JP7034467B2 - 細胞の三次元培養方法、細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞の運搬方法及び細胞の保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の三次元培養方法、細胞構造体、細胞構造体の製造方法及び細胞の運搬方法に関する。

細胞の三次元培養方法は、特に細胞を大量に培養するための手法として知られている。特に、体内の細胞の大半である接着性細胞は、単に培地に懸濁して培養すると、全く増殖しない。そのため、マイクロキャリアという細胞が接着する足場となる部材と共に懸濁培養するのが一般的である。

特許文献１及び２には、マイクロキャリアを用いた接着性細胞を大量に培養する方法が開示されている。

特開２０１１－０３０４５３号公報 特開２０１７－１３６０４２号公報

特許文献１及び２等に記載の従来のマイクロキャリアを用いた懸濁培養方法では、マイクロキャリア同士が細胞を介して大きな凝集塊を形成し、酸素や栄養の透過性が低下することによって、当該凝集塊内部の細胞死や細胞の性質変化に繋がることが問題となってきた。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、マイクロキャリア及び細胞の過剰な凝集による細胞死が抑制された細胞の三次元培養方法を提供する。また、マイクロキャリア及び細胞の凝集塊の大きさが制御されており、細胞生存率及び細胞増殖率が良好な細胞構造体及びその製造方法を提供する。また、細胞生存率を保ちながら安全かつ簡便に細胞を運搬可能な細胞の運搬方法を提供する。

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る細胞の三次元培養方法は、多糖類を含有する第１の溶液と、マイクロキャリアと、接着性細胞とを混合し、前記多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液を添加して、前記多糖類をゲル化して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を得るゲル化工程と、ポリアミノ酸を含む第３の溶液を添加して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を前記ポリアミノ酸で被覆する第１の被覆工程と、前記ゲル状の多糖類の可溶化剤を含む第４の溶液を添加し、前記多糖類を除去する除去工程と、前記ポリアミノ酸で被覆された前記マイクロキャリア及び前記接着性細胞を含むファイバー状の混合物を培養する培養工程と、を備える方法である。

上記第１態様に係る細胞の三次元培養方法は、前記第１の被覆工程の後であって、前記除去工程の前に、更に、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を添加し、前記ポリアミノ酸で被覆された前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を、更にゲル状の前記多糖類で被覆する第２の被覆工程を備えてもよい。

上記第１態様に係る細胞の三次元培養方法において、前記第１の溶液が、更に細胞外マトリックスを含んでもよい。

本発明の第２態様に係る細胞構造体は、マイクロキャリア及び接着性細胞を含み、前記マイクロキャリア及び前記接着性細胞を含む混合物がポリアミノ酸で被覆されており、ファイバー状である。

上記第２態様に係る細胞構造体において、前記混合物が、更にゲル状の多糖類を含んでもよい。

上記第２態様に係る細胞構造体において、前記混合物が、更に細胞外マトリックスを含んでもよい。

上記第２態様に係る細胞構造体において、前記ポリアミノ酸で被覆された前記混合物が、更にゲル状の多糖類で被覆されていてもよい。

本発明の第３態様に係る細胞構造体の製造方法は、マイクロキャリアと、接着性細胞と、多糖類を含有する第１の溶液とを混合し、前記多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液を添加して、前記多糖類をゲル化して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を得るゲル化工程と、ポリアミノ酸を含む第３の溶液を添加して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物をポリアミノ酸で被覆する第１の被覆工程と、を備える方法である。

上記第３態様に係る細胞構造体の製造方法は、前記第１の被覆工程の後に、更に、前記ゲル状の多糖類の可溶化剤を含む第４の溶液を添加し、前記多糖類を除去する除去工程を備えてもよい。

上記第３態様に係る細胞構造体の製造方法は、前記第１の被覆工程の後であって、前記除去工程の前に、更に、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を添加し、前記ポリアミノ酸で被覆された前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を、更にゲル状の前記多糖類で被覆する第２の被覆工程を備えてもよい。

上記第３態様に係る細胞構造体の製造方法において、前記第１の溶液が、更に細胞外マトリックスを含んでもよい。

本発明の第４態様に係る細胞の運搬方法は、上記第２態様に係る細胞構造体を用いる方法である。
本発明の第５態様に係る細胞の保存方法は、上記第３態様に係る製造方法により得られた細胞構造体を４℃以上４０℃以下で保存する保存工程を備える。

上記態様の細胞の三次元培養方法によれば、マイクロキャリア及び細胞の過剰な凝集による細胞死を抑制することができる。上記態様の細胞構造体及びその製造方法によれば、マイクロキャリア及び細胞の凝集塊の大きさを制御することができ、細胞生存率及び細胞増殖率を良好なものとすることができる。上記態様の細胞の運搬方法によれば、細胞生存率を保ちながら安全かつ簡便に細胞を運搬することができる。

本実施形態の細胞の三次元培養方法の一例を示す概略工程図である。 実施例１におけるマイクロキャリア、Ｃ２Ｃ１２細胞及びゲル状のアルギン酸を含む混合物の顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍである。 実施例１における細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）の顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍである。 実施例１における培養１日目の細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）の蛍光顕微鏡像である。スケールバーは２５０μｍである。 実施例１における培養４日目の対照群、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を観察した画像である。上は明視野での顕微鏡像であり、下は蛍光顕微鏡像である。スケールバーは４００μｍである。 実施例１における培養４日目の対照群、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）での細胞増殖率を示すグラフである。 実施例２における細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）の蛍光顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍである。 実施例３におけるＴ字状の細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）の観察写真である。 実施例４における継代培養した各細胞の細胞増殖率を示すグラフである。 実施例５における分化誘導前の細胞の顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍである。 実施例５における分化誘導後の細胞の顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍである。 実施例６における培養１日目及び４日目の対照群１（Ｓｔａｔｉｃ ＭＣ）、対照群２（Ａｇｉｔａｔｉｏｎ ＭＣ）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）（ＭＣ ｆｉｂｅｒ）を観察した画像である。左及び中央は明視野での顕微鏡像であり、右は蛍光顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍである。 実施例６における培養４日目の対照群１（Ｓｔａｔｉｃ ＭＣ）、対照群２（Ａｇｉｔａｔｉｏｎ ＭＣ）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）（ＭＣ ｆｉｂｅｒ）での細胞増殖率を示すグラフである。

＜細胞の三次元培養方法＞
本実施形態の細胞の三次元培養方法は、ゲル化工程と、第１の被覆工程と、除去工程と、培養工程と、を備える方法である。

図１は、本実施形態の細胞の三次元培養方法の一例を示す概略工程図である。図１を参照しながら、各工程について、以下に詳細を説明する。

［ゲル化工程］
ゲル化工程では、まず、多糖類を含有する第１の溶液１ａと、マイクロキャリア２と、接着性細胞３とを混合する。このとき、混合溶液が均一になるように、撹拌することが好ましい。次いで、均一な状態の混合溶液に多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液４を添加して、多糖類をゲル化する。混合溶液を第２の溶液に添加する方法としては、例えば、図１に示すように、注射器等に混合溶液を充填し、第２の溶液を含む容器に、混合溶液を注射器を用いて吐出する方法が挙げられる。又は、例えば、マイクロ流路に、混合溶液及び第２の溶液をそれぞれ送液し、接触させる方法が挙げられる。

ゲル化工程において、多糖類を凝固剤と接触させてハイドロゲルを形成することで、マイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む固形の混合物が得られる。この混合物中では、ゲル状の多糖類１ｂに、マイクロキャリア２及び接着性細胞３が均一に分散した状態が保たれている。

（第１の溶液）
第１の溶液に含まれる多糖類としては、凝固剤を添加することでハイドロゲルを形成でき、可溶化剤を添加することで可溶化できるものであればよい。多糖類として具体的には、例えば、カラギーナン、ＬＭ（Ｌｏｗ Ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）ペクチン、キシログルカン、ジェランガム、ヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩等が挙げられ、これらに限定されない。これら多糖類を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。

また、ヒアルロン酸塩及びアルギン酸塩としては、ヒアルロン酸及びアルギン酸と１価の金属イオンとの塩であることが好ましい。１価の金属イオンとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等が挙げられ、これらに限定されない。

中でも、多糖類としては、アルギン酸又はその塩であることが好ましい。

また、上記多糖類と組み合わせて、例えば、寒天、ゼラチン、アガロース、デンプン、グリコーゲン、ヘパリン、セルロース等のその他の多糖類を併用してもよい。これらその他の多糖類は加温することで溶解し、冷却することでハイドロゲルとすることができる。

第１の溶液中の多糖類の濃度としては、例えば０．５質量％以上３質量％以下とすることができ、例えば１質量％以上２質量％以下とすることができる。

また、多糖類を溶解する溶媒としては、水系溶媒であればよい。水系溶媒として具体的には、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液等の当該分野において公知の緩衝液等が挙げられる。

前記緩衝液は、必要に応じて、ＮａＣｌ、界面活性剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等)、又は防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）を含んでいてもよい。

公知の緩衝液の具体例としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）、ＴＢＳ－Ｔ（ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０）等が挙げられ、これらに限定されない。

また、水系溶媒の代わりに、細胞培養用の培地を用いてもよく、上記水系溶媒と培地との混合溶液であってもよい。前記培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。

前記基本培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられ、これらに限定されない。

また、前記培地はさらに血清、又は、成長因子を含んでいてもよい。

前記血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。

培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。

前記成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。

前記成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１：ＩＧＦ－１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。

培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。

培地にはさらに、以下に例示するホルモン、抗生物質等のその他の添加物を含有していてもよい。

培地に含まれるホルモンとしては、例えば、インシュリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。

培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。

培地に含まれる抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。

培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。

また、第１の溶液は、更に、細胞外マトリックスを含んでいてもよい。細胞外マトリックスとしては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。

（マイクロキャリア）
ゲル化工程において用いられるマイクロキャリアとしては、細胞培養に一般的に用いられる公知のものを用いることができる。また、その形状は、特別な限定はなく、例えば、球状、多角体状、円球状、円錐状、角錐状、円錐台状、角錐台状等が挙げられる。中でも、表面積が大きく、万遍なく細胞が接着可能であることから、球状であることが好ましい。

マイクロキャリアが球状である場合、その粒子径は、例えば１０μｍ以上５００μｍ以下とすることができ、例えば１００μｍ以上３００μｍ以下とすることができる。

また、マイクロキャリアの材質としては、細胞適合性を有するものであればよい。マイクロキャリアとして具体的には、例えば、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン等を含むものであればよい。これらを１種単独含むものであってもよく、２種以上組み合わせて含むものであってもよい。

また、マイクロキャリアの材質がセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチンである場合、後述に示す培養工程において、所望の細胞数に達した後、マイクロキャリアの材質を分解する酵素（セルラーゼ、デキストラナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、プロテアーゼ）等で処理することで、マイクロキャリアを容易に除去することができる。さらに、細胞構造体を被覆するポリアミノ酸を除去することで、細胞を簡便に単離することができる。また、このとき、細胞構造体を被覆するポリアミノ酸を除去せずに継続して培養し、マイクロキャリアが除去された生じた空間を埋めるように細胞をさらに増殖させて、ポリアミノ酸を除去することもできる。これにより、三次元的に形成された細胞のみからなる細胞構造体を得ることができる。

多糖類を含有する第１の溶液と、マイクロキャリアと、接着性細胞との混合溶液中のマイクロキャリアの濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、例えば３０ｍｇ／ｍＬ以上８０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

（接着性細胞）
ゲル化工程において用いられる接着性細胞としては、固体表面に接着して増殖する細胞であれば特に限定されない。接着性細胞として具体的には、例えば、上皮細胞（Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｍＬｕ細胞等）、腫瘍細胞（Ｈｅｌａ細胞、ＶＡＣＯ細胞等）、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞、ＤＢＡＥ細胞等）、白血球（ＨＩＴ－Ｔ１５細胞等）、線維芽細胞（ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＳＦＭＥ細胞等）、筋肉細胞（ＨＬ１細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞等）、神経／内分泌腺細胞（ＲＯＣ－１細胞、ＩＭＲ－３２細胞等）等が挙げられる。これら細胞を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせ用いてもよい。

細胞の由来となる動物としては、脊椎動物であってもよく、無脊椎動物であってもよい。脊椎動物としては、特別な限定はなく、例えば、哺乳動物、両類、爬虫類、両生類、魚類等が挙げられる。無脊椎動物としては、特別な限定はなく、例えば、昆虫、甲殻類、軟体動物、原生動物等が挙げられる。

中でも、細胞の由来となる動物としては、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。哺乳動物として具体的には、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、哺乳動物としては、ヒトであることが好ましい。

（第２の溶液）
第２の溶液に含まれる多糖類に対する凝固剤としては、多糖類の種類に応じて適宜選択すればよい。
多糖類がカラギーナン、ＬＭ（Ｌｏｗ Ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）ペクチン、ジェランガム、アルギン酸及びその塩である場合、凝固剤として具体的には、例えば、２価の金属塩が挙げられる。２価の金属塩としては、例えば、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられ、これらに限定されない。

バリウム塩として具体的には、例えば、塩化バリウム、フッ化バリウム、臭化バリウム、水酸化バリウム、炭酸バリウム、リン酸バリウム等が挙げられる。

塩化カルシウム、フッ化カルシウム、臭化カルシウム、過酸化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム等が挙げられる。

塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム、臭化マグネシウム、過酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム等が挙げられる。

多糖類がキシログルカンである場合、凝固剤として具体的には、例えば、単糖類、オリゴ糖類、アルコール、ポリオール、ポリフェノール類等が挙げられる。

多糖類がヒアルロン酸である場合、凝固剤として具体的には、例えば、グルタルアルデヒド、グリセリンアルデヒド等のアルデヒド類等が挙げられる。

第２の溶液中の凝固剤の濃度としては、凝固剤が２価の金属塩である場合、例えば５０ｍＭ以上２００ｍＭ以下とすることができ、例えば７５ｍＭ以上１５０ｍＭ以下とすることができる。

また、凝固剤を溶解する溶媒としては、水系溶媒であればよい。水系溶媒としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。また、水系溶媒の代わりに、細胞培養用の培地を用いてもよく、上記水系溶媒と培地との混合溶液であってもよい。培地としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。

［第１の被覆工程］
第１の被覆工程では、ポリアミノ酸を含む第３の溶液５を添加して、マイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む混合物をポリアミノ酸６で被覆する。混合物に第３の溶液５を添加する方法としては、例えば、図１に示すように、混合物を加温した第３の溶液に浸漬させる方法が挙げられる。又は、例えば、混合物に加温した第３の溶液を滴下する方法が挙げられる。第３の溶液の温度としては、例えば３０℃以上４０℃以下とすることができる。これにより、ポリアミノ酸で被覆されたマイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の前記多糖類１ｂを含む混合物（以下、「細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）」１０と称する）が得られる。また、ポリアミノ酸で被覆することで、マイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の前記多糖類１ｂを含む混合物同士が凝集することを防止でき、該混合物に含まれるマイクロキャリア２及び接着性細胞３が拡散することを防止することができる。

（第３の溶液）
第３の溶液に含まれるポリアミノ酸としては、例えば、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ポリ－Ｌ－ヒスチジン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ－Ｌ－アスパラギン酸等が挙げられ、これらに限定されない。これらポリアミノ酸を１種単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。

中でも、ポリアミノ酸としては、ポリ－Ｌ－リジンであることが好ましい。

第３の溶液中のポリアミノ酸の濃度としては、凝固剤が２価の金属塩である場合、例えば５０ｍＭ以上２００ｍＭ以下とすることができ、例えば７５ｍＭ以上１５０ｍＭ以下とすることができる。

また、ポリアミノ酸を溶解する溶媒としては、水系溶媒であればよい。水系溶媒としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。また、水系溶媒の代わりに、細胞培養用の培地を用いてもよく、上記水系溶媒と培地との混合溶液であってもよい。培地としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。

［除去工程］
除去工程では、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０に、ゲル状の多糖類の可溶化剤を含む第４の溶液７を添加し、多糖類を除去する。第４の溶液を添加する方法としては、例えば、図１に示すように、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０を第４の溶液７に浸漬させる方法が挙げられる。又は、例えば、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０に第４の溶液７を滴下する方法が挙げられる。これにより、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０に含まれるゲル状の多糖類を分解し、除去して、細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）が得られる。

（第４の溶液）
第４の溶液に含まれるゲル状の多糖類の可溶化剤としては、多糖類の種類に応じて適宜選択すればよい。

多糖類がカラギーナン、ＬＭ（Ｌｏｗ Ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）ペクチン、ジェランガム、並びに、アルギン酸及びその塩である場合、ゲル状の多糖類の可溶化剤としては、例えば、キレート剤、酵素等が挙げられる。

キレート剤として具体的には、例えば、クエン酸、エチレンジアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｄｉａｍｉｎｅ Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（Ｎｉｔｒｉｌｏ Ｔｒｉａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｒｉａｍｉｎｅ Ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＤＴＰＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－三酢酸（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｄｉａｍｉｎｅ Ｔｒｉａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＨＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（Ｇｌｙｃｏｌ Ｅｔｈｅｒ Ｄｉａｍｉｎｅ Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＧＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）、トリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’ ’，Ｎ’ ’ ’，Ｎ’ ’ ’－六酢酸（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｔｒａｍｉｎｅ Ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＴＴＨＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｉｍｉｎｏ Ｄｉａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ；ＨＩＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ジ（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ；ＤＨＥＧ）等が挙げられ、これらに限定されない。また、クエン酸は、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等のクエン酸塩の形であってもよい。

酵素としては、例えば、λ－カラギナーゼ、ペクチナーゼ、ジェランガム分解酵素、アルギン酸リアーゼ等が挙げられ、これらに限定されない。

多糖類がキシログルカン、並びに、ヒアルロン酸及びその塩である場合、ゲル状の多糖類の可溶化剤としては、例えば、キシログルカン分解酵素、ヒアルロニダーゼ等の酵素が挙げられる。

第４の溶液に含まれるゲル状の多糖類の可溶化剤がクエン酸である場合、該クエン酸の濃度としては、例えば０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることができる。

また、第４の溶液に含まれるゲル状の多糖類の可溶化剤がＥＤＴＡである場合、該ＥＤＴＡの濃度としては、例えば０．５ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることができる。

また、第４の溶液に含まれるゲル状の多糖類の可溶化剤が酵素である場合、該酵素の濃度としては、例えば０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、０．０２ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

また、ゲル状の多糖類の可溶化剤を溶解する溶媒としては、水系溶媒であればよい。水系溶媒としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。また、水系溶媒の代わりに、細胞培養用の培地を用いてもよく、上記水系溶媒と培地との混合溶液であってもよい。培地としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。

［培養工程］
培養工程では、ポリアミノ酸６で被覆されたマイクロキャリア２及び接着性細胞３を含む混合物（以下、「細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）」２０と称する場合がある）を培養する。培養方法としては、例えば、図１に示すように、培地９を含むスピンナーフラスコ８内に、細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０を入れて、培養する方法が挙げられる。又は、その他の三次元培養法として公知の方法を用いてもよい。これにより、細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０中において、上記除去工程で除去されたゲル状の多糖類が存在した空間を埋めるように接着細胞を増殖させることができる。また、ゲル状の多糖類の存在により、マイクロキャリア２及び接着性細胞３が均一に分散した状態が保たれたことで、ゲル状の多糖類の除去後においても、過剰な凝集を抑制することができ、細胞構造体の内部に存在する細胞にも、充分に栄養分及び酸素が供給される。これにより、本実施形態の三次元培養方法では、従来の三次元培養方法よりも、細胞生存率及び細胞増殖率が良好なものとなる。

また、培養工程において用いられる培地としては、上記第１の溶液で例示されたものと同様のものが挙げられる。

培養条件は、細胞構造体２０に含まれる細胞の種類に応じて、適宜調整することができる。培養温度としては、例えば３０℃以上４０℃以下とすることができる。培養環境としては、例えば約５％ＣＯ_２を含有する空気の条件下とすることができる。

また、本実施形態の細胞の三次元培養方法では、上記ゲル化工程、上記第１の被覆工程、上記除去工程及び上記培養工程に加えて、更に、その他の工程を備えていてもよい。その他の工程としては、第２の被覆工程、回収工程及び洗浄工程等が挙げられる。第２の被覆工程は、上記第１の被覆工程の後であって、上記除去工程の前に行えばよい。回収工程は、上記培養工程の後に行えばよい。洗浄工程は、上記各工程の後であって、後に続く工程の前に行えばよい。

［第２の被覆工程］
第２の被覆工程では、第１の被覆工程で得られた細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０に、多糖類を含む第１の溶液１ａ及び多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液４を添加する。第１の溶液１ａ及び第２の溶液４を添加する方法としては、例えば、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０及び第１の溶液１ａの懸濁液を調製し、該懸濁液と第２の溶液４とをマイクロ流路に送液して、接触させる方法が挙げられる。

これにより、ポリアミノ酸６で被覆されたマイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む混合物（細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０）を、更にゲル状の多糖類１ｂで被覆することができる。得られる細胞構造体の構造としては、最外表面がゲル状の多糖類１ｂで被覆され、中間層がポリアミノ酸６であり、その内部にマイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む混合物が存在する。この得られた細胞構造体を、以下において、「細胞構造体（ゲル状の多糖類を内外に含有）」と称する場合がある。

［回収工程］
回収工程では、培養工程で得られた培養後の細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０から接着性細胞３を回収する。具体的には、まず、ポリアミノ酸を物理的に引き剥がして、内部からマイクロキャリア２及び接着性細胞３を含む混合物を取り出す。次いで、トリプシン処理等により、マイクロキャリア２と接着性細胞３とを解離させて、接着性細胞３を回収する。

［洗浄工程］
洗浄工程では、上記ゲル化工程で得られたマイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む混合物を洗浄するために行ってもよい。又は、上記第１の被覆工程で得られた細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０を洗浄するために行ってもよい。又は、上記第２の被覆工程で得られた細胞構造体（ゲル状の多糖類を内外に含有）を洗浄するために行ってもよい。上記除去工程で得られた細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０を洗浄するために行ってもよい。又は、培養工程で得られた培養後の細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０を洗浄するために行ってもよい。

洗浄工程では、水系溶媒又は培地を用いて、上記工程で得られたものを１回以上（例えば２回以上３回以下程度）洗浄することができる。洗浄工程で用いられる水系溶媒又は培地としては、上記第１の溶液において例示されたものと同様のものが挙げられる。

＜細胞構造体＞
本実施形態の細胞構造体は、上記細胞の三次元培養方法により得られる。図１の本実施形態の細胞の三次元培養方法の一例を示す概略構成図において、細胞構造体の構成図を示している。

図１に示す細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０は、マイクロキャリア２及び接着性細胞３を含む。また、マイクロキャリア２及び接着性細胞３を含む混合物がポリアミノ酸６で被覆されている。この細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０は、接着性細胞３の生存率及び増殖率が良好である。そのため、接着性細胞３の大量培養に好適に用いられる。

マイクロキャリア２及び接着性細胞３を含む混合物は、更に、細胞外マトリックスを含んでいてもよい。これにより、接着性細胞をより良好に増殖させることができる。細胞外マトリックスとしては、上記第１の溶液において例示されたものと同様のものが挙げられる。

また、図１に示す細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０では、マイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む混合物がポリアミノ酸６で被覆されている。すなわち、本実施形態の細胞構造体は、更に、ゲル状の多糖類１ｂを含んでいてもよい。この細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０は、接着性細胞３の増殖率は低いが、生存率が良好である。そのため、接着性細胞の運搬に好適に用いられる。

また、図示していないが、上記細胞の三次元培養方法の第２の被覆工程により得られる細胞構造体（ゲル状の多糖類を内外に含有）では、最外表面がゲル状の多糖類１ｂで被覆され、中間層がポリアミノ酸６であり、その内部にマイクロキャリア２、接着性細胞３及びゲル状の多糖類１ｂを含む混合物が存在する。すなわち、本実施形態の細胞構造体は、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０が、更にゲル状の多糖類１ｂで被覆されていてもよい。この細胞構造体（ゲル状の多糖類を内外に含有）は、接着性細胞３の増殖率は低いが、生存率が良好である。そのため、接着性細胞の運搬に好適に用いられる。

本実施形態の細胞構造体の形状としては、特別な限定はなく、例えば、シート状（板状）、ファイバー状（繊維状）、球状等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、形状としては、製造しやすい点から、ファイバー状（繊維状）が好ましい。特に、細い構造のファイバー状である場合、より効果的にマイクロキャリア及び細胞の過剰な凝集による細胞死を抑制することができる。

本実施形態の細胞構造体の大きさとしては、撹拌培養可能な大きさであればよい。
本実施形態の細胞構造体の形状がファイバー状（繊維状）である場合、その筒径は、例えば１００μｍ以上１０００μｍ以下とすることができる。また、その長さは、例えば５００μｍ以上１００μｍ以下とすることができる。

＜細胞構造体の製造方法＞
本実施形態の細胞構造体の製造方法は、上記ゲル化工程と、上記第１の被覆工程とを備える方法である。

本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）１０を得ることができる。

本実施形態の細胞構造体の製造方法は、上記ゲル化工程及び上記第１の被覆工程に加えて、更に、上記除去工程、上記培養工程及び上記第２の被覆工程を備えていてもよい。上記除去工程は上記第１の被覆工程の後に行えばよい。上記培養工程は、上記除去工程の後に行えばよい。また、上記第２の被覆工程は、上記第１の被覆工程の後であって、上記除去工程の前に行えばよい。

本実施形態の細胞構造体の製造方法は、上記除去工程を備えることで、細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０を得ることができる。

本実施形態の細胞構造体の製造方法は、上記培養工程を備えることで、細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）２０中の接着性細胞３を増殖させることができる。

本実施形態の細胞構造体の製造方法は、上記第２の被覆工程を備えることで、細胞構造体（ゲル状の多糖類を内外に含有）を得ることができる。

本実施形態の細胞構造体の製造方法は、上記ゲル化工程、上記第１の被覆工程、上記除去工程及び上記第２の被覆工程に加えて、更に、その他の工程を備えていてもよい。その他の工程としては、例えば、洗浄工程及び第２の除去工程等が挙げられる、洗浄工程は、上記細胞の三次元培養方法において記載したものと同様の工程である。また、第２の除去工程は、上記培養工程の後に行えばよい。

［第２の除去工程］
また、第２の除去工程では、マイクロキャリアの材質がセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチンである場合、該マイクロキャリアを除去する。具体的には、まず、上記培養工程において、所望の細胞数に達した後、マイクロキャリアの材質を分解する酵素（セルラーゼ、デキストラナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、プロテアーゼ）等で処理する。これにより、マイクロキャリアを容易に除去することができ、ポリアミノ酸で被覆されており、マイクロキャリアを含まず、接着性細胞を含む細胞構造体（以下、「細胞構造体（マイクロキャリア不含）」と称する場合がある）を得ることができる。

また、得られた細胞構造体（マイクロキャリア不含）をさらに培養することで、マイクロキャリアが除去された生じた空間を埋めるように細胞をさらに増殖させることができる。その後、ポリアミノ酸を物理的に引き剥がして取り除くことで、三次元的に形成された接着性細胞の細胞構造体を得ることができる。

＜細胞の運搬方法＞
本実施形態の細胞の運搬方法は、上記細胞構造体を用いる方法である。

本実施形態の細胞の運搬方法で用いられる細胞構造体としては、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）又は細胞構造体（ゲル状の多糖類を内外に含有）であることが好ましい。後述の実施例に示すとおり、細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）は、接着性細胞３の増殖率は低いが、生存率が良好である。そのため、接着性細胞の運搬に好適に用いられる。

運搬方法としては、例えば、培地を含む開閉可能な密封容器に上記細胞構造体を封入し、運搬する方法が挙げられる。

培地としては、上記第１の溶液において例示されたものと同様のものが挙げられる。

密封容器としては、例えば、スクリューキャップ付のコニカルチューブ、スクリューキャップ付の細胞培養用フラスコ等が挙げられ、これらに限定されない。

運搬する条件としては、運搬する細胞の種類により適宜選択することができる。

運搬時の温度としては、例えば４℃以上４０℃以下とすることができ、例えば１０℃以上３９℃以下とすることができ、例えば１８℃以上３７℃以下とすることができる。

また、運搬時の環境は、例えば約５％ＣＯ_２を含有する空気の条件下であってもよい。

運搬可能な時間としては、細胞の種類、細胞数等により異なる。例えば１時間以上３００日以下とすることができ、例えば１日以上１００日以下とすることができ、例えば３日以上６０日以下とすることができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
１．細胞構造体の作製
（１）ゲル化工程
２ｍｇ／ｍＬのネイティブコラーゲン及び１％のアルギン酸を含む溶液を調製した。次いで、該溶液に、マイクロキャリア（終濃度：６０ｍｇ／ｍＬ、商品名：Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）及びマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞（終濃度：１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を混合して、混合溶液を調製した。次いで、該混合溶液を注射器に充填し、１００ｍＭ塩化カルシウム溶液に吐出して、アルギン酸をゲル化した。これにより、マイクロキャリア、Ｃ２Ｃ１２細胞及びゲル状のアルギン酸を含む混合物が得られた（図２Ａ参照）。なお、図２Ａ中、矢印は細胞を示す。

（２）被覆工程
次いで、該混合物をポリリジン溶液に入れて３７℃まで加温し、ポリリジンを被覆させた。これにより、ポリリジンで被覆されたマイクロキャリア、Ｃ２Ｃ１２細胞及びゲル状のアルギン酸を含む細胞構造体（以下、「細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）」と称する場合がある）が得られた（図２Ｂ参照）。なお、図２Ｂ中、矢印は細胞を示す。

（３）除去工程
次いで、４０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼ含有又は不含の培地を用いて、（２）で得られた細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を１日間培養した。培地としては、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）を用いた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２環境下とした。また、オービタルシェーカー（回転数：約５０ｒｐｍ）を用いて、撹拌培養した。次いで、培養後の各細胞構造体をカルセインＡＭ（生細胞を染色）を用いて染色した。その結果を図３に示す。図３において、「Ａｌｇｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ（－）」は細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を示し、「Ａｌｇｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ（＋）」は細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を示す。

図３から、アルギン酸リアーゼ含有培地を用いて培養した細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）では、ゲル状のアルギン酸が分解されて除去されていた。そのため、Ｃ２Ｃ１２細胞がマイクロキャリア表面に接着していた。一方、アルギン酸リアーゼ不含培地を用いて培養した細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）では、Ｃ２Ｃ１２細胞がマイクロキャリアには接着していなかった。

（４）培養工程
次いで、アルギン酸リアーゼ不含のＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）に交換し、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を、さらに３日間（培養開始から４日間）培養した。

また、対照群として、６ウェルプレートにＣ２Ｃ１２細胞（２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、４ｍｇ／ｍＬのマイクロキャリア（商品名：Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を含有するＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を用いて４日間撹拌培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２環境下とした。また、オービタルシェーカー（回転数：約５０ｒｐｍ）を用いて、撹拌培養した。

４日間の培養後、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）及び対照群を、カルセインＡＭ（生細胞を染色）及びエチジウムホモダイマー（死細胞を染色）を用いて染色した。結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、「ＭＣ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏａｌ）」とは対照群を示す。「ＭＣ ｆｉｂｅｒ Ａｌｇｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ（－）」とは、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を示す。「ＭＣ ｆｉｂｅｒ Ａｌｇｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ（＋）」とは、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を示す。また、上は明視野での顕微鏡像であり、下は蛍光顕微鏡像である。また、スケールバーは４００μｍである。

図４Ａから、対照群では、死細胞が多く観察された。一方、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）及び細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）は、ほとんど生細胞であった。これは、細胞構造体では、マイクロキャリア及び細胞の凝集塊の大きさが制御されており、過剰な凝集が抑制されたためであると推察された。

次いで、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）及び対照群をトリプシン－ＥＤＴＡ処理して、細胞及びマイクロキャリアを解離させた。次いで、細胞数を測定した。結果を図４Ｂに示す。図４Ｂにおいて、細胞増殖率は、培養開始時の細胞数を１としたときの相対比を示している。図４Ｂにおいて、「ＭＣ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏａｌ）」とは対照群を示す。「ＭＣ ｆｉｂｅｒ Ａｌｇｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ（－）」とは、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を示す。「ＭＣ ｆｉｂｅｒ Ａｌｇｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ（＋）」とは、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を示す。

図４Ｂから、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）では細胞がほとんど増殖していなかった。一方、対照群では６．９倍であるの対し、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）では細胞増殖率が９．９倍であり、高い細胞増殖率を示した。

［実施例２］
１．細胞構造体の作製
実施例１の「１．」の（１）～（２）と同様の方法を用いて、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を得た。

２．培養
細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を用いて、2日間培養した。

３．ゲル状のアルギン酸の除去
次いで、４０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼ含有ＤＭＥＭに交換し、「２．」で２日間培養した細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を１日間培養し、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を得た。なお、培養条件としては、オービタルシェーカー（回転数：約５０ｒｐｍ）を用いて、撹拌培養した。次いで、培養後の細胞構造体を、カルセインＡＭ（生細胞を染色）を用いて染色した。その結果を図５に示す。図５中、スケールバーは５００μｍである。

図５から、細胞がマイクロキャリア上に接着し、扁平な形をとることが観察された。また、大半が生細胞であった。

このことから、アルギン酸リアーゼ処理をしない細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）で運送し、任意のタイミングでアルギン酸リアーゼ処理をして培養再開できることが示唆された。

［実施例３］
１．細胞構造体の作製
まず、セルトレーナー（孔：７０μｍ）を１００ｍＭ塩化カルシウム溶液に浸して、取り出した。次いで、２ｍｇ／ｍＬのネイティブコラーゲン及び１％のアルギン酸を含む溶液を調製した。次いで、該溶液に、マイクロキャリア（終濃度：６０ｍｇ／ｍＬ、商品名：Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）及びマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞（終濃度：１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を混合して、混合溶液を調製した。次いで、この混合溶液を、ピペットを用いて、塩化カルシウム溶液に浸潤させたセルトレーナーの上に、Ｔ字状に滴下した。これにより、塩化カルシウム溶液に浸潤させたセルトレーナーと触れた部分がゲル化し、Ｔ字状の細胞構造体が得られた（図６参照）。また、セルトレーナーの孔サイズはマイクロキャリアを通さないため、細胞及びマイクロキャリアを損失しなかった。

この結果から、立体的な任意の構造の細胞構造体が得られることが示唆された。

［実施例４］
１．細胞構造体の作製
実施例１の「１．」の（１）～（４）と同様の方法を用いて、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を得た。

２．回収工程
次いで、「１．」で得られた細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）のポリリジンを物理的に引き剥がして、内部からマイクロキャリア及び細胞を含む混合物を取り出した。次いで、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、マイクロキャリアと細胞とを解離させて、細胞を回収した。得られた細胞を１継代目（Ｐａｓｓａｇｅ １；Ｐ１）とした。

３．細胞構造体の作製（２回目）及び回収工程（２回目）
次いで、得られたＰ１の細胞を用いて、実施例１の「１．」の（１）～（４）と同様の方法を用いて、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を得た。次いで、得られた細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を用いて、上記「２．」と同様の方法で、細胞を回収した。得られた細胞を２継代目（Ｐａｓｓａｇｅ ２；Ｐ２）とした。

４．細胞構造体の作製（３回目）及び回収工程（３回目）
次いで、得られたＰ２の細胞を用いて、実施例１の「１．」の（１）～（４）と同様の方法を用いて、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を得た。次いで、得られた細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を用いて、上記「２．」と同様の方法で、細胞を回収した。得られた細胞を３継代目（Ｐａｓｓａｇｅ ３；Ｐ３）とした。

５．細胞増殖率の確認
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３の細胞の数を測定し、当初培養に用いた細胞数（２×１０^６ｃｅｌｌｓ／細胞構造体１つ当たり）を１とした場合のＰ１、Ｐ２及びＰ３の各細胞数の比を細胞増殖率として算出した。結果を図７に示す。

図７から、安定的に細胞が増殖することが確かめられた。

この結果から、本実施形態の細胞構造体は、細胞を継続的に増殖させる手段として使用可能であることが示唆された。

［実施例５］
１．細胞構造体の作製
実施例１の「１．」の（１）～（４）と同様の方法を用いて、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を得た。

２．回収工程
次いで、「１．」で得られた細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を用いて、実施例４の「２．」と同様の方法で、細胞を回収した。

３．分化誘導
次いで、回収した細胞を播種し、２質量％のウマ血清含有ＤＭＥＭを用いて、４日間培養することで、Ｃ２Ｃ１２細胞を筋管細胞に分化誘導させた。また、対照群として、回収した細胞を、ＤＭＥＭを用いて、３日間培養した。対照群（分化誘導前の細胞）の顕微鏡像を図８Ａに、分化誘導後の細胞を図８Ｂに示す。図８Ａ及び図８Ｂ中、スケールバーは５００μｍである。

図８Ａ及び図８Ｂから、分化誘導により、細胞同士が融合し、太く多核な筋管細胞が形成されることが確かめられた。

このことから、本実施形態の三次元培養方法では、細胞の性質が保持されていることが示唆された。

［実施例６］
１．細胞構造体の作製
実施例１の「１．」の（１）～（４）と同様の方法を用いて、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）を得た。

また、対照群１として、６ウェルプレートにＣ２Ｃ１２細胞（２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、４ｍｇ／ｍＬのマイクロキャリア（商品名：Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を含有するＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を用いて４日間静置培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２環境下とした。

さらに、対照群２として、６ウェルプレートにＣ２Ｃ１２細胞（２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種し、４ｍｇ／ｍＬのマイクロキャリア（商品名：Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を含有するＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）を用いて４日間撹拌培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２環境下とした。また、オービタルシェーカー（回転数：約５０ｒｐｍ）を用いて、撹拌培養した。

４日間の培養後、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）、対照群１及び対照群２を、カルセインＡＭ（生細胞を染色）及びエチジウムホモダイマー（死細胞を染色）を用いて染色した。結果を図９Ａに示す。図９Ａにおいて、「ＭＣ ｆｉｂｅｒ」とは細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を示す。「Ｓｔａｔｉｃ ＭＣ」とは、対照群１を示す。「Ａｇｉｔａｔｉｏｎ ＭＣ」とは、対照群２を示す。また、左及び中央は明視野での顕微鏡像であり、右は蛍光顕微鏡像である。また、スケールバーは５００μｍである。

図９Ａから、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）では、死細胞に対し、生細胞が顕著に多かった。
一方、対照群１では、細胞の凝集が制御できず、内部に死細胞が多く観察された。さらに、対照群２では、比較的小さい凝集塊を形成していたが、撹拌によるシアストレス（流体のせん断応力）によって、大量の死細胞が観察された。

次いで、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）、対照群１及び対照群２をトリプシン－ＥＤＴＡ処理して、細胞及びマイクロキャリアを解離させた。次いで、細胞数を測定した。結果を図９Ｂに示す。図９Ｂにおいて、細胞増殖率は、培養開始時の細胞数を１としたときの相対比を示している。図９Ｂにおいて、「ＭＣ ｆｉｂｅｒ」とは細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）を示す。「Ｓｔａｔｉｃ ＭＣ」とは、対照群１を示す。「Ａｇｉｔａｔｉｏｎ ＭＣ」とは、対照群２を示す。また、左及び中央は明視野での顕微鏡像であり、右は蛍光顕微鏡像である。

図９Ｂから、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）での細胞増殖率が顕著に高かった。一方、対照群２では、細胞増殖率が著しく低下していた。

特に、対照群２は、従来のマイクロキャリアを用いた懸濁培養方法であり、非効率的な増殖や細胞死、性質の変化が問題であることがいわれてきた。また、培養４日目では、小さめの凝集塊で収まっているが、培養を継続することで、対照群１と同様に、凝集が大きくなりすぎる問題が発生する。

これに対し、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）では、静置培養であるため、シアストレスの影響が軽減され、且つ、凝集塊の大きさを制御することで死細胞発生が抑制されたものと推察された。

以上のことから、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸不含）では、高い細胞生存率及び高い細胞増殖率で、細胞を培養できることが示唆された。また、細胞構造体（ゲル状のアルギン酸含有）では、細胞増殖率は低く、細胞生存率が高いことから、細胞を保存又は運搬するために活用できることが示唆された。

本実施形態の細胞の三次元培養方法によれば、マイクロキャリア及び細胞の過剰な凝集による細胞死を抑制することができる。本実施形態の細胞構造体及びその製造方法によれば、マイクロキャリア及び細胞の凝集塊の大きさを制御することができ、細胞生存率及び細胞増殖率を良好なものとすることができる。本実施形態の細胞の運搬方法によれば、細胞生存率を保ちながら安全かつ簡便に細胞を運搬することができる。

１ａ…多糖類を含有する第１の溶液、１ｂ…ゲル状の多糖類、２…マイクロキャリア、３…接着性細胞、４…多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液、５…ポリアミノ酸を含む第３の溶液、６…ポリアミノ酸、７…ゲル状の多糖類の可溶化剤を含む第４の溶液、８…スピンナーフラスコ、９…培地、１０…細胞構造体（ゲル状の多糖類含有）、２０…細胞構造体（ゲル状の多糖類不含）

Claims (13)

1. 多糖類を含有する第１の溶液と、マイクロキャリアと、接着性細胞とを混合し、前記多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液を添加して、前記多糖類をゲル化して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を得るゲル化工程と、
   ポリアミノ酸を含む第３の溶液を添加して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を前記ポリアミノ酸で被覆する第１の被覆工程と、
   前記ゲル状の多糖類の可溶化剤を含む第４の溶液を添加し、前記多糖類を除去する除去工程と、
   前記ポリアミノ酸で被覆された前記マイクロキャリア及び前記接着性細胞を含むファイバー状の混合物を培養する培養工程と、
   を備える細胞の三次元培養方法。
2. 前記第１の被覆工程の後であって、前記除去工程の前に、更に、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を添加し、前記ポリアミノ酸で被覆された前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を、更にゲル状の前記多糖類で被覆する第２の被覆工程を備える請求項１に記載の細胞の三次元培養方法。
3. 前記第１の溶液が、更に細胞外マトリックスを含む請求項１又は２に記載の細胞の三次元培養方法。
4. マイクロキャリア及び接着性細胞を含み、
   前記マイクロキャリア及び前記接着性細胞を含む混合物がポリアミノ酸で被覆されており、
   ファイバー状である、細胞構造体。
5. 前記混合物が、更にゲル状の多糖類を含む請求項４に記載の細胞構造体。
6. 前記混合物が、更に細胞外マトリックスを含む請求項４又は５に記載の細胞構造体。
7. 前記ポリアミノ酸で被覆された前記混合物が、更にゲル状の多糖類で被覆されている請求項４～６のいずれか一項に記載の細胞構造体。
8. マイクロキャリアと、接着性細胞と、多糖類を含有する第１の溶液とを混合し、前記多糖類に対する凝固剤を含む第２の溶液を添加して、前記多糖類をゲル化して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を得るゲル化工程と、
   ポリアミノ酸を含む第３の溶液を添加して、前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物をポリアミノ酸で被覆する第１の被覆工程と、
   を備える細胞構造体の製造方法。
9. 前記第１の被覆工程の後に、更に、前記ゲル状の多糖類の可溶化剤を含む第４の溶液を添加し、前記多糖類を除去する除去工程を備える請求項８に記載の細胞構造体の製造方法。
10. 前記第１の被覆工程の後であって、前記除去工程の前に、更に、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を添加し、前記ポリアミノ酸で被覆された前記マイクロキャリア、前記接着性細胞及びゲル状の前記多糖類を含むファイバー状の混合物を、更にゲル状の前記多糖類で被覆する第２の被覆工程を備える請求項９に記載の細胞構造体の製造方法。
11. 前記第１の溶液が、更に細胞外マトリックスを含む請求項８～１０のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
12. 請求項５～７のいずれか一項に記載の細胞構造体を用いる細胞の運搬方法。
13. 請求項８に記載の製造方法により得られた細胞構造体を４℃以上４０℃以下で保存する保存工程を備える、細胞の保存方法。

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