JP6938163B2 - 脂質組成物、その用途及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ｎ−３ドコサペンタエン酸（ｎ−３ＤＰＡ）を含む脂質組成物、その用途、及びその製造方法に関する。

多価不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ， ＰＵＦＡ）はヒト及び動物の栄養において重要な成分である。

ＰＵＦＡは、炭素鎖中の最初の二重結合の位置によってｎ−３（又はω−３）ＰＵＦＡ、ｎ−６（又はω−６）ＰＵＦＡ等に分類できる。ｎ−３ＰＵＦＡとしてはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５ｎ−３）、ｎ−３ドコサペンタエン酸（ｎ−３ＤＰＡ、Ｃ２２：５ｎ−３）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−３）等が知られている。ｎ−６ＰＵＦＡとしては、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４ｎ−６）、ｎ−６ドコサペンタエン酸（ｎ−６ＤＰＡ、Ｃ２２：５ｎ−６）等が知られている。

ｎ−３ＰＵＦＡとｎ−６ＰＵＦＡはヒト体内の代謝において相互に変換されることはないため、それぞれを摂取する必要がある。ｎ−３ＰＵＦＡとｎ−６ＰＵＦＡとは約１：４のバランスで摂取することが推奨されている（例えば特許文献１）。しかし今日の日本では、ｎ−３ＰＵＦＡとｎ−６ＰＵＦＡとが約１：１５〜１：２５の比率で摂取されており望ましいバランスとは言えない。

一方、ｎ−３ＰＵＦＡの１つであるＥＰＡは抗動脈硬化活性が知られている。ヒト体内に投与されたＥＰＡは血管内壁でｎ−３ＤＰＡに変換されることから、ｎ−３ＤＰＡはＥＰＡの抗動脈硬化活性の活性本体であると考えられる（非特許文献１〜３）。

ｎ−３ＤＰＡの従来の製造方法として、特許文献２には、哺乳類由来の脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を導入した形質転換体を培養する際の培地にＥＰＡを添加することで、ＥＰＡからｎ−３ＤＰＡを製造する方法が開示されている。非特許文献４には、有機化学的合成によりＥＰＡからｎ−３ＤＰＡを合成する方法が開示されている。特許文献３には、腹足類（マキガイ網）等の特定の軟体動物の軟体部又は卵から脂質を抽出しｎ−３ＤＰＡを構成脂肪酸として含む脂質成分を採取することが開示されている。

特許文献４には、実質的に遊離酸の形態の、少なくとも５０％（ａ／ａ）のＥＰＡと、実質的に遊離酸の形態の、少なくとも１５％（ａ／ａ）のＤＨＡと、実質的に遊離酸の形態の、少なくとも１％（ａ／ａ）のＤＰＡ（ｎ−３）とを含む医薬組成物が開示されている。

特許文献５には、ヒト患者において、トリグリセリドレベルをベースラインレベルから低減させる方法であって、１６０ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日のω−３ＤＰＡを含み、任意にＤＨＡを更に含み、ＤＨＡを含む場合はＤＨＡ：ｎ−３ＤＰＡが２：１を超えない組成物を投与する方法が開示されている。

特許文献６には、遺伝子を遺伝子工学的に破壊あるいは発現抑制することにより不飽和脂肪酸酸性能力が向上したストラメノパイルを得る形質転換方法を提供することが開示されている。ストラメノパイルとしてヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）等のラビリンチュラ類が例示されている。特許文献６の実施例８−６には、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＡＴＣＣ ３４３０４のＯｒｆＡ破壊株においてΔ４デサチュラーゼ遺伝子を破壊すると、Ｃ２２：５ｎ−６（ｎ−６ＤＰＡ）およびＣ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）がほとんど生合成されなくなり、Ｃ２２：４ｎ−６（ＤＴＡ）およびＣ２２：５ｎ−３（ｎ−３ＤＰＡ）が蓄積したことが開示されており、図６４には、生成された脂質の組成として、Ｃ２２：４ｎ−６（ＤＴＡ）が１１．０１％、Ｃ２２：５ｎ−３（ｎ−３ＤＰＡ）が１５．７６％、Ｃ２２：５ｎ−６（ｎ−６ＤＰＡ）が０．２１％、Ｃ２２：６ｎ−３（ＤＨＡ）が０．５１％であったことが開示されている。

特許文献７には、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸の体内への吸収性に優れ、常温でも油脂結晶が析出せずに加工し易く、風味の良い油脂組成物として、油脂組成物中の構成脂肪酸残基中、ｎ−３系多価不飽和脂肪酸を２０〜６０重量％、カプリル酸及び／又はカプリン酸を１０〜３０重量％、パルミチン酸を１５〜４０重量％含有し、２位に結合するパルミチン酸残基量／パルミチン酸残基総量（重量比）が０．４〜０．９５であり、油脂組成物全体中、結合する全ての脂肪酸がカプリル酸及び／又はカプリン酸であるトリグリセリドの含有量が１０重量％以下である油脂組成物が開示されている。

特開２０１４−１５９５７６号公報 特開２００３−１１６５６６号公報 特開２０１３−４０２３５号公報 ＵＳ２０１３／０２０９５５６ ＵＳ８，９０６，９６４ ＷＯ２０１２／０４３８２６ 特開２０１６−２０２００１号公報

Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓ．１９９４，１４（３），４７１ Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９９５，１４２（５），４６９ Ｐｒｏｓｔａｇ．Ｌｅｕｃｏｔｒ．Ｅｓｓ．１９９６，５４（５），３１９ Ｌｉｐｉｄｓ，２００６，１４４（２），１７２ Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２０１２，５３（８），１５４３ Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１５，１２５（１２），４５４４ Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． １９５９，３７（８），９１１ Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７，４８，１９９

本発明は、ｎ−３ＤＰＡ等のｎ−３ＰＵＦＡを含む脂質組成物、前記脂質組成物を含む医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物、前記脂質組成物の製造方法、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質の製造方法、及び、前記医薬組成物、前記食品組成物、前記飼料組成物又は前記餌料組成物の製造方法を提供する。

本発明は以下の発明を包含する。
（１）脂質組成物であって、
ＧＣ−ＦＩＤ（検出器として水素炎イオン化型検出器を用いたガスクロマトグラフィー）により分析したときに得られるクロマトグラムにおけるピーク面積比として、
脂肪酸成分の全量に対して、
メチルエステル換算で、
１０％以上のｎ−３ＤＰＡ（ｎ−３ドコサペンタエン酸）と、
３０％以上のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）と
を少なくとも含み、
ｎ−６多価不飽和脂肪酸の含有量が合計で１５％以下であり、
パルミチン酸の含有量が１０％以下であることを特徴とする脂質組成物。
（２）ＧＣ−ＦＩＤにより分析したときに得られるクロマトグラムにおけるピーク面積比として、メチルエステル換算で、１００部のＤＨＡに対して３０部以上のｎ−３ＤＰＡを含む、（１）に記載の脂質組成物。
（３）（１）又は（２）に記載の脂質組成物を含有する、医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物。
（４）脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物の製造方法であって、
オーランチオキトリウム属に属する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から脂質組成物を取得する脂質組成物取得工程と
を含み、
前記培養工程が、
開始時に炭素源を０．５質量％以上の濃度で含む培地中で前記微生物を培養して、前記微生物による炭素源の消費により前記培地中の炭素源を０．１質量％以下まで減少させる第１工程と、
炭素源の濃度が０．１質量％以下となった培地中で４８時間以上の培養を行う第２工程と含む、
前記方法。
（５）前記第１工程が、炭素源を０．５質量％以上の濃度で含む培地中で前記微生物を培養して、前記微生物により炭素源を消費させ、次いで、炭素源を０．５質量％以上の濃度となるように前記培地中に追加添加し、更に培養を行い前記微生物により炭素源を消費させることを含む、（４）に記載の方法。
（６）前記培養工程に用いる前記培地がアスコルビン酸及びイソアスコルビン酸から成る群から選ばれる一つ以上の成分を含むことを含む、（４）又は（５）に記載の方法。
（７）製造される前記脂質組成物が、（１）又は（２）に記載の脂質組成物である、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有するｎ−３ＤＰＡ含有脂質の製造方法であって、
（４）〜（７）のいずれかに記載の方法により脂質組成物を製造する脂質組成物製造工程と、
製造された前記脂質組成物からｎ−３ＤＰＡ含有脂質を分離する分離工程を含むことを特徴とする方法。
（９）脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有するｎ−３ＤＰＡ含有脂質の製造方法であって、
（１）又は（２）に記載の脂質組成物からｎ−３ＤＰＡ含有脂質を分離する分離工程を含むことを特徴とする方法。
（１０）脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物を含有する医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物の製造方法であって、
（４）〜（７）のいずれかに記載の方法により脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物を製造する脂質組成物製造工程と、
製造された前記脂質組成物を配合する配合工程と
を含むことを特徴とする方法。
（１１）脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有するｎ−３ＤＰＡ含有脂質を含有する医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物の製造方法であって、
（４）〜（７）のいずれかに記載の方法により脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物を製造する脂質組成物製造工程と、
製造された前記脂質組成物からｎ−３ＤＰＡ含有脂質を分離する分離工程と、
分離された前記ｎ−３ＤＰＡ含有脂質を配合する配合工程と
を含むことを特徴とする方法。
（１２）Ｄ４２−１６６２５（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２３２４）。

本発明によれば、ｎ−３ＤＰＡ等のｎ−３ＰＵＦＡを含む脂質組成物、前記脂質組成物を含む医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物、前記脂質組成物の製造方法、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質の製造方法、及び、前記医薬組成物、前記食品組成物、前記飼料組成物又は前記餌料組成物の製造方法が提供される。

＜１．脂質及び脂質組成物＞
本発明において脂質は、少なくとも脂肪酸成分を含む親油性化合物の総称であり、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、脂肪酸モノグリセリド、リン脂質等を含む。

本発明において脂質組成物とは、１種以上の脂質を含む組成物を指し、２種以上の脂質を含んでいてもよく、他の成分を更に含んでいてもよい。

＜２．脂質組成物の特徴＞
本発明の一態様は、
脂肪酸成分の全量を基準として、
メチルエステル換算で、
１０％以上のｎ−３ＤＰＡと、
３０％以上のＤＨＡと
を少なくとも含み、
ｎ−６ＰＵＦＡの含有量が合計で１５％以下であり、
パルミチン酸の含有量が１０％以下であることを特徴とする脂質組成物に関する。以下、この態様に係る脂質組成物を「本発明の脂質組成物」と称する。

本明細書において、本発明の脂質組成物における脂肪酸の割合（％）は、特に明示しない限り、脂質組成物の脂肪酸をメチルエステル化して得た試料をＧＣ−ＦＩＤ（検出器として水素炎イオン化型検出器を用いたガスクロマトグラフィー）により分析したときに得られるクロマトグラムにおけるピーク面積比としての、メチルエステル換算での、脂肪酸成分の全量に対する所定の脂肪酸の割合を意味する。脂質組成物中の脂肪酸組成の分析は次の方法で行うことができる：培養液を遠心分離により集菌し、破砕を行った後Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（非特許文献７）により抽出する。抽出された脂質組成物をメチルエステルに変換して得た試料を、ＧＣ−ＦＩＤにより脂肪酸組成を分析する。ＧＣ−ＦＩＤの具体的な条件としては、実施例に記載の条件が例示できる。

本発明の脂質組成物で「ｎ−６ＰＵＦＡの含有量が合計で１５％以下」とは、ｎ−６ＰＵＦＡが含まれていない、又は、含まれていた場合であってもその含有量が１５％以下であることを意味する。

同様に本発明の脂質組成物で「パルミチン酸の含有量が１０％以下」とは、パルミチン酸が含まれていない、又は、含まれていた場合であってもその含有量が１０％以下であることを意味する。

本明細書では同様に、ある成分の含有量が所定の上限値以下であることのみを規定する場合、その成分が含まれていない、又は、含まれていた場合であってもその含有量が上限値以下であることを意味する。

本発明の脂質組成物は、ｎ−３ＰＵＦＡとして、１０％以上のｎ−３ＤＰＡと、３０％以上のＤＨＡとを少なくとも含むことから、少なくとも４０％以上のｎ−３ＰＵＦＡを含む。ｎ−６ＰＵＦＡの含有量は合計で１５％以下である。すなわち本発明の脂質組成物はｎ−３ＰＵＦＡをｎ−６ＰＵＦＡの２．６倍以上の量で含む。本発明の脂質組成物を摂取することで、ｎ−６ＰＵＦＡに偏りがちなｎ−３ＰＵＦＡとｎ−６ＰＵＦＡとのバランスを是正することができる。また、本発明の脂質組成物を摂取することで、有益な生理作用が知られているｎ−３ＤＰＡとＤＨＡを効率的に摂取することができる。このため本発明の脂質組成物は医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物に配合する成分として有用である。

本発明の脂質組成物では、ｎ−３ＤＰＡの含有量がより好ましくは１５％以上であり、より好ましくは２０％以上であり、より好ましくは２４％以上である。本発明の脂質組成物においてｎ−３ＤＰＡの含有量がこの範囲である場合、本発明の脂質組成物を摂取することにより効率的にｎ−３ＤＰＡ及びｎ−３ＰＵＦＡを摂取することができる。メチルエステル換算でのｎ−３ＤＰＡの含有量の上限は特に限定されないが、通常は５０％以下、４８％以下、又は、４６％以下である。

本発明の脂質組成物では、ＤＨＡの含有量がより好ましくは３５％以上であり、より好ましくは４０％以上である。本発明の脂質組成物においてＤＨＡの含有量がこの範囲である場合、より効率的にＤＨＡ及びｎ−３ＰＵＦＡを摂取することができる。メチルエステル換算でのＤＨＡの含有量の上限は特に限定されないが、通常は６５％以下、６０％以下、又は、５５％以下である。

本発明の脂質組成物は、ＧＣ−ＦＩＤにより分析したときに得られるクロマトグラムにおけるピーク面積比として、メチルエステル換算で、１００部のＤＨＡに対して好ましくは３０部以上、より好ましくは４０部以上、より好ましくは５０部以上のｎ−３ＤＰＡを含む。ＤＨＡに対するｎ−３ＤＰＡの含有量がこの範囲である脂質組成物は、ｎ−３ＤＰＡが持つ抗動脈硬化活性等の有利な生理活性を効果的に奏することができる。

本発明の脂質組成物において、ｎ−６ＰＵＦＡの含有量は合計で１５％以下であり、ｎ−６ＰＵＦＡが含まれていなくてもよい。ｎ−６ＰＵＦＡは、ｎ−６ドコサペンタエン酸（ｎ−６ＤＰＡ）等の、炭素数が１６〜２４であり不飽和結合が２〜６個のｎ−６ＰＵＦＡであり、具体的には、リノール酸（ＬＡ、１８：２）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３）、カレンド酸（１８：３（ＧＬＡの１２位幾何異性体））、ｎ−６エイコサジエン酸（ＥＤＡ，２０：２）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３）、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４）、ｎ−６ドコサジエン酸（ＤＤＡ，２２：２）、アドレン酸（２２：４）、ｎ−６ＤＰＡ（２２：５）、ｎ−６テトラコサテトラエン酸（２４：４）、テトラコサペンタエン酸（２４：５）の１１種を含む。ｎ−６ＰＵＦＡの含有量が上記の範囲であることにより、本発明の脂質組成物にはｎ−３ＰＵＦＡがｎ−６ＰＵＦＡの２．６倍以上含まれることとなるため好ましい。ｎ−６ＰＵＦＡの個別の脂肪酸の含有量は特に限定されないが、例えば、本発明の脂質組成物におけるｎ−６ＤＰＡの含有量が１５％以下、又は１２％以下であることができる。

本発明の脂質組成物は、典型的には、ｎ−６ＰＵＦＡの一種であるアラキドン酸（ＡＲＡ）、リノール酸（ＬＡ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）を含有しない。

本発明の脂質組成物において、パルミチン酸の含有量は１０％以下であり、パルミチン酸が含まれていなくてもよい。パルミチン酸の含有量はより好ましくは８％以下であり、より好ましくは６％以下である。本発明の脂質組成物は、パルミチン酸の含有量がこの範囲であることにより、飽和脂肪酸により誘導される小胞体ストレスが原因となる血管石灰化を予防することができる（非特許文献５、６）。本発明の脂質組成物では、より好ましくは、パルミチン酸を含む飽和脂肪酸の含有量が合計で１６％以下であり、飽和脂肪酸が含まれていなくてもよい。

本発明の脂質組成物は、ｎ−３ＤＰＡ及びＤＨＡ以外の他のｎ−３ＰＵＦＡを含んでいてもよい。他のｎ−３ＰＵＦＡとしてはＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）が例示できる。本発明の脂質組成物におけるＥＰＡの含有量としては、例えば１０％以下、８％以下、６％以下、又は５％以下であることができる。

本発明の脂質組成物は、より好ましくは、
脂肪酸成分の全量を基準として、
メチルエステル換算で、
１０％以上５０％以下のｎ−３ＤＰＡと、
３０％以上６５％以下のＤＨＡと
を少なくとも含み、
ｎ−６ＰＵＦＡの含有量が合計で１５％以下であり、
パルミチン酸の含有量が１０％以下であり、
ＥＰＡの含有量が１０％以下である。

各脂肪酸の更に好ましい範囲は、各脂肪酸について上記した範囲にそれぞれ限定することができる。
例えば、本発明の脂質組成物は、
脂肪酸成分の全量を基準として、
メチルエステル換算で、
２０％以上５０％以下のｎ−３ＤＰＡと、
３５％以上６０％以下のＤＨＡと
を少なくとも含み、
ｎ−６ＰＵＦＡの含有量が合計で１５％以下であり、
パルミチン酸の含有量が８％以下であり、
ＥＰＡの含有量が６％以下であることができる。

＜３．医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物＞
本発明の他の一態様は、
上記の本発明の脂質組成物を含有する、医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物に関する。

本発明の医薬組成物は、上記の本発明の脂質組成物と、医薬として許容される１以上の他の成分とを配合して調製することができる。本発明の医薬組成物は固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよい。本発明の医薬組成物は好ましくは経口摂取される形態の医薬組成物である。本発明の医薬組成物における、本発明の脂質組成物の配合量は特に限定されないが、例えば、本発明の脂質組成物を、ｎ−３ＤＰＡをメチルエステル換算で１〜５０質量％含むように配合することができる。

本発明の食品組成物は、上記の本発明の脂質組成物と、食品として許容される１以上の他の成分とを配合して調製することができる。本発明の食品組成物は固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよい。本発明の食品組成物は栄養補助食品として利用することができる。本発明の食品組成物における、本発明の脂質組成物の配合量は特に限定されないが、例えば、本発明の脂質組成物を、ｎ−３ＤＰＡをメチルエステル換算で１〜５０質量％含むように配合することができる。

本発明の餌飼料組成物は、上記の本発明の脂質組成物と、非ヒト動物用の餌飼料として許容される１以上の他の成分とを配合して調製することができる。本発明の餌飼料組成物は固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよい。本発明の餌飼料組成物における、本発明の脂質組成物の配合量は特に限定されないが、例えば、本発明の脂質組成物を、ｎ−３ＤＰＡをメチルエステル換算で１〜５０質量％含むように配合することができる。

＜４．脂質組成物の製造方法＞
本発明の他の一態様は、
脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物の製造方法であって、
オーランチオキトリウム属に属する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から脂質組成物を取得する脂質組成物取得工程と
を含み、
前記培養工程が、
開始時に炭素源を０．５質量％以上の濃度で含む培地中で前記微生物を培養して、前記微生物による炭素源の消費により前記培地中の炭素源を０．１質量％以下まで減少させる第１工程と、
炭素源の濃度が０．１質量％以下となった培地中で４８時間以上の培養を行う第２工程とを含む、
前記方法に関する。

本発明者らは、オーランチオキトリウム属に属する微生物は、通常の培養条件では生成する脂質に占めるｎ−３ＤＰＡ含有脂質の割合は小さいのに対して、炭素源の飢餓ストレスを与える条件にて培養を行う場合にはｎ−３ＤＰＡ含有脂質の割合が顕著に高まるという驚くべき知見に基づき、本発明のｎ−３ＤＰＡ含有脂質組成物製造方法を完成させるに至った。

本発明のｎ−３ＤＰＡ含有脂質組成物製造方法に用いる、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物は、前記培養工程を行ったときに、前記第１工程において、培地中の炭素源の濃度が０．１質量％となった時点での前記微生物体中の脂質組成物における脂肪酸成分に占めるｎ−３ＤＰＡの含有率（メチルエステル換算でのＧＣ−ＦＩＤ分析でのクロマトグラムにおけるピーク面積比を指す。以下同じ）と比較して、前記第２工程終了時点での前記微生物体中の脂質組成物における脂肪酸成分に占めるｎ−３ＤＰＡの含有率が高くなる性質を示す微生物であればよく、より好ましくは、前記第１工程において、培地中の炭素源の濃度が０．１質量％となった時点での前記微生物体中の脂質組成物における脂肪酸成分に占めるｎ−３ＤＰＡの含有率と比較して、前記第２工程終了時点での前記微生物体中の脂質組成物における脂肪酸成分に占めるｎ−３ＤＰＡの含有率が５倍以上、より好ましくは１０倍以上となる微生物であり、より好ましくは、前記第２工程終了時点での前記微生物体中の脂質組成物として、メチルエステル換算で１０％以上のｎ−３ＤＰＡを脂肪酸成分として含有する脂質組成物を生産する能力を有する微生物である。

本発明で用いるオーランチオキトリウム属に属し、ｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物を生産する能力を有する微生物の好ましい具体例としては、オーランチオキトリウム ｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）に分類される微生物株Ｄ４２−１６６２５（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２３２４）が例示できる。

本発明において、前記微生物株は、その変異株であって、ｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物を生産する能力を有する変異株も包含する概念である。前記微生物株の変異株は、前記微生物株に変異誘発処理を施して得られる変異株である。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで「変異原」なる語は、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、適切であれば、他の変異原も使用され得る。

微生物がオーランチオキトリウム属に属することは以下の指標によって判断することができる：顕微鏡観察により細胞壁が薄く、球状で橙色の形状をしており、外質ネットが未発達である、色素としてアスタキサンチン、フェニコキサンチンを含み、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を主な脂肪酸成分として含むトリグリセリドを油滴として蓄積する（非特許文献８）。より具体的には、栄養豊富な培地で培養した時、脂肪酸成分としてメチルエステル換算でＤＨＡを約４０％、パルミチン酸を約３０％、ｎ−６ＤＰＡを約５％含む脂質を細胞内に油滴として蓄積する微生物である。

前記第１工程では、開始時に炭素源を０．５質量％以上の濃度で含む培地中で前記微生物を培養して、前記微生物による炭素源の消費により前記培地中の炭素源を０．１質量％以下まで減少させる。

このとき、培地としては炭素源を少なくとも含む液体培地または固体培地（寒天培地等）を使用することができる。

第１工程の開始時における炭素源の濃度は培地中０．５質量％以上であれば特に限定されず、例えば０．５〜２０質量％、又は、１．０〜１０質量％が適当である。また、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース等の糖類、グリセロール等のアルコール類を用いることができる。これらの炭素源は２種以上組み合わせて用いてもよい。

第１工程では、前記微生物により炭素源を消費させて培地中の炭素源を減少させる。このとき培地中の炭素源の濃度を０．１質量％以下まで減少させる。

第２工程では、第１工程により炭素源の濃度が０．１質量％以下となった状態で更に４８時間以上、より好ましくは７２時間以上、より好ましくは９６時間以上、より好ましくは１２０時間以上、培養する。

第１工程及び第２工程を含む培養工程の時間は初期炭素源濃度に依存するが、全体で１１日間以下、例えば４〜１１日間が適当である。培養工程において、培養温度は１６〜３７℃が適当である。培地の初期ｐＨは３．０〜１２．０、好ましくは３．０〜１０．０、更に好ましくは６．０〜９．５が適当である。培養は静置で行ってもよく、振盪培養、撹拌を行ってもよい。

前記培地は窒素源を更に含むことが好ましい。窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆かす等の天然窒素源、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素源、並びに、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源から選択される１種以上を使用できるが、これらに限られるものではない。

培地は更に天然海水塩又は人工海水塩を含むことが好ましい。天然海水塩又は人工海水塩を培地中に含む場合、その濃度は特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム濃度が０．５％〜４．１％となる量の天然海水塩又は人工海水塩を含む培地が例示できる。

前記培地は更に必要に応じて、硫酸鉄、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸塩、並びにビタミン類から選択される１種以上の他の栄養成分を含有してもよい。

本発明の方法では、より好ましくは、前記第１工程が、炭素源を０．５質量％以上の濃度で含む培地中で前記微生物を培養して、前記微生物により炭素源を消費させ、次いで、炭素源を０．５質量％以上の濃度となるように前記培地中に追加添加し、更に培養を行い前記微生物により炭素源を消費させることを含む。追加添加を行うことにより、ｎ−３ＤＰＡを含む本発明の脂質組成物の生成量を高めることができる。

ここで「炭素源を０．５質量％以上の濃度で含む培地」は、第１工程の開始時の培地であってもよいし、炭素源の追加添加を複数回行う場合には、前回の追加添加で炭素源が添加された培地であってもよい。追加添加はＮ回（ここでＮは１以上の整数）行うことができ、Ｎが２以上の場合は、第（ｎ−１）回（ｎは２〜Ｎ）の炭素源の追加添加の後、前記微生物により炭素源を消費させてから、第ｎ回の追加添加を行い、更に前記微生物により炭素源を消費させる。

最後の第Ｎ回の追加添加の後、前記微生物による炭素源の消費により前記培地中の炭素源を０．１質量％以下まで減少させ、炭素源の濃度が０．１質量％以下となった培地中で更に、第２工程として、好ましくは４８時間以上、より好ましくは７２時間以上、より好ましくは９６時間以上、より好ましくは１２０時間以上、培養する。追加添加を行う場合も、第１工程及び第２工程を含む培養工程の時間は全体で１１日間以下、例えば４〜１１日間が適当であり、培養温度は１６〜３７℃が適当である。培地の初期ｐＨは３．０〜１２．０、好ましくは３．０〜１０．０、更に好ましくは６．０〜９．５が適当である。培養は静置で行ってもよく、振盪培養、撹拌を行ってもよい。

炭素源の第１回〜第Ｎ回の追加添加では、直前の培地中の炭素源の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．１質量％以下である。

第１回〜第Ｎ回の追加添加での、炭素源の添加量は特に限定されないが、好ましくは、培地中の炭素源が０．５質量％以上の濃度となるように添加し、より好ましくは、培地中の炭素源が０．５〜２０質量％、又は、１．０〜１０質量％の濃度となるように添加する。追加添加する炭素源の種類は、培養開始時の培地中の炭素源と同様の範囲から選択することができる。

第１工程及び第２工程を含む培養工程では培地に更にアスコルビン酸かイソアスコルビン酸を配合することが好ましい。本発明者らはアスコルビン酸かイソアスコルビン酸の存在下において培養工程を行うと、前記微生物により生成される脂質組成物中におけるｎ−３ＤＰＡの含有率が顕著に向上するという驚くべき効果を見出した。アスコルビン酸、イソアスコルビン酸の濃度としては、培地中０．５〜１．５質量％が適当である。アスコルビン酸、イソアスコルビン酸の形態は特に限定されず、遊離体でもよいしナトリウム等のアルカリ金属との塩でもよい。

脂質組成物取得工程では、培養工程で得られた培養物から脂質組成物を取得する。
ここで培養物とは、培養により得られた、微生物体と培地との混合物である。培養物は殺菌処理されたものであってもよいし、殺菌処理されていないものであってもよい。

培養物から脂質組成物を取得する方法は特に限定されない。典型的には、前記培養物を遠心分離、濾過等の固液分離手段により分離して微生物体を採取し、採取した微生物体から脂質組成物を取得する。採取した微生物体は更に水洗、乾燥及び破砕から選択される１以上の処理を施してもよい。微生物体の乾燥は凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。微生物体の破砕は、ミルによる処理（例えばガラスビーズを用いたビーズミルによる処理）、超音波処理等によって行うことができる。

採取した微生物体から脂質組成物を取得する方法は特に限定されないが、好ましくは、前記微生物体から、脂質組成物を有機溶媒によって抽出する。有機溶媒を用いた抽出方法としては、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法が例示できる（非特許文献７）。使用できる有機溶媒としては、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で用いるクロロホルム又はクロロホルム／メタノール混合溶媒や、ノルマルヘキサンが例示できる。抽出物から減圧下で溶媒を留去することにより、高濃度の脂質組成物が得られる。

また、前記培養工程で得られた培養物から脂質組成物を分離することは必須ではなく、脂質組成物を含む前記培養物自体やその処理物（乾燥物、濃縮物、破砕物等）を、脂質組成物の用途に利用してもよい。

本発明のｎ−３ＤＰＡ含有脂質組成物製造方法で製造される脂質組成物は、脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを少なくとも含有し、好ましくはＤＨＡを更に含有する。より好ましくは、本発明のｎ−３ＤＰＡ含有脂質組成物製造方法で製造される脂質組成物は、上記の本発明の脂質組成物である。

＜５．ｎ−３ＤＰＡ含有脂質の製造方法＞
本発明の他の一態様は、
脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有するｎ−３ＤＰＡ含有脂質の製造方法であって、
脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物から、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質を分離する分離工程を含むことを特徴とする方法に関する。

ｎ−３ＤＰＡ含有脂質は、ｎ−３ＤＰＡ成分を分子内に含む脂質化合物であり、遊離脂肪酸のｎ−３ＤＰＡ、アシル鎖としてｎ−３ＤＰＡ成分を１つ以上含む脂肪酸トリグリセリド、アシル鎖としてｎ−３ＤＰＡ成分を１つ以上含む脂肪酸ジグリセリド、アシル鎖としてｎ−３ＤＰＡ成分を含む脂肪酸モノグリセリド、アシル鎖としてｎ−３ＤＰＡ成分を１つ以上含むリン脂質、ｎ−３ＤＰＡの低級アルコールエステル等を包含する。

脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物から、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質を分離する方法は特に限定されない。例えば、脂肪酸成分としてｎ−３ＤＰＡを含有する脂質組成物を、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル等のように、脂質組成物中の脂肪酸成分をアルコールによりエステル化し、得られた脂肪酸エステルからｎ−３ＤＰＡエステルをクロマトグラフィー又は蒸留により分離する方法が使用できる。

分離工程により得られたｎ−３ＤＰＡ含有脂質は、他の成分と配合して、医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物の形態とすることができる。

製造される医薬組成物は固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよく、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質の配合量は特に限定されないが、例えば、ｎ−３ＤＰＡをメチルエステル換算で１〜５０質量％含むように配合することができる。

製造される食品組成物は固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよく、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質の配合量は特に限定されないが、例えば、ｎ−３ＤＰＡをメチルエステル換算で１〜５０質量％含むように配合することができる。

製造される餌飼料組成物は固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよく、ｎ−３ＤＰＡ含有脂質の配合量は特に限定されないが、例えば、ｎ−３ＤＰＡをメチルエステル換算で１〜５０質量％含むように配合することができる。

＜１．オーランチオキトリウム属微生物＞
後述する実験ではオーランチオキトリウム属に属する微生物の株として、「Ｄ４２−１６６２５」を用いた。本株は、１８ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列に基づいてオーランチオキトリウム属微生物に分類された微生物株に由来する変異株であり、形態及び代謝産物の特徴から、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に分類される。

また、本株を、表１に示す組成の液体培地中で、２８℃の温度条件下、３００ｒｐｍの振盪速度で４８時間振盪培養を行った。培養された微生物体の凍結乾燥物の脂質を、後述する方法でメチルエステルに変換しガスクロマトグラフィーにより分析したところ、クロマトグラフにおけるピーク面積比（３回の培養物からの平均値）は表２のようになった。本株は、脂肪酸としてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を約４０％、パルミチン酸を約３０％、ｎ−６ＤＰＡを約５％生産することから、オーランチオキトリウム属微生物であることが裏付けられた。

本株は、オーランチオキトリウム ｓｐ．（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）に分類され、識別の表示「Ｄ４２−１６６２５」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２３２４が付与されている（受託日：平成２９年（２０１７年）１月６日）。

＜２．培養と脂質抽出＞
（１）培養
上記の表１に示す液体培地を調製し、試験管に分注して、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）を施した。

各試験管内の前記液体培地に本株を植菌し、２８℃の温度条件下、３００ｒｐｍの振盪速度で振盪培養を行った。

前記液体培地は、培養開始時には１．９質量％の炭素源（グルコース）を含む。
培養時間は最長で１６８時間とした。

一部の実験では、前記液体培地に、培養開始から４８時間後又は７２時間後の時点で炭素源（グルコース又はグリセロール）を添加し、更に培養を続けた。

一部の実験では、培養開始前の前記液体培地中に、１質量％のアスコルビン酸ナトリウム又はイソアスコルビン酸ナトリウムを更に添加したものを液体培地として用いた。
試験１〜７の試験条件は以下の通り。

（２）脂質抽出
所定時間経過後の培養液を遠心分離し、上清を除去して微生物体を単離した。
単離した前記微生物体を、ガラスビーズを用いたビーズミルによる粉砕処理により粉砕した。
微生物粉砕物から、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（非特許文献７）により脂質を抽出した。

（３）脂質分析
上記の脂質のＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法による抽出液を濃縮乾固し、メタノールと１規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて脂肪酸成分をメチルエステルへと変換した。１規定塩酸により中和した後、クロロホルムにより脂肪酸メチルエステルを抽出し、下記条件の、検出器として水素炎イオン化型検出器を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）により分析した。また、ガスクロマトグラフィーで分離した成分中の脂肪酸の分析のために、必要に応じて更に質量分析（ＭＳ）を行った。

上記条件で得られるＧＣ−ＦＩＤのクロマトグラムにおける、検出された全成分（全て脂肪酸メチルエステルと推定される）のピーク面積の合計に対する、各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の割合（％）を求めた。

各脂肪酸メチルエステルの同定は、市販の既知試料との対比及び質量分析（ＭＳ）のパターンと公知情報との対比により行った。

試験１〜３では、培養開始１６８時間後の脂質組成を上記手順により分析した。
試験４、５では培養開始７２時間後と、培養開始７２時間後でのグルコース追加後更に９６時間培養後の脂質組成を上記手順により分析した。

試験６では培養開始４８時間後、７２時間後、１６８時間後の脂質組成を上記手順により分析した。

試験７では培養開始４８時間後と、培養開始４８時間後でのグルコース追加後更に２４時間、４８時間、９６時間培養後の脂質組成を上記手順により分析した。

更に、試験４、５、６、７では、トリコサンを内部標準物質として培養終了後の培養物中のｎ−３ＤＰＡ（メチルエステル換算）の濃度を求めた。

（４）分析結果
試験１〜５の分析結果を表５に示す。
試験６、７の分析結果を表６に示す。

表５、６において、各脂肪酸メチルエステルの割合（％）は、検出された全成分（全て脂肪酸メチルエステルと推定される）のピーク面積の合計に対する割合である。表５、６では、脂肪酸メチルエステルの割合の数値の見た目の合計が１００％でない場合があるが、これは各数値を四捨五入して示している結果である。

なお、抽出された脂質は、既述の１１種のｎ−６ＰＵＦＡのうち、ｎ−６ＤＰＡ及びアドレン酸を表５、６に示す比率で含むこと、並びに、アラキドン酸、リノール酸、γ−リノレン酸を含まないことが確認された。また表５、６において「その他、ｎ−３， ｎ−７」は、標準物質や公知情報との対比から、ｎ−３ＰＵＦＡ又はｎ−７ＰＵＦＡであることが特定された成分であり、「その他、飽和」は、標準物質や公知情報との対比から、飽和脂肪酸であることが特定された成分である。

（５）炭素源濃度の分析
試験１〜７において培地中のグルコース濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、検出波長ＵＶ５０５ｎｍ）で測定した。なお、培養開始時の培地中のグルコース濃度は上記の通り１．９質量％である。

試験１〜７では、培養開始２４時間後の培地中のグルコース濃度は１．２〜１．９質量％の範囲であり、かなりばらつきがあるものの、培養開始２４時間後ではグルコースは枯渇しておらず十分量存在することが分かる。一方、培養開始４８時間後の培地中のグルコース濃度は、試験１〜７のいずれでも、０．１質量％以下であった。このことから、本株の培養開始から４８時間でグルコースは枯渇することが分かる。

試験１〜３は、初期のグルコースが枯渇したと考えられる培養開始４８時間後から更に１２０時間（合計で１６８時間）培養した例であり、表５に示す通り、ｎ−３ＤＰＡ比が顕著に高い脂質組成物を生じた。

試験４、５は、本株の培養開始７２時間後に炭素源を追加添加し、追加添加後更に９６時間（合計で１６８時間）培養した例であり、表５に示す通り、ｎ−３ＤＰＡ比が顕著に高い脂質組成物を生じた。また、培養物中のｎ−３ＤＰＡの濃度が顕著に高い値であった。

１６８時間培養した試験１、２におけるｎ−３ＤＰＡ比が２４．４％、４５．２％であったのに対して、４８時間培養した場合は表２に示すようにｎ−３ＤＰＡ比が１．５％であった。このことから、本株を飢餓条件下で継続して培養することにより脂質中のｎ−３ＤＰＡ比が顕著に上昇することが示された。

試験６、７はともに、培地中のグルコース濃度が培養開始４８時間後に０．１質量％以下であった例である。

表６に示すように、試験６では、グルコースが枯渇したと考えられる培養開始４８時間後から更に２４時間（合計７２時間）培養した時にｎ−３ＤＰＡ比の上昇が認められ、培養開始４８時間後から更に１２０時間（合計１６８時間）培養したときに、ｎ−３ＤＰＡ比が顕著に上昇することが確認できた。

試験７では、グルコース濃度が０．１質量％以下となり枯渇した培養開始４８時間後に、培地に対し２．０質量％のグルコースを追加添加し、更に２４時間培養した時点で、培地中のグルコース濃度が再び０．１質量％以下となった。すなわち、追加添加したグルコースは、２４時間で枯渇したと考えられる。表６に示すように、試験７では、追加添加したグルコースが枯渇したと考えられるグルコース追加添加後２４時間（合計で４８＋２４時間）から更に２４時間（合計で４８＋４８時間）培養した時にｎ−３ＤＰＡ比の上昇が認められ、グルコース追加添加後２４時間（合計で４８＋２４時間）から更に７２時間（合計で４８＋９６時間）培養したときに、ｎ−３ＤＰＡ比が顕著に上昇することが確認できた。

以上の通り、試験６、７から、本株を、飢餓条件下で継続して培養することによりｎ−３ＤＰＡ比が顕著に上昇したことが示された。

本発明で提供される脂質組成物は、医薬、食品、餌飼料等の分野において利用可能である。

Claims (3)

1. 脂質組成物であって、
   ＧＣ−ＦＩＤ（検出器として水素炎イオン化型検出器を用いたガスクロマトグラフィー）により分析したときに得られるクロマトグラムにおけるピーク面積比として、
   メチルエステル換算で、脂肪酸成分の全量に対して、
   １０％以上のｎ−３ＤＰＡ（ｎ−３ドコサペンタエン酸）と、
   ３０％以上のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）と
   を少なくとも含み、
   ｎ−６多価不飽和脂肪酸の含有量が合計で１５％以下であり、
   パルミチン酸の含有量が１０％以下であり、
   エイコサペンタエン酸の含有量が５％以下であり、
   ＧＣ−ＦＩＤにより分析したときに得られるクロマトグラムにおけるピーク面積比として、メチルエステル換算で、１００部のＤＨＡに対して３０部以上のｎ−３ＤＰＡを含み、
   脂質として脂肪酸トリグリセリドを含む
   ことを特徴とする脂質組成物。
2. オーランチオキトリウム属に属する微生物に由来する、請求項１に記載の脂質組成物。
3. 請求項１又は２に記載の脂質組成物を含有する、医薬組成物、食品組成物、又は餌飼料組成物。