JP7038202B2 - 新規な乳酸菌およびその用途 - Google Patents

Description

KCCM KCCM12090P KCCM KCCM12297P KCCM KCCM11807P

本発明は、新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリおよびビフィドバクテリウム・アドレセンティスに関し、具体的には、脳神経精神疾患または炎症疾患の予防および治療に有用な新規な乳酸菌を含む組成物に関する。
また、本発明は、腸内微生物レベルを測定する製剤を含む脳神経精神疾患診断用の組成物に関する。

現代社会では、急増するストレスなどにより不安、うつ、精神分裂などを含む脳神経精神疾患が増加している。特に個人主義が広まった現時代の社会的、構造的な原因などの様々な原因により、うつ病および不安症などの精神障害を抱える患者が増加する傾向にある。
精神障害を抱える患者はひどい場合には自殺につながりうるし、特にうつ病患者の過半数以上が自殺を考えると報告されたことがあり、実際に１０～１５％の患者が自殺を試みると知られている。

精神障害は明確で客観的な判断基準がなく患者ごとに症状が異なりうるし、精神障害が疑われる場合には正確な診断および検査に応じた治療が求められるが、精神障害による病院治療に対する否定的な社会認識のため、ろくな治療が行われていない実情である。また、精神障害を治療するために用いられる抗うつ剤などの薬物は治療効果がそれほど大きくなく、心血管系疾患および自殺などの深刻な副作用が現れるのでその使用が制限的である。

一方、天然物を用いた研究の結果として、大韓民国公開特許第１０－２０１７－００６１４５７号にはツリガネタケ抽出物および紫草抽出物を用いた精神障害治療用の組成物が開示されているが、精神障害を治療できる効果的な乳酸菌については持続的な研究が未だに必要な実情である。

このような背景下、本発明者らは、精神障害の予防および治療剤を研究している最中、腸内微生物群集の変化から精神障害を診断できることを確認し、さらには、ヒトおよびマウスの糞便から分離した新規な乳酸菌が神経退行性疾患誘発因子を抑制し、不安およびうつ行動を改善する効果などを示し、脳神経精神疾患、具体的には神経退行性疾患および精神障害の予防または治療に有用に使用できることを確認し、本発明を完成するに至った。

大韓民国公開特許第１０－２０１７－００６１４５７号

本発明の目的は、新規な乳酸菌を提供することにある。

本発明の他の目的は、新規な乳酸菌を含む脳神経精神疾患の予防または治療用の組成物を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、新規な乳酸菌を含む炎症疾患の予防または治療用の組成物を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、腸内微生物レベルを測定する製剤を含む脳神経精神疾患診断用の組成物を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、脳神経精神疾患が疑われる個体から分離した糞便から腸内微生物レベルを測定するステップ；および前記腸内微生物レベルを脳神経精神疾患ではない対照群の糞便の腸内微生物レベルと比較するステップを含む脳神経精神疾患の診断方法を提供することにある。

前記目的を達成するための一様態として、本発明は、新規な乳酸菌を提供する。

具体的には、本発明において、前記新規な乳酸菌は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０１７．０８．０４、受託番号：ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）（寄託機関：韓国微生物保存センター、寄託日：２０１８．０８．０３、受託番号：ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）であってもよい。

本発明のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８は、ヒトまたはマウスの糞便から分離および同定された新規な乳酸菌であることを特徴とする。

本発明のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３の同定および分類のための１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号１の通りである。したがって、本発明のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）は、配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡを含むことができる。前記配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の分析結果、公知のラクトバチルス・ロイテリ菌株と９９％の相同性を示しており、ラクトバチルス・ロイテリと最も高い分子系統学的類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）に同定し、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３に命名し、韓国微生物保存センターに２０１７年８月４日付で寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）。

本発明のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３はグラム陽性菌であり、細胞の形態は桿菌である。より具体的なラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３の生理学的特性は当該技術分野における通常の方法により分析することができ、その結果は下記表３の通りである。具体的には、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３は、炭素源として、Ｌ－アラビノース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンノース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ－アセチル－グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、メレジトース、ラフィノース、ゲンチオビオース、Ｄ－ツラノースおよびグルコネートを用いることができる。

本発明のビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の同定および分類のための１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、本明細書に添付された配列番号３８の通りである。したがって、本発明のビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）は、配列番号３８の１６Ｓ ｒＤＮＡを含むことができる。前記配列番号３８の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の分析結果、公知のビフィドバクテリウム・アドレセンティス菌株と９８％の相同性を示しており、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスと最も高い分子系統学的類縁関係を示した。したがって、前記乳酸菌をビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）に同定し、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８に命名し、韓国微生物保存センターに２０１８年８月３日付で寄託した（受託番号ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）。

本発明のビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の生理学的特性は当該技術分野における通常の方法により分析することができ、その結果は下記表４の通りである。具体的には、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８は、炭素源として、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ラクトース、Ｄ－サッカロース、Ｄ－マルトース、サリシン、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、ゼラチン、エスクリンクエン酸鉄、Ｄ－セロビオース、Ｄ－ラフィノースおよびＤ－トレハロースを用いることができる。

前記目的を達成するための他の一様態として、本発明は、新規な乳酸菌を含む脳神経精神疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供する。

本発明において、前記新規な乳酸菌は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）またはこれらの混合物であってもよい。

本発明の「ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）」および「ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）」は、前記で説明した通りである。

具体的には、本発明の薬学組成物に含まれる乳酸菌は、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物であってもよいが、脳神経精神疾患の予防または治療の効果を達成できる乳酸菌の形態であれば、特に制限されない。

本発明における用語「培養物」は乳酸菌を公知の液体培地または固体培地で培養させて得たものを意味し、本発明においては新規な乳酸菌を含む概念である。

本発明の脳神経精神疾患は、神経退行性疾患または精神障害であってもよい。

具体的には、本発明の脳神経精神疾患は精神障害であってもよく、前記精神障害は不安、うつ病、気分障害、不眠症、妄想障害、強迫性障害、偏頭痛、ストレス、記憶障害、認知障害および注意力障害を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。

本発明の一実施例においては、ストレスが誘導された動物モデルにラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）の投与時、ストレスによる不安およびうつ行動が顕著に改善され、ストレスが誘導された動物モデルの海馬においてＮＦ－κＢの活性が抑制され、脳由来神経栄養因子の発現が増加し、血中ストレス指標因子であるコルチコステロン、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）の量が減少することを確認した。それにより、前記乳酸菌を含む薬学組成物が脳神経精神疾患、具体的には精神障害の予防または治療に有用に使用できることを確認した。

具体的には、本発明の脳神経精神疾患は神経退行性疾患であってもよく、前記神経退行性疾患はパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄小脳変性症（Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）、トゥレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、フリードライヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ Ａｔａｘｉａ）、マチャド・ジョセフ病（Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、痴呆、ジストニア（Ｄｙｓｔｏｎｉａ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ Ｐａｌｓｙ）および前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ）からなる群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。

本発明の一実施例においては、神経細胞にストレスホルモンであるコルチコステロンと共に前記乳酸菌の処理時、アルツハイマーのような神経退行性疾患を誘発する物質として知られたＮＦ－κＢの活性が抑制されると共に、老化および痴呆などにおいて発現が減少するものとして知られた脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現が増加することを確認した（表５および６）。それにより、前記乳酸菌を含む薬学組成物が脳神経精神疾患、具体的には神経退行性疾患の予防および治療に有用に使用できることを確認した。

また、本発明の一実施例においては、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を併用投与する場合、前記乳酸菌の単独投与群に比べて脳神経精神疾患、具体的にはストレス改善効果が顕著に上昇することを確認した（表２０）。
本発明において、前記薬学組成物は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＩＭ３８） ＫＣＣＭ１１８０７Ｐをさらに含むことができる。

前記ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＩＭ３８） ＫＣＣＭ１１８０７Ｐは、大韓民国公開特許第１０－２０１７－００９０３５９号に開示された公知の乳酸菌であって、大韓民国公開特許第１０－２０１７－００９０３５９号を根拠に容易に入手可能である。

本発明の一実施例においては、ストレスが誘導された動物モデルにラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８とビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８との併用投与時、ストレスによる不安およびうつ行動が顕著に改善され、血中ストレス指標因子であるコルチコステロンの量が減少することを確認した。

前記目的を達成するためのまた他の様態として、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）またはこれらの混合物を含む炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
本発明の「ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）」および「ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）」は、前記で説明した通りである。

具体的には、本発明の薬学組成物に含まれる乳酸菌はその生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物であってもよいが、炎症疾患の予防または治療効果を達成できる乳酸菌の形態であれば、特に制限されない。

本発明における用語「培養物」は乳酸菌を公知の液体培地または固体培地で培養させて得たものを意味し、本発明においては新規な乳酸菌を含む概念である。

本発明の炎症疾患は、関節炎、通風、肝炎、喘息、肥満、角膜炎、胃炎、腸炎、腎臓炎、大腸炎、糖尿、結核、気管支炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、膵臓炎、炎症痛、尿道炎、膀胱炎、膣炎、動脈硬化症、敗血症、火傷、皮膚炎、歯周炎および歯肉炎を含む群より選択されるいずれか一つ以上であってもよい。

本発明の一実施例においては、マウスから分離したマクロファージに炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライドと共に前記乳酸菌の処理時に炎症反応が顕著に抑制されることを確認した（表５および表６）。それにより、本発明の前記乳酸菌を含む薬学組成物が炎症疾患の予防および治療に有用に使用できることを確認した。
具体的には、前記炎症疾患は大腸炎であってもよい。

本発明の一実施例においては、ストレスにより大腸炎が誘導された動物モデルにラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の投与時、大腸炎の指標である大腸の長さが正常レベルに回復し、大腸炎の指標因子であるミエロペルオキシダーゼ、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの量が減少し、ＴＮＦ－αの活性が減少することを確認した（図１５および表１５）。それにより、前記ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を含む薬学組成物が炎症疾患、具体的には大腸炎の予防および治療に有用に使用できることを確認した。

本発明に係る脳神経精神疾患の予防または治療用の薬学組成物または炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または徐放を提供できるように当業界で周知の方法を利用して薬学的剤形に製造することができる。剤形の製造において、本発明に係る薬学組成物は、新規な乳酸菌の活性を阻害しない範囲内で薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。

前記薬剤学的に許容可能な担体は、通常用いられるもの、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などを含むが、これらに制限されるものではない。また、本発明の薬学的組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤、その他の薬剤学的に許容可能な添加剤を含むことができる。

本発明に係る薬学組成物の投与量は、薬剤学的に有効な量でなければならない。「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受惠／危険の比率で脳神経精神疾患または炎症疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。有効用量レベルは、製剤化方法、患者の状態および体重、患者の性別、年齢、疾患の程度、薬物の形態、投与経路および期間、排泄速度、反応感応性などのような要因に応じて当業者により多様に選択できる。有効量は、当業者に認識されているように、処理の経路、賦形剤の使用および他の薬剤と共に使用できる可能性に応じて異なりうる。しかし、好ましい効果のために、経口投与剤の場合、一般に、成人に１日に体重１ｋｇ当たりに本発明の組成物を１日に０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．００１～１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。上記のように投与剤を投与する場合、本発明のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を１日に１×１０²ＣＦＵ／６０ｋｇ～１×１０¹¹ＣＦＵ／６０ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定しようとするものではない。

本発明の脳神経精神疾患の予防または治療用の薬学組成物、または炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物は、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路を通して投与できる。具体的には、本発明の薬学組成物は、経口または非経口投与（例えば、塗布または静脈内、皮下、腹腔内注射）してもよいが、経口投与が好ましい。経口投与のための固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸剤などが含まれる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾルなどが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤としては、各々通常の方法により滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁剤、エマルション、点眼剤、眼軟膏剤、シロップ、坐剤、エアロゾルなどの外用剤および滅菌注射製剤の形態に剤形化して用いることができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、眼軟膏剤、点眼剤、 ペースト剤またはカタプラズマ剤の薬剤学的組成物を製造して用いることができるが、これらに限定されるものではない。局所投与のための製剤は、臨床的処方に応じて無水型または水性型であってもよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としてはウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。

前記目的を達成するためのまた他の様態として、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）またはこれらの混合物を個体に投与するステップを含む脳神経精神疾患の予防または治療方法を提供する。

前記目的を達成するためのまた他の様態として、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）またはこれらの混合物を個体に投与するステップを含む炎症疾患の予防または治療方法を提供する。

本発明の「ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）」、「ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）」、「投与」、「脳神経精神疾患」および「炎症疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。

前記個体は動物をいい、典型的には、本発明の新規な乳酸菌を用いた治療により有益な効果を奏する哺乳動物であってもよい。このような個体の好ましい例には、ヒトのような霊長類、ラット、マウス、猿、犬、猫、牛、馬、豚、羊またはヤギが含まれる。また、このような個体には、脳神経精神疾患または炎症疾患の症状を有するかまたはこのような症状を有する危険のある個体は全て含まれる。

前記目的を達成するためのまた他の様態として、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）またはこれらの混合物を含む脳神経精神疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供する。

前記目的を達成するためのまた他の様態として、本発明は、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）またはこれらの混合物を含む炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供する。

本発明の「ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）」、「ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）」、「投与」、「脳神経精神疾患」および「炎症疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。

前記健康機能食品は、食品の生体調節機能を強調した食品であり、物理的、生化学的、生物工学的な方法を利用して特定の目的に作用および発現するように付加価値を付与した食品である。このような健康機能食品の成分は、生体防御と身体リズムの調節、疾患の防止および回復に関係する身体調節機能を生体に対して十分に発揮するように設計して加工し、食品として許容可能な食品補助添加剤、甘味料または機能性原料を含有することができる。

本発明のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を健康機能食品（または、健康機能飲料添加物）として用いる場合、前記乳酸菌をそのまま添加するかまたは他の食品または食品成分と共に使用し、通常の方法に従って適切に使用できる。前記乳酸菌の混合量は、その使用目的（予防、健康または改善、治療的処置）に応じて適宜に決定できる。

前記健康機能食品は、種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。また、本発明の健康機能食品は、果物および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は単独でまたは組み合わせて使用でき、このような添加剤の比率は組成物の全体重量当たりに０．００１～５０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

前記健康機能食品の種類に特に制限はない。前記乳酸菌を添加できる食品としては、ソーセージ、肉類、パン、チョコレート類、スナック類、キャンデー類、菓子類、インスタントラーメン、ピザ、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などが挙げられる。飲料に剤形化する場合、新規な乳酸菌の他に添加される液体成分としては、これらに限定されないが、通常の飲料のように種々の香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、単糖類（例えば、ブドウ糖、果糖など）、二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）および多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖）、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであってもよい。

前記目的を達成するためのまた他の様態として、本発明は、腸内微生物レベルを測定する製剤を含む脳神経精神疾患診断用の組成物を提供する。

本発明の「脳神経精神疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。

本発明における用語「腸内微生物」は、消化管、具体的には腸内に特異的に存在する微生物であって、具体的にはバクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、β－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。

具体的には、本発明の診断用の組成物は、前記腸内微生物のうちβ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上のレベルが増加する場合には脳神経精神疾患と診断し、前記腸内微生物のうちバクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）を含む群より選択されたいずれか一つのレベルが減少する場合には脳神経精神疾患と診断し、前記腸内微生物のうちβ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上のレベルが増加し、腸内微生物のうちバクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）を含む群より選択されたいずれか一つのレベルが減少する場合には脳神経精神疾患と診断することができる。

具体的には、前記レベルが増加する腸内細菌は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびモルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。

また、前記レベルが減少する乳酸菌はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよく、前記レベルが減少するビフィズス菌はビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）であってもよい。

本発明により提供される脳神経精神疾患診断用の組成物は腸内微生物レベルを測定できる製剤を含み、前記組成物に含まれた製剤を用いて脳神経精神疾患の発病有無を確認しようとする個体から分離した糞便からの腸内微生物のレベルを測定することにより、個体の脳神経精神疾患の発病有無を確認することができる。前記個体は動物であってもよく、好ましくは哺乳類であり、例えば、ヒトのような霊長類、ラット、マウス、猿、犬、猫、牛、馬、豚、羊またはヤギである。

個体の糞便から分離した腸内微生物のレベルを測定することにより、前記個体に脳神経精神疾患が発病したか否かを確認するのに使用できる。

前記腸内微生物レベルを測定できる製剤としては、個体の糞便から分離した腸内微生物を定量的に分析するのに使用できる限り、特にこれらに制限されるものではないが、具体的には、腸内微生物の特異的な遺伝子のレベルを測定できるプライマーまたはプローブなどであってもよく、前記特異的な遺伝子から発現されるタンパク質のレベルを測定できる抗体またはアプタマーなどであってもよく、腸内微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列を定量的に分析するためのプライマーまたはプローブなどであってもよく、腸内微生物のゲノムＤＮＡ配列を定量的に分析するためのパイロシークエンシング用製剤などであってもよい。

具体的には、前記腸内微生物であるフィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）に特異的なプライマーは配列番号２および配列番号３の配列番号で構成されるプライマー対であり、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）に特異的なプライマーは配列番号４および配列番号５の配列番号で構成されるプライマー対であり、β－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に特異的なプライマーは配列番号６および配列番号７の配列番号で構成されるプライマー対であり、δ／γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に特異的なプライマーは配列番号８および９の配列番号で構成されるプライマー対であり、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に特異的なプライマーは配列番号１０および配列番号１１の配列番号で構成されるプライマー対であり、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に特異的なプライマーは配列番号１２および配列番号１３の配列番号で構成されるプライマー対であり、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に特異的なプライマーは配列番号１８および配列番号１９の配列配列で構成されるプライマー対であってもよい。

本発明の一実施例においては、表１の配列番号２～１９のｂａｒｃｏｄｅｄプライマーを含むパイロシークエンシング用製剤を用いてパイロシークエンシングを行って腸内微生物レベルを測定した（試験例３）。

本発明の組成物は、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）の量を測定する製剤をさらに含むことができる。具体的には、前記リポポリサッカライドの量を測定する製剤はリポポリサッカライドの量を測定するのに通常用いられる製剤であってもよく、より具体的にはＬｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）ａｓｓａｙ ｋｉｔに含まれる製剤であってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明の一実施例においては、精神障害が誘導された動物モデルの糞便を分析した結果、リポポリサッカライドの量が増加したことを確認した（図１、２、７および１１）。

本発明は、また他の様態として、前記組成物を含む脳神経精神疾患診断用のキットを提供する。
本発明のキットは、前記組成物を用いて脳神経精神疾患の発病有無の確認対象個体の糞便を収集できる収集容器、糞便内の腸内微生物を抽出するための緩衝液、腸内微生物を測定するのに用いられる測定手段などを含むことができる。

本発明は、また他の様態として、脳神経精神疾患が疑われる個体から分離した糞便から腸内微生物レベルを測定するステップ、および前記腸内微生物レベルを脳神経精神疾患ではない対照群の糞便の腸内微生物レベルと比較するステップを含む脳神経精神疾患の診断方法を提供する。

また、本発明は、脳神経精神疾患が疑われる個体から分離した糞便から腸内微生物レベルを測定するステップ、および前記腸内微生物レベルを脳神経精神疾患ではない対照群の糞便の腸内微生物レベルと比較するステップを含む脳神経精神疾患の診断のための情報提供方法を提供する。

前記糞便は、腸内微生物レベルを測定するための試料であって、個体から分離して収集された糞便を意味する。
具体的には、前記腸内微生物は、バクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、β－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。

本発明の脳神経精神疾患の診断または情報提供方法は、前記腸内微生物のうちレベルが増加する微生物を確認して脳神経精神疾患の発病または危険性の有無を診断することができる。
具体的には、前記脳神経精神疾患の診断または情報提供方法は、脳神経精神疾患が疑われる個体の糞便の腸内微生物レベルを脳神経精神疾患ではない対照群の糞便の腸内微生物レベルと比較して、腸内微生物レベルが増加する個体に対して脳神経精神疾患と判断するステップをさらに含むことができる。

前記レベルが増加する腸内微生物は、β－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。
特に、前記腸内細菌は、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびモルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。

また、本発明の脳神経精神疾患の診断または情報提供方法は、前記腸内微生物のうちレベルが減少する微生物を確認して脳神経精神疾患の発病または危険性の有無を診断することができる。

本発明の「脳神経精神疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。
具体的には、前記脳神経精神疾患の診断または情報提供方法は、脳神経精神疾患が疑われる個体の糞便の腸内微生物レベルを脳神経精神疾患ではない対照群の糞便の腸内微生物レベルと比較して、腸内微生物レベルが減少する個体に対して脳神経精神疾患と判断するステップをさらに含むことができる。

前記レベルが減少する腸内微生物は、バクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。
特に、前記乳酸菌はラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上であってもよく、前記ビフィズス菌はビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）であってもよい。

本発明の一実施例においては、拘束ストレスまたは抗生剤ストレスなどのストレスを誘導した動物モデルから分離した糞便を用いて腸内微生物の群集変化を確認した結果、ストレスを受けていない動物モデルに比べて、β－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のレベルが増加し、バクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）のレベルが減少することを確認した（図２、６、８、１０および１２）。特に、レベルが増加した具体的な腸内細菌としてクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびモルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）があり、レベルが減少した具体的な乳酸菌としてラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）があり、レベルが減少した具体的なビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）があることを確認した。

本発明は、また他の様態として、脳神経精神疾患の予防または治療のための新規な乳酸菌の用途を提供する。具体的には、本発明は、脳神経精神疾患の予防または治療のためのラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）の用途を提供する。また、本発明は、脳神経精神疾患の予防または治療のためのビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）の用途を提供する。

本発明は、また他の様態として、炎症疾患の予防または治療のための新規な乳酸菌の用途を提供する。具体的には、本発明は、炎症疾患の予防または治療のためのラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）の用途を提供する。また、本発明は、炎症疾患の予防または治療のためのビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）の用途を提供する。

本発明は、また他の様態として、脳神経精神疾患の予防または治療のための薬剤の製造において新規な乳酸菌を含む組成物の用途を提供する。具体的には、本発明は、脳神経精神疾患の予防または治療のための薬剤の製造においてラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）を含む組成物の用途を提供する。また、本発明は、脳神経精神疾患の予防または治療のための薬剤の製造においてビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）を含む組成物の用途を提供する。

本発明の「ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）」、「ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）」、「脳神経精神疾患」および「炎症疾患」などの用語は、前記で説明した通りである。

以上、本明細書に記載された数値は、特に明示していない限り、均等範囲まで含むものとして解釈しなければならない。

以下では、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

本発明に係る新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）またはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）は、神経退行性疾患誘発因子を抑制し、不安およびうつ行動を改善するという効果がある。したがって、本発明に係る新規な乳酸菌は、脳神経精神疾患の予防または治療用の組成物として用いることができ、特に、神経退行性疾患および精神障害の予防および治療に効果的である。

また、本発明に係る新規な乳酸菌は、炎症反応を抑制する効果があって炎症疾患の予防または治療用の組成物に用いることができ、特に、大腸炎の予防および治療に効果的である。

さらに、本発明に係る腸内微生物のレベルを測定する組成物は、腸内微生物のレベルを測定して脳神経精神疾患を診断するのに効果的である。

拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）に対する不安行動の測定および血液指標を測定した結果である；（ａ）は、高架式十字迷路試験の結果、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、明暗往来試験の結果、明るい所で過ごす時間が減少することを確認したグラフである；（ｃ）は、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認したグラフである；（ｄ）は、海馬においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少することを確認した図である；（ｅ）は、血液中のコルチコステロンが増加することを確認したグラフである；（ｆ）は、血液中のＩＬ－６が増加することを確認したグラフである；（ｇ）は、血液中のＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｈ）は、血液中のリポポリサッカライドが増加することを確認したグラフである。 （ａ）は、拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）の糞便の腸内微生物群集が変化することを確認した図である；（ｂ）は、拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）の糞便においてリポポリサッカライドが増加することを確認したグラフである。 拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）に対する大腸炎指標を測定した結果である；（ａ）は、拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）の大腸の長さが減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、大腸においてミエロペルオキシダーゼが増加することを確認したグラフである；（ｃ）は、大腸においてＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｄ）は、大腸におけるＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加することを確認した図である；（ｅ）は、大腸においてオクルディンとクローディン－１が減少することを確認した図である。 拘束ストレスを誘導した動物モデルの糞便を投与した動物モデル（ＦＩＳ）の状態を確認した結果である；（ａ）は、高架式十字迷路試験の結果、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、明暗往来試験の結果、明るい所で過ごす時間が減少することを確認したグラフである；（ｃ）は、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認したグラフである；（ｄ）は、海馬においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少することを確認した図である；（ｅ）は、大腸の長さが減少することを確認したグラフである；（ｆ）は、大腸においてミエロペルオキシダーゼが増加することを確認したグラフである。 拘束ストレスを誘導した動物モデルの糞便を投与した動物モデル（ＦＩＳ）の血液指標を測定した結果である；（ａ）は、血液中のコルチコステロンが増加することを確認したグラフである；（ｂ）は、血液中のＩＬ－６が増加することを確認したグラフである；（ｃ）は、血液中のＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである。 拘束ストレスを誘導した動物モデルの糞便を投与した動物モデル（ＦＩＳ）に対する大腸炎指標および微生物群集変化を確認した結果である；（ａ）は、ＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｂ）は、大腸においてＩＬ－６が増加することを確認したグラフである；（ｃ）は、大腸においてＩＬ－１０が減少することを確認したグラフである；（ｄ）は、大腸におけるＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加することを確認した図である；（ｅ）は、糞便の腸内微生物群集が変化することを確認した図である。 抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）に対する不安行動の測定および血液指標を測定した結果である；（ａ）は、高架式十字迷路試験の結果、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、明暗往来試験の結果、明るい所で過ごす時間が減少することを確認したグラフである；（ｃ）は、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認したグラフである；（ｄ）は、海馬においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少することを確認した図である；（ｅ）は、血液中のコルチコステロンが増加することを確認したグラフである；（ｆ）は、血液中のＩＬ－６が増加することを確認したグラフである；（ｇ）は、血液中のＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｈ）は、血液中のリポポリサッカライドが増加することを確認したグラフである。 （ａ）は、抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）の糞便の腸内微生物群集が変化することを確認した図である；（ｂ）は、抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）の糞便のリポポリサッカライドが増加することを確認したグラフである。 抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）に対する大腸炎指標を測定した結果である；（ａ）は、大腸の長さが減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、大腸においてミエロペルオキシダーゼが増加することを確認したグラフである；（ｃ）は、大腸においてＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｄ）は、大腸におけるＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加することを確認した図である；（ｅ）は、大腸においてオクルディンとクローディン－１が減少することを確認した図である。 （Ａ）は、拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）および抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）の糞便を選択培地で培養した結果、増加する菌を確認した図である；（Ｂ）は、拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）および抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）の糞便を選択培地で培養した結果、減少する菌を確認した図である。 拘束ストレスおよび抗生剤ストレスを加えたマウスの糞便において増加した微生物を投与したマウスに対する不安行動の測定および血液指標を測定した結果である；（ａ）は、クレブシエラ・オキシトカ（ＫＯ）、大腸菌（ＥＣ）、アエロコッカス・ウリナエクイー（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅｅｑｕｉ、ＡＵ）およびモルガネラ・モルガニー（ＭＭ）を投与したマウスの高架式十字迷路試験の結果、クレブシエラ・オキシトカを投与した群が開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が顕著に減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、クレブシエラ・オキシトカ（ＫＯ）を投与したマウスの高架式十字迷路試験の結果、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少することを確認したグラフである；（ｃ）は、明暗往来試験の結果、明るい所で過ごす時間が減少することを確認したグラフである；（ｄ）は、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認したグラフである；（ｅ）は、海馬においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少することを確認した図である；（ｆ）は、血液中のコルチコステロンが増加することを確認したグラフである；（ｇ）は、血液中のＩＬ－６が増加することを確認したグラフである；（ｈ）は、血液中のＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｉ）は、血液中のリポポリサッカライドが増加することを確認したグラフである。 （ａ）は、クレブシエラ・オキシトカを投与したマウス（ＫＯ）の糞便の腸内微生物群集が変化することを確認した図である；（ｂ）は、クレブシエラ・オキシトカを投与したマウス（ＫＯ）の糞便のリポポリサッカライドが増加することを確認したグラフである。 クレブシエラ・オキシトカを投与したマウス（ＫＯ）に対する大腸炎指標を測定した結果である；（ａ）は、大腸の長さが減少することを確認したグラフである；（ｂ）は、大腸においてミエロペルオキシダーゼが増加することを確認したグラフである；（ｃ）は、大腸においてＴＮＦ－αが増加することを確認したグラフである；（ｄ）は、大腸におけるＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の増加、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加することを確認した図である；（ｅ）は、大腸においてオクルディンとクローディン－１が減少することを確認した図である。 拘束ストレスを加えたマウスに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）と新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＮＫ３３（ＩＳ＋ＬＲ）を投与した群に対する不安行動の測定および血液指標を比較した結果である；（ａ）は、新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＮＫ３３（ＩＳ＋ＬＲ）を投与した群の高架式十字迷路試験の結果、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が増加することを確認したグラフである；（ｂ）は、明暗往来試験の結果、明るい所で過ごす時間が増加することを確認したグラフである；（ｃ）は、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が減少することを確認したグラフである；（ｄ）は、海馬においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の抑制および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が増加することを確認した図である；（ｅ）は、血液中のコルチコステロンが減少することを確認したグラフである；（ｆ）は、血液中のＩＬ－６が減少することを確認したグラフである；（ｇ）は、血液中のＴＮＦ－αが減少することを確認したグラフである。 拘束ストレスを加えたマウスに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）と新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＮＫ３３（ＩＲ）を投与した群に対する大腸炎指標を測定した結果である；（ａ）は、大腸の長さが回復することを確認したグラフである；（ｂ）は、大腸においてミエロペルオキシダーゼが減少することを確認したグラフである；（ｃ）は、大腸においてＴＮＦ－αが減少することを確認したグラフである；（ｄ）は、大腸におけるＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）の減少、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が減少することを確認した図である。

以下では、本発明の理解を助けるために好ましい実施例および試験例を提示する。但し、下記の実施例および試験例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、これらにより本発明の内容が限定されるものではない。

試験例１：精神障害誘導動物モデル

（１）拘束ストレス
不安症、うつ病またはストレスなどの精神障害を誘導するために３×１０ｃｍの円筒状の拘束ストレス装置にマウスを動かないように固定した。

具体的には、拘束ストレスによる不安誘導マウスを作製するために、装置に固定された前記マウスを２日に１回ずつ頭が上に行くように２時間ずつ立たせておく方法で拘束ストレスを５回繰り返し、最後の拘束ストレスの２時間後に行動試験を行った。
また、拘束ストレスによるうつ誘導マウスを作製するために、装置に固定された前記マウスを頭が上に行くように１２時間ずつ立たせておく方法で毎日１回ずつ２日間連続拘束ストレスを繰り返した。乳酸菌の投与は毎日１回ずつ５日間投与し、最終投与の１時間後に行動試験を行った。

（２）抗生剤ストレス
不安症、うつ病またはストレスなどの精神障害を誘導するためにアンピシリン（１００ｍｇ／ｋｇ）を２日間連続でマウスに投与した。投与の１０日後に不安行動を測定した。

（３）精神障害誘導動物モデルに対する試験方法
拘束ストレスを誘導したマウスモデルに対し、拘束ストレスを開始して７日目から１日１回ずつ３日間試験群に応じて乳酸菌または生理食塩水を投与した。抗生剤ストレスを誘導したマウスモデルに対し、抗生剤ストレスを誘導して７日目から１日１回ずつ３日間試験群に応じて乳酸菌または生理食塩水を投与した。

不安行動は乳酸菌または生理食塩水を投与して５時間後に測定し、血液指標（コルチコステロン、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αなど）は高架式十字迷路試験が終わって１時間後に血液を採取して測定した。

試験例２：ストレス診断のための行動測定方法

（１）高架式十字迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ、ＥＰＭ）試験
高架式十字迷路は、ストレスまたは不安症などの精神障害の程度を測定するための試験装置である。本試験に用いられた高架式十字迷路試験装置は、二つの開放通路（Ｏｐｅｎ ａｒｍ（３０×７ｃｍ））と２０ｃｍ高さの壁を有した二つの閉鎖通路（Ｅｎｃｌｏｓｅｄ ａｒｍ（３０×７ｃｍ））が底部から５０ｃｍだけ高く、中央プラットフォームから７ｃｍずつ伸びている黒色プレキシガラス装置である。本試験は、２０ルクスの明るさにビデオカメラが上に設置されている部屋で高架式十字迷路に置かれたマウスの動きを記録した。

具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、１９～２２ｇ）を高架式十字迷路の真ん中に置き、頭は開放通路に向かうようにした。５分間開放通路と閉鎖通路で過ごした時間と回数を測定した。通路の進入（Ａｒｍ ｅｎｔｒｙ）は、四つの足が全て入っているのを認めることにした。

全試験時間の中、開放通路で過ごした時間（Ｔｉｍｅ ｓｐｅｎｔ ｉｎ ｏｐｅｎ ａｒｍｓ、ＯＴ）は、［開放通路で過ごした時間／（開放通路で過ごした時間＋閉鎖通路で過ごした時間）］×１００で計算した。そして、開放通路進入（ｏｐｅｎ ａｒｍ ｅｎｔｒｉｅｓ、ＯＥ）は、［開放通路に入場／（開放通路に入場＋閉鎖通路に入場）］×１００で計算した。毎行動試験の終了後には、７０％エタノールで残っている臭いを除去した。

公知の試験結果の解釈により、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少する場合に不安症またはうつ病などの精神障害症状が現れたと解釈した。

（２）明暗往来（Ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）試験
暗／明に転換試験に用いられる装置は、戸（７．５×７．５ｃｍ）があるパーティションにおいて同じ大きさの明るい部分（２１×４２×２５ｃｍ、３９０ルクス白色ダイオード）と暗い部分（２１×４２×２５ｃｍ、２ルクス）とから構成されている。明るい部分にマウスを置き、５分間観察しつつ、明るい部分に留まった時間（ｔｉｍｅ ｉｎ ｂｒｉｇｈｔ ａｒｅａ）および明るい部分に往来した回数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）を測定した。毎行動試験の終了後には、７０％エタノールで残っている臭いを除去した。

公知の試験結果解釈により、明るい部分に留まった時間および明るい部分に往来した回数が減少する場合に不安症またはうつ病などの精神障害症状が現れたと解釈した。

（３）ガラス玉覆い隠し（ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ）試験
おがくずが５ｃｍ深さで満たされている透明ケージにマウスを１５分間置いた。その後、５ｃｍ間隔で２５個のガラス玉（直径２ｃｍの透明なガラス玉）をおがくず上に置いた。マウスを一方の中央に置き、３０分間覆い隠したガラス玉の個数を測定した。

公知の試験結果解釈により、マウスが覆い隠したガラス玉を隠す行動が増加する場合に不安症またはうつ病などの精神障害症状が現れたと解釈した。

（４）強制水泳試験（Ｆｏｒｃｅｄ Ｓｗｉｍｍｉｎｇ Ｔｅｓｔ、ＦＳＴ）
Ｐｏｒｓｏｌｔら（Ｐｏｒｓｏｌｔ ＲＤ、Ｌｅ Ｐｉｃｈｏｎ、Ｊａｌｆｒｅ Ｍ（１９７７）Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．２６６；ｐｐ．７３０－７３２）の方法に従い、高さ４０ｃｍ、直径２０ｃｍの水槽に温度２５±１℃の水を２５ｃｍ高さまで満たした。試験用マウスを１匹ずつ水槽に入れ、総６分間のうち最初の２分間は適応時間として測定せず、最後の４分間試験動物の不動状態（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）時間を測定した。不動状態は、頭だけを水上に露呈するための最小限の動きをし、真っすぐ立って動かずに浮いている状態を意味する。

（５）尾懸垂試験（Ｔａｉｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｔｅｓｔ、ＴＳＴ）
Ｓｔｅｒｕら（Ｓｔｅｒｕ Ｌ、Ｃｈｅｒｍａｔ Ｒ、Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｂ、Ｓｉｍｏｎ Ｐ（１９８５）Ｔｈｅ ｔａｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ：Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８５；ｐｐ．３６７－３７０）の方法に従い、直径３５ｃｍおよび高さ５０ｃｍの筒内にマウス尾端１ｃｍ程度に固定装置を取り付けた後、地面から５０ｃｍ離れた位置にぶら下げた。総６分間試験動物の不動状態（ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）時間を測定した。

試験例３：腸内微生物群集の確認試験
腸内微生物群集においてフィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）などの占有率を測定するためにリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）または４５４パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。

具体的には、動物モデルから得た糞便のＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分離した。パイロシークエンシングは、ｂａｒｃｏｄｅｄプライマー（ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ３部分）を用いた。ｑＰＣＲは、下記表１のプライマーを用いて分析した。

試験例４：リポポリサッカライドの測定方法

（１）糞便中のリポポリサッカライドの測定方法
糞便（２０ｍｇ）を３０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１時間超音波処理して微生物を粉砕した後、５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その上澄みを０．４５μｍのフィルタで濾過し、その次に０．２２μｍのフィルタで濾過した後、７０℃で１０分間処理して検体として用いた。前記検体をＬｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ） ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ．、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてリポポリサッカライドを測定した。

（２）血液中のリポポリサッカライドの測定方法
血液をＰＢＳで１０倍希釈し、遠心分離した後、上澄みを０℃で１０分間処理した。前記上澄みを０．４５μｍのフィルタで濾過し、その次に０．２２μｍのフィルタで濾過して検体として用いた。前記検体をＬｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ） ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃ．、Ｅａｓｔ Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてリポポリサッカライドを測定した。

試験例５：大腸炎指標の測定方法

（１）ミエロペルオキシダーゼ活性の測定
大腸組織１００ｍｇに０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）含有の１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ ７．０）２００μＬを入れて均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した。４℃および１０，０００ｇの条件で１０分間遠心分離して上澄みを得た。上澄み５０μＬを０．９５ｍＬの反応液（１．６ｍＭ テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と０．１ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂含有）に入れ、３７℃で反応させながら、６５０ｎｍで経時的に吸光度を測定した。前記ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）の活性は、反応物として生じたＨ₂Ｏ₂ １μｍｏｌ／ｍｌを１ユニットに計算した。

（２）炎症指標の測定
ウェスタンブロット法を利用してｐ－ｐ６５、ｐ６５、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２およびβ－ａｃｔｉｎのような炎症反応指標物質を測定した。具体的には、前記ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性測定試験と同様の方法により得られた上澄み５０μｇを取って免疫ブロット法を行った。また、サイトカインの発現量は、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて、ＬＰＳはＬＡＬ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定した。

実施例１：拘束ストレスを誘導した動物モデルの状態確認
前記試験例１－（１）のような方法により２日に１回ずつ総５回拘束ストレスを加えたマウス（ＩＳ）に対して試験例２～４の試験を行った。
試験例２を行った結果、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少し、明暗往来試験において明るい所で過ごす時間が減少し、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認した（図１（ａ）～（ｃ））。

また、ウェスタンブロットにより確認した結果、海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が増加し、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少し（図１（ｄ））、血液中のコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびリポポリサッカライドの量が増加することを確認した（図１（ｅ）～（ｈ））。

試験例３を行った結果、糞便中のバクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）が減少し、δ、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）とε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増加することを確認し、試験例４を行った結果、糞便中のリポポリサッカライドが増加することを確認した（図２）。
試験例５を行った結果、大腸炎の指標である大腸の長さが減少し、ミエロペルオキシダーゼが増加し、大腸のＴＮＦ－αが増加し、大腸のＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加し、ＮＦ－κＢの活性が増加し、密着結合タンパク質であるオクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）とクローディン－１（ｃｌａｕｄｉｎ－１）が減少することを確認した（図３（ａ）～（ｅ））。

実施例２：拘束ストレスを誘導した動物モデルの糞便を投与した動物モデルの状態確認
前記試験例１－（１）のような方法により２日に１回ずつ総５回拘束ストレスを加えたマウスの糞便を投与したマウス（ＦＩＳ）に対して試験例２～４の試験を行った。
試験例２を行った結果、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少し、明暗往来試験において明るい所で過ごす時間が減少し、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認した（図４（ａ）～（ｃ））。

また、ウェスタンブロットにより確認した結果、海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が増加し、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少し（図４（ｄ））、血液中のコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの量が増加することを確認した（図５（ａ）～（ｃ））。
試験例５を行った結果、大腸炎の指標である大腸の長さが減少し、ミエロペルオキシダーゼが増加し（図４（ｅ）および（ｆ））、大腸のＴＮＦ－αおよびＩＬ－６が増加し、大腸のＩＬ－１０が減少し、大腸のＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加し、ＮＦ－κＢの活性が増加することを確認した（図６（ａ）～（ｄ））。

試験例３を行った結果、糞便中のバクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）が減少し、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）とε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増加することを確認した（図６（ｅ））。

実施例３：抗生剤ストレスを誘導した動物モデルの状態確認
前記試験例１－（２）のような方法によりアンピシリン（１００ｍｇ／ｋｇ）を２日間連続で投与して抗生剤ストレスを加えたマウス（ＡＰ）に対して試験例２～４の試験を行った。

試験例２を行った結果、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少し、明暗往来試験において明るい所で過ごす時間が減少し、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認した（図７（ａ）～（ｃ））。

海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が増加し、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量が減少し（図７（ｄ））、血液中のコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびリポポリサッカライドの量が増加することを確認した（図７（ｅ）～（ｈ））。

試験例３を行った結果、糞便中のバクテロイデス菌（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、放線菌類（ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）が減少し、δ、γ－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）とε－プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）が増加することを確認し、試験例４を行った結果、糞便中のリポポリサッカライドが増加することを確認した（図８（ａ）および（ｂ））。

試験例５を行った結果、大腸炎の指標である大腸の長さが減少し、ミエロペルオキシダーゼが増加し、大腸のＴＮＦ－αが増加し、大腸のＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加し、ＮＦ－κＢの活性が増加し、密着結合タンパク質であるオクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）とクローディン－１（ｃｌａｕｄｉｎ－１）が減少することを確認した（図９（ａ）～（ｅ））。

実施例４：ストレス誘導動物モデルの糞便から分離した微生物を投与した動物モデルの状態確認

（１）ストレス誘導動物モデルの糞便から微生物の分離
拘束ストレスを加えたマウスおよび抗生剤ストレスを加えたマウスの糞便を選択培地で培養した。その結果、ＤＨＬ培地で育つ腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が増加したが、特にクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびモルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）が増加することを確認した（図１０（Ａ））。

その反面、ＢＬ培地で育つビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）は減少したが、特にラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）およびビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）が減少することを確認した（図１０（Ｂ））。

（２）微生物を投与した動物モデルの状態確認
拘束ストレスを加えたマウスおよび抗生剤ストレスを加えたマウスの糞便において増加したクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびモルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）を各々マウスに１×１０⁹ＣＦＵだけ投与した後、前記試験例２－（１）の高架式十字迷路試験を行った。その結果、他の微生物投与群に比べてクレブシエラ・オキシトカを投与した群の開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が顕著に減少することを確認した（図１１（ａ））。
その後、クレブシエラ・オキシトカを投与したマウス（ＫＯ）に対して試験例２～５の試験を行った。

試験例２を行った結果、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少し、明暗往来試験において明るい所で過ごす時間が減少し、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加することを確認した（図１１（ｂ）～（ｄ））。

海馬においてＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が増加し、脳由来神経栄養因子の発現量が減少し（図１１（ｅ））、血液中のコルチコステロン、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびリポポリサッカライドの量が増加することを確認した（図１１（ｆ）～（ｉ））。

試験例３を行った結果、糞便中のバクテロイデス菌、放線菌、フィルミクテスが減少し、δ、γ－プロテオバクテリアとε－プロテオバクテリアが増加することを確認し、試験例４を行った結果、糞便中のリポポリサッカライドが増加することを確認した（図１２（ａ）および（ｂ））。

試験例５を行った結果、大腸炎の指標である大腸の長さが減少し、ミエロペルオキシダーゼが増加し、大腸のＴＮＦ－αが増加し、大腸のＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加し、ＮＦ－κＢの活性が増加し、密着結合タンパク質であるオクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）とクローディン－１（ｃｌａｕｄｉｎ－１）が減少することを確認した（図１３（ａ）～（ｅ））。

実施例５：乳酸菌の分離および同定

（１）ヒトおよびマウスの糞便から乳酸菌の分離
ヒトおよびマウスの新鮮な糞便をＧＡＭ液体培地（ＧＡＭ ｂｒｏｔｈ；Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）に入れて懸濁した。その後、上澄みを取ってＭＲＳ、ＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ－Ｈｅａｒｔ－Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）またはＢＬ寒天培地（ＢＬ ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）に移植し、３７℃で約４８時間～７２時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成した菌株を分離した。

（２）分離した乳酸菌の同定
ヒトまたはマウスの糞便から分離した菌株の生理学的特性および１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を分析して菌株の種を確定し、菌株名を付与した。付与された乳酸菌の菌株名は下記表２の通りである。具体的には、ヒトまたはマウスの糞便から分離した乳酸菌は、９種のラクトバチルス属および２２種のビフィドバクテリウム属であった。

（３）新規な乳酸菌ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３の生理学的特性
表２に記載された菌株のうちラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＮＫ３３（受託番号ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）は、グラム陽性桿菌であることが確認された。また、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を有することが明らかになった。ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列をＢＬＡＳＴ検索で比較した結果、同一な１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・ロイテリ菌株は検索されず、公知のラクトバチルス・ロイテリ菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示すことを確認した。

ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３の生理学的特性中の炭素源利用性をＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ’ｓ、ＵＳＡ）を用いて糖発酵試験で分析した。その結果は下記表３の通りである。下記表３において、「＋」は炭素源利用性が陽性の場合を示し、「－」は炭素源利用性が陰性の場合を示す。

（４）新規な乳酸菌ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の生理学的特性
表２に記載された菌株のうちビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＮＫ９８（受託番号ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）の１６Ｓ ｒＤＮＡは、配列番号３８の塩基配列を有することが明らかになった。ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列をＢＬＡＳＴ検索で比較した結果、同一な１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有するビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）菌株は検索されず、公知のビフィドバクテリウム・アドレセンティス菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９８％の相同性を示すことを確認した。

ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の生理学的特性中の炭素源利用性などをＡＰＩキット（ＡＰＩ ２０Ａ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ’ｓ、ＵＳＡ）を用いて糖発酵試験で分析した。その結果は下記表４の通りである。下記表４において、「＋」は炭素源利用性が陽性の場合を示し、「－」は炭素源利用性が陰性の場合を示す。

実施例６：分離した乳酸菌の活性比較

（１）抗酸化活性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＤＰＰＨ（２，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ－１－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）を０．２ｍＭ濃度になるようにエタノールに溶かしてＤＰＰＨ溶液を製造した。前記ＤＰＰＨ溶液０．１ｍＬに乳酸菌の懸濁液（１×１０⁸ＣＦＵ／ｍＬ）またはビタミンＣ溶液（１ｇ／ｍＬ）を入れて２０分間３７℃で培養した。培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄みを得た。その後、５１７ｎｍで上澄みの吸光度を測定して、分離した乳酸菌の抗酸化活性を計算した。各乳酸菌別の抗酸化活性は、下記表５（ラクトバチルス属）および表６（ビフィドバクテリウム属）の通りである。

（２）マクロファージでの炎症指標の測定
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｍａｌｅ、６週齢、２０～２３ｇ）の腹腔に滅菌された４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍＬを投与した。９６時間の経過後にマウスを麻酔し、マウスの腹腔にＲＰＭＩ １６４０培地８ｍＬを投与した。５～１０分後にマウスの腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージ）を抜き取り、１０００ｇで１０分間遠心分離し、さらにＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄した。前記マクロファージを各ウェル当たりに０．５×１０⁶の数で２４－ウェルプレートに敷き、分離したラクトバチルス属乳酸菌と炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライドを２時間または２４時間処理した後に上澄みおよび細胞を得た。得られた細胞をＲＩＰＡバッファ（Ｇｉｂｃｏ社）に入れて均質化した。２４時間処理した培養上澄みにおいてＴＮＦ－αなどのサイトカイン発現量を、２時間処理して得られた細胞からｐ６５（ＮＦ－κＢ）、ｐ－ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＮＦ－κＢ）およびβ－ａｃｔｉｎの発現量を免疫ブロット法（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により測定した。各ラクトバチルス属乳酸菌別の炎症指標の発現レベルは下記表５の通りである。

（３）小膠細胞の炎症指標の測定
ＢＶ－２小膠細胞を各ウェル当たりに０．５×１０⁶の数で２４－ウェルプレートに敷き、分離したビフィドバクテリウム乳酸菌と炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライドを２時間または２４時間処理した後に上澄みおよび細胞を得た。得られた細胞をＲＩＰＡバッファ（Ｇｉｂｃｏ社）に入れて均質化した。２時間処理して得られた細胞からｐ６５（ＮＦ－ｋＢ）、ｐ－ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＮＦ－ｋＢ）およびβ－ａｃｔｉｎの発現量を免疫ブロット法により測定した。各ビフィドバクテリウム属乳酸菌別の炎症指標の発現レベルは、下記表６の通りである。

（４）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対する脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現効果およびＮＦ－κＢの活性化効果
神経細胞であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を韓国細胞株バンクから分譲して１０％ＦＢＳおよび１％抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地で培養し、１２－ウェルプレートにウェル当たりに２×１０⁶細胞数で分株した。その後、各ウェルに乳酸菌（１×１０⁴ＣＦＵ／ｍＬ）と共にコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）を３００ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して培養した後、ＮＦ－κＢ（ｐ６５、ｐ－ｐ６５）および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）の発現量を免疫ブロット法により測定した。各乳酸菌別のＢＤＮＦ発現レベルおよびＮＦ－κＢ活性化レベルは、下記表５（ラクトバチルス属）および表６（ビフィドバクテリウム属）の通りである。

（５）試験結果
分離した乳酸菌の活性を評価した結果、分離したラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属乳酸菌のうち、本願のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の抗酸化活性および炎症反応抑制効果が顕著に優れることを確認した。特に、アルツハイマーのような老化関連疾患を誘発する物質として知られたＮＦ－κＢの活性を抑制し、老化および痴呆などに見られる小膠細胞の炎症反応を抑制し、老化および痴呆などにおいて減少する脳の神経が産生する脳由来神経栄養因子の発現を増加させることを確認した（表５および表６）。

実施例８：分離したビフィドバクテリウム属乳酸菌の免疫調節効能の評価
糞便から分離したビフィドバクテリウム属乳酸菌の免疫調節効能を評価するために、マクロファージおよび脾臓細胞の免疫反応にビフィドバクテリウム属乳酸菌が及ぼす影響を測定した。

（１）マクロファージでの免疫反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、６週齢、２０～２３ｇ、ラウンバイオ（株））の腹腔に滅菌された４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍＬを投与した。投与して９６時間の経過後にマウスを麻酔し、マウスの腹腔にＲＰＭＩ １６４０培地８ｍＬを投与した。５～１０分後にマウスの腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージ含む）を抜き取り、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、さらにＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄した。前記マクロファージを各ウェル当たりに０．５×１０⁶の数で２４－ウェルプレートに敷き、２４時間培養した後に付着していない細胞を除去して用いた。

前記マクロファージ培養液にビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８と炎症反応誘導物質であるリポポリサッカライドを２時間または２４時間処理した後に上澄みおよび細胞を得て、この時、乳酸菌処理濃度は１×１０⁴ＣＦＵ／ｍＬであった。得られた細胞をＲＩＰＡバッファ（Ｇｉｂｃｏ社）に入れて均質化した。得られた上澄みからＴＮＦ－αの発現量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて測定し、得られた細胞からｐ６５（ＮＦ－κＢ）、ｐ－ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ＮＦ－κＢ）およびβ－ａｃｔｉｎの発現量を免疫ブロット法により測定した。具体的には、上澄み５０μｇを取って、ＳＤＳ １０％（ｗ／ｖ）ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌにおいて１時間３０分間電気泳動をした。電気泳動したサンプルをニトロセルロース紙に１００Ｖおよび４００ｍＡの条件で１時間１０分間トランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。サンプルがトランスファーされたニトロセルロース紙を５％脱脂乳で３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、５分ずつ３回にかけてＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１００の比率にして一晩反応させた。その後、１０分ずつ３回にかけて洗浄し、２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００の比率にして１時間２０分間反応させた。その後、１５分ずつ３回にかけて洗浄し、蛍光発色させた後に現像し、発色バンドの強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、その結果は下記表７の通りである。

（２）脾臓細胞での免疫反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、６週齢、２０～２２ｇ、（株）オリエントバイオ）の脾臓を分離および粉砕して１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いてＣＤ４ Ｔ細胞を分離し、分離したＣＤ４ Ｔ細胞を１２－ウェルプレートに各ウェル当たりに５×１０⁵の数で分株した。

Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を誘導するために抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８、ＩＬ－２およびＩＬ－１２を、Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化を誘導するために抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８、ＩＬ－２およびＩＬ－４を、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化を誘導するために抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８、ＩＬ－６およびＴＧＦ－βを、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化を誘導するために抗－ＣＤ３および抗－ＣＤ２８を入れて細胞を培養しつつ、乳酸菌をウェル当たりに１×１０⁵ＣＦＵ／ｍＬの量で入れて４日間培養した。

その後、脾臓から分離したＴ細胞のＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞への分化能を測定した。具体的には、培養液の細胞を抗－ＦｏｘＰ３または抗－ＩＬ－１７Ａ抗体で染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）装置（Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分布を分析し、その結果は下記表８の通りである。

また、脾臓Ｔ細胞から分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の転写因子およびサイトカイン発現率を測定した。具体的には、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＴｈ１細胞分化誘導培養液からＴ－ｂｅｔ、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２を、Ｔｈ２細胞分化誘導培養液からＧＡＴＡ３およびＩＬ－５を、Ｔｈ１７細胞分化誘導培養液からＲＯＲγｔおよびＩＬ－１７を、Ｔｒｅｇ細胞分化誘導培養液からＦｏｘｐ３およびＩＬ－１０の発現量を分析し、その結果は下記表９の通りである。

表８および表９から確認できるように、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８は、Ｔ細胞のＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞への分化抑制率が高く、特にＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化増加率が高くて炎症反応を効果的に抑制し、それにより炎症性疾患を効果的に改善できることを確認した。

実施例９：ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３のストレス改善効果

前記試験例１のように拘束ストレスを加えたマウスに拘束ストレスを開始して７日目から１日１回ずつ５日間新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３ １×１０⁹ｃｆｕまたは生理食塩水を投与した。前記マウスに対して試験例２～５の試験を行った。

試験例２を行った結果、生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が減少し、明暗往来試験において明るい所で過ごす時間が減少し、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が増加した。しかし、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３を投与した群（ＩＳ＋ＬＲ）は、開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）が増加し、明るい所で過ごす時間が増加し、ガラス玉覆い隠し試験においてガラス玉を覆い隠す行動が減少することを確認した（図１４（ａ）～（ｃ））。

海馬において生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、ＮＦ－κＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が増加し、脳由来神経栄養因子の発現量が減少し、血液中のコルチコステロン、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびリポポリサッカライドの量が増加することを確認した。しかし、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３を投与した群（ＩＳ＋ＬＲ）は、ＮＦ－κＢ活性化（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が抑制され、脳由来神経栄養因子の発現量が増加し、血液中のコルチコステロン、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびリポポリサッカライドの量が減少することを確認した（図１４（ｄ）～（ｇ））。

試験例５を行った結果、生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、大腸炎の指標である大腸の長さが減少し、ミエロペルオキシダーゼが増加し、大腸のＴＮＦ－αが増加し、大腸のＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が増加し、ＮＦ－κＢの活性が増加することを確認した。しかし、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３を投与した群（ＩＲ）は、大腸の長さが正常レベルに回復し、ミエロペルオキシダーゼが減少し、大腸のＴＮＦ－αが減少し、大腸のＣＯＸ－２およびｉＮＯＳの発現が減少し、ＮＦ－κＢの活性が抑制されることを確認した（図１５（ａ）～（ｄ））。
それにより、新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３は、不安症、うつ病およびストレスなどの精神障害の改善効果に優れることを確認した。

実施例１０：ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８のストレス改善効果
前記試験例１の拘束ストレスを加えたマウスに拘束ストレスを開始して７日目から１日１回ずつ３日間ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８ １×１０⁹ｃｆｕ（ＮＫ９８）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＩＭ３８ １×１０⁹ｃｆｕ（ＩＭ３８）、生理食塩水（ＩＳ）またはブスピロン（Ｂｕｓｐｉｒｏｎｅ）１ｍｇ／ｋｇを投与し、前記試験例２および試験例５の試験を行った。

（１）高架式十字迷路試験
前記試験例２－（１）の高架式十字迷路試験と共に血中コルチコステロン（ＢＣ）の量を測定し、その結果は下記表１０の通りである。

表１０から確認できるように、拘束ストレスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、拘束ストレスを与えていない正常対照群に比べて、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間（ＯＴ）および開放通路進入（ＯＥ）がいずれも減少した。しかし、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は、開放通路で過ごす時間と頻度が増加し、血中コスティコステロンの量が顕著に減少し、このような効果はビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８に比べて優れることを確認した。

（２）明暗往来試験
前記試験例２－（２）の明暗往来試験を行い、その結果は下記表１１の通りである。

表１１から確認できるように、拘束ストレスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は拘束ストレスを与えていない正常対照群に比べて明るい所で過ごす時間が減少したが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は明るい所で過ごす時間が増加し、これはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８を投与した群より増加したことを確認した。

（３）強制水泳試験
前記試験例２－（４）の強制水泳試験を行い、その結果は下記表１２の通りである。

表１２から確認できるように、うつマウスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は拘束ストレスを与えていない正常対照群に比べて不動状態時間が増加したが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は不動状態時間が減少し、これはビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８を投与した群より減少したことを確認した。

（４）尾懸垂試験
前記試験例２－（５）の尾懸垂試験を行い、その結果は下記表１３の通りである。

表１３から確認できるように、うつマウスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は拘束ストレスを与えていない正常対照群に比べて不動状態時間が増加したが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は不動状態時間が減少したことを確認した。

（５）バイオマーカー測定
うつマウスの最後の行動試験を行い、２時間後にマウスを麻酔し、前記試験例５のような方法により、血液のコルチコステロンはＥＬＩＳＡにより、脳の脳由来神経栄養因子およびＮＦ－ｋＢと大腸のＮＦ－ｋＢは免疫ブロット法により測定し、その結果は下記表１４の通りである。

表１４から確認できるように、生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、海馬においてＮＦ－ｋＢ活性（ｐ－ｐ６５／ｐ６５）が増加し、脳由来神経栄養因子の発現量が減少し、血液中のコルチコステロン量が増加することを確認した。しかし、ＮＫ９８を投与した群は、ＮＦ－ｋＢ活性が抑制され、脳由来神経栄養因子の発現量が増加し、血液中のコルチコステロン量が減少し、このような効果はＩＭ３８を投与した群に比べて優れることを確認した。

（６）大腸炎の改善効果
試験例１の不安マウスの最後の行動試験を行い、２時間後にマウスを麻酔し、前記試験例５のような方法により腸の長さ、ＭＰＯ、ＣＯＸ－２、ＴＮＦ－αおよびＮＦ－ｋＢの活性化を測定し、その結果は下記表１５の通りである。

表１５から確認できるように、拘束ストレスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、拘束ストレスを与えていない正常対照群に比べて、腸の長さが減り、ＭＰＯおよび炎症指標が増加したが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は、腸の長さが回復し、ＭＰＯ阻害能および炎症指標が改善されたことを確認した。

（７）抗生剤誘導ストレスの改善効果
前記試験例１－（２）のような方法によりアンピシリン（１００ｍｇ／ｋｇ）を２日間連続投与して抗生剤ストレスを誘導したマウスに対して試験例２および５の試験を行い、その結果は下記表１６および１７の通りである。

表１６から確認できるように、抗生剤誘導ストレスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、正常対照群に比べて、高架式十字迷路試験において開放通路で過ごした時間および開放通路進入がいずれも減少したが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は、開放通路で過ごす時間と頻度が増加し、血中コスティコステロンの量が顕著に減少し、このような効果はビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８に比べて優れることを確認した。

また、表１７から確認できるように、抗生剤誘導ストレスモデルに生理食塩水を投与した群（ＩＳ）は、正常対照群に比べて、腸の長さが減り、ＭＰＯおよび炎症指標が増加したが、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は、腸の長さが回復し、ＭＰＯ阻害能および炎症指標が改善されたことを確認した。

実施例１１：ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８の認知機能改善効果

Ｅ．ｃｏｌｉ分離ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）でマウスの腹腔に５日間投与した後に翌日から乳酸菌を投与し、乳酸菌の認知機能改善効能を物体認知試験、Ｙ迷路試験、および海馬においてＢＤＮＦを免疫ブロット法により測定し、その結果は下記表１８の通りである。

具体的には、物体認知試験方法として、内部では外部が見えないように製作された箱（４０×４０×４０ｃｍ）内に形状と大きさが同一な二つの物体（Ａ、Ａ’）を固定した後、マウスを箱の中心から出発させて、１０分間マウスが二つの物体を触る回数を記録した。２４時間が経過した後、二つの物体のうちの一つを新しい物体に変更した後（Ａ、Ｂ）、本来にあった物体と新しい物体を触る回数を記録して数値化した。

また、Ｙ迷路（Ｙ ｍａｚｅ）試験方法として、試験装置は同一な３個のアーム（ａｒｍ）（横８ｃｍ、縦３０ｃｍ、高さ１４ｃｍ）で構成されており、各々は互いに１２０°の一定の角度で配置した。マウスを一方のアーム端に位置させた後、８分間自由にＹ迷路を歩き回るようにし、各アームに入った回数および順序を測定して自発的変更（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）（％）を評価した。変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）は、３個のアームを順次入る場合、すなわち、ＡＢＣ、ＢＣＡ、ＣＡＢなどに定義した。
％変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）＝［総変更数］／［アーム（ａｒｍ）に入った総回数－２］×１００

表１８から確認できるように、物体認知試験およびＹ迷路試験を通じて、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８を投与した群は、認知機能が改善され、ＢＤＮＦ発現が増加することを確認した。

実施例１２：２種の乳酸菌の併用投与に応じたストレス改善効果

新規な乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３、大韓民国公開特許第１０－２０１７－００９０３５９号に開示された乳酸菌であるビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＩＭ３８（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０７Ｐ）またはこれらの混合物のストレス改善効果を比較した。

具体的には、前記試験例１－（１）のように拘束ストレスが誘導されたモデルに生理食塩水（ＩＳ）、１×１０⁹ｃｆｕのラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（ＮＫ３３）、１×１０⁹ｃｆｕのビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８（ＩＭ３８）または前記乳酸菌を併用（ＮＫ３３＋ＩＭ３８）して各々０．５×１０⁹ｃｆｕずつ投与した後、高架式十字迷路試験を行った。その後、各群別に血液を採取して血中コルチコステロンの量を測定し、その結果は下記表１９の通りである。

表１９から確認できるように、単独の乳酸菌投与群に比べて併用投与群の開放通路で過ごした時間および開放通路進入が増加し、血中コルチコステロンの量が顕著に減少することを確認した。

また、ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３およびビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８混合物のストレス改善効果を前記ＮＫ３３およびＩＭ３８の併用投与試験と同様の方法により比較し、その結果は下記表２０の通りである。

表２０から確認できるように、単独の乳酸菌投与群に比べて併用投与群の開放通路で過ごした時間および開放通路進入が増加し、血中コルチコステロンの量が顕著に減少することを確認した。

＜乳酸菌の受託情報＞
本発明の発明者らは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＮＫ３３を２０１７年８月４日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（アドレス：大韓民国、ソウル西大門区弘済内２街ギル４５ユリムビル）に特許寄託してＫＣＣＭ１２０９０Ｐの受託番号を与えられた。
また、本発明の発明者らは、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＮＫ９８を２０１８年８月３日に公認寄託機関である韓国微生物保存センター（アドレス：大韓民国、ソウル西大門区弘済内２街ギル４５ユリムビル）に特許寄託してＫＣＣＭ１２２９７Ｐの受託番号を与えられた。

Claims (17)

1. ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）。
2. 前記ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）は、配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を含む、請求項１に記載のラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３ ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ。
3. ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）を含む脳神経精神疾患の予防または治療用の薬学組成物。
4. 前記ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）は、その生菌体、その死菌体、その培養物、その破砕物またはその抽出物である、請求項３に記載の薬学組成物。
5. ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）をさらに含む請求項３に記載の薬学組成物。
6. 前記脳神経精神疾患は、神経退行性疾患または精神障害である、請求項３から５の何れか１項に記載の薬学組成物。
7. 前記精神障害は、不安、うつ病、気分障害、不眠症、妄想障害、強迫障害、偏頭痛、ストレス、記憶障害、認知障害および注意力障害を含む群より選択されたいずれか一つ以上である、請求項６に記載の薬学組成物。
8. 前記神経退行性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄小脳変性症（Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）、トゥレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、フリードライヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ Ａｔａｘｉａ）、マチャド・ジョセフ病（Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、痴呆、ジストニア（Ｄｙｓｔｏｎｉａ）および進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ Ｐａｌｓｙ）を含む群より選択されたいずれか一つ以上である、請求項６に記載の薬学組成物。
9. 前記薬学組成物は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＩＭ３８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＩＭ３８）をさらに含む、請求項３から５の何れか１項に記載の薬学組成物。
10. ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）を含む脳神経精神疾患の予防または改善用の健康機能食品。
11. ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）（ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）をさらに含む請求項１０に記載の健康機能食品。
12. ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）を含む炎症疾患の予防または治療用の薬学組成物。
13. ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）（ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）をさらに含む請求項１２に記載の薬学組成物。
14. ラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）を含む炎症疾患の予防または改善用の健康機能食品。
15. ビフィドバクテリウム・アドレセンティスＮＫ９８（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＮＫ９８）（ＫＣＣＭ１２２９７Ｐ）をさらに含む、請求項１４に記載の健康機能食品。
16. 脳神経精神疾患の予防または治療用薬剤の調製におけるラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）の使用。
17. 炎症疾患の予防または改善用薬剤の調製におけるラクトバチルス・ロイテリＮＫ３３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＫ３３）（ＫＣＣＭ１２０９０Ｐ）の使用。
    

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