JP7299765B2

JP7299765B2 - マイクロｒｎａ測定方法およびキット

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Publication number: JP7299765B2
Application number: JP2019111432A
Authority: JP
Inventors: 幸二橋本; 美雅稲田; 桂子伊藤
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2023-06-28
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: US20210189504A1; JP2020202768A; EP3983564A1; WO2020250502A1; CN112639135A

Description

本発明の実施形態は、マイクロＲＮＡの測定方法およびキットに関する。

がんの検査には、様々な手法が用いられる。具体的な手法としては、Ｘ線検査、超音波検査など、がんを体外から画像として捉える方法、採取した試料中にがん細胞があるかどうかを顕微鏡で観察する方法（細胞診）、血液中の腫瘍マーカーの量を調べる方法などが挙げられる。画像診断では、がんがある程度の大きさにならないと見つけることができない、他の臓器等に隠れたがんは見つけられない、がん周辺の性質によりがんが像として映りにくいなどの理由から、がんの早期発見が難しい場合がある。また、がんごとに検査法が異なるため、被検者は検査項目ごとに別の検査を受けなければならない。細胞診は、試料が容易に採取できるがんに限られ、内視鏡採取や穿刺ができるがんも対象になるものの、相応する医療機器のある施設で技術を持った医療者が実施する必要があり、かつ、被検者には少なからず苦痛が伴う。腫瘍マーカーの場合は、血液という容易に採取できる試料が用いられるものの、早期がんを検出できない、進行がんでも高値にならない場合がある、がん以外の疾患で高値となる場合がある、といった課題がある。

一方、近年、１７～２５塩基程度の一本鎖核酸であるマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等とも表記される）と、がんや種々の疾患との関係が注目されている。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節する機能を持つことがわかっており、種々の疾患でその種類や発現量が初期の段階から変化していると報告されている。すなわち、がん患者では、特定のｍｉＲＮＡ量が、健常者と比較して増加または減少しており、被検者から採取された試料中の該当するｍｉＲＮＡの量を調べることが、がんかどうかを知る手段となるのである。ｍｉＲＮＡは、組織などの体内から採取する試料だけでなく、体外に排出される尿や、容易に採取できる血清、唾液といった体液中にも存在している。したがって、これら容易に採取できる３種類の体液試料を用いて、がんになると量が変動するｍｉＲＮＡを検査のマーカーとすることにより、がん検査が飛躍的に容易になる。さらに、がんの種類によらず変化するマーカーであれば、すべてのがんを対象に、１回の検査でがんか否かを調べることができる。健康診断、人間ドック等で、簡便・安価に早期段階のがんを見つけることができれば、被検者へのメリットだけでなく、医療費削減に多大な効果をもたらす。

特許第６０３９６５６号公報

ＳｕＹＹ，ＳｕｎＬ，ＧｕｏＺＲ，ＬｉＪＣ，ＢａｉＴＴ，ＣａｉＸＸ，ＬｉＷＨ，ＺｈｕＹＦ．ＪＯｖａｒｉａｎＲｅｓ．２０１９Ｊａｎ２２；１２（１）：６．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０４８－０１８－０４７７－ｘ．ＹｅｒｕｋａｌａＳａｔｈｉｐａｔｉＳ，ＨｏＳＹ．ＳｃｉＲｅｐ．２０１８Ｏｃｔ３１；８（１）：１６１３８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－３４６０４－３．

本発明の実施形態は、ｍｉＲＮＡをマーカーとしてがん診断の指標を提供する方法およびそのためのキットを提供する。

本発明の実施形態によれば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡががん診断のマーカーとして用いられる。

健常者および各種がん患者から得られた血清中のｍｉＲＮＡ（配列番号１）の量を、ＰＣＲ法を用いて測定した結果を示すグラフである。健常者および各種がん患者から得られた血清中のｍｉＲＮＡ（配列番号１）の量を、ＬＡＭＰ法を用いて測定した結果を示すグラフである。

本発明の実施形態によれば、生体試料中のｍｉＲＮＡをマーカーとして用いて健常者とがん患者を識別する方法およびそのためのアッセイキットが提供される。前記生体試料としては、採取が容易な体液を用いることが可能であり、例えば、尿、血清、唾液などの体液を用いることが可能である。本発明の実施形態においてマーカーとして用いられるｍｉＲＮＡは、ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG（配列番号１）のヌクレオチド配列を有するものであり、がん患者から得られた生体試料中の該ＲＮＡの含有量は、健常者から得られた生体試料中の該ＲＮＡの含有量に比べて多い。

本発明の一つの実施形態によれば、被検者におけるがんの診断のための指標を提供する（in vitro）方法、および被検者においてがんを診断する（in vitro）方法が提供され、これらの方法は、（ａ）前記被検者から得られた生体試料中の配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの量を測定する工程、および（ｂ）工程（ａ）で測定された測定値を、健常者から得られた同種の生体試料について同様に測定された前記ＲＮＡの量の測定値と比較する工程を含んでなる。これらの方法において、工程（ａ）において測定される被検者についての測定値が健常者についての測定値よりも高い場合には、該被検者ががんに罹患していることが示される。一方で、工程（ａ）において測定される被検者についての測定値が健常者についての測定値よりも低いか、またはこれと同等である場合には、該被検者ががんに罹患していないことが示される。

本発明の他の実施形態によれば、被検者におけるがんの診断のためのキットが提供され、このキットは、前記被検者から得られた生体試料中の配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの量を測定するための試薬を含んでなる。

本発明の実施形態では、被検者由来の生体試料における配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの定量値が、健常者由来の同種の生体試料における定量値と比較される。その結果、被検者についての定量値が健常者についての定量値よりも高い場合には、該被検者ががんに罹患していることが示される。一方で、被検者についての定量値が健常者についての定量値よりも低いか、またはこれと同等である場合には、該被検者ががんに罹患していないことが示される。

本発明の実施形態において、健常者は、がんに罹患していない者であり、好ましくはがんや悪性腫瘍を含む悪性新生物に罹患していない者である。また、本発明の実施形態において、健常者についての配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの定量値（該ＲＮＡの量の測定値）は、好ましくは複数の健常者についての定量値に基づいて定められる適正範囲の上限値とされる。このような適正範囲は、過去のデータに基づいて予め定めることも可能である。さらに、がん患者と健常者を切り分ける感度と特異度の観点から閾値を定めておき、被検者についての定量値がこの閾値よりも高い場合に健常者についての定量値よりも高いと判断し、この閾値よりも低い場合に健常者についての定量値よりも低いか、または同等であると判断することもできる。

本発明の実施形態において、診断の対象となる被検者は、好ましくはヒト被検者である。

本発明の実施形態において診断の対象となるがんの種類は特に制限されるものではなく、そのがんに罹患した患者において配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡが高発現するいかなるがんも対象となる。このようながんとしては、例えば、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、中皮腫、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、咽頭がん、上顎がん、口腔がん、舌がん、口唇がん、喉頭がん、甲状腺がん、脳腫瘍、神経腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞種、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、肉腫、子宮頸がん、子宮体がん、子宮肉腫、皮膚がん、悪性黒色腫、骨腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられ、好ましくは乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫からなる群から選択される少なくとも一種のがんが診断の対象とされる。

測定に用いられる生体試料は特に制限されるものではなく、被検者において発現したｍｉＲＮＡを検出しうるいかなる生体試料であってもよい。このような生体試料としては、例えば、血液、血清、血漿、白血球、尿、消化液、唾液、胃液、汗、涙、鼻水、精液、膣液、羊水、乳汁、リンパ液、組織、口腔内粘膜、喀痰などが挙げられ、好ましくは血清、尿、唾液などの体液試料、より好ましくは血清が用いられる。生体試料は、遠心、沈殿、抽出および／または分離などの処理を行い、核酸の増幅に適した状態にしてもよい。また、採取された生体試料がそのままで核酸の増幅に適した状態である場合には、採取された生体試料をそのまま検体として使用してもよい。

本発明の好ましい実施形態では、被検者から得られた生体試料から核酸の抽出処理が行われ、これを分析試料として配列番号１のｍｉＲＮＡの定量（量の測定）が行われる。核酸の抽出は、当業者に公知の方法によって容易に行うことができる。例えば、核酸の抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて簡便に行うことができ、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡＰｌａｓｍａ（タカラバイオ製）、Ｑｕｉｃｋ－ｃｆＲＮＡＳｅｒｕｍ＆ＰｌａｓｍａＫｉｔ（ザイモリサーチ製）、ｍｉＲＮｅａｓｙＳｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａキット（キアゲン製）、ｍｉＲＶａｎａＰＡＲＩＳｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ^ＴＭＴｏｔａｌＲＮＡＢｌｏｏｄＫｉｔ（サーモフィッシャー製）、Ｐｌａｓｍａ／ＳｅｒｕｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＮｏｒｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈ製)、ｍｉｃｒｏＲＮＡＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）ＳＰＫｉｔ(和光純薬製)、ＨｉｇｈＰｕｒｅｍｉＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（シグマアルドリッチ製）などを利用して実行することができる。また、市販のキットによらず、生体試料をバッファーで希釈した上で、８０～１００℃の加熱処理後に遠心分離して上清を得る、という簡便な方法を使うこともできる。

本発明の実施形態における配列番号１のｍｉＲＮＡの定量（量の測定）は、当業者に公知の方法によって容易に行うことができる。例えば、配列番号１のｍｉＲＮＡの定量は、核酸増幅法を用いて行うことができ、増幅の速度を指標としてｍｉＲＮＡの量を知ることができる。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などを挙げることができ、好ましくはＬＡＭＰ法を用いることができる。ＰＣＲ法を用いる場合には、増幅速度は、増副産物の量を示すシグナルが閾値に達するまでのサイクル数に相当するものとして測定することができる。また、ＬＡＭＰ法を用いる場合には、増幅速度は、増副産物の量を示すシグナルが閾値に達するまでの時間に相当するものとして測定することができる。ここで、増幅速度が速い場合には前記ｍｉＲＮＡの発現量が多く、増幅速度が遅い場合には前記ｍｉＲＮＡの発現量が少ないことが示される。

さらに、生体試料中の配列番号１のｍｉＲＮＡのコピー数を知るためには、例えば、前記ｍｉＲＮＡを既知のコピー数で含有する複数の試料を用意し、被検者からの生体試料と同様に処理して前記ｍｉＲＮＡの定量操作を行うことにより、検量線を作成することができる。被検者からの生体試料における測定値とこの検量線を比較することにより、生体試料に含まれる前記ｍｉＲＮＡのコピー数を知ることができる。

ＰＣＲ法によるｍｉＲＮＡの定量は、市販のキットを使用して容易に行うことができる。例えば、ｑＰＣＲ法を用いる場合、例えば、ＴａｑＭａｎＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡＡｓｓａｙｓ（サーモフィッシャー製、ＩＤ：４８３０３６＿ｍｉｒ）、ｍｉＲＣＵＲＹＬＮＡｍｉＲＮＡＰＣＲＡｓｓａｙｓ（キアゲン製、カタログＮｏ．ＹＰ０２１０３１３２）などを用いることができる。また、ｑＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎｑＰＣＲｍｉｃｒｏＲＮＡ検出システム（オリジンテクノロジーズ製）と特異的プライマーとを用いて実施することもできる。

前記ｍｉＲＮＡをＬＡＭＰ法で定量する場合、特開２０１９－０１７３８３号公報に記載される方法で長鎖化し、ＬＡＭＰ増幅することができる。すなわち、標的ｍｉＲＮＡにハイブリダイズする配列を３’末端に持ち、その５’側にＬＡＭＰ増幅用プライマー配列またはその相補鎖を持つ第一伸長用プライマーと、標的ｍｉＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列を３’末端に持ち、その５’側にＬＡＭＰ増幅用プライマー配列またはその相補鎖を持つ第二の伸長用プライマーとを用いて伸長産物を作製し、伸長用プライマーに含まれるＬＡＭＰプライマー配列を用いてＬＡＭＰ増幅する方法を用いることができる。その場合、第一の伸長用プライマーには配列番号２（CCAGTCCGCCACTGTACTCACGACC）のプライマーが、第二の伸長用プライマーには配列番号３（AGGGTTGGAGGTTCATGTCAAGGCCCAGTCTCACGTATTCCACTGACCACCAGTCGCACTGAGGGGACTCGGCGTGGCGT）のプライマーを用いることができ、ＬＡＭＰ増幅には、配列番号４（TGGAATACGTGAGACTGGGCCTTTTTTTTTAGGGTTGGAGGTTCATGTCA）および配列番号５（CTGACCACCAGTCGCACTGAGCCAGTCCGCCACTGTACT）のプライマーをそれぞれＦＩＰおよびＢＩＰプライマーとして用い、配列番号６（TGGCGTCGGTC）のプライマーをループプライマーとして用いることにより、好適に増幅することができる。さらに、ループプライマーとしては配列番号７（CGTCGGTCGTGAG）のプライマーを用いることも可能である。

本発明の実施形態のキットは、前記ｍｉＲＮＡの量を測定するための試薬として、上記のようなプライマーや試薬を含むことができる。特に、ＬＡＭＰ法を用いて前記ｍｉＲＮＡを定量する場合には、本発明の実施形態のキットは、配列番号２～６で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセット、または配列番号２～５および７で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを含むことが好ましい。さらに、本発明の実施形態のキットは、ｄＮＴＰ、逆転写酵素、耐熱性ポリメラーゼなどの試薬を適宜含むことができる。

さらに、上記のプライマーセットを用いた前記ｍｉＲＮＡの定量法は、新規な方法であり、よって、本発明の一つの実施形態をなす。従って、本発明の一つの実施形態によれば、生体試料中の配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの量を測定する方法が提供され、この方法は、配列番号２～６で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセット、または配列番号２～５および７で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により核酸増幅を行うことを含んでなる。また、本発明の他の実施形態によれば、生体試料中の配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの量を測定するためのキットが提供され、このキットは、配列番号２～６で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセット、または配列番号２～５および７で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを含んでなる。このキットは、ＬＡＭＰ法に用いられる他の試薬を含むこともできる。

本発明の実施形態によれば、被検者ががんに罹患しているか否かを判別することが可能となる。ｍｉＲＮＡをマーカーとして用いたがんに関連する診断には様々な診断があり、例えば、特定のがんのステージを予測するための診断や、がんの再発の予測や予後予測のための診断なども知られているが、本発明の実施形態による診断はこれらとは異なる。また、本発明の実施形態によれば、単独の特定のがんではなく、がん全般、特に複数種のがんの診断が可能とされ、これは、年に一度の健康診断などにおいて、広い範囲のがんの一次スクリーニングに特に適しているということができる。

上述した実施形態は例示であり、発明の範囲はそれらに限定されない。

以下の実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、検査の精度を示す「感度」、「特異度」および「ＡＵＣ」は次の意味を有する。「感度」は、検査値がある閾値を超えたときに陽性と判断する場合に、疾患群の検査値のうち、閾値を超える検査値の割合を０～１の数値で表したものである。よって、感度が１に近いほど、偽陰性が少ないことが示される。「特異度」は、検査値がある閾値を超えたときに陽性と判断する場合に、健常群の検査値のうち、閾値以下の検査値の割合を０～１の数値で表したものである。よって、特異度が１に近いほど、偽陽性が少ないことが示される。最後に、「ＡＵＣ」は、感度を縦軸（０～１）とし、（１－特異度）を横軸（０～１）とし、閾値を連続的に変化させていったときのＲＯＣ曲線を作成したときの、その曲線の下の面積である。ＡＵＣが１に近い（つまり曲線が左上角に近い）ほど、その診断方法の診断能力が高いことが示される。逆に、ＡＵＣが０．５に近い（つまり曲線が対角線に近い）ほど、その診断方法の診断能力が低いことが示される。

実施例１：ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲＮＡの定量
本実施例では、ｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、健常者血清およびがん患者血清中の配列番号１のｍｉＲＮＡの定量を行った。

検体数は、健常者１６検体、がん患者９４検体であり、がん患者検体の内訳は、乳がん２２、大腸がん６、胃がん６、肺がん３、卵巣がん６、膵臓がん６、胆管がん５、食道がん５、肝臓がん５、脳腫瘍５、膀胱がん５、前立腺がん５、肉腫５、子宮体がん５、および子宮肉腫５であった。すべての血清は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡＰｌａｓｍａ（タカラバイオ）を用いて抽出した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡＡｓｓａｙ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）の取扱説明書にしたがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）でｃＤＮＡ合成した。続いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、および、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡｄｖａｎｃｅｄｍｉＲＮＡＡｓｓａｙＩＤ：４８３０３６＿ｍｉｒを用いてＴａｑＭａｎＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。サンプルとともに配列番号１の合成ＲＮＡの１０^３，１０^４，１０^５,１０^６コピー／μＬを用いて同様に反応させ、検量線を作成した。１０^２コピー／μＬでは検出下限以下であった。

結果を以下の表１に示す。

定量の結果、健常者では、検出下限以下が４検体あった。また、検出できた健常者検体の多くは検量線下限の１０^３コピー／μＬを下回っており、検量線を延長して算出した推定値として１０^２コピー／μＬオーダーであった。一方、がん患者では、がんの種類によらず、１０^３コピー／μＬを超えるものが多数であった。１１０検体の定量結果を箱ひげ図で示した（図１）。縦軸は、抽出液１μＬあたりのコピー数を底１０の対数で示している。がん患者は健常者より高い値に分布することが示された。閾値を１０^３コピー／μＬとしたときの健常者とがん患者を切り分ける感度は０．８３、特異度は０．９４、ＡＵＣ（ＡｒｅａＵｎｄｅｒＣｕｒｖｅ）は０．９５となり、配列番号１のｍｉＲＮＡは、がんであるかどうかを判定するためのマーカーとして高性能であることが示された。

実施例２：ＬＡＭＰ法によるｍｉＲＮＡの定量
本実施例では、ＬＡＭＰ法を用いて、健常者血清およびがん患者血清中の配列番号１のｍｉＲＮＡの定量を行った。

検体の内訳、抽出法は、実施例1と同じである。抽出サンプル２μＬを、反応体積２０μＬ、１６℃１０分、４２℃５分、８５℃５分の条件で逆転写した。逆転写反応液の組成は、６７unit ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（＊）、１ｘＲＴＢｕｆｆｅｒ（＊）、０．１ｍＭｄＮＴＰｓ（＊）、４ＵＲＮａｓｅＯＵＴ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、１０ｎＭＲＴプライマー（CCAGTCCGCCACTGTACTCACGACC：配列番号２）とした。＊はすべてＨｉｇｈ－ＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）に含まれているものを用いた。逆転写後の反応液に、長鎖化液５μＬを添加して、９５℃２分後、９５℃２０秒－５９℃３０秒－７２℃１０秒のサイクルを２０回かけて長鎖化を行った。添加する長鎖化液は、２５μＬ長鎖化反応液中に、０．５ＵＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニューイングランドバイオ）を含み、終濃度が、０．２ｘＴｈｅｒｍｏＰｏｌＢｕｆｆｅｒ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ付属）、０．２ｍＭＭｇＳＯ_４、０．１２ｍＭｄＮＴＰｓ、１０ｎＭＥＬプライマー（AGGGTTGGAGGTTCATGTCAAGGCCCAGTCTCACGTATTCCACTGACCACCAGTCGCACTGAGGGGACTCGGCGTGGCGT：配列番号３）となるよう調整した。次に、長鎖化した産物１μＬを、反応体積２５μＬ、６５℃６０分の条件でＬＡＭＰ増幅を行い蛍光強度の立上り時間を測定した。ＬＡＭＰ増幅液は、８ＵＴｉｎ（ｅｘｏ－）ＬＦＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．５μＬＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含み、終濃度がそれぞれ、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ（ＮＨ_４）ＳＯ_４、0.1% Ｔｗｅｅｎ－２０、０．８Ｍベタイン、１．４ｍＭｅａｃｈｄＮＴＰｓ、１．６μＭＦＩＰプライマー（TGGAATACGTGAGACTGGGCCTTTTTTTTTAGGGTTGGAGGTTCATGTCA：配列番号４）、１．６μＭＢＩＰプライマー（CTGACCACCAGTCGCACTGAGCCAGTCCGCCACTGTACT：配列番号５）、０．８μＭＬＢプライマー（TGGCGTCGGTC：配列番号６）となるよう調整した。リアルタイムＰＣＲ装置にて、経時的に蛍光強度を測定し、閾値を超える時間を測定した。サンプルとともに配列番号１の合成ＲＮＡの１０^２，１０^３，１０^４，１０^５コピー／μＬを用いて同様に反応させ、検量線を作成した。

結果を以下の表２に示す。

定量の結果、健常者は１０^２～３コピー／μＬオーダー、がん患者はがん種によらず、１０^３～４コピー／μＬオーダーの分布であった。１１０検体の定量結果を箱ひげ図で示した（図２）。がん患者は健常者より高い値に分布することが示された。閾値を１０^３コピー／μＬとしたときの健常者とがん患者を切り分ける感度は０．９５、特異度は１．００、ＡＵＣは０．９９となり、配列番号１のｍｉＲＮＡは、がんであるかどうかを判定するためのマーカーとして高性能であることが示された。

実施例３：配列番号６のループプライマーに代えて配列番号７のループプライマーを用いた場合の検討
実施例２において作製した合成ＲＮＡによる検量線用長鎖化産物を、配列番号６のＬＢに代えて、配列番号７（CGTCGGTCGTGAG）のＬＢで増幅したところ、同様の検量線が得られた。よって、配列番号７のＬＢは、本ＬＡＭＰ増幅系において有効であることが示された。

Claims

被検者におけるがんの診断のための指標を提供する方法であって、
（ａ）前記被検者から得られた生体試料中の配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの量を測定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で測定された測定値を、健常者から得られた同種の生体試料について同様に測定された前記ＲＮＡの量の測定値と比較する工程
を含んでなり、
前記がんが、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫であり、
工程（ａ）において測定される被検者についての測定値が健常者についての測定値よりも高い場合には、該被検者が乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫の全てについて、罹患している可能性があることが示され、
工程（ａ）において測定される被検者についての測定値が健常者についての測定値よりも低いか、またはこれと同等である場合には、該被検者が乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫のいずれにも罹患していないことが示され、
前記生体試料が血液、血清または血漿である、方法。
生体試料が血清である、請求項１に記載の方法。
健常者についての測定値が、複数の健常者についての定量値に基づいて定められる適正範囲の上限値である、請求項１または２に記載の方法。
生体試料中の前記ＲＮＡの量の測定が、核酸増幅法を用いて行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸増幅法がＰＣＲ法である、請求項４に記載の方法。
前記核酸増幅法がＬＡＭＰ法である、請求項４に記載の方法。
前記ＬＡＭＰ法が、配列番号２～６で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを用いて行われる、請求項６に記載の方法。
前記ＬＡＭＰ法が、配列番号２～５および７で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを用いて行われる、請求項６に記載の方法。
前記ＲＮＡを既知のコピー数で含有する複数の試料に基づいて作成された検量線を用いることにより、生体試料中の前記ＲＮＡのコピー数が決定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
被検者におけるがんの診断のためのキットであって、前記被検者から得られた生体試料中の配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡの量を測定するための試薬を含んでなり、前記がんが、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫であり、
測定される被検者についての測定値が健常者についての測定値よりも高い場合には、該被検者が乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫の全てについて、罹患している可能性があることが示され、
測定される被検者についての測定値が健常者についての測定値よりも低いか、またはこれと同等である場合には、該被検者が乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がんおよび子宮肉腫のいずれにも罹患していないことが示され、
前記生体試料が血液、血清または血漿である、キット。
生体試料が血清である、請求項１０に記載のキット。
前記試薬が核酸増幅法のための試薬である、請求項１０または１１に記載のキット。
前記核酸増幅法がＰＣＲ法である、請求項１２に記載のキット。
前記核酸増幅法がＬＡＭＰ法である、請求項１２に記載のキット。
配列番号２～６で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを含む、請求項１４に記載のキット。
配列番号２～５および７で表されるヌクレオチド配列をそれぞれ有するプライマーで構成されるプライマーセットを含む、請求項１４に記載のキット。