JP7098325B2

JP7098325B2 - Ｃｓ１標的化キメラ抗原レセプター改変ｔ細胞

Info

Publication number: JP7098325B2
Application number: JP2017529682A
Authority: JP
Inventors: ジェイフォーマン，スティーブン; ワン，シウリー
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2022-07-11
Anticipated expiration: 2035-12-07
Also published as: US20240009288A1; JP2017537627A; IL280917A; AU2015357485A1; BR112017011893A2; IL290459B2; US10821161B2; RU2017121826A3; US12497440B2; AU2015357485B2; IL252645B; JP2022051744A; IL252645A0; AU2021200122A1; CN107429253A; MX2017007250A; US20170360910A1; RU2727451C2; IL280917B; WO2016090369A1

Description

関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、「多発性骨髄腫を治療するためのセントラルメモリー由来ＣＳ１キメラ抗原レセプター改変Ｔ細胞の使用」と題された２０１４年１２月５日に出願された米国非仮出願第６２／０８８，４２３号の利益を主張し、その全体が本明細書に組み込まれる。

操作されたＴ細胞を用いる治療を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療のために研究されている。ある場合には、このような療法において使用されるＴ細胞は、十分に長い期間、in vivoで活性を維持しない。ある場合には、Ｔ細胞の抗腫瘍活性は比較的低い。従って、より長期の抗腫瘍機能を有する腫瘍特異的癌治療のための当該技術分野における必要性が存在する。

ＣＡＲＴ細胞は、ＭＨＣ非依存的なやり方で抗原特異的腫瘍集団を特異的に認識するように操作することができるので、キメラ抗原レセプター（chimeric antigen receptor,ＣＡＲ）により操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（adoptive T cell therapy,ＡＣＴ）は、様々な癌の再発率を低減するための安全かつ有効な方法を提供し得る。

多発性骨髄腫（multiple myeloma,ＭＭ）は、形質細胞のクローン増殖を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍(malignancy)である。ＭＭは、全癌の約１％、及び米国における血液悪性腫瘍の１０％強を占めている。米国だけでも、今年、約２万例の新たな症例が診断され、且つ、１１，０００人以上がこの疾患で死亡する。ＭＭの現在の治療法はしばしば寛解を誘導するが、ほぼすべての患者は最終的に再発して死亡する。

ＣＳ１は、正常な形質細胞及びＭＭ細胞上で高度に且つ選択的に発現されるシグナル伝達リンパ球活性化分子（signaling lymphocyte activation molecule,ＳＬＡＭ）レセプターファミリーの細胞表面糖タンパク質であり、ＮＫ細胞上の発現が低く、且つ、正常組織上での発現がほとんど又は全くない。エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂｃ）（ＨｕＬｕｃ６３）は、再発したＭＭ患者のボルテゾミブと共に投与されたヒト化(humanized)ＣＳ１モノクローナル抗体で、患者の４８％において≧ＰＲを生じる。ＭＭ細胞上でのＣＳ１の高発現は、正常組織における形質細胞へのその制限と相まって、ＣＳ１をＣＡＲＴ細胞療法の合理的な標的とする（Ｈｓｉｅｔａｌ．２００８ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１４：２７７５）。

概要
本明細書には、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが記載される。細胞外ドメインは、ＣＳ１特異的ｓｃＦｖ領域又はその変異体(variant)、及び任意に、例えばヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーを含む。細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面上に発現されたときにＣＡＲがＴ細胞活性を、ＭＭの表面上に発現されるレセプターであるＣＳ１を発現する細胞に向けることを可能にする。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体（ＣＤ３ζ）のゼータ（ζ）鎖由来のシグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激(costimulatory)ドメイン、例えば、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。細胞内領域にＣＤ３ζと直列の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインなどの共刺激ドメインを含めることにより、Ｔ細胞は共刺激シグナルを受け取ることができる。Ｔ細胞、例えば患者特異的な自己(autologous)Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するように操作することができ、且つ、操作された細胞を増殖して(expanded)、ＡＣＴで使用することができる。アルファベータ（αβ）Ｔ細胞及びガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞の両方を含む様々なＴ細胞サブセットを使用することができる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの他の免疫細胞において発現され得る。患者が、本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞で処置される場合、細胞は、自己Ｔ細胞又は同種異系(allogenic,アロジェニック)Ｔ細胞であり得る。場合によっては、使用される細胞は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（central memory T cells,Ｔ_ＣＭ）の両方を含む細胞集団であって、これらはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、及びＣＤ４５ＲＡ－である。細胞集団は他のタイプのＴ細胞も同様に含むことができる。

本明細書に記載のＣＳ１ＣＡＲは、ある有益な特徴、例えば養子移入後の持続性及び増強された抗腫瘍活性を有する。

ＣＳ１を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＭＭなどの癌、並びにＣＳ１を発現する他の癌、の治療に有用であり得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いてＣＳ１発現癌を治療するための方法を含む。

本明細書に記載されるのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であって、当該核酸分子は、
ＣＳ１ｓｃＦｖ（例えば、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＤＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１）又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその改変体；
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその改変体）；又は、
４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体；又は、
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその改変体、及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体の両方；並びに、
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体；
を含む。

本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲのうちの１つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを発現する単離されたＴ細胞、である。

本明細書に記載されるのは、キメラ抗原レセプターをコードする核酸分子であって、キメラ抗原レセプターが：
ＣＳ１ｓｃＦｖ；
スペーサ領域；
ＣＤ２８もしくはＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４－ＩＢＢ共刺激ドメイン、任意のＧｌｙＧｌｙＧｌｙリンカー、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む。

一実施形態では、ＣＳ１ＣＡＲは、配列番号３１，３４，３７，４０，４３、及び４６のいずれかのアミノ酸配列（シグナル配列を欠く成熟ＣＡＲ）からなるかもしくはそれを含むか、又はＣＳ１ＣＡＲは、配列番号３０，３３，３６，３９，４２、および４５のいずれかのアミノ酸配列（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を有する未成熟ＣＡＲ）からなるか、もしくはそれを含む。ＣＡＲは(The CAR and)、シグナル配列、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦレセプターアルファシグナル配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ；ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）を含む形態で発現され得る。ＣＡＲは、例えばＴ２Ａスキップ配列及び短縮型(truncated)ＥＧＦＲｔなど、発現をモニタリングするために有用なさらなる配列で発現され得る。したがって、ＣＡＲは、配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり得るか、又は、配列番号２９～４６のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり得る。ＣＡＲは、１，２，３，４又は５までのアミノ酸変化(changes)（好ましくは、保存的(conservative)アミノ酸変化）を有する配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり得る。

本明細書に記載のＣＳ１キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団もまた開示される（例えば、ＣＡＲは、配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列、配列番号２９～４６のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、又は１，２，３，４又は５までのアミノ酸変化(changes)（好ましくは、保存的(conservative)アミノ酸変化）を有する配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列、を含むかもしくはそれからなる）。

様々な実施形態において、：ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（central memory T cells,Ｔｃｍ）、例えば、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔｃｍである。

「アミノ酸改変(modification)」は、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を指す。「アミノ酸置換」又は「置換」は、親(parent)ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することを指す。非保存的な(non-conservative)やり方で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、別のグループに属するアミノ酸へのコドンをへんかさせることによる）、又は保存的なやり方で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸へのコドンを変化させることによる）、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるために、置換を行うことができる。このような保存的変化は、一般に、得られるタンパク質の構造及び機能の変化をより少なくする。以下は、アミノ酸の様々なグループの例である：
１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；
３）荷電した極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電した）：アスパラギン酸、グルタミン酸；
４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。
別のグループは、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。

ＣＳ１ＳｃＦｖドメイン
ＣＳ１ＳｃＦｖドメインは、ＣＳ１に結合するいずれのＳｃＦｖであり得る。ある場合には、ＣＳ１ＳｃＦｖドメインは、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含む。ある場合には、ＣＳ１ｓｃＦｖは、配列番号１と比較して１，２，３，４もしくは５のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。ＳｃＦｖはヒト化ＳｃＦｖであり得る。

スペーサー地域
本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＳ１標的ドメイン（すなわち、ＣＳ１ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含むことができる。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ(hinge)部分、又はＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。

表１：スペーサの例

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域の全部又は一部、すなわち免疫グロブリンのＣＨ1ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入る配列、例えばＩｇＧ４Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジを含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリン由来配列は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、１，２，３，４又は５の置換、例えば、オフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。

特定の実施形態では、スペーサーは、改変されていないヒンジに存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１以上のアミノ酸残基を含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するヒンジ／リンカー(linger)である。１以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３５，２３４，２３７，２３８，２３９，２４３，２４７，２６７，２６８，２８０，２９０，２９２，２９７，２９８，２９９，３００，３０５，３０９，２１８，３２６，３３０，３３１，３３２，３３３，３３４，３３６，３３９における１以上のアミノ酸残基、又はそれらの組み合わせから選択されるが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ヒンジ／リンカー(liker)の改変ヒンジは、以下のアミノ酸残基置換の１以上を含むが、それらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。：
Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又はそれらの組み合わせ。

いくつかの実施形態では、改変ヒンジは、配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３領域、又は配列番号１０もしくは１１に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列に由来する。

特定の実施形態では、改変ヒンジは、改変されていないヒンジに存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４に由来する。１以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９、又はそれらの組み合わせにおける１以上のアミノ酸残基から選択されるが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態では、改変ヒンジは、以下のアミノ酸残基置換のうちの１つ以上を含むが、それらに限定されないＩｇＧ４に由来する。：
２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ、又はそれらの組み合わせ。ここで、改変されていないヒンジにおけるアミノ酸は、示された位置で上記の同定されたアミノ酸で置換される。一例において、当該配列は、以下のアミノ酸変化Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを含む。

本明細書で論じる免疫グロブリン中のアミノ酸位置については、ナンバリング(numbering)は、ＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームによる。（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．１９９１ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、本明細書にその全体が参考として援用される）。ＥＵインデックス、又はＫａｂａｔもしくはＥＵナンバリングスキームにおけるＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の番号付け(numbering)を指す（Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．１９６９ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６３：７８－８５）。

ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）を有するＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。

ヒンジ／リンカー(linger)領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４ＣＨ３配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含むことができる。したがって、リンカー／スペーサー領域全体は、以下の配列を含むことができる：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）。いくつかの場合において、スペーサーは、配列番号１１と比較して１，２，３，４又は５個の単一アミノ酸変化（例えば、保存的変化）を有する。いくつかの場合には、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）による結合を低下させるやり方で、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）において突然変異している。

膜貫通領域
様々な膜貫通ドメインが、本明細書中で使用され得る。表２は、適切な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通領域はスペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。

表２：膜貫通ドメインの例

共刺激ドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの使用に適したいずれのドメインであり得る。ＲＳＫＲＳＲＧＧＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２３；ＬＬからＧＧへのアミノ酸変化に二重下線）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含むＣＤ２８共刺激ドメインである。いくつかの場合において、ＣＤ２８共シグナル伝達(co-signaling)ドメインは、配列番号２３と比べて１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変化を有する（好ましくは保存的であり、且つ、好ましくは下線を引かれたＧＧ配列においてはない(not)）。いくつかの場合においては、共シグナル伝達ドメインは、
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２４）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含む４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。いくつかの場合においては、４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して１，２，３，４もしくは５個のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。

共刺激ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適切な共刺激ドメインの例を含む。

表３：ＣＤ３ζドメイン及び共刺激ドメインの例

種々の実施形態において、：共刺激ドメインは、
表３に示される共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、
からなる群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体が存在する。いくつかの実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８共刺激ドメイン１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体、が存在する。様々な実施形態では、１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変が置換である。共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対するアミノ末端であり、且つ、いくつかの場合、２～１０、例えば３アミノ酸（例えば、ＧＧＧ）からなる短いリンカーは、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。

ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの使用に適したいずれのドメインであり得る。いくつかの場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含む。いくつかの場合、ＣＤ３ζシグナル伝達(signaling)は、配列番号２１と比較して１，２，３，４もしくは５のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。

短縮型(truncated)ＥＧＦＲ
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）、及び
ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を有する短縮型ＥＧＦＲが続いてもよい。いくつかの場合、短縮型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して１，２，３，４もしくは５のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。

ＣＳ１ＣＡＲ
ＣＳ１ＣＡＲは、図２、図６、図７、図８、図９もしくは図１０に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含むことができる（配列番号２９～４６；ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含むか又は除外するかのいずれかであり、且つ、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び短縮型ＥＧＦＲｔを含むか又は除外するかのいずれかである）。

本明細書に記載のＣＡＲ標的化ＣＳ１の中には、スペーサー領域、膜貫通ドメイン及び各ＣＡＲの共刺激ドメイン（複数可）が示されている表４にまとめたものがある。

表４：ＣＡＲ標的化ＣＳ１の例

＊ＳＥＱＩＤＮＯ：ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを含めて描かれた配列全体／／ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含むが、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを除く配列／／ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを除く配列のための配列
についての配列番号。

図面の説明
図１は、ＣＳ１ＣＡＲ発現レンチウイルスベクター（ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７）の模式図である。ＣＳ１ＣＡＲ構築物は、ＧＭＣＳＦシグナル配列、ＣＳ１ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、リンカー、ＣＨ３ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ構築物に続いて、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及び次いで自殺遺伝子ＥＧＦＲｔコード配列が続く。ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ分子は、単一の転写産物(transcript)から発現される。図２は、シグナルペプチド、リボソームスキップ配列及びＥＧＦＲｔを含むＣＳ１ＣＡＲのアミノ酸配列を示す（配列番号２９）。図３は、ＣＳ１ＣＡＲリダイレクトされた(re-directed)ＴｃｍがＭＭ細胞に対して細胞傷害性を示したことを示す研究の結果を示す一対のグラフである。増殖した(propagated)ＣＳ１ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を、^５１Ｃｒ標識標的細胞との共培養後、４時間の^５１Ｃｒリリースアッセイを用いて評価した。ＯＫＴ３発現ＬＣＬはすべてのＴＣＲに関与したので、それらを陽性対照として使用し、且つ、ＣＳ１陰性ＡＭＬ細胞（ＫＧ１ａ）は陰性対照として使用した。ＣＳ１ＣＡＲ、但し未処理(un-engineered)モック(mock)Ｔ細胞は、ＭＭ細胞に対して特異的な細胞毒性を示した。図４は、ＣＳ１ＣＡＲリダイレクトされたＴｃｍ細胞がＭＭ細胞の刺激に応答してエフェクター機能を示したことを示す研究の結果を示す。ＣＳ１ＣＡＲＴ細胞（１０^５）を、刺激剤としてＭＭ．１Ｓ細胞の１０^５と共に９６ウェル組織培養プレート中で６時間共培養した。１０７ａ脱顆粒及び細胞内ＩＦＮガンマ産生を、フローサイトメトリーで分析した。Ｅｒｂｉｔｕｍによって同定されたＣＡＲＴ細胞の大部分は、ＭＭ細胞との関与の後に脱顆粒するように誘導され、且つ、抗原刺激に応答してＩＦＮガンマ陽性細胞が検出された。図５は、ＣＳ１ＣＡＲリダイレクトされたＴｃｍ細胞がin vivoで多発性骨髄腫を根絶することを示す研究の結果を示す。ＭＭ．１Ｓ細胞を発現するおよそ２×１０^６個のホタルルシフェラーゼが、脛骨内注射によってＮＳＧマウスに接種された。腫瘍接種の７日後、１×１０^６ＣＳ－１ＣＡＲＴ細胞を静脈内注射によって腫瘍を有するマウスに注入した。腫瘍の負担は、１週間に１回、Ｘｅｎｏｇｅｎ（登録商標）イメージングでモニターした。未処理細胞を受けたマウスを対照(control)として使用した。ＣＳ１ＣＡＲＴ細胞は、Ｔ細胞注入の１４日後にＭＭ腫瘍を完全に根絶したが、未処理Ｔ細胞は腫瘍阻害に効果がない。図６は、ＣＳｌｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号３２）。図７は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号３５）。図８は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号３８）。図９は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号４１）。図１０は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号４４）。図１１は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の完全なヌクレオチド配列である（配列番号４７）。図１２は、ＣＳ１ＣＡＲリダイレクトされたＴｃｍ細胞がｉｎｖｉｖｏで多発性骨髄腫を根絶することを示す研究の結果を示す。２×１０^６ＧＦＰｆｆｌｕｃ＋ＭＭ．１Ｓ細胞を、－７日目にＮＳＧマウスに脛骨内注射により接種した。１×１０^６のセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）由来のＣＳ１ＣＡＲ＋Ｔ細胞を０日目に腫瘍を有するマウスに静脈内注入した。同じドナーからＴ細胞又は非形質導入Ｔｃｍを受けなかったマウスを、ネガティブコントロールとして使用した。腫瘍シグナルは、生体光イメージングによってモニターした。複数のマウスからのフォントン(phonton)／秒の平均±ＳＥＭが示されている。ＣＡＲは図２（ＣＨ２ＣＤ２８）；図６（ＣＨ２４ＩＢＢ）；図８（ＥＱＣＤ２８）；図７（ＥＱ４ＩＢＢ）；図１０（ＬＣＤ２８）及び図９（ＬＣＤ４ＩＢＢ）；のものであった。

詳細な説明
いくつかのＣＳ１特異的キメラ抗原レセプター（chimeric antigen receptors,「ＣＡＲ」）の構造、構築及び特徴付けについて以下に記載する。ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを収容する(contains)組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されないが、いずれのレセプターに特異的に結合し得るいずれの分子に限定される。したがって、「抗原」は、ＣＡＲの認識ドメインを指す。細胞外認識ドメインは（単に細胞外ドメインとも呼ばれ、又は単にそれが含有する認識要素により）、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は膜中のＣＡＲを固定する(anchors)。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、且つ、任意には１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣ制限とは無関係に、抗原に結合し、且つ、Ｔ細胞活性化を形質導入（transduce)ことができる。従って、ＣＡＲは、それらのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者集団を治療することができる「普遍的な(universal)」免疫レセプターである。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いる養子免疫療法は、癌の治療のための強力な治療戦略であり得る。

場合によっては、ＣＳ１ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び細胞質シグナル伝達尾部を欠く短縮型(truncated)ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いて作製することができる。この配置において、ＥＧＦＲｔの同時発現は、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にする、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供し、且つ、遺伝子改変細胞のポジティブな選択、並びに、養子移植後のin vivoでの治療用Ｔ細胞の効率的な細胞追跡を可能にする。サイトカインストーム及び標的外の(off-target)毒性を避けるために増殖を効率的に制御することは、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＣＳ１ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、治療関連の毒性の場合にＣＡＲ＋Ｔ細胞を切除するための自殺遺伝子として作用することができる。

本明細書に記載のＣＡＲは、当技術分野で公知の任意の手段によって製造することができるが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造される。キメラレセプターのいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、重複ＰＣＲ、プライマーアシストライゲーション、部位特異的変異誘発など）によって完全なコード配列に調製し、組み立てることができ、便利である。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、且つ、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、及び最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株、を形質転換するために使用される。

患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現のためのベクターで形質導入され得る。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望のレセプターを発現する細胞を免疫学的に選択するために、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells,ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞が富化された細胞は、例えば、ＣＳ１ＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクター、ならびにin vivo検出、アブレーション、及び潜在的な生体外(ex vivo)選択のための非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができる。活性化／遺伝子改変されたＣＳ１セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５でin vitroで増殖され、及び次いで凍結保存され得る。

実施例１：ＣＳ１特異的ＣＡＲの発現に使用されるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、ＣＳ１ＣＡＲを発現する臨床ベクターを誘導することができる親プラスミドである。ＣＡＲの発現に使用したｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された（Ｗａｎｇｅｔａｌ．２０１１Ｂｌｏｏｄ１１８：１２５５）。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦ１プロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’及び３’配列の両方は、以前にＨＸＢｃ２プロウイルス由来のｐｖ６５３ＲＳＮに由来した。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨＡＩＤＳＲｅａｇｅｎｔＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ－１株ｐＮＬ４－３由来であった。

ｐＨＩＶ７の構築は以下のように行った。簡潔には、介在ＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を有するｇａｇ－ｐｏｌプラス５’及び３’末端反復配列（long-terminal repeats,ＬＴＲ）からの６５３ｂｐを含むｐｖ６５３ＲＳＮを以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。ステップ１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ応答配列(rev-responsive element)（ＲＲＥ）まで配列は、ｐ５’ＨＩＶ－１５１を作製し、及び次いで５’ＬＴＲをＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することにより改変し、及び最初にＣＭＶエンハンサーに連結し、及び次に複製（ｐ５’ＨＩＶ－２）のＳＶ４０起点に連結した。ステップ２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行い、ＨＩＶＵ３中のｃｉｓ調節エレメントを除去し、且つ、ｐ３’ＨＩＶ－２を形成した。ステップ３では、ｐ５’ＨＩＶ－３及びｐ３’ＨＩＶ－２から単離した断片をライゲーションしてｐＨＩＶ－３を作製した。ステップ４では、ｐ３’ＨＩＶ－２は、追加の上流のＨＩＶ配列を除去してｐ３’ＨＩＶ－３を生成することによりさらに改変し、且つ、ＷＰＲＥを含有する６００ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳａｌＩフラグメントをｐ３’ＨＩＶ－３に加えてｐ３’ＨＩＶ－４を作製した。ステップ５では、ｐＨＩＶ－３ＲＲＥをＰＣＲによりサイズを減少させ、且つ、ｐＨＩＶ－３（図示せず）由来の５’断片に、及びｐ３’ＨＩＶ－４に連結して、ｐＨＩＶ－６を作製した。ステップ６では、ＨＩＶ－１ｐＮＬ４－３（５５）由来のｃＰＰＴＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４－３から増幅し、且つ、ｐＨＩＶ６におけるＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列との間に配置してｐＨＩＶ－７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７－ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４－プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。

ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナルｐｓｉΨが必要である。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証されている。

ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能は、３つの別個のプラスミドに分割され、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させる：
１）ｐＣｇｐはウイルスベクター構築(assembly)に必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする。；
２）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする。；及び
３）ｐＣＭＶ－Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性－口内炎ウイルス（vesiculo-stomatitis virus,ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。

ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、
ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；
３種全てのヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び
ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列；
を含む。多数の組換え事象(events)を必要とするので、これらの領域の相同性のために複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は非常に低い。さらに、得られたいずれの組換え体は、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列を欠いているであろう。

ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）に置き換え、且つ、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有し、且つ、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入した。

野生型ウイルスの病原性に必要であり、且つ、標的細胞の生産的感染に必要とされるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。さらに、ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物はインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含有しないため、結果として生じる標的細胞中の発現された、且つ、逆転写ＤＮＡプロウイルスゲノムは不活性なＬＴＲを有するであろう。この設計の結果、ＨＩＶ－Ｉ由来配列はプロウイルスから転写されず、且つ、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されるであろう。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させることが期待される。表５は、ｅｐＨＩＶ７に存在する種々のレギュレーター要素をまとめたものである。

図１は、ＣＳ１ＣＡＲ（ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７）ＣＳ１ｓｃＦｖ、ＣＳ１ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、リンカー、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、からなるＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスベクター、の模式的な描写である。ＣＡＲ構築物に続いて、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及び次いで自殺遺伝子ＥＧＦＲｔコード配列が続く。ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ分子は、単一の転写産物から発現される。ベクターの全ヌクレオチド配列を図１１に示し、且つ、表５はベクターの種々の要素の位置を示す。

表５：ＣＳ１ＣＡＲ＿ｅｐＨＩＶ７の機能要素

実施例２：患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターの作製
各プラスミド（ＣＳ１ＣＡＲ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＣｇｐ；ｐＣＭＶ－Ｇ；及びｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２）について、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽に接種するために使用されるシードバンクが生成される。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの産生に使用する前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。

簡単に説明すると、細胞は、無菌性及びウイルス汚染の存在を確認するために試験された２９３Ｔ作業(working)細胞（ＷＣＢ）から増殖される。２９３ＴＷＣＢからの２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍する。十分な数の細胞が存在して、ベクター産生及び細胞培養の維持(cell train maintenance)のために適切な数の１０層細胞工場（cell factroies,ＣＦｓ）をプレートするまで、細胞を増殖(grown)及び拡大する(expanded)。単一の細胞列を生産に使用することができる。

レンチウイルスベクターは、１０ＣＦまでのサブバッチで産生された。同じ週に２つのサブバッチを産生しすることができ、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週になる。１つのロットの製品を製造するために、すべてのサブバッチから製造された材料を下流の処理段階でプールした。２９３Ｔ細胞を２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中でＣＦ中に播種した(plated)。ファクトリーを３７℃のインキュベーターに置き、且つ、ＣＦのすべての層上に細胞の均一な分布を得るために水平に平らにした(leveled)。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２ＭＣａＣｌ_２、２ＸＨＢＳ及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＯ_４法を用いて、上記の４つのレンチウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清を回収し、精製し、濃縮した。上清をＣＦから除去した後、各ＣＦから最終生産細胞(End-of-Production Cells)を回収した。各工場から細胞をトリプシン処理し、遠心分離により収集した。細胞を凍結培地に再懸濁し、及び凍結保存した。これらの細胞は、その後、複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）試験に使用された。

ベクターを精製及び製剤化する(formulate)ために、細胞の破片（debris）
を除去するために膜濾過によって粗製上清を清澄化した。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））によって分解された。ウイルス上清を０．４５μｍのフィルターを用いて細胞破片を清澄化した。清澄化された上清を予め秤量した容器に採取し、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を加えた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間行った。エンドヌクレアーゼ処理した上清の初期接線流限外濾過（tangential flow ultrafiltration,ＴＦＦ）濃度を用いて、粗上清から残留低分子量成分を除去し、ウイルスを約２０倍濃縮した。浄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清を、５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有する中空繊維カートリッジに、流速を最大にしながら、剪断速度を約４，０００秒^－１以下に維持するように設計された流速で循環させた。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始された。ダイアフィルトレーション緩衝液としてＰＢＳ中に４％ラクトースを使用して、８０％透過物置換率を確立した。ウイルス上清を標的体積に持ってきて、２０倍濃度の粗上清を示し、且つ、透析液交換率を１００％として４回の追加交換容量でダイアフィルトレーションを続けた。

ウイルス産物のさらなる濃縮は、高速遠心分離技術を用いて達成された。レンチウイルスの各サブバッチを、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ－２６プラス６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）で、６℃、１６～２０時間遠心分離してペレット化した。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットをＰＢＳ中の４％ラクトースを含む５０ｍＬ容量で再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤(formulation)を表す。ベクター濃縮プロセス全体は約２００倍の体積減少をもたらした。全ての部分バッチの完了後、材料を次に－８０℃に置き、その間、各部分バッチからの試料を無菌性について試験した。サンプルの無菌性を確認した後、サブバッチを頻繁に攪拌しながら３７℃で急速に解凍した。次いで、この物質をプールし、且つ、ウイルスベクタースイート(suite)のクラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティキャビネット内に手でアリコートした。滅菌ＵＳＰクラス６、雄ネジ(externally threaded)Ｏリングクリオバイアル中の濃縮レンチウイルス１ｍＬの充填構成を使用した。ＣＯＨにおける応用技術開発センター（ＣＡＴＤ）の品質システム（ＱＳ）は、ＣＢＧのためのポリシーと標準的な運用手順に従って、そして現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス（current Good Manufacturing Practics,ｃＧＭＰｓ）に準拠してすべての材料をリリースした。

レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残留宿主ＤＮＡ混入物、及び残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験する。他の試験の中でも、正確なベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ－ＰＣＲによってベクター同一性を評価する。すべての放出基準は、本研究での使用を意図したベクターについて満たされている。

実施例３：ＡＣＴでの使用に適したＴｃｍ細胞の調製
Ｔリンパ球は、白血球フェレーシス（leukopheresis）によって患者から得られ、且つ、適切な同種異系又は自己Ｔ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）は、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変され、次いで、抗癌治療を達成するために、臨床上許容される手段を提供する。

ＣＤ８＋であるＴｃｍは、Ｗａｎｇｅｔａｌに記載されるように本質的に単離される（ＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３５：６８９，２０１２）。簡潔には、白血球フェレーシスの当日に、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅによる密度勾配遠心分離により単離し、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡで２回洗浄した。次いで、ＰＢＭＣをＰＢＳ中で１回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＸＶｉｖｏ１５培地に再懸濁し、３００ｃｃのトランスファーバッグに移し、室温（ＲＴ）で一晩３－Ｄローテーター上に保存した。翌日、臨床グレードの抗ＣＤ４（２．５ｍＬ）、抗ＣＤ１４（１．２５ｍＬ）、及び抗ＣＤ４５ＲＡ（２．５ｍＬ）マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を含む３００ｃｃトランスファーバッグ中で、５×１０^９ＰＢＭＣをインキュベートした１０％ＦＣＳを含有するＸＶｉｖｏ１５を、３０分間ＲＴでインキュベートした。ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、製造業者の指示（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）枯渇様式を用いて直ちに枯渇させた。遠心分離後、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に細胞の非標識陰性画分を再懸濁し、且つ、臨床グレードビオチン化ＤＲＥＧ５６ｍＡｂ（ＣＯＨＮＭＣＣＢＧ）で０．１ｍｇ／１０６細胞を室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．５％ＨＳＡを含有する１００ｍＬのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡの最終容量に再懸濁し、新しい３００ｃｃのトランスファーバッグに移した。１．２５ｍＬの抗ビオチンマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）との３０分間のインキュベーション後、ＰＢＭＣ（ＣＤ８＋ＴＣＭ）のＣＤ６２Ｌ＋画分をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）でのポジティブ選択により製造業者の説明書に従って精製し、且つ、１０％ＦＣＳを含むＸＶｉｖｏ１５に再懸濁した。

ＣＤ８＋／ＣＤ４＋であるＴｃｍは、ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋選択をＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋選択に改変することによって、上記プロセスの改変を用いて調製される。この方法は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）デバイス上の２段階プロセスを使用して、まずＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させ、次いでＣＤ６２Ｌ＋細胞を陽性選択する。この改変されたプラットフォームは、単一の白血球フェレーシスから５０×１０^６バルクＴｃｍを生成する。

富化後、Ｔｃｍ細胞を、完全なＸ－Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５中に配合し、且つ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）細胞培養バッグに移し、ＤｙｎａｌＣｌｉｎＥｘ（登録商標）ＶｉｖｏＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。刺激後５日目まで、細胞を約３の感染多重度（multiplicity of infection,ＭＯＩ）でＣＳ１ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。細胞増殖に必要とされる完全なＸ－Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ－２及び」ＩＬ－１５サイトカインの添加により、培養物を最大４２日間維持する（３×１０^５～２×１０^６生存細胞／ｍＬ、及び培養の月曜日、水曜日及び金曜日ごとにサイトカイン補充の間の細胞密度を維持するため）。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０^９細胞に拡大する。培養期間の終わりに、細胞を採取し、２回洗浄し、且つ、臨床グレードの凍結保存培地中で処方する。

Ｔ細胞注入の日（複数可）に、低温保存及び放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために調合する(formulated)。放出された細胞産物を含む凍結保存バイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、且つ、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、且つ、細胞を保存料なし遊離生理食塩水（Preservative-Free Normal Saline,ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液に再懸濁する。サンプルは品質管理テストのために削除される。

実施例４：ＣＳ１ＣＡＲ（ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ）のアミノ酸配列
ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの完全アミノ酸配列を図２に示す。全配列（配列番号２９）は、
２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（配列番号２６）、ＣＳ１ｓｃＦｖ配列（配列番号１）；
ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号３；斜線で示すアミノ酸置換Ｓ～Ｐを有する）；
１０アミノ酸のリンカー（配列番号２）；
ＩｇＧ４ＣＨ３配列（配列番号１２）；
２８アミノ酸のＣＤ２８膜貫通ドメイン配列（配列番号１４）；
ＣＤ２８ｇｇ共刺激ドメイン配列（配列番号２３；ＬＬ to ＧＧアミノ酸の変化が強調表示されている）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（配列番号２１）；
２４アミノ酸のＴ２Ａスキップ配列（配列番号２７）；及び
ＥＧＦＲｔ配列（配列番号２８）；
を含む。

実施例５：ＣＳ１ＣＡＲの活性
図２に示すＣＡＲを発現する増殖したＣＳ１ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を、^５１Ｃｒ標識ＭＭ細胞（ＭＭ．１Ｓ）との共培養後の４時間^５１Ｃｒリリースアッセイを用いて評価した。図３に示すように、操作されたＣＳ１ＣＡＲＴ細胞は、ＭＭ細胞の特異的かつ効率的な死滅を示し、非形質導入のモック(mock)Ｔ細胞は、ＭＭ細胞に対して細胞毒性を示さない。ＭＭ細胞と共培養した場合、図４に示すように、１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮガンマによって示されるように操作されたＣＳ１ＣＡＲＴｃｍ媒介性強力エフェクター機能を有する。ＮＳＧマウスを有するＭＭ腫瘍に養子移入されたとき、ＣＳ１特異的Ｔ細胞は、図５に示すように効率的な抗腫瘍活性を示した。

追加のＣＳ１ＣＡＲ（図２及び図６～１０）を用いた別の研究では、２×１０^６個のＧＦＰｆｆｌｕｃ＋ＭＭ．１Ｓ細胞を、－７日目にＮＳＧマウスに脛骨内注射によって接種した。１×１０^６のセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）由来のＣＳ１ＣＡＲ＋Ｔ細胞を０日目に腫瘍を有するマウスに静脈内注入した。同じドナーからＴ細胞又は非形質導入Ｔｃｍを受けなかったマウスは、ネガティブコントロールとして使用した。腫瘍シグナルは、生体光イメージングによってモニターした。複数のマウスからのフォントン(phonton)／秒の平均±ＳＥＭが示されている。この分析の結果を図１２に示す。

Claims

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子であって、前記アミノ酸配列は、配列番号３２、３３、及び３４で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される１のアミノ酸配列であり、かつ、前記キメラ抗原受容体は、抗腫瘍活性を有する、核酸分子。
配列番号３２、３３、及び３４で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団。
がんの治療方法に用いる、請求項２に記載のヒトＴ細胞の集団を含む医薬組成物。
ヒトＴ細胞の集団が、自己由来である、請求項３に記載の医薬組成物。
ヒトＴ細胞の集団が、同種異系である、請求項３に記載の医薬組成物。
がんが、多発性骨髄腫である、請求項３～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。