBioLayer Interferometryを介した可溶性組換えカニクイザルＴＣＲα／β－ジッパータンパク質相互作用へのＴ０１７００５５Ａ０２（図８Ａ）及びＴ０１７００５６Ｇ０５（図８Ｂ）の動態解析。適用した分析物濃度は、１０００、３３３、１１１、３７、１２．３、４．１、及び１．４nMであった。動態データへのラングミュア適合を、黒線を用いて示しているのに対し、センサーグラムを灰色線により提示している。 ビーズ結合一価抗ＴＣＲナノボディのＴ細胞活性化データ（図９Ａ）。溶液中に提示された一価抗ＴＣＲナノボディのＴ細胞活性化データ（図９Ｂ）。活性化を初代ヒトＴ細胞上のＣＤ６９上方調節をモニターすることにより測定した。ＭＣＦ値（平均チャンネル蛍光）を各々のナノボディについてプロットした。 フローサイトメトリーにおける抗ＣＤ１２３抗体（BD Biosciences、カタログ番号５５４５２７）（黒色）及びアイソタイプ対照（eBioscience、カタログ番号１６－４７２４－８５）、続いてＰＥ標識ヤギ抗マウス（Jackson Immunoresearch lab.Inc.、カタログ番号１１５－１１６－０７１）（灰色）を使用した、ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ－Ｉｎ、ＨＥＫ２９３ Ｆｌｐ－ＩｎカニクイザルＣＤ１２３、ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ、及びＣＨＯ Ｆｌｐ－ＩｎヒトＣＤ１２３でのヒトＣＤ１２３発現の発現の評価。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を各々の細胞株についてプロットした。 フローサイトメトリーにおけるＡＰＣ標識抗ＣＤ１２３抗体（BD Biosciences、カタログ番号５６００８７）（黒色）及びＡＰＣ標識アイソタイプ対照（Biolegend、カタログ番号４００２２０）（灰色）を使用した、Ｕ－９３７、ＭＯＬＭ－１３、ＫＧ１ａ、及びＮＣＩ－Ｈ９２９細胞でのヒトＣＤ１２３発現の評価。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を各々の細胞株についてプロットした。 ＭＯＬＭ－１３細胞（図１２Ａ）及びＫＧ１ａ細胞（図１２Ｃ）への一価抗ＣＤ１２３ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０の用量依存的結合。ＭＯＬＭ－１３細胞（図１２Ｂ）及びＫＧ１ａ細胞（図１２Ｄ）への一価抗ＣＤ１２３ナノボディＡ０１１００５５Ｆ０３の用量依存的結合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 Ｆｌｐ－Ｉｎ親ＣＨＯ細胞（白抜き記号）及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ細胞（黒塗り記号）へのＡｌｅｘａ６４７標識Ａ０１１００５６Ａ１０の用量依存的結合（図１３Ａ）。Ｆｌｐ－Ｉｎ親ＨＥＫ細胞（白抜き記号）及びカニクイザルＣＤ１２３トランスフェクトＨＥＫ細胞（黒塗り記号）へのＡｌｅｘａ６４７標識Ａ０１１００５６Ａ１０の用量依存的結合（図１３Ｂ）。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 Ｆｌｐ－Ｉｎ親ＣＨＯ細胞（白抜き記号）及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ細胞（黒塗り記号）へのＡ０１１００５５Ｆ０３の用量依存的結合（図１４Ａ）。Ｆｌｐ－Ｉｎ親ＨＥＫ細胞（白抜き記号）及びカニクイザルＣＤ１２３トランスフェクトＨＥＫ細胞（黒塗り記号）へのＡｌ１１００５５Ｆ０３の用量依存的結合（図１４Ｂ）。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ＭＯＬＭ－１３細胞（図１５Ａ）への及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（図１５Ｂ）での一価抗ＣＤ１２３ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ ６４７の用量依存的結合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ＭＯＬＭ－１３細胞（図１６Ａ）での及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞上（図１６Ｂ）でのヒトＣＤ１２３への結合についての、一価ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０（四角）及びＡ０１１００５５Ｆ０３（丸）とＡｌｅｘａ ６４７標識Ａ０１１００５６Ａ１０との用量依存的競合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ＭＯＬＭ－１３細胞（図１７Ａ）での及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（図１７Ｂ）でのヒトＣＤ１２３へのＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１２３（クローン７Ｇ３）抗体の用量依存的結合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ｈｕＣＤ１２３をトランスフェクトしたＭＯＬＭ－１３細胞（図１８Ａ）で又はＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（図１８Ｂ）で発現されたＣＤ１２３への結合についての、一価ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０（四角）及びＡ０１１００５５Ｆ０３（丸）とＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１２３（クローン７Ｇ３）抗体との用量依存的競合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 自家ビオチン化ＣＤ１２３組換えタンパク質（R&D Systems、カタログ番号３０１－Ｒ３／ＣＦ）へのマウス抗ヒトＣＤ１２３（クローン７Ｇ３）抗体の用量依存的結合。４５０nmでのＯＤを濃度に対してプロットした。 ＥＬＩＳＡにおけるＣＤ１２３タンパク質への結合についての、一価抗ＣＤ１２３ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０（四角）及びＡ０１１００５５Ｆ０３（黒丸）とマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）（BD Biosciences、カタログ番号５５４５２７）との用量依存的競合（図２０Ａ）。溶液中（星印）の無関係の抗卵リゾチームナノボディｃＡｂＬｙｓ（白丸）及びマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）をそれぞれ陰性対照及び陽性対照として置いた（図２０Ｂ）。４５０nmでのＯＤを濃度に対してプロットした。 ＭＯＬＭ－１３細胞（図２１Ａ）への、ヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（図２１Ｂ）への、及びカニクイザルＣＤ１２３トランスフェクトＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（図２１Ｃ）への一価抗ＣＤ１２３ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ ６４７の用量依存的結合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ＭＯＬＭ－１３細胞で発現されたＣＤ１２３（図２２Ａ）及びＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞にトランスフェクトされたｈｕＣＤ１２３（図２２Ｃ）又はＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞にトランスフェクトされたｃｙＣＤ１２３（図２２Ｂ）への結合についての、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとＡｌｅｘａ６４７－Ａ０１１００５６Ａ１０との用量依存的競合。無関係の多価ポリペプチドＴ０１７０００１２９を陰性対照として置いた。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ＣＨＯ－Ｋ１細胞で発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３への結合についての、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとビオチン化－Ｔ０１７００５６Ｇ０５との用量依存的競合。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 ＨＳＣ－Ｆで発現されたＣＤ３／ＴＣＲへの結合についての、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとＴ０１７００００９９との用量依存的競合。一価Ｈｉｓタグ付きＴ０１７０００１２５を陽性対照として置いた。ＭＦＩ値（チャネル蛍光強度中央値）を濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるフローサイトメトリーベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３発現ＭＯＬＭ－１３細胞の用量依存的なリダイレクトヒトエフェクターＴ細胞死滅。Ａ０１１００５６Ａ１０、Ｔ０１７０００１３２、及びＴ０１７０００１２９を陰性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるフローサイトメトリーベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３発現ＫＧ１ａ細胞の用量依存的なリダイレクトヒトエフェクターＴ細胞死滅。Ａ０１１００５６Ａ１０、Ｔ０１７０００１２９、及びＴ０１７０００１３２を陰性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるフローサイトメトリーベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３細胞の用量依存的なリダイレクトカニクイザルエフェクターＴ細胞死滅。Ａ０１１００５６Ａ１０を陰性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比８を使用した、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるフローサイトメトリーベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３陽性ＫＧ１ａ細胞の用量依存的なリダイレクトカニクイザルエフェクターＴ細胞死滅。いくつかの無関係な構築物を陰性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 ７２時間のインキュベーション時間後のヒトＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３細胞のリダイレクトカニクイザルエフェクターＴ細胞死滅の間でのＣＤ４／ＣＤ８＋ゲートＴ細胞での多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによる用量依存的なＴ細胞活性化（ＣＤ２５上方調節）。ＣＤ４／ＣＤ８＋ゲートＴ細胞内のＭＦＩ（平均蛍光強度）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１５：１を使用した、Ｔ０１７０００１３９（黒色菱形）によるxCELLienceベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞の用量依存的なリダイレクトヒトエフェクターＴ細胞死滅。一価ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０、Ｔ０１７００５６Ｇ０５、及び無関係の構築物Ｔ０１７０００１２９を陰性対照として置いた。５０時間のインキュベーション時間後の細胞指数（ＣＩ）を多特異性ポリペプチドの濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１５：１を使用したxCELLigenceベースのアッセイにおけるＣＤ１２３陰性ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ参照細胞株を使用したリダイレクトヒトエフェクターＴ細胞死滅アッセイにおける一価構成要素及び多特異性ポリペプチド。５０時間のインキュベーション時間後のＣＩを多特異性ポリペプチドの濃度に対してプロットした。 Ｔ細胞の非存在におけるＣＤ１２３トランスフェクト細胞株（図３２Ａ）及び参照細胞株（図３２Ｂ）の増殖に対する一価構成要素及び多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチド。５０時間のインキュベーション時間後のＣＩを多特異性ポリペプチドの濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１５：１を使用した、Ｔ０１７０００１３９によるxCELLigenceベースのアッセイにおけるカニクイザルＣＤ１２３トランスフェクトＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞の用量依存的なリダイレクトカニクイザルエフェクターＴ細胞死滅。一価ナノボディ、Ｔ０１７００５６Ｇ０５、及び無関係の構築物Ｔ０１７０００１２９を陰性対照として置いた。８０時間のインキュベーション時間後のＣＩを多特異性ポリペプチドの濃度に対してプロットした。 ＣＤ１２３陰性ＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ参照細胞株を使用したリダイレクトカニクイザルＴ細胞死滅アッセイにおける一価構成要素及び多特異性ポリペプチド。８０時間のインキュベーション時間後のＣＩを多特異性ポリペプチドの濃度に対してプロットした。 Ｔ細胞の非存在におけるＣＤ１２３トランスフェクト細胞株（図３５Ａ）及び参照細胞株（図３５Ｂ）の増殖に対する一価構成要素及び多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチド。８０時間のインキュベーション時間後のＣＩを多特異性ポリペプチドの濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、ヒトＣＤ１２３発現ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ標的細胞の多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチド依存的なリダイレクトＴ細胞死滅の間でのヒトエフェクターＴ細胞（図３６Ａ）又はカニクイザルエフェクターＴ細胞（図３６Ｂ）による用量依存的なサイトカイン産生。ＩＮＦ－γ産生を７２時間後に測定した。ＯＤ値を濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、ヒトＣＤ１２３発現ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ標的細胞の多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチド依存的なリダイレクトＴ細胞死滅の間でのエフェクターＴ細胞による用量依存的サイトカイン産生。ＩＬ－６産生を７２時間後に測定した。pg/ml値を濃度に対してプロットした。 ５時間のインキュベーション時間後の健常ヒト（図３８Ａ）及びカニクイザル（図３８Ｂ）ＰＢＭＣ試料中の多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるＣＤ１２３＋ｐＤＣ及び好塩基球のリダイレクト自己Ｔ細胞媒介枯渇。Ｌｉｎ－／ＣＤ１２３＋細胞（ｐＤＣ及び好塩基球）のパーセンテージを構築物の濃度に対してプロットした。 ５時間（図３９Ａ）及び２４時間（図３９Ｂ）のインキュベーション時間後の健常ヒトＰＢＭＣ試料中の多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるリダイレクト自己Ｔ細胞単球枯渇。単球（ＣＤ１４＋細胞）のパーセンテージを構築物の濃度に対してプロットした。 ２４時間のインキュベーション時間後の自己ＣＤ１２３陽性細胞のリダイレクトＴ細胞死滅の間でのＣＤ３＋ゲートＴ細胞での多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによる用量依存的なＣＤ６９上方制御、ヒトＴ細胞活性化。ＣＤ３＋ゲートＴ細胞内のＭＦＩ（平均蛍光強度）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用したフローサイトメトリーベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３ＫＧ１ａ細胞のリダイレクトヒト（図４１Ａ）又はカニクイザル（図４１Ｂ）エフェクターＴ細胞死滅についての、一価ナノボディ及び無関係の多価ポリペプチドＴ０１７０００１２９の用量依存的特徴付け。Ｔ０１７０００１３９（黒色菱形）を陽性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、フローサイトメトリーベースのアッセイにおけるヒトＣＤ１２３ ＭＯＬＭ－１３細胞のリダイレクトヒト（図４２Ａ）又はカニクイザル（図４２Ｂ及び図４２Ｃ）エフェクターＴ細胞死滅についての、一価ナノボディ及び無関係の多価ポリペプチドＴ０１７０００１２９の用量依存的な特徴付け。Ｔ０１７０００１３９（黒色菱形）を陽性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、ＭＯＬＭ－１３（図４３Ａ及び図４３Ｃ）及びＫＧ１ａ（図４３Ｂ）標的細胞の多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチド依存的なリダイレクトＴ細胞死滅の間でのヒトエフェクターＴ細胞による用量依存的サイトカイン産生。ヒトＩＬ－６（図４３Ｃ）及びＩＦＮ－γ（図４３Ａおよび図４３Ｂ）産生を７２時間後に測定した。サイトカインの濃度を濃度に対してプロットした。 ＣＤ１２３陰性ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株を使用したフローサイトメトリーベースのアッセイにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによる標的非依存的なリダイレクトヒトエフェクターＴ細胞死滅の用量依存的な特徴付け。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 ＣＤ１２３陰性Ｕ９３７細胞株を使用したフローサイトメトリーベースのアッセイにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによる標的非依存的なリダイレクトヒト（図４５Ａ）又はカニクイザル（図４５Ｂ）エフェクターＴ細胞死滅の用量依存的な特徴付け。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 ７２時間のインキュベーション時間後のＣＤ１２３陰性Ｕ－９３７細胞のカニクイザルエフェクターＴ細胞死滅の間（図４６Ａ）及びＣＤ１２３陰性ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞のヒトエフェクターＴ細胞死滅の間（図４６Ｂ）でのＣＤ４／ＣＤ８＋ゲートＴ細胞での多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによる用量依存的なＴ細胞活性化読み取り。ＣＤ４／ＣＤ８＋ゲートＴ細胞内のＭＦＩ（平均蛍光強度）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、ヒトエフェクターＴ細胞及びＮＣＩ－Ｈ９２９標的細胞を使用したサイトカイン産生に対する多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの影響。ヒトＩＬ－６（図４７Ｂ）及びＩＦＮ－γ（図４７Ａ）産生を測定した。サイトカインの量のＯＤ値を濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、リダイレクトＭＯＬＭ－１３標的細胞死滅設定における多特異性ポリペプチドによるヒトエフェクターＴ細胞の用量依存的なＴ細胞増殖。ＣＰＭ（カウント毎分）を濃度に対してプロットした。 標的細胞の非存在における多特異性ポリペプチドによるヒトエフェクターＴ細胞の用量依存的Ｔ細胞増殖。ＣＰＭ（カウント毎分）を濃度に対してプロットした。 異なるＥ：Ｔ比でのＴ０１７０００１１４及びＭＯＬＭ－１３細胞の存在における非活性化及び前活性化Ｔ細胞の溶解能。細胞死%を構築物の濃度に対してプロットした。 異なるＥ：Ｔ比でのＴ０１７０００１３９及びＫＧ１ａ細胞の存在における非活性化及び前活性化Ｔ細胞の溶解能。細胞死%を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるフローサイトメトリーベースのアッセイにおける血清アルブミンの非存在又は存在におけるＭＯＬＭ－１３細胞の用量依存的なリダイレクトヒト（図５２Ａ及び５２Ｂ）及びカニクイザル（図５２Ｃ及び５２Ｄ）Ｔ細胞死滅。無関係の多価ポリペプチドＴ０１７０００１２９並びに一価構成要素Ａ０１１００５６Ａ１０及びＴ０１７００５６Ｇ０５を陰性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）をポリペプチドの濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるフローサイトメトリーベースのアッセイにおける血清アルブミンの非存在又は存在におけるＫＧ１ａ細胞の用量依存的なリダイレクトヒト（図５３Ａ、５３Ｂ、及び５３Ｃ）及びカニクイザル（図５３Ｄ、５３Ｅ、及び５３Ｆ）Ｔ細胞死滅。無関係の多価ポリペプチドＡ０２２６００００９（ＳＡの存在又は非存在における）及びＴ０１７０００１２９並びに一価構成要素Ａ０１１００５６Ａ１０及びＴ０１７００５６Ｇ０５を陰性対照として置いた。細胞死%（ＴＯＰＲＯ陽性細胞の%）を構築物の濃度に対してプロットした。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、ＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるＭＯＬＭ－１３のリダイレクトＴ細胞死滅の間でのヒトＴ細胞による用量依存的なサイトカイン産生。ヒトＩＬ－６（図５４Ｂ）及びＩＦＮ－γ（図５４Ａ）産生を測定した。サイトカインの量を濃度に対してプロットしている。 エフェクター対標的比１０：１を使用した、リダイレクトＭＯＬＭ－１３標的細胞死滅設定におけるＨＬＥ多特異性ポリペプチドによるヒトエフェクターＴ細胞の用量依存的なＴ細胞増殖。ＣＰＭ（カウント毎分）を濃度に対してプロットした。 ５時間のインキュベーション時間後の健常ヒトＰＢＭＣ試料中の多価ＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるリダイレクト自己Ｔ細胞のリダイレクトＣＤ１２３＋ｐＤＣ及び好塩基球の枯渇。Ｌｉｎ－／ＣＤ１２３＋細胞（ｐＤＣ及び好塩基球）のパーセンテージを構築物の濃度に対してプロットした。 ５時間のインキュベーション時間後のインビトロ設定における健常カニクイザルＰＢＭＣ試料中の多価ＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるリダイレクト自己Ｔ細胞のリダイレクトＣＤ１２３＋ｐＤＣ及び好塩基球の枯渇。Ｌｉｎ－／ＣＤ１２３＋細胞（ｐＤＣ及び好塩基球）のパーセンテージを構築物の濃度に対してプロットした。 ２４時間のインキュベーション時間後の健常ヒトＰＢＭＣ試料中の多価ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるリダイレクト自己Ｔ細胞のリダイレクト単球枯渇。単球（ＣＤ１４＋細胞）のパーセンテージを構築物の濃度に対してプロットした。 処置されたカニクイザルの末梢血中の経時的なＴ細胞数。血液１μL当たりのＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（図５９Ａ）及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（図５９Ｂ）の絶対数を、異なる処置群についての経時的な平均値±ＳＥＭとして表す：陽性対照（白丸、ｎ＝２） 無関係／ＴＣＲポリペプチド（十字、ｎ＝４）、ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチド（黒三角、ｎ＝４）。灰色バーは連続注入処置期間を反映する。 処置されたカニクイザルの末梢血中の経時的なＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞数。血液１μl当たりのＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞の絶対数を、異なる処置群についての平均値±ＳＥＭとして表す：陽性対照（白丸、ｎ＝２）、無関係／ＴＣＲポリペプチド（十字、ｎ＝４）、ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチド（黒三角、ｎ＝４）。灰色バーは連続注入処置期間を反映する。 ＣＤ４＋ＣＤ３＋及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞での経時的なＰＤ－１発現。血液中のＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（図６１Ａ）及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（図６１Ｂ）の頻度を、異なる処置群についての平均値±ＳＥＭとして表す：陽性対照（白丸、ｎ＝２）、無関係／ＴＣＲ ポリペプチド（十字、ｎ＝４）、ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチド（黒三角、ｎ＝４）。灰色バーは連続注入処置期間を反映する。 処置されたカニクイザルにおける経時的な血清インターロイキン－６。血清中のＩＬ－６の濃度を、異なる処置群についての平均値±ＳＥＭ（pg/mL）として表す：陽性対照（白丸、ｎ＝２）、無関係／ＴＣＲポリペプチド（十字、ｎ＝４）、ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチド（黒三角、ｎ＝４）。灰色バーは連続注入処置期間を反映する。
詳細な説明
定義
他に示さない又は定義しない限り、使用する全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは当業者に明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrookら（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、F. Ausubelら（1987, Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York）、Lewin（1985, Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）、Oldら（1981, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd Ed.) University of California Press, Berkeley, CA）、Roittら（2001, Immunology (6th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh）、Roittら（2001, Roitt’s Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK）、Janewayら（2005, Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York）など、並びに本明細書に引用する一般的な背景技術を参照のこと。
他に示さない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、及び操作を実施することができ、それ自体が公知の様式において実施されており、当業者に明かであろう通りである。例えば、再び、標準的なハンドブック及び本明細書において言及する一般的な背景技術、並びに本明細書において引用するさらなる参考文献；並びに、例えば、以下の総説、Presta（2006, Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56）、Levin及びWeiss（2006, Mol. Biosyst. 2(1): 49-57）、Irvingら（2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45）、Schmitzら（2000, Placenta 21 Suppl. A: S106-12）、Gonzalesら（2005, Tumour Biol. 26(1): 31-43）を参照し、それらは、タンパク質工学のための技術、例えば親和性成熟及びタンパク質（例えば免疫グロブリンなど）の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術などを記載している。
本明細書において使用する用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」、又は「タンパク質配列」などの用語において）は一般的に、文脈がより限定された解釈を要求しない限り、関連するアミノ酸配列並びにそれをコードする核酸又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解すべきである。アミノ酸配列は、文脈に依存して、単一アミノ酸あるいは２つ以上のアミノ酸の非分枝配列を意味すると解釈する。ヌクレオチド配列は、３つ以上のヌクレオチドの非分岐配列を意味すると解釈する。
アミノ酸は、天然に存在するタンパク質に一般に見出されるＬ－アミノ酸であり、下の表Ｂ－１に列挙する。Ｄ－アミノ酸を含むそれらのアミノ酸配列をこの定義により包含することを意図しない。翻訳後修飾アミノ酸を含む任意のアミノ酸配列は、修飾位置（例、ヒドロキシル化又はグリコシル化）を伴い、下の表に示す記号を使用し、最初に翻訳されるアミノ酸配列として記載してもよいが、これらの修飾はアミノ酸配列において明示的に示してはならない。配列修飾結合、架橋及び末端キャップ、非ペプチジル結合などとして発現させることができる任意のペプチド又はタンパク質をこの定義に包含する。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質／ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、本開示を通して互換的に使用し、各々は本開示の目的のために同じ意味を有する。各々の用語は、２つ以上のアミノ酸の直鎖で作製された有機化合物を指す。化合物は１０以上のアミノ酸；２５以上のアミノ酸；５０以上のアミノ酸；１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、さらには３００以上のアミノ酸を有していてもよい。当業者は、ポリペプチドとタンパク質を区別するアミノ酸の数の当技術分野で認められたカットオフ点はないものの、ポリペプチドが一般的にタンパク質より少ないアミノ酸を含むこと；ポリペプチドを化学合成又は組換え方法により作製することができること；及び、タンパク質は一般的に、当技術分野において公知の組換え方法によりインビトロ又はインビボで作製されることを理解するであろう。
アミノ酸残基は、標準的な３文字又は１文字アミノ酸コードに従って示されうる。ＷＯ０８／０２００７９のページ４８の表Ａ－２を参照のこと。
Figure 0007222888000001
核酸又はアミノ酸は、例えば、それが得られた反応媒質又は培養媒質と比較し、それが通常、前記の供給源又は媒質中で関連付けられる少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、又は少なくとも１つの汚染物、不純物、もしくは微量成分からそれが分離されている場合、「（本質的に）単離された（形態）（における）」であると考えられる。特に、核酸又はアミノ酸は、それが、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、及び１０００倍以上まで精製されている場合、「（本質的に）単離された」と考える。「（本質的に）単離された形態において」である核酸又はアミノ酸は、好ましくは、本質的に均質であり、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術など、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などを使用して決定される通りである。
文脈が明らかに他を要求しない限り、記載及び請求項を通して、語「含む」、「含んでいる」などは、排他的又は網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で；つまり、「含むが、これに限定しない」という意味で解釈すべきである。
例えば、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチドがそれぞれ別のヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチドを「含む」、或いは別のヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチド「から本質的になる」と言う場合、これは、後者のヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチドが、それぞれ最初に言及したヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチド中に組み入れられていることを意味しうるが、より通常には、これは、最初に言及したヌクレオチド配列、アミノ酸配列、又はポリペプチドが、その配列内に、最初に言及した配列が実際にどのように生成されたか又は得られたかとは無関係に（それは、例えば、本明細書に記載する任意の適切な方法によりうる）、それぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有する、それぞれの一続きのヌクレオチド又はアミノ酸残基を含むことを意味する。非限定的な例を用いて、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言う場合、これは、前記の免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列中に組み入れられていることを意味しうるが、しかし、より通常には、これは、一般的に、本発明のポリペプチドが、その配列内に、前記の本発明のポリペプチドがどのように生成された又は得られたかとは無関係に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸又はヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むと言う場合、最初に言及した核酸又はヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例、ポリペプチド）中に発現される場合、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、前記の発現産物の部分を形成するようにする（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及した、より大きな核酸又はヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム中にある）。
「から本質的になる」により、本発明の方法において使用する免疫グロブリン単一可変ドメインが、本発明のポリペプチドと厳密に同じある、又は限定された数のアミノ酸残基、例えば１～２０アミノ酸残基、例えば、１～１０アミノ酸残基及び、及び好ましくは１～６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、又は６アミノ酸残基（免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端に、カルボキシル末端に、又はアミノ末端及びカルボキシル末端の両方に加えられた）を有する本発明のポリペプチドに対応することを意味する。
「からなる」により、本発明の方法において使用する免疫グロブリン単一可変ドメインが、本発明のポリペプチドと厳密に同じであることを意味する。
２つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを、［第２ヌクレオチド配列中の対応する位置でのヌクレオチドと同一である第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］により割り、［１００%］により乗じることにより算出してもよく、それにおいて、第２ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１ヌクレオチド配列と比較し）は、単一ヌクレオチド（位置）の違いとして考えられる。あるいは、２つ以上のヌクレオチド配列の間での配列同一性の程度は、配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズム（例えばNCBI Blast v2.0など）を使用し、標準的な設定を使用して算出してもよい。配列同一性の程度を決定するための一部の他の技術、コンピューターアルゴリズム、及び設定は、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＥＰ ０９６７２８４、ＥＰ １０８５０８９、ＷＯ００／５５３１８、ＷＯ００／７８９７２、ＷＯ ９８／４９１８５、及びＧＢ ２３５７７６８において記載されている。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のヌクレオチドを伴うヌクレオチド配列を「第１」ヌクレオチド配列として取り、他のヌクレオチド配列を「第２」ヌクレオチド配列として取りうる。
２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」（本明細書において「アミノ酸同一性」とも言う）のパーセンテージを、［第２アミノ酸配列中の対応する位置でのアミノ酸残基と同一である第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］により割り、［１００%］により乗じることにより算出してもよく、それにおいて、第２アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換、又は付加（第１アミノ酸配列と比較し）は、単一アミノ酸残基（位置）での違いとして、即ち、本明細書で定義する通りの「アミノ酸の違い」として考えられる。あるいは、２つのアミノ酸配列の間での配列同一性の程度を、公知のコンピューターアルゴリズム（例えば、ヌクレオチド配列についての配列同一性の程度を決定するための、上に言及するものなど）を使用し、再び、標準的な設定を使用して算出してもよい。通常は、本明細書において上に概説する算出方法に従って、２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を伴うアミノ酸配列を「第１」アミノ酸配列として取り、他のアミノ酸配列を「第２」アミノ酸配列として取りうる。
また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れうるが、それは一般的に、アミノ酸残基が同様の化学的構造の別のアミノ酸残基を用いて置換されており、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対する影響がほとんどない又は本質的にない、アミノ酸置換として記載することができる。そのような保存的アミノ酸置換は当技術分野において、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＧＢ ３３５７６８、ＷＯ ９８／４９１８５、ＷＯ００／４６３８３、及びＷＯ０１／０９３００から周知であり；並びに、そのような置換の（好ましい）型及び／又は組み合わせは、ＷＯ０４／０３７９９９並びにＷＯ ９８／４９１８５からの及び本明細書において引用するさらなる参考文献からの関連する教示に基づいて選択されうる。
そのような保存的置換は、好ましくは、それにおいて、以下の群（ａ）－（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸により置換されている置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｂ）極性、負に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；（ｃ）極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は以下の通りである： ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに；ＡｒｇをＬｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに；ＨｉｓをＡｓｎに又はＧｌｎに；ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに；ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに；ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに、又はＧｌｕに；ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに、又はＩｌｅに；ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに、又はＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに、又はＬｅｕに。
本明細書において記載するポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、また、Schulzら（1978, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag）により開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸バリエーションの頻度の分析に、Chou及びFasman（1974, Biochemistry 13: 211; 1978, Adv. Enzymol., 47: 45-149）により開発された潜在能を形成する構造の分析に、並びにEisenbergら（1984, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144）、Kyte及びDoolittle（1981, J. Molec. Biol. 157: 105-132）、及びGoldmanら（1986, Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353）により開発されたタンパク質における疎水性パターンの分析に基づきうる（全てを、それらの全体において、参照により本明細書に組み入れる）。ナノボディの一次、二次、及び三次構造に関する情報を、本明細書における記載において及び上に引用する一般的な背景技術において与える。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造を、例えば、Desmyterら（1996, Nature Structural Biology, 3: 803）、Spinelliら（1996, Natural Structural Biology, 3: 752-757）、及びDecanniereら（1999, Structure, 7 (4): 361）により与える。従来のＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換をこれらの位置で形成するアミノ酸残基の一部に関するさらなる情報を、上に引用する先行技術において見出すことができる。
アミノ酸配列及び核酸配列は、それらが、それらの全長にわたり１００%配列同一性（本明細書で定義する通り）を有する場合、「厳密に同じ」であると言う。
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸の違い」は、第２配列と比較した、第１配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１、２、又はそれ以上のそのようなアミノ酸の違いを含むことができることが理解されている。さらに特に、本発明のアミノ酸配列及び／又はポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸の違い」は、それぞれａ）、ｃ）、又はｅ）のＣＤＲ配列と比較し、ｂ）、ｄ）、又はｆ）において指定するＣＤＲ配列の位置上での単一アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指し；ｂ）、ｄ）、及びｆ）のＣＤＲ配列が、それぞれａ）、ｃ）、又はｅ）のＣＤＲ配列と比較し、１、２、又は最大３つのそのようなアミノ酸の違いを含むことができることが理解されている。
「アミノ酸の違い」は、任意の１、２、３つ、又は最大４つの置換、欠失、もしくは挿入、又はそれらの任意の組み合わせでありうるが、それは、本発明のポリペプチドの特性を改善する、あるいは、本発明のポリペプチドの所望の特性から又は所望の特性のバランスもしくは組み合わせから少なくとも過剰を減じない。この点において、本発明の結果として得られるポリペプチドは、１つ以上のＣＤＲ配列を含むが、１、２、３、又は最大４つの置換、欠失、もしくは挿入を伴わないポリペプチドと比較し、同じ、ほとんど同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３又はＴ細胞受容体に少なくとも結合すべきであり、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により測定される通りである。
この点において、ｂ）、ｄ）、及び／又はｆ）に従ったアミノ酸配列は、それ自体が公知の親和性成熟の１つ以上の技術を使用した親和性成熟を用いて、それぞれａ）、ｃ）、及び／又はｅ）に従ったアミノ酸配列から由来するアミノ酸配列でありうる。
例えば、及び本発明のポリペプチドを発現させるために使用される宿主生物に依存し、そのような欠失及び／又は置換は、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（例えば１つ以上のグリコシル化部位など）を除去するように設計されうるが、当業者の能力内であろう通りである。
「親和性」は分子間相互作用の強度又は安定性を表示する。親和性は一般的に、ＫＤ、又はモル／リットル（又はM）の単位を有する解離定数により与えられる。親和性は会合定数ＫＡとして表すこともでき、これは１／ＫＤに等しく、（mol/L）－１（又はM－１）の単位を有する。本明細書では、２つの分子間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫＤ値を単位として表す；関係式ＫＡ＝１／ＫＤを考慮し、そのＫＤ値により分子相互作用の強度を特定することもまた、対応するＫＡ値を算出するために使用することができることが当業者に明らかである。ＫＤ値は、周知の関係式ＤＧ＝ＲＴ・Ｉｎ（ＫＤ）（等価的にＤＧ＝－ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））による結合の自由エネルギー（ＤＧ）の変化に関連するため、分子間相互作用の強度を熱力学的な意味においても特徴付ける（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を表示する）。
意味のある（例、特異的）と考えられる生物学的相互作用についてのＫＤは、典型的には１０－１２M（０．００１nM）～１０－５M（１０，０００nM）の範囲内である。相互作用が強いほどそのＫＤは低くなる。
ＫＤはまた、複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆとして表示する）とその会合速度定数の速度（ｋｏｎで表示する）の比率として表すことができる（そのためＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフ速度ｋｏｆｆは単位s－１を有する（ここでｓは秒のＳＩ単位表記である）。オン速度ｋｏｎは単位M－１s－１を有する。オン速度は１０２M－１ｓ－１から約１０７M－１ｓ－１の間で変動しうるが、二分子相互作用について拡散律速会合速度定数に近づく。オフ速度は、関係式ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによる所与の分子間相互作用の半減期に関連する。ｏｆｆ速度は１０－６s－１（ｔ１／２の複数日数を伴う不可逆的複合体に近い）から１s－１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変動しうる。
抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質（例えばＩＳＶなど）の特異的な結合は、それ自体が公知の任意の適切な様式（例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイなどを含む）及び当技術分野においてそれ自体が公知のそれらの異なる変法；並びに本明細書において言及する他の技術において決定することができる。
２つの分子間の分子間相互作用の親和性は、それ自体が公知の異なる技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術（例えば、Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559を参照のこと）を介して測定することができる。用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用する通り、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度における変化の検出によるリアルタイムの生物特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、ここで１つの分子がバイオセンサーチップに固定化されており、他の分子は流動条件下で固定化分子上を通過し、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、故にＫＤ（又はＫＡ）値をもたらす。これは、例えば、周知のBIAcore（登録商標）システム（BIAcore International AB、GE Healthcare、スウェーデン、ウプサラ及びニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して実施することができる。さらなる記載については、Jonssonら（1993, Ann. Biol. Clin. 51: 19-26）、Jonssonら（1991 Biotechniques 11: 620-627）、Johnssonら（1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131）、及びJohnnsonら（1991, Anal. Biochem. 198: 268-277）を参照のこと。
生体分子相互作用の親和性を決定するための別の周知のバイオセンサー技術は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）である（例えば、Abdiche et al. 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217を参照のこと）。用語「バイオレイヤー干渉法」又は「ＢＬＩ」は、本明細書で使用する通り、バイオセンサーチップ（シグナルビーム）上の２つの表面：内部参照層（参照ビーム）及び固定化タンパク質の層から反射される光の干渉パターンを分析する無標識光学技術を指す。バイオセンサーの先端に結合させた分子の数における変化は、波長シフト（nm）として報告される干渉パターンにおいてシフトを起こし、その大きさはバイオセンサーの先端表面に結合させた分子の数の直接的な測定値である。相互作用はリアルタイムで測定することができるため、会合速度及び解離速度並びに親和性を決定することができる。ＢＬＩは、例えば、周知のOctet（登録商標）Systems（ForteBio、Pall Life Sciencesの一部門、米国メンローパーク）を使用して実施することができる。
あるいは、親和性は、KinExA（登録商標）プラットフォーム（Sapidyne Instruments Inc、米国ボイシ）を使用し、動態学的排除アッセイ（KinExA）（例えば、Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43を参照のこと）において測定することができる。用語「KinExA」は、本明細書で使用する通り、非修飾分子の真の平衡結合親和性及び動態を測定するための溶液ベースの方法を指す。抗体／抗原複合体の平衡化溶液を、抗原（又は抗体）でプレコーティングしたビーズを用いたカラムに通し、遊離抗体（又は抗原）がコーティング分子に結合することを可能にする。このようにして捕捉された抗体（又は抗原）の検出は、抗体（又は抗原）に結合する蛍光標識タンパク質を用いて達成する。
GYROLAB（登録商標）イムノアッセイシステムは、自動化生物分析及び迅速な試料転換用のプラットフォームを提供する（Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。
測定プロセスが、例えば１分子のバイオセンサー上のコーティングに関連するアーチファクトにより、暗示された分子の固有の結合親和性に何らかの形で影響を及ぼす場合、測定されたＫＤが見かけ上のＫＤに対応しうることも当業者に明らかであろう。また、１つの分子が他の分子についての２つ以上の認識部位を含む場合、見かけ上のＫＤが測定されうる。そのような状況では、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合力により影響を及ぼされうる。当業者に明かであろう通り、及びＷＯ０８／０２００７９のページ５３～５６に記載される通り、解離定数は、実際の又は見かけ上の解離定数でありうる。解離定数を決定するための方法は当業者に明らかであろうが、例えば、ＷＯ０８／０２００７９のページ５３～５６に言及される技術を含む。
用語「エピトープ」及び「抗原決定基」は、それらを互換的に使用することができ、抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又はポリペプチドなど）により、さらに特に前記分子の抗原結合部位により認識される、巨大分子（例えばポリペプチド又はタンパク質など）の部分を指す。エピトープは、免疫グロブリンのための最小結合部位を定義し、このように、免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
エピトープを認識する抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又はポリペプチドなど）の一部を「パラトープ」と呼ぶ。
特定のエピトープ、抗原、又はタンパク質（又は、その少なくとも１つの部分、フラグメント、もしくはエピトープについて）「（に）結合する」又は「（に）特異的に結合する」ことができる、「について親和性を有する」及び／又は「について特異性を有する」ポリペプチド（例えば本発明の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は一般的に、抗原結合分子もしくはそのフラグメントなど）は、前記エピトープ、抗原、又はタンパク質「に対する」又は「に対して向けられた」と言い、あるいはそのようなエピトープ、抗原、又はタンパク質に関して「結合」分子である、あるいは「抗」エピトープ、「抗」抗原、又は「抗」タンパク質（例、「抗」ＣＤ１２３又は「抗」ＴＣＲ）であると言う。
用語「特異性」は、ＷＯ０８／０２００７９のページ５３～５６のパラグラフｎ）においてそれに与えられる意味を有する；及び、本明細書において言及する通り、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）が結合することができる異なる型の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、ＷＯ０８／０２００７９（本明細書において参照により組み入れられる）のページ５３～５６に記載される通り、親和性及び／又は結合力に基づいて決定することができ、それはまた、抗原結合分子（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）と関連抗原の間の結合を測定するための一部の好ましい技術を記載する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなど）は、それらの抗原に、１０－５～１０－１２モル／リットル以下、及び好ましくは１０－７～１０－１２モル／リットル以下、及び好ましくは１０－８～１０－１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）を伴い（即ち、１０５～１０１２リットル／モル以上、及び好ましくは１０７～１０１２リットル／モル以上、及びより好ましくは１０８～１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）を伴い）結合しうる。１０４モル／リットル（又は１０４M－１より低い任意のＫＡ値）より大きい任意のＫＤ値は一般的に、非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ポリペプチドは、所望の抗原に、親和性５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば、例、１０と５nMの間、例えば１０nM未満、５nM未満、３nM未満、２nM未満、例えば１０nM～１nM、５nM～１nM又はさらにそれ以下を伴い結合しうる。抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的な結合は、それ自体が公知の任意の適切な様式（例えば、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及びサンドイッチ競合アッセイなど）及び当技術分野においてそれ自体が公知のそれらの異なる変法；並びに本明細書において言及する他の技術において決定することができる。当業者に明かであろう通り、及びＷＯ０８／０２００７９のページ５３～５６に記載される通り、解離定数は、実際の又は見かけ上の解離定数でありうる。解離定数を決定するための方法は当業者に明らかであろうが、例えば、ＷＯ０８／０２００７９のページ５３～５６に言及される技術を含む。
親和性を評価するために使用しうる１つのアプローチは、Friguetら（1985, J. Immunol. Methods 77: 305-19）の２工程ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）手順である。この方法によって液相結合平衡測定が確立され、支持体（例えばプラスチックなど）上の分子の１つの吸着に関連して起こりうるアーチファクトが回避される。
しかし、ＫＤの正確な測定はかなり労働集約的でありうるが、結果として、しばしば見かけ上のＫＤ値が２つの分子の結合強度を評価するために決定される。全ての測定が一貫した方法で行われる限り（例、アッセイ条件を不変に保ち）、見かけ上のＫＤ測定値を真のＫＤの近似値として使用することができ、故に本文書ではＫＤ及び見かけ上のＫＤを等しい重要性又は関連性を伴い扱うべきであることに注意すべきである。
最後に、多くの状況において、経験豊富な科学者が、特定の参照分子と比べて結合親和性を決定することが便利であると判断しうることに注意すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂの間の結合強度を評価するために、例えば、Ｂに結合することが公知であり、ＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）又は他のフォーマット（例えば、蛍光検出用のフルオロフォア、光吸収検出用のクロモフォア、ストレプトアビジン媒介ＥＬＩＳＡ検出用のビオチン）において容易に検出するためのフルオロフォア基もしくはクロモフォア基又は他の化学部分（例えばビオチンなど）を用いて適切に標識された参照分子Ｃを使用してもよい。典型的には、参照分子Ｃを一定濃度に保ち、Ａの濃度をＢの所与の濃度又は量について変動させる。結果として、Ａの非存在においてＣについて測定されたシグナルが半分になるＡの濃度に対応するＩＣ５０値が得られる。ＫＤ ｒｅｆ（参照分子のＫＤである）並びに参照分子の全濃度ｃｒｅｆが公知であると仮定すると、相互作用Ａ－Ｂについての見かけ上のＫＤを以下の式から得ることができる：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１ ＋ ｃｒｅｆ／ＫＤ ｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤ ｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに注意すること。ＩＣ５０の測定が比較される結合薬剤について一貫した方法（例、ｃｒｅｆを固定しておく）で実施する場合、分子間相互作用の強度及び安定性をＩＣ５０により評価することができ、この測定値は本文を通してＫＤと又は見かけ上のＫＤと等価と判断する。
半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、生物学的機能又は生化学的機能（例、薬理学的効果）の阻害における化合物の有効性の測定値である。この定量的測定値は所与の生物学的プロセス（又はプロセスの成分、即ち、酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、侵襲性など）を半分だけ阻害するためにどのくらいのＩＳＶ（例、ナノボディ）（阻害剤）が必要かを示す。言い換えれば、それは物質の半（５０%）最大阻害濃度（ＩＣ）である（５０%ＩＣ、又はＩＣ５０）。薬物のＩＣ５０は、用量反応曲線を構築し、アゴニスト活性の逆転に対する異なる濃度の本発明のアンタゴニスト、例えばＩＳＶＤ（例、ナノボディ）などの効果を検証することにより決定することができる。アゴニストの最大の生物学的応答の半分を阻害するのに必要な濃度を決定することによって、ＩＣ５０値を所与のアンタゴニスト、例えば本発明のＩＳＶＤ（例、ナノボディ）などについて算出することができる。
用語「半最大有効濃度（ＥＣ５０）」は、特定の曝露時間後にベースラインと最大値の間の中間で応答を誘導する化合物の濃度を指す。本文脈では、それはポリペプチドの、ＩＳＶ（例、ナノボディ）の効力の測定値として使用する。段階用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０%が観察される化合物の濃度を表す。濃度は好ましくはモル単位で表す。
生物学的システムにおいて、リガンド濃度における小さな変化は、典型的にはシグモイド関数に続く、応答における迅速な変化をもたらす。リガンド濃度の増加に伴う応答における増加が遅くなり始める変曲点がＥＣ５０である。これは最適ラインの導出により数学的に決定することができる。推定のためにグラフに頼ることは、大半の場合において便利である。ＥＣ５０が実施例のセクションにおいて提供される場合、実験は可能な限り正確にＫＤを反映するように設計された。言い換えれば、ＥＣ５０値はＫＤ値と見なしてもよい。
それはまた、化合物の阻害（５０%阻害）の測定値であるＩＣ５０にも関連している。競合結合アッセイ及び機能的アンタゴニストアッセイについては、ＩＣ５０は用量反応曲線の最も一般的な集約尺度である。アゴニスト／刺激因子アッセイについては、最も一般的な集約尺度はＥＣ５０である。
阻害定数Ｋｉは、阻害剤がどれだけ強力であるかの指標である；それは半最大阻害を産生するために要求される濃度である。絶対阻害定数Ｋｉは、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆの等式を使用して算出することができる：
Figure 0007222888000002
式中［Ｌ］はリガンドの固定濃度である。
免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、それが、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２の標的又は抗原に結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば、好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、最大１００００倍以上良好な親和性（上に記載する通り、適切にはＫＤ値、ＫＡ値、ｋｏｆｆ速度、及び／又はｋｏｎ速度として表す）を伴い第１の抗原に結合する場合、第２の標的又は抗原と比較して第１の標的又は抗原「について特異的」であると言う。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが第２の標的又は抗原に結合するＫＤよりも少なくとも１０分の１以下、例えば少なくとも１００分の１以下、好ましくは少なくとも１０００分の１以下、例えば１００００倍以下又はそれよりさらに小さいＫＤ値を伴い第１の標的又は抗原に結合しうる。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが、第２の標的又は抗原と比較し、第１の標的又は抗原「について特異的」である場合、それは（本明細書で定義する）前記第１の標的又は抗原に対して向けられるが、第２の標的又は抗原に対しては向けられない。
アミノ酸配列（例えば、本発明に従った免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドなど）は、２つの異なる抗原又は抗原決定基（例えば哺乳動物の２つの異なる種からの血清アルブミン、例えば、例、ヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミンなど、例えば、例、哺乳動物の異なる種からのＣＤ１２３、例えば、例、ヒトＣＤ１２３及びカニクイザルＣＤ１２３など、例えば、例、哺乳動物の異なる種からのＴＣＲなど、例えば、例、ヒトＴＣＲ及びカニクイザルＴＣＲなど）について「交差反応性」であると言う（それが、これらの異なる抗原又は抗原決定基の両方について特異的（本明細書で定義する通り）である場合）。
用語「（交差）遮断する」、「（交差）遮断した」、「（交差）遮断している」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合している」、及び「（交差）競合」を本明細書において互換的に使用し、所与の標的への他の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤の結合に干渉する、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、標的への別のものの結合と干渉することができる範囲は従って、それが、本発明に従って交差遮断すると言うことができるか否かを問わず、競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの特に適切な定量的交差遮断アッセイが実施例において記載されており、例えば、細胞上に発現されたＣＤ１２３を用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイを含む。（交差）遮断の程度は、（低下した）チャネル蛍光により測定することができる。別の適切な定量的交差遮断アッセイでは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定することができるBIAcore機器を使用する。別の適切な定量的交差遮断アッセイでは、標的へのそれらの結合という点で、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の間での競合を測定するためのＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。
以下では一般的に、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従って交差遮断する又は交差遮断することが可能であるか否かを決定するための適切なFACSアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが理解されるであろう。ＦＡＣＳ機器（例、FACSArray；Becton Dickinson）は製造業者の推奨に従って操作する。
ＣＤ１２３への結合について２つの結合薬剤（例えば、例、２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はナノボディなど）間の「（交差）遮断」又は「（交差）競合」を評価するために、ＦＡＣＳ競合実験を、細胞（例えば、例、内因的にＣＤ１２３を発現する細胞株ＭＯＬＭ－１３又はヒトＣＤ１２３を過剰発現するＦｌｐ－Ｉｎ（商標）－ＣＨＯ細胞など）を用いて実施することができる。例えば モノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｆ１８０４）、モノクローナル抗Ｃ－ｍｙｃ抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号ＷＨ０００４６０９Ｍ２）、モノクローナル抗ＨＩＳ ＴＡＧ抗体（Sigma-Aldrich、カタログ番号ＳＡＢ１３０５５３８）（各々が異なって標識される）を含む異なる検出試薬が使用することができる。広範囲の蛍光体をフローサイトメトリーにおける標識として使用することができる（例えば、例、ＰＥ（Ｒ－フィコエリスリン）、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、アクリジンオレンジ、種々の形態のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、例、Ａｌｅｘａ６４７）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡｍＣｙａｎ、アミノクマリン、ＡＰＣ Ｃｙ５、ＡＰＣ Ｃｙ７、ＡＰＣ－Ｈ７、ＡＰＣ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＡｓＲｅｄ２、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ、Ａｚｕｒｉｔｅ、Ｂ ＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ５－セラミド、ＢＣＥＣＦ－ＡＭ、Ｂｉｓ－ｏｘｏｎｏｌ ＤｉＢＡＣ２（３）、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、カルセイン、カルセインＡＭ、Ｃａｒｏｘｙ－Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣＦＳＥ、クロモマイシンＡ３、ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＣｙＰｅｔ、ＤＡＦ－ＦＭ ＤＡＦ－ＦＭジアセテート、ＤＡＰＩ、ＤＣＦＨ（２’７’ジクロロヒドロフルオレセイン）、ＤＨＲ、ジヒドロカルセインＡＭ、ジヒドロローダミン、ジヒドロチジウム、ＤｉＬＣ１（５）、ＤｉＯＣ６（３）、ＤｉＯＣ７（３）、ｄＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ、ＤＲＡＱ５、Ｄｒｏｎｐａ－Ｇｒｅｅｎ、種々の形態のＤｓＲｅｄ ｄＴｏｍａｔｏ、種々の形態のＤｙＬｉｇｈｔ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ ＡＦ４８８、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｅ２－Ｏｒａｎｇｅ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、種々の形態のｅＦｌｕｏｒ、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ＊、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｅｑＦＰ６５０、ｅｑＦＰ６７０、ＥＲ－Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ ＤＰＸ、エチジウムブロマイド、Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＥＹＦＰ、Ｆｃ ＯｘｙＢｕｒｓｔ Ｇｒｅｅｎ、Ｆｃ ＯｘｙＢｕｒｓｔ Ｇｒｅｅｎ １２３、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、フルオセイン、Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－Ｒｅｄ、ＧＦＰｕｖ、Ｈ２ＤＣＦＤＡ、ＨｃＲｅｄ１、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｂｌｕｅ（３３２５８）、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｒｅｄ（３３３４２）、Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、ＨｙＰｅｒ、Ｉｎｄｏ－１、Ｉｎｄｏ－１ Ｂｌｕｅ（Ｌｏｗ Ｃａ２＋）、Ｉｎｄｏ－１ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｈｉｇｈ Ｃａ２＋）、ｉＲＦＰ、Ｊ－Ｒｅｄ、ＪＣ－１、ＪＣ－９、Ｋａｔｕｓｈｋａ（ＴｕｒｂｏＦＰ６３５）、Ｋａｔｕｓｈｋａ２ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ＬＤＳ ７５１、リサミンローダミンＢ、種々の形態のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ、Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＣＨ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ、ｍＡｍｅｒｔｒｉｎｅ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、メトキシクマリン、ｍＨｏｎｅｙＤｅｗ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ミトラマイシン、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ、ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ Ｇｒｅｅｎ、ｍＫａｔｅ（ＴａｇＦＰ６３５）、ｍＫａｔｅ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｉｍａ－Ｒｅｄ、ｍＫＯ、ｍＫＯｋ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、モノクロロビマン、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ１、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴａｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴＦＰ１、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、ＮＢＤ、ＯｘｙＢｕｒｓｔ Ｇｒｅｅｎ Ｈ２ＤＣＦＤＡ、ＯｘｙＢｕｒｓｔ Ｇｒｅｅｎ Ｈ２ＨＦＦ ＢＳＡ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＰＥ（Ｒ－フィコエリスリン）、ＰＥ Ｃｙ５、ＰＥ Ｃｙ５．５、ＰＥ Ｃｙ７、ＰＥ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ－Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、種々の形態のＱｄｏｔ、Ｒｅｄ ６１３、ＲＦＰ Ｔｏｍａｔｏ、Ｒｈｏｄ－２、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓｉｎｇｌｅｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｉｒｉｕｓ、ＳＮＡＲＦ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＴａｇＢＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｔｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ、ＴＭＲＥ、ＴＭＲＭ、Ｔｏｐａｚ、ＴＯＴＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＲＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ ＴｒｕＲｅｄ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｖｙｂｒａｎｔ ＣｙｃｌｅＤｙｅ Ｖｉｏｌｅｔ、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ ＧＦＰ、Ｘ－ローダミン、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、ＹＯＹＯ－１、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、Ｚｙｍｏｓａｎ Ａ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ ＡＦ４８８）（詳細はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｆｃｎ．ｏｒｇ／ｆｌｏｗ－ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓを参照のこと）。フルオロフォア、又は単に「蛍光体」は、典型的には、ＣＤ１２３を認識する抗体（例、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディなど）又は検出試薬として使用される抗体に付着している。種々のコンジュゲート抗体、例えば、（限定しないが）Alexa Fluor（登録商標）、DyLight（登録商標）、ローダミン、ＰＥ、ＦＩＴＣ、及びＣｙ３に共役させた抗体などを利用可能である。各々のフルオロフォアは特徴的なピーク励起及び発光波長を有する。使用することができる標識の組み合わせは、フルオロフォアを励起するために使用されるランプ又はレーザーの波長及び利用可能な検出器に依存するであろう。
ＣＤ１２３への結合についての２つのテスト結合薬剤（Ａ及びＢ＊と呼ぶ）間の競合を評価するために、コールド（標識を伴わない）結合薬剤Ａの一連の希釈物を標識結合薬剤Ｂ＊と一緒に（例、１０００００個）細胞に加える。テスト混合物中のＢ＊の濃度は、細胞上に発現されたＣＤ１２３上の結合部位を容易に飽和させるのに十分に高くあるべきである。細胞上に発現されたＣＤ１２３上のその結合薬剤についての結合部位を飽和させる結合薬剤Ｂ＊の濃度は、ＣＤ１２３発現細胞上の一連の滴定Ｂ＊及び結合についてのＥＣ５０値を用いて決定することができる。飽和濃度で作用するためには、結合薬剤Ｂ＊を１００×ＥＣ５０濃度で使用することができる。
細胞とＡ及びＢ＊の混合物とのインキュベーション及び細胞の洗浄後、読み出しをＦＡＣＳで実施することができる。最初に、散乱プロファイルから決定される通りに、ゲートを無傷の細胞上に設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
結合薬剤Ｂ＊の別の溶液も調製する。この溶液中の結合薬剤は、テスト混合物（結合薬剤Ａ及びＢ＊を伴う）と同じ緩衝液中及び同じ濃度でなければならない。この別の溶液も細胞に加える。インキュベーション及び細胞洗浄後、読み出しをＦＡＣＳで実施することができる。最初に、散乱プロファイルから決定される通りに、ゲートを無傷の細胞上に設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。
別の溶液Ｂ＊とインキュベートした細胞についての蛍光と比較した、Ａ及びＢ＊の混合物とインキュベートした細胞についての蛍光の低下は、結合薬剤Ａ（結合）が、細胞上に発現したＣＤ１２３への結合について、結合剤Ｂ＊による結合を（交差）遮断することを示す。
本発明に従った交差遮断免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、上のＦＡＣＳ交差遮断アッセイにおいてＣＤ１２３に結合するものであり、アッセイの間に、及び第２の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の存在において、記録された蛍光が、最大蛍光（別々に標識された免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤について測定）の８０%～０．１%（例、８０%～４%）の間、具体的には最大蛍光の７５%～０．１%（例、７５%～４%）の間、より具体的には最大蛍光の７０%～０．１%（例、７０%～４%）の間であるようにする（ちょうど上で定義した通り）。
ＣＤ１２３への結合についての２つのテスト結合薬剤（Ａ＊及びＢ＊と呼ぶ）間の競合もまた、各々が異なるフルオロフォアを用いて標識された両方の結合薬剤をＣＤ１２３発現細胞に加えることにより評価することができる。インキュベーション及び細胞洗浄後、読み出しをＦＡＣＳで実施することができる。各々のフルオロフォアについてゲートを設定し、チャネル蛍光の総量を記録する。フルオロフォアの１つの蛍光の低下及び／又は非存在は、細胞上に発現されたＣＤ１２３への結合についての結合薬剤による（交差）遮断を示す。
以下では一般的に、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従って交差遮断する又は交差遮断することが可能であるか否かを決定するための適切なBIAcoreアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが理解されるであろう。BIAcore機器（例えば、BIAcore 3000）は、製造者の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイにおいて、標的タンパク質（例、ＣＤ１２３）は、ＣＭ５ BIAcoreチップに、標準的なアミンカップリング化学を使用して共役し、標的を用いてコーティングされている表面を生成する。典型的には、標的の２００－８００共鳴単位をチップに共役させうる（結合の簡単に測定可能なレベルを与えるが、しかし、使用されているテスト試薬の濃度により容易に飽和可能である量）。互いに交差遮断するそれらの能力について評価すべき２つのテスト結合薬剤（Ａ＊及びＢ＊と名付ける）を、適切な緩衝液中での結合部位の１対１モル比で混合し、テスト混合物を作製する。結合部位ベースで濃度を算出する場合、結合薬剤の分子量は、その結合薬剤上の標的結合部位の数により割った結合薬剤の全分子量であると仮定する。テスト混合物中の各々の結合薬剤の濃度は、BIAcoreチップ上に捕捉された標的分子上のその結合薬剤についての結合部位を容易に飽和させるために十分に高いはずである。混合物中の結合薬剤は同じモル濃度（結合ベースで）であり、その濃度は、典型的には、１．００と１．５マイクロモル（結合部位ベースで）の間でありうる。Ａ＊単独及びＢ＊単独を含む別々の溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は同じ緩衝液中であり、テスト混合物中と同じ濃度であるべきである。テスト混合物を、標的コーティングされたBIAcoreチップの上に通し、結合の全量を記録する。チップを次に、チップが結合した標的を損傷することなく、結合した結合薬剤を除去するような方法において処理する。典型的には、これは、チップを、３０mM ＨＣｌを用いて６０秒間にわたり処理することにより行う。Ａ＊単独の溶液を次に、標的コーティングされた表面の上に通し、結合の量を記録する。チップを再び処理し、チップが結合した標的を損傷することなく、結合した結合薬剤の全てを除去する。Ｂ＊単独の溶液を次に、標的コーティングされた表面の上に通し、結合の量を記録する。Ａ＊及びＢ＊の混合物の最大理論的結合を次に算出し、標的表面単独の上を通した場合での各々の結合薬剤の結合の合計である。混合物での実際の記録された結合が、この理論的最大値未満である場合、次に、２つの結合薬剤はそれぞれ交差遮断すると言う。このように、一般的に、本発明に従った、交差遮断する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、上のBIAcore交差遮断アッセイにおいて標的に結合するであろうものであり、アッセイの間に、及び第２免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の存在において、記録された結合が、組み合わせにおける２つの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤の、最大理論的結合の８０%～０．１%（例、８０%～４%）の間、特に最大理論的結合の７５%～０．１%（例、７５%～４%）の間、さらに特に最大理論的結合の７０%～０．１%（例、７０%～４%）の間であるようにする（ちょうど上に定義する通り）。上に記載するBIAcoreアッセイは、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本発明に従い、互いに交差遮断するか否かを決定するために使用される一次アッセイである。稀な場合では、特定の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、アミン化学を介して、CM5 BIAcoreチップに共役させた標的に結合しないであろう（これは通常、標的上の関連する結合部位が、チップへの共役によりマスク又は破壊される場合に生じる）。そのような場合において、交差遮断は、標的のタグ付きバージョン、例えば、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きバージョンを使用して決定することができる。この特定のフォーマットにおいて、抗Ｈｉｓ抗体は、Biacoreチップに共役されうるが、次に、Ｈｉｓタグ付き標的は、チップの表面の上を通し、抗Ｈｉｓ抗体により捕捉されうる。交差遮断分析は、本質的に上に記載する通りに行いうる（各々のチップ再生サイクル後、新たなＨｉｓタグ付き標的を、抗Ｈｉｓ抗体コーティングされた表面上に戻し充填しうることを除く）。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付き標的を使用して与えられた例に加えて、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き標的を代わりに使用することができうる。さらに、当技術分野において公知である種々の他のタグ及びタグ結合タンパク質の組み合わせを、そのような交差遮断分析のために使用することができうる（例、抗ＨＡ抗体を伴うＨＡタグ；抗ＦＬＡＧ抗体を伴うＦＡＬＧタグ；ストレプトアビジンを伴うビオチンタグ）。
以下では一般的に、標的（例、ＣＤ１２３）に対して向けられた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、本明細書で定義する通りに交差遮断する又は交差遮断することが可能であるか否かを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイを記載する。アッセイを、本明細書において記載する免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤のいずれかと使用することができることが理解されるであろう。アッセイの一般的な原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングされた標的に対して向けられた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は結合薬剤を有することである。第２の潜在的に交差遮断する抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の過剰量を溶液中に加える（即ち、ＥＬＩＳＡプレートに結合していない）。限定された量の標的を次にウェルに加える。コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤及び溶液中の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、限定された数の標的分子の結合について競合する。プレートを洗浄し、コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤により結合されていない過剰な標的を除去し、また、第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤並びに第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤と標的の間に形成された任意の複合体を除去する。結合した標的の量を次に、標的を検出するために適当である試薬を使用して測定する。コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤を交差遮断することができる溶液中の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤は、コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、第２の溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の非存在において結合することができる標的分子の数と比べ、コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が結合することができる標的分子の数において減少を起こすことができる。第１免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤（例、Ａｂ－Ｘ）を選択し、固定化された免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤にする例において、それはＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングされ、その後、プレートを、適切な遮断溶液を用いて遮断し、その後に加えられる試薬の非特異的結合を最小限にする。第２の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤（例、Ａｂ－Ｙ）の過剰量を次にＥＬＩＳＡプレートに加え、１ウェル当たりのＡｂ－Ｙ標的結合部位のモルが、ＥＬＩＳＡプレートのコーティングの間に１ウェル当たりに使用されたＡｂ－Ｘ標的結合部位のモルよりも少なくとも１０倍高いようにする。標的を次に加え、１ウェル当たりの標的のモルが、各々のウェルをコーティングするために使用されたＡｂ－Ｘ標的結合部位のモルよりも少なくとも２５倍低いようにする。適切なインキュベーション期間に続き、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出するための試薬を加え、コーティングされた抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤（この場合においてＡｂ－Ｘ）により特異的に結合された標的の量を測定する。アッセイについてのバックグラウンドシグナルは、コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤（この場合においてＡｂ－Ｘ）、第２溶液相の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤（この場合においてＡｂ－Ｙ）、標的緩衝液だけ（即ち、標的を伴わない）、及び標的検出試薬を伴うウェルにおいて得られたシグナルとして定義する。アッセイについての陽性対照シグナルは、コーティングされた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤（この場合においてＡｂ－Ｘ）、第２溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤緩衝液だけ（即ち、第２溶液相の免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤を伴わない）、標的及び標的検出試薬を伴うウェルにおいて得られたシグナルとして定義する。ＥＬＩＳＡアッセイは、陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍であるようにする様式において実行してもよい。コーティングする免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤として使用するための、及び第２の（コンペティター）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤として使用するための免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の選択から結果として生じる任意のアーチファクト（例、標的についてのＡｂ－ＸとＡｂ－Ｙの間の有意に異なる親和性）を回避するために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットにおいて実行してもよい：１）フォーマット１は、Ａｂ－Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤であり、Ａｂ－Ｙが、溶液中にあるコンペティターの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤である場合であり、及び２）フォーマット２は、Ａｂ－Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤であり、Ａｂ－Ｘが、溶液中にあるコンペティターの免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤である場合である。Ａｂ－Ｘ及びＡｂ－Ｙは、フォーマット１において又はフォーマット２において、溶液相の抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、溶液相の抗標的免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤の非存在（即ち、陽性対照ウェル）において得られた標的検出シグナルと比較し、標的検出シグナル（即ち、コーティングされている免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤により結合された標的の量）の６０%～１００%の間、特に７０%～１００%の間、さらに特に８０%～１００%の間の低下を起こすことができる場合、交差遮断しているとして定義する。
標的に対して向けられた免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は他の結合薬剤が、交差遮断する、交差遮断することが可能である、競合的に結合する、又は交差競合的である（本明細書で定義する通り）か否かを決定するための他の方法が、例えば、Xiao-Chi Jiaら（2004, Journal of Immunological Methods 288: 91-98）、Millerら（2011, Journal of Immunological Methods 365: 118-125）及び／又は本明細書に記載する方法（例、実施例１６を参照のこと）において記載されている。
本明細書で使用する用語「ＣＤ１２３」はインターロイキン３受容体のαサブユニット（ＩＬ－３Ｒα）を指す。
本明細書で使用する用語「ＴＣＲ」はＴ細胞受容体を指し、それはＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖からなる。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の両方が定常ドメイン及び可変ドメインからなる。本発明のポリペプチド及び免疫グロブリン単一可変ドメインはＴＣＲの定常ドメインに結合する。
本発明のポリペプチドの半減期は、一般的に、ＷＯ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）において記載される通りに定義することができ、本明細書において言及する通り、ポリペプチドの血清濃度が、５０%だけインビボで、例えば、天然機構によるポリペプチドの分解及び／又はポリペプチドのクリアランスもしくは隔離に起因して低下するために要する時間を指す。本発明のポリペプチドのインビボでの半減期を、それ自体が公知の任意の様式において、例えば薬物動態解析により決定することができる。適切な技術が当業者に明らかであろうが、例えば、一般的には、ＷＯ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）において記載される通りでありうる。また、ＷＯ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）において言及される通り、半減期は、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などを使用して表すことができる。例えば、標準的なハンドブック、例えばＫｅｎｎｅｔｈら（1986, Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc）及びM Gibaldi及びD Perron（1982, Pharmacokinetics, Marcel Dekker, 2nd Rev. Ed., 1982）などを参照のこと。用語「半減期における増加」又は「増加した半減期」はまた、ＷＯ０８／０２００７９のページ５７のパラグラフｏ）において定義される通りであり、特に、ｔ１／２ベータにおける増加（ｔ１／２アルファ及び／又はＡＵＣあるいは両方における増加を伴う又は伴わない）を指す。
他に示さない限り、用語「免疫グロブリン」及び「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体に又は従来の４鎖抗体に言及するために使用されるかを問わず、一般的な用語として使用され、完全サイズの抗体、その個々の鎖、並びにその全ての部分、ドメイン、又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインなどを含むが、限定しない）の両方を含む。
本明細書において使用する用語「ドメイン」（ポリペプチド又はタンパク質の）は、その三次元構造を、タンパク質の残りに非依存的に保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能的特性に関与し、多くの場合において、他のタンパク質に、タンパク質の及び／又はドメインの残部の機能の喪失を伴わず、加える、除去する、又は移してもよい。
本明細書において使用する用語「免疫グロブリンドメイン」は、抗体鎖（例えば、例、従来の４鎖抗体の又は重鎖抗体の鎖など）の球状領域、又はそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持する点において特徴付けられ、それは、２つのベータ－シート中に配置された約７つの逆平行ベータ－ストランドの２層サンドイッチからなり、場合により、保存されたジスルフィド結合により安定化される。
本明細書において使用する用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、それらは、当技術分野において、及び本明細書において下に「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及され；それらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断され、それらは、当技術分野において、及び本明細書において下に「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及する。このように、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下の通りに示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。抗原結合部位を保有することにより抗原のための抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＩＳＶ」は、「単一可変ドメイン」と互換的に使用し、抗原結合部位が、単一免疫グロブリンドメイン上に存在し、及びそれにより形成される分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを、「従来の」免疫グロブリン又はそれらのフラグメントから離れて設定し、それにおいて、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインは、相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合において、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合部位に寄与しうる、即ち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位形成に含まれうる。
上の定義の観点において、従来の４鎖抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子；当技術分野において公知である）の又はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド結合したＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又はそのような従来の４鎖抗体から由来するダイアボディ（全てが当技術分野において公知である）の抗原結合ドメインは、正常には、免疫グロブリン単一可変ドメインとして見なされないであろう。なぜなら、これらの場合において、抗原のそれぞれのエピトープへの結合は、正常には、１つの（単一）免疫グロブリンドメインにより生じないであろうが、しかし、（会合する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽及び重鎖可変ドメインなどの対により、即ち、免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対（それは、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する）により生じうるからである。
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することを伴わず、抗原のエピトープに特異的に結合することが可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨ又はＶＬドメインにより形成される。故に、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３を上回らないＣＤＲにより形成される。
そのため、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）もしくはその適切なフラグメント；又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列又はＶＨＨ配列）もしくはその適切なフラグメントでありうる；それが、単一の抗原結合単位を形成することが可能である限り（即ち、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位であり、単一の抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用して機能的な抗原結合単位を形成する必要がないようにする）。
本発明の一態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）である；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列でありうる。
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（又は（単一）ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又はｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸）、ナノボディ（本明細書で定義する通りで、ＶＨＨを含むが、限定しない）、他の単一可変ドメイン、又はそれらの任意の１つの任意の適切なフラグメントでありうる。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（本明細書で定義する通り）又はその適切なフラグメントでありうる。［注意：ナノボディ、ナノボディズ、及びナノクローンはAblynx N.V.の登録商標である］ナノボディの一般的な記載については、下のさらなる記載、並びに本明細書において引用する、例えば、例、ＷＯ０８／０２００７９（ページ１６）において記載される先行技術を参照のこと。
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体としても公知であり、本来は「重鎖抗体」の（即ち、「軽鎖の欠けた抗体」の；Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されている。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（それらを本明細書において「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」と呼ぶ）から、及び従来の４本鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（それらを本明細書において「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」と呼ぶ）から区別するために選択している。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる記載については、Muyldermansによる総説論文（2001, Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302）、並びに以下の特許出願（一般的な背景技術と呼ぶ）を参照のこと：ＷＯ ９４／０４６７８、ＷＯ ９５／０４０７９、及びＷＯ ９６／３４１０３（Vrije Universiteit Brussel）；ＷＯ ９４／２５５９１、ＷＯ ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ １１３４２３１、及びＷＯ０２／４８１９３（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）；ＷＯ ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、及びＷＯ０３／０５５５２７（Vlaams Instituut voor Biotechnologie（ＶＩＢ））；ＷＯ０３／０５０５３１（Algonomics N.V.及びAblynx N.V.）；ＷＯ０１／９０１９０（National Research Council of Canada）；ＷＯ０３／０２５０２０（＝ ＥＰ １４３３７９３）（Institute of Antibodies）；並びにＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７、及びＷＯ０６／１２２８２５（Ablynx N.V.）及びAblynx N.V.によるさらなる公開特許出願。これらの出願において言及されるさらなる先行技術、特に国際出願ＷＯ０６／０４０１５３のページ４１～４３に言及される参考文献のリストも参照のこと（そのリスト及び参考文献は、本明細書において参照により組み入れる）。これらの参考文献において記載される通り、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、特にフレームワーク配列の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。ナノボディ（ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化を含む）並びに他の修飾、部分又はフラグメント、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価構築物（リンカー配列の一部の非限定的な例を含む）及びナノボディ及びそれらの調製物の半減期を増加させるための異なる修飾のさらなる記載を、例えばＷＯ０８／１０１９８５及びＷＯ０８／１４２１６４において見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な記載については、本明細書において引用する、例えば、例、ＷＯ０８／０２００７９（ページ１６）において記載される先行技術を参照のこと。
「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」、及び「ｄＡｂ」（用語「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」はGlaxoSmithKlineグループの企業により登録商標として使用されている）としても公知であり、例えばＥＰ ０３６８６８４、Wardら（1989, Nature 341: 544-546）、Holtら（2003, Trends in Biotechnology 21: 484-490）及びＷＯ０３／００２６０９並びに、例えばＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８ 及びDomantis Ltdの他の公開特許出願において記載されている。ドメイン抗体は本質的に、非ラクダ哺乳動物、特にヒト４鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合ドメインとして（即ち、ＶＬ又はＶＨドメインとそれぞれ対合することなく）エピトープに結合するために、そのような抗原結合特性についての特定の選択（例、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによる）が要求される。ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、完全ヒト配列から由来する場合、約１３～約１６kDaの分子量を有し、例えばヒトにおける治療的使用のためのヒト化を要求しない。
それらは哺乳動物由来ではないため本発明の文脈においてあまり好ましくないが、単一可変ドメインが、サメの特定の種から由来しうることにも注目すべきである（例えば、いわゆる、「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば、ＷＯ０５／１８６２９を参照のこと）。
このように、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」は、非ヒト供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体から由来するポリペプチドを含む。それらは、以前に記載された通りにヒト化してもよい。さらに、この用語は、非ラクダ供給源、例、マウス又はヒトから由来するポリペプチドを含み、それは「ラクダ化」されており、例、Davies及びRiechmann（1994, FEBS 339: 285-290; 1995, Biotechnol. 13: 475-479; 1996, Prot. Eng. 9: 531-537）及びRiechmann及びMuyldermans（1999, J. Immunol. Methods 231: 25-38）において記載されている通りである。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基に、Kabatら（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）により与えられたＶＨドメインについての一般的な番号付けに従って番号を付け、ラクダからのＶＨＨドメインに適用された通りであり、例えば、Riechmann及びMuyldermans（1999, J. Immunol. Methods 231: 25-38）の図２において示されている通りである。ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けするための代替方法は、その方法を類似の様式においてＶＨＨドメインに適用することもでき、当技術分野において公知である。しかし、本明細書の記載、請求項、及び図面において、上に記載した通りにＶＨＨドメインに適用されたＫａｂａｔに従った番号付けに従うであろう（他に示さない限り）。
ＶＨドメインについて及びＶＨＨドメインについて当技術分野において周知である通り、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動しうるが、Ｋａｂａｔ番号付けにより示されたアミノ酸残基の総数に対応しないであろう（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けに従った１つ以上の位置が、実際の配列において占められないであろう、又は実際の配列は、Ｋａｂａｔ番号付けにより許される数よりも多いアミノ酸残基を含みうる）ことに注意すべきである。これは、一般的に、Ｋａｂａｔに従った番号付けが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応しうる又はしないであろうことを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０～１２０の範囲中、しばしば、１１２と１１５の間にありうる。しかし、より小さい及びより長い配列も、本明細書において記載する目的のために適切でありうることに注意すべきである。
ＣＤＲ領域の決定はまた、異なる方法に従って行ってもよい。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は１～３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は３１～３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は３６～４９位のアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は５０～６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は６６～９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、及びＶＨＨのＦＲ４は１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む。
本願では、しかし、ＣＤＲ配列をKontermann及びDubel（2010, Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51）に従って決定する。この方法に従い、ＦＲ１は１～２５位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は２６～３５位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は３６～４９位のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は５０～５８位のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は５９～９４位のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は９５～１０２位のアミノ酸残基を含み、及びＦＲ４は１０３～１１３位のアミノ酸残基を含む（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、ヒト化に供することができる。特にヒト化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、以前のパラグラフにおいてそれについて一般的に定義される免疫グロブリン単一可変ドメインでありうるが、しかし、それにおいて、ヒト化置換（本明細書で定義する通り）である及び／又はそれに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が（及び特にフレームワーク残基の少なくとも１つにおいて）存在する。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換の１つ以上（又はその組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に（それ自体が公知の任意の様式において、本明細書においてさらに記載する通りに）導入することができ、結果として得られるＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の簡単さ及びレベルについて、及び／又は他の所望の特性についてテストすることができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（又はその適切な組み合わせ）が、当業者により、本明細書における開示に基づき決定することができる。また、先述のものに基づき、免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などは、部分的にヒト化又は完全にヒト化してもよい。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体及びナノボディなど（ＶＨＨドメイン及びヒト化ＶＨＨドメインを含む）はまた、１つ以上の変化を１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列中に導入することによる親和性成熟に供することができ、それらの変化は、それぞれの親分子と比較し、そのそれぞれの抗原についての結果として得られる免疫グロブリン単一可変ドメインの改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟した免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、当技術分野において公知の方法により、例えば、Marksら（1992, Biotechnology 10: 779-783）、Barbasら（1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813）、Shierら（1995, Gene 169: 147-155）、Yeltonら（Immunol. 155: 1994-2004）、Jacksonら（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、Hawkinsら（1995, J. MoI. Biol. 226: 889-896）、Johnson及びHawkins（1996, Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press）により記載される通りに調製してもよい。
ポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばドメイン抗体又はナノボディなどから開始し、前記の免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマット化する」とも言う；及びポリペプチドの作製された部分である免疫グロブリン単一可変ドメインが、「フォーマット化」される又は前記ポリペプチド「のフォーマット中」にあると言う。免疫グロブリン単一可変ドメインをフォーマット化することができる方法の例及びそのようなフォーマットの例は、本明細書における開示に基づき当業者に明らかであろう；及びそのようなフォーマット化された免疫グロブリン単一可変ドメインは本発明のさらなる態様を形成する。
例えば及び限定を伴わず、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを、ポリペプチドの調製のための「結合単位」、「結合ドメイン」、又は「構成要素」（これらの用語は互換的に使用される）として使用してもよく、それらは場合により、結合単位（即ち、ＣＤ１２３の同じもしくは別のエピトープに対する及び／又はＣＤ１２３以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質、もしくは標的、例、ＴＣＲに対する）として役立ちうる１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。
一価ポリペプチドは、１つだけの結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含む又はそれから本質的になる。２つ以上の結合単位（例えば、例、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、本明細書において「多価」ポリペプチドとも言うが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位／免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書において「多価」フォーマット中にあるとも言う。例えば、「二価」ポリペプチドは２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（場合により、リンカー配列を介して連結されている）を含みうるのに対し、「三価」ポリペプチドは３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（場合により、２つのリンカー配列を介して連結されている）を含みうるのに対し、「四価」ポリペプチドは４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（場合により、３つのリンカー配列を介して連結されている）を含みうる、など。
多価ポリペプチドにおいて、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは同じもしくは異なりうるが、同じ抗原もしくは抗原決定基に対して（例えば、同じ部分もしくはエピトープに対して、又は異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられうる、あるいは代わりに、異なる抗原もしくは抗原決定基；又はそれらの任意の適切な組み合わせに対して向けられうる。少なくとも１つの結合単位が第１抗原（即ち、ＣＤ１２３）に対して向けられており、少なくとも１つの結合単位が第２抗原（即ち、ＣＤ１２３とは異なる）に対して向けられている少なくとも２つの結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）を含むポリペプチドは、「多特異性」ポリペプチドとも言うが、そのようなポリペプチド中に存在する結合単位（例えば、例、免疫グロブリン単一可変ドメインなど）は、本明細書において「多特異性フォーマット」中にあるとも言う。このように、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１抗原（即ち、ＣＤ１２３）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び第２抗原（即ち、ＣＤ１２３とは異なる、例、ＴＣＲなど）に対して向けられた１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドであるのに対し、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１抗原（即ち、ＣＤ１２３）に対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、第２抗原（即ち、ＣＤ１２３とは異なる、例、ＴＣＲなど）に対して向けられた１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第３抗原（即ち、ＣＤ１２３及び第２抗原の両方とは異なる）に対して向けられた少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドである；など。
１つの抗原に対して向けられたポリペプチドはまた、「単一特異性」ポリペプチドとも呼ぶ。そのような「単一特異性」ポリペプチドは、１つの抗原（例えば、例、ＴＣＲ又はＣＤ１２３）に対して向けられた１つの結合単位（例えば、例、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインなど）だけを含む一価ポリペプチドでありうる。そのような「単一特異性」ポリペプチドはまた、同じ抗原に対して向けられた２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ポリペプチドでありうる。そのような「単一特異性」多価ポリペプチドは、同じ抗原の同じ部分もしくはエピトープに対して、又は同じ抗原（例、ＣＤ１２３）の異なる部分もしくはエピトープに対して向けられうる。
同じ抗原上の異なる部分又はエピトープに対して向けられた２つ以上の結合単位を含むポリペプチドはまた、「多重パラトープ」ポリペプチドとも呼ぶ。「多重パラトープポリペプチド」、例えば「二重パラトープポリペプチド」又は「三重パラトープポリペプチド」などは、異なるパラトープを各々有する２つ以上の結合単位を含む又はそれから本質的になる（本明細書においてさらに記載する通り；本発明の多価ポリペプチドに関するチャプターを参照のこと）。
本発明のポリペプチド
本発明は、ＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞を再指向させるポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドがこの機能を発揮する能力は、それらの多特異性フォーマットから生じる。本発明により提供する多特異性ポリペプチド（「本発明の多特異性ポリペプチド」と呼ぶ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含む。
本発明はまた、本発明のそのような多特異性ポリペプチドにおいて結合単位又は構成要素として使用されうる一価ポリペプチドに関する。したがって、一態様では、本発明は、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶを提供する。別の態様では、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶを提供する。これらの一価ポリペプチドは１つの抗原だけに結合し、従って「本発明の単一特異性ポリペプチド」と呼ぶ。
ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、さらに多価ポリペプチドを形成するようにフォーマット化してもよく、それらも本発明に包含する。そのような多価ポリペプチドは、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶを含む。これらの多価ポリペプチドは１つの抗原（即ち、ＣＤ１２３）だけに結合し、従って「本発明の単一特異性ポリペプチド」とも呼ぶ。
本発明の単一特異性ポリペプチド及び本発明の多特異性ポリペプチドを本明細書にさらに記載し、一般的に「本発明のポリペプチド」と呼ぶ。
１．本発明の単一特異性ポリペプチド
１．１ ＴＣＲに結合する単一特異性ポリペプチド
本発明は、ＴＣＲに特異的に結合する単一特異性ポリペプチドに関する。好ましくは、そのような本発明の単一特異性ポリペプチドは一価である。好ましい態様では、単一特異性ポリペプチドは免疫グロブリン単一可変ドメインであり、これを本明細書では「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「本発明のＩＳＶ」と呼ぶ。
Ｔ細胞受容体（本明細書ではＴＣＲとも呼ぶ）はＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖からなるヘテロ二量体である。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の両方が定常ドメイン及び可変ドメインからなる。本発明のポリペプチドはＴＣＲの定常ドメインに特異的に結合する。
Ｔ細胞受容体はＴＣＲ複合体の一部を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＴＣＲ複合体」又は「ＴＣＲαβ－ＣＤ３複合体」は、Ｔ細胞の表面に提示されるＴ細胞受容体複合体を指す（Kuhns et al. 2006, Immunity 24: 133-139を参照のこと）。ＴＣＲ複合体は、６つの異なるＩ型一回膜貫通タンパク質：リガンド認識に関与するＴＣＲヘテロ二量体を形成するＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖、並びに非共有結合ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、及びζ鎖（受容体活性化時にリン酸化され、多数のシグナル伝達成分を動員する細胞質配列モチーフを持つ）で構成される。ヒトＣＤ３及びヒトＴＣＲα／β定常ドメインの配列を表Ａ－８に提供する（配列番号７０～７５；ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：ＣＤ３デルタ：Ｐ０４２３４、ＣＤ３ガンマ：Ｐ０９６９３、ＣＤ３エプシロン：Ｐ０７７６６、ＣＤ３ゼータ：Ｐ２０９６３、ＴＣＲアルファ：Ｐ０１８４８及びＴＣＲベータ：Ｐ０１８５０に関連）。
一態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）の定常ドメイン（配列番号７４）及び／又はＴ細胞受容体β（ＴＣＲβ）の定常ドメイン（配列番号７５）、或いはそれらの多型変異体又はアイソフォームに結合する、本明細書に記載するポリペプチドに関する。
アイソフォームは、単一により、又は生物学的事象、例えば代替プロモーターの使用、代替スプライシング、代替開始及びリボソームフレームシフト（全て当技術分野において公知である）などの組み合わせにより同じ遺伝子から生成することができる代替タンパク質配列である。
厳密な免疫化、スクリーニング、及び選択方法の後にだけ、本発明者らはＴＣＲの定常ドメインに結合するＩＳＶを同定することができた。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３において類似性及び相違性を伴う１０４クローンを含む配列のクラスターを同定した（表Ａ－５を参照のこと）。対応する配列アラインメントを提供する（表Ａ－１）。
したがって、本発明は、配列番号４２及び７８～１８０からなる群より選択されるＩＳＶであるポリペプチドに関する（表Ａ－５を参照のこと）。さらなる態様では、ポリペプチドは、配列番号４２及び７８～１８０からなる群より、あるいは配列番号４２と７８～１８０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択される。
したがって、本発明は、ＴＣＲに結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから（本質的に）なるポリペプチドに関し、それにおいてＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＮＸ５ＬＸ６を有し、それにおいてＸ１はＤ、Ａ、Ｓ、Ｅ、又はＧであり、Ｘ２はＨ又はＹであり、Ｘ３はＫ又はＬであり、Ｘ４はＩ又はＬであり、Ｘ５はＦ、Ｉ、又はＶであり、及びＸ６はＧ又はＳである。
さらなる態様では、本発明は、ＴＣＲに結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから（本質的に）なるポリペプチドに関し、それにおいてＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｘ１ＩＸ２ＩＸ３ＤＸ４Ｘ５Ｘ６を有し、それにおいてＸ１はＨ、Ｔ、又はＲであり、Ｘ２はＳ、Ｔ、又はＡであり、Ｘ３はＧ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ４はＱ、Ｄ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶであり、Ｘ５はＴ、Ａ、又はＶであり、及びＸ６はＤ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳである。
さらなる態様では、本発明は、ＴＣＲに結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらかな（本質的に）なるポリペプチドに関し、それにおいてＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｘ１ＳＲＸ２Ｘ３ＰＹＸ４Ｙを有し、それにおいてＸ１はＦ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、又はＫであり、Ｘ２はＩ又はＬであり、Ｘ３はＹ又はＷであり、及びＸ４はＤ、Ｎ、又はＳである。
本発明のポリペプチドにおける使用のための好ましいＣＤＲ配列、並びにＣＤＲ配列の好ましい組み合わせを表Ａ－５に示す。
したがって、本発明は、ＴＣＲに特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから本質的になるポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
特に、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の２、４、５、６、８、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２７、２９、３０、３１、３３、及び／又は３５位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の１、３、５、７、８、及び／又は９位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５０、５２、５４、５６、５７、及び／又は５８位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の１、４、５、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９５、９８、９９、及び／又は１０１位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１；又は
ｂ） 配列番号１８１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ２位では、ＤをＡ、Ｓ、Ｅ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＨをＹに変化させている；
－ ５位では、ＫをＬに変化させている；
－ ６位では、ＩをＬに変化させている；
－ ８位では、ＦをＩ又はＶに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＧをＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｅｄｅ）による結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１９２；又は
ｂ） 配列番号１９２のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＨをＴ又はＲに変化させている；
－ ３位では、ＳをＴ又はＡに変化させている；
－ ５位では、ＧをＳ又はＡに変化させている；
－ ７位では、ＱをＤ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶに変化させている；
－ ８位では、ＴをＡ又はＶに変化させている；及び／又は
－ ９位では、ＤをＡ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｅｄｅ）による結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号２１８；又は
ｂ） 配列番号２１８のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＦをＹ、Ｌ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＩをＬに変化させている；
－ ５位では、ＹをＷに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＮ又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１；又は
ｂ） 配列番号１８１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ２位では、ＤをＡ、Ｓ、Ｅ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＨをＹに変化させている；
－ ５位では、ＫをＬに変化させている；
－ ６位では、ＩをＬに変化させている；
－ ８位では、ＦをＩ又はＶに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＧをＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２；又は
ｄ） 配列番号１９２のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＨをＴ又はＲに変化させている；
－ ３位では、ＳをＴ又はＡに変化させている；
－ ５位では、ＧをＳ又はＡに変化させている；
－ ７位では、ＱをＤ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶに変化させている；
－ ８位では、ＴをＡ又はＶに変化させている；及び／又は
－ ９位では、ＤをＡ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８；又は
ｆ） 配列番号２１８のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＦをＹ、Ｌ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＩをＬに変化させている；
－ ５位では、ＹをＷに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＮ又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１～１９１からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１９２～２１７からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２１８～２２５からなる群より選択される。
したがって、好ましい態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１９２であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１８である。
一般的に、表Ａ－５に列挙するＣＤＲの組み合わせ（即ち、表Ａ－５中の同じ行に言及するもの）が好ましい。このように、ＩＳＶ中のＣＤＲは表Ａ－５中に言及するＣＤＲ配列であるか、或いは表Ａ－５中に列挙するＣＤＲ配列を伴う４、３、２、又は１つだけのアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択される場合、その他のＣＤＲの少なくとも１つ、及び好ましくは両方が、表Ａ－５中の同じ組み合わせに属する（即ち、表Ａ－５中の同じ行に言及する）ＣＤＲ配列より適切に選択されるか、或いは同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列を伴う４、３、２、又は１つだけのアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択される。
本発明はまた、本明細書に記載する少なくとも１つのポリペプチドのＴＣＲへの結合を交差遮断する、及び／又は、本明細書に記載する通り、少なくとも１つのポリペプチドによりＴＣＲへの結合を交差遮断するポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関する。
本発明のポリペプチドは、エフェクター細胞（例えばＴ細胞など）の表面上のＴＣＲに特異的に結合する。「一価」フォーマットでは、ＴＣＲに結合する本発明の一価ポリペプチドは、Ｔ細胞活性化を最小限から全く起こさない。
本明細書で使用する通り、用語「エフェクター細胞」は、ＴＣＲ複合体、好ましくは免疫細胞（例えばＴ細胞など）、好ましくはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４細胞、Ｔヘルパー細胞、又はＴ４細胞としても公知）、より好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、又はＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知）又はナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を含む細胞である。一部の態様では、細胞はインビボで存在する。一部の態様では、細胞はインビトロで存在する。本発明のエフェクター細胞は、特に哺乳動物細胞、好ましくは霊長類細胞、及びさらにより好ましくはヒト細胞に関する。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）の１つ以上の細胞応答（例えば増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、活性化マーカーの発現、及びリダイレクト標的細胞溶解より選択される）を指す。
本発明の単一特異性ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常ドメインに、１００nM～１０pMの間の平均ＫＤ値で、例えば９０nM以下の平均ＫＤ値で、さらにより好ましくは８０nM以下の平均ＫＤ値で、例えば７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５nM未満又はさらに小さい値、例えば４、３、２、又は１nM未満など、例えば５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０pM未満、又はさらに小さい値、例えば１０pM未満などで結合する。好ましくは、ＫＤはＫｉｎｅｘａ、ＢＬＩ、又はＳＰＲにより決定され、例えばＰｒｏｔｅｏｎにより決定される通りである。例えば、前記ＫＤは、実施例のセクションに示す通りに決定する。
本発明の単一特異性ポリペプチドは、１００nM～１pMの間のＥＣ５０値で、例えば１００nM以下の平均ＥＣ５０値で、さらにより好ましくは９０nM以下の平均ＥＣ５０値で、例えば８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５nM未満又はさらに小さい値、例えば４、３、２、もしくは１nM未満又はさらに小さい値、例えば５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５pM未満、又はさらに小さい値、例えば４pM未満などでＴＣＲに結合する。前記平均ＥＣ５０は、好ましくは、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、又はＥＬＩＳＡにより決定し、例えば、前記ＥＣ５０は、実施例のセクションに示す通りに決定する。
実施例において、ＫＤはＥＣ５０と十分に相関することが示されている。
さらなる態様では、本明細書に記載する単一特異性ポリペプチドは、少なくとも約１０２M－１s－１、少なくとも約１０３M－１s－１、少なくとも約１０４M－１s－１、少なくとも約１０５M－１s－１、少なくとも約１０６M－１s－１、１０７M－１s－１、少なくとも約１０８M－１s－１、少なくとも約１０９M－１s－１、及び少なくとも約１０１０M－１s－１からなる群より選択されるＴＣＲへの（又は結合についての）オン速度定数（ｋｏｎ）を有する（好ましくは表面プラズモン共鳴により測定する通り、又は実施例のセクションで実施する通り）。
さらなる態様では、本明細書に記載する多特異性ポリペプチドは、最大約１０－３s－１、最大約１０－４s－１、最大約１０－５s－１、最大約１０－６s－１、最大約１０－７s－１、最大約１０－８s－１、最大約１０－９s－１、最大約１０－１０s－１からなる群より選択されるＴＣＲへの（又は結合についての）オフ速度定数（ｋｏｆｆ）を有する（好ましくは表面プラズモン共鳴により測定する通り、又は実施例のセクションで実施する通り）。
ＴＣＲに結合する本発明の単一特異性ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは免疫グロブリンフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）であるフレームワーク配列又は免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導された（例えば、配列最適化、例えばヒト化又はラクダ化などによる）フレームワーク配列を有する。例えば、フレームワーク配列は、免疫グロブリン単一可変ドメインから、例えば軽鎖可変ドメイン（例、ＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例、ＶＨ配列）から由来するフレームワーク配列でありうる。１つの特に好ましい態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（それにおいて前記フレームワーク配列は、場合により部分的又は完全にヒト化されていてもよい）から由来するフレームワーク配列、又はラクダ化された従来のＶＨ配列のいずれかである。
フレームワーク配列は、好ましくは、単一特異性ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインがドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸配列）；単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸）；「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適切なアミノ酸）；ナノボディＶＨＨ；ヒト化ＶＨＨ；ラクダ化ＶＨ；又は親和性成熟により得られたＶＨＨであるようにする。再び、適切なフレームワーク配列は、例えば、標準的なハンドブック並びに本明細書に記載するさらなる開示及び先行技術に基づき当業者に明らかであろう。
特に、本発明の単一特異性ポリペプチド中に存在するフレームワーク配列は、本発明の単一特異性ポリペプチドがナノボディであるように、１つ以上のホールマーク残基（ＷＯ０８／０２００７９（表Ａ－３～Ａ－８）に定義）を含みうる。そのようなフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）の一部の好ましいが、非限定的な例が、本明細書中のさらなる開示から明らかになるであろう（例、表Ａ－５を参照のこと）。一般的に、ナノボディ（特にＶＨＨ、部分的又は完全ヒト化ＶＨＨ及びラクダ化ＶＨ）は、１つ以上のフレームワーク配列中の１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特に特徴付けることができる（例、ＷＯ０８／０２００７９、６１ページ、２４行目から９８ページ、３行目）。
さらに特に、本発明は、（一般的）構造ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を伴うアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又はそれから（本質的に）なるポリペプチドを提供し、
それにおいて、ＦＲ１からＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１から４を指し、ＣＤＲ１からＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１から３を指す：
ｉ）配列番号４２及び７８～１８０の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも８０%、より好ましくは９０%、さらにより好ましくは９５%のアミノ酸同一性を有する（表Ａ－５を参照のこと）；それにおいて、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視する。この点に関して、配列番号４２及び７８～１８０の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１の配列（配列番号２２６～２５０）、フレームワーク２の配列（配列番号２５１～２７６）、フレームワーク３の配列（配列番号２７７～３１９）、及びフレームワーク４配列（配列番号３２０～３２４）を列挙する表Ａ－５も参照のこと（表Ａ－５を参照のこと）；及び、それにおいて
ｉｉ）好ましくは、Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８位でのアミノ酸残基の１つ以上は、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ－３から表Ａ－８に言及するホールマーク残基より選択される。
本発明はまた、多数の配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
特に、本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、前の段落において免疫グロブリン単一可変ドメインについて一般的に定義しているアミノ酸配列でありうるが、それにおいて（本明細書で定義する通り）ヒト化置換である及び／又はそれに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が（特にフレームワーク残基の少なくとも１つにおいて）存在する。一部の好ましいが、非限定的なヒト化置換（及びそれらの適切な組み合わせ）が、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかになるであろう。また、又はあるいは、他の潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上のより密接に関連したヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定された潜在的に有用なヒト化置換（又はその組み合わせ）の１つ以上を、前記ＶＨＨ配列中に導入し（それ自体公知の任意の様式において（本明細書にさらに記載する通り））、結果として得られたヒト化ＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の容易さ及びレベルについて、並びに／或いは他の所望の特性についてテストすることができる。この方法において、限られた程度の試行錯誤により、他の適切なヒト化置換（又はそれらの適切な組み合わせ）が、本明細書の開示に基づいて当業者により決定されることができる。また、前述に基づき、免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）は部分的にヒト化されていても、又は完全にヒト化されていてもよい。
本発明はまた、安定性試験の間での保存時に改善された発現及び／又は増加した安定性を示しうる配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又はＩＳＶは、Ｎ末端での低下したピログルタミン酸翻訳後修飾を示しうるが、故に生成物の増加した安定性を有しうる。また、本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又はＩＳＶは、他の改善された特性、例えば、例、より少ない免疫原性、ＴＣＲについての改善した結合特性（ＫＤ値（実際または見かけ上）、ＫＡ値（実際又は見かけ上）、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代わりにＥＣ５０値として適切に測定する及び／又は表現する（本明細書中にさらに記載する通り）、ＴＣＲについての改善された親和性及び／又は改善された結合力）などを示しうる。
本発明の一部の特に好ましい配列最適化免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号４２及び７８～１８０の免疫グロブリン単一可変ドメインの配列最適化変異体である。
このように、本発明の一部の他の好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは、（本明細書で定義する通り）ＴＣＲに結合することができ、以下であるナノボディである：
ｉ） 配列番号４２及び７８～１８０の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの配列最適化変異体であり；及び／又は
ｉｉ） 配列番号４２及び７８～１８０の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し（表Ａ－５を参照のこと）、それにおいてアミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視する；この点に関して、表Ａ－５も参照のこと。そこでは配列番号４２及び７８～１８０の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号２２６～２５０）、フレームワーク２配列（配列番号２５１～２７６）、フレームワーク３配列（配列番号２７７～３１９）、及びフレームワーク４配列（配列番号３２０～３２４）を列挙する（表Ａ－５を参照のこと）；
及び、それにおいて：
ｉｉｉ） 好ましくは、Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８位でのアミノ酸残基の１つ以上は、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ－３～表Ａ－８に言及するホールマーク残基より選択される。
本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、全て「改善された免疫グロブリン可変ドメイン」と表題の付けられた、以下の同時係属中の米国仮特許出願に記載する特定の変異／アミノ酸残基を含みうる：２０１４年５月１６日に出願されたＵＳ ６１／９９４５５２；２０１４年６月１８日に出願されたＵＳ ６１／０１４，０１５；２０１４年８月２１日に出願されたＵＳ ６２／０４０，１６７；及び２０１４年９月８日に出願されたＵＳ ６２／０４７，５６０（全てがAblynx N.V.に属する）並びにこれらの仮出願に基づき、２０１５年１１月１９日に公開された国際出願ＷＯ ２０１５／１７３３２５。
特に、本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、適切には、（ｉ）１１２位のＫ又はＱ；（ｉｉ）１１位のＶと組み合わされた１１０位のＫ又はＱ；又は（ｉｉｉ）８９位のＴ；又は（ｉｖ）１１０位にＫ又はＱを伴う８９位のＬ；又は（ｖ）１１位のＶ及び８９位のＬ；又は（ｉ）～（ｖ）の任意の適切な組み合わせを含みうる。
前記の同時係属中の米国仮特許出願にも記載されている通り、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインが上の（ｉ）～（ｖ）の１つに従った変異（又はそれらの適切な組み合せ）を含む場合：
－ １１位のアミノ酸残基は、好ましくはＬ、Ｖ、又はＫより選択される（及び最も好ましくはＶである）；及び
－ １４位のアミノ酸残基は、好ましくはＡ又はＰより適切に選択される；及び
－ ４１位のアミノ酸残基は、好ましくはＡ又はＰより適切に選択される；及び
－ ８９位のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、Ｖ、又はＬより適切に選択される；及び
－ １０８位のアミノ酸残基は、好ましくはＱ又はＬより適切に選択される；及び
－ １１０位のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、Ｋ、又はＱより適切に選択される；及び
－ １１２位のアミノ酸残基は、好ましくはＳ、Ｋ、又はＱより適切に選択される。
前記の同時係属中の米国仮出願に言及されている通り、前記変異は、本発明のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又は構築物へのいわゆる「既存の抗体」の結合を防止又は低下させる際に効果的である。この目的のために、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、（場合により前記変異との組み合わせにおいて）Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（式中、ｎは１～１０、好ましくは１～５、例えば１、２、３、４、又は５など（及び好ましくは１又は２、例えば１など）であり；各々のＸは、非依存的に選択され、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）からなる群より非依存的に選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、それらについて再び、前記の米国仮特許出願並びにＷＯ １２／１７５７４１も参照のこと。特に、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、それがタンパク質、ポリペプチド、又はそれを含む他の構築物のＣ末端を形成する場合、そのようなＣ末端伸長を含んでもよい（再び、前記の米国仮出願並びにＷＯ １２／１７５７４１にさらに記載される）。
したがって、本発明は、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎをさらに含む、本明細書に記載するポリペプチドに関し、それにおいて、ｎは１～５、例えば１、２、３、４、又は５であり、及びＸが天然に存在するアミノ酸であり、好ましくはシステインではない。
本発明のこれらのポリペプチド、及び特に本発明のＣＤＲ配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインは、多特異性ポリペプチド（例えば本発明の多特異性ポリペプチドなど）の調製のための構成単位又は結合単位としての使用のために特に適している。
したがって、ＴＣＲに結合する本発明の単一特異性ポリペプチドは、本質的に単離された形態（本明細書で定義する通り）でありうる、又はそれらはタンパク質又はポリペプチドの一部を形成しうるが、それはＴＣＲに結合する１つのポリペプチド又はＩＳＶを含みうる、又はそれから本質的になりうる、及び、場合により、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て、場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含みうる。
したがって、本発明はまた、本発明の１つの単一特異性ポリペプチド（又はその適切なフラグメント）を含む、又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドにも関する。さらなる態様では、ＴＣＲに結合する本発明の単一特異性ポリペプチドは、多特異性ポリペプチドの一部を形成しうるが、それはＴＣＲに結合する１つのＩＳＶを含みうる、又はそれから本質的になりうる、及び、場合により、別の標的（例えばＣＤ１２３など）に特異的に結合する１つ以上のさらなるＩＳＶをさらに含みうる、及び、場合により、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て、場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含みうる。
本発明の単一特異性ポリペプチドはこのように、本明細書に記載する通り、本発明の多特異性ポリペプチドを提供するように、そのようなタンパク質又はポリペプチド中での結合単位又は構成要素として使用する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多特異性ポリペプチド及びそれらの調製については、Conrathら（2001, J. Biol. Chem. 276: 7346-7350）、並びに例えばＷＯ ９６／３４１０３、ＷＯ ９９／２３２２１、及びＷＯ ２０１０／１１５９９８も参照のこと）。本発明はまた、このように、ＴＣＲに結合する１つの一価ポリペプチドを含む、又はそれから本質的になる一価構築物であるポリペプチドに関する。
１．２ ＣＤ１２３結合ポリペプチド
本発明は、ＣＤ１２３、好ましくはヒト及び／又はカニクイザルＣＤ１２３に特異的に結合する単一特異性ポリペプチドに関する。好ましい態様では、単一特異性ポリペプチドは免疫グロブリン単一可変ドメインであり、本明細書では「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「本発明のＩＳＶ」とも呼ぶ。
ＣＤ１２３は、インターロイキン３受容体（ＩＬ－３Ｒα）のαサブユニットとしても公知である。ヒトＣＤ１２３及びカニクイザルＣＤ１２３の配列を表Ａ－８に提供する（配列番号６８～６９；ヒトＣＤ１２３：ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２１７４及びカニクイザルＣＤ１２３：ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＥＨＨ６１８６７．１参照）。
一態様では、本発明は、ヒトＣＤ１２３（配列番号６８）に結合する、本明細書に記載する単一特異性ポリペプチドに関する。
ＣＤ１２３に結合する単一特異性ポリペプチドは、ＣＤ１２３に対する特異性について慎重に選択されている。本発明のポリペプチドは、本発明の多特異性フォーマット（即ち、ＴＣＲに結合する１つのＩＳＶ及びＣＤ１２３に結合する１つ以上のＩＳＶを含むフォーマット）へのフォーマット化の際、ＣＤ１２３への高度に特異的な結合を示す。そのため、標的外結合は回避され、標的非依存的なＴ細胞活性化は最小限である（本明細書でさらに例示する通り）。
本発明者らは、ＣＤ１２３に高度に特異的な結合を示す、２つのナノボディクラスターを同定した（実施例１２）。クラスターの代表を本発明の多特異性ポリペプチドにフォーマット化する際（さらに記載する通り）、最小の標的非依存的なＴ細胞活性化だけが観察され、クラスターの代表の高い特異性を示した。対応するアラインメントを提供する（ナノボディ５６Ａ１０（のファミリーメンバー）に関連するナノボディ（即ち、ナノボディ５６Ａ１０と同じファミリーに属するナノボディ）については表Ａ－２を参照のこと、及びナノボディ５５Ｆ０３（のファミリーメンバー）に関連するナノボディ（即ち、ナノボディ５５Ｆ０３と同じファミリーに属するナノボディ）については表Ａ－３を参照のこと）。
本明細書で使用する「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」、又は「ファミリー」は、同一の長さを有する（即ち、それらがそれらの配列内に同じ数のアミノ酸を有する）一群のナノボディ及び／又はＶＨＨ配列を指し、そのうちの８位と１０６位の間のアミノ酸配列（カバット番号付けに従う）は、８９%以上のアミノ酸配列同一性を有する。
したがって、本発明は、配列番号１～１０からなる群より選択されるポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関する（表Ａ－４参照）。さらなる態様では、ポリペプチドは、配列番号１～１０からなる群より、あるいは配列番号１～１０のうちの１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらには９９%超の配列同一性を有するポリペプチドより選択される。
したがって、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから本質的になるポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関する：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから本質的になるポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで ４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の３、６、７、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２８、３１、３２、及び／又は３３位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで ３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の３、６、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５２、５４、及び／又は５８位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の３、４、及び／又は５位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９７、９８、及び／又は９９位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）を含む、又はそれらから本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで ４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の３、６、７、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２８、３１、３２、及び／又は３３位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の３、６、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５２、５４、及び／又は５８位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の３、４、及び／又は５位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９７、９８、及び／又は９９位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
一態様では、本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、配列番号１～６の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらには９９%超の配列同一性を有しうる（表Ａ－４参照）。これらのポリペプチドを本明細書において「５６Ａ１０に関連するポリペプチド」又は「５６Ａ１０に関連するＩＳＶ」と呼ぶ。
したがって、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ２は配列番号１７である。
さらなる態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号２１；又は
ｂ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は配列番号１７である；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２１；又は
ｄ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１～１５からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１～２２からなる群より選択される。
したがって、好ましい態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１であり、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１である。
したがって、本発明は、配列番号１～６からなる群より選択されるＩＳＶであるポリペプチドに関する。
５６Ａ１０に関連するポリペプチド又はＩＳＶは、ＣＤ１２３についてのそれらの精巧な特異性について選択された。本発明のポリペプチドの結合は、適切な結合アッセイ（フローサイトメトリーアッセイを含むが、これに限定しない）において測定することができる。そのようなフローサイトメトリーアッセイでは、ＣＤ１２３を内因的に発現する細胞（例えば、例、ＭＯＬＭ－１３又はＫＧ１ａ細胞など）を使用してもよい。あるいは、ＣＤ１２３を過剰発現するようにトランスフェクトされた細胞（例えば、例、ＣＨＯ－Ｋ１、ｈｕＣＤ１２３、又はＨＥＫ２９３カニクイザルＣＤ１２３など）を使用してもよい。適切な細胞株は本明細書中の実施例から明らかになるであろう。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、１０nM～１００pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、細胞上に発現されたＣＤ１２３又はＣＤ１２３発現細胞に結合しうる。
より具体的には、本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、ＭＯＬＭ－１３細胞上に発現されるヒトＣＤ１２３に、好ましくはフローサイトメトリーにより測定した、１０nM～１００pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５nM以下など、例えば４、３、２、もしくは１nM未満、又はさらに小さい値の平均ＥＣ５０値で結合する。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、ＣＨＯ－Ｋ１細胞上に発現されたヒトＣＤ１２３に、好ましくはフローサイトメトリーにより測定した、１０nM～100pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５nM以下など、例えば４、３、２、もしくは１nM未満、又はさらに小さい値の平均ＥＣ５０値で結合する。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、ＨＥＫ２９３細胞上に発現されたカニクイザルＣＤ１２３に、好ましくはフローサイトメトリーにより測定した、１０nM～１００pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５nM以下など、例えば４もしくは３nM未満、又はさらに小さい値の平均ＥＣ５０値で結合する。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶの結合もＳＰＲにより測定することができる。
そのため、本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、１０nM～１００pMの間の平均ＫＤ値、例えば５nM以下など、例えば４、３、もしくは２nM未満又はさらに小さい値などの平均ＫＤ値でヒトＣＤ１２３に結合しうるが、前記ＫＤ値は、好ましくは表面プラズモン共鳴により決定する。
したがって、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド又はＩＳＶに関し、それにおいて前記平均ＫＤ又はＥＣ５０はフローサイトメトリー又はＳＰＲにより決定し、例えば前記ＫＤ又はＥＣ５０は実施例のセクションに示すように決定する。
実施例では、ＳＰＲにおいて測定されたＫＤがフローサイトメトリーにおいて測定されたＥＣ５０と十分に相関することが示されている。
別の態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号７～１０のうちの１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、さらには９９%超の配列同一性を有しうる（表Ａ－４参照）。これらのポリペプチドは、本明細書において「５５Ｆ０３に関連するポリペプチド」又は「５５Ｆ０３に関連するＩＳＶ」と呼ぶ。
したがって、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６である。
さらなる態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号２３；又は
ｂ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、ポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は配列番号１６である；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２３；又は
ｄ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８～２０からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２３～２５からなる群より選択される。
したがって、好ましい態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド、好ましくはＩＳＶに関し、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８であり、及びＣＤＲ３は配列番号２３である。
好ましいポリペプチド及び／又はＩＳＶは、配列番号７～１０からなる群より選択される。
５５Ｆ０３に関連するポリペプチド又はＩＳＶは、ＣＤ１２３についてのそれらの精巧な特異性について選択された。本発明のポリペプチドの結合は、本明細書に記載するように、適切な結合アッセイ（フローサイトメトリーアッセイ及びＳＰＲを含むが、これらに限定しない）において測定することができる。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、細胞上に発現されたＣＤ１２３又はＣＤ１２３発現細胞に、１０μM～１００nMの平均ＥＣ５０値で結合しうる。
より具体的には、本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、好ましくはフローサイトメトリーにより測定した、１０μM～１００nMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５μM以下など、例えば４、３、２、もしくは１μM未満など、又はさらに小さい値でＭＯＬＭ－１３細胞上に発現されるヒトＣＤ１２３に結合する。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、好ましくはフローサイトメトリーにより測定した、１００nM～１nMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５０nM以下など、例えば４０、３０、２０、もしくは１０nM未満など、又はさらに小さい値など、例えば９、８、もしくは７nM未満など、又はさらに小さい値などでＣＨＯ－Ｋ１細胞上に発現されるヒトＣＤ１２３に結合する。
本発明のポリペプチド、好ましくはＩＳＶは、好ましくはフローサイトメトリーにより測定した、１０nM～１００pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５nM以下など、例えば４、もしくは３nM未満など、又はさらに小さい値などでＨＥＫ２９３細胞上に発現されるカニクイザルＣＤ１２３に結合する。
さらなる態様では、本発明は、１μM～１０nMの間の平均ＫＤ値を伴い、例えば５００nM以下など、例えば４００、３００、もしくは２００nM未満など、又はさらに小さい値などでヒトＣＤ１２３に結合するポリペプチド又はＩＳＶに関し、前記ＫＤ値は好ましくは表面プラズモン共鳴により測定する。
したがって、本発明は、本明細書に記載するポリペプチド又はＩＳＶに関し、それにおいて前記平均ＫＤ又はＥＣ５０はフローサイトメトリー又はＳＰＲにより決定し、例えば前記ＫＤ又はＥＣ５０が実施例のセクションに記載するように決定する。
実施例において、ＳＰＲにおいて測定するＫＤは、ＭＯＬＭ－１３細胞を使用したフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定されるように、ＥＣ５０と十分に相関することが示されている。
一般的に、表Ａ－４中に列挙するＣＤＲの組み合わせ（即ち、表Ａ－４中の同じ行で言及するもの）が好ましい。このように、ＩＳＶ中のＣＤＲが、表Ａ－４中に言及する、又は表Ａ－４に列挙するＣＤＲ配列と４、３、２、又は１つだけのアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択され、他のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは両方が、表Ａ－４中の同じ組み合わせに属する（即ち、表Ａ－４中の同じ行で言及する）ＣＤＲ配列より適切に選択される、又は同じ組み合わせに属するＣＤＲ配列と４、３、２、又は１つだけのアミノ酸の違いを有するＣＤＲ配列からなる群より適切に選択されるＣＤＲ配列であることが一般的に好ましい。上に記載するＣＤＲを有する本発明の代表的なポリペプチドを表Ａ－４中に示す。
本発明は、本明細書に記載する及び／又は配列番号１～１０より選択されるポリペプチドの少なくとも１つのＣＤ１２３への結合を交差遮断するＣＤ１２３に特異的に結合する、並びに／或いは、本明細書に記載する及び／又は配列番号１～１０より選択されるポリペプチドの少なくとも１つによるＣＤ１２３への結合から交差遮断されているポリペプチド、好ましくは、ＩＳＶに関する。
本発明はさらに、ＣＤ１２３に結合する２つ以上のＩＳＶを含む、又は（本質的に）それからなる単一特異性ポリペプチドに関する。そのような多価（単一特異性）ポリペプチド（本明細書で「本発明の多価ポリペプチド」とも呼ぶ）では、ＣＤ１２３に結合する２つ以上のＩＳＶは、本明細書でさらに記載するように、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結しうる。
したがって、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶを含むポリペプチドに関し、ここでＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶの群又は５５Ｆ０３に関連するＩＳＶの群より選択される。
より具体的な態様では、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つのＩＳＶを含むポリペプチドに関し、ここでＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶの群又は５５Ｆ０３に関連するＩＳＶの群より選択される。
本発明のそのような多価単一特異性ポリペプチドにおいて、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは同じであっても異なっていてもよく、ＣＤ１２３の同じ抗原決定基に対して（例えば、ＣＤ１２３の同じ部分又はエピトープに対して）向けられてもよく、或いは、ＣＤ１２３の異なる抗原決定基に対して、又はＣＤ１２３の異なる部分もしくはエピトープ；又はそれらの任意の適切な組み合わせに対して向けられてもよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｂ）ＣＤ１２３の第１の抗原決定基に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び第１の免疫グロブリン単一可変ドメインとは異なるＣＤ１２３の同じ抗原決定基に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメイン；又は（ｃ）ＣＤ１２３の第１の抗原決定基に対して向けられた第１の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＣＤ１２３の別の抗原決定基に対して向けられた第２の免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。
本発明の三価ポリペプチドは、（ａ）同一の免疫グロブリン単一可変ドメイン；（ｂ）ＣＤ１２３の同じ抗原決定基に対して向けられた異なる免疫グロブリン単一可変ドメイン；又は（ｃ）ＣＤ１２３の別の抗原決定基に対して向けられた異なる免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む、上のいずれかでありうる。
そのため、一態様では、本発明の単一特異性ポリペプチドは、例えば多重パラトープポリペプチド、例えば、例、二重パラトープなどでありうる。本明細書中で使用する用語「二重パラトープ」（抗原）結合分子又は「二重パラトープ」ポリペプチドは、少なくとも２つ（即ち、２つ以上）の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを意味し、ここで「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＣＤ１２３に対して向けられており、「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＣＤ１２３に対して向けられており、ここでこれらの「第１」及び「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインは異なるパラトープを有する。したがって、二重パラトープポリペプチドは、ＣＤ１２３に対して向けられた２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、又はそれらからなり、ここで少なくとも１つの「第１」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＣＤ１２３上の第一エピトープに対して向けられ、少なくとも１つの「第２」の免疫グロブリン単一可変ドメインはＣＤ１２３上の第１エピトープとは異なるＣＤ１２３上の第２エピトープに対して向けられる。
したがって、本発明は、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶが、第１のＩＳＶ及び第２のＩＳＶを含む二重パラトープであり、ここで第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶにより結合されたＣＤ１２３上のエピトープとは異なるＣＤ１２３上のエピトープに結合する。そのようなポリペプチドはまた、本明細書において「本発明の二重パラトープポリペプチド」とも呼ぶ。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載する（二重パラトープ）ポリペプチドを提供し、ここで第１のＩＳＶを５６Ａ１０に関連するＩＳＶの群より選択され、第２のＩＳＶを５５Ｆ０３に関連するＩＳＶの群より選択される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで第２のＩＳＶは第１のＩＳＶのＮ末端に位置する。そのようなポリペプチドは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶのＮ末端に５５Ｆ０３に関連するＩＳＶを含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドを提供し、ここで第２のＩＳＶは第１のＩＳＶのＣ末端に位置する。そのようなポリペプチドは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶのＣ末端に５５Ｆ０３に関連するＩＳＶを含む。
本発明の二重パラトープポリペプチドは、強い結合（「結合力」とも呼ぶ）のため、対応する一価ポリペプチドと比較し、ＣＤ１２３への結合について改善された親和性を有しうる。
結合力はポリペプチドの親和性であり、即ち、リガンドは２つ（又はそれ以上）のファーマコフォア（ＩＳＶ）を介して結合することができ、それにおいて、複数の相互作用が相乗作用して「見かけ上」の親和性を増強する。結合力は、本発明のポリペプチドと関連抗原又は抗原決定基の間での結合の強度の測定値である。本発明のポリペプチドは、その２つ（又はそれ以上）の構成要素（例えばＩＳＶなど）を介して、少なくとも２つの標的又は抗原決定基に結合することができ、それにおいて、複数の相互作用（例、第１の構成要素又はＩＳＶが第１の標的又は第１の抗原決定基に結合し、第２の構成要素又はＩＳＶが第２の標的又は第２の抗原決定基に結合する）が相乗作用して「見かけ上」の親和性を増強する。結合力は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位の間での親和性及び抗原結合分子上に存在する関連する結合部位の数の両方に関連する。例えば、限定はしないが、細胞上の異なる標的又は異なる抗原決定基に対して向けられた２つ以上の構成単位（例えばＩＳＶなど）を含むポリペプチドは、個々の単量体又は個々の構成単位（例えば、本発明のポリペプチド中に含まれる一価ＩＳＶなど）の各々よりも高い結合力で結合しうる（及び、通常はするであろう）。
本発明の単一特異性ポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又はそれらから（本質的に）なる。これらのＩＳＶのフレームワーク配列は、好ましくは（例えば、配列最適化、例えばヒト化又はラクダ化などにより）免疫グロブリンフレームワーク配列又は免疫グロブリンフレームワーク配列から由来するフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）である。例えば、フレームワーク配列は、免疫グロブリン単一可変ドメインから、例えば軽鎖可変ドメイン（例、ＶＬ配列）から及び／又は重鎖可変ドメイン（例、ＶＨ配列）から由来するフレームワーク配列でありうる。１つの特に好ましい態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（前記フレームワーク配列は、場合により、部分的又は完全にヒト化されていてもよい）から由来するフレームワーク配列、又はラクダ化された従来のＶＨ配列のいずれかである。
フレームワーク配列は、好ましくは、本発明の単一特異性ポリペプチドに包含されるＩＳＶが、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸配列）；単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸）；「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸）；ナノボディ；ＶＨＨ；ヒト化ＶＨＨ；ラクダ化ＶＨ；又は親和性成熟により得られたＶＨＨであるようにしうる。再び、適切なフレームワーク配列は、例えば、標準的なハンドブック並びに本明細書に記載するさらなる開示及び先行技術に基づき、当業者に明らかであろう。
特に、本発明の単一特異性ポリペプチド中に存在するフレームワーク配列は、本発明の単一特異性ポリペプチドがナノボディであるように、１つ以上のホールマーク残基（ＷＯ０８／０２００７９（表Ａ－３～Ａ－８）中で定義される通り）を含みうる。そのようなフレームワーク配列（の適した組み合わせ）の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる開示から明らかになるであろう（例、表Ａ－４を参照のこと）。一般的には、ナノボディ（特に、ＶＨＨ、部分的又は完全ヒト化ＶＨＨ及びラクダ化ＶＨ）は、特に、フレームワーク配列の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる（例、ＷＯ０８／０２００７９、ページ６１、２４行からページ９８、３行においてさらに記載される通り）。
さらに特に、本発明は、（一般的な）構造ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を伴うアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供し、
それにおいて、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、及び、それにおいて、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、及びそれらは：
ｉ） 配列番号１～１０（表Ａ－４を参照のこと）のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０%、より好ましくは９０%、さらにより好ましくは９５%のアミノ酸同一性を有し、それにおいて、アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視する。この点に関して、表Ａ－４も参照のこと。それは、配列番号１～１０の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号２６～２９）、フレームワーク２配列（配列番号３０～３３）、フレームワーク３配列（配列番号３４～３９）、及びフレームワーク４配列（配列番号４０～４１）を列挙している（表Ａ－４を参照のこと）；又は
及び、それにおいて：
ｉｉ） 好ましくは、Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８位でのアミノ酸残基の１つ以上は、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ－３から表Ａ－８に言及するホールマーク残基より選択される。
本発明はまた、多数の配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
特に、本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、以前のパラグラフにおいて免疫グロブリン単一可変ドメインについて一般的に定義されるアミノ酸配列でありうるが、しかし、それにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基が（及び、特にフレームワーク残基の少なくとも１つにおいて）存在し、それは、ヒト化置換（本明細書で定義する通り）である及び／又はそれに対応する。一部の好ましいが非限定的なヒト化置換（及びそれらの適切な組み合わせ）は、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかになるであろう。また、又は代わりに、他の潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換の１つ以上（又はその組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に（それ自体が公知の任意の様式において、本明細書においてさらに記載する通りに）導入することができ、結果として生じるヒト化ＶＨＨ配列を、標的についての親和性について、安定性について、発現の簡単さ及びレベルについて、及び／又は他の所望の特性についてテストすることができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（又はその適切な組み合わせ）は、当業者により、本明細書における開示に基づき決定することができる。また、先述のものに基づき、免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）を部分的にヒト化又は完全にヒト化してもよい。
本発明はまた、安定性試験の間での保存時に改善した発現及び／又は増加した安定性を示しうる配列最適化ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又はＩＳＶは、Ｎ末端の低下したピログルタミン酸翻訳後修飾を示し、故に増加した生成物の安定性を有しうる。また、本発明の配列最適化ポリペプチド及び／又はＩＳＶは、ＣＤ１２３についての他の改善された特性、例えば、より少ない免疫原性、改善した結合特性（適切に測定された及び／又はＫＤ値（実際又は見かけ上）、ＫＡ値（実際又は見かけ上）、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代わりにＥＣ５０値として表現される（本明細書中にさらに記載する通り））、ＣＤ１２３についての改善された親和性及び／又は改善された結合力を示す。
本発明の一部の特に好ましい配列最適化免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号１～１０の免疫グロブリン単一可変ドメインの配列最適化変異体である。
このように、本発明の一部の他の好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは、（本明細書で定義する通り）ＣＤ１２３に結合することができ、以下であるナノボディである：
ｉ） 配列番号１～１０の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの配列最適化変異体であり；及び／又は
ｉｉ） 配列番号１～１０の免疫グロブリン単一可変ドメインの少なくとも１つと少なくとも８０%のアミノ酸同一性を有し（表Ａ－４を参照のこと）、それにおいてアミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基を無視する；この点に関して、表Ａ－４も参照のこと。そこでは配列番号１～１０の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号２６～２９）、フレームワーク２配列（配列番号３０～３３）、フレームワーク３配列（配列番号３４～３９）、及びフレームワーク４配列（配列番号４０～４１）を列挙する（表Ａ－４を参照のこと）；
及び、それにおいて：
ｉｉｉ） 好ましくは、Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４、及び１０８位でのアミノ酸残基の１つ以上は、ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ－３～表Ａ－８に言及するホールマーク残基より選択される。
本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、全て「改善された免疫グロブリン可変ドメイン」と表題の付けられた、以下の同時係属中の米国仮特許出願に記載する特定の変異／アミノ酸残基を含みうる：２０１４年５月１６日に出願されたＵＳ ６１／９９４５５２； ２０１４年６月１８日に出願されたＵＳ ６１／０１４，０１５；２０１４年８月２１日に出願されたＵＳ ６２／０４０，１６７；及び２０１４年９月８日に出願されたＵＳ ６２／０４７，５６０（全てがAblynx N.V.に属する）並びにこれらの仮出願に基づいており、２０１５年１１月１９日に公開された国際出願ＷＯ ２０１５／１７３３２５。
特に、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、適切には、（ｉ）１１２位のＫ又はＱ；（ｉｉ）１１位のＶと組み合わされた１１０位のＫ又はＱ；又は（ｉｉｉ）８９位のＴ；又は（ｉｖ）１１０位にＫ又はＱを伴う８９位のＬ；又は（ｖ）１１位のＶ及び８９位のＬ；又は（ｉ）～（ｖ）の任意の適切な組み合わせを含みうる。
前記の同時係属中の米国仮特許出願にも記載されている通り、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインが上の（ｉ）～（ｖ）の１つに従った変異（又はそれらの適切な組み合せ）を含む場合：
－ １１位のアミノ酸残基は、好ましくはＬ、Ｖ、又はＫより選択される（及び最も好ましくはＶである）；及び
－ １４位のアミノ酸残基は、好ましくはＡ又はＰより適切に選択される；及び
－ ４１位のアミノ酸残基は、好ましくはＡ又はＰより適切に選択される；及び
－ ８９位のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、Ｖ、又はＬより適切に選択される；及び
－ １０８位のアミノ酸残基は、好ましくはＱ又はＬより適切に選択される；及び
－ １１０位のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、Ｋ、又はＱより適切に選択される；及び
－ １１２位のアミノ酸残基は、好ましくはＳ、Ｋ、又はＱより適切に選択される。
前記の同時係属中の米国仮出願に言及されている通り、前記変異は、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又は構築物へのいわゆる「既存の抗体」の結合を防止又は低下させる際に効果的である。この目的のために、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、（場合により前記変異との組み合わせにおいて）Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（式中、ｎは１～１０、好ましくは１～５、例えば１、２、３、４、又は５など（及び好ましくは１又は２、例えば１など）であり；各々のＸは、非依存的に選択され、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）からなる群より非依存的に選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、それらについて再び、前記の米国仮特許出願並びにＷＯ １２／１７５７４１も参照のこと。特に、本発明のポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインは、それがタンパク質、ポリペプチド、又はそれを含む他の構築物のＣ末端を形成する場合、そのようなＣ末端伸長を含んでもよい（再び、前記の米国仮出願並びにＷＯ １２／１７５７４１にさらに記載される）。
したがって、本発明は、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎをさらに含む、本明細書に記載するポリペプチドに関し、それにおいて、ｎは１～５、例えば１、２、３、４、又は５であり、及びＸが天然に存在するアミノ酸であり、好ましくはシステインではない。
本発明のこれらのポリペプチド、及び特に本発明のＣＤＲ配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインは、多価又は多特異性ポリペプチドの調製のための構成単位又は結合単位としての使用のために特に適している。
したがって、ＣＤ１２３に結合する本発明の単一特異性ポリペプチドは、本質的に単離された形態（本明細書で定義する通り）でありうる、又はそれらはタンパク質又はポリペプチドの一部を形成しうるが、それはＣＤ１２３に結合する１つ以上のＩＳＶを含みうる、又はそれから本質的になりうる、及び、場合により、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て、場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含みうる。
したがって、本発明はまた、本発明の１つ以上の単一特異性ポリペプチド（又はその適切なフラグメント）を含む、又はそれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドに関する。さらなる態様では、ＣＤ１２３に結合する本発明の単一特異性ポリペプチドは、多特異性ポリペプチドの一部を形成しうるが、それはＣＤ１２３に結合する１つ以上のＩＳＶを含みうる、又はそれから本質的になりうる、及び、場合により、別の標的（例えばＴＣＲなど）に特異的に結合する１つのＩＳＶをさらに含みうる、及び、場合により、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て、場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含みうる。
本発明の単一特異性ポリペプチドはこのように、本明細書に記載する通り、本発明の多特異性ポリペプチドを提供するように、そのようなタンパク質又はポリペプチド中での結合単位又は構成要素として使用する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多特異性ポリペプチド及びそれらの調製については、Conrathら（2001, J. Biol. Chem. 276: 7346-7350）、並びに例えばＷＯ ９６／３４１０３、ＷＯ ９９／２３２２１、及びＷＯ ２０１０／１１５９９８も参照のこと）。
２．多特異性ポリペプチド
本発明はさらに、２つ以上の構成要素（例えば本発明の少なくとも２つの単一特異性ポリペプチド又はＩＳＶなど）を含む、又はそれから（本質的に）なる多特異性ポリペプチドに関し、それにおいて、少なくとも１つの構成要素が第１の抗原（即ち、ＣＤ１２３）に対して向けられ、少なくとも１つの構成要素が第２の抗原（即ち、ＴＣＲ）に対して向けられる。これらの多特異性ポリペプチドはまた、本明細書において「本発明の多特異性ポリペプチド」とも呼ぶ。本発明のこれらの多特異性ポリペプチドにおける使用のための好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは（先に記載した通り）本発明の単一特異性ポリペプチドである。
本明細書中にさらに記載する通り、追加の結合単位、例えば異なる抗原特異性（即ち、ＣＤ１２３及びＴＣＲとは異なる）を有する免疫グロブリン単一可変ドメインなどは、本発明の多特異性ポリペプチドに連結されうる。３つ以上の特異性、三重特異性、四重特異性などの免疫グロブリン単一可変ドメインを組み合わせることによって、構築物を形成することができる。これらの多特異性ポリペプチドはまた、本明細書において「本発明の（多特異性）ポリペプチド」又は「本発明の構築物」とも呼ぶ。
このように、例えば、「本発明の二重特異性ポリペプチド」は、第１の抗原（即ち、ＣＤ１２３）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及び第２の抗原（即ち、ＴＣＲ）に対する少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又はそれらから（本質的に）なるポリペプチドであるのに対し、「本発明の三重特異性ポリペプチド」は、第１の抗原（即ち、ＣＤ１２３）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、第２の抗原（即ち、ＴＣＲ）に対する免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び第３の抗原（即ち、ＣＤ１２３及びＴＣＲとは異なる）などに対する少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、又はそれらから（本質的に）なるポリペプチドである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書にさらに記載する通り、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結してもよい。
したがって、本発明は、ＴＣＲに特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含む、又はそれらかな（本質的に）なるポリペプチドに関する。さらなる態様では、本発明はまた、ＴＣＲに特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン及びＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶを含む、又はそれらからなるポリペプチドを提供する。そのような多特異性ポリペプチド又はその構築物の一部の非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになるであろう。
（実施例のセクションでも実証している通り）ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶ及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを、本発明のポリペプチド中で任意の順序で配置することができることが理解されよう。さらに特に、一態様では、ＩＳＶ結合ＴＣＲはＮ末端に位置し、１つ以上のＩＳＶ結合ＣＤ１２３はＣ末端に位置する。別の態様では、１つ以上のＩＳＶ結合ＣＤ１２３はＮ末端に位置し、ＩＳＶ結合ＴＣＲはＣ末端に位置する。別の態様では、ＣＤ１２３に結合する１つ以上のＩＳＶはＮ末端に位置し、ＣＤ１２３に結合する１つ以上のさらなるＩＳＶはＣ末端に位置する。好ましい態様では、本発明は、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶがポリペプチドのＮ末端に位置するポリペプチドに関する。
一部の態様では、本発明の多重特異性ポリペプチドは、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶを含む。一様態では、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶがＣＤ１２３上の同じエピトープに結合する。一態様では、そのような本発明の多特異性ポリペプチドは、５６Ａ１０に関連する２つ以上のＩＳＶを含みうる。別の態様では、本発明のそのようなポリペプチドは、５５Ｆ０３に関連する２つ以上のＩＳＶを含む。
より好ましい態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶは異なるエピトープに結合する。したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する２つ以上のＩＳＶは、第１のＩＳＶ及び第２のＩＳＶを含み、ここで第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶにより結合されたＣＤ１２３上のエピトープとは異なるＣＤ１２３上のエピトープに結合する。
さらに特に、本発明は本発明の多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に結合する第１のＩＳＶは５６Ａ１０に関連するＩＳＶより選択され、ＣＤ１２３に結合する第２のＩＳＶを５５Ｆ０３に関連するＩＳＶより選択される。先に考察した通り、本発明のこれらの二重パラトープポリペプチドは、強い結合（「結合力」とも呼ぶ）のため、本発明の単一特異性ポリペプチドと比較し、ＣＤ１２３への結合について改善された親和性を有する。
（実施例のセクションでも実証している通り）ＣＤ１２３に結合するＩＳＶは、本発明の多特異性ポリペプチドにおいて任意の順序で配置され得ることが理解されるであろう。さらに特に、一態様では、第２のＩＳＶ（即ち、５５Ｆ０３に関連するＩＳＶ）は、第１のＩＳＶ（即ち、５６Ａ１０に関連するＩＳＶ）のＮ末端に位置する。別の態様では、第２のＩＳＶ（即ち、５５Ｆ０３に関連するＩＳＶ）は第１のＩＳＶ（即ち、５６Ａ１０に関連するＩＳＶ）のＣ末端に位置する。そのような多特異性構築物の一部の非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになるであろう。
典型的には、本発明の多特異性ポリペプチドは、標的細胞上の高親和性及び高特異性抗原認識及びＴ細胞活性化を組み合わせ、Ｔ細胞の天然の特異性に非依存的な活性化をもたらす。
本明細書で言及する「標的細胞」は、その表面上に特定の抗原（即ち、ＣＤ１２３）を提示する細胞である。一様態では、「標的細胞」はＣＤ１２３の過剰発現により特徴付けられる細胞である。好ましい態様では、そのような標的細胞はＣＤ１２３関連疾患と関連している。さらにより好ましい態様では、標的細胞は、ＣＤ１２３を（過剰）発現する癌細胞である。用語「癌」は、典型的には調節不全の細胞増殖又は生存により特徴付けられる哺乳動物における病理学的状態を指す。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）の１つ以上の細胞応答を指し、例えば増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、活性化マーカーの発現、及びリダイレクト標的細胞溶解より選択される。本明細書で使用する用語「細胞応答」は、ＴＣＲ複合体の構築時の細胞内シグナル伝達の結果としての細胞の応答を指す。
標的細胞上の細胞表面分子（例えばＣＤ１２３など）及びＴ細胞ＴＣＲの両方に結合するポリペプチドの作用機序は一般に公知である。Ｔ細胞を標的細胞（例えばＣＤ１２３発現細胞など）に極めて接近させること、即ち、前記Ｔ細胞を会合させてＴＣＲ複合体をクラスター化させることは、Ｔ細胞活性化及びその後のＴ細胞による標的細胞の死滅をもたらす。本発明において、このプロセスは、ＣＤ１２３関連疾患（例えば増殖性疾患又は炎症状態など）に対する闘いにおいて利用される。一般的に、Ｔ細胞は、孔形成タンパク質（パーフォリンと呼ぶ）及び細胞死誘導プロテアーゼ（グランザイムと呼ぶ）との致命的な組み合わせを含む顆粒を備えている。好ましくは、これらのタンパク質は、Ｔ細胞が、死滅させることを目的とする標的細胞と近接している場合に形成される細胞溶解性シナプスを介して標的細胞（例えばＣＤ１２３発現細胞など）に送達される。通常では、Ｔ細胞と標的細胞の間の近接は、その適合するＴ細胞受容体を使用してＴ細胞がＭＨＣ ／ペプチド複合体に結合することにより達成される。本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体／ ＭＨＣ相互作用の非存在においてＴ細胞を標的細胞にそのように近接させる。
したがって、本発明は本明細書に記載する多特異性ポリペプチドに関し、前記ポリペプチドはＴ細胞を標的細胞に向かわせる。したがって、本発明のポリペプチドは「ＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞をリダイレクトする」、これは、本発明のポリペプチドによって、死滅されるＣＤ１２３発現細胞にＴ細胞を近接させることを意味する。
１つのアーム（ＴＣＲに結合するＩＳＶ）を用いて、本発明の多特異性ポリペプチドは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体のシグナル伝達複合体のタンパク質成分であるＴＣＲサブユニットの定常ドメインに結合する。他のアーム（ＣＤ１２３に結合する１つ以上のＩＳＶ）を用いて、多特異性ポリペプチドは標的細胞上のＣＤ１２３に結合する。好ましくは、Ｔ細胞活性化は、多特異性ポリペプチドがＣＤ１２３発現細胞（の部位）でＴ細胞に提示される場合にだけ見られる。活性化のための標的細胞（即ち、ＣＤ１２３発現細胞）への抗原依存は、好ましい安全性プロフィールをもたらす。本発明の多特異性ポリペプチドは、ＣＤ１２３に高度に特異的な結合を示す。そのため、本明細書に例示する通り、標的外結合は回避され、標的非依存的なＴ細胞活性化は最小である。一様態では、多特異性ポリペプチドはＴ細胞及び標的細胞を一時的に係留する。好ましくは、多特異性ポリペプチドは、標的細胞（即ち、ＣＤ１２３発現細胞）の高度に強力なリダイレクト溶解のために、休止中のポリクローナルＴ細胞（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞など）を活性化に誘導することができる。好ましくは、Ｔ細胞は第１の標的細胞の溶解後に次の標的細胞に向けられる。
一態様では、本発明は、本明細書に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここで前記多特異性ポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導する。
さらなる態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここで前記Ｔ細胞活性化はＭＨＣ認識から非依存的である。
本明細書で使用する「ＭＨＣ認識から非依存的なＴ細胞活性化」は、標的細胞上のＭＨＣ／ペプチド複合体の、Ｔ細胞上のその適合するＴ細胞受容体への結合から非依存的であるＴ細胞活性化を指す。Ｔ細胞を標的細胞に近接させることにより、標的細胞は死滅されるであろう。通常では、Ｔ細胞と標的細胞の間の近接は、その適合するＴ細胞受容体を使用してＴ細胞がＭＨＣ／ペプチド複合体に結合することにより達成される。本発明の多特異性ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体／ＭＨＣ相互作用の非存在においてＴ細胞を標的細胞にそのように近接させる。多特異性ポリペプチドは標的細胞上のＣＤ１２３に結合し、そのため、Ｔ細胞に提示され、結合し、Ｔ細胞活性化及び標的細胞の死滅をもたらす。
したがって、さらなる態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、標的細胞上のＣＤ１２３に結合した前記ポリペプチドをＴ細胞に提示することに依存する。
さらなる態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、前記Ｔ細胞による１つ以上の細胞応答を起こし、ここで前記細胞応答は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、活性化マーカーの発現、及びリダイレクト標的細胞溶解からなる群より選択される。
Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは当技術分野において公知であり、例えば、ＷＯ９９／５４４４０において又はSchlerethら（2005, Cancer Immunol. Immunother. 20: 1-12）により記載されている通りである、或いは実施例又は以下に例示される通りである。
限定しないが、本発明のポリペプチドによるＴ細胞活性化は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及び種々の細胞接着分子の上方調節、サイトカイン（例、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－４、及びＩＬ－１０）のデノボ発現及び／又は放出、グランザイム及びパーフォリン発現の上方制御、並びに／或いは細胞増殖、膜小胞形成、プロカスパーゼ３及び／又は７の活性化、核ＤＮＡの断片化及び／又はカスパーゼ基質ポリ（ＡＤＰｒｉｂｏｓｅ）ポリメラーゼの切断をモニターすることにより測定することができる。好ましくは、多特異性ポリペプチドによる標的細胞のリダイレクト溶解は、Ｔ細胞受容体特異性、ＭＨＣクラスＩ及び／又はβ２ミクログロブリンの存在、並びに／或いは任意の共刺激に非依存的である。
本発明のポリペプチドは、本明細書においてさらに例示するように、以前に刺激されていない（即ち、非活性化）末梢ポリクローナルＣＤ８＋及びＣＤ４＋陽性Ｔ細胞とのインビトロでのリダイレクト溶解を示す。本発明のポリペプチドによるＴ細胞の動員を介した標的細胞のリダイレクト溶解は、細胞溶解性シナプス形成並びにパーフォリン及びグランザイムの送達を含む。Ｔ細胞による細胞溶解は、例えば、Atkinson及びBleackley（1995, Crit. Rev. Immunol 15(3-4): 359-384）により記載されている。好ましくは、本発明のポリペプチドは、孔形成においてＴ細胞を刺激し、細胞傷害性Ｔ細胞顆粒のアポトーシス促進性成分を送達することにより標的細胞（例、癌細胞）の死滅を媒介する。好ましくは、関与するＴ細胞は連続標的細胞溶解が可能である。インビトロでは、本発明のポリペプチドを用いて、リダイレクト溶解が低ピコモル濃度で見られ、非常に少数の本発明のポリペプチドを、Ｔ細胞を誘発するために標的細胞に結合させる必要があることを示唆する。実施例において実証するように、低いエフェクター対標的細胞比率は、連続的な標的細胞溶解についての指標となりうるが、本発明のポリペプチドの高い効力を実証した。
本明細書で使用するように、用語「効力」は、薬剤、例えば単一特異性もしくは多特異性ポリペプチド、ＩＳＶ、又はナノボディなどの生物学的活性の測定値である。効力は、その特定の効果が生じるために要求される、本発明のポリペプチドの量の機能である。それは、そのポリペプチドについてのＩＣ５０の逆として単純に測定される。本発明の多特異性ポリペプチドについて、それはＴ細胞活性化を誘導するための本発明の前記ポリペプチドの能力を指す。薬剤の効力は、例えば実験のセクションに記載するように、当技術分野において公知の任意の適切な方法により決定することができる。細胞培養ベースの効力アッセイは、それらが薬剤により誘発される生理学的応答を測定し、比較的短期間内に結果を生むことができるため、しばしば生物学的活性を決定するための好ましいフォーマットである。生成物の作用機序に基づく種々の型の細胞ベースのアッセイを使用することができ、増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、殺細胞アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、細胞表面受容体結合アッセイ、及び機能的に必須のタンパク質又は他のシグナル分子（例えばリン酸化タンパク質、酵素、サイトカイン、ｃＡＭＰなど）の誘導／阻害を測定するためのアッセイ、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅アッセイ（例えば、実施例のセクションにおいて記載する通り）を含むが、これらに限定せず、全てが当技術分野において公知である。細胞ベースの効力アッセイからの結果は、本発明の多特異性ポリペプチドと、対応する参照一価ＩＳＶ（例、１つだけのＩＳＶ又は１つのナノボディを含み、場合により無関係のナノボディをさらに含むポリペプチド）について得られた応答との比較により決定する「相対効力」として表すことができる（実験のセクション参照）。
（本発明のポリペプチドの）「効力」は、効果自体の最高強度を飽和ポリペプチド濃度で測定する。効力は、本発明のポリペプチドにより達成可能な最高応答を示す。それは、所望の（治療的）効果を産生するためのポリペプチドの能力を指す。
一態様では、本発明の多特異性ポリペプチドによってＴ細胞が活性化され、フローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定されるように、１０nM～１pMの間の平均ＥＣ５０値でＣＤ１２３発現細胞（例えばＭＯＬＭ－１３又はＫＧ１ａ細胞）を死滅させる（実施例２５参照）。
より具体的には、本発明のポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、１nMと１pMの間の平均ＥＣ５０値、例えば５００pM以下の平均ＥＣ５０値など、例えば４００、３００、２００、或いは１００pM未満又はさらに小さい値など、例えば９０、８０、７０、６０、５０、４０、或いは３０pM未満又はさらに小さい値などでＣＤ１２３発現細胞（例えばＭＯＬＭ－１３細胞など）の死滅を起こし、前記ＥＣ５０値は、例えば、標的細胞としてのＭＯＬＭ－１３細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定される。
より具体的には、本発明のポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、約１０%超、例えば１５%、１６%、１７%、１８%、１９%、或いは２０%又はさらにそれ以上など、例えば２５%超、又はさらに３０%超などの平均溶解パーセンテージでＣＤ１２３発現細胞（例えばＭＯＬＭ－１３細胞など）の溶解を起こし、前記溶解パーセンテージは、例えば、標的細胞としてのＭＯＬＭ－１３細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定される。
より具体的には、本発明のポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、１０nMと１０pMの間の平均ＥＣ５０値、例えば５nM以下の平均ＥＣ５０値など、例えば４、３、２、或いは１nM未満又はさらに小さい値など、例えば９０、８０、７０、或いは６０pM未満又はさらに小さい値などでＣＤ１２３発現細胞（例えばＫＧ１ａ細胞など）の死滅を起こし、前記ＥＣ５０値は、例えば、標的細胞としてのＫＧ１ａ細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定される。
より具体的には、本発明のポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導し、ここで前記Ｔ細胞活性化は、約１０%超、例えば１５%、１６%、１７%、或いは１８%又はさらにそれ以上など、例えば２４%超などの平均溶解パーセンテージでＣＤ１２３発現細胞（例えばＫＧ１ａ細胞など）の溶解を起こし、前記溶解パーセンテージは、例えば、標的細胞としてのＫＧ１ａ細胞及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて決定される。
別の態様では、本発明の多特異性ポリペプチドによってＴ細胞が活性化され、そのため、サイトカイン分泌を誘導しうる。したがって、ポリペプチドは、１００nM～１０pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－６分泌を起こす（実施例３０参照）。
より具体的には、本発明のポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導し、ここで前記Ｔ細胞活性化は１００nM～１０pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５０nM以下、例えば４０、３０、２０、１０、もしくは９nM未満又はさらに小さい値など、例えば８、７、６、５、４、３、２、もしくは１nM未満又はさらに小さい値など、例えば５００pM未満又はさらに小さい値など、例えば４００、３００、２００、もしくは１００pM未満又はさらに小さい値などの平均ＥＣ５０値でＩＦＮ－γ分泌を起こし、前記ＥＣ５０値は、例えば実施例３０でさらに説明されるように、例えばＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて決定される。
より具体的には、本発明のポリペプチドはＴ細胞活性化を誘導し、ここで前記Ｔ細胞活性化は１００nM～１０pMの間の平均ＥＣ５０値を伴い、例えば５０nM以下、例えば４０、３０、２０、もしくは１０nM未満又はさらに小さい値など、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１nM未満又はさらに小さい値など、例えば５００pM未満又はさらに小さい値など、例えば４００、３００、２００、もしくは１００pM未満又はさらに小さい値などの平均ＥＣ５０値でＩＬ－６分泌を起こし、前記ＥＣ５０値は、例えば実施例３０でさらに説明されるように、例えばＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて決定される。
別の態様では、本発明の多特異性ポリペプチドは形質細胞様細胞（ｐＤＣ）及び好塩基球の枯渇を起こす（実施例３１参照）。
したがって、本発明は、前記Ｔ細胞活性化が形質細胞様細胞（ｐＤＣ）及び好塩基球の枯渇を起こすポリペプチドに関する。
別の態様では、本発明の多特異性ポリペプチドはＴ細胞増殖をさらに起こしうる（実施例３９参照）。
したがって、本発明は、前記Ｔ細胞活性化が前記Ｔ細胞の増殖を起こすポリペプチドに関する。
本発明の多特異性ポリペプチドは、それらの特異性について注意深く選択されているＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含む。そのため、本発明の多特異性ポリペプチドはＣＤ１２３への高度に特異的な結合を示し、それによって、それらがＣＤ１２３発現標的細胞を死滅することが可能になる。対照的に、最小の死滅だけがＣＤ１２３発現細胞の非存在において観察されたが、これは本発明のポリペプチドの安全性を強調する。
したがって、別の様態では、本発明は、ＣＤ１２３陽性細胞の非存在におけるＴ細胞活性化が最小であるポリペプチドに関する（実施例３６～３８参照）。
より具体的には、本発明はポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３陰性細胞のＴ細胞活性化誘導性溶解は、約１０%以下、例えば９%以下など、例えば８、７、或いは６%又はさらにそれ以下などであり、前記溶解は、例えば、標的細胞としてのＣＤ１２３陰性細胞、例えばＵ－９３７又はＮＣＩ－Ｈ９２９細胞など、及びエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的細胞比で使用し、ＴＯＰＲＯ３読み出しを用いたフローサイトメトリーベースのアッセイにおいて平均溶解パーセンテージとして決定する。
より具体的には、本発明は、ＣＤ１２３陰性細胞の存在においてＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の分泌を誘導しないポリペプチドに関し、前記分泌は、例えばＥＬＩＳＡベースのアッセイにおいて決定される。
本発明者らは、本発明のＴＣＲ結合ＩＳＶ及び本発明の１つ以上のＣＤ１２３結合ＩＳＶを含む本発明の特定の多特異性ポリペプチドが、ＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞をリダイレクトするのに特に適していることを観察した。本発明のこれらの多特異性ポリペプチドを用いて、Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ１２３発現細胞の非存在において最小であった。
したがって、本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含む、ＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞をリダイレクトさせる多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び／又は
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
さらなる態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
特定の態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１～１９１；又は
ｂ） 配列番号１８１～１９１の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の２、４、５、６、８、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２７、２９、３０、３１、３３、及び／又は３５位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２～２１７；又は
ｄ） 配列番号１９２～２１７の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで ４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の１、３、５、７、８、及び／又は９位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５０、５２、５４、５６、５７、及び／又は５８位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８～２２５；又は
ｆ） 配列番号２１８～２２５の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで ４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の１、４、５、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９５、９８、９９、及び／又は１０１位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１；又は
ｂ） 配列番号１８１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ２位では、ＤをＡ、Ｓ、Ｅ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＨをＹに変化させている；
－ ５位では、ＫをＬに変化させている；
－ ６位では、ＩをＬに変化させている；
－ ８位では、ＦをＩ又はＶに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＧをＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１９２；又は
ｂ） 配列番号１９２のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＨをＴ又はＲに変化させている；
－ ３位では、ＳをＴ又はＡに変化させている；
－ ５位では、ＧをＳ又はＡに変化させている；
－ ７位では、ＱをＤ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶに変化させている；
－ ８位では、ＴをＡ又はＶに変化させている；及び／又は
－ ９位では、ＤをＡ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号２１８；又は
ｂ） 配列番号２１８のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＦをＹ、Ｌ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＩをＬに変化させている；
－ ５位では、ＹをＷに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＮ又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８１；又は
ｂ） 配列番号１８１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ２位では、ＤをＡ、Ｓ、Ｅ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＨをＹに変化させている；
－ ５位では、ＫをＬに変化させている；
－ ６位では、ＩをＬに変化させている；
－ ８位では、ＦをＩ又はＶに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＧをＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１９２；又は
ｄ） 配列番号１９２のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＨをＴ又はＲに変化させている；
－ ３位では、ＳをＴ又はＡに変化させている；
－ ５位では、ＧをＳ又はＡに変化させている；
－ ７位では、ＱをＤ、Ｅ、Ｔ、Ａ、又はＶに変化させている；
－ ８位では、ＴをＡ又はＶに変化させている；及び／又は
－ ９位では、ＤをＡ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１８；又は
ｆ） 配列番号２１８のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ １位では、ＦをＹ、Ｌ、又はＧに変化させている；
－ ４位では、ＩをＬに変化させている；
－ ５位では、ＹをＷに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＮ又はＳに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＴＣＲに結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
別の態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１～１９１からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１９２～２１７からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２１８～２２５からなる群より選択され、及び、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１９２であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１８であり、及びＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
好ましい態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、配列番号４２及び７８～１８０からなる群より、あるいは配列番号４２及び７８～１８０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択され、及びＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、本明細書にさらに記載する通りである。
上に記載するＴＣＲ結合ＩＳＶとは別に、本発明の多特異性ポリペプチドにおいて、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは５６Ａ１０及び／又は５５Ｆ０３に関連する。
したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１～１６；又は
ｂ） 配列番号１１～１６の１つのアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ１の３、６、７、及び／又は８位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、２８、３１、３２、及び／又は３３位）に存在する；ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号１７～２０；又は
ｄ） 配列番号１７～２０の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ２の３、６、及び／又は１０位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、５２、５４、及び／又は５８位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｅ） 配列番号２１～２５；又は
ｆ） 配列番号２１～２５の１つのアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、ここで３、２、又は１つのアミノ酸の違いは、ＣＤＲ３の３、４、及び／又は５位（Ｋａｂａｔ番号付けに従うと、９７、９８、及び／又は９９位）に存在する；ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
一態様では、ＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、５６Ａ１０に関連するＩＳＶでありうる。
したがって、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むＩＳＶが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ２は配列番号１７である。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号２１；又は
ｂ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１１；又は
ｂ） 配列番号１１のアミノ酸配列と４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＴをＳ又はＰに変化させている；
－ ６位では、ＩをＳに変化させている；
－ ７位では、ＮをＤに変化させている；及び／又は
－ ８位では、ＤをＶ又はＡに変化させている；
ただし、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ１を含むポリペプチドが、４、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ１を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は配列番号１７である；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２１；又は
ｄ） 配列番号２１のアミノ酸配列と１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＰをＡに変化させている；
ただし、１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１～１５からなる群より選択され、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１～２２からなる群より選択される。
したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１１であり、ＣＤＲ２は配列番号１７であり、及びＣＤＲ３は配列番号２１である。
好ましい態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、配列番号１～６からなる群より、或いは配列番号１～６のうちの１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択される。
上とは別に、又はそれに加えて、ＣＤ１２３に特異的に結合するＩＳＶは、５５Ｆ０３に関連するＩＳＶでありうる。
したがって、本発明はまた、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６である。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むＩＳＶが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は、上に記載する多特異性ポリペプチドに関し、ここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号２３；又は
ｂ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むＩＳＶが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むＩＳＶによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいて：
ｉ） ＣＤＲ１は配列番号１６である；
及び
ｉｉ） ＣＤＲ２は以下からなる群より選択される：
ａ） 配列番号１８；又は
ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列と３、２、又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ３位では、ＹをＷに変化させている；
－ ６位では、ＮをＳに変化させている；及び／又は
－ １０位では、ＱをＥに変化させている；
ただし、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ２を含むポリペプチドが、３、２、又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ２を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）；
及び
ｉｉｉ） ＣＤＲ３は以下からなる群より選択される：
ｃ） 配列番号２３；又は
ｄ） 配列番号２３のアミノ酸配列と２又は１つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列、それにおいて
－ ４位では、ＥをＲに変化させている；及び／又は
－ ５位では、ＴをＤ又はＹに変化させている；
ただし、２又は１つのアミノ酸の違いを伴うＣＤＲ３を含むポリペプチドが、２又は１つのアミノ酸の違いを伴わないＣＤＲ３を含むポリペプチドによる結合と比較して、ほぼ同じ、又はより高い親和性を伴いＣＤ１２３に結合することを条件とする（前記親和性は表面プラズモン共鳴により測定される）。
別の態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８～２０からなる群より選択され、及びＣＤＲ３は配列番号２３～２５からなる群より選択される。
したがって、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）から本質的になり、それにおいてＣＤＲ１は配列番号１６であり、ＣＤＲ２は配列番号１８であり、及びＣＤＲ３は配列番号２３である。
好ましい態様では、本発明は多特異性ポリペプチドに関し、ここでＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、本明細書に記載する通りであり、及びここでＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶは、配列番号７～１０からなる群より、或いは配列番号７～１０の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらに９９%超の配列同一性を有するＩＳＶより選択される。
単一特異性ポリペプチドについて詳しく記載されたように、本発明の多特異性ポリペプチド中に存在する免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例、ＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例、ＶＨ配列）からなりうる；それらは、従来の四本鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列、又は重鎖抗体から由来する重鎖可変ドメイン配列からなりうる。好ましい態様では、それらは、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用のために適切なアミノ酸）、ナノボディ（ＶＨＨを含むが、これに限定しない）、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨ、又は親和性により得られたＶＨＨ配列からなる。免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的又は完全にヒト化されたナノボディ或いは部分的又は完全にヒト化されたＶＨＨからなりうる。免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び構築物へのいわゆる「既存の抗体」の結合を防止又は低下させる際に効果的である（本明細書に記載するような）変異を含みうる。本発明の好ましい態様では、本発明の多特異性ポリペプチドに包含される免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書で定義するように、本発明の１つ以上の単一特異性ポリペプチドである。
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１からなる群より選択されてもよい（表Ａ－７参照）。さらなる態様では、ポリペプチドは、配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１からなる群より、或いは配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１のうちの１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、もしくはさらに９９%超又はさらにそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドより選択される。
本発明の多特異性ポリペプチドは、本明細書中にさらに記載するように、「本発明のポリペプチド」又は「本発明の構築物」を形成するための１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位を含みうる。例えば、そのような結合単位は、ポリペプチドの半減期（本明細書では「半減期延長」及び「半減期延長構築物」とも呼ぶ）を増加させるアミノ酸配列でありうる。本発明の特定の、しかし、非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチドは、ＣＤ１２３に対する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及びＴＣＲに対する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインの他、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。したがって、本発明は、増加した半減期を伴うポリペプチドを提供する前記結合単位が、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインである、本明細書に記載する構築物に関する。さらに別の態様では、本発明は、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶが単一ドメイン抗体、ｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、又はラクダ化ＶＨから本質的になる、本明細書に記載する構築物に関する。
好ましい態様では、血清アルブミンに結合するＩＳＶは、配列番号４３又は３５１～３６２からなる群より選択される。
好ましい態様では、ＩＳＶは各々に直接連結されているか、又はリンカーを介して互いに連結されている。
本発明の好ましい構築物は、配列番号６３～６７からなる構築物、或いは配列番号６３～６７の１つと８０%超、８５%超、９０%超、９５%超、又はさらには９９%超の配列同一性を有する構築物の群より選択されてもよい。
好ましい態様では、構築物は配列番号６３～６７からなる群より選択される。
それらの投与時、本発明の半減期が延長した構築物は、腎クリアランスにより瞬時に除去されることはないであろう。そのため、半減期の延長は好ましいＰＫプロファイルに寄与するであろう。したがって、連続的な静脈内注入についての必要性はなく、そのため、患者の服薬遵守が改善されるであろう。特定の態様では、本発明の構築物は連続注入を要求しない。
また、単一特異性ポリペプチドについて広範に記載されているように、本発明の多特異性ポリペプチド又は本発明の構築物は、いわゆる「既存の抗体」の本発明のポリペプチド及び構築物への結合を防止又は低下させる際に効果的である変異をさらに含みうる。この目的のために、本発明のポリペプチド及び構築物は、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（式中、ｎは１～１０、好ましくは１～５、例えば１、２、３、４、又は５など（及び好ましくは１又は２、例えば１など）を含みうる；及び各々のＸは、本明細書に記載するように、非依存的に選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）からなる群より非依存的に選択される。
したがって、本発明は、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎをさらに含む本発明のポリペプチド又は構築物に関し、式中、ｎは１～５、例えば１、２、３、４、又は５などであり、それにおいてＸは天然に存在するアミノ酸であり、好ましくはシステインではない。
より具体的には、本発明はポリペプチド又は構築物に関し、ここで前記ポリペプチド又は構築物は配列番号３３８～３４２からなる群より選択される。
本発明の多価又は多特異性ポリペプチドを調製するための方法は、少なくとも２つ以上の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド及び／又は単一特異性ポリペプチド、並びに例えば１つ以上のリンカーを適切な様式において一緒に連結する工程を含みうる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチド（及びリンカー）は、当技術分野において公知の及び本明細書においてさらに記載する通りの任意の方法により共役させることができる。好ましい技術は、多価又は多特異性ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製するための、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチド（及びリンカー）をコードする核酸配列の連結を含む。アミノ酸又は核酸を連結するための技術は当業者に明らかであろうが、再び、上に言及する標準的なハンドブック（例えばSambrookら及びAusubelらなど）並びに下の実施例を参照のこと。
したがって、本発明はまた、本発明の多価ポリペプチド又は多特異性ポリペプチドを調製する際での、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異的ポリペプチドの使用に関する。多価又は多特異性ポリペプチドの調製のための方法は、場合により、１つ以上のリンカーを介して、本発明の１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを、本発明の少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチドに連結することを含む。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチドを次に、２つ（例、二価ポリペプチド中で）、３つ（例、三価ポリペプチド中で）、又はそれ以上（例、多価ポリペプチド中で）の結合単位を含む多価又は多特異性ポリペプチドを提供及び／又は調製する際に結合ドメイン又は結合単位として使用する。この点において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチドは、例えば２つ、３つ又はそれ以上の結合単位を含む多価又は多特異性、例えば二重特異性又は三重特異性ポリペプチドなどを提供及び／又は調製する際に結合ドメイン又は結合単位として使用しうる。
したがって、本発明はまた、多価又は多特異性ポリペプチドを調製する際での、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又は特に一価もしくは単一特異性ポリペプチド（本明細書に記載する通り）の使用に関する。多価又は多特異性ポリペプチドの調製のための方法は、場合により１つ以上のリンカーを介して（本明細書にさらに記載する通り）、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチドの、本発明の少なくとも１つのさらなる免疫グロブリン単一可変ドメイン、一価ポリペプチド、及び／又は単一特異性ポリペプチドへの連結を含む。
本発明の構築物
本発明の単一特異性ポリペプチド及び本発明の多特異性ポリペプチドは、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位（これらの一価ポリペプチド並びに多価ポリペプチド（追加の基、残基、部分、又は結合単位を伴う又は伴わない）は全て「本発明の構築物」と呼ぶ）をさらに含んでもよく、又は含まなくてもよい。存在する場合、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、さらなる機能性を、免疫グロブリン単一可変ドメインに（及び／又は、それが存在するポリペプチドに）提供しうる、又は提供しないであろう、免疫グロブリン単一可変ドメインの特性を改変しうる、又は改変しないであろう。
例えば、そのようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、１つ以上の追加のアミノ酸配列でありうるが、ポリペプチドは、（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドであるようにする。好ましいが、しかし、非限定的な態様では、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は免疫グロブリンである。さらにより好ましくは、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適切であるアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適切であるアミノ酸、又はナノボディ（例えば、例、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、又はラクダ化ＶＨなど）からなる群より選択される免疫グロブリン単一可変ドメインである。
上に記載するように、追加の結合単位、例えば異なる抗原特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインなどを連結して多特異性構築物を形成することができる。２つ以上の特異性の免疫グロブリン単一可変ドメインを組み合わせることにより、二重特異性、三重特異性などの構築物を形成することができる。例えば、本発明に従ったポリペプチドは、本発明の単一特異性又は多特異性ポリペプチド及び別の標的（即ち、ＣＤ１２３又はＴＣＲとは異なる）に対する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。そのような構築物及びその改変は、当業者が容易に想到することができ、本明細書で使用する用語「本発明の構築物」により全て包含する。
上に記載する構築物において、１つ、２つ、又はそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つ以上の基、残基、部分、又は結合単位を、互いに直接及び／又は１つ以上の適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結してもよい。例えば、１つ以上の基、残基、部分、又は結合単位がアミノ酸配列である場合、リンカーはまた、アミノ酸配列でありうるが、結果として得られる構築物が融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）であるようにする。
１つ以上のさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、任意の適切な及び／又は所望のアミノ酸配列でありうる。さらなるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドの（生物学的な）特性を変化させうる、もしくは変化させないであろう、変えうる、もしくは変えないであろう、又は、そうでなければ影響しうる、もしくは影響しないであろう、及びさらなる機能性を本発明のポリペプチドに加えうる、もしくは加えないであろう。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、それが１つ以上の所望の特性又は機能性を本発明のポリペプチドに付与するようにする。
そのようなアミノ酸配列の例は当業者に明らかであろうが、一般的には、従来の抗体及びそれらのフラグメント（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含むが、それらに限定しない）に基づくペプチド融合体において使用される全てのアミノ酸配列を含みうる。例えば、Holliger及びHudson（2005, Nature Biotechnology 23: 1126-1136）による総説を参照のこと。
例えば、そのようなアミノ酸配列は、半減期、溶解性、もしくは吸収を増加させ、免疫原性もしくは毒性を低下させ、望ましくない副作用を除去又は減弱させ、本発明の構築物に他の有利な特性を付与する、及び／又はその非所望の特性を低下させる（本発明のポリペプチド自体と比較し）アミノ酸配列でありうる。そのようなアミノ酸配列の一部の非限定的な例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えば、ＷＯ００／２７４３５を参照のこと）又はハプテン分子（例えば、循環抗体により認識されるハプテン、例えば、ＷＯ ９８／２２１４１を参照のこと）などである。
本発明の１つの特定の、しかし、非限定的な態様では、それは本明細書にさらに記載するであろうが、本発明の構築物は、それらが由来している免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドと比較し、血清中での増加した半減期を有する（本明細書にさらに記載する通り）。例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、半減期を延長する１つ以上の基又は部分（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に（化学的又は他の方法で）連結してもよく、増加した半減期を伴う本発明のポリペプチドの誘導体を提供する。
本発明の１つの特定の態様では、対応する本発明のポリペプチドと比較し、増加した半減期を有する構築物を調製する。そのような半減期延長部分を含む本発明の構築物の例は、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインが１つ以上の血清タンパク質（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適切なフラグメントなど）に適切に連結されている構築物、或いは１つ以上の結合単位（例えば、例、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために適切なアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用のために適切なアミノ酸、ナノボディ、ＶＨＨ、血清タンパク質（例えば血清アルブミンなど（例えばヒト血清アルブミンなど））に結合することができるヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨ、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）、トランスフェリン、又はＷＯ０４／００３０１９に列挙されている他の血清タンパク質の１つ；免疫グロブリン単一可変ドメインがＦｃ部分（例えばヒトＦｃなど）又はその適切な部分もしくはフラグメントに連結されているポリペプチド；或いは１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清タンパク質（例えば、限定しないが、ＷＯ ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、又はＷＯ０２／０７６４８９に記載されているタンパク質及びペプチドなど）に結合することができる１つ以上の小型タンパク質又はペプチドに適切に結合している構築物を含むが、これらに限定しない。また、ＷＯ０３／００２６０９及びＷＯ０４／００３０１９において記載されているｄＡｂに、並びに、Harmsenら（2005, Vaccine 23:4926-4942）；ＥＰ ０３６８６８４、並びにＷＯ０８／０２８９７７、ＷＯ０８／０４３８２１、ＷＯ０８／０４３８２２、ＷＯ０８／０６８２８０、ＷＯ０９／１２７６９１、及びＷＯ １１／０９５５４５（Ablynx N.V.による）を参照のこと。
本発明の特定の、しかし、非限定的な態様に従い、本発明の構築物は、ＣＤ１２３対する１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び／又はＴＣＲに対する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインの他、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含みうる。したがって、本発明は、増加した半減期を伴う構築物を提供する前記結合単位が、血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインである、本明細書に記載する構築物に関する。さらに別の態様では、本発明は、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶが、単一ドメイン抗体、ｄＡｂ、ナノボディ、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、又はラクダ化ＶＨから本質的になる、本明細書に記載する構築物に関する。
血清アルブミンに結合するＩＳＶは、当技術分野において記載されているような任意のＩＳＶでありうる。
一態様では、ヒト血清アルブミンに結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、上で引用したAblynx N.V.による出願において一般的に記載されている通りでありうる（例えば、ＷＯ０４／０６２５５１を参照のこと）。増加した半減期を提供し、本発明の構築物において使用することができる一部の好ましいナノボディは、ＷＯ０６／１２２７８７に開示されているナノボディＡＬＢ－１～ＡＬＢ－１０（表ＩＩ及びＩＩＩを参照のこと）、並びにＷＯ ２０１２／１７５４００又はＷＯ ２０１５／１７３３２５に開示されているナノボディ（例、ＷＯ ２０１２／１７５４００の配列番号１～１１、ＷＯ ２０１５／１７３３２５の配列番号１９）、及びＵＳ ６２／２５６，８４１、ＵＳ ６２／３３５，７４６、ＵＳ ６２／３４９，２９４、及び「改良血清アルブミン結合剤」と題された譲受人による対応する国際出願ＷＯ ２０１７／０８５１７２（これら３つの米国仮特許出願の優先権を主張する）からのナノボディを含む。
一態様では、本発明は、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶが本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなる、本明細書に記載するポリペプチドに関し、それにおいてＣＤＲ１はＧＦＴＦＳＳＦＧＭＳ（配列番号３６３）又はＧＦＴＦＲＳＦＧＭＳ（配列番号３６４）であり、ＣＤＲ２はＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬ（配列番号３６５）であり、及びＣＤＲ３はＧＧＳＬＳＲ（配列番号３６６）である。
増加した半減期を提供し、本発明の構築物において使用することができる一部の特に好ましいナノボディは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）－Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２－Ａ、Ａｌｂ８２－ＡＡ、Ａｌｂ８２－ＡＡＡ、Ａｌｂ８２－Ｇ、Ａｌｂ８２－ＧＧ、Ａｌｂ８２－ＧＧＧとも呼ばれる免疫グロブリン単一可変ドメインを含む（表Ｂ－２）。
したがって、本発明は、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶが、配列番号４３又は３５１～３６２からなる群より選択される、本明細書に記載する構築物に関する。
Figure 0007222888000003
一般的に、増加した半減期を伴う本発明のポリペプチドは、好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドそれ自体の半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍など、例えば、少なくとも１０倍又は２０倍超より大きな半減期を有する。
一般的に、増加した半減期を伴う本発明の構築物は、好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドそれ自体の半減期と比較し、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらに２４、４８、もしくは７２時間超だけ増加した半減期を有する。
別の好ましいが、しかし、非限定的な態様では、本発明のそのような構築物は、ヒトにおいて少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明の構築物は、少なくとも５日（例えば約５～１０日など）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９～１４日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０～１５日など）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１～１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２～１８日以上など）、又は１４日超（例えば約１４～１９日など）の半減期を有しうる。
本発明において、構築物中でのアルブミン標的化結合単位それ自体の含有は、得られた効力又は有効性に本質的な影響を有さないことが実証された。ＨＳＡの存在において有効性／効力の小さな喪失が観察されたが、半減期延長ＴＣＲ結合多特異性ポリペプチドは依然としてＣＤ１２３発現細胞の死滅において強力であった。アルブミンベースの薬物送達は、主に増強した透過性及び保持効果を介した腫瘍に対するその受動的な標的並びにエネルギー及びアミノ酸の供給源としての腫瘍細胞によるアルブミンについての増加した需要により、改善された癌治療を達成するために有用であることが実証されている。
特定の一態様に従い、本発明の１つ以上のポリペプチドは、１つ以上の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として／を形成するために使用することができる２つ又は３つの定常ドメイン）に、Ｆｃ部分に、並びに／或いは、本発明のポリペプチドに１つ以上のエフェクター機能を付与する、及び／又は１つ以上のＦｃ受容体に結合する能力を付与しうる１つ以上の抗体部分、フラグメント、又はドメインに（場合により適切なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結されうる。例えば、この目的のために、それに限定しないが、１つ以上のさらなるアミノ酸配列は、抗体の１つ以上のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン（例えば重鎖抗体（本明細書中に記載）から及びより好ましくは従来のヒト４鎖抗体から）を含んでもよく；並びに／或いは、例えばＩｇＧからの（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からの）、ＩｇＥからの、又は別のヒトＩｇ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＭなどからのＦｃ領域（の一部）を形成しうる。例えば、ＷＯ ９４／０４６７８にはラクダＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（即ち、ナノボディ）を含む重鎖抗体が記載されており、それにおいてラクダ科ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインをヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインにより置換しており、ナノボディ並びにヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインを各々含む（しかし、ＣＨ１ドメインは含まない）２つの重鎖からなる免疫グロブリンを提供し、その免疫グロブリンはＣＨ２及びＣＨ３ドメインにより提供されるエフェクター機能を有し、及びその免疫グロブリンは任意の軽鎖の存在を伴わず機能することができる。エフェクター機能を提供するために本発明のポリペプチドに適切に連結され得る他のアミノ酸配列は、当業者に明らかであり、所望のエフェクター機能に基づいて選択されうる。例えば、ＷＯ０４／０５８８２０、ＷＯ ９９／４２０７７、ＷＯ０２／０５６９１０、及びＷＯ０５／０１７１４８、並びにHolliger及びHudson（上記）による総説；及びＷＯ０９／０６８６２８を参照のこと。本発明のポリペプチドのＦｃ部分への共役はまた、本発明の対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期に導きうる。一部の適用のために、任意の生物学的に有意なエフェクター機能を伴わずに増加した半減期を付与するＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（即ち、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン）の使用もまた適切である、又はさらには好ましいであろう。本発明の１つ以上のポリペプチド及びインビボで増加した半減期を伴う１つ以上の定常ドメインを含む他の適切な構築物は当業者に明らかであり、例えばＣＨ３ドメインに、場合によりリンカー配列を介して連結されたポリペプチドを含みうる。一般的に、増加した半減期を伴う任意の融合タンパク質又は誘導体は、好ましくは、腎吸収についてのカットオフ値である５０kDa超の分子量を有する。
別の具体的であるが非限定的な態様では、本発明のポリペプチドは、（即ち、従来の４鎖抗体中に天然に存在する定常ドメインと比較し）二量体に自己会合する傾向が低下した（又は本質的にない）天然に存在する、合成又は半合成定常ドメイン（又は類似体、変異体、変異体、それらの部分もしくはフラグメント）に連結されうる。そのような単量体（即ち、自己会合性ではない）Ｆｃ鎖変異体、又はそのフラグメントは当業者に明らかであろう。例えば、Helmら（J. Biol. Chem. 271: 7494, 1996）には、本発明のポリペプチド鎖において使用することができる単量体Ｆｃ鎖変異体が記載されている。
また、そのような単量体Ｆｃ鎖変異体は、好ましくは、それらが（それらが由来するＦｃ部分に依存して）補体又は関連するＦｃ受容体に依然として結合することが可能であるようにする、及び／又は、それらは、それらが由来するＦｃ部分のエフェクター機能の一部又は全部を（又は意図された使用のために依然として適切である低下レベルで）依然として有するようにする。あるいは、本発明のそのようなポリペプチド鎖において、単量体Ｆｃ鎖は、ポリペプチド鎖に増加した半減期を付与するために使用してもよく、その場合において、単量体Ｆｃ鎖はまた、エフェクター機能を全く又は実質的に有さない。
さらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させうる、もしくは変化させないであろう、変えうる、もしくは変えないであろう、又は、そうでなければ、影響しうる、もしくは影響しないであろう、及び、さらなる機能性を本発明のポリペプチドに加えうる、もしくは加えないであろう。例えば、そのようなアミノ酸残基は：
ａ） Ｎ末端Ｍｅｔ残基を、例えば、異種宿主細胞又は宿主生物における発現の結果として含むことができ；
ｂ） 合成時に宿主細胞からのポリペプチドの分泌に向けるシグナル配列又はリーダー配列を形成しうる（例えば、本発明のポリペプチドのプレ、プロ、又はプレプロ形態を、本発明のポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存して提供する）。適切な分泌リーダーペプチドは当業者に明らかであろうし、本明細書においてさらに記載する通りでありうる。通常、そのようなリーダー配列は、ポリペプチドのＮ末端に連結されるであろうが、本発明は、その最も広い意味において、それに限定されず；
ｃ） ポリペプチドの精製を可能にする又は促進する「タグ」、例えば、アミノ酸配列又は残基を、例えば、前記配列又は残基に対して向けられた親和性技術を使用して形成してもよい。その後、前記配列又は残基を除去し（例、化学的又は酵素的切断により）、ポリペプチドを提供しうる（この目的のために、タグは、場合により、切断可能なリンカー配列を介して、アミノ酸配列もしくはポリペプチド配列に連結してもよく、又は切断可能なモチーフを含んでもよい）。そのような残基の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びｍｙｃタグ、例えばＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号３６７）などであり；
ｄ） 官能化されていた及び／又は官能基の付着のための部位として役立つことができる１つ以上のアミノ酸残基でありうる。適切なアミノ酸残基及び官能基は当業者に明らかであろうが、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書において言及するアミノ酸残基及び官能基を含むが、しかし、限定しない。
本発明の構築物において、２つ以上の構成要素、ＩＳＶ又はナノボディ及び場合により１つ以上のポリペプチド、１つ以上の他の基、薬物、薬剤、残基、部分、又は結合単位を互いに直接連結してもよく（例えば、ＷＯ ９９／２３２２１に記載されている）、並びに／或いは１つ以上の適切なスペーサーもしくはリンカー、又はそれらの任意の組み合わせを介して互いに連結してもよい。
本発明の構築物における使用のための適切なスペーサー又はリンカーは当業者に明らかであり、一般的にアミノ酸配列及び／又は他の基、薬物、薬剤、残基、部分、もしくは結合単位を連結するために当技術分野において使用される任意のリンカー又はスペーサーでありうる。好ましくは、前記リンカー又はスペーサーは、医薬的使用について意図したポリペプチド及び／又は構築物を構築する際での使用のために適切である。
一部の特に好ましいスペーサーは、抗体フラグメント又は抗体ドメインを連結するために当技術分野において使用されるスペーサー及びリンカーを含む。これらは、上で引用した一般的な背景技術において言及したリンカー、並びに例えばダイアボディ又はＳｃＦｖフラグメントを構築するために当技術分野において使用されるリンカーを含む（この点に関して、しかし、ダイアボディ及びＳｃＦｖフラグメントにおいて、使用されるリンカー配列は、関連するＶＨ及びＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することが可能になる長さ、柔軟性の程度、及び他の特性を有するべきであるのに対し、各々の免疫グロブリン単一可変ドメインはそれ自体で完全な抗原結合部位を形成するため、本発明のポリペプチドにおいて使用されるリンカーの長さ又は柔軟性に特別な制限はない。
例えば、リンカーは適切なアミノ酸配列、特に１～５０の間、好ましくは１～３０の間、例えば１～１０の間などのアミノ酸残基のアミノ酸配列でありうる。そのようなアミノ酸配列の一部の好ましい例は、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー、型（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ、例えば（例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３）（ＷＯ ９９／４２０７７において記載されている通り）、並びに本明細書において言及するAblynxによる出願（例えばＷＯ０６／０４０１５３及びＷＯ０６／１２２８２５を参照のこと）において記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９、及びＧＳ７７リンカー、並びにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域又は同様の配列など（例えばＷＯ ９４／０４６７８に記載されている通り）を含む。
一部の他の特に好ましいリンカーが表Ｂ－３に記載されており、そのうち３５ＧＳ（配列番号３３４）が特に好ましい。
したがって、本発明は、ＩＳＶが、配列番号３２５～３３６からなる群より選択されるリンカーを介して互いに連結されているポリペプチドに関する。
Figure 0007222888000004
他の適切なリンカーは、一般的に、有機化合物又はポリマー、特に医薬的使用のためのタンパク質における使用について適切なものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインを連結するために使用されてきた（例えば、ＷＯ０４／０８１０２６を参照のこと）。
使用されるリンカーの長さ、柔軟性の程度、及び／又は他の特性（ＳｃＦｖフラグメントにおいて使用されるリンカーに関して通常そうであるように重要ではないが）は、ＣＤ１２３及び／又はＴＣＲについての、或いは１つ以上の他の抗原についての親和性、特異性、又は結合力を含むが、これらに限定しない、本発明の最終ポリペプチドの性質に何らかの影響を及ぼしうることが本発明の範囲内に包含される。本明細書中の開示に基づき、当業者は、場合により一部の限られたルーチン実験後、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
例えば、第１及び第２の標的に対して向けられた構成要素、ＩＳＶ、又はナノボディを含む本発明の多価又は多特異性ポリペプチドにおいて、リンカーの長さ及び柔軟性によって、好ましくは、ポリペプチド中に存在する本発明の各々の構成要素、ＩＳＶ、又はナノボディが、その同族の標的（例、各々の標的上の抗原決定基）に結合することが可能になる。再び、本明細書の開示に基づき、当業者は、場合により一部の限られたルーチン実験後に、本発明の特定のポリペプチドにおける使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
使用されるリンカーが、本発明のポリペプチド又は構築物に１つ以上の他の好ましい特性又は機能性を付与すること、並びに／或いは誘導体の形成のため及び／又は 官能基の結合のために（例、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書中に記載する通り）１つ以上の部位を提供することも本発明の範囲内である。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含むリンカーが、改善された親水性を提供することができるのに対し、小さなエピトープ又はタグを形成する又は含むリンカーは、検出、同定、及び／又は精製の目的のために使用することができる。再び、本明細書中の開示に基づき、当業者は、場合により一部の限られたルーチン実験後に、本発明の特定のポリペプチド又は構築物における使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
最後に、２つ以上のリンカーが本発明のポリペプチド又は構築物において使用される場合、これらのリンカーは同一でも異なっていてもよい。再び、本明細書中の開示に基づき、当業者は、場合により一部の限られたルーチン実験後に、本発明の特定のポリペプチド又は構築物における使用のための最適なリンカーを決定することができるであろう。
通常、発現及び製造の容易さのために、本発明のポリペプチド又は構築物は直鎖状ポリペプチドであろう。しかし、本発明はその最も広い意味において、それに限定しない。例えば、本発明のポリペプチドが３つ以上のアミノ酸配列、ＩＳＶ、又はナノボディを含む場合、３つ以上の「アーム」を伴うリンカーの使用によりそれらを連結することが可能であり、それらの各々の「アーム」はアミノ酸配列、ＩＳＶ、又はナノボディに連結されて「星型」構築物を提供する。通常あまり好ましくはないが、環状構築物を使用することも可能である。
したがって、本発明は、前記第１のＩＳＶ及び前記第２のＩＳＶ、並びに、恐らくは前記第３のＩＳＶ及び／又は前記ＩＳＶ結合血清アルブミンが互いに直接連結されている又はリンカーを介して連結されている、本明細書に記載するポリペプチドに関する。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを含み、及びタグ又は他の機能的部分（例、毒素、標識、放射性化学物質など）をさらに含む構築物も本発明に包含する。
あるいは、追加の基、残基、部分、又は結合単位は、例えば、化学的な基、残基、部分でありうるが、それらはそれ自体が、生物学的に及び／又は薬理学的に活性でありうる又は活性ではないであろう。例えば、限定しないが、そのような基は、本発明の２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン又は一価ポリペプチドに連結してもよく、本発明のポリペプチドの「誘導体」を提供する。
したがって、本発明は、その最も広い意味においてまた、本発明のポリペプチドの誘導体を含む。そのような誘導体は、一般的に、本発明のポリペプチドの、並びに／或いは本発明のポリペプチドを形成するアミノ酸残基の１つ以上の修飾により、特に化学的及び／又は生物学的（例、酵素的）修飾により得ることができる。
そのような修飾の例、並びにそのような様式で（即ち、タンパク質骨格上、しかし、好ましくは、側鎖上のいずれかで）修飾することができるポリペプチド配列内のアミノ酸残基の例、そのような修飾を導入するために使用することができる方法及び技術、並びにそのような修飾の潜在的な使用及び利点が、当業者に明らかであろう（Zangi et al. 2013, Nat. biotechnol. 31: 898-907も参照のこと）。
例えば、そのような修飾は、１つ以上の官能基、残基、又は部分の、本発明のポリペプチド中への又は上への、並びに、特に１つ以上の所望の特性又は機能性を付与する１つ以上の官能基、残基、又は部分の、本発明のポリペプチドへの導入（例、共有結合的連結による又は他の適切な様式において）を含みうる。そのような官能基の例は当業者に明らかであろう。
例えば、そのような修飾は、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性、及び／又は吸収を増加させる、本発明のポリペプチドの免疫原性及び／又は毒性を低下させる、本発明のポリペプチドの任意の望ましくない副作用を除去又は減弱させる、並びに／或いは本発明のポリペプチドに他の有利な特性を付与する及び／又はその非所望の特性を低下させる１つ以上の官能基；あるいは先行するものの任意の組み合わせの導入（例、共有結合による又は任意の他の適切な様式において）を含みうる。そのような官能基の及びそれらを導入するための技術の例は、当業者に明らかであろうが、一般的に、本明細書において上に引用する一般的な背景技術において言及する全ての官能基及び技術、並びに医薬的タンパク質の修飾のための、及び特に抗体又は抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）の修飾のための、それ自体が公知の官能基及び技術を含みうるが、それらについては、例えばRemington（1980, Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980）を参照のこと。そのような官能基は、例えば、本発明のポリペプチドに、又は、場合により、適切なリンカーもしくはスペーサーを介して、直接的に（例えば、共有結合的に）連結してもよく、再び、当業者に明かであろう通りである。
１つの特定の例は、本発明のポリペプチドがその半減期を増加させるために（例えば、ペグ化によって）化学的に修飾されている本発明の誘導体ポリペプチドである。これは、医薬的タンパク質の半減期を増加させる及び／又は免疫原性を低下させるための最も広く使用される技術の１つであり、適切な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧなど）などの付着を含む。一般的に、ペグ化の任意の適切な形態を使用することができる（例えば、抗体及び抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含むが、限定しない）のための当技術分野において使用されるペグ化など）；例えば、Chapman（2002, Nat. Biotechnol. 54: 531-545)、Veronese and Harris(2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456）、Harris及びChess（2003, Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221）、及びＷＯ０４／０６０９６５を参照のこと。タンパク質のペグ化のための種々の試薬も商業的に（例えば、Nektar Therapeutics、米国から）利用可能である。
好ましくは、部位特異的ペグ化を特にシステイン残基を介して使用する（例えば、Yangら（2003, Protein Engineering 16: 761-770)を参照のこと）。例えば、この目的のために、ＰＥＧを、本発明のポリペプチドにおいて天然に存在するシステイン残基に付着してもよく、本発明のポリペプチドを修飾し、ＰＥＧの付着のために１つ以上のシステイン残基を適切に導入してもよく、又は、ＰＥＧの付着のために１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端に融合してもよく、全てで、当業者にそれ自体が公知のタンパク質操作の技術を使用する。
好ましくは、本発明のポリペプチドについて、５０００超、例えば１０，０００超及び２００，０００未満など、例えば１００，０００未満など；例えば２０，０００～８０，０００の範囲中の分子量を伴うＰＥＧを使用する。
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、通常は翻訳時及び／又は翻訳後修飾の部分として、本発明のポリペプチドを発現するために使用される宿主細胞に依存してＮ連結又はＯ連結グリコシル化を含む。
さらに別の修飾は、本発明の標識ポリペプチドの意図する使用に依存して、１つ以上の検出可能な標識又は他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含みうる。それらを付着し、使用し、及び検出するための適切な標識及び技術は当業者に明らかであり、例えば、蛍光標識（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒドなど、並びにフルオレスカミン及び蛍光金属、例えば１５２Ｅｕ又は他のランタニド系列からの金属）、燐光標識、化学発光標識又は生物発光標識（例えばルミナール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタン、又はＧＦＰ及びその類似体）、放射性同位元素（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅなど）、金属、金属キレート、又は金属カチオン（例えば、金属カチオン、例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａ、又はインビボ、インビトロ、もしくはインサイチュ診断及び画像化における使用のために特に適切な他の金属又は金属カチオン（例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅ）など）、並びに発色団及び酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ－Ｖ－ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ‐グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース－ＶＩ－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）を含むが、これらに限定しない。他の適切な標識が当業者に明らかであろうが、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲスペクトロスコピーを使用して検出することができる部分を含む。
本発明のそのような標識ポリペプチドは、例えば、特定標識の選択に依存して、インビトロ、インビボ、又はインサイチュアッセイ（それ自体が公知のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、及び他の「サンドイッチアッセイ」などを含む）並びにインビボ診断及び撮像目的のために使用してもよい。当業者に明かであろう通り、別の修飾は、キレート基の導入を含みうるが、例えば、上に言及する金属又は金属カチオンの１つをキレート化する。適切なキレート基は、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むが、これらに限定しない。
さらに別の修飾は、特定の結合対、例えばビオチン（ストレプト）アビジン結合対などの１つの部分である官能基の導入を含みうる。そのような官能基を使用し、本発明のポリペプチドを別のタンパク質、ポリペプチド、又は化学的化合物（結合対の他の半分に、即ち、結合対の形成を通じて結合されている）に連結してもよい。例えば、本発明のポリペプチドをビオチンに共役し、別のタンパク質、ポリペプチド、化合物、又は担体（アビジン又はストレプトアビジンに共役されている）に連結してもよい。例えば、本発明のそのような共役ポリペプチドを、レポーターとして、例えば診断システムにおいて使用してもよく、そこでは検出可能なシグナル産生薬剤がアビジン又はストレプトアビジンに共役されている。そのような結合対を、例えば、また使用し、本発明のポリペプチドを担体（医薬的な目的のために適切な担体を含む）に結合してもよい。１つの非限定的な例は、Cao及びSuresh（2000, Journal of Drug Targeting 8: 257）により記載されているリポソーム製剤である。そのような結合対も使用し、治療的に活性な薬剤を本発明のポリペプチドに連結してもよい。
他の潜在的な化学的及び酵素的修飾が当業者に明らかであろう。そのような修飾はまた、研究目的のために（例、機能－活性関係を試験するために）導入されうる。例えばLundblad及びBradshaw（1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151）を参照のこと。
好ましくは、誘導体は、それらが、本明細書に定義する通り（即ち、本発明のポリペプチドについて定義する通り）の親和性（本明細書にさらに記載する通り、ＫＤ値（実際の又は見かけ上の値）、ＫＡ値（実際の又は見かけ上の値）、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として適切に測定及び／又は表現される）を伴いＣＤ１２３及び／又はＴＣＲに結合する。
本発明のそのようなポリペプチド及びその誘導体はまた、本質的に単離された形態（本明細書に定義する通り）でありうる。
本発明はさらに、本明細書において記載するポリペプチド、核酸、宿主細胞、及び組成物を調製するための方法に関する。
本発明のポリペプチド及び構築物は、それ自体が公知の様式において調製することができ、本明細書におけるさらなる記載から当業者に明らかであろう通りである。例えば、本発明のポリペプチド及び構築物は、抗体の調製のために及び特に抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定しない）の調製のために、それ自体が公知の任意の様式において調製することができる。ポリペプチド、構築物、及び核酸を調製するための一部の好ましいが、しかし、非限定的な方法は、本明細書に記載する方法及び技術を含む。
本発明のポリペプチド又は構築物（すなわち、それは、それをコードする核酸の発現により得ることができる）を産生するための方法は、以下の工程を含みうる：
－ 適切な宿主細胞もしくは宿主生物（また、本明細書において「本発明の宿主」と呼ぶ）において又は別の適切な発現系において本発明の前記ポリペプチド又は構築物をコードする核酸（また、本明細書において「本発明の核酸」と呼ぶ）を発現させること、場合により、以下が続く：
－ このようにして得られた本発明のポリペプチド又は構築物を単離及び／又は精製すること。
特に、そのような方法は以下の工程を含みうる：
－ 本発明の前記宿主が、少なくとも１つの本発明のポリペプチド又は構築物を発現及び／又は産生するような条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持すること（すなわち、それは、それをコードする核酸の発現により得ることができる）；場合により、以下が続く：
－ このようにして得られた本発明のポリペプチド又は構築物を単離及び／又は精製すること。
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチド又は構築物をコードする（すなわち、それは、それをコードする核酸の発現により得ることができる）核酸又はヌクレオチド配列に関する（「本発明の核酸」とも呼ぶ）。本発明の核酸は、一本又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形態でありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、意図する宿主細胞又は宿主生物における発現のために特に適応されたコドン使用を伴うＤＮＡなど）でありうる。
本発明の一態様に従い、本発明の核酸は、本明細書で定義する通り、本質的に単離形態である。本発明の核酸はまた、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、又はＹＡＣなど）の形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、それは再び、本質的に単離形態でありうる。
本発明の核酸は、本明細書において与える本発明のポリペプチド又は構築物に関する情報に基づき、それ自体が公知の様式において調製する又は得ることができ（すなわち、それらは、それをコードする核酸の発現により得ることができる）、並びに／あるいは適切な天然の供給源から単離することができる。また、当業者に明らかであろう通り、本発明の核酸を調製するために、また、いくつかのヌクレオチド配列、例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列及び例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸を、適切な様式において一緒に連結することができる。
本発明の核酸を生成するための技術は当業者に明らかであろうが、例えば、自動ＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つ以上の天然に発生する及び／又は合成配列（あるいはそれらの２つ以上の部分）を組み合わせること、切断発現産物の発現に導く変異の導入；１つ以上の制限部位の導入（例、適切な制限酵素を使用して簡単に消化及び／又は連結されうるカセット及び／又は領域を作製すること）、及び／又は、１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応を用いた変異の導入を含むが、これらに限定しない。これらの及び他の技術は当業者に明らかであろうが、再び、上に言及する、標準的なハンドブック（例えば Sambrookら及びAusubelらなど）、並びに下の実施例を参照のこと。
本発明の核酸はまた、遺伝子構築物の形態でありうる、その中に存在しうる、及び／又はその部分でありうるが、当業者に明らかであろう通りである。そのような遺伝子構築物は、一般的に、場合により、それ自体が公知の遺伝子構築物の１つ以上のエレメント、例えば、１つ以上の適切な調節エレメント（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び本明細書において言及する遺伝子構築物のさらなるエレメントなどに連結された本発明の少なくとも１つの核酸を含む。本発明の少なくとも１つの核酸を含むそのような遺伝子構築物はまた、本明細書において「本発明の遺伝子構築物」と呼ぶ。
本発明の遺伝子構築物はＤＮＡ又はＲＮＡでありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、意図する宿主細胞又は宿主生物の形質転換のための適切な形態で、意図する宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への組込みのための適切な形態で、あるいは意図する宿主生物における非依存的な複製、維持、及び／又は遺伝のための適切な形態でありうる。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンなどの形態でありうる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、発現をインビトロ及び／又はインビボで（例、適切な宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）提供することができるベクターでありうる。
好ましいが、しかし、非限定的な態様では、本発明の遺伝子構築物は以下を含む
ａ） 本発明の少なくとも１つの核酸；動作可能に以下に接続する
ｂ） １つ以上の調節エレメント、例えばプロモーター及び、場合により、適切なターミネーターなど；及び、場合により、また、
ｃ） それ自体が公知の遺伝子構築物の１つ以上のさらなるエレメント；
それにおいて、用語「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「動作可能に接続された」は、当技術分野においてそれらの通常の意味を有する（本明細書においてさらに記載する通り）；及び、それにおいて、遺伝子構築物中に存在する前記の「さらなるエレメント」は、例えば、３’又は５’ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換もしくは組込み（の効率）を促進もしくは増加しうるエレメントでありうる。そのような遺伝子構築物のためのこれらの及び他の適切なエレメントは当業者に明らかであろうが、例えば、使用する構築物の型；意図する宿主細胞又は宿主生物；目的の本発明のヌクレオチド配列を発現させる様式（例、構成的、一過性、又は誘導的発現を介する）；及び／又は使用すべき形質転換技術に依存しうる。例えば、抗体及び抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定しない）の発現及び産生のためのそれ自体が公知の調節配列、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に類似の様式において使用してもよい。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、本発明の前記の少なくとも１つの核酸及び前記の調節エレメント、及び場合により、前記の１つ以上のさらなるエレメントを互いに「動作可能に連結」し、それにより一般的に、それらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、前記プロモーターが、コード配列の転写及び／又は発現を開始する、あるいはそうでなければ制御／調節することができる場合、コード配列に「動作可能に連結されている」と考えられる（それにおいて前記コード配列は、前記プロモーター「の制御下」にあるとして理解すべきである）。一般的に、２つのヌクレオチド配列を動作可能に連結する場合、それらは同じ方向にありうる、及び通常はまた、同じリーディングフレームにありうる。それらは通常はまた、本質的に連続的であるが、これも要求されないであろう。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節エレメント及びさらなるエレメントは、それらが、意図する宿主細胞又は宿主生物においてそれらの意図する生物学的機能を提供することが可能であるようにする。
例えば、プロモーター、エンハンサー、又はターミネーターは、意図する宿主細胞又は宿主生物において「動作可能」であるべきであり、それにより（例えば）前記プロモーターが、動作可能に連結されている（本明細書に定義する通り）ヌクレオチド配列（例、コード配列）の転写及び／又は発現を開始する又はそうでなければ制御／調節することが可能であるべきであることを意味する。
一部の特に好ましいプロモーターは、本明細書において言及する宿主細胞における発現のためのそれ自体が公知のプロモーター；並びに特に細菌又は酵母細胞における発現のためのプロモーター、例えば本明細書において言及するプロモーター及び／又は実施例において使用するプロモーターなどを含むが、これらに限定しない。
選択マーカーは、それが、即ち、適当な選択条件下で、本発明のヌクレオチド配列を用いて（成功裏に）形質転換された宿主細胞及び／又は宿主生物を、（成功裏に）形質転換されていない宿主細胞／生物から区別することを可能にするようにすべきである。そのようなマーカーの一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、抗生物質（例えばカナマイシン又はアンピシリンなど）に対する耐性を提供する遺伝子、温度耐性を提供する遺伝子、又は非形質転換細胞もしくは生物の生存のために必須の、培地中の特定の因子、化合物、及び／又は（食品）成分の非存在において宿主細胞もしくは宿主生物を維持させる遺伝子である。
リーダー配列は、意図する宿主細胞又は宿主生物において、それが、所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又はそれが転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分もしくは細胞小器官に向かわせるようにすべきである。リーダー配列はまた、前記細胞からの発現産物の分泌も可能にしうる。そのため、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物において動作可能な任意のプロ、プレ、又はプレプロ配列でありうる。リーダー配列は、細菌細胞における発現のために要求されないこともある。例えば、抗体及び抗体フラグメント（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定しない）の発現及び産生のためのそれ自体が公知のリーダー配列を、本質的に類似の様式において使用してもよい。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、宿主細胞又は宿主生物において、それが遺伝子構築物（それに存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現の検出を可能にするようにすべきである。発現マーカーはまた、例えば、細胞の特定の部分もしくは細胞小器官及び／又は多細胞生物の特定の細胞、組織、器官、もしくは部分における発現産物の局在化を場合により可能にしうる。そのようなレポーター遺伝子はまた、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、又は構築物を伴うタンパク質融合体として発現されうる。一部の好ましいが非限定的な例は、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰなど）を含む。
適切なプロモーター、ターミネーター、及びさらなるエレメントの一部の好ましいが、非限定的な例は、本明細書に記載する宿主細胞における発現のために使用することができるもの；並びに特に細菌細胞又は酵母細胞における発現のために適切なもの、例えば本明細書に記載するもの及び／又は以下の実施例において使用するものなどを含む。プロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及び本発明の遺伝子構築物中に存在する／それにおいて使用されうるさらなるエレメント（例えばターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、並びに／或いは組込み因子など）の（さらなる）非限定的な例については、一般的なハンドブック、例えば上に言及するSambrookら、及びAusubelら、並びに ＷＯ ９５／０７４６３、ＷＯ ９６／２３８１０、ＷＯ ９５／０７４６３、ＷＯ ９５／２１１９１、ＷＯ ９７／１１０９４、ＷＯ ９７／４２３２０、ＷＯ ９８／０６７３７、ＷＯ ９８／２１３５５、ＵＳ ７，２０７，４１０、ＵＳ ５，６９３，４９２、及びＥＰ １０８５０８９において与えられる実施例を参照のこと。他の例は当業者に明らかであろう。上で引用した一般的な背景技術及び本明細書で引用するさらなる参考文献も参照のこと。
本発明の遺伝子構築物は、一般的に、例えば、上に言及する一般的なハンドブック、例えばSambrookら、及びAusubelらなどに記載されている技術を使用し、本発明のヌクレオチド配列を上に記載する１つ以上のさらなるエレメントに適切に連結することにより提供されうる。
しばしば、本発明の遺伝子構築物は、それ自体が公知の適切な（発現）ベクターにおいて本発明のヌクレオチド配列を挿入することにより得られるだろう。適切な発現ベクターの一部の好ましいが、非限定的な例は、以下の実施例において使用するもの、並びに本明細書で言及するものである。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物を使用し、宿主細胞又は宿主生物を、即ち、本発明のポリペプチド又は構築物の発現及び／又は産生のために（すなわち、それは、それをコードする核酸の発現により得ることができる）形質転換してもよい。適切な宿主又は宿主細胞が当業者に明らかでありうるが、例えば、任意の適切な真菌、原核又は真核細胞又は細胞株、あるいは任意の適切な真菌、原核又は（非ヒト）真核生物でありうるが、例えば：
－ 細菌株、グラム陰性株、例えば大腸菌の；プロテウスの、例えば、プロテウス・ミラビリスの；シュードモナスの、例えばシュードモナス・フルオレッセンスの株など；及びグラム陽性株、例えばバチルス、例えば、バチルス・サブチリス又はバチルス・ブレビスの；ストレプトマイセスの、例えば、ストレプトマイセス・リビダンスの；スタフィロコッカスの、例えば、スタフィロコッカス・カルノサスの；及びラクトコッカスの、例えば、ラクトコッカス・ラクティスの株などを含むが、これらに限定しない；
－ 真菌細胞、トリコデルマの種からの、例えば、トリコデルマ・リーゼイからの；ニューロスポラの、例えば、ニューロスポラ・クラッサからの；ソルダリアの、例えば、ソルダリア・マクロスポラからの；アスペルギルスの、例えば、アスペルギルス・ニガーからの又はアスペルギルス・ソーヤからの；又は他の糸状菌からの細胞を含むが、これらに限定しない；
－ 酵母細胞、サッカロマイセス、例えば、サッカロマイセス・セレビシエの；シゾサッカロマイセスの、例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベの；ピキアの、例えば、ピキア・パストリスの又はピキア・メタノリカの；ハンゼヌラの、例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファの；クルイベロマイセスの、例えば、クルイベロマイセス・ラクティスの；アークスラの、例えば、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）の；ヤロウィアの、例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の種からの細胞を含むが、これらに限定しない；
－ 両生類細胞又は細胞株、例えばアフリカツメガエル卵母細胞など；
－ 昆虫由来の細胞又は細胞株、例えば鱗翅目から由来する細胞／細胞株（スポドプテラＳｆ９及びＳｆ２１細胞を含むが、これらに限定しない）など、又はショウジョウバエから由来する細胞／細胞株、例えばシュナイダー及びＫｃ細胞など；
－ 植物又は植物細胞、例えば、タバコ植物中；及び／又は
－ 哺乳動物細胞又は細胞株、例えば、ヒトから由来する細胞又は細胞株、哺乳動物からの細胞又は細胞株（ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＢＨＫ－２１細胞） を含むが、これらに限定しない）及びヒト細胞又は細胞株、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞など；
並びに、抗体及び抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖフラグメントを含むが、これらに限定しない）の発現及び産生のための、それ自体が公知の全ての他の宿主又は宿主細胞、それらは、当業者に明らかであろう。また、本明細書において上で引用する一般的な背景技術に、並びに、例えば、ＷＯ ９４／２９４５７；ＷＯ ９６／３４１０３；ＷＯ ９９／４２０７７；Frenkenら（1998, Res Immunol. 149: 589-599）；Riechmann and Muyldermans (1999)（上記）；van der Linden（2000, J. Biotechnol. 80: 261-270）；Joostenら（2003, Microb. Cell Fact. 2: 1）；Joosten et al. 2005（Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-392）を参照のこと。
本発明のポリペプチド又は構築物は、いわゆる「イントラボディ」として表現してもよく、例えば、ＷＯ ９４／０２６１０、ＷＯ ９５／２２６１８、及びＵＳ ７，００４，９４０；ＷＯ０３／０１４９６０において；Cattaneo及びBiocca（1997, Intracellular Antibodies: Development and Applications” Landes and Springer-Verlag）において；及びKontermann（2004, Methods 34: 163-170）において記載される通りである。
本発明のポリペプチド又は構築物は、例えば、また、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中で、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ、又は羊の乳汁中で（例えば、哺乳動物中にトランスジーンを導入するための一般的な技術についてのＵＳ ６，７４１，９５７、ＵＳ ６，３０４，４８９、及びＵＳ ６，８４９，９９２を参照のこと）、植物又は植物の部分中で（それらの葉、花、果実、種子、根、又は塊茎を含むが、これらに限定しない）（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファにおいて）、あるいは、例えば、カイコＢｏｍｂｉｘ ｍｏｒｉの蛹中で産生することもできる。
さらに、本発明のポリペプチド又は構築物はまた、無細胞発現系において発現及び／又は産生することができ、そのような系の適切な例は当業者に明かであろう。一部の好ましいが、しかし、非限定的な例は、小麦胚芽系における；ウサギ網状赤血球ライセートにおける；又は大腸菌Ｚｕｂａｙ系における発現を含む。
好ましくは、本発明において、本発明のポリペプチド又は構築物を医薬的使用のために適切な形態において提供する（インビボ又はインビトロ）発現系（例えば細菌発現系など）を使用し、そのような発現系は再び当業者に明かであろう。また、当業者に明かであろう通り、医薬的使用のために適切な本発明のポリペプチド又は構築物は、ペプチド合成のための技術を使用して調製することができる。
工業規模での産生のために、免疫グロブリン単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド治療薬の（工業）産生のための好ましい異種宿主は、大規模発現／産生／発酵のために、及び特に大規模な医薬的な発現／産生／発酵のために適切である大腸菌、ピキア・パストリス、Ｓセレビシエの株を含む。そのような株の適切な例は当業者に明らかであろう。そのような株及び産生／発現系はまた、企業、例えばBiovitrum（スウェーデン、ウプサラ）などにより利用可能になる。
あるいは、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模な発現／産生／発酵のために、及び特に大規模な医薬的な発現／産生／発酵のために使用することができる。再び、そのような発現／産生系がまた、上に言及する企業の一部により利用可能になる。
特定の発現系の選択は、部分的には、特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化についての要求に依存しうる。グリコシル化が望ましい又は要求される免疫グロブリン単一可変ドメインを含む組換えタンパク質の産生は、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物の発現宿主の使用を必要としうる。この点において、得られたグリコシル化パターン（即ち、付着した残基の種類、数、及び位置）が、発現のために使用される細胞又は細胞株に依存しうることが当業者に明らかであろう。好ましくは、ヒト細胞又は細胞株のいずれかを使用し（即ち、ヒトのグリコシル化パターンを本質的に有するタンパク質に導く）、或いは別の哺乳動物細胞を使用し、それはヒトのグリコシル化と本質的及び／又は機能的に同じである、或いは少なくともヒトのグリコシル化を模倣するグリコシル化パターンを提供することができる。一般的に、原核生物の宿主（例えば大腸菌など）は、タンパク質をグリコシル化する能力を有さず、より低い真核生物（例えば酵母など）の使用は、通常、ヒトのグリコシル化とは異なるグリコシル化パターンに導く。それにもかかわらず、全ての先行する宿主細胞及び発現系を本発明において、得るべき所望のポリペプチド又は構築物に依存して使用することができることを理解すべきである。
このように、本発明の１つの非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物をグリコシル化する。本発明の別の非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物は非グリコシル化である。
本発明の１つの好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物は、細菌細胞中で、特に大規模な医薬品産生のために適切な細菌細胞（例えば上に言及する株の細胞など）中で産生される。
本発明の別の好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物は、酵母細胞中で、特に大規模な医薬品産生のために適切な酵母細胞（例えば上に言及する種の細胞など）中で産生される。
本発明のさらに別の好ましいが、しかし、非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物は、哺乳動物細胞中で、特にヒト細胞中で又はヒト細胞株の細胞中で、さらに特にヒト細胞中で又は大規模な医薬品産生のために適切なヒト細胞株（例えば本明細書において上に言及する細胞株など）の細胞中で産生される。
宿主細胞中での発現を使用して本発明のポリペプチド又は構築物を産生する場合、本発明のポリペプチド又は構築物は細胞内（例、細胞質ゾル中、ペリプラズム中、又は封入体中）で産生し、次に宿主細胞から単離し、場合によりさらに精製することができる；或いは、細胞外で（例、宿主細胞が培養されている培地中で）産生し、次に培養培地から単離し、場合によりさらに精製することができる。真核生物宿主細胞を使用する場合、細胞外産生が通常好ましい。なぜなら、これによって、得られたポリペプチド又は構築物のさらなる単離及び下流プロセシングがかなり促進されるからである。細菌細胞、例えば上に言及する大腸菌の株などは、数クラスのタンパク質（例えば毒素及び溶血素など）を除き、通常、細胞外にタンパク質を分泌せず、大腸菌における分泌産生は、内膜を横切るペリプラズム間隙へのタンパク質の転位を指す。ペリプラズム産生は、細胞質ゾル産生を上回るいくつかの利点を提供する。例えば、分泌産物のＮ末端アミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一でありうる。また、細胞質中よりペリプラズム中でずっと少ないプロテアーゼ活性があると考えられる。また、ペリプラズム中の混入タンパク質は少ないため、タンパク質精製がより簡単になる。別の利点は、ペリプラズムが細胞質よりも酸化的な環境を提供するため、正しいジスルフィド結合が形成されうることである。大腸菌において過剰発現されるタンパク質は、不溶性凝集体、いわゆる封入体中でしばしば見られる。これらの封入体は、サイトゾル中又はペリプラズム中に位置しうる；これらの封入体からの生物学的に活性なタンパク質の回収は、変性／リフォールディングプロセスを要求する。多くの組換えタンパク質（治療用タンパク質を含む）が封入体から回収される。あるいは、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のポリペプチド又は構築物を分泌するように遺伝的に改変されている細菌の組換え株を使用することができる。
このように、本発明の１つの非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物は、細胞内で産生された、及び宿主細胞から、特に細菌細胞から、又は細菌細胞中の封入体から単離されたポリペプチド又は構築物である。本発明の別の非限定的な態様に従い、本発明のポリペプチド又は構築物は、細胞外で産生された、及び宿主細胞を培養した培地から単離されたポリペプチド又は構築物である。
これらの宿主細胞との使用のための一部の好ましい、しかし、非限定的なプロモーターは以下を含む：
－ 大腸菌での発現用：ｌａｃプロモーター（及びその誘導体、例えばｌａｃＵＶ５プロモーターなど）；アラビノースプロモーター；ファージラムダの左方向（ＰＬ）及び右方向（ＰＲ）プロモーター；ｔｒｐオペロンのプロモーター；ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）；Ｔ７プロモーター（より具体的にはＴ７ファージ遺伝子１０のもの）及び他のＴファージプロモーター；Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター；外来調節オペレーター配列の１つ以上のコピーを含む上のプロモーターの操作変異体；
－ Ｓセレビシエでの発現用：構成：ＡＤＨ１（アルコールデヒドロゲナーゼ１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームｃイソ１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）；調節：ＧＡＬ１、１０、７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコールデヒドロゲナーゼ２）、ＰＨ０５（酸性ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）；異種：ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）；
－ ピキア・パストリスでの発現用：ＡＯＸ１プロモーター（アルコールオキシダーゼＩ）；
－ 哺乳動物細胞での発現用：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター；プロモーターがＴｅｔリプレッサーにより調節され得るように２つのテトラサイクリンオペレーター配列を含むヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーター変異体；単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＲＳＶ ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター；ヒト、チンパンジー、マウス、又はラットからの伸長因子１α（ｈＥＦ－１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ－１末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーター。
これらの宿主細胞との使用のための一部の好ましいが、しかし、非限定的なベクターに以下を含む：
－ 哺乳動物細胞での発現用ベクター：pMＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、pMＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ－ｐＳＶ２－ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ－１（８－２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ－ＭＭＴｎｅｏ（３４２－１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）、及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）、並びにウイルスベースの発現系、例えばアデノウイルスに基づくものなど；
－ 細菌細胞中での発現用ベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）；
－ 酵母又は他の真菌細胞における発現用ベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Invitrogen）；
－ 昆虫細胞内での発現用ベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
－ 植物又は植物細胞での発現用ベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルスベースのベクター、アグロバクテリウムの適切な株、又はＴｉプラスミドベースのベクター。
これらの宿主細胞との使用のための一部の好ましいが、しかし、非限定的な分泌配列は以下を含む：
－ 細菌細胞（例えば大腸菌など）での使用のため：ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢなど；ＴＡＴシグナルペプチド、溶血素Ｃ末端分泌シグナル；
－酵母での使用のため：α接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）など；
－ 哺乳動物細胞での使用のため：標的タンパク質が真核生物起源である場合の固有のシグナル；マウスＩｇκ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド；など。
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するための適切な技術が、当業者に明らかであろうが、意図する宿主細胞／宿主生物及び使用する遺伝子構築物に依存しうる。再び、上に言及するハンドブック及び特許出願を参照のこと。
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物を用いて成功裏に形質転換されているそれらの宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択するための工程を実施してもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子構築物中に存在する選択可能なマーカーに基づく選択工程又は本発明のポリペプチド又は構築物の検出を含む工程（例、特異的抗体を使用する）でありうる。
形質転換された宿主細胞（それは安定な細胞株の形態でありうる）又は宿主生物（それは安定な変異体系統又は株の形態でありうる）は、本発明のさらなる態様を形成する。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、それらが（宿主生物の場合において：その少なくとも１つの細胞、部分、組織、又は器官において）本発明のポリペプチド又は構築物を発現する、又は（例、適した条件下で）発現することが（少なくとも）可能であるようにする。本発明はまた、例えば、細胞分裂により又は有性もしくは無性生殖により得られうる、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代、及び／又は子孫を含む。
したがって、別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド又は構築物を発現する（又は適切な状況下で発現することが可能である）及び／又はそれをコードする核酸を含む宿主又は宿主細胞に関する。そのような宿主又は宿主細胞の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、一般的に、ＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６５、又はＷＯ０９／０６８６２７において記載されうる。例えば、本発明のポリペプチド又は構築物は、有利には酵母株（例えばピキア・パストリスの株など）において発現、産生、又は製造してもよい。ＷＯ０４／２５５９１、ＷＯ １０／１２５１８７、ＷＯ １１／００３６２２、及びＷＯ １２／０５６０００も参照のこと。これらには、ピキア及び他の宿主／宿主細胞における免疫グロブリン単一可変ドメイン及びそれを含むポリペプチドの発現／産生が記載されている。
本発明のポリペプチド又は構築物の発現を産生する／得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物を、一般的に、本発明の（所望の）ポリペプチド又は構築物を発現／産生するような条件下で保ち、維持し、及び／又は培養してもよい。適切な条件は当業者に明らかであろうが、通常、使用する宿主細胞／宿主生物に、並びに本発明の（関連）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに依存しうる。再び、本発明の遺伝子構築物に関するパラグラフにおいて上に言及するハンドブック及び特許出願を参照のこと。
一般的に、適切な条件は、適切な培地の使用、食物の適切な供給源及び／又は適切な栄養物の存在、適切な温度の使用、並びに、場合により、適切な誘導因子又は化合物の存在（例、本発明のヌクレオチド配列が誘導可能なプロモーターの制御下にある場合）を含みうるが；それらの全てが当業者により選択されうる。再び、そのような条件下で、本発明のポリペプチド又は構築物を、構成的な様式において、一過性の様式において、又は適切に誘導された場合だけ発現されうる。
また、本発明のポリペプチド又は構築物を、（最初に）未成熟形態（上に言及する通り）において生成してもよく、それを次に、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、翻訳後修飾に供してもよいことが当業者に明らかであろう。また、本発明のポリペプチド又は構築物を、再び、使用する宿主細胞／宿主生物に依存して、グリコシル化してもよい。
本発明のポリペプチド又は構築物を次に、宿主細胞／宿主生物から及び／又は前記宿主細胞又は宿主生物を培養した培地から、それ自体が公知のタンパク質単離及び／又は精製技術、例えば（調製的）クロマトグラフィー及び／又は電気泳動技術、沈殿差技術、親和性技術（例、本発明のポリペプチド又は構築物と融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用して）、及び／又は調製的な免疫学的技術（即ち、単離すべきポリペプチド又は構築物に対する抗体を使用して）を使用して単離してもよい。
本発明の組成物
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのポリペプチドもしくは構築物、及び／又は本発明の少なくとも１つの核酸、及び場合によりそれ自体が公知のそのような組成物の１つ以上のさらなる成分（即ち、組成物の意図する使用に依存する）を含む又は含む産物又は組成物に関する。
一般的に、医薬的使用のために、本発明のポリペプチド又は構築物は、本発明の少なくとも１つのポリペプチド又は構築物及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤及び／又はアジュバント、並びに、場合により、１つ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含む、医薬的調製物又は組成物として製剤化されうる。非限定的な例を用いて、そのような製剤は、経口投与のために、非経口投与のために（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内又は髄腔内投与）、局所投与のために、吸入による、皮膚パッチによる、インプラントによる、座剤などによる投与のために適切な形態でありうるが、ここで非経口投与が好ましい。そのような適切な投与形態（それは、投与の様式に依存して、固形、半固形、又は液体でありうる）並びに方法及びその調製物中での使用のための担体が、当業者に明らかであろうが、本明細書においてさらに記載うる。そのような医薬的調製物又は組成物は、一般的に、本明細書において「医薬的組成物」と呼ぶ。非ヒト生物における使用のための組成物の医薬的調製物は、一般的に、本明細書において「獣医用組成物」と呼ぶ。そのような組成物の一部の好ましいが、しかし、非限定的な例が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
このように、さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチド又は構築物及び少なくとも１つの適切な担体、希釈剤又は賦形剤（即ち、医薬的使用のために適切な）、及び場合により１つ以上のさらなる活性物質を含む医薬的組成物に関する。特定の態様では、本発明は、配列番号１～１０、４７、４９、５２、５３、５５、５６、５８～６１、６３～６７、及び３３８～３４２のいずれかより選択される本発明のポリペプチド又は構築物 、及び少なくとも１つの適切な担体、希釈剤、又は賦形剤（即ち、医薬的使用のために適切である）、及び場合により１つ以上のさらなる活性物質を含む医薬的組成物に関する。
語句「医薬的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は合理的な利益／リスク比と釣り合った他の問題もしくは合併症を伴わず、ヒト及び動物の組織と接触した使用のために適切であるそれらの化合物、材料、組成物、及び／又は投与形態を指すために本明細書において用いる。
本明細書で使用する語句「医薬的に許容可能な担体」は、１つの器官又は身体の部分から別の器官、又は身体の部分への被験化合物の運搬又は輸送に関与する医薬的に許容可能な材料、組成物、又は賦形剤、例えば液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、又は溶媒封入材料などを意味する。各々の担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。
一般的に、本発明のポリペプチド及び構築物は、それ自体が公知の任意の適した様式において製剤化及び投与することができる。例えば、上で引用する一般的な背景技術（並びに特にＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６７、及びＷＯ０８／０２００７９に）並びに標準的なハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams and Wilkins (2005)；又はHandbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、ページ２５２～２５５を参照のこと）などを参照のこと。
本発明のポリペプチド又は構築物は、従来の抗体及び抗体フラグメント（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）並びに他の医薬的に活性なタンパク質のためのそれ自体が公知の任意の様式において製剤化及び投与されうる。それを調製するためのそのような製剤及び方法は、当業者に明らかであろうが、例えば、非経口投与（例、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内、又はくも膜下腔内投与）のために適切な調製物を含む。
非経口投与のための調製物は、例えば、注入又は注射のために適切である滅菌溶液、懸濁剤、分散剤、又は乳剤でありうる。そのような調製物のための適切な担体又は希釈剤は、例えば、ＷＯ０８／０２００７９のページ１４３に言及されるものを含むが、それらに限定しない。通常、水性溶液又は懸濁液が好ましいであろう。
本発明のポリペプチド又は構築物はまた、注入又は注射により静脈内又は腹腔内に投与してもよい。本発明のポリペプチド又は構築物の溶液は水中で調製することができ、場合により無毒性界面活性剤と混合することができる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中並びに油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含む。
非経口投与のための適切な医薬的組成物は、１つ以上の医薬的に許容可能な無菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳濁液、又は使用直前に無菌注射用溶液もしくは分散液に再構成されうる無菌粉末（糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含みうる）、又は懸濁剤もしくは増粘剤との組み合わせにおける、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチド、又は構築物を含む。
医薬的組成物において用いてもよい適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及び同様のものなど）、及びそれらの適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油など）、及び注射用有機エステル（例えばオレイン酸エチルなど）を含む。適当な流動性は、例えば、コーティング材料（例えばレシチンなど）の使用により、分散剤の場合においては要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。
これらの組成物はまた、アジュバント（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤など）を含んでもよい。被験化合物に対する微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、及び同様のものなど）の包含により確実になりうる。また、等張剤（例えば糖、塩化ナトリウム、及び同様のものなど）を組成物中に含むことが望ましいであろう。また、注射用の医薬的形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど）の包含によりもたらしうる。
一部の場合において、薬物の効果を長期化させるために、皮下注射又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、不良な水溶性を有する結晶又は非結晶材料の液体懸濁液の使用により達成しうる。薬物の吸収速度は次にその溶解速度に依存し、それは次に、結晶サイズ及び結晶形態に依存しうる。あるいは、非経口投与された薬物形態の吸収遅延は、薬物を油賦形剤中に溶解又は懸濁させることにより達成する。
注射用デポー形態を、生分解性ポリマー（例えばポリラクチド－ポリグリコリドなど）中で被験化合物のミクロカプセル化マトリックスを形成することにより作製する。薬物とポリマーの比率及び用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を含む。デポー注射用製剤はまた、身体組織と適合性があるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を捕捉することにより調製する。
注射又は注入用に適切な医薬剤形は、場合によりリポソーム中にカプセル化された、無菌注射用又は注入用溶液もしくは分散液の即時調製用に適合された活性成分を含む無菌水溶液もしくは分散剤又は無菌粉末を含むことができる。全ての場合において、最終的な剤形は、製造及び保存の条件下で無菌、液体、及び安定でなければならない。
無菌注射用溶液は、上に列挙する他の成分のいくつかを伴う適当な溶媒中に、要求される量で活性ポリペプチドを取り込ませることにより調製し、必要に応じて、ろ過滅菌が続く。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分に加えて、以前に無菌ろ過した溶液中に存在する任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
処置における使用のために要求される本発明のポリペプチド又は構築物の量は、選択された特定のポリペプチド又は構築物だけでなく、投与の経路、処置されている状態の性質、並びに患者の年齢及び状態にも伴い変動しうるが、究極的には担当医又は臨床医の判断によるであろう。また、本発明のポリペプチド又は構築物の投与量も変動するであろう。
所望の用量は、便利には、単一用量中で又は適当な間隔で投与される分割用量として（例えば、２、３、４又はそれ以上のサブ用量／日として）提示しうる。サブ用量自体はさらに、例えば多数の別々の緩く間隔を置いた投与中に分割してもよい。
投与レジメンは長期間の毎日の処置を含みうる。「長期間」により、少なくとも２週間及び好ましくは、いくつかの週、月、又は年の期間を意味する。この投与量の範囲における必要な改変が、当業者により、本明細書において与えられた教示のルーチン実験だけを使用して決定されうる。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと。投与量はまた、任意の合併症の事象において個々の医師により調整されることができる。
別の態様では、本発明のポリペプチドもしくは構築物、本発明の核酸、本発明の発現ベクター、又は本発明の宿主もしくは宿主細胞を含むキットを提供する。キットはまた、ポリペプチド又は構築物及び使用説明書を含む１つ以上のバイアルを含みうる。キットはまた、本発明のポリペプチド又は構築物を投与するための手段（例えば注射器、注入器又は同様のものなど）を含みうる。
本発明のポリペプチド、構築物、又は組成物の使用
本発明はさらに、本明細書に記載するポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞、及び組成物の適用及び使用、並びにＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防及び／又は治療方法に関する。一部の好ましいが、しかし、非限定的な適用及び使用が、本明細書におけるさらなる記載から明らかになるであろう。
本発明のポリペプチド、構築物、及び組成物は、一般的に、ＣＤ１２３発現細胞（の部位）でＴ細胞を活性化するために使用することができ、ＣＤ１２３発現細胞を溶解する。本発明のポリペプチド及び構築物による、Ｔ細胞上のＴＣＲ及び腫瘍細胞上のＣＤ１２３への同時結合は、細胞の活性化及びそれに続くＣＤ１２３発現細胞の溶解（死滅）を誘導する。ＣＤ１２３発現細胞に結合していない場合、本発明のポリペプチド及び構築物はＴ細胞活性化をほとんど示さない。そのため、本発明のポリペプチド及び構築物による標的非依存的溶解（即ち、ＣＤ１２３発現を伴わない細胞の溶解）は最小である。
したがって、一態様では、本発明のポリペプチド、構築物、及び組成物は、例えば、本明細書に記載するアッセイのうちの１つ（例えば、実施例のセクションに記載するリダイレクトヒトＴ細胞媒介性死滅フローサイトメトリーベースのアッセイなど）を使用し、それ自体が公知の任意の適切な様式において測定し、同じ条件下であるが本発明のポリペプチド又は構築物の存在を伴わないＣＤ１２３発現細胞の数と比較し、少なくとも１０%、好ましくは少なくとも１５%、例えば少なくとも１６%、１７%、１８%、１９%、もしくは２０%以上、例えば３０%以上などの平均溶解パーセンテージを伴いＣＤ１２３発現細胞の溶解を起こす。
これとは別に、又は同時に、本発明のポリペプチド、構築物、及び組成物によるＣＤ１２３陰性細胞のＴ細胞活性化誘導性溶解は、例えば、本明細書に記載するアッセイのうちの１つ（例えば、実施例のセクションに記載するリダイレクトヒトＴ細胞媒介性死滅フローサイトメトリーベースのアッセイなど）を使用し、それ自体が公知の任意の適切な様式において測定し、同じ条件下であるが本発明のポリペプチド又は構築物の存在を伴わないＣＤ１２３陰性細胞の数の約１０%以下、例えば９%以下など、例えば８、７、もしくは６%又はさらにそれ以下などである。
ＣＤ１２３発現細胞のこの死滅は、そのようなＣＤ１２３発現細胞の存在が豊富である及び／又は望ましくない疾患又は状態において有利でありうる。
したがって、一態様では、本発明は、医薬としての使用のためのポリペプチド、構築物、及び組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物又はそれを含む組成物を提供する。
さらに特に、本発明は、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物又はそれを含む組成物を提供し、ここでＣＤ１２３関連疾患又は増殖性疾患又は炎症状態である。
本発明はまた、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解のための方法であって、前記方法は、それを必要とする被験者に医薬的に活性な量の本発明のポリペプチドもしくは構築物及び／又はそれを含む組成物を投与することを含む。
特に、本発明は、ＣＤ１２３関連疾患又は状態が増殖性疾患又は炎症状態である、上に記載する方法に関する。
炎症状態は、ＣＤ１２３発現細胞の死滅により予防、処置、及び／又は寛解される任意の炎症状態でありうる。
一態様では、炎症状態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択される。
したがって、本発明は、炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のためのポリペプチド、構築物、又は組成物に関し、ここで、前記炎症状態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択される。
したがって、本発明はまた、炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解のための方法に関し、ここで前記炎症状態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択され、前記方法は、それを必要とする被験者に、医薬的に活性な量の少なくとも１つの本発明のポリペプチドもしくは構築物又は本発明の組成物を投与することを含む。
増殖性疾患は、ＣＤ１２３発現細胞の死滅により予防、処置、及び／又は寛解される任意の増殖性疾患でありうる。
一態様では、前記増殖性疾患は癌である。ＣＤ１２３過剰発現に関連する癌の例は、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば、（限定しないが）以下の癌を含む：リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫。
したがって、本発明は、癌の予防、処置、及び／又は寛解における使用のためのポリペプチド、構築物、及び組成物に関し、ここで前記癌は、リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。
したがって、本発明は、癌の予防、処置、及び／又は寛解のための方法に関し、ここで前記癌は、リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫からなる群より選択され、前記方法は、それを必要とする被験者に、医薬的に活性な量の少なくとも１つの本発明のポリペプチドもしくは構築物又は本発明の組成物を投与することを含む。
本発明はまた、医薬の製造のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物又は本発明の組成物の使用に関する。
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物又はそれを含む組成物の使用に関する。
さらに特に、本発明は、ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物又はそれを含む組成物の使用に関し、ここでＣＤ１２３関連疾患又は状態は増殖性疾患又は炎症状態である。
一態様では、本発明は、炎症状態の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物、又はそれを含む組成物の使用に関し、ここで前記炎症状態は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー、喘息、及び関節リウマチからなる群より選択される。
別の態様では、本発明は、増殖性疾患の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物、又はそれを含む組成物の使用に関し、ここで前記増殖性疾患は癌である。ＣＤ１２３過剰発現に関連する癌の例は、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば（限定しないが）以下の癌を含む：リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞性白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫。
したがって、本発明はまた、癌の予防、処置、及び／又は寛解のための医薬の製造のための、本発明のポリペプチドもしくは構築物、又はそれを含む組成物の使用に関し、ここで前記癌は、リンパ腫（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性Ｂリンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む）、骨髄異形成症候群、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、全身性肥満細胞症、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。
本発明の文脈において、用語「予防、処置、及び／又は寛解」は、疾患を予防、処置、及び／又は寛解することを含むだけでなく、一般的に、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅らせる又は逆転させること、疾患に関連付けられる１つ以上の症状の発生を予防する又は遅らせること、疾患に関連付けられる１つ以上の症状を低下及び／又は軽減すること、疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度及び／又は持続時間を低下させること、並びに／或いは疾患の及び／又はそれに関連付けられる任意の症状の重症度のさらなる増加を予防すること、疾患により起こされる任意の生理学的な傷害を予防、低下、又は逆転させること、並びに、一般的に、処置されている患者に有益である任意の薬理学的な作用も含む。
本明細書において互換的に使用する通り、用語「医薬的に効果的な量」又は「医薬的に活性な量」は、ＣＤ１２３発現細胞の存在においてＴ細胞を活性化するために十分な量を指す。ＣＤ１２３関連疾患の文脈において、それは、ＣＤ１２３関連疾患の予防、処置、及び／又は寛解において治療的な利益を提供する、単独での、又は他の療法との組み合わせにおけるポリペプチド、構築物、又は医薬的組成物の量を指す。本発明の多特異性ポリペプチド又は構築物の量に関連して使用される場合、この用語は、治療全体を改善する、望ましくない効果を低下もしくは回避する、又は別の治療の治療効果もしくは相乗効果を増強する量を包含しうる。
本明細書で使用する通り、用語「治療」は、ＣＤ１２３関連疾患（例、炎症状態又は増殖性疾患）の処置、予防、及び／又は管理において使用することができる任意のプロトコル、方法、及び／又は薬剤を指す。特定の実施形態では、用語「治療（therapies）」及び「治療（therapy）」は、ＣＤ１２３関連疾患（例、炎症状態又は増殖性疾患）、或いは当業者（例えば医療従事者など）に公知のその１つ以上の症状の処置、予防、及び／又は管理において有用な生物学的治療、支持治療、及び／又は他の治療を指す。
別の態様では、本発明は、免疫療法のため、特に受動免疫療法のための方法に関し、その方法は、ＣＤ１２３関連疾患に苦しむ又はそのリスクがある被験者に、本発明のポリペプチドもしくは構築物、又はそれを含む医薬的組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
処置すべき被験者は、任意の温血動物でありうるが、しかし、特に哺乳動物、さらに特にヒトである。当業者に明らかであろう通り、処置される被験者は、特に本明細書において言及する疾患及び状態に苦しむ、又はそのリスクがある人であろう。
一般的に、本発明に従ったポリペプチドもしくは構築物及び／又はそれを含む組成物は、任意の適切な様式において投与することができる。例えば（それに限定しないが）、本発明に従ったポリペプチド及びそれを含む組成物を、再び、使用される特定の医薬的製剤又は組成物に依存して、経口、非経口（例、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内、もしくは髄腔内、又は胃腸管内を回避する他の任意の投与経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所、坐剤を用いて、吸入、により投与することができる。臨床医は、そのような投与において使用される適切な投与経路及び適切な医薬的製剤又は組成物を、予防又は処置すべき疾患又は障害及び臨床医に周知である他の因子に依存して、選択されることができるであろう。
好ましい態様では、本発明のポリペプチドもしくは構築物又はそれを含む組成物は、静脈内（例、（これらに限定しないが）、注入又はボーラスにより）又は皮下に投与する。
本発明のポリペプチドもしくは構築物及び／又はそれを含む組成物は、ＣＤ１２３関連疾患を予防、処置、及び／又は寛解するために適切である処置計画に従って投与する。臨床医は、一般的に、適切な処置レジメンを、因子、例えば、処置すべき疾患の種類、疾患の段階、疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用すべき本発明の特定のポリペプチド又は構築物、使用すべき特定の投与経路及び医薬的製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、並びに臨床医に周知の同様の因子などに依存して決定することができるであろう。
一般的に、処置レジメンは、本発明の１つ以上のポリペプチド又は構築物の、或いはそれを含む１つ以上の組成物の、１つ以上の医薬的に効果的な量又は用量における投与を含みうる。投与される特定の量又は用量は、臨床医により、再び、上に引用する因子に基づき決定することができる。
一般的に、ＣＤ１２３関連疾患の予防、処置、及び／又は寛解のために、及び処置するＣＤ１２３関連疾患の種類（例、増殖性疾患（癌を含む）又は炎症状態）、処置する疾患の段階、使用する本発明のポリペプチド又は構築物の効力、並びに特定の投与経路及び使用される特定の医薬製剤又は組成物に依存して、本発明のポリペプチドは一般的に１グラムから１マイクログラム／体重kg／日の間の量で投与する。臨床医は、一般的には、適切な一日用量を、本明細書において言及する因子に依存して決定することができるであろう。また、特定の場合において、臨床医は、例えば、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき、これらの量から逸脱することを選んでもよいことが明らかであろう。一般的に、投与される量に関する一部のガイダンスを、しかし、親和性／結合力、有効性、生物分布、半減期、及び当業者に周知の同様の因子における違いを考慮に入れて、本質的に同じ経路を介して、同じ標的に対する抗体フラグメントの同等の従来の抗体について通常投与される量から得ることができる。
通常、上の方法では、本発明の単一ポリペプチド又は構築物が使用されるであろう。しかし、本発明の２つ以上のポリペプチド又は構築物を組み合わせにおいて使用することは本発明の範囲内である。
本発明のポリペプチドもしくは構築物、又はそれを含む組成物はまた、１つ以上のさらなる医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて、即ち、併用処置レジメンとして使用してもよく、それは相乗効果を導きうる又は導かないであろう。再び、臨床医は、そのようなさらなる化合物又は成分、並びに適切な組み合わせの処置レジメンを、上に引用する因子及び彼の専門家判断に基づき選択することができるであろう。
特に、本発明のポリペプチド、構築物、及び組成物を、ＣＤ１２３関連疾患（例、増殖性障害（癌を含む）又は炎症状態）の予防、処置、及び／又は寛解のために使用する、又は使用することができる他の医薬的に活性な化合物又は成分との組み合わせにおいて使用してもよく、その結果として、相乗効果が得られうる又は得られないであろう。そのような化合物及び成分、並びにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬的製剤又は組成物の例が、臨床医に明らかでありうる。
そのような化合物及び成分、並びにそれらを投与するための経路、方法、及び医薬的製剤又は組成物の例が、臨床医に明らかでありえ、以下が挙げられる：アントラサイクリン（ダウヌルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ルビダゾン）、シタラビン（ＡＭＬ）、造血成長因子、脱メチル化剤（例えばデシタビン又はアザシチジンなど）、全トランス型レチノイン酸、三酸化ヒ素、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、メルファラン、プレドニゾン、レナリドマイド、シクロホスファミド、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、フルダラビン、コルチコステロイド、ビンクリスチン、ラスブリカーゼ、Ｌ－アスパラギナーゼ、ペグ化アスパラギナーゼ、クラドリビン、ペントスタチン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン；又はそれらの任意の組み合わせ。
２つ以上の物質又は成分を併用処置レジメンの部分として使用する場合、それらは、同じ投与経路を介して、又は異なる投与経路を介して、本質的に同じ時間に又は異なる時間に（例、本質的に同時に、連続的に、又は代わりのレジメンに従って）投与することができる。物質又は成分を同じ投与経路を介して同時に投与すべき場合、それらは、異なる医薬的製剤もしくは組成物又は組み合わせた医薬的製剤もしくは組成物の部分として投与してもよく、当業者に明らかであろう通りである。
また、２つ以上の活性物質又は成分を併用処置レジメンの部分として使用する場合、物質又は成分の各々を、化合物又は成分をそれ自体で使用する場合に使用される同じ量で、同じレジメンに従って投与してもよく、そのような組み合わせ使用は、相乗効果を導きうる又は導かないであろう。しかし、２つ以上の活性物質又は成分の組み合わせ使用が相乗効果を導く場合、依然として所望の治療的作用を達成しつつ、投与される物質又は成分の１つ、それ以上、又は全ての量を低下させることも可能でありうる。これは、例えば、依然として所望の医薬的又は治療的効果を挙げつつも、物質又は成分の１つ以上の使用に関連付けられる、それらをそれらの通常の量で使用した場合における、任意の不要な副作用を回避、限定、又は低下させるために有用であろう。
本発明に従って使用される処置レジメンの有効性は、含まれる疾患又は障害についてそれ自体が公知である任意の様式で決定及び／又は追跡してもよく、臨床医に明らかであろう通りである。臨床医はまた、適当な場合、及びケースバイケースに基づき、特定の処置レジメンを変化又は改変することができ、所望の治療的効果を達成し、不要な副作用を回避、限定、又は低下させ、及び／又は、一方で所望の治療的効果を達成し、他方で不要な副作用を回避、限定、又は低下させる適当なバランスを達成するようにする。
一般的に、処置レジメンには、所望の治療的効果が達成されるまで及び／又は所望の治療的効果が維持される限り従いうる。再び、これは臨床医により決定されることができる。
本発明のポリペプチド又は構築物、核酸、遺伝子構築物並びに宿主及び宿主細胞のさらなる使用は、本明細書中の開示に基づいて当業者に明らかであろう。
本明細書に例証し、考察した態様は、本発明を作製し使用するために発明者に公知である最良の方法を当業者に教示することだけを意図している。本発明の上に記載する態様の改変及び変法は、上に記載する教示に照らして当業者により理解されるように、本発明から逸脱することなく可能である。従って、特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明は具体的に記載されたものとは別の方法で実施されてもよいことが理解される。
本発明を今回、以下の非限定的な好ましい態様、実施例、及び図面を用いてさらに記載する。
本願を通じて引用する参考文献（文献・参考文献、発行特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全ての全内容が、本明細書により、参照により、特に本明細書において上に参照する教示について明確に組み入れられる。
実施例
実施例１：ＴＣＲに関連する材料及び方法。
１．１ ＴＣＲαβ／ＣＤ３トランスフェクト細胞株
完全ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の全ての６本鎖の組換え過剰発現を伴う一過性及び安定なＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－６１）、ＨＥＫ２９３Ｈ（Life technologies、１１６３１－０１７）細胞株、Ｌｉａｎａ（ラマ臍帯細胞由来の線維芽細胞）を生成した。このために、ＴＣＲアルファ（α）及びＴＣＲベータ（β）鎖のコード配列を、ＣＭＶプロモーターの下流のｐｃＤＮＡ３．１由来ベクター中にクローニングし、２Ａ様ウイルスペプチド配列を両鎖の間に挿入してポリタンパク質の翻訳の間にリボソームスキッピングを誘導する。同じベクター中で、ＣＤ３複合体のイプシロン鎖、デルタ鎖、ガンマ鎖、及びゼータ鎖のコード配列を、追加のＣＭＶプロモーターの下流に、それぞれの鎖の間に２Ａ様ウイルスペプチド配列を使用してクローニングした。また、ヒトＣＤ３の４本鎖の組換え過剰発現を伴う安定なＨＥＫ２９３Ｈクローンを、単一遺伝子ベクターを使用して上に記載する通りに生成した。
ヒトＣＤ３及びヒトＴＣＲα／β定常ドメインについての使用配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢから由来した（ＣＤ３デルタ：Ｐ０４２３４、ＣＤ３ガンマ：Ｐ０９６９３、ＣＤ３イプシロン：Ｐ０７７６６、ＣＤ３ゼータ：Ｐ２０９６３、ＴＣＲα：Ｐ０１８４８、及びＴＣＲβ：Ｐ０１８５０；それぞれ配列番号７０～７５）。ヒトＴＣＲα／β可変ドメインについての配列は結晶構造配列から由来した（ＰＤＢコード：２ＩＡＮ、２ＸＮ９、及び３ＴＯＥ）（それぞれ配列番号３４３、７６、及び３４５を伴う２ＩＡＮ、２ＸＮ９、及び３ＴＯＥから由来するヒトＴＣＲα可変ドメイン；それぞれ配列番号３４４、７７、及び３４６を伴う２ＩＡＮ、２ＸＮ９、及び３ＴＯＥから由来するヒトＴＣＲβ可変ドメイン）。
ヒトＴ細胞受容体複合体の細胞表面発現を、機能的マウスＩｇＧ２ｂ抗ヒトＴＣＲα／β抗体、クローンＢＷ２４２／４１２（Miltenyi、１３０－０９８－２１９）及び機能的マウスＩｇＧ２ａ抗ＣＤ３ ＰＥ標識抗体、クローンＯＫＴ－３（eBioscience、１２－００３７）を使用したフローサイトメトリーにより確認した（図１）。
１．２ 可溶性組換えＴＣＲα／βタンパク質
可溶性ヒト及びカニクイザル／アカゲザルＴＣＲα／βタンパク質を自家で生成した。ヒトＴＣＲα／β定常ドメインの細胞外部分についての配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢから由来した（ＴＣＲα：Ｐ０１８４８及びＴＣＲβ：Ｐ０１８５０；それぞれ配列番号７４及び７５）。ヒトＴＣＲα／β可変ドメインは結晶構造配列から由来した（ＰＤＢコード：２ＸＮ９；α鎖及びβ鎖についてそれぞれ配列番号７６及び７７）。
カニクイザル／アカゲザルＴＣＲα／β定常ドメインの細胞外部分についての配列はそれぞれＧｅｎＢａｎｋファイルＥＨＨ６３４６３及びＡＥＡ４１８６８から由来した（配列番号３４７及び３４８）。カニクイザル／アカゲザルＴＣＲα／β可変ドメインについての配列はＡＥＡ４１８６５及びＡＥＡ４１８６６から由来した（α鎖及びβ鎖についてそれぞれ配列番号３４９及び３５０）。
ヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）又はカニクイザル／アカゲザルＴＣＲα／βの細胞外ドメインを、ジッパータンパク質コード配列（O’Shea et al. 1993 Curr. Biol. 3(10): 658-667）に融合させ、LonzaのGS Gene Expression System（商標）を使用してCHOK1SV細胞（Lonza）により産生し、その後に精製した。
ＴＣＲα／βジッパータンパク質の品質をＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて評価した。Maxisorp９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc）を、２μg/mLの可溶性組換えヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）－ジッパータンパク質又は可溶性組換えカニクイザルＴＣＲα／βジッパータンパク質を用いてコーティングした。一晩のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ＋１%カゼインを用いて室温で１時間にわたり洗浄し、ブロッキングした。次に、プレートを、機能的フラッグタグ付ナノボディ又は機能的マウスＩｇＧ抗－非ヒト霊長類／ラットＴＣＲα／β抗体、クローンＲ７３（eBioscience、１６－５９６０）のいずれかの連続希釈物を用いて室温で１時間にわたり振盪しながらインキュベートし、再び洗浄し、それぞれモノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Sigma、Ａ８５９２）、ペルオキシダーゼ共役ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Dako、Ｐ０２６０）を用いてインキュベートした。１時間後、TMB One Solution（Promega、Ｇ７４３１）を加えた。反応を２M Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させ、Tecan sunrise 4を使用して４５０nmでのＯＤを測定することにより用量依存的結合を決定した（図２）。
実施例２：ＴＣＲ／ＣＤ３を用いたラマの免疫化、重鎖だけの抗体フラグメントレパートリーのクローニング、及びファージの調製。
２．１ 免疫化
ラクダ科動物（例、ラマ及びアルパカ）においてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α及び／又はβ定常鎖に対する重鎖だけの抗体を生成することが示された。天然のＴ細胞受容体複合体はＣＤ３（ガンマ、デルタ、イプシロン、及びゼータ）鎖、ならびにＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方からなるが、ＣＤ３鎖が非存在は、ＴＣＲの定常ドメインへの接近を促進すると仮定した。特にＣＤ３鎖はＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常ドメインを側方から囲み、それへの接近を限定するためである。他の標的を用いた本発明者らの経験に反して、ＴＣＲα鎖又はβ鎖に対する免疫応答を得ることは予想されるほど単純ではなかった。
最後のアプローチにおいて、倫理委員会（ＣＲＩＡ、ＬＡ１４００５７５、ベルギー、ＥＣ２０１２＃１）の承認後、本発明者らは、Ｔ細胞複合体についてコードするＤＮＡを用いた複合免疫化プロトコールを試みた。要するに、３頭の追加のラマを、標準的なプロトコールに従い、ｐＶＡＸ１－ヒトＴＣＲ（２ＩＡＮ）／ＣＤ３（実施例１．１に記載）プラスミドベクター（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバーグ）を用いて、及びｐＶＡＸ１－ヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）／ＣＤ３（実施例１．１に記載）プラスミドベクター（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバーグ）を用いて免疫化した。２頭のラマは、追加で１回の初代ヒトＴ細胞の皮下注射を受けた。RosetSep（StemCell Technologies、１５０６１）を使用して健常ボランティアから、Buffy Coat血液（Blood bank Gent）からヒトＴ細胞を回収し、製造者の指示に従ったFicoll-Paque（商標）PLUS（GE Healthcare、１７－１４４０－０３）による濃縮が続き、液体窒素中に保存した。解凍後、細胞を洗浄し、GibcoからのＤ－ＰＢＳ中に再懸濁し、注射前に氷上に保った。
２．２ 重鎖だけの抗体フラグメントレパートリーのクローニング及びファージの調製
動物１頭当たり、血液サンプルを、１種類の免疫抗原の注射後に回収した。これらの血液サンプルから、製造者の指示（Amersham Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）に従ってFicoll-Hypaqueを使用してＰＢＭＣを調製した。各々の免疫化ラマについて、免疫化スケジュールの特定のサブセットから由来する、即ち、１種類の免疫化抗原後のサンプルから単離した全ＲＮＡをプールすることによりライブラリーを構築した。
要するに、ＰＣＲ増幅されたＶＨＨレパートリーを、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを促進にするように設計されたベクター中に特定の制限部位を介してクローニングした。ベクターはｐＵＣ１１９から由来した。ＶＨＨコード配列をもつフレームにおいて、ベクターはＣ末端３ｘＦＬＡＧ及びＨｉｓ６タグをコードする。ファージは、標準的なプロトコール（例えば、ＷＯ ０４／０４１８６５、ＷＯ ０４／０４１８６３、ＷＯ ０４／０６２５５１、ＷＯ ０５／０４４８５８、及び本明細書に引用するAblynx N.V．により提出された出願を参照のこと）に従って調製した。
実施例３：ファージディスプレイを介したＴＣＲ／ＣＤ３特異的ＶＨＨの選択。
選択されたＶＨＨの大多数が、ＴＣＲα鎖又はＴＣＲβ鎖のいずれかの可変領域に対して向けられた。従って、異なる選択及び対抗選択戦略が本発明者らにより考案されなければならなかった。
要するに、全てのラマから得られ、ファージライブラリーとしてクローニングされたＶＨＨレパートリーを、異なる選択戦略において多数の選択条件を適用して使用した。免疫化の間に使用されたのと同じ可変ドメインを伴うヒトＴＣＲ／ＣＤ３トランスフェクト細胞株を使用する選択は、可変ドメイン結合剤だけをもたらした。従って、異なる可変ＴＣＲα／βドメイン（トランスフェクト細胞（実施例１．１に記載）、可溶性タンパク質（実施例１．２に記載）、又はヒト初代Ｔ細胞（実施例２．１に記載する通りに単離）を含むツールを選択の間に使用し、定常ドメイン結合剤の同定において重要であることを証明した。選択の間での追加の変数は、抗原提示法（細胞を使用する場合は溶液中で、又はタンパク質を使用する場合はプレート上にコーティングする）、抗原濃度、使用するオルソログ（ヒト又はカニクイザル組換えＴＣＲα／βタンパク質）、及び選択ラウンド数を含んだ。全ての固相コーティング相の選択をMaxisorp ９６ウェルプレート（Nunc、ドイツ、ヴィースバーデン）中で行った。
選択を以下の通りに実施した：固相及び液相選択フォーマット用のＴＣＲα／β－ＣＤ３抗原調製物を複数の濃度で上に記載する通りに提示した。ファージライブラリーとの２時間のインキュベーション、続く徹底した洗浄後、結合したファージを、トリプシン（１ｍg/mL）を用いて１５分間にわたり溶出した。トリプシンプロテアーゼ活性は、０．８mMプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することにより直ちに中和した。対照として、抗原を伴わない選択を並行して実施した。
個々のＶＨＨクローンの分析のためにファージアウトプットを使用して大腸菌を感染させた。ペリプラズム抽出物を標準的なプロトコールに従って調製した（例えば、ＷＯ ０３／０３５６９４、ＷＯ ０４／０４１８６５、ＷＯ ０４／０４１８６３、ＷＯ ０４／０６２５５１、ならびに他の先行技術及び本明細書中に引用するAblynx N.V．により提出された出願を参照のこと）。
実施例４：スクリーニング、配列分析、及び精製。
４．１ フローサイトメトリーアッセイにおけるＴＣＲ／ＣＤ３結合ナノボディについてのスクリーニング
ヒトＴＣＲ／ＣＤ３をトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１又はＨＥＫ２９３Ｈ細胞、及び混合細胞株設定におけるそれぞれのＣＨＯ－Ｋ１又はＨＥＫ２９３Ｈ参照細胞株を使用し、ペリプラズム抽出物を細胞発現ＴＣＲ／ＣＤ３結合についてスクリーニングした。この目的のために、大量の参照細胞株を８μMのＰＫＨ２６を用いて標識し、凍結した。５×１０４個のＰＫＨ標識参照細胞を５×１０４個の標的細胞と混合し、ペリプラズム抽出物と４℃で３０分間にわたりインキュベートし、３回洗浄した。次に、細胞を１μg/mlのモノクローナル抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）と４℃で３０分間にわたりインキュベートし、再び洗浄し、５μg/mlのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）AffiniPureヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、１１５－１３５－１６４）と４℃で３０分間にわたりインキュベートした。サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（Sigmaからの１０%ＦＢＳ及びMerckからの０．０５%アジ化ナトリウムを伴う、GibcoからのＤ－ＰＢＳ）中に再懸濁し、次にBD FACSArrayを介して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、２０，０００個の細胞を取得の間にカウントした。ＰＫＨ２６－ＳＳＣ分布に基づき、ＰＫＨ標識親集団及びヒトＴＣＲ／ＣＤ３非標識標的集団を選択した。これら２つの集団について、平均ＡＰＣ値を算出した。
４．２ ヒトＴ細胞活性化アッセイにおけるＴＣＲ／ＣＤ３結合ナノボディについてのスクリーニング
いくつかの試みの後、標準的なプロトコールに従った、即ち、９６ウェルプレート上にコーティングされた抗体又はナノボディによる精製ヒトＴ細胞の活性化は十分に高感度ではないことが判明した（データは示さず）。
活性を評価するために、異なるアッセイをビーズ結合Ｔ細胞活性化に基づいて開発した。要するに、Dynabeads（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ThermoFisher Scientific、１１０３３）を、モノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）（１５μg/１Ｅ７ビーズ）を用いてコーティングした。４℃で２時間のインキュベーション期間後、Dynabeads（登録商標）を洗浄し、振盪しながら８０μlのペリプラズム抽出物と４℃で２０分間にわたりインキュベートした。ビーズ複合体を可溶性マウス抗ＣＤ２８抗体（Pelicluster CD28 - Sanquin、Ｍ１６５０）と一緒に、精製された初代ヒトＴ細胞（実施例２．１に記載する通りに単離した）に加える前に、非結合ナノボディを洗い流した。対照条件として、非刺激ヒトＴ細胞を使用した。簡単には、モノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体に結合させたDynabeads（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ThermoFisher Scientific、１１０３３）を、無関係のナノボディを含む８０μlのペリプラズム抽出物中でインキュベートした。洗浄工程の間での非結合ナノボディの除去後、無関係のナノボディ－ビーズ複合体を精製された初代ヒトＴ細胞に加えた。３７℃及び５%ＣＯ２で２４時間のインキュベーション後、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ６９ＰＥ（BD Biosciences、５５７０５０）を使用したフローサイトメトリーにおいてＣＤ６９発現レベルを測定することによりヒトＴ細胞の活性化状態を決定した。
４．３ 得られたナノボディの配列分析
フローサイトメトリー結合スクリーン及びＴ細胞活性化アッセイにおいて陽性とスコア化されたナノボディを配列決定した。
配列分析は、ナノボディＴ０１７００５６Ｇ０５及びその異なるファミリーメンバーの同定をもたらし、合計１０４の異なるクローン（配列番号４２及び７８～１８０）を表す。対応するアライメントを提供する（表Ａ－１）。
Ｔ０１７００５６Ｇ０５に対するファミリーメンバーのＣＤＲの配列可変性を、以下の表に示す。
Figure 0007222888000005
Figure 0007222888000006
Figure 0007222888000007
４．４ 一価ナノボディの精製
同定されたファミリーの２つの代表的なナノボディを選択し、トリプルＦｌａｇ、Ｈｉｓ６－タグ付きタンパク質として大腸菌ＴＧ１中で発現させた。１mMのＩＰＴＧの添加により発現を誘導し、３７℃で４時間にわたり継続させた。細胞培養物をスピンさせた後、ペレットを凍結融解することによりペリプラズム抽出物を調製した。これらの抽出物を出発材料として使用し、ナノボディをＩＭＡＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して精製した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して評価した通り、ナノボディを純度９５%まで精製した（データは示さず）。
実施例５：ＣＨＯ－Ｋ１細胞上に発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３への及び精製された初代ヒトＴ細胞への抗ＴＣＲナノボディの結合。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞上で発現されたヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）／ＣＤ３への及び精製された初代ヒトＴ細胞への精製された一価抗ＴＣＲナノボディの用量依存的結合をフローサイトメトリーにより評価した。簡単には、細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレート（１×１０５個細胞／ウェル）に移し、ナノボディの連続希釈物（１μMから開始）をＦＡＣＳ緩衝液中で、４℃で３０分間にわたり会合させた。細胞を遠心分離により３回洗浄し、１μg/mlモノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）を用いて４℃で３０分間にわたりプローブ化し、再び洗浄し、５μg/mlのＲ－フィコエリトリンAffiniPure Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch １１５－１１６－０７１）を用いて４℃で３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて３回洗浄した。その後、細胞を、５nMのＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes、Ｔ３６０５）を補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、生存細胞を死細胞と区別し、これをゲート操作の間に除去した。細胞を、FACS Arrayフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowing Softwareを使用して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、１００００個の細胞を取得の間にカウントした。この集団から、ＴＯＰＲＯ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＰＥ値を算出した。
結果を図３に示す。用量反応曲線から得られたＥＣ５０値を表Ｃ－１に表す。
表Ｃ－１：フローサイトメトリーにおいて決定された、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）－／ＣＤ３細胞への結合についての及び精製された初代Ｔ細胞への結合についての抗ＴＣＲ一価ナノボディのＥＣ５０（M）。
Figure 0007222888000008
ナノボディは、ＣＨＯ－Ｋ１細胞上に発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３に明らかに結合した。ナノボディはまた、精製された初代ヒトＴ細胞に結合したが、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＣＲα／β（２Ｘ９）／ＣＤ３細胞と比較してわずかに低い効力を伴った。
実施例６：結合エピトープの決定。
ＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現されたヒトＴＣＲα／β（２ＩＡＮ）／ＣＤ３への精製一価抗ＴＣＲナノボディの結合を、実施例５に概要を示す通り、フローサイトメトリーにおいて評価し、ヒトＣＤ３をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｈ細胞への結合と比較した。１μMから開始したＴ０１７００５５Ａ０２及びＴ０１７００５６Ｇ０５の希釈系列を細胞に適用した。親ＨＥＫ２９３Ｈ細胞株をＴＣＲ／ＣＤ３陰性細胞株として含めた。
結果を図４に示す。用量反応曲線から得られたＥＣ５０値を表Ｃ－２に示す。
表Ｃ－２：フローサイトメトリーにおいて決定された、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞上に発現されたヒトＴＣＲα／β（２ＩＡＮ）／ＣＤ３又はヒトＣＤ３への結合についての抗ＴＣＲ一価ナノボディのＥＣ５０（M）。
Figure 0007222888000009
ナノボディは、ＨＥＫ２９３Ｈ上に発現されたヒトＴＣＲ（２ＩＡＮ）／ＣＤ３には明らかに結合したが、ヒトＣＤ３だけを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｈ細胞にも、ＨＥＫ２９３Ｈ親細胞株にも結合しなかった。結論として、２つのクローンはヒトＴＣＲα／βへの結合について特異的であった。ヒトＣＤ３への結合は観察されなかった。
実施例７：可溶性組換えヒトＴＣＲα／βタンパク質への抗ＴＣＲナノボディの結合。
７．１ ＥＬＩＳＡにおけるヒトＴ細胞受容体タンパク質への抗ＴＣＲナノボディの結合
可溶性組換えヒトＴＣＲα／βタンパク質への精製された一価ＴＣＲナノボディの結合を、２μg/mlの直接コーティングされた可溶性組換えヒトＴＣＲα／βタンパク質を使用したＥＬＩＳＡ（実施例１．２に記載する通り）において評価した。
結果を図５に示す。用量反応曲線から得られたＥＣ５０値を表Ｃ－３に示す。
表Ｃ－３：ＥＬＩＳＡにおいて決定された、可溶性組換えヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）タンパク質への結合についての抗ＴＣＲ一価ナノボディのＥＣ５０（M）。
Figure 0007222888000010
抗ＴＣＲナノボディは可溶性組換えヒトＴＣＲα／βタンパク質に結合した。
７．２ ＢＬＩにおけるヒトＴ細胞受容体タンパク質への抗ＴＣＲナノボディの結合
結合親和性を、Octet RED 384機器（Pall ForteBio Corp．）でBio-Layer Interferometry（ＢＬＩ）を使用して測定した。組換えヒト可溶性ＴＣＲα／β（２ＸＮ９）－ジッパータンパク質を、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学を介して、アミン反応性センサー（ForteBio）上に共有結合的に固定化した。動態解析のために、センサーを最初に泳動緩衝液（GE Healthcare Life Sciencesからの１０mM Ｈｅｐｅｓ、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５%ｐ２Ｏ、ｐＨ７．４）中に浸してベースライン設定を決定した。その後、会合工程（１８０秒）のためにセンサーを異なる濃度の精製ナノボディ（１．４nM～１mMの範囲）を含むウェル中に浸し、解離（１５分）工程のために泳動緩衝液を含むウェルに移した。ForteBio Data Analysisソフトウェアを使用し、１：１相互作用モデルを適用して親和定数（ＫＤ）を算出した。
結果を図６に示す。結合特性を表Ｃ－４に列挙する。
表Ｃ－４：Octet RED384機器を用いて決定された、可溶性組換えヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）タンパク質への結合についての抗ＴＣＲ一価ナノボディの動態解析。
Figure 0007222888000011
ＢＬＩを使用してヒト可溶性ＴＣＲα／β（２ＸＮ９）－ジッパータンパク質で決定された結合親和性は、フローサイトメトリーにおいてＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＣＲα／β（２ＸＮ９）／ＣＤ３細胞で決定された親和性との相関を示した（実施例５参照）。
実施例８：組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βタンパク質への抗ＴＣＲナノボディの結合。
８．１ ＥＬＩＳＡにおけるカニクイザルＴ細胞受容体タンパク質への抗ＴＣＲナノボディの結合
組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βタンパク質への精製した一価抗ＴＣＲナノボディの結合を、２μg/mlの直接コーティングされた組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βジッパータンパク質を使用したＥＬＩＳＡにおいて評価した（実施例１．２に記載する通り）。
用量反応曲線から得られたＥＣ５０値を表Ｃ－５に示す。例示的な結果を図７に示す。
表Ｃ－５：ＥＬＩＳＡにおいて決定された、組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／β－ジッパータンパク質への結合についての抗ＴＣＲ一価ナノボディのＥＣ５０（M）。
Figure 0007222888000012
結果は、抗ＴＣＲナノボディが組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βジッパータンパク質に結合することを示した。
８．２ ＢＬＩにおけるカニクイザルＴ細胞受容体タンパク質への抗ＴＣＲナノボディの結合
一価抗ＴＣＲナノボディの結合親和性は、本質的に実施例７．２に記載する通りに、組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βタンパク質を使用し、Octet RED384機器（Pall ForteBio Corp．）でのＢｉｏ－Ｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）を使用して測定した。
結果を図８に示す。抗ＴＣＲナノボディの結合特性を表Ｃ－６に列挙する。
表Ｃ－６：Octet RED384機器を用いて決定された、組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βジッパータンパク質への結合についての抗ＴＣＲ一価ナノボディの動態解析。
Figure 0007222888000013
ナノボディは、組換えヒト可溶性ＴＣＲα／β（２ＸＮ９）ジッパータンパク質と比較して１０倍低い親和性を伴い、組換えカニクイザル可溶性ＴＣＲα／βタンパク質に結合する。
実施例９：精製された初代ヒトＴ細胞活性化能の決定。
精製された一価抗ＴＣＲナノボディの機能性をヒトＴ細胞活性化アッセイにおいて評価した。Dynabeads（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ThermoFisher Scientific、１１０３３）を、モノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４、１５μg/１Ｅ７ビーズ）を用いてコーティングした。４℃で２時間のインキュベーション期間後、Dynabeads（登録商標）を洗浄し、振盪しながら４℃で２０分間にわたり一定量（１μg）の精製Ｆｌａｇタグ付きナノボディとインキュベートした。ビーズ複合体を可溶性マウス抗ＣＤ２８抗体（Pelicluster CD28 - Sanquin、Ｍ１６５０）と一緒に、異なる健常ドナーから単離した（実施例２．１に記載する通りに単離した）精製された初代ヒトＴ細胞に加える前に、非結合ナノボディを洗い流した。また、抗ＣＤ２８抗体の存在において、抗マウスＩｇＧ Dynabeads（登録商標）上への事前の捕捉を伴わないナノボディと精製された初代ヒトＴ細胞とのインキュベーションにより、ナノボディによる一価ＴＣＲ結合の効果を評価した。精製された初代ヒトＴ細胞の活性化状態を、３７℃及び５%ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後にモノクローナルマウス抗ヒトＣＤ６９ＰＥ（BD Biosciences、５５７０５０）を使用したフローサイトメトリーにおいてＣＤ６９発現を測定することによりモニターした。
結論として、抗ＴＣＲナノボディは、抗マウスＩｇＧダイナビーズ上での捕捉後に明らかなＣＤ６９上方調節を示した。無関係のナノボディは、ＣＤ６９上方調節を全く示さなかった（図９Ａ）。また、溶液中に存在するナノボディはいずれも、ＣＤ６９の発現増加により測定されるように、精製された初代ヒトＴ細胞を活性化することができなかった（図９Ｂ）。
実施例１０：ＣＤ１２３を用いたラマの免疫化、重鎖だけの抗体フラグメントレパートリーのクローニング、及びファージの調製。
１０．１ 免疫化
３頭のラマを、標準的なプロトコールに従って、アジュバントとしてStimune（Cedi Diagnostics、オランダ、レリスタット）を使用した頸部への筋肉内注射を介して、ヒトＣＤ１２３の組換えＨｉｓタグ付き細胞外ドメイン（R&D Systems、３０１－Ｒ３／ＣＦ）を用いて免疫化した。
３５日目に採取した免疫血清サンプルを、ＥＬＩＳＡにより、吸着したｈＣＤ１２３への抗原特異的結合について分析した。全てのラマが、優れたＩｇＧ１媒介性血清応答、及びｈＣＤ１２３に対する良好から中程度の重鎖媒介性応答を示す。
１０．２ 重鎖だけの抗体フラグメントレパートリーのクローニング及びファージの調製
動物１頭当たり、最後の免疫抗原の注射後４日及び８日に１００mLの血液サンプルを回収した。これらの血液サンプルから、製造者の指示（Amersham Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）に従ってFicoll-Hypaqueを使用してＰＢＭＣを調製した。各々の免疫化ラマについて、異なる血液サンプルから単離した全ＲＮＡをプールすることによりライブラリーを構築した。
要するに、ＰＣＲ増幅されたＶＨＨレパートリーを、ＶＨＨライブラリーのファージディスプレイを促進にするように設計されたファージミドベクター中に特定の制限部位を介してクローニングした。ベクターはｐＵＣ１１９から由来した。ＶＨＨコード配列とインフレームにおいて、ベクターはＣ末端３×ＦＬＡＧ及びＨＩＳ６タグをコードする。ファージを標準的なプロトコールに従って調製した（例えば、ＷＯ ０４／０４１８６５、ＷＯ ０４／０４１８６３、ＷＯ ０４／０６２５５１、ＷＯ ０５／０４４８５８、ならびに他の先行技術及び本明細書に引用するAblynx N.V．により提出された出願を参照のこと）。
実施例１１：ファージディスプレイを介したＣＤ１２３特異的ＶＨＨの選択。
全てのラマから得られ、ファージミドライブラリーとしてクローン化されたＶＨＨレパートリーを、多数の選択条件を適用した種々の選択戦略において使用した。変数は以下を含んだ：ｉ）ＣＤ１２３抗原の供給源（ヒト細胞中で産生された組換えタンパク質又は細胞上で過剰発現された全長タンパク質）、ｉｉ）抗原提示（ビオチン化組換え外部ドメインを使用した場合での溶液中、非ビオチン化Ｆｃ融合外部ドメインについてはプレート上に直接コーティング）、及びｉｉｉ）抗原濃度。
簡単には、ＣＤ１２３（自家生成）、ビオチン化ヒトＣＤ１２３（R&D Systems、３０１－Ｒ３／ＣＦ、自家ビオチン化）、及びプレートコーティングヒトＣＤ１２３－Ｆｃ（Sino Biological、１０５１８－Ｈ０８Ｈ）を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、異なるライブラリーの２×１０１１ファージ粒子を用いて１時間～２時間にわたりインキュベートし、徹底的な洗浄が続いた；結合したファージを、トリプシン（１ｍg/mL）を用いて１５分間にわたり溶出し、次に０．８mMプロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することによりプロテアーゼ活性を直ちに中和した。対照として、親細胞株を伴う又は抗原を伴わない選択を並行して実施した。
個々のＶＨＨクローンの分析のためにファージアウトプットを使用して大腸菌を感染させた。ペリプラズム抽出物を標準的なプロトコールに従って調製した（例えば、ＷＯ ０３／０３５６９４、ＷＯ ０４／０４１８６５、ＷＯ ０４／０４１８６３、ＷＯ ０４／０６２５５１、ならびに他の先行技術及び本明細書に引用するAblynx N.V．により提出された出願を参照のこと）。
実施例１２：ＣＤ１２３結合ナノボディについてのスクリーニング。
１２．１ 結合ＥＬＩＳＡにおけるスクリーニング
ペリプラズム抽出物を結合ＥＬＩＳＡ（R&D Systems、３０１－Ｒ３）においてヒトＣＤ１２３上でスクリーニングした。この目的のために、マイクロタイタープレートをヒトＣＤ１２３（１μg/ml）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ中４% Ｍａｒｖｅｌを用いて室温で１時間にわたりブロッキングした。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ペリプラズム抽出物（２% Ｍａｒｖｅｌを伴うＰＢＳ中で１／１０希釈）を室温で少なくとも１時間にわたりインキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後、１% Ｍａｒｖｅｌを伴うＰＢＳ中のモノクローナル抗ＦＬＡＧ Ｍ２－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Sigma、Ａ８５９２、１／５０００）を用いてＶＨＨの結合を検出した。染色を、基質ｅｓＴＭＢ（Nalgene）を用いて実施し、シグナルを１５分後に４５０nmで測定した。
１２．２ フローサイトメトリーにおけるスクリーニング
ペリプラズム抽出物を、９６ウェルフォーマット中の一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＣＤ１２３細胞でのフローサイトメトリーアッセイにおいてスクリーニングした。また、ヘテロ二量体受容体複合体中でのＩＬ－３Ｒβパートナーの存在におけるＩＬ－３Ｒαへの結合を確認するために、内因的にＩＬ－３Ｒを発現するＭＯＬＭ－１３細胞への結合を評価した。この目的のために、細胞（１×１０５個細胞／ウェル／０．１mL）を、ペリプラズム抽出物（１：１０希釈）とＦＡＣＳ緩衝液（Sigmaからの１０%ＦＢＳ及びMerckからの０．０５%アジ化ナトリウムを伴う、InvitrogenからのＤ－ＰＢＳ）中で、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。細胞を３回洗浄し、１μg/mlのモノクローナル抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）と４℃で３０分間にわたりインキュベートし、再び洗浄し、ヤギ抗マウスＲＰＥ標識抗体（Jackson Immunoresearch、１１５－１１６－０７１、１：１００）と４℃で３０分間にわたりインキュベートした。サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で死細胞について染色するためにＴＯＰＲＯ３とインキュベートし、蛍光をFACSArray装置（ＢＤ）で評価した。
１２．３ ナノボディの配列解析
結合ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーアッセイにおいて陽性とスコア化されたナノボディを配列決定した。配列解析は、ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０及びＡ０１１００５５Ｆ０３ならびにそれらの異なるファミリーメンバーの同定をもたらした。対応するアライメントを表Ａ－２及び表Ａ－３にそれぞれ提供する。
Ａ０１１００５６Ａ１０に対するファミリーメンバーのＣＤＲの配列可変性を以下の表に示す。
Figure 0007222888000014
Figure 0007222888000015
Figure 0007222888000016
Ａ０１１００５Ｆ０３に対するファミリーメンバーのＣＤＲの配列可変性を以下の表に示す。
Figure 0007222888000017
Figure 0007222888000018
Figure 0007222888000019
１２．４ 一価ナノボディの精製
各々のファミリーについての代表的なナノボディを選択し、トリプルＦｌａｇ、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質として大腸菌ＴＧ１中で発現させた。１mMのＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導し、３７℃で４時間にわたり継続させた。細胞培養物をスピン後、ペレットを凍結融解することによりペリプラズム抽出物を調製した。これらの抽出物を出発材料として使用し、ナノボディをＩＭＡＣ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介して精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して評価したように、ナノボディを純度９５%まで精製した（データは示さず）。
実施例１３：特徴付けのための追加の細胞株。
１３．１ ＣＤ１２３トランスフェクト細胞株
ＣＤ１２３の組換え過剰発現を伴う安定なＨＥＫ２９３ Flp-In（Invitrogen、Ｒ７５０－０７）及びCHO Flp-In（Invitrogen、Ｒ７５８－０７）細胞株を、Flp-In（商標）部位特異的組換え技術（Ｆｌｐリコンビナーゼ媒介性組込みによる安定な哺乳動物発現細胞株を生成するためのFlp－In（商標）システム（Invitrogen、Ｋ６０１００１、Ｋ６０１００２））を使用して生成した。これにより、ＤＮＡ組込みが、サッカロマイセス・セレビシエから由来するＦｌｐリコンビナーゼ（ｐＯＧ４４）によりＦＲＴ（Ｆｌｐ組換え標的）部位の特定のゲノム位置に生じる。Flp－In（商標）宿主細胞株及び発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ５）は両方ともこのＦＲＴ部位を含み、それにより単一の相同ＤＮＡ組換えを可能にする。ヒトＣＤ１２３についての配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２１７４から由来し、カニクイザルＣＤ１２３の配列はＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ． ＥＨＨ６１８６７．１から由来した（それぞれ配列番号６８及び６９）。ヒト及びカニクイザルＣＤ１２３の細胞表面発現を、マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（BD Biosciences、５５４５２７）及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（BD Bioscience、１６－４７２４－８５）を使用したフローサイトメトリーにより確認した。簡単には、細胞（１×１０５個細胞／ウェル）を採取し、Ｖ底９６ウェルプレート（Greiner Bio-one、６５１１ １８０）に移し、マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（０．２５μg/ml）を用いて、及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（０．２５μg/ml）を用いて４℃で染色した。３０分のインキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１０%ＦＢＳ（Sigma、Ｆ７５２４）及び０．０５%アジ化ナトリウム（Acros organics、１９０３８００５０）を含むGibcoからのＤ－ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。次に、細胞を５μg/mlのＲ－フィコエリスリンAffiniPure Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、１１５－１１６－０７１）と４℃で３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。その後、細胞を、５nMのＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes、Ｔ３６０５）を補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して生存細胞と死細胞を区別した。細胞を、FACS Arrayフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowing Softwareを使用して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、１００００個の細胞を取得の間にカウントした。この集団からＴＯＰＲＯ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＰＥ値を算出した。データを図１０に示す。
１３．２ Ｕ９３７、ＭＯＬＭ－１３、ＫＧ１ａ、及びＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株
ＭＯＬＭ－１３（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ－５５４）、Ｕ－９３７（ATCC（登録商標）、ＣＲＬ－１５９３．２（商標））、ＫＧ１ａ（ATCC（登録商標）、ＣＣＬ２４６．１（商標））、及びＮＣＩ－Ｈ９２９（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ－１６３）でのヒトＣＤ１２３の発現レベルを、フローサイトメトリーにおいてＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（BD Biosciences、５６００８７）及びＡＰＣ標識アイソタイプ対照（Biolegend、４００２２０）を使用して決定した。簡単には、細胞を収集し、２５μgのヒトＦｃブロックを伴うＦＡＣＳ緩衝液（BD Biosciences、５６４２２０）中に１×１０７個細胞/mlの密度で懸濁し、室温で１０分間にわたりインキュベートした。次に、細胞を１×１０６個細胞/mlの細胞濃度に希釈し、Ｖ底９６ウェルプレートに移した（１×１０５個細胞／ウェル）。細胞を、ＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（１０倍希釈）及びＡＰＣ標識アイソタイプ対照（１０倍希釈）を用いて４℃で染色した。３０分のインキュベーション後、細胞を３回洗浄し、１μg/mlのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Sigma、Ｐ４１７０）を補充したＦＡＣＳ緩衝液中に４℃で３０分間にわたり再懸濁し、次にBD FACSCanto及びFlowingソフトウェアを介して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。１００００個の細胞をＰ１内でカウントした。この集団からＰＩ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＡＰＣ値を算出した。データを図１１に示す。
また、１細胞当たりの受容体の数を、製造者の指示に従ってQIFIKIT（Dako、Ｋ００７８）を使用して決定した。データを表Ｃ－７に示す。
Figure 0007222888000020
実施例１４：内因的にＣＤ１２３を発現する細胞株への一価抗ＣＤ１２３ナノボディの結合。
内因的にＣＤ１２３を発現する細胞株ＭＯＬＭ－１３及びＫＧ１ａへの精製された一価抗ＣＤ１２３ナノボディの用量依存的結合をフローサイトメトリーにより評価した。簡単には、細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレートに移し（１×１０５個細胞／ウェル）、ナノボディの連続希釈物（１μMから開始）をＦＡＣＳ緩衝液中で、４℃で３０分間にわたり会合させた。細胞を遠心分離により３回洗浄し、モノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）を用いて４℃で３０分間にわたりプローブ化し、再び洗浄し、５μg/mlのＲ－フィコエリスリンAffiniPure Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、１１５－１１６－０７１）と４℃で３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。その後、細胞を、５nMのＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes、Ｔ３６０５）を補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して生存を死細胞と区別し、これをゲート手順の間に除去した。細胞を、FACS Arrayフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowing Softwareを使用して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、１００００個の細胞を取得の間にカウントした。この集団からＴＯＰＲＯ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＰＥ値を算出した。
ＭＯＬＭ－１３及びＫＧ１ａへのナノボディの結合を図１２に示す。用量反応曲線から得られたＥＣ５０値を表Ｃ－８に示す。
Figure 0007222888000021
ＣＤ１２３を内因的に発現する細胞（ＭＯＬＭ－１３、ＫＧ１ａ）への両方のナノボディの結合があった。
実施例１５：トランスフェクト細胞上のＣＤ１２３への一価抗ＣＤ１２３ナノボディの結合。
ヒトＣＤ１２３過剰発現ＣＨＯ－Ｋ１及びカニクイザルＣＤ１２３過剰発現ＨＥＫ２９３細胞への精製された一価抗ＣＤ１２３ナノボディの用量依存的結合をフローサイトメトリーにより評価した。
Ａ０１１００５５Ｆ０３の結合を検出するために、細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレートに移した（１×１０５個細胞／ウェル）。Ａ０１１００５５Ｆ０３の連続希釈物（１００nmから開始）をＦＡＣＳ緩衝液中で、４℃で３０分間にわたり会合させた。細胞を遠心分離によりＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１μg/mlモノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）を用いて４℃で３０分間にわたりプローブ化して結合ナノボディを検出した。検出は０．５μg/mlのＲ－フィコエリスリンAffiniPure Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、１１５－１１６－０７１）を用いて４℃で３０分間にわたり行った。細胞を洗浄し、ＴＯＰＲＯ３とインキュベートして死細胞を染色し、次に死細胞をゲート手順の間に除去した。細胞を次にBD FACSArrayを介して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、１００００個の細胞を取得の間にカウントした。この集団からＴＯＰＲＯ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＰＥ値を算出した。
Ａ０１１００５６Ａ１０の結合を検出するために、細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレートに移した（１×１０５個細胞／ウェル）。Ａｌｅｘａ６４７標識Ａ０１１００５６Ａ１０（１００nmから開始）の連続希釈液をＦＡＣＳ緩衝液中で、４℃で３０分間にわたり会合させた。３０分のインキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。その後、細胞を１μg/mlのヨウ化プロピジウムを補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、生細胞を死細胞と区別した。細胞をFACS Arrayフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowing Softwareを使用して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、１００００個の細胞を取得の間にカウントした。この集団からＰＩ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＡＰＣ値を算出した。
ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０及びＡ０１１００５５Ｆ０３について、ＣＤ１２３トランスフェクト細胞株及び参照細胞株へのナノボディの結合をそれぞれ図１３及び図１４に示す。用量反応曲線から得られたＥＣ５０値を表Ｃ－９に示す。
Figure 0007222888000022
ＣＤ１２３トランスフェクト細胞株への両方のナノボディの結合があった。両方のナノボディがヒト－カニクイザルＣＤ１２３交差反応性である。
実施例１６：フローサイトメトリーにおいて細胞上に発現されたＣＤ１２３への結合についてのナノボディ競合。
ＣＤ１２３ナノボディが互いに競合するか否かを調べるために、ナノボディ競合アッセイを設定した。この目的のために、Ａ０１１００５６Ａ１０の大バッチをＡｌｅｘａ６４７で標識して凍結した。次に、細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレート（１×１０５個細胞／ウェル）に移し、ナノボディの連続希釈物及び固定濃度のＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７（ＭＯＬＭ－１３について０．７nM、ＣＨＯ Ｆｌｐ－ＩｎヒトＣＤ１２３について０．５nM）と混合した。アッセイにおいて使用したＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７濃度は、それぞれの細胞へのＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７の結合についてＥＣ５０値未満であった（結合曲線を図１５に示す）。４℃で９０分のインキュベーション期間後、Ａ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７の結合をフローサイトメトリーにおいて決定した。それに、細胞を３回洗浄し、１μg/mlのヨウ化プロピジウムを補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、４℃で３０分間にわたりインキュベートし、次にBD FACSArrayを介して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。１００００個の細胞をＰ１内でカウントした。この集団からＰＩ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＡＰＣ値を算出した。
結果を図１６に提示する。用量反応曲線から得られたＩＣ５０値を表Ｃ－１０に示す。
Figure 0007222888000023
非標識Ａ０１１００５６Ａ１０は、予想通り、ＭＯＬＭ－１３細胞上のＣＤ１２３及びトランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞上に発現されたヒトＣＤ１２３への結合についてＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７と競合した。ナノボディＡ０１１００５５Ｆ０３は、ヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞上のＣＤ１２３への結合についてＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７と競合しなかった。ＭＯＬＭ－１３細胞株では、Ａ０１１００５５Ｆ０３は、テストした最高濃度でのみＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７と競合した。
実施例１７：フローサイトメトリーにおける細胞上に発現されたＣＤ１２３への結合についてのマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）との競合。
抗ＣＤ１２３ナノボディが細胞上のヒトＣＤ１２３への結合についてマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）と競合するか否かを調べるために、マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）競合アッセイを、フローサイトメトリーに基づく方法論を使用して実施した。この目的のために、ナノ抗体の連続希釈物及びＥＣ３０濃度のＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）（BD Biosciences、５６００８７）を細胞と９０分間にわたりインキュベートし、その後、抗体結合をフローサイトメトリーにおいて決定した。ＭＯＬＭ－１３及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞へのＡＰＣ標識マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）の結合曲線を図１７に示す。
競合実験からの結果を図１８に提示する。用量反応曲線から得られたＩＣ５０値を表Ｃ－１１に示す。
Figure 0007222888000024
ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０は、ＭＯＬＭ－１３及びヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞上でマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）との競合を示した；従って、マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）及びナノボディＡ０１１００５６Ａ１０のエピトープは少なくとも部分的に重複している。Ａ０１１００５５Ｆ０３は、ＭＯＬＭ－１３細胞上でマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）と競合した。ヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞株でのマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）との競合の非存在は、ヒトＣＤ１２３についてのナノボディＡ０１１００５５Ｆ０３のより低い親和性の結果でありうる。
実施例１８：ＥＬＩＳＡにおける組換えヒトＣＤ１２３への結合についてのマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）との競合。
抗ＣＤ１２３ナノボディが組換えヒトＣＤ１２３タンパク質への結合についてマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）と競合するか否かを調べるために、ＥＬＩＳＡに基づく方法論を使用して競合アッセイを行った。簡単には、マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）（BD Biosciences、５５４５２７）をＰＢＳ中１μg/mlでコーティングした。４℃での一晩のインキュベート後、プレートを室温でカゼイン（ＰＢＳ中１%）を用いてブロッキングした。次に、一価抗ＣＤ１２３ナノボディの連続希釈物及び４nMの自家ビオチン化ＣＤ１２３組換えタンパク質（R&D Systems、３０１－Ｒ３／ＣＦ）を加え、ＰＢＳ＋０．１%カゼイン＋０．０５%Ｔｗｅｅｎ中で、室温で１時間にわたりインキュベートした。自家ビオチン化ＣＤ１２３組換えタンパク質の濃度は、マウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）への自家ビオチン化ＣＤ１２３組換えタンパク質の結合から得られたＥＣ３０値に基づいた（結合曲線を図１９に示す）。コーティングされていないマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）を陽性対照として置き、無関係の抗卵リゾチームナノボディｃＡｂＬｙｓを陰性対照として置いた。Tecan Hydrospeed洗浄機を使用してプレートをＰＢＳ＋０．０５%Ｔｗｅｅｎで洗浄し、７Ｇ３会合ビオチン化ＣＤ１２３をＰＢＳ＋０．１%カゼイン＋０．０５%Ｔｗｅｅｎ中の１μg/mlのエクストラビジンペルオキシダーゼ（Sigma、Ｅ２８８６）を介して検出し、ｅｓＴＭＢ基質を用いた展開が続いた。反応を１M ＨＣｌで停止し、Tecan Infinite M1000を使用してＯＤ４５０nmでの吸収を測定した。
結果を図２０に提示する。用量反応曲線から得られたＩＣ５０値を表Ｃ－１２に示す。
Figure 0007222888000025
Ａ０１１００５６Ａ１０とマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）の間で、組換えヒトＣＤ１２３タンパク質への結合について競合が観察された。Ａ０１１００５５Ｆ０３は、組換えヒトＣＤ１２３タンパク質への結合についてマウスモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体（クローン７Ｇ３）と競合しなかった。
実施例１９：ヒトＣＤ１２３タンパク質（ＳＰＲ）への一価抗ＣＤ１２３ナノボディの結合。
ヒトＣＤ１２３についての精製されたＣＤ１２３特異的ナノボディの結合親和性を、ProteOn XPR36機器でのＳＰＲベースのアッセイにより評価した。それに、組換えＣＤ１２３（R&D Systems、３０１－Ｒ３－０２５／ＣＦ）を、アミンカップリングを介してＥＤＣ及びＮＨＳ化学を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。ワンショット動態学的アプローチを介した動態解析のために、精製したナノボディを異なる濃度（４．２nMから１０００nmの間）で２分間にわたり注入した。流速は４５μl/分であり、ProteOn泳動緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５%Ｔｗｅｅｎ ２０）を泳動緩衝液として使用した。１０００nmサンプルの解離時間は１５分であった。会合／解離データの評価は、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）を適合することにより実施した。
Figure 0007222888000026
ヒトＣＤ１２３への結合についての一価抗ＣＤ１２３ナノボディのＫＤ値は、細胞上の結合データと相関した。Ａ０１１００５６Ａ１０はＡ０１１００５５Ｆ０３と比較してより良好な親和性を有する。
実施例２０：ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチド及び対照ポリペプチドの構築。
Ｔ細胞を結合することが可能なポリペプチドを得るために、ＣＤ１２３ナノボディを抗ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）ナノボディＴ０１７００５６Ｇ０５（配列番号４２）と連結した。後者はＴＣＲα／β定常ドメインに特異的に結合するナノボディである。（Ablynx N.Vにより２０１６年５月１３日に出願された、「ＴＣＲアルファ／ベータ反応性に基づくＴ細胞動員ポリペプチド」と表題の付けられたＷＯ ２０１６／１８０９６９を参照のこと）。
Ｔ細胞結合ポリペプチドの治療活性は、腫瘍関連抗原上の複数のエピトープの同時標的化により改善することができる。腫瘍細胞は、治療内の標的抗原の下方調節だけでなく、また（点）変異を導入することにより回避機構を作製することができる。抗原上の複数のエピトープの同時標的化は、腫瘍回避変異体を生成する可能性を低下させる可能性が高い。さらに、単一抗原上の複数のエピトープを標的化することによって、結合の親和性を増加させることができる（結合力効果）。この多価腫瘍抗原標的化の概念のために、ＣＤ１２３抗原に対して反応性のある２つのナノボディを、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対するナノボディＴ０１７００５６Ｇ０５と連結した。
それぞれのナノボディの特定の順序はフォーマット内で変動した。エフェクター及び腫瘍ナノボディを３５ＧＳリンカーと遺伝的に連結し、その後、標準的なプロトコール（多特異性ポリペプチド）に従って酵母ピキア中で発現させた。並行して、無関係のポリペプチドを、腫瘍反応性ナノボディの一方又は両方を無関係の抗卵リゾチームナノボディｃＡｂＬｙｓ又は抗ＲＳＶナノボディＲＳＶ００７Ｂ０２（Ｑ１０８Ｌ）で置換することにより生成した。
生成したポリペプチドを表Ｃ－１４に列挙する。
Figure 0007222888000027
実施例２１：フローサイトメトリーにおける細胞上に発現されたＣＤ１２３への結合についてのＡ０１１００５６Ａ１０と多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドの間での競合。
ヒト又はカニクイザルＣＤ１２３へのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの結合を、実施例１６に記載するようにＡ０１１００５６Ａ１０競合アッセイにおいて評価した。次に、ＭＯＬＭ－１３及びＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ ｈｕＣＤ１２３細胞への結合、カニクイザルＣＤ１２３トランスフェクトＨＥＫ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞への結合を評価した。
この目的のために、Ａ０１１００５６Ａ１０のバッチをＡｌｅｘａ６４７で標識して凍結した。次に、細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレートに移し（１×１０５個細胞／ウェル）、多特異性結合ポリペプチドの連続希釈物（１μMから開始する）及び固定濃度のＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７と混合した。アッセイにおいて使用した濃度（ＭＯＬＭ－１３については０．４nM、ＣＨＯ Ｆｌｐ－ＩｎヒトＣＤ１２３及びＨＥＫ Ｆｌｐ－ＩｎカニクイザルＣＤ１２３については０．９nM）は、それぞれの細胞へのＡ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７の結合についてのＥＣ５０値未満であった（結合曲線を図２１に示す）。４℃で９０分間のインキュベーション期間後、Ａ０１１００５６Ａ１０－Ａｌｅｘａ６４７の結合を、実施例１６に記載するようにフローサイトメトリーにおいて測定した。Ａ０１１００５６Ａ１０及びＴ０１７０００１２９をそれぞれ陽性対照及び陰性対照として置いた。
結果を図２２に提示する。用量反応曲線から得られたＩＣ５０値を表Ｃ－１５及び表Ｃ－１６に示す。
Figure 0007222888000028
Figure 0007222888000029
全てのテストした多特異性ポリペプチドは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１２３発現細胞への結合を示し、ヒトカニクイザルＣＤ１２３交差反応性が確認された。親和性のわずかな低下が、Ａ０１１００５６Ａ１０がＮ末端位置にないポリペプチドについて観察された。
実施例２２：フローサイトメトリーにおける細胞上に発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３への結合についてのＴ０１７００５６Ｇ０５とＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの間での競合。
ヒトＴＣＲ／ＣＤ３へのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの結合を、フローサイトメトリーによるＴ０１７００５６Ｇ０５競合アッセイにおいて評価した。この目的のために、Ｔ０１７００５６Ｇ０５の大バッチをビオチンで標識して凍結した。次に、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＣＲ／ＣＤ３発現細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレートに移し（１×１０５個細胞／ウェル）、ＦＡＣＳ緩衝液中で多特異性結合ポリペプチドの連続希釈物（１μMから開始する）及び固定濃度のビオチン化Ｔ０１７００５６Ｇ０５と混合した。アッセイにおいて使用したビオチン化Ｔ０１７００５６Ｇ０５の濃度（３０nm）は、細胞への結合についてのＥＣ５０値未満であった（データは示さず）。４℃で９０分のインキュベーション期間後、ビオチン化Ｔ０１７０００５６Ｇ０５ナノボディの結合をフローサイトメトリーにおいて決定した。それに、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中のストレプトアビジン－ＰＥ（ebioscience、１２－４３１７－８７、１０００倍希釈）中に再懸濁し、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液＋１μg/mlのＴＯＰＲＯ（Molecular Probes、Ｔ３６０５）中に４℃で３０分間にわたり再懸濁し、次にＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏを介して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。１００００個の細胞をＰ１内でカウントした。この集団からＴＯＰＲＯ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＰＥ値を算出した。Ｔ０１７００５６Ｇ０５を陽性対照として置いた。
結果を図２３に提示する。用量反応曲線から得られたＩＣ５０値を表Ｃ－１７に示す。
Figure 0007222888000030
細胞上に発現されたヒトＴＣＲ／ＣＤ３へのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの結合を確認した。一価ＴＣＲナノボディに対するＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドＴ０１７０００１１６の親和性における下落が、ＴＣＲナノボディのＣ末端位置に起因して観察された。
実施例２３：フローサイトメトリーにおける細胞上に発現されたカニクイザルＴＣＲ／ＣＤ３への結合についてのＴ０１７００００９９とＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの間での競合。
カニクイザルＴＣＲ／ＣＤ３へのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの結合をフローサイトメトリーにおけるＴ０１７０００９９（二価Ｔ０１７００５６Ｇ０１、配列番号３３７）競合アッセイにおいて評価した。この目的のために、ＨＳＣ－Ｆ（ＪＣＲＢ、ＪＣＲＢ１１６４）カニクイザルＴＣＲ／ＣＤ３発現細胞を収集し、Ｖ底９６ウェルプレートに移し（１×１０５個細胞／ウェル）、ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの連続希釈物（１μMから開始）及びＦＡＣＳ緩衝液中の５００nmのＴ０１７０００９９と混合した。４℃で９０分のインキュベーション期間の後、細胞を遠心分離によりＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１μg/mlのモノクローナルマウス抗FLAG（登録商標）Ｍ２抗体（Sigma-Aldrich、Ｆ１８０４）を用いて４℃で３０分間にわたりプローブ化し、結合したＴ０１７０００９９を検出した。検出は、５μg/mlのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）AffiniPureヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunoresearch、１１５－１３５－１６４）を用いて４℃で３０分間にわたり行った。細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウムと共にインキュベートして死細胞について染色し、それを次にゲート手順の間に除去した。細胞を次にBD FACSArrayを介して分析した。最初に、全細胞集団の８０%超を占めるＰ１集団をＦＳＣ－ＳＳＣ分布に基づいて選択した。このゲートにおいて、１００００個の細胞を取得の間にカウントした。この集団からＰＩ＋細胞（死細胞）を除外し、中央値ＡＰＣ値を算出した。Ｔ０１７０００１２５を陽性対照として置いた。
結果を図２４に提示する。用量反応曲線から得られたＩＣ５０値を表Ｃ－１８に示す。
Figure 0007222888000031
Ｎ末端にＴＣＲ結合ナノボディを伴う全てのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドについて、カニクイザルＴＣＲ／ＣＤ３への結合が観察された。
実施例２４：ヒトＣＤ１２３タンパク質（ＳＰＲ）への一価ナノボディ及び多特異性ポリペプチドの結合。
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドについての結合親和性は、ProteOn XPR36機器でのＳＰＲに基づく親和性決定により評価した。それに、組換えＣＤ１２３（R&D Systems、３０１－Ｒ３－０２５／ＣＦ）を、アミンカップリングを介してＥＤＣ及びＮＨＳ化学を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。精製ナノボディを、動態解析のためのワンショット動態アプローチを介して、異なる濃度（４．２nMから１０００nmの間）で２分間にわたり注入した。１０００nmサンプルの解離時間は１５分であった。流速は４５μl/分であり、ProteOn泳動緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５%Ｔｗｅｅｎ ２０）を泳動緩衝液として使用した。会合／解離データの評価を、１：１相互作用モデル（ラングミュア結合モデル）を適合することにより実施した。結合特性を表Ｃ－１９に列挙する。
Figure 0007222888000032
ヒトＩＬ－３Ｒαへの一価ナノボディ及び多特異性ポリペプチドのＫＤは、細胞上の結合データと相関する。２つのＩＬ－３Ｒα構成要素を含むポリペプチドＴ０１７０００１１６が最良のＫＤを有した。
実施例２５：フローサイトメトリーベースのアッセイにおけるＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドによるＣＤ１２３標的細胞のリダイレクトヒトＴ細胞媒介性死滅。
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドによって腫瘍細胞を死滅させることができたか否かを評価するために、細胞傷害性アッセイを、単離ヒトＴ細胞をエフェクター細胞として用いて実施した。
それに、ヒトＴ細胞を、RosetteSep（StemCell Technologies、１５０６１）を使用して健常なボランティア（Blood bank Gent）から回収し、製造業者の指示に従ったFicoll-Paque（商標）PLUS（GE Healthcare、１７－１４４０－０３）での濃縮が続いた。精製ヒトＴ細胞の品質及び純度を、抗ＣＤ３（eBioscience、１２－００３７－７３）、抗ＣＤ８（BDBiosciences、５５５３６７）、抗ＣＤ４（BD Biosciences、３４５７７１）、抗ＣＤ４５ＲＯ（BD Biosciences、５５５４９３）、抗ＣＤ４５ＲＡ（BDBiosciences、５５０８５５） 、抗ＣＤ１９（BDBiosciences、５５５４１３）、抗ＣＤ２５（BDBiosciences、５５７１３８）、及び抗ＣＤ６９（BDBiosciences、５５７０５０）蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーアッセイにおいてチェックした。細胞を液体窒素中で凍結した。
ヒトＣＤ１２３発現ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞を、製造者の指示に従ってＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Sigma、ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ）を使用して８μM ＰＫＨ－２６膜色素で標識し、標的細胞として使用した。２．５×１０５個のエフェクター（即ち、ヒト初代Ｔ細胞）及び２．５×１０４個の標的細胞（即ち、ＰＫＨ標識ＭＯＬＭ－１３細胞又はＫＧ１ａ細胞）を９６ウェルＶ底プレート中で同時インキュベートした（エフェクター対標的比１０：１）。濃度依存的な細胞溶解の測定のために、ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドの連続希釈物を細胞に加え、５%ＣＯ２雰囲気中で、３７℃で１８時間にわたりインキュベートした。ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０ならびにポリペプチドＴ０１７０００１２９及びＴ０１７０００１３２を陰性対照として置いた。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。その後、細胞を５nMのＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes、Ｔ３６０５）を補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して生存細胞と死細胞を区別した。細胞を、FACS Arrayフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して分析した。１サンプル当たり、８０μlの総サンプル量が得られた。ゲーティングをＰＫＨ２６陽性細胞に設定し、この集団内でＴＯＰＲＯ３陽性細胞を決定した。Ｔ０１７０００１２９、Ｔ０１７０００１３２、及びＡ０１１００５６Ａ１０を陰性対照として置いた。
例示的な結果を、ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞についてそれぞれ図２５及び図２６に示す。ＥＣ５０値は、ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞についてそれぞれ表Ｃ－２０及び表Ｃ－２１に示す。
Figure 0007222888000033
Figure 0007222888000034
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドは、ＣＤ１２３陽性細胞株のヒトＴ細胞媒介性死滅を誘導した。多特異性ポリペプチドにおけるＴＣＲナノボディの位置についての明らかな優先度があった。一般的に、Ｎ末端位置に抗ＴＣＲナノボディを伴うポリペプチドは最良の死滅能力を示した。２つのＣＤ１２３反応性ナノボディを伴うポリペプチドＴ０１７０００１３５、Ｔ０１７０００１３８、及びＴ０１３７００１３９は、１つだけのＣＤ１２３ナノボディを伴うポリペプチドＴ０１７０００１２８と比較して改善された効力を示した。これらの結果は、ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドが腫瘍標的陽性細胞株のＴ細胞媒介性死滅を誘導することができること、及び単一抗原上の複数のエピトープを標的化することによって機能性（結合力活性）が改善されることを実証した。
また、ポリペプチドＴ０１７０００１３８及びＴ０１７０００１３９（両方がＮ末端位置にＴＣＲ反応性ナノボディを伴う三価ポリペプチドである）の比較によって、効力及び有効性に対してＣＤ１２３ナノボディの向きの影響があることが示された。
一価ＣＤ１２３構成要素及びＴＣＲ構成要素を含む無関係のポリペプチドは標的細胞の死滅を誘導せず、死滅を誘導するためにＴ細胞及び標的細胞を多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドと架橋する必要性が確認された。
結果は、異なるドナーからの精製Ｔ細胞を使用して確認された（データは示さず）。
実施例２６：フローサイトメトリーベースのアッセイにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドによるＣＤ１２３標的細胞のリダイレクトされたカニクイザルＴ細胞媒介性死滅。
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドのヒト－カニクイザルＴＣＲ交差反応性を確認するために、ポリペプチドをカニクイザルＴ細胞媒介性ＣＤ１２３陽性腫瘍細胞死滅アッセイにおいて評価した。簡単には、多特異性ポリペプチドを、２．５×１０５個のエフェクター細胞（即ち、カニクイザル初代Ｔ細胞）の存在において２．５×１０４個のＰＫＨ標識標的細胞（即ち、ＭＯＬＭ－１３細胞又はＫＧ１ａ細胞）とインキュベートした（実施例２５に記載する通り、エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）は１０対１に相当する）。Ｔ細胞は、Pan T Cell Isolation Kit（ＭＡＣＳ、１３０－０９１－９９３）を使用し、LPT Laboratory of Pharmacology and Toxicology GmbH & Co. K. G.により単離された。ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０ならびにポリペプチドＴ０１７０００１２９及びＴ０１７０００１３２を陰性対照として置いた。
例示的な結果を、ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞についてそれぞれ図２７及び図２８に示す。ＥＣ５０値は、ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞についてそれぞれ表Ｃ－２２及び表Ｃ－２３に示す。
Figure 0007222888000035
Figure 0007222888000036
Ｔ０１７０００１３４を除く全てのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドは、ＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３又はＫＧ１ａ細胞株のカニクイザルＴ細胞媒介性死滅を誘導した。Ｎ末端位置にＴＣＲ反応性ナノボディを伴うポリペプチドが最も強力かつ有効であった。ポリペプチドＴ０１７０００１３８及びＴ０１７０００１３９（両方が２つのＣＤ１２３反応性ナノボディを伴う３価ポリペプチドである）は、１つだけのＣＤ１２３反応性ナノボディを含むポリペプチドＴ０１７０００１２８と比較して改善された効力を示した。一価抗ＣＤ１２３ナノボディ及びＴＣＲ構成要素を含む無関係のポリペプチドは標的細胞の死滅を誘導せず、死滅を誘導するためにＴ細胞及び標的細胞を多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドと架橋する必要性が確認された。
結果は、異なるカニクイザルからの精製Ｔ細胞を使用して確認された（データは示さず）。
実施例２７：ＣＤ１２３標的細胞のリダイレクトされたカニクイザルＴ細胞媒介性死滅の間でのＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドによるカニクイザルＴ細胞活性化。
多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドを用いたカニクイザルＴ細胞及びＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３細胞の処理に続くＴ細胞活性化をモニターするために、ポリペプチドを、２．５×１０５個の初代Ｔ細胞の存在において２．５×１０４個の標的細胞と７２℃で３７時間にわたりインキュベートした（実施例２６に記載する通り）。カニクイザルＴ細胞活性化は、フローサイトメトリーにおいてＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞集団でのＣＤ２５上方調節をモニターすることにより測定した。
それに、７２時間のインキュベーション後、エフェクター細胞及び標的細胞を遠心分離により回収し、２５μg/mlのヒトＦｃブロック（BD Bioscience、５６４２２０）を伴うＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁し、室温（ＲＴ）で１０分間にわたりインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中のモノクローナルマウス抗ＣＤ４－ＡＰＣ（Biolegend、３００５０５）（２００倍希釈）、モノクローナルマウス抗ＣＤ８ ＡＰＣ（BDBiosciences、５５５３６６）（５０倍希釈）、及びモノクローナル抗ＣＤ２５ ＰＥ（BD Biosciences、５５７１３８）（５０倍希釈）抗体を用いて４℃で３０分間にわたり染色した。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、FACS Cantoフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して分析した。１サンプル当たり、総サンプル量３０μlが得られた。Ｔ細胞をＳＳＣ－ＡＰＣプロットに基づいてゲーティングした。この集団から平均ＰＥ値を算出した。
データを図２９に示す。Ｔ０１７０００１３９について得られたＥＣ５０値を表Ｃ－２４に示す。
Figure 0007222888000037
Ｔ細胞をＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３標的細胞及び一価ＴＣＲ又はＣＤ１２３結合構成要素Ｔ０１７００５６Ｇ０５、Ａ０１１００５５Ｆ０３、もしくはＡ０１１００５６Ａ１０又は無関係の多価ポリペプチドＴ０１７０００１２９とインキュベートした場合、ＣＤ２５上方調節は観察されなかった。データは、ＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３標的細胞及びＴ０１７０００１３９多特異性ポリペプチドとのインキュベーション後のカニクイザル初代Ｔ細胞でのＣＤ２５上方調節を示した。
ＭＯＬＭ－１３細胞は用量依存的に死滅され（図２５、表Ｃ－２２）、多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドがリダイレクト死滅の過程においてＴ細胞活性化を誘導したことを示している。
同様に、Ｔ細胞は、標的細胞及び一価構成要素及び無関係の多特異性ポリペプチドとインキュベートした場合には活性化されず、Ｔ細胞及び標的細胞をＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチドと架橋してＣＤ２５上方調節を誘導する必要性を示す。
実施例２８：xCELLigenceベースのアッセイにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるＣＤ１２３トランスフェクト接着性標的細胞のリダイレクトされたヒトＴ細胞媒介性死滅。
ＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチドを、xCELLigenceベースのアッセイにおいて、ヒトＣＤ１２３トランスフェクト接着性標的細胞のリダイレクトされたヒトＴ細胞媒介性死滅について特徴付けた。このアッセイにおいて、電極の表面への標的細胞の付着により誘導されるインピーダンスにおける変動を測定する。Ｔ細胞は非接着性であり、従って、インピーダンス測定に影響を及ぼさない。xCELLigence機器（Roche）は、電気インピーダンスにおける変化を定量化し、それらを細胞指数と呼ばれる無次元パラメータとして表示し、これは、細胞により覆われている組織培養ウェルの総面積に正比例する。簡単には、xCELLigenceステーションを５%ＣＯ２の３７℃インキュベーター中に置く。５０μlのアッセイ培地をＥ－プレート９６（ACEA Biosciences；０５ ２３２ ３６８ ００１）の各々のウェルに加え、xCELLigenceシステムでのブランク読み取りを実施し、細胞の非存在におけるバックグラウンドインピーダンスを測定した。その後、２×１０４個のヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ又はＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ参照細胞をＥプレート９６上に播種し、５０μlの連続希釈した多特異性ポリペプチドを加えた。ＲＴで３０分後、５０μlのヒトＴ細胞（３×１０５個）を各々のウェルに加え、１５：１のエフェクター対標的比を有するようにした。プレートをxCELLigenceステーション中に置き、インピーダンスを３日間にわたり１５分毎に測定した。データを、結果において示した固定時間点を使用して分析した。
このアッセイにおいて得られたＩＣ５０値を表Ｃ－２５に列挙する。結果を図３０、図３１、及び図３２に示す。
Figure 0007222888000038
得られたデータによって、フローサイトメトリーベースの死滅アッセイにおいて得られた結果、即ち、ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドがＣＤ１２３陽性細胞株のヒトＴ細胞媒介性死滅を誘導することができ（図３０）、死滅活性がＴ細胞の非存在において観察されないことが確認された（図３２）。また、ＣＤ１２３腫瘍標的抗原が存在する場合にだけＴ細胞媒介性死滅が観察され（参照細胞株を用いた死滅の非存在については図３１を参照のこと）、多特異性ポリペプチドが細胞傷害性の誘導について決定的にそれらの標的に依存的であることを示す。
一価ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０及びＴ０１７００５６Ｇ０５ならびに無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９は、標的細胞の死滅を誘導せず、死滅を誘導するためにＴ細胞及び標的細胞を多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドと架橋することの必要性が確認された。
結果は、異なるドナーからの精製Ｔ細胞を使用して確認された（データは示さず）。
実施例２９：xCELLigenceベースのアッセイにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるＣＤ１２３トランスフェクト接着性標的細胞のリダイレクトされたカニクイザルＴ細胞媒介性死滅。
多特異性ポリペプチドの交差反応性を確認するために、ポリペプチドを、実施例２８に記載する通り、xCELLigenceベースのアッセイにおいて、カニクイザルＣＤ１２３トランスフェクション接着性標的細胞のリダイレクトされたカニクイザルＴ細胞媒介性死滅において評価した。
このアッセイにおいて得られたＩＣ５０値を表Ｃ－２６に列挙する。結果を図３３、図３４、及び図３５に示す。
Figure 0007222888000039
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドＴ０１７０００１３９は、ＣＤ１２３陽性細胞株のカニクイザルＴ細胞媒介性死滅を誘導することができ（図３３）、死滅活性はＴ細胞の非存在において観察されなかった（図３５）。また、カニクイザルＣＤ１２３腫瘍標的抗原が存在する場合にだけＴ細胞媒介性死滅が観察され（図３４）、多特異性ポリペプチドが細胞傷害性の誘導について決定的にそれらの標的に依存的であることを示す。
一価ナノボディＡ０１１００５６Ａ１０及びＴ０１７００５６Ｇ０５ならびに無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９は標的細胞の死滅を誘導せず、死滅を誘導するためにＴ細胞及び標的細胞を多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドと架橋することの必要性が確認された。
多特異性ポリペプチドＴ０１７０００１３９のヒト－カニクイザルＣＤ１２３及びＴＣＲ交差反応性は、xCELLigenceベースの死滅アッセイにおいて確認された。
結果は、異なるドナーからの精製Ｔ細胞を使用して確認された（データは示さず）。
実施例３０：リダイレクトされた死滅の間でのサイトカイン産生に対する多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの影響。
サイトカイン放出の誘導を、xCELLigenceアッセイに基づいて、ヒト及びカニクイザルＴ細胞媒介性ＣＤ１２３死滅の間にモニターした。サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡにより測定した。簡単には、ヒトＣＤ１２３トランスフェクトＣＨＯ－Ｋ１細胞（２×１０４個細胞／ウェル）を、精製ヒト又はカニクイザル初代Ｔ細胞（３×１０５個細胞／ウェル）の存在において多特異性ＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチドの連続希釈（１２５nMで開始）又は固定濃度（１２５nM）の無関係のポリペプチドを伴うＥ－プレート９６中に播種した（実施例２８に記載する通り）。プレートへのヒト又はカニクイザルＴ細胞／ポリペプチドの添加の７２時間後、上清中のヒト初代Ｔ細胞によるヒトＩＦＮ－γ及びヒトＩＬ－６産生ならびにカニクイザル初代Ｔ細胞によるカニクイザルＩＦＮ－γを測定した。
ヒトＩＬ－６の放出を、製造者の指示に従って、ヒトIL-6 Quantikine ELISAキット（R&D systems、Ｄ６０５０）を使用してＥＬＩＳＡにおいて測定した。ＩＦＮ－γの放出を以下のように決定した：Maxisorp ９６－ウェルＥＬＩＳＡプレート（Nunc）を抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（BDBiosciences、５５１２２１）又は抗カニクイザルＩＦＮ－γ抗体（Biolegend、５０７５０２）でコーティングした。一晩のインキュベート後、プレートを洗浄し、室温で１時間にわたりＰＢＳ＋２%ＢＳＡでブロッキングした。次に、プレートを１００μlの上清（２倍希釈）及び１μg/mlのビオチン化抗ＩＦＮ－γ抗体（BD Biosciences、５５４５５０）と振盪しながら２時間３０分間にわたりインキュベートし、再び洗浄してストレプトアビジン－ＨＲＰ（Dakocytomation、Ｐ０３９７）とインキュベートした。３０分後、TMB One Solution（Promega、Ｇ７４３１）を加えた。反応を２M Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させ、ポリペプチド用量依存的なＩＦＮ－γの産生を、Tecan sunrise 4を使用した４０５nmでのＯＤの測定により決定した。
ＩＦＮ－γについての結果を図３６に示す。ＩＬ－６についての結果を図３７に示す。これらのアッセイにおいて得られたＥＣ５０値を表Ｃ－２７及び表Ｃ－２８に列挙する。
Figure 0007222888000040
Figure 0007222888000041
サイトカイン産生が、ＣＤ１２３過剰発現ＣＨＯ Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞及び初代Ｔ細胞をＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとインキュベートした場合に観察された。無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９及びＴ０１７０００１３２はサイトカイン産生を誘導しなかった。
実施例３１：健常なＰＢＭＣにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドによるリダイレクトされた自己Ｔ細胞形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及び好塩基球の枯渇。
凍結保存した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解凍し、アッセイ培地（ＲＭＰＩ１６４０＋１０%ＦＢＳ）で洗浄した。２×１０５個のＰＢＭＣを、９６ウェルＶ底プレート中の２００μlのアッセイ培地中の多特異性ポリペプチドの連続希釈物とインキュベートし、５%ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。示した時間点で、細胞をモノクローナルマウス抗ＣＤ１４－ＡＰＣ抗体（Biolegend、３０１８０８）、抗ＣＤ１６－ＡＰＣ抗体（Biolegend、３０２０１２）、抗ＣＤ１９－ＡＰＣ抗体（Biolegend、３０２２１２）、抗ＣＤ２０－ＡＰＣ抗体（Biolegend、３０２３１２）、抗ＣＤ５６－ ＡＰＣ抗体（Biolegend、３１８３１０）、抗ＣＤ１２３－ＰＥ抗体（Biolegend、３０６００６）、及び抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＦＩＴＣ抗体（Biolegend、３０７６０３）を用いて４℃で染色した。簡単には、細胞を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液（Sigmaからの１０%ＦＢＳ及びMerckからの０．０５%アジ化ナトリウムを伴う、GibcoからのＤ－ＰＢＳ）で１回洗浄し、２５μlのヒトＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ、０．５μg/ml（BD Biosciences、５６４２２０、１０００倍希釈）中に室温で１０分間にわたり再懸濁した。次に、２５μlの抗体を加え、製造者の指示に従って４℃で３０分間にわたりインキュベートした。ＰＢＭＣを含む別々のウェルを、５nMのＴＯＰＲＯ３（Molecular Probes、Ｔ３６０５）を補充したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して生細胞集団を死細胞集団から区別した。サンプルを３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（Sigmaからの１０%ＦＢＳ及びMerckからの０．０５%アジ化ナトリウムを伴う、GibcoからのＤ－ＰＢＳ）中に再懸濁し、次にFACS Divaソフトウェアを備えたFACS Canto（ＢＤ）サイトメーターを介して分析した。１サンプル当たり、７５μlの総サンプル容量が得られた。データ解析を、FACS Diva及びFlowingソフトウェアを用いて実施した。
ＴＯＰＲＯ染色を含むウェルに基づき、ゲーティングを、死細胞を排除するように設定した。ヒト及びカニクイザルのｐＤＣ及び好塩基球を、系列マーカー（ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５６）陰性／ＣＤ１２３陽性集団として同定した。
結果を図３８に示す。
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドによるヒト及びカニクイザルＣＤ１２３陽性集団それぞれの枯渇が５時間のインキュベーション時間後に観察された。標的化ナノボディを無関係のナノボディにより置き換えた場合、ＣＤ１２３陽性集団の枯渇は観察されず、Ｔ細胞及び標的細胞をＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチドで架橋して枯渇を誘導する必要性を示した。
アッセイを、３つの異なるヒトドナーからのＰＢＭＣ及び２つの異なるカニクイザルからのＰＢＭＣを使用して繰り返し、ＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチドの機能性を確認した。
実施例３２：健常なヒトＰＢＭＣサンプル中の多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるリダイレクトされた自己ヒトＴ細胞単球枯渇。
単球の枯渇を評価するために、解凍し、アッセイ培地（ＲＭＰＩ １６４０＋１０%ＦＢＳ）で洗浄し、５時間又は２４時間のいずれかにわたり多特異性ポリペプチドの連続希釈液とインキュベートした凍結保存ヒトＰＢＭＣを使用し、アッセイを上に記載するように実施した。細胞の染色を上に記載するように実施した。単球をＣＤ１４＋集団として同定した。
結果を図３９に示す。
５時間のインキュベーション後、単球枯渇は、ＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチド及び無関係のナノボディについて観察されなかった。２４時間後、単球枯渇がＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチドについて観察されたが、無関係のポリペプチドについては観察されなかった。３人の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用してアッセイを繰り返し、ＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチドの機能性を確認した。
実施例３３：健常なヒトＰＢＭＣサンプル中の自己ＣＤ１２３陽性細胞のリダイレクトされたＴ細胞死滅の間での多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるヒトＴ細胞活性化。
ＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチド媒介性枯渇プロセスの間でのＴ細胞活性化を特徴付けるために、自己ＰＢＭＣアッセイを上に記載するように実施し、ヒトＴ細胞の活性化状態を、２４時間のインキュベーション後でのＣＤ６９の上方調節の測定によりモニターした。簡単には、２４時間のインキュベーション時間後、細胞を４℃で３０分間、モノクローナルマウス抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（BD Biosciences、５５５３３２）で染色してヒトＴ細胞と同定し、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ６９－ＰＥ抗体（BD Biosciences、５５７０５０）でＴ細胞活性化を評価した。細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（Sigmaからの１０%ＦＢＳ及びMerckからの０．０５%アジ化ナトリウムを伴う、GibcoからのＤ－ＰＢＳ）中に再懸濁し、次にFACS Divaソフトウェアを備えたFACS Canto（ＢＤ）サイトメーターを介して分析した。１サンプル当たり、７５μlの総サンプル容量が得られた。データ解析を、FACS Diva及びFlowingソフトウェアを使用して実施した。
例示的な結果を図４０に示す。
データは、ＰＢＭＣを多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとインキュベートした場合でのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の用量依存的な上方調節を示した。一価ナノボディ又は無関係のポリペプチドとのインキュベーションは、ＣＤ６９の上方調節をもたらさなかった。
実施例３４：フローサイトメトリーベースのアッセイにおけるＣＤ１２３標的細胞のリダイレクトされたＴ細胞媒介性死滅についての無関係のポリペプチドの特徴付け。
ＴＣＲナノボディＴ０１７００５６Ｇ０５の安全性を評価するために、無関係のポリペプチド（一価ナノボディ及び多価ポリペプチドＴ０１７０００１２９）の徹底的な分析を、１０：１のＥ：Ｔ比を使用し、リダイレクトされたＴ細胞媒介性標的死滅アッセイにおいて実施した（実施例２５及び２６に記載する通り）。ポリペプチドＴ０１７０００１３９を陽性対照として置いた。
ＫＧ１ａ標的細胞を使用した結果を図４１に示し、ＭＯＬＭ－１３を使用した結果を図４２に示す。得られたＥＣ５０値を表Ｃ－２９及び表Ｃ－３０に列挙する。
Figure 0007222888000042
Figure 0007222888000043
陽性対照Ｔ０１７０００１３９は、ヒト及びカニクイザルＴ細胞を使用した場合に予想通りに挙動した。一価の構成要素も無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９（ＣＤ１２３の構成要素を無関係な構成要素と置き換えた）もＣＤ１２３陽性細胞の死滅を誘導せず、ＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチドの特異性が確認された。
実施例３５：ヒトのリダイレクトされた死滅の間でのサイトカイン産生に対する多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの影響。
サイトカイン放出の誘導を、ＦＡＣＳベースの読み出しに基づき、ヒトＴ細胞媒介性ＣＤ１２３死滅アッセイの間にモニターした。ヒトサイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡにより測定した。簡単には、ＭＯＬＭ－１３又はＫＧ１ａを、精製したヒト初代Ｔ細胞（３×１０５個細胞／ウェル）の存在において無関係の多特異性ＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチドの連続希釈と共にＶ底９６ウェルプレート（２×１０４個細胞／ウェル）中に播種した（実施例２５に記載する通り）。プレートへのヒト初代Ｔ細胞／ポリペプチドの添加後７２時間に、上清中のヒト初代Ｔ細胞によるヒトＩＦＮ－γ及びＩＬ－６産生を実施例３０に記載するように測定した。
結果を図４３Ａ、４３Ｂ、及び４３Ｃに示す。このアッセイにおいて得られたＥＣ５０値を表Ｃ－３１と表Ｃ－３２に列挙する。
Figure 0007222888000044
Figure 0007222888000045
ＫＧ１ａ細胞及びヒト初代Ｔ細胞のＭＯＬＭ－１３をＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとインキュベートした場合にサイトカイン産生が観察された。無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９はサイトカイン産生を誘導しなかった。
実施例３６：ＣＤ１２３陰性細胞株を使用したフローサイトメトリーベースのアッセイにおける多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドについての標的非依存的なリダイレクトされたヒト又はカニクイザルエフェクターＴ細胞死滅の特徴付け。
多特異性ポリペプチドのＣＤ１２３非依存的な死滅を評価するために、ＣＤ１２３陰性Ｕ－９３７及びＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株をフローサイトメトリーベースの死滅アッセイにおいて評価した。Ｕ－９３７細胞及びＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を、製造者の指示に従ってＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Sigma、ＰＫＨ２６ＧＬ－１ＫＴ）を使用して８μM ＰＫＨ－２６膜色素で標識し、標的細胞として使用した。アッセイは、初代ヒト又はカニクイザルＴ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）を使用して実施例２５及び２６に記載する通りに実施した。
例示的な結果を、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞及びＵ－９３７細胞についてそれぞれ図４４及び図４５に示す。
ＴＣＲ／ＣＤ１２３多特異性ポリペプチド及び無関係のポリペプチドは、最小のＴ細胞リダイレクトＵ－９３７死滅活性（６%未満）だけを示し、多特異性ポリペプチドがＣＤ１２３への結合について良好な特異性を有することを示す。
実施例３７：ＣＤ１２３陰性細胞株を使用したリダイレクトエフェクターＴ細胞死滅アッセイの間での多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドについてのＴ細胞活性化の特徴付け。
多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを用いたＴ細胞及びＣＤ１２３陰性細胞の処理に続くＴ細胞活性化をモニターするために、ポリペプチドを２．５×１０５個の初代Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１）の存在において２．５×１０４個のＵ－９３７及びＮＣＩ－Ｈ９２９標的細胞と３７℃で２４時間にわたりインキュベートした（実施例２５及び２６に記載する通り）。Ｔ細胞活性化を、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞集団での７２時間のインキュベーション後のＣＤ２５上方調節をモニターすることにより以前に記載した通りに測定し、モノクローナルマウス抗ＣＤ４－ＡＰＣ抗体（Biolegend、３００５０５）、モノクローナルマウス抗ＣＤ８ ＡＰＣ抗体（BD Biosciences、５５５３６６）、及びモノクローナル抗ＣＤ２５抗体（BD Biosciences、５５７１３８）を使用し、実施例２７に記載する通りにフローサイトメトリーにおいて測定した。
例示的な結果を図４６に示す。
多特異性ポリペプチド及びＵ－９３７又はＮＣＩ－９２９ ＣＤ１２３陰性細胞株とのインキュベーション後のＴ細胞活性化の評価は、多特異性ポリペプチドのいずれについてもＣＤ２５の最小の上方調節だけを示した。そのため、ＣＤ１２３陰性標的細胞の存在において、Ｔ細胞による最小のＴ細胞活性化又は死滅だけがあった。
実施例３８：ヒトのリダイレクトされた死滅の間での多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドについてのサイトカイン産生の特徴付け。
サイトカイン放出の特異的な誘導は、ＦＡＣＳベースの読み出しに基づくヒトＴ細胞媒介性死滅アッセイの間にモニターした。サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡにより測定した。簡単には、ＮＣＩ－Ｈ９２９を、精製ヒト初代Ｔ細胞（３×１０５個細胞／ウェル）の存在において、多特異性ＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチド又は無関係のポリペプチドの連続希釈物を伴うＶ底９６ウェルプレート（２×１０４個細胞／ウェル）中に播種した（実施例２５に記載する通り）。プレートへのヒト初代Ｔ細胞／ポリペプチドの添加後７２時間に、ヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ及びＩＬ－６産生を、実施例３０に記載する通りに上清中で測定した。結果を図４７に示す。
ＣＤ１２３陰性ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株及びヒト初代Ｔ細胞をＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドとインキュベートした場合、サイトカイン産生は観察されなかった。
実施例３９：リダイレクトされた死滅の間でのＴ細胞増殖に対する多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの影響。
ヒトＴ細胞の増殖に対する多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの効果を調べるために、ガンマ線照射した（１００Gy）ＭＯＬＭ－１３細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Greiner bio-one、６５５ １８０、２×１０４個細胞／ウェル）中に多特異性ポリペプチド及びヒト初代Ｔ細胞（２×１０５個細胞／ウェル）と一緒に播種し、空気中の５×ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃で７２時間にわたりインキュベートした。次に、細胞を３Ｈ－チミジン（３Ｈ－Ｔｄｒ、New England Nuclear、マサチューセッツ州ボストン、２０Ci/mM比放射能）で約１８時間にわたりパルスし、ガラス繊維フィルターストリップ上に収集し、次に液体シンチレーション計測によりカウントした。
例示的な結果を図４８に示す。
ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドは用量依存的な様式においてＴ細胞増殖を誘導した。Ｔ細胞増殖は無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９については観察されなかった。
並行して、標的細胞の非存在におけるヒトＴ細胞の増殖に対する多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの効果を評価した。それに、多特異性ポリペプチド及びヒト初代Ｔ細胞（２×１０５個細胞／ウェル）を空気中５×ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃で７２時間にわたりインキュベートした。増殖を上に記載する通りに測定した。データを図４９に示す。
実施例４０：前活性化Ｔ細胞対非活性化Ｔ細胞の溶解性能。
刺激条件下で複数日のインキュベーション期間に応答したＴ細胞の溶解性能をテストするために、（実施例２５に記載する通りに単離された）初代ヒトＴ細胞を解凍し、２：１のＴ細胞対ビーズ比を使用したDynabeads（登録商標）ヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Gibco－Technologies、１１１３２Ｄ）を使用して前活性化した。３日後、ビーズを追加の３日間にわたり新鮮なビーズと置き換えた。次に、ビーズを除去し、ＭＯＬＭ－１３標的死滅アッセイにおいて前活性化及び非活性化Ｔ細胞を評価した。簡単には、同じドナーからの非活性化又はＣＤ３／ＣＤ２８前活性化初代Ｔ細胞を、異なるＥ：Ｔ比（８：１、２：１、１：２、１：１）のＰＫＨ標識ＭＯＬＭ－１３細胞と、及びＴ０１７０００１１４の連続希釈物と、又は異なるＥ：Ｔ比（２：１、１：２、１：４、１：８）のＰＫＨ標識ＫＧ１Ａ細胞と、及びＴ０１７０００１３９の連続希釈物と混合した。２４時間のインキュベーション後の細胞傷害性の読み取りを、実施例２５において上に記載する通りに実施した。
結果を、ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞についてそれぞれ図５０及び図５１に示す。このアッセイにおいて得られたＥＣ５０値を、ＭＯＬＭ－１３細胞及びＫＧ１ａ細胞についてそれぞれ表Ｃ－３３及び表Ｃ－３４に列挙する。
Figure 0007222888000046
Figure 0007222888000047
前活性化Ｔ細胞は、テストした全てのＥ：Ｔ比で、非活性化Ｔ細胞よりも強力に標的細胞を溶解した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いたエフェクター細胞の前刺激は、より高い溶解率をもたらした。
実施例４１：半減期延長（ＨＬＥ）多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチド及び対照ポリペプチドの構築。
ＡＬＢ１１（配列番号４３）（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するナノボディ）をＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドに連結させて、フォーマット化された分子のインビボでの半減期を増加させた（ＷＯ０６／１２２７８７）。多数のフォーマットを、３５ＧＳリンカーを使用し、Ｎ末端にＴＣＲα／β動員ナノボディ及びＣ末端にＣＤ１２３腫瘍標的化ナノボディ又はアルブミン標的化ナノボディを用いて生成し、上に示す通りに発現させた。無関係のポリペプチドを、腫瘍抗原結合ナノボディを無関係の抗ＲＳＶナノボディで置き換えることにより生成した。探索したフォーマットの概要を表Ｃ－３５に示す。
Figure 0007222888000048
実施例４２：多特異性動員ポリペプチドにおけるＡＬＢ１１のアルブミン結合特性。
ヒト及びカニクイザル血清アルブミン（ＳＡ）それぞれへの半減期延長多特異性ポリペプチドの結合親和性を、Biacore T100機器でのＳＰＲベースの親和性決定によって測定した。それに、ヒト（Sigma、Ａ３７８２）及びカニクイザルＳＡ（自家で産生）それぞれを、アミンカップリングを介して、ＥＤＣ及びＮＨＳ化学を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。ＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチドを異なる濃度（６．２～５００nm）で２分間にわたり注射し、４５μl/分の流速で１５分間にわたり解離させた。サンプル注射の間に、表面を１０mMグリシン－ＨＣｌ ｐＨ１．５で再生した。ＨＢＳ－ＥＰ＋を泳動緩衝液として使用した。動態定数を、単一サイクル動態１：１結合モデルを使用したアルゴリズムを伴うBIAEvaluationソフトウェアを使用してセンサーグラムから算出した。親和定数ＫＤを、結果として得られた会合及び解離速度定数ｋａ及びｋｄから算出し、表Ｃ－３６に示す。
Figure 0007222888000049
ＡＬＢ１１構成要素を多特異性動員ポリペプチドにフォーマット化することによって、ヒト及びカニクイザル血清アルブミンへの結合についての親和性における許容可能な下落がもたらされた。
実施例４３：フローサイトメトリーベースのアッセイにおけるＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるＭＯＬＭ－１３標的細胞のリダイレクトされたＴ細胞媒介性死滅。
ＡＬＢ１１ナノボディの添加及び血清アルブミン（ＳＡ）への結合がポリペプチドの効力に影響を与えうるため、ＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを、３０μM ＳＡの非存在又は存在において、実施例２５及び２６に記載する通りのフローサイトメトリーアッセイに基づき、細胞ＣＤ１２３陽性ＭＯＬＭ－１３標的細胞のリダイレクトされたヒト及びカニクイザルＴ細胞媒介性死滅について評価した。
このアッセイにおいて得られたＥＣ５０値を表Ｃ－３７に列挙する。結果を図５２に示す。
Figure 0007222888000050
全てのＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドは、ヒト及びカニクイザルＴ細胞の両方によるＭＯＬＭ－１３細胞の用量依存的な死滅を示した。ポリペプチド中でのＡＬＢ１１の包含によって効力は減少しなかった。ＨＳＡ又はＣＳＡの添加時、効力における小さな下落が観察されたが、有効性は影響を受けなかった。
実施例４４：フローサイトメトリーベースのアッセイにおけるＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドによるＫＧ１ａ標的細胞のリダイレクトされたＴ細胞媒介性死滅。
半減期延長されたＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチドはまた、３０μM血清アルブミンの非存在又は存在において、実施例２４及び２５に記載する通りのフローサイトメトリーアッセイに基づき、ＣＤ１２３ ＫＧ１ａ標的細胞のリダイレクトされたヒト及びカニクイザルＴ細胞媒介性死滅について評価した。
このアッセイにおいて得られたＥＣ５０値を表Ｃ－３８に示す。結果を図５３に示す。
Figure 0007222888000051
全てのＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドが、ヒト及びカニクイザルＴ細胞の両方によるＫＧ１ａ細胞の用量依存的な死滅を示した。ポリペプチド中でのＡＬＢ１１の包含によって効力は減少しなかった。ＨＳＡ又はＣＳＡの添加時、効力における小さな下落が観察されたが、有効性は影響を受けなかった。
実施例４５：リダイレクトされた死滅の間でのサイトカイン産生に対するＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドＴ０１７０００１４４の影響。
サイトカイン放出の誘導を、ＦＡＣＳベースの読み出しに基づくヒトＴ細胞媒介性死滅アッセイの間にモニターした。ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡにより測定した。簡単には、ＭＯＬＭ－１３（２×１０４個細胞／ウェル）を、精製ヒト初代Ｔ細胞（３×１０５個細胞／ウェル）の存在において、多特異性ＴＣＲ／ＣＤ１２３結合ポリペプチド又は無関係のポリペプチドの連続希釈物と播種した（実施例３５において記載する通り）。プレートへのヒト初代Ｔ細胞／ポリペプチドの添加後７２時間に、上清中のヒト初代Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ及びＩＬ－６産生を実施例３０に記載する通りに測定した。
このアッセイで得られたＥＣ５０値を表Ｃ－３９と表Ｃ－４０に列挙する。結果を図５４に示す。
Figure 0007222888000052
Figure 0007222888000053
ＭＯＬＭ－１３細胞及びヒト初代Ｔ細胞をＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドＴ０１７０００１４４とインキュベートした場合にサイトカイン産生が観察された。無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９はサイトカイン産生を誘導しなかった。
実施例４６：リダイレクトされた死滅の間でのＴ細胞増殖に対するＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの影響。
ヒトＴ細胞の増殖に対するＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドの効果を調べるために、ガンマ線照射（１００Gy）ＭＯＬＭ－１３細胞を、ＨＬＥ多特異性ポリペプチドＴ０１７０００１４４及びヒト初代Ｔ細胞（２×１０５個細胞／ウェル）と一緒に９６ウェル平底マイクロタイタープレート中に播種し（２×１０４個細胞／ウェル）、ＳＡの非存在において、空気中５×ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃で７２時間にわたりインキュベートした。Ｔ０１７０００１２９を陰性対照として置いた。次に、細胞を３Ｈ－チミジン（３Ｈ－Ｔｄｒ、New England Nuclear、マサチューセッツ州ボストン、２０Ci/mM比放射能）で約１８時間にわたりパルスし、ガラス繊維フィルターストリップ上に収集し、次に液体シンチレーション計数によりカウントした。
例示的な結果を図５５に示す。
ＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドＴ０１７０００１４４は用量依存的な様式においてＴ細胞増殖を誘導した。Ｔ細胞増殖は、無関係のポリペプチドＴ０１７０００１２９については観察されなかった。
実施例４７：健常なヒトＰＢＭＣサンプル及び健常なカニクイザルＰＢＭＣにおけるＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドによるリダイレクトされた自己Ｔ細胞形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）及び好塩基球の枯渇。
ＨＬＥ構築物を、実施例３１に記載する通り、ＳＡの非存在においてヒト及びカニクイザル自己ＰＢＭＣアッセイにおいてさらに評価した。多特異性ポリペプチドによるＣＤ１２３陽性細胞（ｐＤＣ：系統陰性、ＣＤ１２３陽性、ＨＬＡ－ＤＲ陽性及び好塩基球：系統陰性、ＣＤ１２３陽性、ＨＬＡ－ＤＲ陰性）の枯渇を５時間のインキュベーション時間後に評価した。
結果を、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣについてそれぞれ図５６及び図５７に示す。
ＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドは、リダイレクトされたＴ細胞によりヒト及びカニクイザルＰＢＭＣ内のＣＤ１２３＋ｐＤＣ及び好塩基球を枯渇させることができた。Ｔ０１７０００１４４が最も強力なポリペプチドであった。ポリペプチドＴ０１７０００１４２は、１つのＴＣＲ構成要素、ＡＬＢ１１、及び１つだけのＣＤ１２３構成要素で構成され、５時間後にＰＢＭＣアッセイにおいて機能性を示さなかった。ＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドのヒトカニクイザル交差反応性を自己設定において確認した。
実施例４８：健常なヒトＰＢＭＣサンプル中のＨＬＥ ＣＤ１２３／ＴＣＲ多特異性ポリペプチドによるリダイレクトされた自己Ｔ細胞単球枯渇。
自家ヒトＰＢＭＣ設定におけるＨＬＥ多特異性ポリペプチドによる単球（ＣＤ１４＋細胞）の枯渇を、ＳＡの非存在における２４時間のインキュベーション時間後に評価した。アッセイを実施例３２に記載する通りに実施した。
結果を図５８に示す。
ＨＬＥ多特異性ポリペプチドによって、リダイレクトされたＴ細胞によりヒトＰＢＭＣ内のＣＤ１２３＋単球を枯渇させることができた。Ｔ０１７０００１４４が最も強力なポリペプチドであった。ポリペプチドＴ０１７０００１４２は、１つのＴＣＲ構成要素、ＡＬＢ１１、及び１つだけのＣＤ１２３構成要素で構成され、２４時間後に自己単球枯渇アッセイにおいて機能性を示した。
実施例４９：非ヒト霊長類モデルにおけるインビボでの有効性及び安全性。
非ＨＬＥ及びＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ナノボディのインビボでの有効性及び安全性を、非ヒト霊長類モデルにおいて評価する。
参照化合物で処置した動物を陽性対照として含める。非ＨＬＥ ＩＲＲ／ＴＣＲ結合ポリペプチドでの処置を、多特異性ポリペプチドのＣＤ１２３標的化部分についての特異性対照として使用する。参照化合物及び非ＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを、カニクイザルでの７日間のＮａＣｌ注入「前処置」後に連続静脈内注入を介して投与する。非ＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを、表Ｃ－４１に従った週１回の用量漸増スキームにおいて、参照化合物に対して等モル用量で４日間オン／３日間オフ注入として４週間にわたり投与する。ＨＬＥ多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを、表Ｃ－４１に従った週１回の用量漸増スキームにおける１、２、３、８、１５、及び２２日目にボーラス静脈内注射を介してカニクイザルに投与する。
Figure 0007222888000054
血液からのＴ細胞再分布を、表Ｃ－４２に記載する通り、フローサイトメトリー及び示差血球数測定を使用し、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与前＋投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与前＋投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与前＋投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与前＋投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６にＴ細胞サブセットを測定することによりモニターする。
インビボでの有効性を、表Ｃ－４３に詳述する通り、フローサイトメトリー及び血液中の示差血球数を使用し、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与前＋投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与前＋投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与前＋投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与前＋投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６でのＰＢＭＣ中のＣＤ１２３＋細胞のパーセンテージ及び数の評価により評価する。
安全性を、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６に血清中のサイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＩＦＮ－γ）の評価により評価する。
Figure 0007222888000055
Figure 0007222888000056
ＰＫ分析用の血清サンプルを、－７日、ｄ－４、ｄ１（投与前＋投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与前＋投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与前＋投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与前＋投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６）に回収する。
ＡＤＡ分析用の血清サンプルを、－７日、ｄ１（投与前）、ｄ８（投与前）、ｄ１５（投与前）、ｄ２２（投与前）、ｄ２９、及びｄ３６に回収する。
４日目及び２５日目に、血液中Ｔ細胞を全ての動物から単離し、実施例２５に記載する通りに消耗試験においてテストする。
２９日目に、剖検をグループ２の動物で実施する。３６日目に、剖検を残りの全ての動物で実施する。
実施例５０：非ヒト霊長類モデルにおけるインビボでの有効性及び安全性－多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ナノボディ、実験結果。
多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドＴ０１７０００１３９のインビボでの有効性及び安全性を非ヒト霊長類モデルにおいて評価した。
参照化合物（ＭＧＤ００６、Macrogenics）で処置した動物を陽性対照として含めた。無関係の／ＴＣＲ結合ポリペプチドＴ０１７０００１２９を用いた処置を、多特異性ポリペプチドのＣＤ１２３標的化部分についての特異性対照として使用した。参照化合物、無関係の／ＴＣＲ結合ポリペプチド、及び多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを、カニクイザルの７日間のＮａＣｌ注入「前処置」後の連続静脈内注入を介して投与した。無関係の／ＴＣＲ結合ポリペプチド及び多特異性ＣＤ１２３／ＴＣＲ結合ポリペプチドを、表Ｃ－４４に従った週１回の用量漸増スキームにおいて、参照化合物に対して等モル用量での４日間オン／３日間オフ注入として４週間にわたり投与した。
Figure 0007222888000057
血液からのＴ細胞再分布を、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与前＋投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与前＋投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与前＋投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与前＋投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６にフローサイトメトリーを使用してＴ細胞サブセットを測定することによりモニターした。
図５９に示すように、参照化合物で処置した陽性対照群において、循環ＣＤ４＋ＣＤ３＋及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の数が異なる投与サイクルの間に変動し、枯渇よりもむしろ輸送及び／又は辺縁趨向を示唆した。対照的に、ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドでの又は無関係の／ＴＣＲポリペプチドでの処置は、ＣＤ４＋ＣＤ３＋又はＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞数の強い変動をもたらさなかった。
循環ＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞数を、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与前＋投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与前＋投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与前＋投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与前＋投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６に血中のフローサイトメトリーを使用してＰＢＭＣ中のＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞の数を測定することによりインビボでの有効性を評価するための薬力学的エンドポイントとして探索した。
結果を図６０に示す。ＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞は参照化合物ＭＧＤ００６（陽性対照）で処置された動物において枯渇したが、有効性の喪失が４回目の投与サイクルに向かって観察された。ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドでの処置は、最初の投与サイクルから既に血液中のＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞の枯渇を起こし、それは４回目及び最後の投与サイクルを通して持続した。無関係の／ＴＣＲポリペプチドで処置した動物では、ＣＤ１２３＋ＣＤ１４－細胞の有意な枯渇は観察されなかった。
次に、循環ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞でのＰＤ－１の発現を、インビボでのＴ細胞枯渇を評価するための代用マーカーとして探索した。このために、ＰＤ－１発現を、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与前＋投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与前＋投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与前＋投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与前＋投与後４時間）、ｄ２５、ｄ２９、ｄ３２、及びｄ３６に血中のフローサイトメトリーを使用してＰＢＭＣ中で測定した。
結果を図６１に示す。ＰＤ－１発現は、参照化合物ＭＧＤ００６（陽性対照）で処置した動物における大部分のＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞で強く増加し、投与終了後のＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のおよそ半分に留まった。対照的に、ＰＤ－１発現は、投与サイクルを通してＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドでの又は無関係の／ＴＣＲポリペプチドでの処置時にベースラインのままであった。
安全性を、テスト日－７、ｄ－４、ｄ１（投与後４時間）、ｄ４、ｄ８（投与後４時間）、ｄ１１、ｄ１５（投与後４時間）、ｄ１８、ｄ２２（投与後４時間）、及びｄ２５に血清中のサイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＩＦＮ－γ）の評価により評価した。
以下のサイトカインのレベルはアッセイの検出限界未満のままであった：ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、及びＩＦＮ－γ。インターロイキン－６は、最初の投与サイクルの開始時に陽性対照群において低濃度で検出された。この増加は一過性のもので、１頭の動物においてだけであった。ＣＤ１２３／ＴＣＲポリペプチドで処置した群では、１頭の動物が投与前に検出可能なＩＬ－６濃度を示し、１頭の動物が２回目の投与サイクルの開始時に一過性の小さな増加を示し、操作上のストレスを示唆している。無関係の／ＴＣＲポリペプチドで処置した群では、１頭の動物が３回目の投与サイクルにおいてＩＬ－６の一過性の小さな増加を示し、再び、操作上のストレスを示唆している。ＩＬ－６測定からの結果を図６２に示す。
Figure 0007222888000058
Figure 0007222888000059

Figure 0007222888000060

Figure 0007222888000061

Figure 0007222888000062

Figure 0007222888000063

Figure 0007222888000064
Figure 0007222888000065
Figure 0007222888000066
Figure 0007222888000067
Figure 0007222888000068

Figure 0007222888000069

Figure 0007222888000070

Figure 0007222888000071

Figure 0007222888000072

Figure 0007222888000073

Figure 0007222888000074
Figure 0007222888000075
Figure 0007222888000076

Figure 0007222888000077

Figure 0007222888000078

Figure 0007222888000079

Figure 0007222888000080
Figure 0007222888000081

Figure 0007222888000082

Claims (12)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）及びＣＤ１２３に特異的に結合する１つ以上のＩＳＶを含む、ＣＤ１２３発現細胞の死滅のためにＴ細胞をリダイレクトさせるポリペプチドであって、ＴＣＲに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、それにおいて：
    ポリペプチドが、配列番号４７、４９、５２、５３、５５、５６、及び５８～６１からなる群より選択される、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドを含み、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含む構築物であって、
    １つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位が、請求項１に記載の対応するポリペプチドと比較し、増加した半減期を伴う構築物を提供する、構築物。
  3. １つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位が、１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されている、請求項２に記載の構築物。
  4. 増加した半減期を伴う構築物を提供する１つ以上の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミンなど）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧなど）に結合することができる結合単位からなる群より選択される、請求項２又は３に記載の構築物。
  5. 構築物が、配列番号６４～６７からなる群より選択される、請求項２又は３に記載の構築物。
  6. 請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２～４のいずれかに記載の構築物をコードする核酸であって、前記ポリペプチド又は構築物をコードする核酸の発現によりそれを得ることができる、核酸。
  7. 核酸が、遺伝子構築物の形態である、請求項６に記載の核酸。
  8. 請求項６記載の核酸又は請求項７記載の遺伝子構築物、又は請求項６記載の核酸及び／又は遺伝子構築物を含む発現ベクターを含む宿主又は宿主細胞。
  9. 請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２～４のいずれかに記載の構築物の産生のための方法であって、前記ポリペプチド又は構築物はそれをコードする核酸の発現により得ることができ、少なくとも以下の工程：
    ａ）適切な宿主細胞もしくは宿主生物又は別の適切な発現系において請求項６又は７記載の核酸を発現させること；場合により以下が続く
    ｂ）請求項１に記載のポリペプチド又は請求項２～４のいずれかに記載の構築物を単離及び／又は精製すること、
    を含む方法。
  10. 請求項１に記載の少なくとも１つのポリペプチド、又は請求項２～４のいずれかに記載の構築物、又は請求項６又は７記載の核酸を含む組成物。
  11. 医薬としての使用のための、請求項１に記載のポリペプチド、請求項２～４のいずれかに記載の構築物、又は請求項１０に記載の組成物。
  12. ＣＤ１２３関連疾患又は状態の予防、処置、及び／又は寛解における使用のための、請求項１に記載のポリペプチド、請求項２～４のいずれかに記載の構築物、又は請求項１０に記載の組成物。
JP2019526298A 2016-11-16 2017-11-16 Ｃｄ１２３及びｔｃｒアルファ／ベータに結合することが可能なｔ細胞動員ポリペプチド Active JP7222888B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662422770P 2016-11-16 2016-11-16
US62/422,770 2016-11-16
US201762557208P 2017-09-12 2017-09-12
US62/557,208 2017-09-12
PCT/EP2017/079507 WO2018091606A1 (en) 2016-11-16 2017-11-16 T cell recruiting polypeptides capable of binding cd123 and tcr alpha/beta

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2020500510A JP2020500510A (ja) 2020-01-16
JP2020500510A5 JP2020500510A5 (ja) 2020-12-24
JP7222888B2 true JP7222888B2 (ja) 2023-02-15

Family

ID=60543514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019526298A Active JP7222888B2 (ja) 2016-11-16 2017-11-16 Ｃｄ１２３及びｔｃｒアルファ／ベータに結合することが可能なｔ細胞動員ポリペプチド

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11840569B2 (ja)
EP (1) EP3541846A1 (ja)
JP (1) JP7222888B2 (ja)
KR (2) KR102665596B1 (ja)
CN (2) CN117700549A (ja)
AU (2) AU2017361846B2 (ja)
BR (1) BR112019010061A2 (ja)
CA (1) CA3043515A1 (ja)
IL (2) IL266506B2 (ja)
MX (2) MX2019005696A (ja)
WO (1) WO2018091606A1 (ja)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS66859B1 (sr) * 2015-05-13 2025-06-30 Ablynx Nv Polipeptidi koji regrutuju t-ćelije na bazi tcr-alfa/beta reaktivnosti
CN121021694A (zh) 2019-05-04 2025-11-28 印希比生物科学有限公司 结合cd123的多肽及其用途
CN110804096B (zh) * 2019-11-21 2021-07-06 深圳普瑞金生物药业有限公司 Cd123单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒
CA3163910A1 (en) * 2019-12-09 2021-06-17 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting il-13 and tslp
AR120698A1 (es) 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp
CN111732635B (zh) * 2020-06-22 2022-03-22 中国医学科学院基础医学研究所 与cd123蛋白特异性结合的多肽、多肽复合物、共递送系统及其制备方法与应用
CN112480258B (zh) * 2020-12-11 2022-07-29 华道(上海)生物医药有限公司 抗cd123纳米抗体及其应用
IL303783A (en) 2020-12-18 2023-08-01 Sanofi Sa Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting glypican-3 and t cell receptor
EP4263610A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity
JP2024509027A (ja) * 2020-12-18 2024-02-29 アブリンクス エン．ヴェー． Ｔｃｒアルファ／ベータの反応性に基づくｔ細胞動員ポリペプチド
AU2022221633A1 (en) * 2021-02-17 2023-08-10 Igm Biosciences, Inc. Anti-cd123 binding molecules and uses thereof
US12162940B2 (en) 2021-05-05 2024-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh BMA031 antigen binding polypeptides
KR20240122867A (ko) 2021-12-17 2024-08-13 아블린쓰 TCRαβ, CD33, 및 CD123을 표적화하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드
US20240109965A1 (en) 2022-06-14 2024-04-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor
US20240415974A1 (en) 2022-12-23 2024-12-19 Ablynx N.V. Protein-based conjugation carriers
AU2024221136A1 (en) 2023-02-17 2025-10-02 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor
US20260007757A1 (en) 2024-06-18 2026-01-08 Ablynx Nv Antibody-recruiting molecules

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173820A2 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)
WO2016028896A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
WO2016116626A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Sanofi Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB335768A (en) 1929-10-24 1930-10-02 Jacoviac Maurice Improvements in protecting devices for gramophone disc records
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
ATE348175T1 (de) 1992-07-17 2007-01-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Method eder intrazellularen bindung von zielgerichteten molekülen
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
AU6796094A (en) 1993-04-29 1994-11-21 Raymond Hamers Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of (camelidae)
WO1994029457A2 (en) 1993-06-09 1994-12-22 Unilever N.V. Process for producing fusion proteins comprising scfv fragments by a transformed mould
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
US6091639A (en) 1993-08-27 2000-07-18 Kabushiki Kaisha Toshiba Non-volatile semiconductor memory device and data programming method
WO1995007463A1 (en) 1993-09-10 1995-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
CA2183667A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Wayne A. Marasco Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US5693492A (en) 1995-05-05 1997-12-02 Merck & Co., Inc. DNA encoding glutamate gated chloride channels
ES2139329T3 (es) 1995-09-22 2000-02-01 Bioimage A S Nuevas variantes de la proteina fluorescente verde, gfp.
US6027881A (en) 1996-05-08 2000-02-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence
DE69738166T2 (de) 1996-06-27 2008-06-19 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Antikörpermoleküle, die spezifisch mit dem aktiven Zentrum oder dem aktiven Spalt eines Zielmoleküls interagieren
US6124128A (en) 1996-08-16 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Long wavelength engineered fluorescent proteins
WO1998021355A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 Life Technologies, Inc. Mutants of green fluorescent protein
EP1027073A2 (en) 1996-11-19 2000-08-16 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
AU2152299A (en) 1997-10-27 1999-05-24 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins
BR9907241A (pt) 1998-01-26 2000-10-17 Unilever Nv Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo
US20020155604A1 (en) 1998-02-19 2002-10-24 Jeffrey A. Ledbetter Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
TR200003087T2 (tr) 1998-04-21 2001-02-21 Micromet Ag Yeni CD19 X CD3 Spesifik polipeptidler ve kullanımları
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
BR9916765A (pt) 1999-01-05 2001-09-25 Unilever Nv Processo para produzir um material imunoadsorvente, uso de uma proteìna que é ligada por meio de uma ligação covalente a um fragmento de anticorpo, material imunadsorvente, uso de um material, e, kit de teste diagnóstico
EP1144616B2 (en) 1999-01-19 2009-01-14 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
JP2002535993A (ja) 1999-02-05 2002-10-29 リイクスニフェルシタイト ライデン 組換え体細胞における代謝物の生合成を変調する方法
DE1100895T1 (de) 1999-03-15 2001-09-06 The University Of British Columbia, Vancouver Abc1 polypeptide und verfahren und reagenzien zur modulation des cholesterolgehalts
BR0009866A (pt) 1999-04-22 2002-01-08 Unilever Nv Método de inibição de infecção viral, uso de uma proteìna de ligação de antìgeno monovalente, produto alimentìcio, composição farmacêutica ou cosmética, proteìna de ligação de antìgeno monovalente, sequência de nucleotìdeos, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos de seleção e de indentificação de uma proteìna de ligação de antìgeno
JP2003508031A (ja) 1999-06-18 2003-03-04 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａｔｐ結合カセット輸送体蛋白質ａｂｃ１を用いるコレステロール流出を増加させｈｄｌを上昇させるための組成物および方法
EP1198572A2 (en) 1999-08-02 2002-04-24 Keygene N.V. Method for generating cgmmv resistant plants, genetic constructs, and obtained cgmmv-resistant plants
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
WO2001044301A1 (en) 1999-11-29 2001-06-21 Unilever Plc Immobilized single domain antigen-binding molecules
DE60031441T2 (de) 1999-11-29 2007-08-30 Unilever N.V. Immobilisierung von proteinen mit hilfe eines polypeptidsegments
ATE422369T1 (de) 1999-12-24 2009-02-15 Genentech Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verlängerung der entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen verbindungen
ATE428733T1 (de) 2000-03-14 2009-05-15 Unilever Nv Variabele domänen der schweren kette eines antikörpers gegen menschliche ernährungslipasen und deren verwendungen
US20030190598A1 (en) 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6741957B1 (en) 2000-07-21 2004-05-25 Daimlerchrysler Corporation Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis
AU2002229639A1 (en) 2000-12-13 2002-06-24 De Haard, Johannes Joseph Wilhelmus Camelidae antibody arrays
WO2002056910A1 (en) 2001-01-17 2002-07-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002335930B2 (en) 2001-03-09 2005-07-28 Morphosys Ag Serum albumin binding moieties
WO2004081026A2 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
JP2004538324A (ja) 2001-08-03 2004-12-24 メディカル リサーチ カウンシル 細胞内抗体
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
KR100599789B1 (ko) 2001-12-03 2006-07-12 삼성에스디아이 주식회사 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법
US20050214857A1 (en) 2001-12-11 2005-09-29 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
AU2002360068B2 (en) 2001-12-21 2009-09-03 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Method for cloning of variable domain sequences
CA2471645A1 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
AU2003244817B2 (en) 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
CA2497172A1 (en) 2002-09-10 2004-03-25 Acres Gaming Incorporated Method and device for collecting and reporting data
US7004940B2 (en) 2002-10-10 2006-02-28 Ethicon, Inc. Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers
AU2003284891A1 (en) 2002-10-23 2004-05-13 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and a33-like 3 dna, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
EP2284192A3 (en) 2002-11-08 2011-07-20 Ablynx N.V. Camelidae antibodies for sublingual administration
AU2003283137B8 (en) 2002-11-08 2010-07-29 Ablynx N.V. Camelidae antibodies against immunoglobulin E and use thereof for the treatment of allergic disorders
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
DE60329627D1 (de) 2002-12-31 2009-11-19 Nektar Therapeutics Al Corp Hydrolysestabile maleimidendgruppen-enthaltende polymere
MXPA05006043A (es) 2003-01-10 2006-01-30 Ablynx Nv Polipeptidos terapeuticos, homologos de los mismos, fragmentos de los mismos y para uso al modular la agregacion mediada de plaquetas.
US7461263B2 (en) 2003-01-23 2008-12-02 Unspam, Llc. Method and apparatus for a non-revealing do-not-contact list system
JP2007521234A (ja) 2003-08-12 2007-08-02 ウィリアム エム ヤーブロー 尋常性ざ瘡の治療薬及び使用方法
AU2003283136A1 (en) 2003-11-07 2005-05-26 Ablynx N.V. Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
US7207410B2 (en) 2004-04-29 2007-04-24 Daimlerchrysler Corporation Apparatus and method for enhanced impact sensing
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
KR20070084170A (ko) 2004-10-13 2007-08-24 아블린쓰 엔.브이. 알쯔하이머병 등의 퇴행성 신경 질환의 치료 및 진단을위한 단일 도메인 카멜리드 항-아밀로이드 베타 항체 및이를 포함하는 폴리펩타이드
EP1844073A1 (en) 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
LT2949668T (lt) 2005-05-18 2019-11-11 Ablynx Nv Pagerinti nanokūnai tm prieš navikų nekrozės faktorių alfa
TR201815552T4 (tr) 2005-05-20 2018-11-21 Ablynx Nv Agregasyon ile ilgili hastalıkların tedavisine yönelik iyileştirilmiş nanoantikorlar (TM).
WO2008020079A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
EP2069402A2 (en) 2006-09-08 2009-06-17 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
CA2666511A1 (en) 2006-10-11 2008-04-17 Ablynx N.V. Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the ph, compounds comprising the same, and uses thereof
AU2007328900A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
CA2678218A1 (en) 2007-02-21 2008-08-28 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
WO2008142164A2 (en) 2007-05-24 2008-11-27 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
MX2010008578A (es) 2008-02-08 2010-11-10 Medimmune Llc Anticuerpos anti-receptor 1 de interferon alfa con afinidad reducida al ligando fc.
JP2011516603A (ja) 2008-04-17 2011-05-26 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合することが可能なペプチド、並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
JP5647222B2 (ja) 2009-04-10 2014-12-24 アブリンクス エン．ヴェー． Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
AU2010243551B2 (en) 2009-04-30 2015-03-26 Ablynx Nv Method for the production of domain antibodies
EP2451839B1 (en) 2009-07-10 2020-04-22 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
JP2013518853A (ja) 2010-02-05 2013-05-23 アブリンクス エン．ヴェー． 血清アルブミンと結合することが可能なペプチド並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
NO2632946T3 (ja) 2010-10-29 2018-05-05
EP2640750A1 (en) * 2010-11-16 2013-09-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
PH12013502669B1 (en) 2011-06-23 2018-08-10 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
AU2012271974B2 (en) 2011-06-23 2017-01-12 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
US9657105B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
CN115160441A (zh) * 2013-09-26 2022-10-11 埃博灵克斯股份有限公司 双特异性纳米抗体
RU2746738C2 (ru) 2014-05-16 2021-04-20 Аблинкс Нв Улучшенные вариабельные домены иммуноглобулина
RS66859B1 (sr) 2015-05-13 2025-06-30 Ablynx Nv Polipeptidi koji regrutuju t-ćelije na bazi tcr-alfa/beta reaktivnosti
CN108473564B (zh) 2015-11-18 2022-04-08 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173820A2 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)
WO2016028896A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
WO2016116626A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Sanofi Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHU-RU KUO，PROTEIN ENGINEERING, DESIGN AND SELECTION，英国，OXFORD JOURNAL，2012年10月，VOL:25, NR:10，PAGE(S):561 - 569，http://dx.doi.org/10.1093/protein/gzs040

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024227463A1 (en) 2024-11-28
RU2019118441A3 (ja) 2021-03-15
KR102665596B1 (ko) 2024-05-14
EP3541846A1 (en) 2019-09-25
IL266506A (en) 2019-07-31
IL266506B1 (en) 2025-01-01
US20240199740A1 (en) 2024-06-20
IL266506B2 (en) 2025-05-01
RU2019118441A (ru) 2020-12-17
AU2017361846B2 (en) 2024-08-22
JP2020500510A (ja) 2020-01-16
US20200157216A1 (en) 2020-05-21
KR20190080934A (ko) 2019-07-08
MX2024004265A (es) 2024-04-25
MX2019005696A (es) 2019-08-14
US11840569B2 (en) 2023-12-12
BR112019010061A2 (pt) 2019-08-13
CA3043515A1 (en) 2018-05-24
WO2018091606A1 (en) 2018-05-24
CN110177809B (zh) 2023-11-03
CN117700549A (zh) 2024-03-15
IL317416A (en) 2025-02-01
CN110177809A (zh) 2019-08-27
KR20240076829A (ko) 2024-05-30
AU2017361846A1 (en) 2019-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7222888B2 (ja) Ｃｄ１２３及びｔｃｒアルファ／ベータに結合することが可能なｔ細胞動員ポリペプチド
US11919966B2 (en) Methods for inhibiting tumor growth or treating cancer by administering an immunoglobulin single variable domain that binds glucocorticoid-induced TNFR family-related receptor (GITR)
JP7366865B2 (ja) Ｋｖ１．３結合免疫グロブリン
TWI778943B (zh) 抗tigit抗原結合蛋白及其使用方法
JP6159684B2 (ja) Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
US20240092919A1 (en) T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity
KR20200123164A (ko) Lag3 및 pd1에 결합하는 치료 분자
KR20200021069A (ko) Cd38 조정 항체
CN113811545A (zh) 对btn2具有特异性的抗体及其用途
RU2775063C2 (ru) Рекрутирующие т-клетки полипептиды, способные связывать cd123 и tcr альфа/бета
BR122025017402A2 (pt) Polipeptídeos de recrutamento de células t capazes de se ligarem ao cd123 e tcr alfa/beta
BR122024012205A2 (pt) Polipeptídeos de recrutamento de células t capazes de se ligarem ao cd123 e tcr alfa/beta
TW202528358A (zh) 利用結合至epcam及cd137之藥劑與pd-1軸結合拮抗劑組合的治療方法
JP2024509027A (ja) Ｔｃｒアルファ／ベータの反応性に基づくｔ細胞動員ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201111

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20201111

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211109

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220128

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220408

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220509

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220802

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221202

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20221202

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20221208

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20221213

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230110

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230203

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7222888

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250