JP6921465B2

JP6921465B2 - 微生物乾燥菌体の製造方法

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Publication number: JP6921465B2
Application number: JP2019195170A
Authority: JP
Inventors: 伊藤　雅彦; 雅彦伊藤; 喜作志村; 智代田; 笠羽　恵子; 恵子笠羽; 康浩茂木; 彰久松井; 聡司三井田
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-08-18
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: CN108271382A; EP3369805A1; EP3369805A4; WO2017073752A1; US20190062693A1; JPWO2017073752A1; EA039591B1; EP3369805B1; ZA201802802B; JP2020010725A; EA201891064A1; JP6823601B2; US10844347B2

Description

本発明は、微生物乾燥菌体の製造方法に関し、更に詳細には、高温での長期保存後の生菌の生残率が高い微生物乾燥菌体の製造方法に関する。

腸内細菌として知られている乳酸菌は、従来からヨーグルトやチーズ等の乳製品の製造に広く利用されており、また、近年、乳酸菌を乾燥させたものを用いた食品や飲料等の開発が進んでいる。そして、乳酸菌の効果を得るためには、生きたままの菌体を利用することが望ましいが、乾燥菌体を得る工程では、菌体が損傷し、死滅することが多く、必要量の生菌体を得ることは難しかった。

そして、菌体の損傷や死滅を減らすためには、菌体を乾燥させる際に使用する分散媒に含まれる成分が重要であることが知られており、例えば、グルタミン酸ナトリウム（特許文献１）やトレハロース（非特許文献１）を分散媒に添加したり、または、これらを組み合わせて使用すること（特許文献２）が開示されている。

一方、乾燥菌体の流通面を考慮すると、常温（20〜40℃）で長期保存しても生残率が高く維持される乾燥菌体が望まれている。一般に常温の範囲においては、保存中の製品劣化は温度が高いほど促進されると考えられており、特に高温（30〜40℃）での品質安定性が重要である。

特許第３５０４３６５号特開２０１０−４７８７号公報

G.L.DE ANTONI et al.「Trehalose, a Cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus」 Cryobiology 26, p.149-153, 1989

従って本発明は、高温での長期保存後の生菌の生残率が高い微生物乾燥菌体の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行っていたところ、微生物菌体を乾燥させる前に、予め、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を組みあわせて含む分散媒に微生物菌体を懸濁し、次いで乾燥を行うことで、高温での長期保存後の生菌の生残率が高くなることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、微生物菌体を、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含む分散媒中に懸濁した後、乾燥することを特徴とする微生物乾燥菌体の製造方法である。

また、本発明は、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含む分散媒を用いて微生物菌体を乾燥させた微生物乾燥菌体である。

また、本発明は、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含む微生物菌体の乾燥用分散媒である。

本発明方法によれば、高温で長期間保存しても生菌の生残率が高い微生物乾燥菌体が得られる。そのため、本発明方法によって得られた微生物乾燥菌体は、流通や保存の面から極めて優れているものである。

本発明方法により、微生物菌体乾燥粉末が得られる微生物としては、特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・クレモリス（Lactobacillus cremoris）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ユーグルティ（Lactobacillus yoghurti）、ラクトバチルス・デルブルッキィーサブスピーシーズ．ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキィーサブスピーシーズ．デルブルッキィー（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）等のラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）等のビフィドバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．ラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属細菌を挙げることができ、これらを１種または２種以上用いることができる。好ましくは、ラクトバチルス属細菌が挙げられ、ラクトバチルス・カゼイがより好ましく、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６、受託日：昭和５６年５月１日、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２０号室））が特に好ましい。

本発明方法の実施にあたっては、まず、微生物を常法に従って培養し、次いで、例えばデラバル型連続遠心機等を用いて集菌し、必要に応じて洗浄する。

この集菌した微生物菌体を、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含む、水溶液の分散媒（以下、これを単に「本発明分散媒」ともいう）中に加えて懸濁させ、この懸濁液を乾燥すれば、目的とする微生物乾燥菌体を得ることができる。上記分散媒の溶媒としては、特に限定されないが、例えば、精製水、脱イオン水等の飲用可能な水を使用できる。本発明分散媒は、微生物菌体の乾燥用分散媒であり、保護剤、抗菌剤およびキレート剤を含むものである。また、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤からなる分散媒が好ましい。

本発明分散媒で使用する保護剤としては、特に限定されないが、例えば、グルタミン酸またはその塩、二糖類、グリセロール、マルトデキストリン、サイクロデキストリン、脱脂粉乳等を使用することができ、グルタミン酸もしくはその塩および／または二糖類を使用することが好ましく、例えばグルタミン酸塩としては、グルタミン酸ナトリウムやグルタミン酸カリウム等が挙げられ、特にグルタミン酸ナトリウムが好ましい。二糖類としては、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等が挙げられ、トレハロースが好ましい。また、グルタミン酸ナトリウムおよび／または二糖類が好ましく、グルタミン酸ナトリウムおよび／またはトレハロースがより好ましい。本発明分散媒中における保護剤の含有量は、１〜４０質量％（以下、％で示す）が好ましく、５〜３０％がより好ましい。

また、本発明分散媒で使用する抗酸化剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸またはその塩、ビタミンＥ、カテキン、グルタチオン、アスタキサンチン等を使用することができ、例えば、アスコルビン酸塩としては、アスコルビン酸ナトリウムやアスコルビン酸カルシウム等が挙げられ、特にアスコルビン酸ナトリウムが好ましい。本発明分散媒中における抗酸化剤の含有量は、０.０１〜１０％が好ましく、０.０５〜５％がより好ましい。

更に、本発明分散媒で使用するキレート剤としては、特に限定されないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸またはその塩やフィチン酸等を使用することができる。このうち、クエン酸塩としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。本発明分散媒中におけるキレート剤の含有量は０.１〜１０％が好ましく、０.５〜５％がより好ましい。

また、本発明分散媒として、グルタミン酸ナトリウム、トレハロース、アスコルビン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含有する水溶液を用いることが好ましい。

本発明分散媒中に微生物菌体を懸濁した菌体懸濁液中の微生物菌体数は、１.０×１０^５〜４.０×１０^１４ｃｆｕ／ｍＬ程度であり、１.０×１０^７〜４.０×１０^１３ｃｆｕ／ｍＬがより好ましい。

本発明方法において乾燥は、特に限定されないが、例えば、凍結乾燥や噴霧乾燥等の公知の乾燥方法を利用することができるが、乾燥工程での微生物の生残率を高めるためには、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥法における乾燥条件としては、例えば、−３５℃〜−４５℃で６〜１２時間の凍結処理を行った後、１２℃〜３２℃で４０〜９０時間の乾燥処理を行う条件を挙げることができる。なお、凍結乾燥機の例としては、TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS（（株）宝エーテーエム）を挙げることができる。

上記のようにして得られる微生物乾燥菌体（以下、「本発明の微生物乾燥菌体」ともいう）は、後記実施例で示すように高温での長期保存後の生菌の生残率が高いものであり、具体的には、微生物乾燥菌体をミルで粉砕し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース製）に充填し、脱酸素剤（三菱ガス化学（株）製）と共にアルミパウチに入れて３５℃４週間保存した場合の、保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合（生残率）が、３０％以上のものである。また、微生物乾燥菌体をミルで粉砕し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース製）に充填し、脱酸素剤（三菱ガス化学（株）製）と共にアルミパウチに入れて、保存中に温度を変更する保存条件として、２℃１日、３５℃２日、３０℃６日、２２℃６か月を一連とする条件で保存した場合の生残率が３５％以上であり、２２℃６か月保存した場合の生残率が４０％以上である。

本発明の微生物乾燥菌体は、凍結乾燥直後の強度が大きくないため、その後の粉砕が容易にできるという効果を奏する。さらに、水に溶解したときの分散性が良好であり、少ない時間で凍結乾燥が完了するものである。また、吸湿性が低く、長期保存後においても塊が形成されず、ハンドリング性が良好であり、外観、色調、臭いなども保存開始時と変わらず、良好なものである。

また、本発明の微生物乾燥菌体は、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤を含む分散媒を用いて微生物菌体を乾燥させた微生物乾燥菌体である。この乾燥菌体を、そのまま、あるいは通常食品に添加される他の食品素材と混合することにより、食品や飲料に利用することができる。例えば、食品としては、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、ヨーグルトや発酵乳等が挙げられ、飲料としては、清涼飲料、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料等が挙げられる。また、飲食品の形態としては、通常用いられる飲食品の形態、例えば、粉末、顆粒等の固体状、ペースト状、液状等が挙げられる。また、微生物乾燥菌体を、錠剤、散剤、チュアブル剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤等に加工してもよい。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、ラクトバチルス・カゼイの生菌数は、次の方法で測定した。

ラクトバチルス・カゼイ生菌数
ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体を生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）で段階希釈した。希釈液１ｍＬをＢＣＰ加プレートカウント寒天培地で混釈し、３７℃、７２時間培養した後に、生じたコロニーを計測し、希釈率を乗じ、ラクトバチルス・カゼイ生菌数とした。

実施例１
ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体の調製（１）：
ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＹＩＴ９０２９を、酵母エキス１％、リン酸一カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、乳糖２％を含む培地(ｐＨ７)で、３７℃、２０時間嫌気的に培養した。培養終了後、液温が２０℃以下になるまで冷却し、５規定の水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調整した。この培養液を遠心分離（１４０００Ｇ、４℃、３０分間）して得られた菌体を回収して、下記表１に示した組成で全量が１０００ｍＬとなるように分散媒を製造し、分散媒に菌体を２．０×１０^１１ｃｆｕ／ｍＬとなるように懸濁した。菌体懸濁液をトレーに分注し、凍結乾燥法により乾燥菌体を調製した。なお、凍結乾燥は、凍結乾燥機 TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS（（株）宝エーテーエム）を用い、棚温−４０℃で９時間、その後２０℃で８０時間の条件で行った。得られた乾燥菌体をミルで粉砕し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース製）に充填し、脱酸素剤（三菱ガス化学（株）製）と共にアルミパウチに入れ、３５℃、４週間保存した後、ラクトバチルス・カゼイの生菌数を測定した。保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合（生残率）を表１に示す。

保護剤（グルタミン酸ナトリウムおよびトレハロース）、抗酸化剤（アスコルビン酸ナトリウム）およびキレート剤（クエン酸ナトリウム）を含有する分散媒を用いた発明方法１は、抗酸化剤とキレート剤を含まない分散媒を用いた比較方法１および比較方法２よりも、生残率が高かった。

実施例２
ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体の調製（２）：
分散媒の組成を下記表２に示したものに変更した以外は、実施例１と同様の方法で、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＹＩＴ９０２９の凍結乾燥菌体を調製し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース製）に充填し、脱酸素剤（三菱ガス化学（株）製）と共にアルミパウチに入れ、３５℃、４週間保存した後、ラクトバチルス・カゼイの生菌数を測定した。保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合（生残率）を表２に示す。

キレート剤を含まない分散媒を用いた比較方法３〜５の生残率は発明方法１よりも低かった。実施例１および２の結果から、保護剤、抗酸化剤およびキレート剤の３成分を含む分散媒で製造した乾燥菌体は、保護剤のみを用いた場合や保護剤と抗酸化剤のみを用いた場合に比べ、高温で長期間保存後の生残率が高いことが示された。

実施例３
ラクトバチルス・カゼイ乾燥菌体の調製（３）：
実施例１の発明方法１と同様の方法でラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＹＩＴ９０２９の凍結乾燥菌体を調製し、通常の大気組成下で脱気を行わずに、０．２ｇずつカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース製）に充填し、ＰＴＰ包装（Press Through Package、アルミシートおよび塩化ビニル製）し、脱酸素剤（三菱ガス化学（株）製）と共にアルミパウチに入れ、表３に示す条件で保存した後、ラクトバチルス・カゼイの生菌数を測定した。保存開始時の生菌数に対する保存後の生菌数の割合（生残率）を表３に示す。なお、２℃１日→３５℃２日→３０℃６日→２２℃６か月の保存条件は、凍結乾燥菌体を３０〜３５℃で輸送し、その後２２℃で保管することを想定したものである。また、保存後の凍結乾燥菌体は、吸湿性が低く、塊が形成されておらず、外観、色調、臭いも保存開始時と変わらず、良好なものであった。

２℃１日→３５℃２日→３０℃６日→２２℃６か月および２２℃６か月の保存条件のいずれにおいても、生残性は良好であることが示され、特に２℃１日→３５℃２日→３０℃６日→２２℃６か月の実用化を想定した保存条件においても、生残性が良好であることが示された。

本発明方法により得られる微生物乾燥菌体は、高温で長期間保存しても生菌の生残率が高いものである。したがって、流通や保存の面から極めて優れているものである。また、本発明方法により得られる微生物乾燥菌体は、食品や飲料等に利用することができるものである。

Claims

ラクチカゼイバチルス属に属する微生物の菌体を、保護剤としてのグルタミン酸ナトリウムおよびトレハロース、抗酸化剤としてのアスコルビン酸ナトリウム、キレート剤としてのクエン酸ナトリウムを含む水溶液である分散媒中に懸濁した後、乾燥する微生物乾燥菌体の製造方法であって、
分散媒中の含有量が、保護剤が５〜３０質量％、抗酸化剤が０．０５〜５質量％およびキレート剤が０．５〜５質量％である、
ことを特徴とする微生物乾燥菌体の製造方法。
ラクチカゼイバチルス属に属する微生物が、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭＢＰ−１３６６）である請求項１に記載の微生物乾燥菌体の製造方法。
乾燥を、凍結乾燥法により行う請求項１または２に記載の微生物乾燥菌体の製造方法。