JP7061235B2

JP7061235B2 - 抗ｃｌｄ１８ａ２ナノ抗体及びその応用

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Publication number: JP7061235B2
Application number: JP2021540850A
Authority: JP
Inventors: 高鋒姚; 亜麗陸; 振興周; 芸琳方; 麗▲ナ▼ 朱; 常魁黎; 宏塔章; 暁芳温; 佳里董; 岩山黄
Original assignee: 浙江道尓生物科技有限公司
Priority date: 2019-01-15
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2022-04-27
Anticipated expiration: 2039-12-06
Also published as: CN111434692A; CN116333141A; CN113817061A; AU2019422629A1; CN116333141B; WO2020147451A1; US11560427B2; EP3913001A9; AU2019422629B2; EP3913001B1; CN114106183A; CN111434692B; EP3913001C0; EP3913001A1; US20220259303A1; CN114106183B; JP2022516809A; EP3913001A4; ES2991026T3; CN113817061B

Description

本発明は、生物学分野に関し、特に、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体及びその応用に関する。

クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ１８，ＣＬＤ１８）は、上皮や内皮のタイトジャンクション中に位置する分子量約２８ｋＤの膜貫通型タンパク質であって、隣り合う細胞間を密着結合するものである。正常な上皮組織の場合には、細胞同士の隙間が密着しているため、細胞表面のクローディンへの接触は難しい。しかし、腫瘍細胞の場合には隙間が比較的大きいため、腫瘍細胞上のクローディンが細胞外抗体や免疫療法における潜在的な標的となる。ＣＬＤ１８は４つの疎水性領域を有しており、これらが膜貫通領域として２つの細胞外ドメインを形成している。そのうち、疎水性領域１と疎水性領域２は細胞外ドメイン１を囲繞形成しており、疎水性領域３と疎水性領域４は細胞外ドメイン２を囲繞形成している。また、遺伝子の違いに基づくスプライシングによって、ＣＬＤ１８は、ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２という２種類の切断産物を形成する。ＣＬＤ１８Ａ１は、正常な肺及び胃の上皮に選択的に発現するが、ＣＬＤ１８Ａ２は胃細胞のみに発現する。更に重要な点として、ＣＬＤ１８Ａ２は、分化した胃上皮の短命細胞にのみ存在し、胃の幹細胞には存在しない（非特許文献１）。これらの特性は、ＣＬＤ１８Ａ２が、胃癌及びその他のＣＬＤ１８Ａ２陽性腫瘍の治療に用いられる臨床価値を有する治療標的であることを示している。

モノクローナル抗体は、癌の検出及び生物学的分子標的治療への応用に成功しており、腫瘍治療に変革をもたらしている。しかし、従来のモノクローナル抗体（約１５０ｋＤ）は分子量が大きすぎ、組織を貫通しにくいことから、腫瘍領域における有効濃度が低くなり、治療効果が不十分である。また、従来の抗体は高い免疫原性を有しており、変性した抗体は元の親和性を発揮することが大変難しい。このほか、完全にヒト化する従来の抗体は、開発サイクルの長さ、生産コストの高騰、安定性の不足といった様々な要因から、臨床における応用及び普及が制限されている。これに対し、その後登場したナノ抗体は、大人のラクダ体内の重鎖抗体に由来する最小の機能的抗原結合性フラグメントを有しており、高い安定性と、抗原結合における高い親和性を備えている。通常の抗体と比較して、ナノ抗体は以下のような多くの固有の性質を有している。

１）ナノ抗体のコード配列は、ヒトＶＨファミリー３及び４との相同性が高いため、免疫原性が弱い。

２）ナノ抗体は、分子量がわずか１５ｋＤａ程度と小さく、構造がシンプルである。そのため、微生物中で大量に発現させやすく、精製が容易である。

３）ナノ抗体は大量のエピトープを識別可能であり、分子の隙間に隠れたエピトープであっても識別することができる。

４）ナノ抗体は分子量が小さいため、組織を貫通しやすく、通常の抗体では到達しにくい部位にも到達する。

５）ナノ抗体は、変性又は高温環境下において高い可溶性と安定性を有する。

ナノ抗体は、固有の性質とコストの低さから応用範囲が広く拡大している。そのため、ナノ抗体は、疾病の治療及び診断面で大きな価値を有しており、抗体による腫瘍の標的診断
及び治療においても大きく発展する可能性がある。

ところが、現在のところ、ＣＬＤ１８Ａ２エピトープを標的とする特異性ナノ抗体は存在しない。よって、ＣＬＤ１８Ａ２に対し有効な新たな特異性ナノ抗体を開発することには重要な価値がある。

ＮｉｉｍｉＴ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｌ．２００１；２１（２１）：７３８０－７３９０．

上記で述べた従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の課題を解決するために、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体を提供することである。

上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体を提供する。前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、ＳＥＱＩＤＮＯ．４～１１のアミノ酸配列のいずれかで示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９～２６のアミノ酸配列のいずれかで示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ．３３～３９のアミノ酸配列のいずれかで示されるＣＤＲ３、を含んでいる。

本発明のいくつかの実施形態において、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示される以下のＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含んでいる。

（１）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１９で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３３で示されるＣＤＲ３。或いは、
（２）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．５で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２０で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３４で示されるＣＤＲ３。或いは、
（３）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．６で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２１で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３５で示されるＣＤＲ３。或いは、
（４）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．７で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２２で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３６で示されるＣＤＲ３。或いは、
（５）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．８で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２３で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３７で示されるＣＤＲ３。或いは、
（６）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．９で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２４で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３８で示されるＣＤＲ３。或いは、
（７）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１０で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２５で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３６で示されるＣＤＲ３。或いは、
（８）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１１で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２６で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３９で示される
ＣＤＲ３。

本発明のいくつかの実施形態において、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体はフレームワーク領域ＦＲを含む。前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列で示される以下のＦＲ１～ＦＲ４を含んでいる。

（１）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１２で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２７で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４０で示されるＦＲ４。或いは、
（２）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１３で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２８で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。或いは、
（３）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１４で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２９で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。或いは、
（４）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１５で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３０で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。或いは、
（５）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１６で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３１で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。或いは、
（６）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１３で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３１で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。或いは、
（７）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１７で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３０で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。或いは、
（８）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１８で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３２で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４。

本発明のいくつかの実施形態において、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のアミノ酸配列は、ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するものであって、ａ）で限定したアミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列、を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体はヒト化抗体であり、好ましくは、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６７～９０で示される。

本発明は、その他の局面において、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の融合タンパク質を提供する。当該融合タンパク質は、前記ナノ抗体の第１ドメインを含み、更に、体内半減期を延長するために用いられ、及び／又は、エフェクター細胞に対して結合作用を有する第２ドメインを含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、血清アルブミンフラグメント、ポリエチレングリコールフラグメント、ＨＳＡと結合するナノ抗体のうちの１又は複数の組み合わせを含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは免疫グロブリンのＦｃ領域を
含み、好ましくは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域から選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれる。前記エフェクター機能には、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性のうちの１又は複数の組み合わせが含まれる。

本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのうちの１又は複数の組み合わせから選択される。前記ＩｇＧは、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの１又は複数の組み合わせから選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫グロブリンのＦｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．９１～９５のいずれかから選択される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第２ドメインは、Ｔ細胞上に存在するＣＤ３に対し親和性を有し、及び／又は、Ｔ細胞上に存在するＣＤ３と結合可能な分子を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記第１ドメインと第２ドメインの間には連結ペプチドが設置されている。

本発明のいくつかの実施形態において、前記連結ペプチドは、アラニン及び／又はセリン及び／又はグリシンからなる柔軟なポリペプチド鎖から選択され、連結ペプチドの長さは３～４０個のアミノ酸である。

本発明は、その他の局面において、前記ナノ抗体をコードするか、前記融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、その他の局面において、前記分離したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

本発明は、その他の局面において、抗体の発現システムを提供する。前記発現システムは、前記発現ベクター、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている前記ポリヌクレオチドを含む。

本発明は、その他の局面において、前記ナノ抗体又は前記融合タンパク質の作製方法を提供する。当該作製方法は、前記抗体の発現に適した条件において、前記抗体の発現システムを培養することで前記抗体を発現し、前記抗体を精製・分離する、とのステップを含む。

本発明は、その他の局面において、免疫複合体を提供する。前記免疫複合体は、前記ナノ抗体又は前記融合タンパク質を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫複合体は連結部を更に含む。前記連結部は、検出可能マーカー、細胞傷害性、放射性同位体、又は生物活性タンパク質のうちの１又は複数の組み合わせを含む。

本発明は、その他の局面において、検出用試薬キットを提供する。前記検出用試薬キットは、前記ナノ抗体、又は前記融合タンパク質、又は前記免疫複合体を含む。

本発明は、その他の局面において、薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、前記ナノ抗体、又は前記融合タンパク質、又は前記免疫複合体を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、更に、薬学的に許容可能なベクターを含む。

本発明は、その他の局面において、細胞を提供する。前記細胞は、膜結合型の前記ポリペプチドを含む。また、前記細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ又はＮＫ細胞である。前記ポリペプチドは、抗原識別領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記抗原識別領域は前記ナノ抗体を含む。

本発明は、その他の局面において、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に関連する疾病を診断、治療又は予防するための薬物の製造における前記ナノ抗体、又は前記融合タンパク質、又は前記免疫複合体、又は前記薬物組成物、又は前記細胞の用途を提供する。

本発明のいくつかの実施形態において、前記ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に関連する疾病は腫瘍から選択され、前記腫瘍は、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌及び胆嚢癌のうちの１又は複数の組み合わせから選択される。

図１は、本発明における細胞表面抗原ＣＬＤ１８Ａ２に対するＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質の結合曲線（Ｅｌｉｓａ）を示す。図２は、本発明におけるＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質のＣＤＣ活性を示す。図３は、本発明におけるＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質のＣＤＣ活性を示す。図４は、本発明におけるＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質のＡＤＣＣ活性を示す。図５は、本発明におけるマウス体内の腫瘍成長に対するＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質の抑制作用を示す。図６は、本発明におけるＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の結合曲線を示す。図７は、本発明におけるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の結合曲線を示す。図８は、本発明におけるｉｎｖｉｔｒｏのＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の殺傷効果を示す。図９は、本発明におけるｉｎｖｉｔｒｏのＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ１に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の殺傷効果を示す。図１０は、本発明におけるマウス体内の腫瘍成長に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の抑制作用を示す。図１１は、本発明におけるａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２及びＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ１に作用したあとのＩｎｖｉｔｒｏのサイトカイン放出量の検出結果を示す。図１２は、本発明におけるマウス体内の腫瘍成長に対するａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抑制作用を示す。

本発明の発明者は、詳細な研究の結果、ＣＬＤ１８Ａ２上に存在するエピトープと特異的に結合するナノ抗体を提供するとともに、前記ナノ抗体を含む融合タンパク質、免疫複合体、及びＣＬＤ１８Ａ２を標的とするキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供する。前記タンパク質又は細胞は、ＣＬＤ１８Ａ２に対して特異性及び良好な親和性を有するほか、明らかな腫瘍抑制作用を有している。これに基づき、本発明を完成させた。

「抗体」又は「免疫グロブリン」との用語は、本文中において、重鎖抗体を示すか通常の４本鎖抗体を示すかに関わらず、いずれも一般的な用語として用いられ、全長抗体、単一の鎖及び全ての部分、ドメイン又はフラグメント（例えば、ＶＨＨドメインやＶＨ／ＶＬドメインといった抗原結合ドメイン又はフラグメントを含むがこれらに限らない）を含む。また、本文中で使用する「配列」との用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「単一の可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語に含まれる）は、本文中で限定的な解釈を要する場合を除き、一般的に、関連するアミノ酸配列を含むとともに、前記配列をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列を含むものと理解される。

「モノクローナル抗体」との用語は、単一の分子で構成される抗体分子生成物を意味する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。

（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」との用語は、タンパク質の折り畳み構造を意味し、タンパク質の残りの部分とは独立して三次構造を維持可能である。一般的に、ドメインは、タンパク質の単一の機能及び性質を司るものであり、様々な状況において、タンパク質のその他の部分及び／又はドメインの機能を損なうことなく、その他のタンパク質に対して添加、除去又は移植することが可能である。

「シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）」、「ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」は同じ意味であり、抗体の重鎖の可変領域をクローニングして、１つの重鎖の可変領域のみでなるシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）が作製される。この抗体は、完全な機能を有する最小の抗原結合性フラグメントである。通常は、アルパカの免疫血清から軽鎖及び重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を持たない天然の抗体を取得したあと、抗体の重鎖の可変領域をクローニングすることで、１つの重鎖の可変領域のみでなるシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を作製する。

「シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）」との用語は、基本的に、当該分野及び以下の部分において、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」とそれぞれ称される４つの「フレームワーク領域」で構成される免疫グロブリンのドメインを意味する。前記フレームワーク領域は、当該分野及び以下の部分において、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」とそれぞれ称される３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」によって間隔を隔てている。そのため、シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）の一般的な構造又は配列は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で表すことができる。シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は抗原結合部位を有しているため、抗原に対する特異性が抗体に付与される。

「重鎖シングルドメイン抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ抗体フラグメント」、「ＶＨＨ抗体」及び「ナノ抗体」（「Ｎａｎｏｂｏｄｙ」は、ＡｂｌｙｎｘＮＶ社（ヘント，ベルギー）の登録商標）との用語は、互換的に使用可能である。

「ＩＭＧＴナンバリングシステム」は、ヒト及びその他の脊椎動物の免疫グロブリン（ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に特化した統合情報システムであって、ＴＨＥＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳＹＳＴＥＭ（登録商標）のことである（Ｌａｆｒａｎｃ等，２００３，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７）。ＩＭＧ
Ｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ）にログインし、抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子を分析することで、可変領域のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎｓ，ＦＲ）及び相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲ）が特定される。免疫グロブリンの可変ドメイン構造内におけるＣＤＲの「位置」は種間において保守的であり、且つ、環と称される構造内に存在している。そのため、構造的特徴に基づき可変ドメイン配列を揃えたナンバリングシステムを使用することで、ＣＤＲとフレームの残基が容易に鑑定される。この情報は、任意の種に由来する免疫グロブリンのＣＤＲ残基を通常のヒト由来抗体における受容体フレームに移植及び置換するために利用可能である。また、別途説明している場合を除き、本明細書、特許請求の範囲及び図面において、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体は、ＣＤＲ領域とＦＲ領域の特定のために、ＩＭＧＴのナンバリング方法に従ってナンバリングしている。

「特異的結合」との用語は、この結合が抗原に対し選択的なものであり、望まない又は非特異的な相互作用とは区別可能なことを意味する。抗原結合モジュールが特異的エピトープに結合する能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）や、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）社製機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ等，ＧｌｙｃｏＪ１７，３２３－３２９（２０００））、及び免疫蛍光技術といった当業者が熟知するその他の技術によって測定可能である。

「ヒト化抗体」との用語は、基本的にヒト以外の種に由来する免疫グロブリンの抗原結合部位を有する分子を意味し、前記分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列をベースとしている。前記抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインを含んでいてもよいし、可変ドメインの適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでいてもよい。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、１又は複数のアミノ酸を置換することで修飾してもよい。例えば、修飾によってヒト免疫グロブリンにいっそう類似させてもよい。ヒト化抗体の形式によっては、全てのＣＤＲ配列を維持している（例えば、アルパカ由来の３つ全てのＣＤＲを含むヒト化ナノ抗体）。また、その他の形式としては、元の抗体から変異した１又は複数のＣＤＲを有するものがある。

抗体について述べる場合、「エフェクター機能」との用語は、抗体のＦｃ領域に由来し、且つ抗体のアイソタイプによって変化する生物学的活性のことを意味する。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウン調節又はＢ細胞の活性化が含まれる。

「抗体依存性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害性の形式の一つである。何らかの細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌性免疫グロブリンによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞は、抗原を有する標的細胞に特異的に結合したあと、細胞傷害性によって前記標的細胞を殺傷可能となる。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」するためのものであり、前記殺傷にとって絶対的に必要である。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞としてＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単核細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。また、ＦｃＲは造血細胞上で発現することが知られている（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ＆Ｋｉｎｅｔ，１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２参照）。標的分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、ＩｎｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ測定を行えばよい（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び第５，８２１，３３７号参照）。前記測定に適用されるエフェクター細
胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）やナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞が含まれる。

「補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」又は「ＣＤＣ」とは、抗体により誘導されるもう一つの細胞殺傷方法である。補体の活性化にとっては、ＩｇＭが最も有効なアイソタイプとされる。また、ＩｇＧ１とＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路によるＣＤＣの誘導においては非常に有効である。好ましくは、このカスケードでは、抗原－抗体複合体の形成に伴って、抗体分子（例えば、ＩｇＧ分子）のＣＨ２ドメインにおける複数のＣ１ｑ結合に密に関与する部位が露出する（Ｃ１ｑは補体Ｃ１における３種類のサブクラスの１つである）。好ましくは、露出したＣ１ｑ結合部位によって、それまで低親和性であったＣ１ｑ－ＩｇＧの相互作用が高親和性の相互作用に変換される。これにより、その他の一連の補体タンパク質を含むカスケードが触発されて、エフェクター細胞の走化／活性剤であるＣ３ａ及びＣ５ａのタンパク質加水分解及び放出が誘発される。好ましくは、当該補体のカスケードによって、最終的に膜侵襲複合体が形成される。膜侵襲複合体は細胞膜に孔を形成するため、水及び溶質が細胞の内外を自在に通り抜けるのに有利となる。

「ＣＤ３」との用語は、ヒトＣＤ３タンパク質のマルチサブユニット複合体を意味する。ＣＤ３タンパク質のマルチサブユニット複合体は、６つの異なるポリペプチド鎖から構成される。これらのポリペプチド鎖には、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ０４２３４）、２つのＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ０７７６６）、及びＴ細胞受容体α及びβ鎖に関連するＣＤ３ζ鎖ホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ２０９６３）が含まれる。「ＣＤ３」との用語には、ＣＤ３のあらゆる変異体、異性体及び種相同体が含まれる。また、別途明記している場合を除き、「ＣＤ３」は、細胞（Ｔ細胞を含む）により自然に発現するか、上記のポリペプチドをコードする遺伝子又はｃＤＮＡトランスフェクション細胞上に発現可能である。Ｔ細胞表面の分化抗原群３（ＣＤ３）は、Ｔ細胞受容体の補助受容体であり、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を補助する。

２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、配列間における同一アミノ酸のパーセンテージを意味する。また、「配列類似性」とは、同一の、又は代表的な保守的アミノ酸置換が行われたアミノ酸のパーセンテージを意味する。アミノ酸又はヌクレオチド間の配列同一性の度合を評価する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、アミノ酸配列の同一性については、通常は配列解析ソフトを用いて測定する。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて同一性を特定可能である。

「キメラ抗原受容体」、「ＣＡＲ」との用語は、ＴＣＲ機能を模倣した人工受容体のことであり、抗原識別領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域が順に連結されてなる。腫瘍細胞表面の抗原（受容体）がキメラ抗原受容体の抗体（リガンド）と結合すると、ヒンジ領域と膜貫通領域を通じてシグナルが細胞内に伝達される。次に、細胞内シグナル領域は、シグナルを活性化シグナルに変換してエフェクター細胞を活性化させる。すると、エフェクター細胞は、パーフォリンを分泌するか、サイトカインを発生させて腫瘍細胞を殺傷する。また、これと同時にエフェクター細胞自体も増殖するため、更に免疫殺傷作用が増大する。

薬剤の「有効量」とは、その適用を受けた細胞又は組織における生理学的変化を引き起こすために必要な量のことである。

例えば、薬物組成物のような薬剤の「治療有効量」とは、必須の投与量及び期間において所望の治療又は予防結果を効果的に実現するための量のことである。治療有効量の薬剤は、例えば、疾病による好ましくない作用を除去、低減、遅延、最小化又は予防する。

「個体」又は「被験者」は哺乳類である。哺乳類には、家畜化した動物（例えば、雌牛、羊、猫、犬、馬）、霊長類（例えば、ヒト及びヒト以外のサルといった霊長類）、イエウサギ及び齧歯類（例えば、マウスやラット）が含まれるがこれらに限らない。好ましくは、前記個体又は被験者はヒトである。

「薬物組成物」との用語は、その形式によって内部に含有される活性成分の生物学的活性が有効となり、且つ、当該組成物の適用を受ける被験者に許容不可能な毒性をもたらすその他の成分が含まれていない製剤を意味する。

「薬学的に許容可能なベクター」とは、薬物組成物内の活性成分を除く被験者にとって無害の成分を意味する。薬学的に許容可能なベクターには、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤が含まれるが、これらに限らない。

「治療／予防」（及び、その語法的変形）との用語は、個体の疾病を変化させ、治そうとする自然なプロセスのことであり、且つ、予防又は臨床病理学の過程で実施される臨床的介入とも言える。治療による所望の効果には、疾病の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾病に伴うあらゆる直接的又は間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾病の進行速度の低下、疾病状態の改善又は軽減、及び予後の除去又は改善が含まれるが、これらに限らない。いくつかの実施方案において、本発明の抗体は、疾病の形成遅延又は疾病の進行緩和に用いられる。

「抗原」との用語は、抗体が選択的に結合可能な所定の抗原を意味する。標的抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、細胞、脂質、ハプテン、又は、その他の天然に存在するか合成される化合物とすることができる。本文のいくつかの実施方案において、標的抗原とは、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞のことであり、より好ましくは、ＣＬＤ１８Ａ２分子の一部分を発現するものである。

「全細胞サブトラクティブスクリーニング」との用語は、近年、ファージディスプレイ技術において発展しているハイスループットスクリーニング技術である。当該技術では、対になった細胞を利用してファージライブラリをサブトラクティブスクリーニングすることで、高い親和性をもって標的細胞と結合する短ペプチドを短時間のうちにスクリーニングできる。

「エピトープ」とは、抗原分子の表面における単一の抗体分子と結合する部位のことであり、例えば、抗原表面における抗体と結合可能な１又は複数の抗原結合領域のことである。且つ、哺乳類（例えば、ヒト）のような動物には、免疫応答を誘発し得る抗原性活性又は免疫原性活性の局所的領域が備わっている。免疫原性活性を有するエピトープは、動物に抗体反応を誘発するポリペプチドの部分である。また、抗原性活性を有するエピトープは、当該分野において熟知されている任意の方法（例えば、免疫測定を含む）で測定される抗体と結合するポリペプチドの部分である。なお、抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を有していなくともよい。エピトープは、例えば、アミノ酸又は糖側鎖といった分子の化学的活性表面のクラスターから構成されるとともに、特定の３次元構造的特徴と特定の電荷特徴を有していることが多い。エピトープは、線形エピトープであってもよいし、立体配座エピトープであってもよい。線形エピトープは、タンパク質中の連続したアミノ酸配列によって形成される。また、立体配座エピトープは、タンパク質配列中の連続してはいないが、タンパク質が折り畳まれて３次元構造を形成したあとに一体的に集合するアミノ酸から形成される。タンパク質の３次元構造は、例えば、活性化するか、別のタンパク質又はリガンドと結合することで変性した立体配座をなしたときに、誘発エピトープを形成する。いくつかの実施方案において、ＣＬＤ１８Ａ２エピトープはＣＬＤ１８Ａ２タ
ンパク質の３次元表面における特徴をなす。また、その他の実施方案において、ＣＬＤ１８Ａ２エピトープはＣＬＤ１８Ａ２タンパク質の線形特徴をなす。通常、抗原はいくつかの又は多くの異なるエピトープを有しており、多くの異なる抗体と反応することが可能である。

ナノ抗体
本発明は、第１の局面において、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体を提供する。前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、ＳＥＱＩＤＮＯ．４～１１のアミノ酸配列のいずれかで示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１９～２６のアミノ酸配列のいずれかで示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ．３３～３９のアミノ酸配列のいずれかで示されるＣＤＲ３、を含んでいる。本発明のいくつかの具体的実施例において、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示される以下のＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含んでいる。

（１）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１９で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３３で示されるＣＤＲ３。或いは、
（２）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．５で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２０で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３４で示されるＣＤＲ３。或いは、
（３）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．６で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２１で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３５で示されるＣＤＲ３。或いは、
（４）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．７で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２２で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３６で示されるＣＤＲ３。或いは、
（５）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．８で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２３で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３７で示されるＣＤＲ３。或いは、
（６）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．９で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２４で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３８で示されるＣＤＲ３。或いは、
（７）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１０で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２５で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３６で示されるＣＤＲ３。或いは、
（８）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１１で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２６で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３９で示されるＣＤＲ３。

本発明で提供する抗ＣＬＤ１８Ａ２抗原ナノ抗体は、フレームワーク領域ＦＲを含み得る。前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列で示される以下のＦＲ１～ＦＲ４を含んでいる。

本発明で提供する抗ＣＬＤ１８Ａ２抗原ナノ抗体におけるアミノ酸配列としては、ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するものであって、ａ）で限定したアミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列、を含むことができる。具体的に、前記ｂ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかで示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠損、又は添加を経て得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものであって、且つ、ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかで示されるアミノ酸からなるポリペプチド断片の機能を有するポリペプチド断片であり、例えば、ＣＬＤ１８Ａ２に対する特異的結合能力を有している。上記ｂ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかと８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の相同性を有している。本発明で提供する抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞と特異的に結合可能である。例えば、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞と結合可能であるとともに、ＣＬＤ１８Ａ２を発現しないがＣＬＤ１８Ａ１を発現する細胞とは結合不可能である。つまり、ＣＬＤ１８Ａ２のみを識別し、ＣＬＤ１８Ａ１は識別しない。

本発明で提供する抗ＣＬＤ１８Ａ２抗原ナノ抗体は、ヒト化抗体とすることができる。ヒト化に改変することで、抗体の免疫原性を効果的に低下させられる。前記ヒト化ナノ抗体は、少なくとも１つの抗体の機能特性を保持可能であり、例えば、ＣＬＤ１８Ａ２に対する特異的結合能力を有している。本発明の具体的実施形態において、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ヒト化ナノ抗体のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６７～９０で示される。

融合タンパク質
本発明は、第２の局面において、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の融合タンパク質を提供する。当該融合タンパク質は、本発明の第１の局面で提供したナノ抗体の第１ドメインと、体内半減期を延長するために用いられ、及び／又はエフェクター細胞に対して結合作用を有
する第２ドメインを含む。前記融合タンパク質は、結合分子とすることができる。前記結合分子は、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞と特異的に結合可能である。

前記第２ドメインにおける体内半減期を延長するためのフラグメントは、血清アルブミンフラグメント、ポリエチレングリコールフラグメント、ＨＳＡ結合ドメイン（例えば、ＨＳＡと結合するナノ抗体）等を含むことができる。また、前記第２ドメインにおけるエフェクター細胞に対し結合作用を有するフラグメントは免疫グロブリンのＦｃ領域等を含むことができ、好ましくは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域から選択する。前記ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれる。前記エフェクター機能には、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性のうちの１又は複数の組み合わせが含まれる。前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等のうちの１又は複数の組み合わせから選択可能である。前記ＩｇＧは、具体的に、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４等のうちの１又は複数の組み合わせから選択可能である。ナノ抗体の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンのＦｃ領域によって、前記融合タンパク質の二量体化が可能になるとともに、前記融合タンパク質の体内半減期が延長され、且つＦｃ媒介性の関連活性が増大する。本発明の具体的実施形態において、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とすることができ、より具体的には、野生型ＩｇＧ１のＦｃ配列とすることができる。前記配列には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異を導入可能である。例えば、ａ）Ｆｃ媒介性のＣＤＣ活性を変化させる突然変異、ｂ）Ｆｃ媒介性のＡＤＣＣ活性を変化させる突然変異、或いは、ｃ）Ｆｃ媒介性のＡＤＣＰ活性を変化させる突然変異、を導入可能である。本発明の別の具体的実施形態において、前記免疫グロブリンのＦｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．９１～９５のいずれかから選択される。前記第２ドメインにおいて、エフェクター細胞に対し結合作用を有するフラグメントは、更に、Ｔ細胞上に存在する分化抗原群３（ＣＤ３）に対し高い親和性を有する／Ｔ細胞上に存在する分化抗原群３（ＣＤ３）と結合する分子を含んでいてもよい。好ましくは、抗ＣＤ３ナノ抗体とし、アミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ．１３１とする。

本発明で提供する抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の融合タンパク質において、前記第１ドメインと第２ドメインの間には連結ペプチドを設置可能である。前記連結ペプチドは、アラニン（Ａ）及び／又はセリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）からなる柔軟なポリペプチド鎖とすることができる。連結ペプチドの長さは３～４０個のアミノ酸とすればよく、好ましくは、３～９個、９～１２個、１２～１６個、１６～２０個、２０～２５個、２５～３０個、３０～３５個、３５～４０個とする。本発明の別の具体的実施形態において、連結ペプチドの長さは、８個又は１５個又は３５個とすることができる。

好ましい実施例の一つでは、健康なヒト由来の血清を補体源として用いる。前記Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃは、ＣＬＤ１８Ａ２抗原を発現した細胞に対し殺傷効果を有しており、且つ、細胞溶解の割合が陽性対照ｃｈ－１７５Ｄ１０よりも高い。

別の好ましい実施例において、前記Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質は、腫瘍識別部分であるＡｎｔｉ－Ｃ１８．２を有している。また、当該分子のもう一方のアームは、Ｔ細胞抗原（エフェクターサブ結合アーム）（主にＣＤ３）に対して特異性を有している。２つのアームが各々の標的抗原に同時に結合することで、Ｔ細胞は腫瘍細胞に導かれて腫瘍細胞で活性化し、当該箇所において、それぞれが細胞溶解機能を発揮可能となる。抗ＣＤ３ナノ抗体は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ受容体複合体におけるＣＤ３に結合可能であり、Ｔ細胞を活性化させる第１シグナルを提供し得る（抗原提示細胞上のＭＨＣ－ペプチド複合体がＴＣＲに結合するのに類似している）ため、Ｔ細胞の活性化に有利である。且つ、ＣＤ３の抗原結合部を対象とするＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質を含有しているため、Ｔ細胞を腫瘍細胞の周辺に凝集させて、Ｔ細胞による腫瘍細胞の
殺傷効率を向上させることが可能となる。

分離したポリヌクレオチド
本発明は、第３の局面において、本発明の第１の局面で提供したナノ抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ等とすることができる。前記分離したポリヌクレオチドを提供する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、ＤＮＡの自動合成及び／又は組換えＤＮＡ技術等で作製して取得してもよいし、適切な天然源から分離してもよい。本発明の具体的実施形態において、前記分離したポリヌクレオチドの核酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９～１３０のいずれかで示される。

発現ベクター
本発明は、第４の局面において、発現ベクターを提供する。前記発現ベクターは、本発明の第３の局面で提供した分離したポリヌクレオチドを含む。前記発現ベクターの作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記発現ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、生体内組換え技術等の方法で作製して取得することが可能であり、より具体的には、前記分離したポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで作製可能である。本発明における発現ベクターは、通常、当該分野において熟知されている市販の各種発現ベクター等のことであり、例えば、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、又はその他のベクターとすることができる。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１又は複数の調節配列を含んでもよい。また、前記調節配列は適切なプロモーター配列を含むことができる。通常、プロモーター配列は、発現されるアミノ酸配列のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。また、調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞により識別されることで転写を終結させる配列を含むことができる。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である。

通常、適切なベクターは、少なくとも１つの有機体において役割を発揮する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、及び１又は複数の選択可能なマーカーを含むことができる。例えば、これらのプロモーターには、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、λファージのＰＬプロモーター、真核プロモーター（ＣＭＶ主要前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ピキア・パストリスのメタノールオキシダーゼプロモーターを含む）、及びその他の既知の制御可能な遺伝子が原核又は真核細胞或いはそのウイルス内で発現するプロモーターが含まれ得るが、これらに限らない。マーカー遺伝子は、形質転換した宿主細胞を選択するための表現型及び性状を提供するために使用可能である。例えば、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、或いは、大腸菌に用いられるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性等が含まれ得るが、これらに限らない。前記ポリヌクレオチドが発現される場合には、発現ベクターにエンハンサー配列を含んでもよい。ベクターにエンハンサー配列を挿入すれば、転写が強化される。エンハンサーはＤＮＡのシスエレメントであり、通常は約１０～３００個の塩基対を有している。エンハンサーがプロモーターに作用することで、遺伝子の転写が強化される。

発現システム
本発明は、第５の局面において、抗体の発現システムを提供する。前記発現システムは、本発明の第４の局面で提供した発現ベクター、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれている本発明の第３の局面で提供したポリヌクレオチドを含む。発現ベクターの発現に適用されるあらゆる細胞は、いずれも宿主細胞となり得る。例えば、前記宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、或いは、酵母細胞のような下等真核細胞、或いは、哺乳類細胞のような高等真核細胞とすることができる。具体的には、大腸菌、ストレプトマイセス属、サルモネラ・ティフィムリウムの細菌細胞、真菌細胞（例えば、酵母、糸状真菌、植物細胞）、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞、或いはＢｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞の動物細胞等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。前記発現システムを作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、電気穿孔法、ウイルス媒介性形質転換法、電子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。

免疫複合体
本発明は、第６の局面において、免疫複合体を提供する。前記免疫複合体は、本発明の第１の局面で提供したナノ抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質を含む。通常、前記免疫複合体は連結部を更に含む。前記連結部は、検出可能マーカー、細胞傷害性、放射性同位体、又は生物活性タンパク質等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。前記免疫複合体の作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記ナノ抗体及び／又は融合タンパク質を、直接的に、又は適切な長さのスペーサーを介して連結部と連結可能である。連結方式は、化学架橋又は遺伝子工学による融合発現とすればよく、これにより前記免疫複合体が得られる。治療目的のためには、例えば放射性グループのような治療エフェクターグループが適切な場合がある。これらの放射性グループは、放射性同位体又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１ｌｎ、^１２３ｌ、^１２５ｌ、^１３１ｌ、^２０１ＴＩ、^２１３Ｂｉ）、傷害性、或いは、細胞傷害性グループ（例えば、細胞増殖抑制剤）から構成されるか、そのグループを含む。このほか、本発明のポリペプチドは、マーカーグループ（マーカーのポリペプチド）と連結可能であり、その後、これを例えば診断目的に使用可能である。適切なマーカーグループは、放射性同位体（例えば、上記で提示したもの）、或いは、放射性同位体、放射性核種を含むグループ、蛍光グループ（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパク質、染料、ローダミン、フルオレセイン及びその誘導体（例えばＦＩＴＣ）、アントシアニジンなど）、酵素グループ（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ）、化学発光グループ、ビオチングループ、金属粒子（例えば、金粒子）、磁性粒子（例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ_３Ｏ_４）及び／又は磁気赤鉄鉱（Ｆｅ_２Ｏ_３）を含む核を有する）、所定のポリペプチドグループ等から選択可能である。

検出用試薬キット
本発明は、第７の局面において、本発明の第１の局面で提供したナノ抗体、本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体を含む検出用試薬キットを提供する。前記試薬キットは、必要に応じて、容器、対照物（陰性又は陽性対照）、緩衝剤、助剤等を更に含んでもよく、当業者は、具体的状況に応じてこれらを選択可能である。

本発明は、更に、検出方法を提供する。前記検出方法は、ＣＬＤ１８Ａ２タンパク質の検出に使用可能である。前記検出方法は、細胞及び／又は組織サンプルの取得、媒体へのサンプルの溶解、溶解した前記サンプル内におけるＣＬＤ１８Ａ２タンパク質のレベル検出、を含み得る。本発明の具体的実施例において、検出対象は、細胞保存液中に存在する細胞含有サンプルとすることができる。本発明の別の具体的実施例において、前記ナノ抗体には、更に、検出に適用可能であるか、その他の試薬により検出可能な蛍光染料、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、タグ等が組み合わされている。

薬物組成物
本発明は、第８の局面において、本発明の第１の局面で提供した抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体、又は本発明の第２の局面で提供した抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体を含む薬物組成物を提供する。

前記薬物組成物は、更に、当該分野において薬学的に許容可能な各種ベクターを含むことができる。薬学的に許容可能なベクターとは、使用する投与量及び濃度が適用者にとって無害なものであり、具体的には、緩衝剤（例えば、アセテート、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸）、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）、防腐剤（例えば、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸炭化水素基エステル、（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル又はｐ－ヒドロキシ安息香酸酢酸プロピル）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタンアルコール、ｍ－クレゾール）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン）、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、張度調節剤（例えば、トレハロースや塩化ナトリウム）、糖類（例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、塩対イオン（例えばナトリウム）、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、及び／又は、非イオン界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むものとできるが、これに限らない。また、生体内に適用する製剤は一般的に無菌である。製剤の無菌化を実現する方法は当業者にとって既知のものとし、例えば、滅菌用フィルターによる濾過等の方法で実現すればよい。更に、当業者は、薬物組成物に求められる剤形に応じて適切な薬学的に許容可能なベクターを選択することで、異なる剤形に製造することが可能である。例えば、本発明の薬物組成物は、タブレット、注射剤、凍結乾燥剤等の各種剤形を含み得るが、これらに限らない。

前記薬物組成物において、通常、前記融合タンパク質及び免疫複合体の含有量は有効量とする。また、前記有効量に対応する活性成分の含有量は、治療の対象及び特定の投与方式に基づき決定する。例えば、薬物組成物の総質量で算出する場合、前記融合タンパク質及び免疫複合体の含有量の範囲は、約０．０１～９９％、０．１～７０％、１～３０％、０．０１～０．０５％、０．０５～０．１％、０．１～０．３％、０．３～０．５％、０．５～１％、１～３％、３～５％、５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～５０％、５０～７０％又は７０～９９％とすればよい。

本発明の融合タンパク質、免疫複合体及び薬物組成物は、単一の有効成分として適用してもよいし、併用療法において適用してもよい。即ち、その他の薬剤と併用してもよい。例えば、前記併用療法では、前記融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物をその他の少なくとも１つの抗腫瘍薬と併用することが可能である。また、例えば、前記併用療法では、
前記融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物を免疫チェックポイント阻害剤と併用することが可能である。前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤等のうちの１又は複数の組み合わせを含むが、これらに限らない。好ましくは、前記阻害剤はモノクローナル抗体とすることができる。

ＣＬＤ１８Ａ２を標的とするキメラ抗原受容体を発現する細胞
本発明は、第９の局面において、ＣＬＤ１８Ａ２を標的とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を発現する細胞を提供する。前記ＣＬＤ１８Ａ２を標的とする細胞は、通常、キメラ抗原受容体としてのポリペプチドを含む。また、前記ポリペプチドは、抗原識別領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含むことができる。前記キメラ抗原受容体を作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、膜貫通領域は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３又はＣＤ２８といったＣＤタンパク質、α、β、γ又はδといったＴ細胞受容体のサブユニット、ＩＬ－２受容体のサブユニット（α鎖）、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ又はｐ７５）のサブユニット（β鎖又はγ鎖）、又はＦｃ受容体のサブユニット鎖の膜貫通領域とすることができる。本発明の具体的実施例において、膜貫通領域は、ＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ２８の膜貫通領域を含む。また、本発明の別の具体的実施例において、膜貫通領域は、ＣＤ４又はＣＤ８の膜貫通領域（例えば、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１３９３４５．１に記載されているＣＤ８α鎖又はそのフラグメント）を含む。本発明の別の具体的実施例において、ＣＡＲは、更に、抗原識別領域と膜貫通領域の間のヒンジ領域を含む。本発明の別の具体的実施例において、ヒンジ領域は、ＣＤ８（例えばＣＤ８α）又はＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインから選択される。また、ＣＡＲに用いられる細胞内シグナル領域の好ましい例としては、天然のＴ細胞受容体と、相互作用によって抗原結合後にシグナル伝達を開始する補助受容体の細胞質配列、これらの配列のあらゆる誘導体又は変異体、及び同一の機能を有するあらゆる合成配列が可能である。細胞内シグナル領域は、抗原依存性の一次活性化を惹起するものと、抗原に依存することなく作用して二次又は共刺激シグナルを提供するものの２種類に分けられる。一次活性化エフェクタードメインは、シグナル伝達モチーフを含み得る。当該モチーフとしては、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）が知られている。ＩＴＡＭは明確に定義されたシグナル伝達モチーフであって、通常は複数の受容体の細胞質内尾部に存在して、ｓｙｋ／ｚａｐ７０系チロシンキナーゼの結合部位として用いられる。非限定的な実施例として、本発明で使用されるＩＴＡＭの実施例には、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄから派生するものが含まれ得る。本発明の具体的実施例において、細胞内シグナル領域はＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７とも称する）を含む。天然ＴＣＲはＣＤ３ζシグナル伝達分子を含むため、当該エフェクタードメインの使用は自然界で発生するＴＣＲ構造に最も類似している。本発明の別の具体的実施例において、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９３２１７０に記載されている配列、又は、当該配列における活性を有するか、活性を刺激するフラグメントを含む。本発明で記載したように、細胞内シグナル領域は、二次又は共刺激シグナルを提供することも可能である。Ｔ細胞は、共刺激分子を更に含む。共刺激分子は、抗原提示細胞上の同種の共刺激リガンドと結合することでＴ細胞応答を強化する。例えば、増殖の活性化、分化等が強化される。そのため、本発明の具体的実施例において、細胞内シグナル領域は共刺激ドメインを更に含む。本発明の別の具体的実施例において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ９４）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、又はこれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。また、更なる実施方案において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ又はこれらの任意の組み合わせから選
択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。また、本発明の別の具体的実施例において、共刺激ドメインは、例えば、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０に記載されているＣＤ２８、又は、ＣＤ２８における活性を有するか、活性を刺激するフラグメントを含む。

更に、前記キメラ抗原受容体によって前記ＣＬＤ１８Ａ２を標的とする細胞を作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ及び／又はＮＫ細胞とすることができる。前記ナノ抗体がＣＬＤ１８Ａ２抗原に結合すると、前記Ｔ細胞、マクロファージ及び／又はＮＫ細胞の活性化及び／又は刺激によって、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞を殺傷することが可能となる。

本発明の好ましい実施例において、前記抗原識別領域は、本発明の第１の局面で提供したナノ抗体を含む。また、前記ヒンジ領域はＣＤ８から選択され、前記膜貫通領域はＣＤ２８である（実施例ではＣＤ２８ａと記載）。前記細胞内シグナル領域の共刺激ドメインは、ＣＤ２８（実施例ではＣＤ２８ｂと記載）、又はＣＤ２８とＣＤ１３７の組み合わせから選択される。前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを更に含む。好ましい実施例において、前記ＣＬＤ１８Ａ２を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｖｏ及びＩｎｖｉｔｒｏのいずれにおいても明らかな殺傷効果を有する。

用途
本発明は、第１０の局面において、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に関連する疾病を診断、治療又は予防するための薬物の製造における本発明の第１の局面で提供したナノ抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体、又は本発明の第８の局面で提供した薬物組成物、第９の局面で提供したキメラ抗原受容体としてのポリペプチド、又は本発明の第９の局面で提供したＣＬＤ１８Ａ２を標的とするキメラ抗原受容体を発現する細胞の用途を提供する。

本発明で提供するナノ抗体、融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物の「治療有効量」は、好ましくは、疾病症状の重大性の低下、疾病の無症状期の頻度及び継続時間の増加、或いは、疾病の苦痛に伴う傷害又は機能喪失の防止をもたらす。例えば、ＣＬＤ１８Ａ２関連腫瘍の治療（胃癌などを含む）の場合、未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましくは、細胞の成長又は腫瘍の成長を少なくとも約１０％抑制する。また、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約３０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％抑制する。腫瘍の成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測するための動物モデルシステムで評価可能である。或いは、細胞の成長能力を検査することで評価してもよい。このような抑制は、当業者にとって公知の実験を通じてＩｎｖｉｔｒｏで測定可能である。治療有効量のナノ抗体、融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物によって、通常は、腫瘍の大きさを縮小することが可能である。或いは、その他の方式で対象の症状を緩和することができる。当業者は、例えば、対象の大きさ、対象の症状の重大性、及び選択した特定の組成物又は投与経路といった実際の状況に応じて適切な治療有効量を選択すればよい。治療の処方（例えば、投与量の決定等）は医師により定められる。また、通常考慮する要因には、治療しようとする疾病、患者の個別の状況、送達部位、適用方法及びその他の要因等が含まれるがこれらに限らない。また、予防有効量とは、必須の投与量及び時間内で効果的に所望の予防効果が実現される量のことである。通常（必然ではない）、予防投与量は疾病の発症前又は疾病の初期に被験者に用いられるため、「予防有効量」は一般的に「治療有効量」よりも低くなる。本発明において、診断、治療及び／又は予防可能なＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に関連する疾病の実施例には、ＣＬＤ１８Ａ２
を発現する全ての癌及び固形腫瘍が含まれ得る。具体的には、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌及び頭頸部癌等が含まれ得るがこれらに限らない。また、これらの癌は、初期、中期又は末期とすることができ、例えば転移癌とすることができる。

以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。

本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。また、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。

実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と等しい。更に、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。

別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法は、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。これらの技術は、従来の文献で完全に説明されており、具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９ａｎｄＴｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ等，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７ａｎｄｐｅｒｉｏｄｉｃｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎａｎｄＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９９、及び、ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，ＣｈｒｏｍａｔｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９等、を参照すればよい。

実施例１：ＣＬＤ１８Ａ２発現細胞株の作製及び検出
ＣＬＤ１８Ａ１（アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．９６）及びＣＬＤ１８Ａ２（アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．９７）の全長遺伝子をそれぞれ含むｐＣＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ社）から、プラスミドマキシキット（バイオミガ（Ｂｉｏｍｉｇａ）社）を用いてプラスミドを抽出した。次に、発現プラスミドを滅菌ろ過したあと、ＣＨＯ－Ｓ細胞に電気穿孔した。そして、Ｇ４１８（シグマ社）を添加して９６ウェルにプレ
ーティングし、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２の安定トランスフェクション細胞株をそれぞれ作製した。選択した９６ウェルマイクロプレート上の安定トランスフェクション細胞株は、Ｇ４１８を添加した培養条件において徐々に増大した。また、Ａｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ１８抗体［３４Ｈ１４Ｌ１５］（アブカム社）を用い、ドットブロット（Ｄｏｔｂｌｏｔｔｉｎｇ）により検出したところ、陽性発現細胞株ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２がそれぞれ特定された。且つ、同様の方法を用いて、ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ１及びＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２を作製した。胃腺癌細胞ＮＵＧＣ－４は武漢金開瑞有限公司から購入した。検査の結果、当該胃腺癌細胞ＮＵＧＣ－４はＣＬＤ１８Ａ２の発現について陽性を示さなかった。

実施例２：Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体ライブラリの調製
実施例１のＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２安定トランスフェクション細胞を細胞量１．０×１０^７個／ｍｌ用い、健康なアルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａｐａｃｏｓ）を免疫するとともに、１ｍｌの完全フロイントアジュバント（シグマ社）で免疫を補助した。更に、２１日後に再び免疫し、合計で３回免疫することで、Ｂ細胞を刺激して抗原特異性のナノ抗体を発現させた。そして、３回の免疫から１週間後、真空採血管でアルパカの血液を３０ｍｌ採取し、リンパ球分離溶液（天津市▲こう▼洋華科生物科技有限公司）を用いてリンパ球を分離してから、Ｔｒｉｚｏｌ法でトータルＲＮＡを抽出した。次に、逆転写試薬キット（インビトロジェン社）を用い、説明書に従って３μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するとともに、ネステッドＰＣＲ及び次のプライマーを用いてＶＨＨを増幅させた。即ち、１回目のＰＣＲでは、フォワードプライマー５’－ＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１０）と、リバースプライマー５’－ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１１）を用い、２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲを鋳型として、フォワードプライマー５’－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＫＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１２）と、リバースプライマーとして、５’－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＧ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１３）、又は、５’－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１４）を用い、それぞれ増幅させた。そして、ターゲットとするＶＨＨ核酸フラグメントを回収し、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）で切断してから、同様に切断したファージディスプレイ用ベクターｐｃｏｍｂ３ｘｓｓ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６３８９０、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿６３８９０）に挿入するとともに、Ｔ４リガーゼ（タカラ社）を用いてライゲーションした。続いて、ライゲーション産物をエレクトロコンピテントセルＥＲ２７３８に形質転換することで、Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体ライブラリを調製した。また、段階希釈プレーティングによって、ライブラリ容量の大きさが１．２３×１０^８であることを測定した。且つ、２４個のクローンをランダムに抜き取ってコロニーＰＣＲ検出を行ったところ、結果より、調製ライブラリの挿入率は１００％であることが明らかとなった。

実施例３：Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のスクリーニング及び鑑定
３．１Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のスクリーニング
調製したＡｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体ライブラリをヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ社）でパッケージングして、ディスプレイライブラリである組換えファージの力価を測定したところ、５．７×１０^１３ＰＦＵ／ｍｌであった。そこで、１８ｍｌ、７×１０^５個／ｍｌのＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２と、１５ｍｌ、３×１０^６個／ｍｌのＣＨＯ－Ｓ細胞を取り、４℃下において３００ｇで５分間遠心分離したあと、培地の上清を除去した。次に、細胞をＰＢＳで再懸濁し、再び遠心分離したあとに、２％のスキムミルク
（ＰＢＳで希釈）を用いて室温で１時間ブロッキングした。続いて、ブロッキングしたＣＨＯ－Ｓ細胞（約４．５×１０^７個）に組換えファージライブラリ約５．７×１０^１１ＰＦＵを加え、室温で３０分間インキュベートしてから、全細胞サブトラクティブスクリーニングを２回行った。そして、上清を約１．５×１０^７個のブロッキングしたＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２安定トランスフェクション細胞に加え、室温で１時間インキュベートして結合させてから、遠心分離したあとＰＢＳで再懸濁し、細胞を洗浄した。洗浄は５回行った。次に、洗浄したファージを細胞に結合させ、１ｍｌの０．１Ｍｇｌｙ－ＨＣｌ１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ｐＨ２．２）緩衝液を用いて１０分間インキュベートし、溶出してから、遠心分離して上清を取り、１ＭｐＨ８．０Ｔｒｉｓ－Ｃｌで中和した。続いて、ファージの力価を測定したところ、力価は３．６×１０^５ＰＦＵ／ｍｌであった。そこで、前記ファージ溶出液を増幅させて測定したところ、力価は１×１０^１３ＰＦＵ／ｍｌとなった。

１回目にエルトリエーションした増幅ライブラリの組換えファージを約２×１０^１１ＰＦＵ取り、ブロッキングした細胞量３×１０^７個のＣＨＯ－Ｓを用いて室温で３０分間インキュベートしてからスクリーニングを行った。次に、４℃下において３００ｇで５分間遠心分離したあと、ブロッキングした細胞量１×１０^７個のＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１細胞を用いて上清を室温で３０分間インキュベートしてから、再びスクリーニングを行った。また、スクリーニングのあと、上清を取り、ブロッキングした細胞量１．５×１０^７個のＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２細胞を用いて室温で１時間インキュベートし、結合させた。そして、４℃下において３００ｇで５分間遠心分離したあと、ＰＢＳで再懸濁してから洗浄した。また、ＰＢＳで５回洗浄したあとに、５００μｌの０．１Ｍｇｌｙ－ＨＣｌ１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ｐＨ２．２）で１０分間インキュベートして溶出し、４℃下において３００ｇで５分間遠心分離したあと、上清を取って１ＭｐＨ８．０Ｔｒｉｓ－Ｃｌにより中和した。２回目にエルトリエーションしたファージの力価を測定したところ、結果は６×１０^５ＰＦＵ／ｍｌであった。そこで、２回目にエルトリエーションしたファージの溶出液を増幅し、５０％グリセリンで保存した。

３．２ファージの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による１回目のスクリーニング
２回目のエルトリエーションで溶出したファージの力価測定プレートから８０個の単クローンを抜き取り、９６ウェルマイクロプレートで培養するとともに、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いて感染させ、パッケージングすることで、上清における組換えファージの蓄積を取得した。次に、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２を、１ウェルあたり細胞５×１０^５個で９６ウェルマイクロプレートにプレーティングするとともに、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングした。そして、マイクロプレート遠心分離機を用い、ブロッキングした３種類の細胞に対応する９６ウェルマイクロプレートを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで上清を慎重に除去した。続いて、単クローン組換えファージの上清を９６ウェルマイクロプレートでそれぞれ３％ＢＳＡにより３倍に希釈してから、１ウェルあたり５０μｌの体積で、３種類の細胞がプレーティングされた９６ウェルマイクロプレートに加えるとともに、室温で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳで３回洗浄したあと、希釈したＨＲＰ－ａｎｔｉ－Ｍ１３抗体（北京義翹神州科技有限公司）を１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。また、ＰＢＳで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。且つ、５分間インキュベートして発色したあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２の３つの９６ウェルマイクロプレートに対するＥＬＩＳＡ測定の結果より、ＯＤ値が陰性ウェル（ＣＨＯ－Ｓに対応するウェル）の１．５倍以上のものを陽性と認定し、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１プレートにおいて陰性を示し且つＣＨＯ
－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２プレートにおいて陽性を示したクローンを選別した。

３．３大腸菌発現上清の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による２回目のスクリーニング
３種類の細胞ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２の９６ウェルマイクロプレートにおける発色結果に基づいて選別したクローンを培養し、単一のナノ抗体配列を含有するｐｃｏｍｂ３ｘｓｓプラスミドを抽出するとともに、プラスミドをそれぞれ大腸菌発現宿主ＲｏｓｅｔｔａＤＥ３に形質転換した。そして、それぞれの発現クローンを抜き取って培養したあと、０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で一晩誘導し、ペリプラズムに発現したタンパク質を培養上清に浸透させた。続いて、その中から１６個のクローンの培地上清を抜き取って再びＥＬＩＳＡ測定を行った。即ち、１：５０００で希釈したｍｏｕｓｅａｎｔｉｈｉｓｔａｇ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。また、これを洗浄したあと、１：１００００で希釈したＨＲＰ－ＧｏａｔａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートしてから、洗浄後にＴＭＢを加えて発色させた。そして、これらの中から陰性クローンプラスミドを陰性対照として選択した。細胞のＥＬＩＳＡ結果は表１に示す通りとなり、更に、特異的に結合したクローンを選択した。続いて、これらのクローンをそれぞれシーケンシングし、アミノ酸配列を照合して反復配列を除去することで、配列の異なる８つの特異的結合クローンを取得した。表１に、取得した特異的結合クローンを例示する。

実施例４：Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の初期評価及び鑑定
４．１Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の宿主大腸菌における発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列プラスミドを鋳型とし、フォワードプライマーを５’－ｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｔｇｇａｇｔｃｔ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１５）、リバースプ
ライマーを５’－ｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔｇｔｃｇａｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃｔｔａｃｔａａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｃｔｇ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１６）として、ハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（通用生物系統（安徽）有限公司）を用いＰＣＲ増幅を行った。また、配列５’末端にシグナルペプチド配列を保持し、３’末端にヒスチジンタグのコード配列を保持した。次に、ＰＣＲ産物を電気泳動し、約５００ｂｐほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したＰＣＲ産物を、組換え試薬キット（近岸蛋白質科技有限公司）を用いて、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したｐＥＴ３２ａ^＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と組換え連結することで、大腸菌発現プラスミドを作製した。そして、これを大腸菌のコンピテント状態であるＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換し、アンピシリン耐性プレートに塗布して、インキュベータにおいて３７℃で一晩培養した。次に、アンピシリン耐性プレート上のクローンを抜き取り、プラスミドのシーケンシングを行うことで、ｐＥＴ３２ａ^＋ベクターに対する配列の正確な挿入を特定した。

シーケンシングにより特定した大腸菌発現プラスミドを大腸菌発現宿主Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換して、大腸菌発現菌株を作製した。アンピシリン耐性プレートから組換えクローンを抜き取り、培養してから、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で一晩発現を誘導した。一晩発現誘導した菌液を超音波破砕し、４℃下において１２０００ｇで１０分間遠心分離したあと上清を取り、Ｎｉカラム（博格隆生物技術有限公司）を用いて精製することで、最終的なタンパク質純度を９０％以上とした。

４．２Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体タンパク質の特異的結合
ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２を、１ウェルあたり細胞５×１０^５個で９６ウェルマイクロプレートにプレーティングするとともに、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、精製したヒスチジンタグ融合Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体タンパク質を濃度２μｇ／ｍｌまで希釈したあと、ブロッキングした細胞に１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。そして、洗浄したあと、１：５０００で希釈したｍｏｕｓｅａｎｔｉｈｉｓｔａｇ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。且つ、洗浄後に、１：１００００で希釈したＨＲＰ－ＧｏａｔａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。そして、洗浄後にＴＭＢを加えて発色させ、４５０ｎｍでＯＤ値を測定したところ、結果は表２のようになった。

４．３Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体タンパク質の親和性鑑定
ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２を１ウェルあたり細胞５×１０^５個で９６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、精製したヒスチジンタグ融合ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体を１％ＢＳＡで段階希釈したあと、ブロッキングした細胞にそれぞれ加えて、室温で１時間インキュベートした。そして、洗浄したあと、１：５０００で希釈したｍｏｕｓｅａｎｔｉｈｉｓｔａｇ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。且つ、洗浄後に、１：１００００で希釈したＨＲＰ－ＧｏａｔａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。そして、洗浄後にＴＭＢを加えて発色させ、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。また、グラフパッドプリズムｖ５．０アプリでデータ処理とグラフ作成及び分析を行い、細胞内のＣＬＤ１８Ａ２に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のＥＣ５０値を取得することで、ＣＬＤ１８Ａ２に対する抗体の親和性を反映した。結果は表３の通りであった。

実施例５：Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のヒト化
ヒト化の方法については、ＶｉｎｃｋｅＣらが構築したＶＨＨヒト化ユニバーサルフレームワーク移植法（ＶｉｎｃｋｅＣ，ＬｏｒｉｓＲ，ＳａｅｒｅｎｓＤ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＳ，ＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓＳ，ＣｏｎｒａｔｈＫ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００９；２８４（５）：３２７３-３２８４）を用いて完成させた。配列相同性に基づき設計を完了したユニバーサルヒト化ＶＨＨフレームワークｈ－ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡ（ＰＤＢ番号：３ＥＡＫ）について、対応するＣＤＲ領域をＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のＣＤＲ領域に置き換えるとともに、ＦＲ２領域の個々のアミノ酸をヒト化抗体ＤＰ－４７の配列に基づき更にヒト化した。これにより、各ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体について、少なくとも３種類のヒト化変異体をそれぞれ取得した。ヒト化前後の抗体配列については表４に示す通りであった。

実施例６：哺乳類細胞を用いたＡｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２関連抗体の作製
６．１Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体・Ｆｃ融合タンパク質（Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ）の発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列及びヒト化配列をそれぞれ鋳型とし、フォワードプライマーを５’－ｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｇａｔｃｃａｃｃｇｇｇｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｔｇｇａｇｔｃ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１７）、リバースプライマーを５’－ｇｃａｇｇａｃｔｔｇｇｇｃｔｃａｇａａｇａｃａｃｇｇｔｇａｃｃａｇｇｇｔｃｃｃｃｔｇｇｃｃ－３’（ＳＥＱＩＤＮＯ．１１８）として、ハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（安徽通用生物技術有限公司）を用いＰＣＲ増幅を行った。次に、ＰＣＲ産物を電気泳動し、約４００ｂｐほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したＰＣＲ産物を、シグナルペプチド及びヒトＩｇＧ１のＦｃ配列（アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．９１）を含むｐＣＤＮＡ３．１ベクターと組換え連結することで、Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体とヒトＩｇＧ１のＦｃとを融合した細胞発現プラスミドを作製した。また、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（バイオミガ社）を用い、抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体とヒトＩｇＧ１のＦｃとを融合した細胞発現プラスミドを抽出し、プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：３で均一に混合したあと３０ｍｉｎ間静置した。その後、これをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に加え、３７℃下において、５％ＣＯ_２の振とう培養機内で７日間培養してから、遠心分離後に上清を取得した。続いて、上清をｐＨ７．０に調節したあと、サンプルをＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）に加え、１００％０．１ＭＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて溶出した。溶出液は、１０％１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に予め投入した。そして、１００％の溶出液をコンダクタンス４ｍｓ／ｃｍとなるまで希釈し、ｐＨ５．５に調整したあと、遠心分離にかけた（８０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）。続いて、上清液をｐＨ５．０まで調整してからサンプルをＤＳＰクロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）に投入し、０～６０％の溶出液（２０ｍＭＮａＡｃ、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を線形溶出した。流速は２ｍｌ／ｍｉｎとし、１５ｍｉｎ間行った。

６．２陽性対照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０の発現及び精製
米国特許第９７５１９３４Ｂ２号における配列番号１１８の重鎖及び配列番号１２５の軽鎖で構成されるキメラ抗体（米国特許第９７５１９３４Ｂ２号における名称はｃｈ－１７５Ｄ１０）を対照抗体とし、そのアミノ酸配列における対応するポリヌクレオチド配列をｐＣＤＮＡ３．１ベクターと組換え連結した。そして、実施例６．１と同様の方法でＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションを行って、発現及び精製した。

６．３Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質と陽性対照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０
の集合体含有量の比較分析
Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃと対照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０の純度チェックのために、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶを用いて分析を行った。検出器はＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ、検出波長は２１４ｎｍ、流動相は１５０ｍＭｐＨ７．０ＰＢ＋５％イソプロパノール、クロマトグラフィーカラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ５／１５０ＧＬ、動作時間は１５分、カラム温度は２５℃とした。

表５の結果より、本発明におけるＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質のポリマーは、対照ｃｈ－１７５Ｄ１０よりも明らかに少なかった。

実施例７：Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質の機能鑑定
７．１ＣＬＤ１８Ａ２に対するＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質の親和性鑑定
Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質を１％ＢＳＡでそれぞれ段階希釈した。また、ＨＲＰ－Ｇｏａｔａｎｔｉ－ＨｕｍａｎＩｇＧＦｃ（Ｎｏｖｅｘ）二次抗体を１：２００００で希釈して使用した。残りの細胞ＥＬＩＳＡの方法は、実施例３．２の記載と同様とした。また、グラフパッドプリズムｖ５．０アプリでデータ処理とグラフ作成及び分析を行い、細胞内のＣＬＤ１８Ａ２に対するＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃの結合曲線とＥＣ５０値を取得することで、ＣＬＤ１８Ａ２に対する抗体の親和性を反映した。

結果は、図１に示した通り、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ１９Ｖ１－Ｆｃ、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－Ｆｃは、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－１９－Ｆｃの親和性に匹敵しており、陽性対照ｃｈ－１７５Ｄ１０よりも優れていた。また、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－１９－Ｆｃ、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ１９Ｖ１－Ｆｃ、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－Ｆｃ、ｃｈ－１７５Ｄ１０のＥＣ５０は、それぞれ０．７１ｎＭ、０．８２ｎＭ、０．４１ｎＭ、２．５９ｎＭであった。つまり、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２ナノ抗体をヒト化しても、親和性に顕著な変化は生じなかった。

７．２ＣＤＣ検出
健康なヒト由来の血清を補体源とし、６５℃で３０分間インキュベートしたものを不活化血清対照とした。ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２を１ウェルあたり５×１０^４個で９６ウェルマイクロプレートにプレーティングした。そして、検出対象のＡｎｔｉ－Ｃ１８．２
－Ｆｃ融合タンパク質、陰性対照（Ｆａｂ領域を含まないＩｇＧ１のＦｃフラグメント、アミノ酸配列ＳＥＱＮＯ．９１）及び陽性対照抗体ｃｈ－１７５Ｄ１０を培地で段階希釈したあと、９６ウェルマイクロプレートに加え、最終濃度を７５０ｎＭから段階的に０．０５ｎＭまで低下させた。次に、３７℃で３０分間インキュベートしたあと、５％の健康なヒト由来の血清又は不活化血清対照をそれぞれ加え、３７℃で４時間インキュベートした。そして、ＬＤＨ検出用試薬キット（東仁化学科技（上海）有限公司）の説明書に従ってＬＤＨ放出測定を行った。結果は図２及び図３に示した通りであった。

７．３ＡＤＣＣ検出
健康なドナー由来のヒトの血液を分離して得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を洗浄し、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加された１６４０培地で再懸濁した。次に、５％ＦＢＳ１６４０培地を用い、検出対象のＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－Ｆｃ融合タンパク質と陽性対照ｃｈ－１７５Ｄ１０を５００ｎＭまで希釈してから、５０μｌを９６ウェルマイクロプレートにそれぞれ加えた。続いて、ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２をそれぞれ５％ＦＢＳ１６４０培地を用いて洗浄及び再懸濁し、約２×１０^５／ｍｌの細胞密度としてから、対応する９６ウェルマイクロプレートに５０μｌずつ加えた。そして、再懸濁したＰＢＭＣ細胞を１００μｌ／ウェルで加え、ＰＢＭＣの細胞量を１ウェルあたり１×１０^５個、ＥＴ比を１０：１とした。これを３７℃のインキュベータで４時間インキュベートしたあと、ＬＤＨ検出用試薬キット（東仁化学科技（上海）有限公司）に従ってＬＤＨ放出量を測定した。結果は図４に示す通りであった。

７．４モデルマウスの腫瘍成長に対する融合タンパク質の抑制活性と、陽性対照及び陰性対照との比較
本実験では、患者由来の胃癌組織を用いて作製した異種移植片モデル（ｐａｔｉｅｎｔｌ
ｄｅｒｉｖｅｄｘｅｎｏｇｒａｆｔ，ＰＤＸ）の担癌マウスについて、融合タンパク質の抗腫瘍作用を測定した。各実験群が４～６匹のマウスとなるよう、大きさ１００ｍｍ^３程度の担癌マウスをランダムに群分けした。そして、腫瘍移植から１５ｄ後に異なるタンパク質及び異なる投与量で治療を行い、投与期間中に各群のマウスについて腫瘍体積及び体重の変化を監視測定した。投与頻度を２回／週とし、監視測定の頻度を２回／週として、５週間連続で監視測定した。また、投与量と投与方式については表６に示す通りとした。腫瘍体積の測定については、ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、下記の公式に従って腫瘍体積を計算した。
Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２

実験結果は図５に示す通りであった。時間の経過とともに、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ６Ｖ３－ＦｃとＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－Ｆｃを接種したマウスは、対照群に比べて腫瘍体積が良好に制御され、明らかな増加は見られなかった。つまり、Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ６Ｖ３－Ｆｃ及びＡｎｔｉＣ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－Ｆｃは明らかな腫瘍抑制作用を有していた。

実施例８：Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質のベクター作製及び発現、精製
８．１Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の配列設計
Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質は、ＣＬＤ１８Ａ２とＣＤ３を標的とする二重特異性ナノ抗体であり、Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２及びＡｎｔｉ－ＣＤ３ナノ抗体から構成される。Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の配列は本発明における配列とし、Ａｎｔｉ－ＣＤ３ナノ抗体の配列は文献の報告を参照した（国際公開第２０１６／１８０９８２号）。また、Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２及びＡｎｔｉ－ＣＤ３ナノ抗体は、ＧＳ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．１３２）により連結した。発現後の精製に有利となるよう、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質、Ａｎｔｉ－ＣＤ３ナノ抗体のＣ末端には６つのＨｉｓアミノ酸を連結した。

８．２Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質のベクター作製、発現及び精製Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質、Ａｎｔｉ－ＣＤ３ナノ抗体の配列は、通用生物系統（安徽）有限公司に最適な合成を依頼した。また、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ酵素切断産物と発現ベクターｐＰＩＣ９をＴ４リガーゼ（タカラ社）によって連結し、大腸菌のコンピテント状態であるＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換するとともに、アンピシリン耐性プレートに塗布して、インキュベータにおいて３７℃で一晩培養した。次に、アンピシリン耐性プレート上のクローンをそれぞれ抜き取り、プラスミドのシーケンシングを行うことで、ｐＰＩＣ９ベクターに対する配列の正確な挿入を特定した。そして、シーケンシングにより特定した発現プラスミドをピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換した。次に、ＭＤプレートから組換えクローンを抜き取って培養し、メタノールで発現を誘導した。一晩発現誘導した菌液は、４℃下において１２０００ｇで１０分間遠心分離したあと上清を取り、Ｎｉカラム（博格隆生物技術有限公司）を用いて精製することで、最終的なタンパク質純度を９０％以上とした。

実施例９：Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の機能鑑定
９．１Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の細胞結合特異性
Ｊｕｒｋａｔ（中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞バンクから購入）をＣＤ３陽性細胞とし、実施例１で作製したＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２をＣＬＤ１８Ａ２の陽性細胞とした。そして、本発明で作製及び発現したＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の細胞結合活性を測定した。

ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２及びＪｕｒｋａｔ細胞を１ウェルあたり５×１０^５個で９６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、精製したＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質、実施例４で作製したＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－６及びＡｎｔｉ－Ｃ１８．２－１９ナノ抗体、Ａｎｔｉ－ＣＤ３ナノ抗体を１％ＢＳＡで段階希釈したあと、ブロッキングした細胞にそれぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。また、この後の実験プロセスは実施例４．３と同様とした。グラフパッドプリズムｖ５．０アプリでデータ処理とグラフ作成を行って、ＣＨＯ－Ｓ－ＣＬＤ１８Ａ２、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の親和性の値を分析した。その結果、図６及び図７に示すように、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質は、ＣＬＤ１８Ａ２陽性細胞及びＣＤ３陽性細胞に対し良好な結合活性を有していた。ＣＬＤ１８Ａ２陽性細胞との結合状況については、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ６Ｖ３（ＳＥＱＩＤＮＯ．１３３）のＥＣ５０値が６．５０ｎＭ、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ１９Ｖ３（ＳＥＱＩＤＮＯ．１３４）のＥＣ５０値が４．６０ｎＭであった。また、ＣＤ３陽性細胞Ｊｕｒｋａｔ
との結合状況については、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ６Ｖ３のＥＣ５０値が９．３９ｎＭ、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ１９Ｖ３のＥＣ５０値が１０．３６ｎＭであった。

９．２Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質のＩｎｖｉｔｒｏ細胞殺傷測定
Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の細胞殺傷効果を評価するために、本発明では、Ｔ細胞（妙通生物社）をエフェクター細胞として細胞傷害性試験を行った。

Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質を段階希釈し、１ウェルあたり５０μｌを投入した。また、ＣＬＤ１８Ａ２及びＣＬＤ１８Ａ１安定トランスフェクション細胞をそれぞれ５％ＦＢＳ１６４０培地（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）で洗浄及び再懸濁し、約２×１０^５／ｍｌの細胞密度としてから、対応する９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり５０μｌ加えた。次に、健康なドナー由来のヒトＴ細胞を５％ＦＢＳ１６４０培地に再懸濁し、１ウェルあたり１×１０^５個投入してＥＴ比を１０：１とした。これを３７℃下においてインキュベータで４時間インキュベートしたあと、ＬＤＨ検出用試薬キット（東仁化学科技（上海）有限公司）に従ってＬＤＨ放出量を測定し、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の細胞殺傷効果を評価した。

Ｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害性実験において、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ６Ｖ３、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ１９Ｖ３は、ＣＬＤ１８Ａ２を高発現したＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２に対する殺傷効果が非常に顕著であり（図８）、ＥＣ５０値がそれぞれ２６．１５ｐＭ、２０．７３ｐＭであった。一方、ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ１細胞に対しては、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質に明らかな殺傷効果は見られなかった（図９）。つまり、Ｉｎｖｉｔｒｏ実験において、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質は、Ｔ細胞の関与下で、ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２細胞に対し特異的な殺傷効果を有しており、且つ、ＣＬＤ１８Ａ２を発現していない細胞に対しては基本的に非毒性であった。

９．３Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の腫瘍抑制活性
本発明では、患者由来の胃癌組織を用いて作製した異種移植片モデル（ｐａｔｉｅｎｔｌ
ｄｅｒｉｖｅｄｘｅｎｏｇｒａｆｔ，ＰＤＸ）の担癌ＮＳＧマウスについて、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質の腫瘍抑制作用を分析した。腫瘍が１００ｍｍ^３程度まで成長した時点で、担癌マウスをランダムに各群５匹となるよう群分けし、腹腔注射によって健康なヒト由来のＰＢＭＣ細胞を２×１０^７投与した。そして、１日後に、担癌マウスに対し５μｇ（２５μｇ／ｍｌ、２００μｌＰＢＳ）のＡｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３融合タンパク質を腹腔注射した。これを１日１回、４週間続け、腫瘍の体積を週に２回記録した。

実験結果の結果、図１０から明らかなように、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ６Ｖ３、Ａｎｔｉ－ＣＬＤＮ１８×ＣＤ３－ｈｕ１９Ｖ３は、移植腫瘍に対し明らかな成長抑制作用を有していた。また、時間の経過とともに、実験群の腫瘍体積は徐々に小さくなった。

実施例１０：ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に標的とするＶＨＨのキメラ抗原受容体への適用
本発明におけるＣＬＤ１８Ａ２を特異的に標的とするＶＨＨをキメラ抗原受容体の作製に適用した。表７には、作製したキメラ抗原受容体及びその構造を列挙している（抗原識別
領域－ヒンジ領域－膜貫通領域－細胞内シグナル領域。ただし、共発現したｅＧＦＰ構造については記載していない）。

１０．１特異的ＶＨＨを発現するためのレンチウイルスプラスミドベクターの作製
作製事例として、本発明では、第三世代自己不活化型レンチウイルスベクターシステムを使用した。当該システムは、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅから購入）、タンパク質Ｇａｇ／Ｐｏｌ及びＲｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅから購入）、及び、空ベクターｐＷＰＴ－ｅＧＦＰ（ａｄｄｇｅｎｅから購入）をベースに作製されるベクターであって、目的遺伝子ＣＡＲをコードする組換え発現ベクター、という３つのプラスミドを有している。本発明では、多種類のＶＨＨ配列を挿入して完全なＣＡＲ構造を作製しやすいよう、ｐＷＰＴ－ｅＧＦＰをベースに、特異的ＶＨＨを発現するためのレンチウイルスプラスミド汎用ベクターを作製した。また、目的遺伝子ＣＡＲをコードする組換え発現ベクターにＴ２Ａを用いることで、目的遺伝子ＣＡＲとｅＧＦＰの共発現を実現した。Ｔ２Ａは、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａｖｉｒｕｓ由来の２Ａペプチドであり、「自己スプライシング」機能を有しているため、上流と下流の遺伝子の共発現を実現可能である。また、ｅＧＦＰを検出することで、間接的にＣＡＲの発現を検出可能となる。

ＣＤ８シグナルペプチド及びＣＤ８ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ａ－ＣＤ２８ｂ－ＣＤ３－Ｔ２Ａ－ｅｇｆｐ構造を含む配列（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４１）を合成した。ＣＤ８シグナルペプチドとＣＤ８ｈｉｎｇｅの間には、ＶＨＨ又はその他の特異的識別配列を挿入するためのマルチクローニングサイトを挿入した。合成した配列は、両端のＭｌｕ１及びｓａｌＩ酵素切断部位を介して、同様に切断されたベクターｐＷＰＴ－ＧＦＰ（ａｄｄｇｅｎｅ）とＴ４リガーゼ（タカラ社）を介してライゲーションした。そして、ライゲーション産物をＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換し、アンピシリン耐性プレートに塗布して、クローンを抜き取ってから培養及びシーケンシングすることで、ＣＡＲＴ汎用ベクターｐＷＰＴ－ｘ－ＣＡＲ－２８Ｚを作製した。同様に、ＣＤ８シグナルペプチド及びＣＤ８ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ａ－ＣＤ２８ｂ－ＣＤ１３７－ＣＤ３－Ｔ２Ａ－ｅｇｆｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４２）を含むものを合成した。ＣＤ８シグナルペプチドとＣＤ８ｈｉｎｇｅの間には、ＶＨＨ又はその他の特異的識別配列を挿入するためのマルチクローニングサイトを挿入した。合成した配列は、両端のＭｌｕ１及びＳａｌＩ酵素切断部位を介して、同様に切断されたベクターｐＷＰＴ－ＧＦＰを挿入することで、ＣＡＲＴ汎用ベクターｐＷＰＴ－ｘ－ＣＡＲ－２８－１３７Ｚを作製した。

１０．２Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ＣＡＲを発現するレンチウイルスプラスミドの作製
Ａｎｔｉ－Ｃ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－Ｆｃを発現するプラスミドを鋳型とし、採用したプライマー対であるフォワードプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４３）とリバースプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４４）をハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（通用生物系統（安徽）有限公司）でＰＣＲ増幅させるとともに、ＰＣＲ産物を電気泳動にかけてゲルから切断・回収した。また、ＣＡＲＴ汎用ベクターｐＷＰＴ－ｘ－ＣＡＲ－２８Ｚを制限酵素ＮｄｅＩ（タカラ社）及びＰｓｔＩ（タカラ社）でダブルダイジェストし、電気泳動にかけてゲルから切断・回収した。次に、回収したＰＣＲ産物とベクターを組換え試薬キット（近岸蛋白質科技有限公司）により組換え連結し、ライゲーション産物をＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換するとともに、アンピシリン耐性プレートに塗布した。そして、クローンを抜き取って培養及びシーケンシングすることで、Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ＣＡＲレンチウイルスプラスミドｐＷＰＴ－ａＣ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－２８Ｚを作製した。また、同様にして、回収したＰＣＲ産物と、ＮｄｅＩ（タカラ社）及びＰｓｔＩ（タカラ社）でダブルダイジェストしたベクターｐＷＰＴ－ｘ－ＣＡＲ－２８－１３７Ｚを組換え連結することで、Ａｎｔｉ－ＣＬＤ１８Ａ２ＣＡＲレンチウイルスプラスミドｐＷＰＴ－ａＣ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－２８－１３７Ｚを作製した。以上の操作によって、ｐＷＰＴ－ａＣ１８．２－ｈｕ６Ｖ３－２８ＺとｐＷＰＴ－ａＣ１８．２－ｈｕ６Ｖ３－２８－１３７Ｚを作製した。

１０．３プラスミドトランスフェクション２９３Ｔパッケージングレンチウイルス
レンチウイルスのパッケージングについては、一般的な方法に従った。概略すると、細胞密度５×１０^６でＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を１０ｃｍのシャーレに移植し、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで一晩培養した。培地は、１０％ウシ胎児血清（ジブコ社）を含有するＤＭＥＭ（ジブコ社）とした。また、トランスフェクションの約２時間前に培養液を無血清ＤＭＥＭに交換した。細胞のトランスフェクション時には、ＣＡＲを発現するレンチウイルスプラスミドを使用するだけでなく、プラスミド（ウイルスの膜タンパク質及び構造タンパク質を提供する）ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．０Ｇを使用してコトランスフェクションさせる必要があった。このうち、目的配列ＣＡＲ又は空ベクターを発現するレンチウイルスプラスミドについては５μｇ、ｐｓＰＡＸ２については３．７５μｇ、ｐＭＤ２．０Ｇについては１．２５μｇ使用した。トランスフェクション時には、上記３種類のプラスミドの混合物を５００μｌのＭＥＭ培地に添加した。また、もう一つの小型遠沈管内で、２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（サーモフィッシャー社）を５００μＬのＭＥＭ培地に加えた。その後、希釈したトランスフェクション試薬を希釈後のプラスミドの上方に加え、均一に混合し、室温で２０分間静置したあと、プラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を１０ｃｍのシャーレに移して振り、均一に混合した。そして、これを３７℃のインキュベータに入れて、６時間後に１０％ウシ胎児血清のＤＭＥＭ培地に交換した。細胞のトランスフェクションから３日後に、ウイルスを取得可能となった。そこで、ウイルスを含む培養上清を遠沈管に移し、４℃下において１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することで細胞を除去した。その後、ウイルスを含む培地をフィルタリングして分包し、－８０℃で凍結保存した。次に、１０％ウシ胎児血清のＤＭＥＭにおいて、１×１０^５／ｍＬの細胞密度で、１００μＬ／ウェルのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を９６ウェル培養プレートに移植し、３７℃且つ５％ＣＯ_２で一晩培養した。そして、翌日、５０μＬ／ウェルの培養上清を捨て、５０μＬ／ウェルの新鮮な前記培養液を補充するとともに、最終濃度６μｇ／ｍＬのポリブレンを含ませて、３７℃且つ５％ＣＯ_２で３０ｍｉｎ間インキュベートした。続いて、これに１０μＬ／ウェルのウイルス原液を加え、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。そして、感染から４８ｈ後に、フローサイトメーターでｅＧＦＰを測定し、陽性率が５～２０％の細胞数を好
ましいとして、力価を計算したところ約２×１０^６Ｕ／ｍＬとなった。

実施例１１：ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞
１１．１ａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔの作製
健康なヒト由来の末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核細胞（上海妙通社）を取得して、ＣＤ３マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ）社）により説明書に従って分離した。次に、約１×１０^６／ｍＬの密度でＱｕａｎｔｕｍ００７リンパ球培養液（ＰＡＡＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＧｍｂＨ社から購入）を加えて培養するとともに、細胞：磁気ビーズの割合を１：１として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭＨｕｍａｎＴ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（サーモフィッシャー社）及び最終濃度１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２（上海近岸社）を加えて２４ｈ培養を刺激した。その後、ＭＯＩ≒５で前記組換えレンチウイルス（実施例１０．３）を使用してＴ細胞を感染させた。感染させた細胞は、１日置きに５×１０^５／ｍＬの密度で継代しつつ、リンパ球培養液に最終濃度１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２を加えた。そして、培養から８日目に、フローサイトメトリーで細胞を測定したところ、ｅＧＦＰとＣＡＲが共発現していたことから、ｅＧＦＰを検出した陽性細胞をキメラ抗原受容体発現陽性細胞とみなした。また、未感染のＴ細胞を陰性対照としたところ、異なるキメラ抗原受容体を発現したウイルス感染Ｔ細胞の陽性率は約６６．４％であった。

１１．２ａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔの殺傷実験
我々は、異なるａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、Ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２細胞及びＣＬＤ１８Ａ２陰性細胞株ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ１に対して奏する殺傷作用を観察した。ＥＴ比はそれぞれ３：１、１：１及び１：３とし、標的細胞の数は１００００／ウェルとした。各群には複数ウェルとして５つを設定し、５つのウェルの平均値を取得した。これらをいずれも１６ｈ培養したあと、ＬＤＨ検出用試薬キット（上海東仁社）を用いて上清のＬＤＨ含有量を測定することで殺傷評価を行った。その結果、表８に示したように、ＥＴ比を３：１とした場合に、特異性ａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＬＤ１８Ａ２発現陽性細胞を効果的に殺傷可能であったが、ＣＬＤ１８Ａ２陰性細胞についてはほとんど殺傷しなかった。以上の結果より、ａＣ１８．２－ＣＡＲ－ＴはＣＬＤ１８Ａ２陽性細胞を特異的に殺傷可能であるとともに、殺傷作用がＥＴ比と正の相関を示すことが明らかとなった。

１１．３Ｉｎｖｉｔｒｏのサイトカイン放出
ＣＬＤ１８Ａ２発現陽性細胞ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２とａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を１：１の割合で合わせて培養し、２４ｈ間インキュベートしたあと、培養上清を収集してから、ＩＬ－２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＴＮＦ－α（Ｒ＆ＤＳｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）及びＩＦＮ－γ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）をそれぞれ用い、試薬キットの説明書に従ってサイトカインを測定した。図１１の結果に示したように、ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２は、ａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔと合わせてインキュベートした場合に、陰性細胞ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ１と比べて、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ等のサイトカインの分泌が著しく高かった。

１１．４ａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔのｉｎｖｉｖｏ薬効学研究
ＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２を用いて皮下移植腫瘍モデルを作製した。３×１０^６個のＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下接種し、マウスの平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ^３になった時点で、１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔注射することでＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの免疫細胞を除去した。これにより、養子移植した遺伝子組換えＴ細胞が抗腫瘍機能をより良好に発揮できるようにした。翌日、尾静脈から１．０×１０^７個のａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞ａＣ１８．２－ｈｕ１９Ｖ３－２８－１３７Ｚを注射した。且つ、２８－１３７Ｚを発現するＭｏｃｋ群を対照とし、皮下移植腫瘍の成長を観察及び測定した。その結果、図１２に示すように、ａＣ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞はＮＵＧＣ－４－ＣＬＤ１８Ａ２移植腫瘍の成長を明らかに抑制可能であった。

以上述べたように、本発明は従来技術における様々な欠点を解消しており、高度な産業上の利用価値を有している。

上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明するものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。従って、当業者が本発明で開示した精神及び技術的思想から逸脱することなく完成させるあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれる。

Claims

抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体であって、前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、
（１）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１９で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３３で示されるＣＤＲ３、或いは、
（２）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．５で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２０で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３４で示されるＣＤＲ３、或いは、
（３）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．６で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２１で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３５で示されるＣＤＲ３。或いは、
（４）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．７で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２２で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３６で示されるＣＤＲ３、或いは、
（５）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．８で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２３で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３７で示されるＣＤＲ３、或いは、
（６）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．９で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２４で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３８で示されるＣＤＲ３、或いは、
（７）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１０で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ
ＩＤＮＯ．２５で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３６で示されるＣＤＲ３、或いは、
（８）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１１で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱ
ＩＤＮＯ．２６で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３９で示されるＣＤＲ３、を含む抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体。
前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体はフレームワーク領域ＦＲを含み、前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列で示されるＦＲ１～ＦＲ４として、
（１）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１２で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２７で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４０で示されるＦＲ４、或いは、
（２）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１３で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２８で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、或いは、
（３）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１４で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２９で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、或いは、
（４）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１５で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３０で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、或いは、
（５）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１６で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３１で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、或いは、
（６）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１３で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３１で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、或いは、
（７）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１７で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３０で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、或いは、
（８）アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２で示されるＦＲ１、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．１８で示されるＦＲ２、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．３２で示されるＦＲ３、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．４１で示されるＦＲ４、を含むことを特徴とする請求項１に記載のナノ抗体。
前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のアミノ酸配列は、
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４２～４９のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するものであって、ａ）で限定したアミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列、を含むことを特徴とする請求項１に記載のナノ抗体。
前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体はヒト化抗体であることを特徴とする請求項１に記載のナノ抗体。
前記抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６７～９０で示されることを特徴とする請求項４に記載のナノ抗体。
抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の融合タンパク質であって、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体における第１ドメインを含み、更に、体内半減期を延長するために用いられ、及び／又は、エフェクター細胞に対して結合作用を有する第２ドメインを含む融合タンパク質。
前記第２ドメインは、血清アルブミンフラグメント、ポリエチレングリコールフラグメント、ＨＳＡと結合するナノ抗体のうちの１又は複数の組み合わせを含み、
及び／又は、前記第２ドメインは免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、
及び／又は、前記第２ドメインは、Ｔ細胞上に存在するＣＤ３に対し親和性を有し、及び／又は、Ｔ細胞上に存在するＣＤ３と結合可能な分子を含むことを特徴とする請求項６に
記載の融合タンパク質。
前記Ｆｃ領域は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域から選択されることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
前記ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれ、前記エフェクター機能には、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性のうちの１又は複数の組み合わせが含まれ、
及び／又は、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのうちの１又は複数の組み合わせから選択され、前記ＩｇＧは、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの１又は複数の組み合わせから選択され、
及び／又は、前記免疫グロブリンのＦｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．９１～９５のいずれかから選択され、
及び／又は、前記第１ドメインと第２ドメインの間には連結ペプチドが設置されていることを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。
前記連結ペプチドは、アラニン及び／又はセリン及び／又はグリシンからなる柔軟なポリペプチド鎖から選択されることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
前記連結ペプチドの長さは３～４０個のアミノ酸であることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体をコードするか、請求項６～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、分離したポリヌクレオチド。
請求項１２に記載の分離したポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
抗体の発現システムであって、請求項１３に記載の発現ベクター、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現システム。
前記抗体の発現に適した条件において、請求項１４に記載の抗体の発現システムを培養することにより、前記抗体を発現し、前記抗体を精製・分離する、とのステップを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体、又は請求項６～１１のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤ１８Ａ２ナノ抗体の融合タンパク質の作製方法。
免疫複合体であって、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体、又は請求項６～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む免疫複合体。
前記免疫複合体は連結部を更に含み、前記連結部は、検出可能マーカー、細胞傷害性、放射性同位体、又は生物活性タンパク質のうちの１又は複数の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１６に記載の免疫複合体。
請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体、又は請求項６～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１６又は１７に記載の免疫複合体を含む検出用試薬キット。
請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体、又は請求項６～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１６又は１７に記載の免疫複合体を含む薬物組成物。
更に、薬学的に許容可能なベクターを含むことを特徴とする請求項１９に記載の薬物組成
物。
分離したポリペプチドであって、抗原識別領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記抗原識別領域は、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体を含む、分離したポリペプチド。
膜結合型の請求項２１に記載のポリペプチドを含み、Ｔ細胞、マクロファージ又はＮＫ細胞である細胞。
請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ抗体、又は請求項６～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１６に記載の免疫複合体、又は請求項１９或いは２０に記載の薬物組成物、又は請求項２１に記載のポリペプチド、又は請求項２２に記載の細胞の、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に関連する疾病を診断、治療又は予防するための薬物の製造における使用。
前記ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に関連する疾病は腫瘍から選択され、前記腫瘍は、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌及び胆嚢癌のうちの１又は複数の組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２３に記載の使用。