JP7112736B2 - 半透膜及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、半透膜、細胞培養用デバイス、組織型チップ、器官型チップ、器官型チップシステム、前記細胞培養用デバイスを用いた細胞の培養方法、及び、前記細胞培養用デバイスを用いた細胞数の測定方法に関する。
本願は、２０１７年１月１８日に、日本に出願された特願２０１７－００６７４１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

創薬や動物実験代替法に関連する企業では、細胞バンク等から凍結細胞を購入後、継代培養して増殖した細胞を凍結保存するとともに、一部の細胞で培養モデルを作製して開発に必要な試験を実施している。つまり、開発に必要な試験を実施するまでに、莫大なコストと時間を消費している。さらに、単層培養の細胞ではなく、より生体に近しい「組織型培養モデル」が求められている。

「組織型培養モデル」に関連した技術としては、例えば、各種ゲル包埋培養技術、スフェロイド培養技術（例えば、特許文献１参照。）、及び各種チャンバー培養技術（例えば、特許文献２参照。）等が挙げられる。

一方、本発明者は、これまでに細胞外マトリックス成分を含有するハイドロゲル薄膜、及び該ハイドロゲル薄膜を備えるチャンバー等を開発してきた。例えば、特許文献３には細胞外マトリックス成分を含有するガラス化されたマトリックスゲル薄膜の水和物からなる薄膜、及び環状体又は網状体等の保持体と一体化したハイドロゲル薄膜が開示されている。

特開２０１２－６５５５５号公報 再公表ＷＯ２００８／１３００２５号公報 特開平８－２２８７６８号公報

特許文献１及び２に記載の「組織型培養モデル」に関連した従来技術は、いずれも培養操作が煩雑であり、組織型培養モデルの構築にコスト及び時間を要するのみならず、生産再現性が必ずしも良くないため、ロット間の差もある。さらに、スフェロイド培養技術等、細胞が露出された状態にある培養技術は、３次元組織を構成している個々の細胞の保護性能が必ずしも良くない。
また、上述の「組織型培養モデル」に関連した従来技術では、細胞を長期的に培養下で維持することが難しく、培養モデルを構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約がある。

また、特許文献３に記載の細胞外マトリックス成分を含有するハイドロゲル薄膜を備える細胞培養用デバイスでは、内部に液体を注入した際に膜がたわんでしまい、さらにハイドロゲル薄膜の部分をピンセット等で保持すると損傷してしまうという課題があった。また、ガーゼ等の保持体と一体化されたハイドロゲル薄膜を備える細胞培養用デバイスでは、薄膜が損傷しにくく適度な強度を有するが、ガーゼ等の保持体が吸水し膨張するため、膜がたわんでしまうという課題は残されていた。

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、たわみにくく、取扱いが容易な適度な強度を有する半透膜を提供する。また、細胞保護性能が優れるのみならず、取扱いも容易であって、細胞の長期間培養が可能であり、且つ、細胞数を計測可能な細胞培養用デバイスを提供する。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、格子状であって、低吸水性の半透膜を備えた細胞培養用デバイスを作製し、当該細胞培養用デバイスに細胞を注入し培養することで、膜がたわむことなく、ピンセットで保持可能であり、取り扱いが容易で、且つ、高機能な組織型チップが得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る半透膜は、液相中で半透性を有し、且つ、格子構造を有する低吸水性の保持体を含む。

上記第１態様に係る半透膜において、前記保持体の格子構造がマイクロメートル単位の目盛りとして機能してもよい。

上記第１態様に係る半透膜において、前記保持体がポリエステル又はポリスチレンからなってもよい。

上記第１態様に係る半透膜は、生体適合性を有する材料を含んでもよい。

上記第１態様に係る半透膜において、前記生体適合性を有する材料がゲル化する細胞外マトリックス由来成分であってもよい。

上記第１態様に係る半透膜において、前記ゲル化する細胞外マトリックス由来成分がネイティブコラーゲン、又はアテロコラーゲンであってもよい。

本発明の第２態様に係る細胞培養用デバイスは、上記第１態様に係る半透膜を少なくとも一部に備える。

上記第２態様に係る細胞培養用デバイスは、さらに、気相中で液密性を有してもよい。

上記第２態様に係る細胞培養用デバイスは、培養液に懸濁された細胞を注入可能であり、内部容積が１０ｍＬ以下であってもよい。

上記第２態様に係る細胞培養用デバイスは、全体が前記半透膜からなってもよい。

本発明の第３態様に係る組織型チップは、１種類の細胞を含む上記第２態様に係る細胞培養用デバイスを備える。

上記第３態様に係る組織型チップにおいて、前記細胞の密度が、２．０×１０^３細胞／ｍＬ以上１．０×１０^９細胞／ｍＬ以下であってもよい。

本発明の第４態様に係る器官型チップは、少なくとも２種類の細胞を含む上記第２態様に係る細胞培養用デバイスを備える。

上記第４態様に係る器官型チップにおいて、前記細胞の密度が、２．０×１０^３細胞／ｍＬ以上１．０×１０^９細胞／ｍＬ以下であってもよい。

本発明の第５態様に係るキットは、多細胞構造体を提供するためのキットであって、上記第３態様に係る組織型チップ又は上記第４態様に係る器官型チップと、培養液と、を含む開閉可能な密封容器を備える。

本発明の第６態様に係る器官型チップシステムは、上記第３態様に係る組織型チップ又は上記第４態様に係る器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ又は前記器官型チップが密閉性を保ちながら連結されている。

本発明の第７態様に係る細胞の培養方法は、上記第２態様に係る細胞培養用デバイスを用いる方法である。

本発明の第８態様に係る細胞数の測定方法は、上記第２態様に係る細胞培養用デバイスを用いる方法である。

上記態様の半透膜は、たわみにくく、取扱いが容易な適度な強度を有する。また、上記態様の細胞培養用デバイスは、細胞保護性能が優れるのみならず、取扱いも容易であって、細胞の長期間培養が可能であり、且つ、細胞数を計測可能である。

本発明の第１実施形態に係る半透膜を模式的に示す平面図である。 本発明の第１実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。 本発明の第２実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。 本発明の第３実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。 本発明の第４実施形態に係る細胞培養用デバイス（デバイス内部と外部とが注入孔を介して連通）を模式的に示す斜視図である。 本発明の第４実施形態に係る細胞培養用デバイス（デバイス内部と外部とが不通）を模式的に示す斜視図である。 本発明の第５実施形態に係る細胞培養用デバイス（デバイス内部と外部とが注入孔を介して連通）を模式的に示す断面図である。 本発明の第５実施形態に係る細胞培養用デバイス（デバイス内部と外部とが不通）を模式的に示す断面図である。 本発明の第６実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。 本発明の第１実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。 本発明の第２実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。 本発明の第３実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。 本発明の第４実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。 製造例１において作製された半透膜を示す画像である。 実施例１における保持体が包埋された半透膜を備える細胞培養用デバイスにＰＢＳを注入して、ピンセットで摘まんだ状態を示す画像である。 実施例１における保持体が包埋された半透膜を備える細胞培養用デバイスにＰＢＳを注入して、縦置きで静置した状態を示す画像である。 実施例１における保持体を含まない半透膜を備える細胞培養用デバイスにＰＢＳを注入して、ピンセットで摘まんだ状態を示す画像である。 実施例１における保持体を含まない半透膜を備える細胞培養用デバイスにＰＢＳを注入して、縦置きで静置した状態を示す画像である。 試験例１における培養１日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。 試験例１における培養２日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。 試験例１における培養４日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。 試験例１における培養７日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。 試験例１における培養１０日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。 試験例１における培養１４日目のＨｅｐＧ２細胞の様子を示す画像である。

以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。

≪半透膜≫
一実施形態において、本発明は、液相中で半透性を有し、且つ、格子構造を有する低吸水性の保持体を含む半透膜を提供する。

本実施形態の半透膜は、たわみにくく、取扱いが容易な適度な強度を有する。そのため、本実施形態の半透膜を備える細胞培養用デバイスは、膜がたわむことなく、さらにピンセットで摘まんでも破損することなく保持することができ、取扱いが容易である。

＜構造＞
［第１実施形態］
図１は、本発明の第１実施形態に係る半透膜を模式的に示す平面図である。
ここに示す半透膜１０は、格子構造を有する低吸水性の保持体１を含む。保持体１は、半透膜表面の少なくとも一部に接着していてもよく、半透膜内に少なくとも一部が包埋された状態であってもよい。

半透膜１０は、液相中で半透性を有する。
なお、本明細書において、「半透性」とは、一定の分子量以下の分子又はイオンのみを透過可能な性質を意味し、「半透膜」とは、当該性質を有する膜である。本実施形態の半透膜を備える細胞培養用デバイスにおいて、例えば、細胞を含む該細胞培養用デバイスを、培養液を含む容器内に浸した場合に、前記半透膜は、細胞を細胞培養用デバイスの外部に透過させず、一方、培養液に溶解している栄養分を細胞培養用デバイスの内部に透過させるとともに、細胞培養用デバイスの内部の培養液に溶解した老廃物を含む細胞生産物を細胞培養用デバイスの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞の長期間培養に用いることができる。
より具体的には、本実施形態の半透膜は、例えば、分子量約１００万以下の高分子化合物を透過することができるものとすることができ、例えば、分子量約２０万以下の分子化合物を透過することができるものとすることができる。

図１において、半透膜１０は円形であるものを示したが、その他の形状でもよく、例えば、多角形（正多角形等も含む）、楕円形、扇形等が挙げられ、これらに限定されない。

また、図１において、保持体１は正方形であるものを示したが、その他の形状でもよく、例えば、多角形（正多角形等も含む）、楕円形、扇形等が挙げられ、これらに限定されない。

＜構成材料＞
［保持体］
本実施形態における保持体は、格子状であって低吸水性であることが好ましい。

本明細書において、「格子状」とは、複数の縦の線と横の線とがそれぞれ垂直に交差した状態を意味する。本実施形態における保持体は、縦の線及び横の線がそれぞれマイクロメートル単位で等間隔に並んでいる部分を有することが好ましい。すなわち、本実施形態における保持体はマイクロメートル単位の目盛りとして機能することが好ましい。これにより、本実施形態の半透膜を備える細胞培養用デバイスにおいて、細胞を含む場合に、血球計算盤の代わりとして用いることができ、細胞培養用デバイス内に含まれる細胞数を容易に計測することができる。

格子を形成する縦の線及び横の線のそれぞれの間隔（すなわち、目開き）は、１００μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以上３００μｍ以下であることがより好ましい。

また、格子を形成する縦の線及び横の線の線径は、例えば０．１μｍ以上１００μｍ以下とすることができ、例えば１μｍ以上８０μｍ以下とすることができる。

また、本明細書における「低吸水性」とは、日本工業規格（ＪＩＳ Ｋ ７２０９）で測定される吸水率が低いことを意味する。具体的には、吸水率が１％未満であることが好ましい。

本実施形態における保持体の材料としては、プラスチックであって、繊維（糸）又はフィルムの加工により格子を形成でき、低吸水性及び適度な硬度を有し、且つ、細胞毒性が低いものを用いることができる。前記プラスチックとしては、例えば、ポリ塩化ビニル、スチレンコポリマー、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリカーボネート、ポリエステル（特に、ポリエチレンテレフタレート）、ユリア樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ポリアセタール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ四フッ化エチレン、ポリ二フッ化エチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン等が挙げられ、これらに限定されない。

前記ポリアクリレート（アクリル樹脂）としてより具体的には、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）等が挙げられる。

中でも、本実施形態における保持体の材料としては、製造コスト、及び本実施形態の半透膜は細胞を取り扱うために通常用いられることから、ポリエステル又はポリスチレンであることが好ましく、ポリエチレンテレフタレート又はポリスチレンであることがより好ましい。

保持体の製造方法としては、可塑性樹脂の繊維（糸）又はフィルムを用いて公知のメッシュの製造方法を用いて製造することができる。

具体的には、繊維（糸）を用いた保持体の製造方法としてより具体的には、まず、上述の材料からなる所望の線径である繊維（糸）を、機械等を用いて、格子状に編みこむことで製造することができる。このとき、縦の繊維（糸）と横の繊維（糸）との交点を熱又は圧力等を加えて融着させてもよい。交点を融着させることにより、段差のない平滑な保持体を得ることができる。

また、フィルムを用いた保持体の製造方法としてより具体的には、まず、上述の材料からなる所望の膜厚であるフィルムを、機械等を用いて、格子状に多孔を切削することで製造することができる。このとき、前記多孔の形状は均一で、マイクロメートル単位の目盛りとして機能するものであってよく、例えば、多角形（正方形を含む）、円形、楕円形等が挙げられ、これらに限定されない。

［その他］
本実施形態の半透膜において、保持体以外の構成材料としては、細胞毒性のないものを用いることができ、天然高分子化合物であってもよく、合成高分子化合物であってもよい。また、前記性質を有する材料としては、生体適合性を有する材料であることが好ましい。
なお、本明細書において、「生体適合性」とは、生体組織と材料との適合性を示す評価基準を意味し、「生体適合性を有する」とは、材料それ自体が毒性を有さず、内毒素等の微生物由来の成分を有さず、生体組織を物理的に刺激することなく、生体組織を構成するタンパク質や細胞等と相互作用しても拒絶されない状態を意味する。

生体適合性を有する天然高分子化合物としては、例えば、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、多糖類（例えば、アルギネート、セルロース、デキストラン、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、ポリヒアルロン酸、及びそれらの誘導体等）、キチン、ポリ（３－ヒドロキシアルカノエート）（特に、ポリ（β－ヒドロキブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシオクタノエート））、ポリ（３－ヒドロキシ脂肪酸）、フィブリン、寒天、アガロース等が挙げられ、これらに限定されない。

前記セルロースには、合成により改質されたものも含み、例えば、セルロース誘導体（例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、キトサン等）等が挙げられる。より具体的なセルロース誘導体としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルローススルフェートナトリウム塩等が挙げられる。

中でも、前記天然高分子化合物としては、優れた保水性を有することから、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、フィブリン、寒天、又はアガロースであることが好ましい。

ゲル化する細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択し半透膜を作製することが可能である。また、原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣した半透膜を得ることができる。

生体適合性を有する合成高分子化合物としては、例えば、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ無水物、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン等）、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール等）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド等）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリエチレンテレフタレート等）、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。

中でも、前記合成高分子化合物としては、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド－ｃｏ－（ε－カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリオルトエステル、又はコポリマーであることが好ましい。

本実施形態の半透膜において、保持体以外の構成材料としては、上記に例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。また、本実施形態における半透膜の材料は、天然高分子化合物、又は合成高分子化合物のうちいずれかで構成されていてもよく、天然高分子化合物及び合成高分子化合物の両方から構成されていてもよい。

また、半透膜が上記に例示された材料のうち２種類以上から構成されている場合、半透膜は、上記に例示された材料の混合物から構成されていてもよい。又は、半透膜は、１種類の材料からなる半透膜を２層以上積層してなり、各半透膜を構成する材料が互いに異なる膜から構成されていてもよい。

中でも、本実施形態の半透膜において、保持体以外の構成材料としては、天然高分子化合物が好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分がより好ましく、コラーゲンがさらに好ましい。また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン、又はアテロコラーゲンを例示できる。

本実施形態における半透膜の材料が、細胞外マトリックス由来成分である場合に、細胞外マトリックス由来成分を半透膜の単位面積１ｃｍ^２あたり０．１ｍｇ以上１０．０ｍｇ以下含有することが好ましく、０．５ｍｇ以上５．０ｍｇ以下含有することがより好ましい。特に、細胞外マトリックス由来成分がコラーゲンである場合、コラーゲンを半透膜の単位面積１ｃｍ^２あたり０．２ｍｇ以上１０．０ｍｇ以下含有することが好ましく、１ｃｍ^２あたり０．２５ｍｇ以上５．０ｍｇ以下含有することがより好ましい。

半透膜における細胞外マトリックス由来成分（特に、コラーゲン）の含有量が上記範囲であることにより、細胞を細胞培養用デバイス内に注入し、培養することが可能な強度とすることができる。

なお、「該膜の単位面積１ｃｍ^２あたりの重量」とは、膜の厚さを任意として、該材料片１ｃｍ^２あたりに含有される成分の重量を指す。

本実施形態における半透膜の厚さは特に制限されないが、１μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５００μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以上３００μｍ以下であることがさらに好ましく、１０μｍ以上２００μｍ以下であることが特に好ましい。半透膜の厚さが上記範囲であることにより、細胞を細胞培養用デバイス内に注入し、培養することが可能な強度とすることができる。

ここで、「半透膜の厚さ」とは、半透膜全体の厚さを意味し、例えば、複数層からなる半透膜の厚さとは、半透膜を構成するすべての層の合計の厚さを意味する。

また、本実施形態における半透膜は、使用時に破損することがなく、実用上大変優れるものである。

＜半透膜の製造方法＞
１．生体適合性を有する合成高分子化合物を用いた半透膜の製造方法
例えば、半透膜の構成材料が生体適合性を有する合成高分子化合物である場合は、公知の方法（例えば、特開２００１－１４９７６３号公報等参照。）を利用して、半透膜を製造することができる。

生体適合性を有する合成高分子化合物を用いた半透膜の製造方法としてより具体的には、まず、合成高分子化合物を有機溶剤中に溶解した製膜原液を調製する。

有機溶剤としては、合成高分子化合物に対する溶剤を用いることができ、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン等が挙げられ、これらに限定されない。

合成高分子化合物と有機溶剤との混合割合は、使用する合成高分子化合物及び有機溶剤の種類に応じて適宜調整することができ、例えば、合成高分子化合物１５重量％、有機溶剤８５重量％とすることができる。

また、溶解時における有機溶剤の温度は、通常３０℃以上１００℃以下とすることができ、５０℃以上８０℃以下であることが好ましい。

次いで、調製した製膜原液を例えばノズルから吐出させる方法等を用いて、凝固液中で凝固させ、所定の形状の半透膜を製造する。このとき、保持体を凝固液中に配置しておき、保持体を含むように、前記製膜原液を万遍なく吐出させることで半透膜を製造することができる。

前記凝固液としては、有機溶剤と水との混合液を用いることが好ましい。凝固液に用いる有機溶剤としては、合成高分子化合物の溶解に用いた有機溶剤として例示されたものと同様のものを用いることができる。なお、凝固液に用いる有機溶剤は、合成高分子化合物の溶解に用いた有機溶剤とは同じ種類であってもよく、異なる種類であってもよい。

また、凝固液中における水の割合は、例えば、３０重量％以上８０重量％以下とすることができる。

さらに、凝固速度を調整する目的で、凝固液中に、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセリン等のアルコール類やエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類を添加してもよい。

又は、所定の形状に凝固させた製膜２枚を用いて、保持体を挟みこみ、接着剤を用いて接着及び乾燥させることで、半透膜を製造してもよい。

前記接着剤としては、細胞毒性がないものを用いることができ、合成化合物の接着剤であってもよく、天然化合物の接着剤であってもよい。

合成化合物の接着剤としては、例えば、ウレタン系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、リン酸カルシウム系接着剤、レジン系セメント等が挙げられる。

天然化合物の接着剤としては、例えば、フィブリン糊、ゼラチン糊等が挙げられる。

得られた半透膜は、蒸留水等で洗浄し、さらに、紫外線照射等による滅菌を行い、使用することができる。

２．ハイドロゲルを用いた半透膜の製造方法
また、例えば、半透膜の構成材料がハイドロゲルである場合は、公知の方法（例えば、特開平８－２２８７６８号公報、国際公開第２０１２／０２６５３１号、特開２０１２－１１５２６２号公報、及び特開２０１５－３５９７８号公報等参照。）を利用して、半透膜を製造することができる。

なお、本明細書において、「ハイドロゲル」とは、高分子化合物が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を示し、より具体的には、天然物高分子化合物や合成高分子化合物の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものを意味する。

ハイドロゲルには、例えば、上述のゲル化する細胞外マトリックス由来成分、フィブリン、寒天、アガロース、セルロース等の天然高分子化合物、及びポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等の合成高分子化合物が含まれる。

ハイドロゲルを用いた半透膜の製造方法としてより具体的には、まず、予め保持体を配置しておいた鋳型に完全にはゲル化していない状態のハイドロゲル（以下、「ゾル」と称することがある。）を配置し、ゲル化を誘導する。
ゾルがコラーゲンゾルである場合、コラーゲンゾルは至適な塩濃度を有するものとして、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、基礎培養液、無血清培養液、血清含有培養液等を用いて、調製したものを用いることができる。また、コラーゲンのゲル化の際の溶液のｐＨは、例えば６以上８以下とすることができる。

また、コラーゲンゾルの調製は例えば４℃程度で行えばよい。その後、ゲル化する際の保温は、用いるコラーゲンの動物種に依存したコラーゲンの変性温度より低い温度とすることができ、一般的には２０℃以上３７℃以下の温度で保温することで数分から数時間でゲル化を行うことができる。

また、半透膜を作製するためのコラーゲンゾルの濃度は、０．１％以上１．０％以下であることが好ましく、０．２％以上０．６％以下であることがより好ましい。コラーゲンゾルの濃度が上記下限値以上であることにより、ゲル化が弱すぎず、また、コラーゲンゾルの濃度が上記上限値以下であることにより、均一なコラーゲンゲルを含む半透膜を得ることができる。

さらに、得られたハイドロゲルを乾燥し、ハイドロゲル乾燥体としてもよい。ハイドロゲルを乾燥させることにより、ハイドロゲル内の自由水を完全に除去し、さらに結合水の部分除去を進行させることができる。

このガラス化工程（ハイドロゲル内の自由水を完全に除去した後に、結合水の部分除去を進行させる工程）の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れたガラス化後のハイドロゲル、すなわちビトリゲル（登録商標）を得ることができる。なお、必要に応じて短期間のガラス化後に再水和して得たビトリゲル（登録商標）をＰＢＳ等で洗浄し、再度ガラス化することもできる。

なお、本明細書において、「ビトリゲル（登録商標）」とは、従来のハイドロゲルをガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後に再水和して得られる安定した状態にあるゲルのことを指し、本発明者によって、「ビトリゲル（ｖｉｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）」と命名されている。

乾燥方法としては、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、１０℃４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、若しくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等の方法を例示することができる。

さらに、得られたビトリゲル（登録商標）乾燥体をＰＢＳや使用する培養液等で再水和することで、再度、ビトリゲル（登録商標）としてもよい。

また、本明細書においては、ハイドロゲルからなる半透膜の製造工程を詳細に説明するにあたり、当該ガラス化工程の直後であり再水和の工程を経ていないハイドロゲルの乾燥体に対しては、単に「ハイドロゲル乾燥体」とした。そして、当該ガラス化工程の後に再水和の工程を経て得られたゲルを「ビトリゲル（登録商標）」として区別して表し、そのビトリゲル（登録商標）をガラス化させて得られた乾燥体を「ビトリゲル（登録商標）乾燥体」とした。また、ビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線照射する工程を施して得られるものを「ビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）材料乾燥体」とし、該ビトリゲル（登録商標）材料乾燥体に再水和する工程を施して得られるゲルを「ビトリゲル（登録商標）材料」とした。従って、「ビトリゲル（登録商標）」及び「ビトリゲル（登録商標）材料」は水和体である。

つまり、得られたビトリゲル（登録商標）を再乾燥することで、再ガラス化させて、ビトリゲル（登録商標）乾燥体としてもよい。

乾燥方法としては、上述に例示した方法と同様の方法が挙げられる。

また、得られたビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線を照射して、ビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）材料乾燥体としてもよい。

紫外線の照射には、公知の紫外線照射装置を使用することができる。

ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、単位面積あたりの総照射量が、０．１ｍＪ／ｃｍ^２以上６０００ｍＪ／ｃｍ^２以下であることが好ましく、１０ｍＪ／ｃｍ^２以上４０００ｍＪ／ｃｍ^２以下であることがより好ましく、１００ｍＪ／ｃｍ^２以上３０００ｍＪ／ｃｍ^２以下であることがさらに好ましい。総照射量が上記の範囲であることにより、続く再水和工程において得られるビトリゲル（登録商標）材料の透明度及び強度を特に好ましいものとすることができる。

また、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射は、複数回繰り返し行ってもよい。ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、１度目の紫外線の照射をビトリゲル（登録商標）乾燥体に行った後に、ビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）材料乾燥体の再水和及び再ガラス化の工程を行い、その後２度目以降の再ガラス化後のビトリゲル（登録商標）材料乾燥体への紫外線の照射を行うことが好ましい。

単位面積あたりの紫外線総照射量が同一であるとき、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射を、複数回に分割して繰り返して行うことで、続く再水和工程において得られるビトリゲル（登録商標）材料の透明度及び強度をより高めることができる。また分割の回数は多いほど好ましい。例えば、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射の単位面積あたりの総照射量が、１０００ｍＪ／ｃｍ^２以上４０００ｍＪ／ｃｍ^２以下の範囲であるとき、該範囲内での照射回数が２回以上１０回以下であることが好ましく、２回以上６回以下であることがより好ましい。

また、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への紫外線の照射を繰り返す場合、紫外線の照射部位を、ビトリゲル（登録商標）乾燥体の一方の面と他方の面（上面と下面）とに分けて照射して、その総照射量を、ビトリゲル（登録商標）乾燥体への単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。

紫外線の照射を、ビトリゲル（登録商標）乾燥体に行うことで、続く再水和工程において得られるビトリゲル（登録商標）材料の強度と透明度が高まることは、ビトリゲル（登録商標）材料内の高分子化合物同士が、紫外線によって架橋されるからと考えられる。つまり、当該操作により、高い透明度及び強度をビトリゲル（登録商標）材料に維持させることができると考えられる。

さらに、得られたビトリゲル（登録商標）乾燥体に紫外線照射処理を施したビトリゲル（登録商標）材料乾燥体をＰＢＳや使用する培養液等で再水和することで、ビトリゲル（登録商標）材料としてもよい。

さらに、得られたビトリゲル（登録商標）材料を乾燥することで、再ガラス化させて、ビトリゲル（登録商標）材料乾燥体としてもよい。

乾燥方法としては、上述に例示した方法と同様の方法が挙げられる。

又は、上述の製造方法を用いて、通常の半分程度の厚みのハイドロゲル、ハイドロゲル乾燥体、ビトリゲル（登録商標）、ビトリゲル（登録商標）乾燥体、ビトリゲル材料、又はビトリゲル（登録商標）材料乾燥体からなる製膜２枚を用いて、保持体を挟みこみ、接着剤、又はゾルを用いて接着及び乾燥させることで、半透膜を製造してもよい。

前記接着剤としては、細胞毒性がないものを用いることができ、上述の「１．生体適合性を有する合成高分子化合物を用いた半透膜の製造方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

≪細胞培養用デバイス≫
一実施形態において、本発明は、上述の半透膜を少なくとも一部に備える細胞培養用デバイスを提供する。

本実施形態の細胞培養用デバイスは、膜がたわむことなく、さらにピンセット等で半透膜を摘まんでも破損することなく保持することができる。

また、従来では、培養モデルとして多細胞構造体を作製後、１～３日以内に使用しなければならず、時間的制約があった。これに対し、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞を３～３０日程度、長期間培養することが可能であり、時間的制約を受けない。

さらに、本実施形態の細胞培養用デバイスは、半透膜の内部又は表面（細胞培養用デバイスの天面若しくは底面の外側）に保持体を含むため、血球計算盤の代わりとして用いることができ、細胞培養用デバイス内に含まれる細胞数を容易に計測することができる。

本実施形態の細胞培養用デバイスは上述の半透膜を少なくとも一部に備える。よって、例えば、細胞を含む本実施形態の細胞培養用デバイスを、培養液を含む容器内に浸した場合に、前記半透膜において、細胞を細胞培養用デバイスの外部に透過させず、一方、培養液に溶解している栄養分を細胞培養用デバイスの内部に透過させるとともに、細胞培養用デバイスの内部の培養液に溶解した老廃物を含む細胞生産物を細胞培養用デバイスの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞の長期間培養に用いることができる。

本実施形態の細胞培養用デバイスは、さらに、気相中で液密性を有することが好ましい。

本明細書において、「液密性」とは、液体が漏れない状態を意味する。本実施形態の細胞培養用デバイスは、例えば、内部に培養液等の液体を含んでいる場合に、気相中において、いずれの面からも液体が漏れず、内部に保つことができる。一方、気体を通すことができるため、内部に液体を含む場合、内部の液体は経時的に蒸発する。よって、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞が内部に封入された状態で保つことができる。

本明細書において、「多細胞構造体」とは、複数の細胞が細胞－基質間の結合、及び細胞－細胞間の結合を形成した単層細胞又は多層細胞からなる３次元構造体を意味する。本実施形態における多細胞構造体は、１種類以上の機能細胞と、その足場の役割を果たす基質と、により構成されている。すなわち、本実施形態における多細胞構造体は、複数の機能細胞と基質とが相互作用することで、より生体内の組織又は器官に類似した形態を構築しているものである。したがって、多細胞構造体には、血管及び胆管のうち少なくともいずれか等の毛細管網様構造が３次元的に構築されていてもよい。このような毛細管網様構造は、多細胞構造体の内部にのみ形成されていてもよく、少なくともその一部が多細胞構造体の表面又は底面に露出されるように形成されていてもよい。

＜構造＞
［第１実施形態］
図２は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。
ここに示す細胞培養用デバイス１００は、半透膜１０を天面及び底面に備え、部材１１により側面を封止された円柱の形状をしている。図２において、半透膜を天面及び底面に備えるものを例示したが、天面、底面又は側面等の一部に備えるものでもよく、天面、底面、及び側面等の全体が半透膜からなるものでもよい。中でも、本実施形態の細胞培養用デバイスは、培養モデルとして用いる場合には、半透膜を天面及び底面に備えるものが好ましい。

図２において、細胞培養用デバイスの形状が円柱であるものを示したが、その他の形状でもよく、本実施形態の細胞培養用デバイスの形状は、細胞を格納でき、細胞に均一に酸素及び培養液に溶解している栄養分が行き渡る形状とすることができ、培養液をデバイス内部に満たしていてもよく、培養液を満たさずに気体部分を残していてもよい。本実施形態の細胞培養用デバイスの形状としては、例えば、円柱（例えば、リング状の円柱、中空糸状の円柱等）、円錐、円錐台、角錐、角錐台、球、多面体（例えば、四面体、五面体、六面体（立方体含む）、八面体、十二面体、二十面体、二十四面体、ケプラー・ポアンソ立体等）等が挙げられ、これらに限定されない。

図２に示すように細胞培養用デバイスの形状がリング状の円柱である場合、細胞培養用デバイスの内径は、１ｍｍ以上６０ｍｍ以下であることが好ましく、３ｍｍ以上３５ｍｍ以下であることがより好ましく、５ｍｍ以上３０ｍｍ以下であることがさらに好ましい。

また、細胞培養用デバイスの外径は、３ｍｍ以上６８ｍｍ以下であることが好ましく、５ｍｍ以上４３ｍｍ以下であることがより好ましく、７ｍｍ以上３５ｍｍ以下であることがさらに好ましい。

また、細胞培養用デバイスの厚み（リング状の円柱の高さ）は、５μｍ以上であって、５０μｍ以上１５ｍｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１０ｍｍ以下であることがより好ましく、５００μｍ以上２ｍｍ以下であることがさらに好ましい。

なお、本明細書において、「細胞培養用デバイスの厚み（リング状の円柱の高さ）」は、細胞培養用デバイスの天面の外側の縁部から、底面の外側の縁部までの距離を意味する。

図２において、天面及び底面が平面であるものを示したが、天面及び底面が凹部構造、又は凸部構造であってもよい。特に、天面及び底面が凹部構造であるとき、天面の内側の凹部の中心部（天面の内側の最凹部）と底面の内側の凹部の中心部（底面の内側の最凹部）とが接触せず、一定の距離（例えば、５μｍ以上）を保っていることが好ましい。これにより、細胞培養用デバイスの厚み（リング状の円柱の高さ）、すなわち、細胞培養用デバイスの天面の外側の縁部から、底面の外側の縁部までの距離が、天面の外側の凹部の中心部（天面の外側の最凹部）から底面の外側の凹部（底面の外側の最凹部）の中心部までの距離よりも長くなり、例えば、天面から薬剤を添加した場合に、添加した薬剤の方向性を維持することができる。さらに、天面及び底面が凹部構造であるため、天面及び底面の外側に新たに細胞を播種して培養することが可能となる。

また、図２において、天面及び底面と側面の部材とが垂直に接合されたものを示したが、天面及び底面のうち少なくとも一方の縁部が直線状、凸曲線状、凹曲線状、又は略Ｓ字曲線状の傾斜を描きながら側面の部材に接合されていてもよい。特に、底面の縁部が上述の形状の傾斜を描きながら側面の部材に接合されている場合、ピンセット等を用いて本実施形態の細胞培養用デバイスの天面及び底面を挟みこんで持ち上げる際に、傾斜の部分にプンセット等が入り込み、容易に持ち上げることができる。

本実施形態の細胞培養用デバイスの内部容積は、培養液に懸濁した細胞を注入可能であり、細胞の活性をアッセイする試験等のインビトロ試験系で用いられる多細胞構造体を構築することができる程度のスモールスケールとすることができ、１０ｍＬ以下であることが好ましく、１０μＬ以上５ｍＬ以下であることがより好ましく、１５μＬ以上２ｍＬ以下であることがさらに好ましく、２０μＬ以上１ｍＬ以下であることが特に好ましい。内部容積が上記の上限値以下であることにより、十分に酸素及び培養液の栄養分が供給され、細胞を効率よく長期間に渡り培養することができる。また、内部容積が上記の下限値以上であることにより、インビトロ試験系で用いるのに十分な細胞数及び細胞密度の細胞を得ることができる。

［第２実施形態］
図３は、本発明の第２実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。

なお、図３以降の図において、既に説明済みの図に示すものと同じ構成要素には、その説明済みの図の場合と同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。

ここに示す細胞培養用デバイス２００は、支持体１２を備えている以外は、図２に示す細胞培養用デバイス１００と同じものである。すなわち、細胞培養用デバイス２００は、半透膜１０を天面及び底面に備え、部材１１により側面を封止された円柱の形状をしており、外側面に支持体１２を備える。

細胞培養用デバイス２００は、支持体１２を有することにより、例えば、細胞を含む細胞培養用デバイス２００を一回り大きい容器に固定することにより、細胞を気相にて培養することができる。また、細胞培養用デバイス２００は、支持体１２を有することにより、例えば、細胞を含む細胞培養用デバイス２００は、培養液中において、浮力により浮くことができ、細胞培養用デバイス２００のように天面及び底面に半透膜１０を備える場合、天面は空気に接し、底面は培養液に接するため、細胞を気相及び液相にて培養することができる。

また、支持体１２は、細胞培養用デバイス２００に固定されていてもよく、取り外し可能であってもよい。

［第３実施形態］
図４は、本発明の第３実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。

ここに示す細胞培養用デバイス３００は、チューブ１３を備えている以外は、図２に示す細胞培養用デバイス１００と同じものである。すなわち、細胞培養用デバイス３００は、半透膜１０を天面及び底面に備え、部材１１により側面を封止された円柱の形状をしている。さらに、細胞培養用デバイス３００の外側面において向かい合うようにチューブ１３を備え、チューブ１３は細胞培養用デバイス３００の内部に挿入されており、２つのチューブ１３及び細胞培養用デバイス３００は連通している。

細胞培養用デバイス３００は、チューブ１３を備えることにより、培養液を側面からも供給することができる。さらに、チューブ１３を備える細胞培養用デバイス３００同士を連結させることにより、後述に示す器官型チップシステムを構築することができる。

また、チューブ１３の細胞培養用デバイス３００が挿入されている側と反対側の先端には、栓や弁等の開閉可能な装置（図示せず）を備えることが好ましい。

［第４実施形態］
図５Ａ及び図５Ｂは、本発明の第４実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。図５Ａに示す細胞培養用デバイス４００ａは、デバイス内部と外部とが注入孔１４を介して連通している。一方、図５Ｂに示す細胞培養用デバイス４００ｂはデバイス内部と外部とが不通である。

ここに示す細胞培養用デバイス４００ａ及び４００ｂは、半透膜が円形の保持体１を含む半透膜１０ａであり、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂからなる注入孔１４を備え、部材が第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂからなる以外は、図２に示す細胞培養用デバイス１００と同じものである。すなわち、細胞培養用デバイス４００ａ及び４００ｂは、円形の保持体１を含む半透膜１０ａを天面及び底面に備え、部材１１により側面を封止された円柱の形状をしている。また、部材１１が第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂからなり、第１の部材１１ａの外周面に接するように第２の部材１１ｂを備える。さらに、第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂは、内周面と外周面とを貫通する第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂをそれぞれ備える。そのため、第１の部材１１ａと第２の部材１１ｂとの位置を左右に回転させて調節することで、細胞培養用デバイス４００ａに示すように、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂが接続してデバイス内部と外部とを連通させることができる。一方、細胞培養用デバイス４００ｂに示すように、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂの位置をずらすことで、デバイス内部と外部とを不通とする（遮断する）ことができる。

細胞培養用デバイス４００ａは、第１の部材１１ａと第２の部材１１ｂとの位置を左右に回転させて、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂが接続させることで、デバイス内部と外部とを連通させることができ、培養液を側面からも供給することができる。一方、細胞培養用デバイス４００ｂは、第１の部材１１ａと第２の部材１１ｂとの位置を左右に回転させて、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂの位置をずらすことで、栓や弁等の開閉可能な装置を備えずに、デバイス内部と外部とを不通とする（遮断する）ことができる。

［第５実施形態］
図６Ａ及び図６Ｂは、本発明の第５実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す断面図である。図６Ａに示す細胞培養用デバイス５００ａは、デバイス内部と外部とが注入孔１４を介して連通している。一方、図６Ｂに示す細胞培養用デバイス５００ｂはデバイス内部と外部とが不通である。

ここに示す細胞培養用デバイス５００ａ及び５００ｂは、半透膜が円形の保持体１を含む半透膜１０ａであり、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂからなる注入孔１４を備え、部材が第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂからなる以外は、図２に示す細胞培養用デバイス１００と同じものである。すなわち、細胞培養用デバイス５００ａ及び５００ｂは、円形の保持体１を含む半透膜１０ａを天面及び底面に備え、部材１１により側面を封止された円柱の形状をしている。また、部材１１が第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂからなり、第１の部材１１ａの外周面に接するように第２の部材１１ｂを備える。さらに、第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂは、内周面と外周面とを貫通する第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂをそれぞれ備える。そのため、第１の部材１１ａと第２の部材１１ｂとの位置を上下に調節することで、細胞培養用デバイス５００ａに示すように、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂが接続してデバイス内部と外部とを連通させることができる。一方、細胞培養用デバイス５００ｂに示すように、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂの位置を上下にずらすことで、デバイス内部と外部とを不通とする（遮断する）ことができる。

細胞培養用デバイス５００ａは、第１の部材１１ａと第２の部材１１ｂとの位置を上下に動かして、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂが接続させることで、デバイス内部と外部とを連通させることができ、培養液を側面からも供給することができる。一方、細胞培養用デバイス５００ｂは、第１の部材１１ａと第２の部材１１ｂとの位置を上下に動かして、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂの位置をずらすことで、栓や弁等の開閉可能な装置を備えずに、デバイス内部と外部とを不通とする（遮断する）ことができる。

また、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、細胞培養用デバイス５００ａ及び５００ｂは、上下の操作が簡便であることから、第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂのかみ合わせる部分の形状がテーパー構造となっていることが好ましい。

［第６実施形態］
図７は、本発明の第６実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。

ここに示す細胞培養用デバイス６００は、半透膜が円形の保持体１を含む半透膜１０ａであり、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂからなる注入孔１４を備え、部材が第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂからなる以外は、図２に示す細胞培養用デバイス１００と同じものである。すなわち、細胞培養用デバイス６００は、円形の保持体１を含む半透膜１０ａを天面及び底面に備え、部材１１により側面を封止された円柱の形状をしている。また、部材１１が第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂからなり、第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂは同一の形状である。さらに、第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂは、その天面に外周面から中心に向かって、半円柱状の窪みである第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂをそれぞれ備える。この第１の部材１１ａ及び第２の部材１１ｂを天面同士が接するように、且つ、第１の注入孔１４ａ及び第２の注入孔１４ｂが合わさるように接着剤等を用いて貼りあわせることで、図７に示す外周面から内周面へ貫通する注入孔１４を備える細胞培養用デバイス６００が得られる。

細胞培養用デバイス６００は、注入孔１４を備えることにより、培養液を側面からも供給することができる。

また、細胞培養用デバイス６００の注入孔１４の外部と接する側には、栓や弁等の開閉可能な装置（図示せず）を備えることが好ましい。

本実施形態の細胞培養用デバイスは、図２～７に示すものに限定されず、本実施形態の細胞培養用デバイスの効果を損なわない範囲内において、図２～７に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。

例えば、図２～７に示す細胞培養用デバイスにおいて、天面を備えず、開放系の形状であってもよい。

また、例えば、図２～４に示す細胞培養用デバイスにおいて、部材は注入孔を備えていてもよい。注入孔を備える場合、該注入孔を閉じるための栓を備えることが好ましい。

注入孔の形状は、特別な限定はなく、例えば、円形、多角形（正多角形等も含む）、楕円形等が挙げられる。

注入孔の半径は、細胞培養用デバイスの厚み（すなわち、部材の高さ）に応じて適宜調整することができ、例えば１０μｍ以上１０００μｍ以下とすることができる。

また、例えば、図５Ａ～図７に示す細胞培養用デバイスについて、注入孔を１つ備えるものを示したが、２つ以上備えていてもよい。

また、例えば、図２～７に示す細胞培養用デバイスにおいて、天面及び底面が保持体を含む半透膜であるものを示したが、天面又は底面が保持体を有さない半透膜であってもよい。保持体を含む半透膜を天面又は底面のいずれかの面に有することにより、細胞数がより計測しやすくなる。

また、例えば、図２～７に示す細胞培養用デバイスにおいて、半透膜と部材との間に、接着剤層を備えていてもよい。この場合、半透膜は、接着剤層を介して、部材に対して着脱可能となっていてもよい。半透膜は、部材に対する接着性が低く、半透膜に対する接着性が高い接着剤を用いることで、多孔質膜の外面に対して着脱可能とすることができる。これにより、本実施形態の細胞培養用デバイスを用いて細胞を培養後、半透膜をデバイス内の細胞とともに簡便に取出すことができる。

また、例えば、図２～７に示す細胞培養用デバイスにおいて、半透膜の外面に、接着剤層を介して、気密性を有するフィルムを備えていてもよい。この場合、気密性を有するフィルムは、接着剤層を介して、半透膜に対して着脱可能となっていてもよい。気密性を有するフィルムは、気密性を有するフィルムに対する接着性が低く、多孔質膜に対する接着性が高い接着剤を用いることで、多孔質膜の外面に対して着脱可能とすることができる。

また、本実施形態の細胞培養用デバイスにおいては、各構成（半透膜、部材等）の大きさや形状は、目的に応じて任意に調節できる。

＜各構成＞
［半透膜］
本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられる半透膜は、気相中で液密性を有するため、例えば、本実施形態の細胞培養用デバイスの内部に培養液等の液体を含んでいる場合に、気相中において、半透膜から液体が漏れることなく、内部に保つことができる。この液密性は、半透膜上での表面張力によるものである。一方、気体を通すことができるため、内部に液体を含む場合、内部の液体は経時的に蒸発する。

また、本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられる半透膜は、液相中で半透性を有するため、例えば、細胞を含む本実施形態の細胞培養用デバイスを、培養液を含む容器内に浸した場合に、前記半透膜において、細胞培養用デバイス内の細胞はデバイスの外部に透過させず、一方、培養液に溶解している栄養分を細胞培養用デバイスの内部に透過させるとともに、細胞培養用デバイスの内部の培養液に溶解した老廃物を含む細胞生産物を細胞培養用デバイスの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞の長期間培養に用いることができる。

より具体的には、本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられる半透膜は、例えば、分子量約１，０００,０００以下の高分子化合物を透過することができるものとすることができ、例えば、分子量約２００，０００以下の分子化合物を透過することができるものとすることができる。

前記性質を有する半透膜の材料としては、上述の「半透膜」の「構成材料」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

［部材］
本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、半透膜以外の部分を構成する部材は、液密性を有するものを用いることができる。また、本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、半透膜以外の部分を構成する部材は、通気性を有するものであってもよく、通気性を有さないものであってもよい。

前記部材が、通気性を有するものである場合、酸素透過係数が、例えば１００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができ、例えば１０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができ、例えば１２００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上２５００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができる。さらに、二酸化炭素透過係数が、例えば１０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができ、例えば３０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上１５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができ、例えば５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上１００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができる。

また、前記部材が通気性を有さないものである場合、酸素透過係数が例えば１００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができ、例えば５０ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができる。さらに、二酸化炭素透過係数が、例えば１０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができ、例えば５００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下とすることができる。

本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、半透膜以外の部分を構成する部材の材料としては、細胞の培養に適したものを用いることができる。半透膜以外の部分を構成する材料としては、例えば、ガラス材料、エラストマー材料、樹状ポリマーを含むプラスチック、コポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。

ガラス材料としては、例えば、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラス等が挙げられる。

エラストマー材料としては、例えば、ウレタンゴム、ニトリルゴム、シリコーンゴム、シリコーン樹脂（例えば、ポリジメチルシロキサン）、フッ素ゴム、アクリルゴム、イソプレンゴム、エチレンプロピレンゴム、クロロスルホン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴム、クロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブタジエンゴム、ポリイソブチレンゴム等が挙げられる。

樹状ポリマーとしては、例えば、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（酢酸ビニル－共－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン等が挙げられる。

コポリマーとしては、例えば、ポリ（酢酸ビニル－共－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－共－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－共－アクリル酸）、及び、これらの誘導体等が挙げられる。

部材の材料は、上記に例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。

また、部材が上記に例示された材料のうち２種類以上から構成されている場合、部材は、上記に例示された材料の混合物から構成されていてもよい。又は、部材は、１種類の材料からなる部材を組み合わせて形成されており、各部材を構成する材料が互いに異なっていてもよい。

また、部材の形状は、本実施形態の細胞培養用デバイスの全体形状、及び、本実施形態の細胞培養用デバイスを構成する部分に応じて、適宜選択することができる。

（部材の製造方法）
本実施形態における部材は、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。

例えば、部材の材料としてエラストマー材料又はプラスチックを用いる場合の製造方法としては、圧縮成形法、射出成形法、押出成形法等が挙げられ、これらに限定されない。

また、例えば、部材の材料としてガラス材料を用いる場合の製造方法としては、例えば、液滴成形法、ダンナー法、オーバーフロー法、フロート法、ブロー成形法、プレス成型法等が挙げられ、これらに限定されない。

また、注入孔を備える部材を製造する場合、部材を製造した後に、レーザー照射等により、注入孔を形成させ、注入孔を備える部材を製造してもよい。又は、注入孔にあたる部分の半円状の窪みを有する同じ形状の部材を２枚貼り合せることで注入孔を備える部材を製造してもよい。又は、部材の一部を突起させた後、当該突起部に注入孔を形成させてもよい。

［栓］
本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、部材が注入孔を備える場合に、用いられる埋め込み型の栓は、部材よりも硬い材質のものが好ましい。具体的には、例えば、鉄、ステンレス鋼等の金属等が挙げられ、これらに限定されない。また、部材の突起部に注入孔を備える場合には、用いられる栓は、埋め込み型であっても、被覆型であってもよい。

また、栓の形状は、注入孔を塞ぐことができる形状とすることができ、埋め込み型の場合は、例えば、球状、円錐状、円錐台状、角錐状、角錐台状、円柱状、角柱状等が挙げられ、被覆型の場合は、例えば、球殻状、ドーム状、円錐筒状、円錐台筒状、円筒状、角錐筒状、角錐台筒状、角筒状等のキャップ形状が挙げられ、これらに限定されない。

［支持体］
本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられる支持体の材料としては、例えば、有機材料であってもよく、無機材料であってもよい。

有機材料としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド系樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられ、特別な限定はない。

無機材料としては、例えば、セラミックス、ガラス等が挙げられ、特別な限定はない。

また、支持体の形状は、例えばシート状、棒状等が挙げられ、これらに限定されない。

（支持体の製造方法）
本実施形態における支持体は、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。

例えば、支持体の材料として有機材料を用いる場合の製造方法としては、例えば、圧縮成形法、カレンダー成形法、射出成形法、押出成形法、インフレーション成形等が挙げられ、これらに限定されない。

また、例えば、支持体の材料としてガラスを用いる場合の製造方法としては、例えば、上述の（部材の製造方法）に例示された方法と同様のものが挙げられる。

また、例えば、支持体の材料としてセラミックスを用いる場合の製造方法としては、例えば、乾式成形法（例えば、金型成形法、冷間静水圧成形法、ホットプレス法、熱間静水成形法等）、塑性成形法（例えば、ろくろ成形法、押出成形法、射出成型法）、鋳込み成形法（例えば、泥漿鋳込み法、加圧鋳込み法、回転鋳込み法等）、テープ成形法等が挙げられ、これらに限定されない。

［チューブ］
本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられるチューブの材料としては、特別な限定はなく、上記生体適合性を有する材料であってもよく、又は細胞の培養に適した材料であってもよい。前記生体適合性を有する材料としては、上述の「半透膜」の「構成材料」の「その他」において例示されたものと同様のものが挙げられる。前記細胞の培養に適した材料としては、上述の「部材」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

また、チューブとして好適に用いられるものとしてより具体的には、例えば、医療用のカテーテル、留置針のカテーテル等が挙げられる。

（チューブの製造方法）
本実施形態におけるチューブは、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。

具体的な製造方法としては、上述の「半透膜」の「半透膜の製造方法」及び上述の「部材」の「部材の製造方法」において例示された方法と同様の方法を用いて、チューブ状となるように成形することができる。

［気密性を有するフィルム］
気密性を有するフィルムの厚さは、例えば１０μｍ以上５００μｍ以下とすることができ、例えば３０μｍ以上３００μｍ以下とすることができ、例えば５０μｍ以上１５０μｍ以下とすることができる。

ここで、「気密性を有するフィルムの厚さ」とは、気密性を有するフィルム全体の厚さを意味し、例えば、複数層からなる気密性を有するフィルムの厚さとは、気密性を有するフィルムを構成するすべての層の合計の厚さを意味する。

気密性を有するフィルムの材料としては、気密性を有する材料であればよい。

気密性を有するフィルムの材料として具体的には、有機材料であってもよく、無機材料であってもよい。

有機材料としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド系樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられ、特別な限定はない。

無機材料としては、例えば、セラミックス、ガラス等が挙げられ、特別な限定はない。

気密性を有するフィルムは、上記に例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。

また、気密性を有するフィルムが上記に例示された材料のうち２種類以上から構成されている場合、気密性を有するフィルムは、上記に例示された材料の混合物から構成されていてもよい。又は、気密性を有するフィルムは、１種類の材料からなる気密性を有するフィルムを２層以上積層してなり、各気密性を有するフィルムを構成する材料が互いに異なってもよい。

（気密性を有するフィルムの製造方法）
気密性を有するフィルムは、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。

例えば、気密性を有するフィルムの材料として有機材料を用いる場合の製造方法としては、例えば、圧縮成形法、カレンダー成形法、射出成形法、押出成形法、インフレーション成形等が挙げられ、これらに限定されない。

また、例えば、気密性を有するフィルムの材料としてガラスを用いる場合の製造方法としては、例えば、上述の（部材の製造方法）に例示された方法と同様のものが挙げられる。

また、例えば、気密性を有するフィルムの材料としてセラミックスを用いる場合の製造方法としては、例えば、乾式成形法（例えば、金型成形法、冷間静水圧成形法、ホットプレス法、熱間静水成形法等）、塑性成形法（例えば、ろくろ成形法、押出成形法、射出成型法）、鋳込み成形法（例えば、泥漿鋳込み法、加圧鋳込み法、回転鋳込み法等）、テープ成形法等が挙げられ、これらに限定されない。

＜細胞培養用デバイスの製造方法＞
本実施形態の細胞培養用デバイスは、所望の形状となるように、半透膜のみ、又は、半透膜と部材とを組み立てることにより製造することができる。また、必要に応じて、支持体及びチューブを備え付けることができる。

半透膜、部材、支持体及びチューブそれぞれの製造方法は、先に説明したとおりである。

より具体的には、図２に示す本実施形態の細胞培養用デバイスの製造方法を以下に詳細に説明する。
まず、部材１１の天面及び底面と同じ大きさ、又は、部材１１の天面及び底面よりも一回り大きい半透膜１０を２枚準備する。次いで、準備した半透膜１０をそれぞれ部材１１の天面及び底面となるように、接合させる。

半透膜１０と部材１１との接合方法としては、例えば、接着剤による接合方法、両面テープによる接合方法、ヒートシーラーや熱板、超音波、レーザー等を用いて熱溶着により接合する方法、ほぞとほぞ穴とを作製することにより接合するほぞ接ぎによる方法（例えば、片胴付き、二方胴付き、三方胴付き、四方胴付き、小根付き、面腰ほぞ、二枚ほぞ、二段ほぞ等）等が挙げられ、これらに限定されない。また、これらの接合方法のうち１種類を用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

また、前記接着剤としては、細胞毒性がないものを用いることができ、合成化合物の接着剤であってもよく、天然化合物の接着剤であってもよい。

合成化合物の接着剤としては、例えば、ウレタン系接着剤、シアノアクリレート系接着剤、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、リン酸カルシウム系接着剤、レジン系セメント等が挙げられる。

天然化合物の接着剤としては、例えば、フィブリン糊、ゼラチン糊等が挙げられる。

また、前記両面テープとしては、細胞毒性がないものを用いることができ、医療用途にて用いられているもの等が好適に用いられる。具体的には、例えば、支持体の両面に粘着剤層が積層された構造を有し、前記粘着剤層がゴム系、アクリル系、ウレタン系、シリコーン系、ビニルエーテル系の公知の粘着剤からなるもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、３Ｍジャパン社製の皮膚貼付用両面テープ（製品番号：１５１０、１５０４ＸＬ、１５２４等）、日東電工社製の皮膚用両面粘着テープ（製品番号：ＳＴ５０２、ＳＴ５３４等）、ニチバンメディカル社製の医療用両面テープ（製品番号：＃１０８８、＃１０２２、＃１０１０、＃８０９ＳＰ、＃４１４１２５、＃１０１０Ｒ、＃１０８８Ｒ、＃８８１０Ｒ、＃２１１０Ｒ等）、ＤＩＣ社製の薄型発泡体基材両面接着テープ（製品番号：＃８４０１０、＃８４０１５、＃８４０２０等）等が挙げられる。

なお、白や黒等の着色された色の異なる両面接着テープ（例えば、ＤＩＣ社製の＃８４０１０ＷＨＩＴＥ及び＃８４０１０ＢＬＡＣＫ等）を、それぞれ部材の天面及び底面に用いることで、半透膜が透明又は半透明である場合には、天面側及び底面側を目視で容易に区別することができる。

次いで、γ線照射、電子線照射、ＵＶ照射、又は、酸化エチレンガス（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｇａｓ：ＥＯＧ）等により滅菌し、必要に応じて、半透膜１０又は部材１１の大きさを整えることで、細胞培養用デバイス１００を得ることができる。

又は、図２に示す本実施形態の細胞培養用デバイスの製造方法としては、例えば、まず、保持体を含まない半透膜を用いて、上述の製造方法と同様の方法を用いて、半透膜と部材とを接合し、細胞培養用デバイスを製造する。次いで、保持体を、上述の接着剤を用いて部材に接着及び乾燥させて、細胞培養用デバイスを製造してもよい。

また、図３に示す本実施形態の細胞培養用デバイス２００のように支持体１２を備える場合、予め支持体１２を半透膜１０又は部材１１に接合させておいてもよく、また、組み立てられた細胞培養用デバイス２００に接合させてもよい。接合方法としては、上述の半透膜と部材との接合方法と同様の方法により固定されていてもよく、留具等を用いて取り外し可能なように取り付けられていてもよい。

また、図４に示す本実施形態の細胞培養用デバイス３００のようにチューブを備える場合、予め半透膜１０又は部材１１にチューブ１３を挿入しておいてもよく、組み立てられた細胞培養用デバイス３００にチューブ１３を挿入してもよい。チューブの挿入方法としては、例えば、チューブとして留置針のカテーテルを用いる場合、細胞培養用デバイスに留置針を差し込み、その後、内筒針を抜くことで、チューブを挿入することができる。

≪細胞培養用デバイスの使用方法≫
本実施形態の細胞培養用デバイスは後述に示すとおり、例えば、細胞の培養、細胞の運搬、組織型チップ、器官型チップ、器官型チップシステム等に使用することができる。

本明細書において、「組織」とは、１種類の幹細胞が分化していく一定の系譜に基づいたパターンで集合した構造の単位を示し、全体として一つの役割を有する。例えば、表皮角化細胞は、表皮の基底層に存在する幹細胞が有棘層を経て顆粒層を構成する細胞へと分化し、終末分化して角質層を形成することで、表皮としてのバリア機能を発揮している。よって、本実施形態の組織型チップは、１つの細胞系譜に由来する１種類の細胞を含み多細胞構造体を構築することにより、例えば、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等を再現することができる。

また、本明細書において、「器官」とは、２種類以上の組織から構成され、全体として一つの機能を担う。よって、本実施形態の器官型チップは、細胞系譜の異なる少なくとも２種類の細胞を含み多細胞構造体を構築することにより、例えば、胃、腸、肝臓、腎臓等を再現することができる。

さらに、本明細書において、「器官系」とは、同じような機能をもった２つ以上の器官や、全体として一連の機能を担う２つ以上の器官のまとまりを示す。よって、本実施形態の器官型チップシステムは、組織型チップ、又は器官型チップを複数組み合わせることにより、例えば、消化器系、循環器系、呼吸器系、泌尿器系、生殖器系、内分泌系、感覚器系、神経系、運動器系、神経系等の器官系を再現することができる。なお、生体はこれらの器官系の相互作用によりホメオスタシスを維持している。本実施形態の器官型チップシステムでは、器官系の異なる器官型チップを複数組み合わせることができるため、器官系の異なる器官の相互作用を解析することも可能となる。例えば、小腸型チップ、肝臓型チップ、神経型チップの順に連結した器官型チップシステムにおいて、小腸型チップに薬剤を添加した場合、小腸型チップで吸収された薬剤が肝臓型チップで代謝され、肝臓型チップで排出された薬剤の肝代謝物が神経型チップに及ぼす毒性等を解析することが可能となる。

＜細胞の培養方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の細胞培養用デバイスを用いる細胞の培養方法を提供する。

本実施形態の培養方法によれば、容易に細胞を培養し、多細胞構造体を構築することができる。また、細胞を３～３０日程度維持することができ、従来よりも長期間細胞を維持することができる。さらに、本実施形態の培養方法によれば、後述の組織型チップを得ることができる。

本実施形態の培養方法において、以下に詳細を説明する。

まず、細胞を懸濁した培養液を準備する。次いで、ピペット、スポイト、又は注射針（翼状針、留置針等含む）等のノズルを使用して、上述の細胞培養用デバイス内に懸濁液を注入する。

細胞培養用デバイスが注入孔を有する場合、細胞懸濁液の注入は注入孔より行うが、注射針を用いた場合は、注入孔から注入してもよく、部材に直接刺して注入してもよい。

また、細胞を懸濁した培養液の注入後、部材の材質よりも硬度が高く弾性が低い材質の埋め込み型の栓で注入孔を塞ぐことが好ましい。また、部材の突起部に注入孔を備える場合には、埋め込み型又は被覆型の栓で注入孔を塞ぐことが好ましい。

より具体的には、例えば、注入した部位がプラスチックからなる部材である場合は、ステンレス鋼の球等で注入孔を塞げばよい。

次いで、細胞を懸濁した培養液が注入された細胞培養用デバイスは、気相及び液相のうち少なくともいずれかにて培養し、多細胞構造体を構築することができる。気相での培養は、例えば、空のシャーレ等の容器を用いて行うことができ、細胞が乾燥し死滅しない程度の時間において培養することができる。

また、液相での培養は、例えば、培養液を含むシャーレ等の容器を用いて行えばよい。又は、例えば、スピナーフラスコ等を用いて、撹拌培養することができる。これにより、細胞を懸濁した培養液が注入された細胞培養用デバイスを複数同時に培養することができ、大量の多細胞構造体を短期間で簡便に得ることができる。

また、気相及び液相での培養は、例えば、図３に示す支持体を有する細胞培養用デバイスを用いて、培養液を含むシャーレ等の容器に該細胞培養用デバイスを浮かべて行えばよい。

本実施形態の培養方法において用いられる細胞としては、例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、は虫類細胞、両生類細胞、魚類細胞等の脊椎動物細胞；昆虫細胞、甲殻類細胞、軟体動物細胞、原生動物細胞等の無脊椎動物細胞；グラム陽性細菌（例えば、バチルス種等）、グラム陰性細菌（例えば、大腸菌等）等の細菌：酵母、植物細胞、及び、それらの単一細胞又は複数の細胞から構成される小さな生命個体等が挙げられる。

前記小さな生命個体としては、例えば、アメーバ、ゾウリムシ、ミカヅキモ、ハネケイソウ、クロレラ、ミドリムシ、ウチワヒゲムシ等の単細胞生物；ミジンコ、アルテミアの幼生、カイアシ亜網類、貝虫亜綱類、鞘甲亜綱の幼生、コノハエビ亜綱の幼生、フクロエビ上目類の幼生、ホンエビ上目類の幼生等の微小甲殻類動物；プラナリア（細切断後の再生プラナリアも含む）、陸生節足動物の幼生、線形動物、植物の種子（特に、発芽種子）、カルス、プロトプラスト、海洋微生物（例えば、ビブリオ属、シュードモナス属、エロモナス属、アルテロモナス属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、フレキシバクター属等の海洋細菌、藍藻、クリプト藻、渦鞭毛藻、珪藻、ラフィド藻、黄金色藻、ハプト藻、ユーグレナ藻、プラシノ藻、緑藻等の藻類等）、仔稚魚、仔稚貝等が挙げられ、これらに限定されない。

例えば、本実施形態の細胞培養用デバイスを用いて発芽種子を培養する場合において、細胞培養用デバイスの天面は発芽した芽が貫くことができる程度の硬度を有し、且つ生分解性材料からなることにより、発芽種子をデバイス内に入れたものをそのまま土壌に植え込み、植物体を生育することができる。

なお、本明細書において「生分解性材料」とは、土壌中又は水中の微生物等によって無機物に分解される性質を有する材料を意味する。

前記脊椎動物細胞（特に、哺乳動物細胞）としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。また、これら細胞の多細胞性球状凝集塊（スフェロイド）を用いてもよい。また、生体の正常組織又はがん組織から分離された小さな組織片を、そのまま細胞塊と同様に用いてもよい。

生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、表皮角化細胞（ケラチノサイト）、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。

幹細胞とは、自己を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。

前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。

がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞であり、周囲の組織に浸潤し、又は転移を起こす悪性新生物である。がん細胞の由来となる癌としては、例えば、乳癌（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌等）、前立腺癌（例えば、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌等）、膵癌（例えば、膵管癌等）、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌等）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫等）、結腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸癌（例えば、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍等）、小腸癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌等）、頭頚部癌、唾液腺癌、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓癌（例えば、原発性肝癌、肝外胆管癌等）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌等）、胆嚢癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱癌、尿道癌、皮膚癌（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺癌（例えば、甲状腺髄様癌等）、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。

また、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。

細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。

本実施形態の培養方法に用いられる培養液は、細胞が動物細胞である場合、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基礎培養液を用いることができ、細胞の種類により適宜選択することができる。前記培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられ、これらに限定されない。

また、細菌、酵母、植物細胞、及びそれらの単一細胞又は複数の細胞から構成される小さな生命個体の培養液は、各々の生育に適した組成の培養液を調製すればよい。

また、本実施形態の培養方法において、細胞を懸濁する培養液に、細胞外マトリックス由来成分、生理活性物質等を混合し、注入してもよい。

前記細胞マトリックス由来成分としては、上述の「半透膜」の「構成材料」の「その他」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

また、前記生理活性物質としては、例えば、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。例えば、分化誘導因子を含むことにより、注入する細胞が幹細胞、又は前駆細胞等である場合、該幹細胞、又は前駆細胞を分化誘導し、所望の組織を再現した多細胞構造体を構築させることができる。

また、本実施形態の培養方法において、細胞を懸濁した培養液を細胞培養用デバイスの容量一杯になるように注入してもよく、又は細胞培養用デバイスの容量に満たない量を注入してもよい。例えば、細胞培養用デバイスが図２に示すように半透膜を天面及び底面に備える構造であり、半透膜の材料がコラーゲンである場合、注射針等により細胞を懸濁した培養液を細胞培養用デバイスの容量に満たない量注入し、引き抜くことにより、減圧により細胞培養用デバイスの天面と底面とが凹み、天面の半透膜と底面の半透膜に細胞が挟まれ、コラーゲンを用いたサンドイッチ培養を行うことができる。

本実施形態の培養方法において、培養条件としては、培養する細胞の種類により適宜選択することができる。

培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下であってもよく、例えば３０℃以上３９℃以下であってもよく、例えば３５℃以上３９℃以下であってもよい。

また、培養時のＣＯ_２濃度は、例えば約５％のＣＯ_２条件下であってもよい。

培養時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば３日以上３０日以下であってもよく、例えば５日以上２０日以下であってもよく、例えば７日以上１５日以下であってもよい。

＜細胞数の測定方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の細胞培養用デバイスを用いる細胞数の測定方法を提供する。

本実施形態の測定方法によれば、血球計算盤を用いずに、細胞培養用デバイス内に含まれる細胞数を容易に計測することができる。

本実施形態の測定方法について、以下に詳細に説明する。

まず、細胞を懸濁した培養液を準備する。次いで、ピペット、スポイト、又は注射針（翼状針、留置針等含む）等のノズルを使用して、上述の細胞培養用デバイス内に細胞を懸濁した培養液を注入する。

本実施形態の測定方法において用いられる細胞としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、本実施形態の測定方法において用いられる培養液としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

次いで、注入孔を栓で閉じて、細胞培養用デバイス内に細胞が均一に分散するように混和させた後、細胞培養用デバイスを顕微鏡にセットする。次いで、保持体が形成している格子の１マスに含まれる細胞を計測する。次いで、例えば、保持体において、１マスの縦及び横の長さが２５０μｍの格子が形成されている場合、そのうちの４マス×４マスの１６マスの格子（すなわち、縦１ｍｍ×横１ｍｍの１ｍｍ^２の中に形成された４マス×４マスの１６マスの格子）を用いて、該１６マスにおいて、それぞれ１マスに含まれる細胞を計測し、１６マス内の細胞数の合計を算出する。異なる位置の１６マス（１ｍｍ^２）を用いて、少なくとも１回以上、細胞数を計測し、１ｍｍ^２中に含まれる細胞数の平均値を算出する。次いで、以下の式［１］の「Ｎ」に前記細胞数の平均値を代入することで、１ｃｍ^２当たりの細胞数「Ｃ」を算出することができる。
Ｃ ＝ Ｎ × １０^２ ・・・［１］
上記式［１］において、「１０^２」は１ｃｍ^２に対する容量の変換値を意味する。

さらに、以下の式［２］の「Ｓ」に細胞培養用デバイスの底面積を代入することで、細胞培養用デバイスに含まれる全ての細胞数「Ａ」を算出することができる。
Ａ ＝ Ｃ × Ｓ ・・・［２］

細胞数を測定することで、所望の細胞数となるまで細胞培養用デバイス内において、細胞を培養することができる。さらに、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ等の死細胞のみを染色する試薬を用いることで、細胞培養用デバイス内の細胞の生存率を細胞培養用デバイスから取り出さずに測定することができる。

＜組織型チップ＞
一実施形態において、本発明は、１種類の細胞を含む上述の細胞培養用デバイスを備える組織型チップを提供する。

本実施形態の組織型チップは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクリーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な組織に対する動態及び毒性の評価試験系に活用することができる。

さらに、従来の培養モデルは構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があったのに対し、本実施形態の組織型チップは、長期間培養が可能である。

本実施形態の組織型チップに含まれる細胞としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、含まれる細胞の種類は、構築したい組織の種類に応じて、適宜選択することができる。

また、本実施形態の組織型チップに含まれる細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。本実施形態の組織型チップは、含まれる細胞が多細胞構造体を構築した後であっても、３～２１日程度の長期間培養が可能である。

本実施形態の組織型チップに含まれる細胞の密度は、構築したい組織の種類により異なるが、２．０×１０^３細胞／ｍＬ以上１．０×１０^９細胞／ｍＬ以下であることが好ましく、２．０×１０^５細胞／ｍＬ以上１．０×１０^８細胞／ｍＬ以下であることがより好ましい。

細胞密度が上記範囲内であることにより、生体組織により近い細胞密度の組織型チップを得ることができる。

本実施形態の組織型チップは、上述の「細胞の培養方法」に記載の方法を用いて、製造することができる。また、製造後の組織型チップの維持条件についても、上述の「細胞の培養方法」に記載の培養条件と同条件とすることができる。また、組織型チップの内部には、培養液や空気等の気体を含んでいてもよく、培養液や空気等の気体を含まなくてもよい。組織型チップ内に培養液や空気等の気体を含まない場合、細胞、又は細胞及び細胞外マトリックス由来成分が密に接着しており、生体内の組織により近しい構成の多細胞構造体を構築している。

＜器官型チップ＞
一実施形態において、本発明は、少なくとも２種類の細胞を含む上述の細胞培養用デバイスを備える器官型チップを提供する。

本実施形態の器官型チップは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な器官に対する動態及び毒性の評価試験系に活用することができる。

さらに、従来の培養モデルは構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があったのに対し、本実施形態の器官型チップは、長期間培養が可能である。

本実施形態の器官型チップに含まれる細胞としては、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、含まれる細胞の種類は、少なくとも２種類の細胞を含めばよく、構築したい器官の種類に応じて、適宜選択することができる。

また、本実施形態の器官型チップに含まれる細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。本実施形態の器官型チップは、含まれる細胞が多細胞構造体を構築した後であっても、３～２１日程度の長期間培養が可能である。

本実施形態の器官型チップに含まれる細胞の密度は、構築したい器官の種類により異なるが、２．０×１０^３細胞／ｍＬ以上１．０×１０^９細胞／ｍＬ以下であることが好ましく、２．０×１０^５細胞／ｍＬ以上１．０×１０^８細胞／ｍＬ以下であることがより好ましい。

細胞密度が上記範囲内であることにより、生体内の器官により近い細胞密度の器官型チップを得ることができる。

本実施形態の器官型チップは、上述の「細胞の培養方法」に記載の方法を用いて、製造することができる。また、製造後の器官型チップの維持条件についても、上述の「細胞の培養方法」に記載の培養条件と同条件とすることができる。また、器官型チップの内部には、培養液や空気等の気体を含んでいてもよく、培養液や空気等の気体を含まなくてもよい。器官型チップ内に培養液や空気等の気体を含まない場合、細胞、又は細胞及び細胞外マトリックス由来成分が密に接着しており、生体内の器官により近しい構成の多細胞構造体を構築している。

＜多細胞構造体を提供するためのキット＞
一実施形態において、本発明は、多細胞構造体を提供するためのキットであって、上述の組織型チップ、又は上述の器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備えるキットを提供する。

本実施形態のキットは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクリーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な組織や器官に対する動態及び毒性の評価試験系に活用することができる。

さらに、従来の培養モデルは構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約があったのに対し、本実施形態のキットは、長期間培養が可能である。

本実施形態のキットにおける組織型チップ、又は器官型チップに含まれる細胞は、多細胞構造体が構築される途中の段階であってもよく、多細胞構造体が構築された後であってもよい。中でも、すぐにインビトロ試験系に利用することができることから、本実施形態のキットにおける組織型チップ、又は器官型チップに含まれる細胞は多細胞構造体が構築された後であることが好ましい。

本実施形態のキットにおける密封容器は、開閉可能なものを用いることができ、特別な限定はない。密封容器としては、例えば、スクリューキャップ付のコニカルチューブ、スクリューキャップ付の細胞培養用フラスコ、ジッパー付き袋、チャック付き袋等が挙げられ、これらに限定されない。

密封容器の材料としては、液密性を有するものを用いることができる。また、密封容器は、通気性を有するものであってもよく、通気性を有さないものであってもよい。密封容器の材料としてより具体的には、上述の［部材］において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、密封容器の材料としては、壊れにくく、軽量であることから、プラスチックであることが好ましい。

本実施形態のキットにおける培養液は、組織型チップ、又は器官型チップに含まれる細胞の種類により適宜選択することができ、具体的には、上述の「細胞の培養方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

また、本実施形態のキットにおいて、培養液は、密封容器の容量一杯に含まれることが好ましい。これは、密封容器に培養液を容量一杯まで注ぎ、密封することで、組織型チップ、又は器官型チップの乾燥を防ぎ、組織型チップ、又は器官型チップを安全に持ち運ぶことができる。

本実施形態のキットにおいて、密封容器の中に含まれる組織型チップ、又は器官型チップは１つであってもよく、２つ以上であってもよい。２つ以上である場合、同じ種類の多細胞構造体が構築された組織型チップ、又は器官型チップであることが好ましい。

本実施形態のキットは、さらに、密封容器に含まれる培養液とは別に、培養液を備えていてもよい。培養液が密封容器に含まれるものと同じ種類であってもよく、別の種類であってもよい。培養液を別に備えることにより、本実施形態のキットをインビトロ試験系等において使用するまでの間、組織型チップ、又は器官型チップを培養するための交換用培養液として用いることができる。

＜器官型チップシステム＞
一実施形態において、本発明は、上述の組織型チップ、又は、上述の器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ、又は、前記器官型チップが密閉性を保ちながら連結された器官型チップシステムを提供する。

本実施形態の器官型チップシステムは、一から培養モデルを構築する必要がなく、従来の培養モデル、又は、動物実験の代替として、各種疾患に対する候補薬剤のスクリーニング、若しくは候補薬剤をはじめとする化学物質の正常な複数の組織や器官に対する動態及び毒性の評価試験等への活用が期待できる。

なお、本明細書において、「密閉」とは、隙間なく閉じられた状態を意味する。

［第１実施形態］
図８Ａは、本発明の第１実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。

ここに示す器官型チップシステム１０Ａは、３つの組織型チップ１Ａがそれぞれチューブ１０１を介して連結した構造である。

例えば、培養液を左側の矢印の方向から右側の矢印の方向へ流すことにより、３つの組織型チップ１Ａを連結されたままの状態で培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を左側の矢印の方向から右側の矢印の方向へ流すことにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。

図８Ａに示す組織型チップ１Ａは、上述の「組織型チップ」に記載のものと同様のものである。組織型チップ１Ａに構築された多細胞構造体を構成する細胞（図示せず）の種類は、所望の器官、又は器官系の種類により適宜選択することができる。

また、図８Ａに示すチューブ１０１は、図４のチューブ１３と同様であり、その構成は上述の「チューブ」に記載のものと同様のものである。

［第２実施形態］
図８Ｂは、本発明の第２実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。

ここに示す器官型チップシステム１０Ｂは、同じ大きさの３つの組織型チップ１Ｂが積み重ねられた構造である。このとき、それぞれの組織型チップ１Ｂの少なくとも天面及び底面は半透膜である。

例えば、培養液を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向へ流すことにより、３つの組織型チップ１Ｂを積み重ねたままの状態で培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向へ流すことにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。

［第３実施形態］
図８Ｃは、本発明の第３実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。

ここに示す器官型チップシステム１０Ｃは、大きさの異なる４つの組織型チップ１Ｃを有し、一番大きな組織型チップ１Ｃの中に、小さな組織型チップ１Ｃが封入された構造である。このとき、一番大きな組織型チップ１Ｃの少なくとも天面及び底面は半透膜であり、一番大きな組織型チップ１Ｃに封入された組織型チップ１Ｃは全面半透膜である。

例えば、培養液を含むシャーレ等の容器に器官型チップシステム１Ｃを入れることで培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を含むシャーレ等の容器に器官型チップシステム１Ｃを入れることにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。

［第４実施形態］
図８Ｄは、本発明の第４実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。

ここに示す器官型チップシステム１０Ｄは、大きさの異なる４つの組織型チップ１Ｄが大きい順に下から積み重ねられた構造である。このとき、それぞれの組織型チップ１Ｄの少なくとも天面及び底面は半透膜である。

例えば、培養液を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向へ流すことにより、４つの組織型チップ１Ｄを積み重ねたままの状態で培養することができる。また、例えば、各種疾患に対する候補薬剤を上側の矢印の方向から下側の矢印の方向に流すことにより、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性等を検証することができる。

本実施形態の器官型チップシステムは、図８Ａ～図８Ｄに限定されず、本実施形態の器官型チップシステムの効果を損なわない範囲内において、図８Ａ～図８Ｄに示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。

例えば、図８Ａ～図８Ｄにおいて組織型チップを備える場合を例示したが、器官型を少なくとも一部に備えるものであってもよい。

例えば、図８Ａに示す器官型チップシステムは、各チューブが栓や弁等の開閉可能な装置を備えていてもよい。

また、図８Ｂ及び図８Ｄに示す器官型チップシステムは、それぞれの組織型チップが支持体を有していてもよく、さらに、それぞれの組織型チップを固定するために、天面及び底面の外周を接着剤等で固定していてもよい。

また、本実施形態の器官型チップシステムにおいては、各構成（組織型チップ、チューブ等）の大きさや形状は、目的に応じて任意に調節できる。

本実施形態の器官型チップシステムは、それ自体で、例えば、肝臓、胃、腸等の臓器を再現することができる。さらに、本実施形態の器官型チップシステムを複数組み合わせることにより、例えば、消化器系、循環器系、呼吸器系、泌尿器系、生殖器系、内分泌系、感覚器系、神経系、運動器系、神経系等の器官系を再現することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［製造例１］半透膜１の製造
１．保持体の準備
まず、ポリエステル製メッシュ（Ｔ８０－７０；株式会社ヤマニ製、線径７０μｍ、目開き２４８μｍ×２４８μｍ）を保持体として使用するために、ハサミで直径３４ｍｍの円形に切り出した。次いで、直径６０ｍｍペトリディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ＃３５１００７）に、７０％エタノールを入れた。次いで、ペトリディッシュ中に、保持体として使用する直径３４ｍｍの円形メッシュを１０分程度浸し、殺菌した。次いで、７０％エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに５ｍＬのＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ８５３７）を入れ、保持体を洗浄した。このＰＢＳによる洗浄は計３回繰り返した。洗浄後、保持体１枚を直径３５ｍｍディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ＃３５３００１）に移し入れ、１０％ ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ（以下、「培養液」と称する場合がある。）２ｍＬを加えて１０分間浸漬した。

２．半透膜１の製造
半透膜の製造は、保持体包埋ネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜（ネイティブコラーゲンの単位面積あたりの含有量：０．５ｍｇ／ｃｍ^２）（以下、「半透膜１」と称する場合がある。）を公知の方法（参考文献：特開平８－２２８７６８号公報）に準じて調製した。なお、半透膜１は２枚製造した。

（１）まず、氷上で冷却した５０ｍＬコニカルチューブに３ｍＬの培養液を加え、さらに３ｍＬの細胞培養用０．５％コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＡＣ（高研社製）を加えて均一に混合することで、０．２５％コラーゲンゾルを調製した。

（２）次いで、保持体１枚が入っている直径３５ｍｍディッシュより培養液を除去した後、２ｍＬの０．２５％コラーゲンゾルを注いだ。次いで、５％ＣＯ_２／９５％空気存在下の３７℃細胞培養用インキュベーター内で２時間静置することでゲル化し、保持体を包埋したネイティブコラーゲンゲルを作製した。

（３）保持体を包埋したネイティブコラーゲンゲルを、１０℃、湿度４０％（４０％ＲＨ）の恒温恒湿機に設置した簡易クリーンベンチ内に移し入れた。その後、２日間静置し、乾燥させ、保持体を包埋したネイティブコラーゲンゲル乾燥体を得た。

（４）次いで、恒温恒湿機より取り出し、保持体を包埋したネイティブコラーゲンゲル乾燥体の入っている直径３５ｍｍディッシュに２ｍＬのＰＢＳを注いで１０分間静置し、再水和した。ＰＢＳを除去して、再度、２ｍＬのＰＢＳを注いで１０分間静置した後、再水和された保持体を包埋したネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜をディッシュ底面より剥離して、予め２ｍＬのＰＢＳを注いだ新しい直径３５ｍｍディッシュ内に移し入れ、ＰＢＳで平衡化した。

（５）次いで、得られた保持体を包埋したネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜をビニールを敷いた９６×９６×１５ｍｍのディッシュ（アズワン♯Ｄ－２１０－１６）の上に乗せて、１０℃、湿度４０％（４０％ＲＨ）の恒温恒湿機に設置した簡易クリーンベンチ内に移し入れ、再乾燥し、保持体を包埋したネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を得た。この保持体を包埋したネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体を、ハサミで直径１３ｍｍの円形に切り出し、保持体包埋コラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体（半透膜１）を得た（図９参照。）。

［製造例２］
１．半透膜（コントロール）の製造
（１）まず、ナイロン膜 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｔ＃ＲＰＮ１７８２Ｂ）をくり抜き機（森下製版、刃：直径２４ｍｍ～３３ｍｍ）でくり抜き、外径３３ｍｍ、内径２４ｍｍの環状ナイロン膜支持体を作製した。次いで、直径６０ｍｍペトリディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ＃３５１００７）に、７０％エタノールを入れた。このペトリディッシュ中に、環状ナイロン膜支持体を１０分程度浸し、殺菌した。次いで、７０％エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに５ｍＬのＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ８５３７）を入れ、環状ナイロン膜支持体を洗浄した。このＰＢＳによる洗浄は計３回繰り返した。洗浄後、環状ナイロン膜支持体１枚を直径３５ｍｍディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ＃３５３００１）に移し入れ、培養液２ｍＬを加えて１０分間浸漬した。

（２）保持体の代わりに環状ナイロン膜支持体を包埋したこと以外は、製造例１の「２．半透膜１の製造」と同様の方法を用いて、環状ナイロン膜支持体を包埋したネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜乾燥体（以下、「半透膜（コントロール）」と称する場合がある。）を得た。

［製造例３］半透膜２の製造
１．保持体の準備
ポリエステル製メッシュ（Ｔ８０－７０；株式会社ヤマニ製、線径７０μｍ、目開き２４８μｍ×２４８μｍ）を保持体として使用するために、ハサミで直径１３ｍｍの円形に切り出した。まず、直径３５ｍｍペトリディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｃａｔ＃３５１００８）に、７０％エタノールを入れた。次いで、ペトリディッシュ中に、保持体として使用する直径１３ｍｍの円形メッシュを１０分程度浸し、殺菌した。次いで、７０％エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに２ｍＬのＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ８５３７）を入れ、保持体を洗浄した。このＰＢＳによる洗浄は計３回繰り返した。洗浄後、ＰＢＳを除去し、培養液２ｍＬを加えて１０分間浸漬した。

２．半透膜２の製造
半透膜の製造は、公知の方法（参考文献：特開２０１５－２０３０１８号公報）に準じて０．２５％コラーゲンゾルを接着剤として使用し、２枚のネイティブコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜（ネイティブコラーゲンの単位面積あたりの含有量：０．５ｍｇ／ｃｍ^２）の間に保持体を挟み結合することで調製した（以下、「半透膜２」と称する場合がある。）。なお、半透膜２は２枚製造した。

（１）まず、製造例２の「１．半透膜（コントロール）の製造」と同様の方法を用いて、半透膜（コントロール）を作製した。

（２）次いで、２枚の半透膜（コントロール）を再水和した。ビニールを敷いた９６×９６×１５ｍｍのディッシュ（アズワン♯Ｄ－２１０－１６）の上に再水和した１枚の半透膜（コントロール）を乗せ、その中央に培養液に浸した直径１３ｍｍの円形メッシュの保持体を置き、さらに、その上に製造例１の「２．半透膜１の製造（１）」と同様の方法を用いて作製した０．２５％コラーゲンゾルを０．１ｍＬ添加した。次いで、その上に、再水和したもう１枚の半透膜（コントロール）を覆い被せて、気泡が入らないように再水和した２枚の半透膜（コントロール）で保持体を挟んだ。次いで、１０℃、湿度４０％（４０％ＲＨ）の恒温恒湿機に設置した簡易クリーンベンチ内に移し入れ、一晩乾燥し、２枚の半透膜（コントロール）で保持体を挟んで接着した乾燥体を得た。

（３）２枚の半透膜（コントロール）で保持体を挟んで接着した乾燥体を、ＦＵＮＡ－ＵＶ－Ｌｉｎｋｅｒ（フナコシ：ＦＳ－１５００／１５Ｗ／２５４ｎｍ）内に移し入れ、２００ｍＪ／ｃｍ^２の照射量となるようにＵＶを照射した。次いで、２枚の半透膜（コントロール）で保持体を挟んで接着した乾燥体を裏返して、もう一度、２００ｍＪ／ｃｍ^２の照射量でＵＶを照射した。この合計４００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶ照射により、再水和した際にも２枚の半透膜（コントロール）が分離されることなく接着を維持できた。

（４）保持体を挟んで接着した半透膜（コントロール）の乾燥体を、ハサミで直径１３ｍｍの円形に切り出し、保持体を挟んで接着したコラーゲンビトリゲル（登録商標）膜材料乾燥体（半透膜２）を得た。

［実施例１］
１．細胞培養用デバイスの製造
アクリル樹脂リング（外径１３ｍｍ、内径７．９８ｍｍ、厚さ２．０ｍｍ、注入孔径０．７ｍｍ）の両面に保持体を含む半透膜を貼り付けることで、以下の３種類の細胞培養用デバイスを製造した。また、コントロールとして、アクリル樹脂リングの両面に保持体なしの半透膜のみを貼り付けた細胞培養用デバイスを製造した。なお、本実施例では、保持体を含む半透膜をアクリル樹脂リングの両面に貼り付けたが、保持体を含む半透膜をアクリル樹脂リングの片面のみに貼り付けて、もう一方の面には保持体なしの半透膜を貼り付けてもよい。

（１）細胞培養用デバイス１の製造
まず、アクリル樹脂リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を塗布し、製造例１で製造した半透膜１を貼り付けた。次いで、アクリル樹脂リングを裏返したもう一方の面にも同様にポリウレタン系接着剤を塗布して、製造例１で製造した半透膜１を貼り付けた（以下、「細胞培養用デバイス１」と称する場合がある。）。

（２）細胞培養用デバイス２の製造
まず、アクリル樹脂リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を塗布し、製造例３で製造した半透膜２を貼り付けた。次いで、アクリル樹脂リングを裏返したもう一方の面にも同様にポリウレタン系接着剤を塗布して、製造例３で製造した半透膜２を貼り付けた（以下、「細胞培養用デバイス２」と称する場合がある。）。

（３）細胞培養用デバイス（コントロール）の製造
（３－１）まず、製造例２で製造した２枚の半透膜（コントロール）を再水和した後、公知の方法（参考文献：特開２００７－１８５１０７号公報）に準じて、２枚の環状ゴム磁石の間に挟持させて磁力で固定した後に再乾燥することで、しわの無い半透膜（コントロール）の乾燥体を得た。

（３－２）次いで、アクリル樹脂リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を塗布し、環状ゴム磁石の間に挟持させた半透膜（コントロール）の乾燥体を貼り付けた後、環状ゴム磁石を除去し、さらに、アクリル樹脂リングよりはみ出た半透膜（コントロール）の乾燥体をハサミで切り落とした。アクリル樹脂リングを裏返したもう一方の面にも、同様の操作を施した（以下、「細胞培養用デバイス（コントロール）」と称する場合がある。）。

（４）細胞培養用デバイス３の製造
（４－１）まず、上記「（３）細胞培養用デバイス（コントロール）の製造」と同様の方法を用いて、細胞培養用デバイス（コントロール）を得た。

（４－２）次いで、ポリエステル製メッシュ（Ｔ８０－７０；株式会社ヤマニ製、線径７０μｍ、目開き２４８μｍ×２４８μｍ）を保持体として使用するために、ハサミで直径１３ｍｍの円形に切り出し、７０％エタノールに１０分程度浸して殺菌した後、乾燥した。

（４－３）次いで、半透膜（コントロール）を貼り付けたアクリル樹脂リングの両面に、リング領域のみにポリウレタン系接着剤を塗布し、殺菌した直径１３ｍｍの円形メッシュの保持体を貼り付けた（以下、「細胞培養用デバイス３」と称する場合がある。）。つまり、半透膜（コントロール）の外側の保持体は外周部（リング領域）でのみ接着していた。

２．細胞培養用デバイスの膜の物性
（１）細胞培養用デバイスの膜のたわみ具合の確認
まず、細胞培養用デバイス１、細胞培養用デバイス２、細胞培養用デバイス３、及び細胞培養用デバイス（コントロール）の注入孔から、それぞれＰＢＳを注入し、細胞培養用デバイス１、細胞培養用デバイス２、細胞培養用デバイス３、及び細胞培養用デバイス（コントロール）内をＰＢＳで満たし、ステンレス剛製の球を用いて、注入孔を塞いだ。次いで、細胞培養用デバイス１、細胞培養用デバイス２、細胞培養用デバイス３、及び細胞培養用デバイス（コントロール）を縦置きにて静置した。細胞培養用デバイス１及び細胞培養用デバイス（コントロール）の様子を図１０Ｂ及び図１１Ｂにそれぞれ示す。

図１０Ｂから、２枚の半透膜１を備える細胞培養用デバイス１では、ＰＢＳを満たしても、膜はたわむことなく、平滑であった。同様の現象が、細胞培養用デバイス２及び細胞培養用デバイス３についても確認された。

一方、図１１Ｂから、２枚の半透膜（コントロール）を備える細胞培養用デバイス（コントロール）では、ＰＢＳを満たすことにより、膜が２枚ともたわんでおり、凸状に膨らんでいた。

以上のことから、保持体を含む半透膜を備える細胞培養用デバイスでは、膜はたわむことなく保持されることが示された。

（２）細胞培養用デバイスの膜の強度の確認
次いで、ＰＢＳで満たされた細胞培養用デバイス１、細胞培養用デバイス２、細胞培養用デバイス３、及び細胞培養用デバイス（コントロール）を、ピンセットを用いて、半透膜の面を摘まみ上げた。細胞培養用デバイス１及び細胞培養用デバイス（コントロール）の様子を図１０Ａ及び図１１Ａにそれぞれ示す。

図１０Ａから、２枚の半透膜１を備える細胞培養用デバイス１では、膜はピンセットによる損傷なく保持できた。同様の現象が、細胞培養用デバイス２及び細胞培養用デバイス３についても確認された。

一方、図１１Ａから、２枚の半透膜（コントロール）を備える細胞培養用デバイス（コントロール）では、膜はピンセットにより圧縮され、損傷した。

以上のことから、保持体を含む半透膜を備える細胞培養用デバイスでは、ピンセットによる損傷なく保持され、取扱いが容易であることが示された。

［試験例１］細胞培養用デバイスを用いたヒト肝がん細胞株のＨｅｐＧ２細胞の培養
（１）予め培養したＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所バイオリソースセンターより購入、ＲＣＢ１６４８）を回収し、１．０×１０^５細胞／ｍＬとなるように培養液と混合し、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を調製した。

（２）次いで、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を留置針付き１ｍＬシリンジ内に充填した。次いで、実施例１で作製した細胞培養用デバイス１、細胞培養用デバイス２、及び細胞培養用デバイス３の注入孔から留置針の先端を射し入れた。次いで、ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液１００μＬを細胞培養用デバイス１、細胞培養用デバイス２、及び細胞培養用デバイス３の中に注入し、ステンレス剛製の球を用いて、注入孔を塞いだ。

（３）次いで、２４ウェルプレートの各ウェル内に１ｍＬの培養液を注入し、ＨｅｐＧ２細胞を培養した各デバイスを沈めて、培養を開始した。

（４）次いで、一日置きに培養液を交換し、細胞培養用デバイスに封入されたＨｅｐＧ２細胞を、位相差顕微鏡を用いて、培養１日目、２日目、４日目、７日目、１０日目、及び１４日目と経時的に観察し、撮影した。細胞培養用デバイス３の結果を、図１２Ａ～図１２Ｆに示す。

図１２Ａ～図１２Ｆから、培養７日目頃までは、保持体の格子の１マス内に含まれる細胞を、位相差顕微鏡を用いて計測できることが示された。同様の現象は、細胞培養用デバイス１及び細胞培養用デバイス２についても確認された。

また、経時的にＨｅｐＧ２細胞が増殖しており、細胞培養用デバイスを用いて培養できることが示された。

本実施形態の半透膜は、たわみにくく、取扱いが容易な適度な強度を有する。また、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞保護性能が優れるのみならず、取扱いも容易であって、細胞の長期間培養が可能であり、且つ、細胞数を計測可能である。さらに、本実施形態の細胞培養用デバイスを用いて、組織型チップ、器官型チップ、又は、器官型チップシステムを構築することにより、従来の培養モデル、又は、動物実験の代替として、疾患に対する薬効、薬剤及びその代謝物の代謝経路や細胞毒性の確認試験等への活用が期待できる。

１…保持体、１０…半透膜、１０ａ…保持体を含む半透膜、１１…部材、１１ａ…第１の部材、１１ｂ…第２の部材、１２…支持体、１３，１０１…チューブ、１４…注入孔、１４ａ…第１の注入孔、１４ｂ…第２の注入孔、１００，２００，３００，６００…細胞培養用デバイス、４００ａ，５００ａ…細胞培養用デバイス（デバイス内部と外部とが注入孔を介して連通）、４００ｂ，５００ｂ…細胞培養用デバイス（デバイス内部と外部とが不通）、１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ…組織型チップ、１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ…器官型チップシステム。

Claims (14)

1. 血球計算盤として機能する格子構造を有する低吸水性の保持体を含むビトリゲル膜を少なくとも一部に備える多細胞構造体培養用デバイスであって、
   前記ビトリゲル膜は、ハイドロゲル膜をガラス化した後に再水和して得られるゲル膜である、多細胞構造体培養用デバイス。
2. 前記保持体の格子構造において、格子を形成する縦の線及び横の線のそれぞれの間隔が、１００μｍ以上５００μｍ以下である、請求項１に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
3. 前記保持体がポリエステル又はポリスチレンからなる請求項１又は２に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
4. ネイティブコラーゲン、又はアテロコラーゲン由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
5. 培養液に懸濁された細胞を注入可能であり、内部容積が１０ｍＬ以下である請求項１～４のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
6. 全体が前記ビトリゲル膜からなる請求項１～５のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
7. １種類の細胞を含む請求項１～６のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを備える組織型チップ。
8. 前記細胞の密度が、２．０×１０^３細胞／ｍＬ以上１．０×１０^９細胞／ｍＬ以下である請求項７に記載の組織型チップ。
9. 少なくとも２種類の細胞を含む請求項１～６のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを備える器官型チップ。
10. 前記細胞の密度が、２．０×１０^３細胞／ｍＬ以上１．０×１０^９細胞／ｍＬ以下である請求項９に記載の器官型チップ。
11. 多細胞構造体を提供するためのキットであって、
    請求項７若しくは８に記載の組織型チップ、又は、請求項９若しくは１０に記載の器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備えるキット。
12. 請求項７若しくは８に記載の組織型チップ、又は、請求項９若しくは１０に記載の器官型チップを少なくとも２つ備え、前記組織型チップ又は前記器官型チップが密閉性を保ちながら連結されている器官型チップシステム。
13. 請求項１～６のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを用いる細胞の培養方法。
14. 請求項１～６のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを用いる細胞数の測定方法。

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