JP7023221B2

JP7023221B2 - 高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを含む脱毛防止又は育毛促進用組成物

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Publication number: JP7023221B2
Application number: JP2018516485A
Authority: JP
Inventors: ウンジョンチェ，; ヨンヒイ，; スンヒョンシン，; キョンフヮンフヮン，; ウンギョンチョ，; テリョンイ，
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2016-09-26
Publication date: 2022-02-21
Anticipated expiration: 2036-09-26
Also published as: JP2018530546A; EP3357501B1; WO2017057881A1; CN108289921B; KR20170038383A; EP3357501A1; CN108289921A; US10653616B2; US20180256488A1; KR102475127B1; HK1250344A1; EP3357501A4

Description

本明細書には、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを含む脱毛防止又は育毛促進用組成物、及び前記組成物を製造する方法が開示される。

多くの動物細胞は、多様な大きさや成分を有する細胞内起源の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌できる能力を持っており、このような細胞外小胞は、血液、小便、唾液及び細胞培養液を含むすべての生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｌｕｉｄｓ）から発見される（非特許文献１、非特許文献２）。

細胞外小胞は、小さくは直径約２０ｎｍから大きくは直径約５μｍの大きさを有する膜構造小胞体であって、その大きさと構成において異質性があり、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ、約３０～１００ｎｍ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ、約１００～１、０００ｎｍ）、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの多数の相違する種を含む。

前記細胞外小胞の相違する類型は、その起源、直径、スクロースでの密度、形状、沈降速度、脂質組成物、タンパク質マーカーまたは分泌方式（すなわち、シグナル（誘導性）によるものか自発的（構成的）なものか）などに基づいて区別される。例えば、微小胞は、約１００～１，０００ｎｍの不規則な形状を有する膜小胞であって、円形質膜の外側に向けて出芽（円形質膜から起源）し、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０リガンドを含むマーカー、ホスファチジルセリンを含む脂質を有すると知られている。一方、エクソソームは、約３０～１００ｎｍ（＜２００ｎｍ）のカップ形状を有する最も小さい膜小胞であって、後期エンドソームの内側から出芽（エンドソーム起源）し、ＣＤ６３、ＣＤ９のテトラスパニン、ＴＳＧ１０１、ＥＳＣＲＴを含むマーカー、コレステロール、スフィンゴミエリン、セラマイド、ホスファチジルセリンを含む脂質を有すると知られている。

細胞外小胞は、分泌する起源細胞（ドナー細胞）の状態を反映し、どの細胞から分泌したかによって多様な生物学的活性を示し、細胞間で遺伝物質とタンパク質を移しながら細胞間相互作用に重要な役割をする。

植物においても円形質膜と多胞体の融合は、細胞外空間への小さい小胞の放出を引き起こし、多様な植物種の多様な植物細胞において多胞体内小胞が細胞外空間で観察される（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。また、近年の研究では、植物細胞由来のエクソソーム様ナノ粒子（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｌｉｋｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は哺乳動物細胞由来のエクソソームとナノ大きさの小胞構造及びナノ粒子組成物が類似すると報告されたことがある（非特許文献６、非特許文献７）。

従来のエクソソームは、主にバイオマーカーとして用いられてきており、エクソソーム自体の効能を用いてエクソソームを特定の用途として用いる技術についての開発ははまだ十分でない実情である。特に、植物細胞由来のエクソソーム様の膜構造小胞体の特定の用途については知られたところがほとんどなく、高麗人参の場合、高麗人参由来の抽出物や単一成分の育毛効能は報告されたことがあるが、高麗人参が出す複合生理活性物質であるエクソソーム様の膜構造小胞体の育毛効能については報告されたところがない。脱毛防止及び育毛促進用組成物に関する先行技術は、特許文献１に記載されている。

韓国登録特許第１０－１５３０４９０号公報

Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM, Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases. Circ Res, 2014;114:345-53 Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M, Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis, Adv Drug Deliv Rev, 2013;65:398-401 Marchant R, Peat A, Banbury GH, The ultrastructural basis of hyphal growth. New Phytol., 1967;66:623-629 Halperin W, Jensen WA, Ultrastructural changes during growth and embryogenesis in carrot cell cultures. J Ultrastruct Res., 1967;18:428-443 Marchant R, Robards AW, Membrane systems associated with the plasmalemma of plant cells. Ann Bot., 1968;32:457-471 Qianli An, Ralph Huckelhoven, Karl-Heinz Kogel and Aart J. E. van Bel, Multivesicular bodies participate in a cell wall-associated defence response in barley leaves attacked by the pathogenic powdery mildew fungus. Cellular Microbiology (2006)8(6), 1009-1019 Regente M, Pinedo M, Elizalde M and de la Canal L. Apoplastic exosomelike vesicles:a new way of protein secretion in plants ?, Plant Signal Behav, 2012 May,7(5):544-546

一側面において、本明細書は、高麗人参由来の複合生理活性物質であるエクソソーム様ベジクルを有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供することを目的とする。

他の側面において、本明細書は、前記組成物を製造する方法を提供することを目的とする。

本明細書に開示された技術は、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル（ｅｘｏｓｏｍｅｌｉｋｅｖｅｓｉｃｌｅ）を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する。

一側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の根から分離したものであってよい。

他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、直径２０～５００ｎｍの大きさを有するものであってよい。

他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の細胞外液の１００，０００×ｇ以上の超遠心分離で沈降するものであってよい。

他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）での浮遊密度が１．００～１．２０ｇ／ｍｌのものであってよい。

他の側面において、前記有効成分は、毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌｓ、ＤＰＣｓ）を活性化して毛髪成長を誘導するものであってよい。

また、本明細書に開示された技術は、前記組成物を製造する方法であって、（１）高麗人参を搾汁して搾汁液を収得する段階；（２）前記搾汁液を遠心分離して残滓を除去し上層液を収得する段階；及び（３）前記上層液を超遠心分離してエクソソーム様ベジクル（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｌｉｋｅｖｅｓｉｃｌｅ）を収得する段階；を含む方法を提供する。

一側面において、前記段階（２）における遠心分離は、５００～３，０００×ｇで１０～３０分間実施していてよい。

他の側面において、前記段階（３）における超遠心分離は、スクロースクッション密度勾配及びイオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配を利用して超遠心分離するものであってよい。

他の側面において、前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００～２００，０００×ｇで２～６時間実施していてよい。

他の側面において、前記段階（３）においてエクソソーム様ベジクルは、上層液を超遠心分離した後、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）で１．００～１．２０ｇ／ｍｌの浮遊密度を有するフラクションを分離する段階を含んで収得していてよい。

一側面において、本明細書に開示された技術は、高麗人参由来の複合生理活性物質であるエクソソーム様ベジクルを有効成分として含む脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する効果がある。

前記組成物は、頭皮から毛髪が抜ける現象、又は毛髪が疎になる又は細くなる現象を予防し防止する効果がある。

前記組成物は、新しい毛髪を生成する発毛機能、又は前記発毛を促進させる機能だけでなく、毛髪周期の成長期から退行期への遅延を促進し且つ既存の毛髪が健康に育つようにする機能を具現する効果がある。

他の側面において、本明細書に開示された技術は、前記組成物を製造する方法を提供する効果がある。

本明細書の一実施例に係る高麗人参の根の搾汁液からエクソソーム様ベジクルを分離する過程を段階別に示した図である。本明細書の一試験例に係る高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの透過電子顕微鏡による撮像結果を示した図である。本明細書の一試験例に係る高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを毛嚢毛乳頭細胞に低濃度の範囲（０．１～２０μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示した図である。本明細書の一試験例に係る高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを毛嚢毛乳頭細胞に高濃度の範囲（１０～１００μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示した図である。本明細書の一試験例に係る高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを毛嚢器官培養（ｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅ）に処理したときの毛髪成長長さ増加（ｈａｉｒｓｈａｆｔｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）効果を示した図である。本明細書の一試験例に係る高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを毛嚢器官培養（ｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅ）に処理したときの毛髪成長長さ増加（ｈａｉｒｓｈａｆｔｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）効果を示した図である。

以下、本発明を詳しく説明する。

本明細書は、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｌｉｋｅｖｅｓｉｃｌｅ）を有効成分として含む脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する。本明細書は、高麗人参由来の抽出物ではない高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル、具体的に、高麗人参の細胞外液由来のエクソソーム様ベジクルを有効成分として含む脱毛防止又は育毛促進用組成物を提供する。

毛髪の周期は、成長期、退行期、休止期と知られている３つの主な周期に分けられる。成長期には、細胞の早い増殖とともに皮膚中へと深く毛嚢が成長しながら毛髪形成がなされる。次の現象は退行期であって、この退行期は細胞分裂の中断が目立つ過渡期であり、この過程で毛嚢は徐々に退行していって育毛が中断される。次の現象である休止期において退行毛嚢は稠密に満たされた毛乳頭（ｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａ）細胞を有する胚（ｇｅｒｍ）を含む。休止期から新たな成長期現象への開始は、前記胚から早い細胞の増殖、毛乳頭の膨張及び基底膜要素の合成によって誘導される。一般に、「育毛」は成長期でなされ、休止期から成長期への誘導及び成長期から退行期への遅延によって促進される。

本明細書において「脱毛」とは、頭皮から毛髪が抜ける現象、又は毛髪が疎になる又は細くなる現象を意味し、「脱毛防止」とは、上述したような脱毛現象を予防し抑制することを意味し、「育毛促進」とは、新しい毛髪を生成する発毛機能、又は発毛を促進させる機能だけでなく、成長期から退行期への遅延を促進し且つ既存の毛髪が健康に育つようにする機能を意味する。

前記高麗人参は、トチバニンジン属（Ｐａｎａｘｓｐｅｃｉｅｓ）植物の種子、根、幹、葉及び実からなる群から選択される一つ以上であってよく、具体的なトチバニンジン属植物としては、高麗人参（Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）、サンシチニンジン（Ｐａｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）、竹節人参（Ｐａｎａｘｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、三葉人参（Ｐａｎａｘｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、ヒマラヤ人参（Ｐａｎａｘｐｓｅｕｄｏｇｉｎｓｅｎｇ）又はベトナム人参（Ｐａｎａｘｖｉｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ）などがあり、加工の有無や生育環境に分けられる紅参、水参、白参、栽培参、長脳参、山参培養根を含む山参（深山に野生する高麗人参）など、品種や種類に制限されることなく使用可能である。

本明細書において「エクソソーム様ベジクル（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｌｉｋｅｖｅｓｉｃｌｅ）」は、細胞から分泌して細胞外空間に放出されたナノ大きさの細胞外小胞、すなわち、細胞外ベジクル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）を意味するものであって、前記ベジクルは、エクソソームを含み、エクソソームとナノ大きさのベジクル構造及びその組成物が類似のベジクルをいずれも含む最広義の概念である。

前記エクソソーム様ベジクルは、膜構造小胞体であって内部と外部とに区分され、細胞の細胞膜脂質と膜タンパク質、遺伝物質及び細胞質成分を有していることから、細胞の性質や状態を間接的に把握できるようにする。さらに、前記エクソソーム様ベジクルは、他の細胞及び組織に結合して膜構成要素、ｍＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓ、タンパク質（成長ホルモン、サイトカインなど）などを伝達し、これらの伝達物質を受容細胞に伝達することで細胞－細胞間の疎通を媒介する細胞外伝達体として作用する。

本明細書において「高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル」は、高麗人参の細胞から分泌したナノ大きさのエクソソーム様ベジクルを意味する。前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の細胞外液（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｆｌｕｉｄ）から分離したものであってよく、分離されたエクソソーム様ベジクルは、全体的に又は部分的に本来存在する組織または細胞から物理的に分離したものであってよい。

例示的な一具現例において、前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の根から分離したものであってよい。

一側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、２０～５００ｎｍの直径を有する細胞外ベジクル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）であってよい。他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上であり、且つ５００ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の直径を有する細胞外ベジクルであってよい。

他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の細胞外液の１００，０００×ｇ以上、具体的に、１００，０００～２００，０００×ｇ、または１００，０００×ｇの超遠心分離で沈降するものであってよい。

他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）での浮遊密度が１．００～１．２０ｇ／ｍｌ、または１．０３～１．２０ｇ／ｍｌ、または１．０６～１．２０ｇ／ｍｌのものであってよい。前記浮遊密度は、密度勾配遠心法によって測定された密度を言う。

他の側面において、前記エクソソーム様ベジクルは、例えば、標的細胞で所望の機能を効率的に行い得るように膜成分が化学的又は物理的に変形されたものであってよい。例えば、エクソソーム様ベジクルの膜成分がチオール基（－ＳＨ）又はアミン基（－ＮＨ_２）を用いて化学的な方法で変形されたものであるか、又はエクソソーム様ベジクルに標的誘導物質、細胞膜融合物質、ポリエチレングリコールを化学的に結合させて膜成分が化学的に変形されたものであってよい。

例示的な一具現例において、前記エクソソーム様ベジクルは、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、分画遠心分離（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、平衡密度勾配遠心分離（ＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍＤｅｎｓｉｔｙＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、密度勾配（ｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔ）、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、及び自由流動電気泳動（ｆｒｅｅ－ｆｌｏｗｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）からなる群から選択される一つ以上の方法を用いて分離していてよいが、エクソソーム様ベジクルの分離方法がこれらに制限されるものではない。

密度勾配は、密度が異なる物質を区分するときに最も多く用いられる方法であって、本明細書に係るエクソソーム様ベジクルは、密度が区分されていて密度勾配を通じて分離していてよい。この方法の具体的な例としては、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、塩化セシウム（ｃｅｓｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）などの密度勾配分離材料を用いて実施することができるが、これに制限されるものではない。一側面において、密度勾配は、超遠心分離などとともに用いられていてよい。他の側面において、エクソソーム様ベジクルを選別するためにゲル濾過（ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いていてよい。また他の側面において、大きさの小さい分子を除去するために、濾過に代えて透析を用いていてもよい。また他の側面において、自由流動電気泳動を用いていてよい。

例示的な一具現例において、前記高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルは、（１）高麗人参から高麗人参の細胞外液を含む液汁を収得する段階；（２）前記液汁を遠心分離して残滓を除去し上層液を収得する段階；及び（３）前記上層液を超遠心分離してエクソソーム様ベジクルを収得する段階；を含んで収得されていてよい。

例示的な一具現例において、前記段階（１）において液汁は、高麗人参から搾り出した液体であって、機械的分解、化学物質処理などの方法を適宜用いて収得していてよい。一側面において、液汁は、高麗人参を搾汁して収得していてよく、前記搾汁工程は、当該技術分野における周知の方法に従い通常の技術者が適宜選択して実施していてよい。

例示的な一具現例において、前記段階（２）における遠心分離は、５００～３，０００×ｇで１０～３０分間実施していてよい。このとき、前記遠心分離は、速度又は時間を変化させて段階的に実施していてもよい。

例示的な一具現例において、前記段階（３）における超遠心分離は、スクロースクッション密度勾配及びイオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配を用いて超遠心分離するものであってよい。

例示的な一具現例において、前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００～２００，０００×ｇで２～６時間実施していてよい。このとき、前記超遠心分離は、速度又は時間を変化させて段階的に実施していてもよい。

例示的な一具現例において、前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００～２００，０００×ｇで１～６時間スクロースクッション密度勾配を用いた超遠心分離及びイオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配を用いた超遠心分離を含む一連の超遠心分離工程を通じて実施していてよい。

例示的な一具現例において、前記段階（３）においてエクソソーム様ベジクルは、上層液を超遠心分離した後に分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）して得た１．００～１．２０ｇ／ｍｌの浮遊密度を有するフラクションを分離する段階を含んで収得していてよい。このとき、前記分離されたフラクションは、緩衝溶液に希釈し超遠心分離する段階をさらに含んでいてよく、具体的に、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離し、直径２０～５００ｎｍを有するペレット化したエクソソーム様ベジクルを分離していてよい。

他の側面において、本明細書は、脱毛防止又は育毛促進に有効な量の高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを、これを必要とする対象に投与することを含む脱毛防止方法又は育毛促進方法を提供する。

他の側面において、本明細書は、対象の脱毛防止又は育毛促進のための高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを提供する。

他の側面において、本明細書は、対象の脱毛防止又は育毛促進のための高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル含有組成物を製造するための用途を提供する。

例示的な一具現例において、前記高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルは、薬学組成物、化粧料組成物又は食品組成物の形態で対象に適用又は投与するものであってよい。

例示的な一具現例において、前記高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルは、対象の皮膚又は頭皮に適用又は投与するものであってよい。

例示的な一具現例において、前記組成物は、凍結乾燥された剤形であってよい。前記組成物は、すぐに使えるように（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）密封された包装材又は包装容器に入れられた凍結乾燥された剤形であってよい。

また、本明細書は、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを有効成分として含み、凍結乾燥された剤形を有する組成物；及び滅菌水又は精製水；を含む脱毛防止用キット又は育毛促進用キットを提供する。前記キットは、すぐに使えるように（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）密封された包装材又は包装容器に入れられたキットであってよい。

例示的な一具現例によれば、前記組成物は、薬学組成物であってよい。

前記薬学組成物は、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの他、防腐剤、安定化剤、水和剤、又は浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、及びその他治療的に有用な物質をさらに含有していてよく、通常の方法によって多様な経口投与剤又は非経口投与剤の形態で剤形化していてよい。

前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬・軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられ、これらの剤形は、有効成分以外に、界面活性剤、希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有していてよい。錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンといった結合剤をさらに含有していてよく、場合に応じて、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有していてよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されていてよい。

また、前記非経口投与剤の形態としては、経皮投与型の剤形が挙げられ、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってもよいが、これらに制限されるものではない。

前記有効性分の投与量の決定は当業者の水準内にあり、薬物の１日投与用量は、投与しようとする対象の症状進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの様々な要因により変わるが、成人を基準としたとき、一般には、前記組成物１μｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、他の一側面において、５０μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇを１日１～３回分けて投与していてよく、前記投与量は、如何なる方法であっても本明細書の範囲を限定するものではない。

前記薬学組成物は皮膚外用剤であってよく、前記皮膚外用剤とは、皮膚外部において塗布されるものであればいずれも含まれ得る製剤の総称であり、多様な剤形の医薬品がこれに含まれ得る。

例示的な一具現例によれば、前記組成物は化粧料組成物であってよい。

前記化粧料組成物には、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの他、機能性添加物及び一般の化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれていてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質、及び海藻エキスからなる群から選択された成分を含んでいてよい。それ以外に含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。

前記化粧料組成物は、剤形が特に限定されず、目的とするところに応じて適宜選択していてよい。例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、せっけん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、及びボディークレンザーからなる群から選択されたいずれか一つ以上の剤形に製造されていてよいが、これらに制限されるものではない。

剤形がペースト、クリーム、又はゲルである場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられていてよい。

本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられていてよく、特にスプレーである場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。

本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられていてよく、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラガカントなどが用いられていてよい。

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられていてよい。

例示的な一具現例によれば、前記組成物は食品組成物であってよい。

前記食品組成物は、液状又は固状の剤形であってよく、例えば、各種食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態で用いられていてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他に当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と同時に適用した場合、相乗効果が生じることがある。

本明細書に開示された有効成分の他に含有していてよい液体成分には、特に制限などなく、普通の飲料と同様に様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含んでいてよい。前記天然炭水化物の例としては、葡萄糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースなどの二糖類；デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。前述した香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム）を有利に用いていてよい。前記天然炭水化物の割合は、本明細書に開示された組成物１００ｍｌ当たり、通常約１～２０ｇ、一側面において、約５～１２ｇであってよい。

前記食品組成物は、一側面において、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤、及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでいてよい。他の側面において、天然果物ジュースや野菜飲料の製造のための果肉を含んでいてよい。これらの成分は、独立で、或いは組み合わせて用いていてよい。これらの添加剤の割合は多様であってよいが、本明細書に開示された組成物１００重量部当たり０．００１～約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

以下、実施例によって本発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例１．高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの分離
（段階１）先ず、４年根の高麗人参の根を準備し、これを搾汁して高麗人参の根の細胞外液を含む搾汁液を製造した。

（段階２）前記搾汁液を４℃、５００×ｇで１０分間遠心分離をして上層液を得、４℃、３，０００×ｇで２０分間更に遠心分離をして上層液を得た。

（段階３）３５ｍｌ容量の超遠心分離チューブに０．５ｍｌの２．０Ｍスクロースと１ｍｌの０．８Ｍスクロース、そして３２ｍｌの異物が除去された前記上層液をこの順に入れ、４，１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。前記超遠心分離の後、高麗人参の根のエクソソーム様ベジクルはそれの密度によって２．０Ｍスクロース層と０．８Ｍスクロース層との間に位置した。これに対し、チューブの上方から溶液を除去して高麗人参の根のエクソソーム様ベジクルが含まれた層を分離した。

（段階４）前記分離された高麗人参の根のエクソソーム様ベジクルが含まれた層を対象に密度勾配超遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行った。具体的に、前記分離された高麗人参の根のエクソソーム様ベジクルが含まれた層０．４２ｍｌと６０％のｉｏｄｉｘａｎｏｌ２．０８ｍｌとを混ぜ合わせて、最終的に５０％ｉｏｄｉｘａｎｏｌ２．５ｍｌを調製し、１２ｍｌ容量の超高速遠心分離用チューブに入れた後、３５％ｉｏｄｉｘａｎｏｌ２．５ｍｌ、２０％ｉｏｄｉｘａｎｏｌ２．５ｍｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭＨＥＰＥＳ２．５ｍｌをこの順に積み込み、４℃、２００，０００×ｇで４時間超遠心分離した。次いで、チューブの上段から１ｍｌずつ一部分(ｆｒａｃｔｉｏｎ)を得て密度を測定して、エクソソーム様ベジクル密度に該当するｆｒａｃｔｉｏｎ３（１．０８ｇ／ｍｌ）を収得した（図１参照）。

（段階５）前記収得したｆｒａｃｔｉｏｎ３をＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）６０ｍｌに希釈して７０ｍｌ容量の超遠心分離用チューブに入れた後、４℃、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離して、ペレット化された高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを収得した。

試験例１．高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの透過電子顕微鏡分析
前記実施例１で収得した高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルに対し、透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）でその大きさや形態を分析した。

図２は、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの透過電子顕微鏡による撮像結果であって、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルは直径が５０～１００ｎｍで且つ略球形を成していることを確認した。

試験例２．毛嚢細胞増殖効果
前記実施例１で分離した高麗人参の根から排出されたエクソソーム様ベジクルを、毛嚢毛乳頭細胞（ｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌ、ｈＤＰＣ）に多様な濃度で処理して、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの毛嚢細胞増殖効果を確認した。

具体的に、毛嚢毛乳頭細胞（ｈＤＰＣｓ（ｐａｓｓａｇｅ６、７））を９６ウェルプレートで２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ２４時間培養（５％のＣＯ_２、３７℃）した後、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを濃度別（０．１～１００μｇ／ｍｌ）に処理した。次いで、４８時間培養してから培養培地を交換した後、ＭＴＴａｓｓａｙ（１００μｇ／ｗｅｌｌ、５７０ｎｍでの吸光度測定）によって増殖効果を評価した。

図３は、エクソソーム様ベジクルを低濃度の範囲（０．１～２０μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示し、図４は、エクソソーム様ベジクルを高濃度の範囲（１０～１００μｇ／ｍｌ）で処理したときの毛嚢細胞増殖結果を示す。図３及び図４中の縦軸は毛嚢細胞増殖結果（陰性対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＴＬ）に対する％）を示し、５％のＦＢＳ陽性対照群を用いて比較した。その結果、毛嚢毛乳頭細胞に高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルを処理したときに毛嚢細胞増殖効果を示すことが分かった。

試験例３．毛髪成長長さ増加効果
前記実施例１で分離した高麗人参の根から排出されたエクソソーム様ベジクルを、毛嚢器官培養（ｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅ）に多様な濃度で処理して、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルの毛髪成長長さ増加（ｈａｉｒｓｈａｆｔｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）効果を確認した。

具体的に、４３歳、６３歳の男性の後頭部の頭皮組織から毛嚢器官を一つずつ分離してＷｉｌｌｉａｍ’ｓＥ培地（Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、インシュリン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗生剤（１％）、抗真菌剤（１％）含有）に培養した。成長が起きた毛嚢組織に対して薬物を処理していないものを対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、ＭＮＸ（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）５０μＭ処理群と高麗人参主成分２０ｐｐｍ処理群を陽性対照群とした。実験群に対し、実施例１で分離した高麗人参の根から排出されたエクソソーム様ベジクル１０μｇ／ｍｌを処理した。処理から３日及び７日後にそれぞれの長さの測定及び撮像を行った。

図５及び図６は、エクソソーム様ベジクル１０μｇ／ｍｌを処理したときの毛髪長さ成長結果を示す。その結果、エクソソーム様ベジクル１０μｇ／ｍｌを処理したとき、対照群に比べて毛髪長さ成長を示しており、高麗人参由来のエクソソーム様ベジクルは毛髪成長長さ増加効果を示すことが分かった。

以下、本明細書の一側面に係る組成物の剤形例を説明するが、他の種々の剤形への応用も可能であり、これは本発明を限定するためではない単に具体的に説明するためのものに過ぎない。

［剤形例１］軟質カプセル剤
実施例１の高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル５０ｍｇ、Ｌ－カルニチン８０～１４０ｍｇ、大豆油１８０ｍｇ、パーム油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇ、及びレシチン６ｍｇを混合し、通常の方法に従って、１カプセル当たり４００ｍｇずつ充填して軟質カプセル剤を製造した。

［剤形例２］錠剤
実施例１の高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル５０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ、及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を利用して顆粒化した後、糖エステル（ｓｕｇａｒｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加して、打錠機で打錠して錠剤を製造した。

［剤形例３］顆粒剤
実施例１の高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル５０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ、及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、砲に充填して顆粒剤を製造した。

［剤形例４］ドリンク剤
実施例１の高麗人参由来のエクソソーム様ベジクル５０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて各瓶に２００ｍｌずつ充填した。瓶に充填した後、１３０℃で４～５秒間殺菌して、ドリンク剤飲料を製造した。

［剤形例５］軟膏
下記の表１に記載された組成にて通常の方法により軟膏を製造した。

［剤形例６］美容液型製剤
下記の表２に記載された組成にて通常の方法により美容液型製剤を製造した。

［剤形例７］シャンプー
下記の表３に記載された組成にて通常の方法によりシャンプーを製造した。

［剤形例８］リンス
下記表４に記載された組成にて通常の方法によりリンスを製造した。

以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好適な実施態様であるに過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらのなど価物によって定義されるといえよう。

Claims

高麗人参の根由来のナノサイズのエクソソーム様ベジクル（ｅｘｏｓｏｍｅｌｉｋｅｖｅｓｉｃｌｅ）を有効成分として含む、脱毛防止又は育毛促進用組成物。
前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の根の細胞外液に由来するエクソソーム様ベシクルである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
前記エクソソーム様ベジクルは、２０～５００ｎｍの直径を有するものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
前記エクソソーム様ベジクルは、高麗人参の根の細胞外液の１００，０００×ｇ以上の超遠心分離で沈降するものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
前記エクソソーム様ベジクルは、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）での浮遊密度が１．００～１．２０ｇ／ｍｌのものである、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
前記有効成分は、毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａｃｅｌｌｓ、ＤＰＣｓ）を活性化して毛髪成長を誘導する、請求項１に記載の脱毛防止又は育毛促進用組成物。
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
（１）高麗人参の根を搾汁して搾汁液を収得する段階；
（２）前記搾汁液を遠心分離して残滓を除去し上層液を収得する段階；及び
（３）前記上層液を超遠心分離してエクソソーム様ベジクル（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｌｉｋｅｖｅｓｉｃｌｅ）を収得する段階；を含む、方法。
前記段階（２）における遠心分離は、５００～３，０００×ｇで１０～３０分間実施する、請求項７に記載の方法。
前記段階（３）における超遠心分離は、スクロースクッション密度勾配及びイオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配を用いて超遠心分離するものである、請求項７に記載の方法。
前記段階（３）における超遠心分離は、１００，０００～２００，０００×ｇで２～６時間実施する、請求項７に記載の方法。
前記段階（３）においてエクソソーム様ベジクルは、上層液を超遠心分離した後、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）で１．００～１．２０ｇ／ｍｌの浮遊密度を有するフラクションを分離する段階を含んで収得する、請求項７に記載の方法。